KR102254057B1 - 하이드록시에틸셀룰로스 및 글리세린을 유효성분으로 함유하는 품질저하 방지용 골이식재의 제조방법 - Google Patents

하이드록시에틸셀룰로스 및 글리세린을 유효성분으로 함유하는 품질저하 방지용 골이식재의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하이드록시에틸셀룰로스 및 글리세린을 유효성분으로 함유하는 품질저하 방지용 골이식재의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose) 및 글리세린(glycerine)을 유효성분으로 함유하는 골이식재 손상 억제용 조성물; 상기 골이식재 손상 억제용 조성물, 탈회골기질 및 뼈유래 무기질을 유효성분으로 포함하는 골형성 유도를 위한 골이식용 조성물; 및 하이드록시에틸셀룰로스와 글리세린을 유효성분으로 함유하는 품질저하 방지용 골이식재의 제조방법에 관한 것이다.

Description

하이드록시에틸셀룰로스 및 글리세린을 유효성분으로 함유하는 품질저하 방지용 골이식재의 제조방법{Manufacturing method of keeping quality bone graft material comprising hydroxyethyl cellulose and glycerine}
본 발명은 하이드록시에틸셀룰로스 및 글리세린을 유효성분으로 함유하는 품질저하 방지용 골이식재의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 골이식재의 손상 억제용 조성물 및 본 발명의 골이식재 손상 억제용 조성물, 탈회골기질 및 뼈유래 무기질을 유효성분으로 포함하는 골형성 유도를 위한 골이식용 조성물에 관한 것이다.
생체재료는 의약품을 제외한 인공, 천연 또는 그들의 복합재료로서 인체 내에서 단기 또는 장기간 동안 체내의 조직이나 기관의 기능을 치료, 보강, 대치 또는 회복시키는데 사용되는 재료를 일컫는다. 손상된 뼈조직의 치료분야에 있어서 이들의 재건을 주요 목적으로 하는 여러 가지 이식재가 알려져 있다. 이식재는 무유합골절의 치료, 관절 고정, 골강의 충진, 뼈 및 관절부위 손실분 대체, 관골구와 두개골의 강화, 성장판 연골의 융합 등 매우 다양한 목적으로 사용되고 있다.
특히 뼈 이식을 통한 뼈의 재건 분야에 있어서, 자신의 뼈 일부분을 채취하여 이식부분에 이식하는 자가이식이 가장 일반적으로 사용되고 있는 방법이다. 자가이식의 장점은 뼈의 기질뿐만 아니라 뼈형성에 작용하는 살아있는 세포를 그대로 이식부위에 제공함으로써 뼈생성이 여타의 이식물과 비교할 때 보다 원활하게 일어날 수 있다는 점과, 자신의 뼈 일부분을 사용하기 때문에 면역거부반응에 의한 치료효과의 반감 및 실패확률을 크게 줄일 수 있다는 점이다. 또한, 뼈의 흡수가 거의 없고 피로골절이 적으며 골유도 및 골전도 능력이 뛰어나기 때문에 뼈의 유합과 비후가 신속하게 진행되어 골간의 큰 손실부 재건에 유리하다. 그러나, 이러한 자가이식의 장점에도 불구하고, 자가이식은 피시술자의 신체에서 뼈를 채취해야하므로, 환자의 고통 및 외과적 수술에 필히 수반되는 이차감염의 문제가 항상 존재하는 단점이 있다.
한편, 이러한 단점을 해결하고자 대안으로 제시된 것이 탈회골기질(DBM; Demineralized Bone Matrix)이다. 탈회골기질은 골유도 능력뿐만 아니라 골 채취를 위한 부가적인 수술이 필요치 않은 장점을 갖고 있다. 그러나, 탈회골기질은 수용액과 친화성이 떨어지며, 단독으로 이식시 형태유지가 어려운 단점을 갖고 있다. 또한, 특별한 안정화제 또는 담체와 같이 사용되지 않을 경우, 탈회골기질 내에 포함되어 있는 골형성 단백질(BMP; Bone Morphogenetic Protein)이 생체 내에서 쉽게 퇴화될 수 있는 가능성이 항상 존재하며, 손상부위에 이식할 때 탈회골기질 자체만으로는 이식이 어렵다는 단점이 존재한다.
뿐만 아니라 탈회골기질을 이용한 이식용 재료의 제조공정에는 탈회공정 및 멸균공정이 수반되는데, 탈회 및 멸균과정 중에 독성성분에 의한 오염 발생 가능성이 있고, 주요 성장인자들의 손상 문제가 발생하고 있다. 따라서 탈회공정 및 멸균공정 중에 주요성분의 손상이 없으며, 골이식, 골유도 및 골전도능이 우수한 탈회골기질을 이용한 새로운 골재생재의 개발이 필요한 실정이다.
나아가 최근 사회풍조는 반려동물에 대한 사회적 관심이 증가되면서 반려동물을 가족 구성원 또는 동반자로 인식하는 사람들의 수가 증가하고 있으며, 반려동물의 시장도 꾸준히 증가하고 있어 2014년에는 2조원, 2020년에는 6조원의 성장규모로 급팽창할 것으로 예상하고 있다. 또한, 반려동물의 가족 구성원 인식 증가로 인해 반려동물과의 야외활동이 증가되고 있는데, 야외활동시의 사고 및 노령화된 반려동물의 증가로 이러한 애완동물에 대한 골 이식 필요도 점차 늘어나고 있다. 이에 반려동물에게 유용하게 적용할 수 있는 우수한 골재생재의 개발이 필요하다.
대한민국 공개특허 제10-2003-0027934호 대한민국 공개특허 제10-2001-0040677호
그러므로 본 발명자들은 탈회골기질, 뼈 유래 무기질 및 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose)와 글리세린(glycerine) 함유 수용액을 포함하는 조성물이 골이식, 골유도 및 골전도능이 모두 우수함을 확인하였고, 특히 하이드록시에틸셀룰로스 및 글리세린 함유 수용액의 경우, 골이식재 제조 과정 중에서 멸균 처리에 의한 골이식재의 품질저하 및 골손상을 억제할 수 있고, 골내 함유된 성장인자와 같은 단백질의 손실 및 변성을 효과적으로 억제함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose) 및 글리세린(glycerine)을 유효성분으로 함유하는, 골이식재의 손상 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 골이식재의 손상 억제용 조성물, 탈회골기질 및 뼈유래 무기질을 유효성분으로 포함하는, 골형성 유도를 위한 골이식용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose) 및 글리세린(glycerine)을 유효성분으로 함유하는, 골이식재의 손상 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물 총 중량 대비 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose)는 1~8 중량% 및 글리세린(glycerine)은 30~60중량%로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 손상은 골이식재의 전자빔 멸균에 의한 입도감소, 콜라젠 분해감소 및 성장인자의 농도감소일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 골이식재의 손상 억제용 조성물, 탈회골기질 및 뼈유래 무기질을 유효성분으로 포함하는, 골형성 유도를 위한 골이식용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 해면골 또는 치밀골을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 골형성 촉진, 골유도 증진, 골전도 촉진 및 골이식재의 손상 억제효과를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 골이식재의 손상 억제용 조성물은 60~80 중량%로 함유되고, 상기 탈회골기질 및 뼈유래 무기질은 20~40 중량%로 함유되는 것일 수 있다.
본 발명의 골이식재의 손상 억제용 조성물 해면골 또는 치밀골을 더 포함하는 경우, 탈회골기질; 뼈유래 무기질; 및 해면골 또는 치밀골의 혼합물 100 중량% 대비 상기 탈회골기질은 50~60 중량%, 상기 뼈유래 무기질은 10~20 중량% 및 해면골 또는 치밀골 20~30 중량%로 함유되는 것일 수 있다.
본 발명은 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose) 및 글리세린(glycerine)을 유효성분으로 함유하는 골이식재의 품질저하 억제용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 골이식재의 손상 억제 용도로 사용할 수 있고, 상기 조성물과 탈회골기질 및 뼈 유래 무기질을 함유하는 조성물은 골형성 유도를 위한 골이식용 조성물로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 골이식재의 손상 억제용 조성물은 골이식재 제조 과정 중에서 멸균 처리에 의한 골손상 및 골내 함유된 성장인자와 같은 단백질의 손실 및 변성을 효과적으로 억제할 수 있으며, 본 발명의 골이식용 조성물은 골형성 촉진, 골유도 증진 및 골전도 촉진이 우수하여, 골이식이 요구되는 각종 산업에 널리 활용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 의해 본 발명의 골이식용 조성물을 이용한 골이식재 제조방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 하이드록시아파타이트(표준물질로 사용) 및 본 발명에서 제조한 개뼈 유래 무기질 성분에 대한 X-선 회절 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에서 제조한 탈회골기질 단독 및 본 발명에 따른 골이식용 조성물에 대한 멸균처리 전후의 뼈이식재의 입도 변화를 비교분석한 그래프이다.
도 4A는 동물모델을 대상으로 앞다리의 결손부위에 본 발명의 골이식용 조성물을 이식하고 시간에 따른 골형성 정도를 X-ray 영상을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이고, 4B는 각각의 이식재 처리군에 따른 4주 및 8주째의 골형성 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5A는 이식재 처리군에 따른 골형성 정도를 디지털이미지 분석을 통해 확인한 사진을 나타낸 것이고, 5B는 신생골의 면적 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6A, B는 동물모델을 대상으로 앞다리의 결손부위에 본 발명의 골이식용 조성물을 이식하고 4주, 8주차에 골형성 정도를 micro CT 영상을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이고, C는 각각의 이식재 처리군에 따른 4주 및 8주째의 골형성 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 골이식, 골유도 및 골전도능이 모두 우수하며, 골이식재 제조 과정 중에서 멸균 처리로 발생하는 골이식재의 품질저하 및 골내 함유된 성장인자와 같은 단백질의 손실 또는 변성의 문제를 효과적으로 억제할 수 있는 골이식재 손상 억제용 조성물 및 이를 포함하는 골이식용 조성물을 제공함에 특징이 있다.
구체적으로 본 발명에 따른 골이식재의 손상 억제용 조성물은 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose) 및 글리세린(glycerine)을 유효성분으로 포함하며, 이때 상기 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose)는 1~8 중량%로 포함되고 상기 글리세린(glycerine)은 30~60중량%로 포함된다.
상기 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose)는 백색 또는 연황백색을 띄는 분말 형태의 수용성 고분자성분으로 셀룰로오스 유도체 중에서도 가장 뛰어난 내염성과 pH 안정성을 가지며, 콜로이드성, 보수성 및 내온성을 가지고 있어 각종 산업에서 다양한 제품의 응용에 사용 가능한 원료로 인정받는 성분이다. 수용액의 형태로는 pH 2~12의 범위에서 안정하고, 특히 pH 4~11의 범위에서는 장기 보존안정성이 뛰어나다. 피부, 모발 등에 얇은 피막을 형성하여 피부를 부드럽게 감쌀 수 있고 사용감을 향상시키는 데 도움을 줄 수 있으며, 제약분야에서는 우수한 점성, 수용성 등으로 인공눈물 및 약물전달용 부형제로 사용하기도 한다. 뿐만 아니라 다른 원료들이 서로 분리되지 않도록 유화 안정에 도움을 주는 원료로도 사용되고 있다. 겔을 형성하는 능력이 있는 점증제로 점도를 젤리 같은 점성으로 높여주어 모양을 고정하거나 점도를 개선하는 역할을 한다.
또한, 글리세린은 천연수지에서 비누나 지방산을 제조하는 경우 부생품으로 수득할 수 있는데, 최근에는 프로필렌을 염소로 처리하여 에피클로로 히드린을 만들고, 이것을 가수분해하여 합성하기도 한다. 고무, 치약, 화장품, 화약, 도료 ,셀로판, 인쇄잉크, 과자 및 빙과류 등 다양한 분야에서 사용된다.
한편, 본 발명에서는 하이드록시에틸셀룰로스 및 글리세린을 유효성분으로 포함하는 조성물이 골이식을 위한 이식재, 즉 골이식재의 손상을 효과적으로 억제할 수 있는 기능이 있음을 최초로 규명하였다.
상기 조성물에 함유된 하이드록시에틸셀룰로스는 조성물 총 중량 대비 1~8 중량%으로 포함되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 6~8 중량%로 사용할 수 있다. 만일 1중량% 미만으로 포함되는 경우에는 본 발명의 조성물이 물처럼 흘러내려 사용하기에 불편하게 될 뿐만 아니라 골이식재의 손상 억제 효과도 거의 없는 문제점이 있으며, 8중량%를 초과한 경우에는 거의 녹지가 않아 조성물 제조에 어려움이 있고 8중량%를 초과하여 더 많은 양을 첨가하여도 그에 따른 골이식재 손상 억제의 증가현상이 발생하지 않아 경제적인 측면에서 유효하지 않다.
또한, 글리세린(glycerine)은 조성물 총 중량 대비 30~60중량%로 사용하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 60 중량%로 사용하는 것이 좋다.
만일 글리세린을 30 중량% 미만으로 사용하게 되면 수분 보충 효과가 거의 없을 뿐만 아니라 골이식재의 멸균 후 유용 단백질 성분의 보호 효과가 미비한 문제점이 있으며, 반면 60 중량%를 초과하여 사용하게 되면 이식 후, 이식재의 골재생 효과를 오히려 방해하는 문제점이 생기며 사용량 증가에 따른 골이식재 보호 효과의 증가를 유발하지 않아, 이 또한 비경제적이다.
따라서 하이드록시에틸셀룰로스 및 글리세린은 본 발명에서 제시하는 중량%의 양으로 사용하는 것이 중요하다.
이식을 위해 사용하는 골이식재들의 경우, 제품 제조 과정 중에 멸균 처리하여 외부로부터의 오염을 방지하고 이식재 내에 함유된 오염물질을 살균 및 멸균처리하여 이식 후, 이식 부위에서 오염물질에 의한 부작용이 유발되지 못하도록 하고 있다. 그러나 이러한 멸균 처리 과정에서 골이식재의 상당수가 손실되는 문제가 있고 이식재 내에 함유된 중요한 성장인자 및 주요 기능을 갖는 단백질들이 손상 또는 변성되는 문제점이 발생하고 있다.
그러나 본 발명에서 제공하는 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose) 및 글리세린(glycerine)을 유효성분으로 함유하는, 골이식재의 손상 억제용 조성물은 방사선 멸균에 의한 골이식재의 입도감소, 골이식재의 주요성분인 콜라젠의 분해감소 및 성장인자들의 농도감소 방지 효과가 매우 우수한 특징이 있다.
이를 확인하기 위해 본 발명자들은 상기 본 발명의 골이식재 손상 억제용 조성물을 이용한 골이식용 조성물을 제조하였고, 전자빔 멸균 전 후의 골이식재의 입도변화 및 골이식재의 분해도 변화를 분석하였는데, 그 결과, 탈회골기질만을 함유한 군에 비해 본 발명의 골이식재 손상 억제용 조성물을 포함한 군이 입도의 감소 변화가 거의 없어 입도 손상을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.
뿐만 아니라 전자빔 멸균 전후의 콜라겐 분해도를 분석한 결과, 탈회골기질만을 함유한 군에 비해 본 발명의 골이식재 손상 억제용 조성물을 포함한 군이 골이색재의 분해를 월등하게 감소시키는 것으로 나타났다.
그러므로 본 발명자들은 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose) 및 글리세린(glycerine)을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 골이식재의 손상 억제용 조성물을 성공적인 골이식을 위해 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명은 본 발명에 따른 골이식재 손상 억제용 조성물, 탈회골기질 및 뼈유래 무기질을 유효성분으로 포함하는, 골형성 유도를 위한 골이식용 조성물을 제공한다.
상기 골이식재 손상 억제용 조성물에는 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose) 및 글리세린(glycerine)을 유효성분으로 포함하며 이에 대한 내용은 앞서 기술된 바와 같다.
상기 탈회골기질은(Demineralized bone matrix, DBM) 탈회공정을 통해 골이식재 내 무기질 성분을 제거하고 그 내부에 존재하는 교원질이나 성장인자, 특히 BMP계열의 성장인자를 노출시켜 간엽세포를 조골세포로 분화시켜 골 형성을 유도하는 역할을 한다.
일반적으로 뼈는 약 65%의 무기질과 35%의 유기질로 구성되어 있으며 골유도능을 가진 다양한 성장인자는 인산칼슘을 비롯한 무기질에 갇혀 있는 상태로 존재하기 때문에 탈회처리를 하지 않으면 골유도능을 발휘하지 못한다. 따라서 골유도능을 위해 탈회처리를 수행하는데, 탈회 처리된 탈회골기질을 이용한 이식재들은 상대적으로 골재건 효과가 미비한 문제점이 있다. 이는 탈회과정에서 대부분의 무기질이 모두 제거되기 때문이며 탈회골을 이식하면 너무 빨리 흡수되어 이식재의 골전도 효과가 낮아지는 문제점이 발생한다. 또한 새로운 뼈가 형성될 때 필요한 무기질 성분을 제공해 줄 수 없는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 본 발명의 골형성 유도를 위한 골이식용 조성물에 탈회골기질과 더불어 뼈유래 무기질을 유효성분으로 사용하였다.
본 발명에서 사용한 상기 뼈 유래 무기질은 인체 뼈 또는 동물의 뼈로부터 수득한 무기질을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 개뼈를 이용하여 탈회골기질을 제조한 후, 사용하였던 개뼈로부터 무기질을 분리 및 수득하여 사용하였다.
본 발명자들은 일실시예에서 개뼈 유래 수득한 무기질에 대한 성분 분석을 수행하였는데, X-선회절 분석 결과 골재생 촉진효과를 갖는 다량의 무기질 및 미량원소가 함유되어 있음을 확인하였다.
또한 상기 본 발명의 골형성 유도를 위한 골이식용 조성물에는 해면골 또는 치밀골을 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 해면골을 사용할 수 있다.
뼈는 일반적으로 중앙부가 좁고 양단은 퍼져있으며 연골(관절연골)로 뒤덮여 있다. 관절연골은 연골하골량(subchondral bone)으로 지지되고 있는데 그 밑에, 즉 골단부위에 위치하는 것이 해면골이다. 해면골은 구멍이 많이 있고 딱딱한 뼈가 거미줄과 같이 있으며 망상골이라고도 하며 골조직의 20%를 차지하나 부피에 비해 표면적이 커서 대사활동은 피질골의 8배에 이른다. 장골에서는 골간단 부위에 많이 분포하여 압박력에 대해 저항성이 크다. 골수강 내에는 작은 기둥 모양의 해면골(bony trabecula)가 있으며, 해면골들 사이에는 지방조직이나 조혈조직이 존재한다. 해면골들은 서로 연결되어 있으며 해면골 자체는 층판을 형성하고 있지만 피질골과는 달리 층판의 배열이 동심성이 아니고 단순하다.
치밀골은 뼈의 주요기능인 신체의 지지기능 및 내장기관의 보호, 운동력의 전달 및 다양한 화학물질, 특히 칼슘을 저장하고 방출하는 기능을 담당하고 있는 뼈의 바깥부분인 피질을 이루는 부분으로서 밀도가 매우 높은 뼈조직을 말한다.
본 발명의 골형성 유도를 위한 골이식용 조성물에 사용될 수 있는 해면골 또는 치밀골의 기원은 시술하고자하는 대상물과 다른 종(species)으로부터 유래된 것도 무방하나, 같은 종일 경우에는 보다 높은 골재생 효과 및 골재생 후의 형태유지 효과를 기대할 수 있으므로, 바람직하게는 개뼈 유래의 것을 사용하는 것이 좋다.
상기 본 발명의 골형성 유도를 위한 골이식용 조성물에 함유된 골이식재의 손상 억제용 조성물은 상기 골이식용 조성물 총 중량 대비 60~80 중량%로 함유될 수 있고, 상기 탈회골기질 및 뼈유래 무기질은 20~40 중량%로 함유될 수 있다.
상기 골이식용 조성물 총 중량 대비 상기 골이식재의 손상 억제용 조성물이 60 중량% 미만으로 포함되게 되면 멸균 과정에서 이식재 및 이식재 내의 유용성분이 손상 및 손실되는 문제점이 발생할 수 있고 80 중량%를 초과하게 되면 상대적으로 탈회골기질 및 뼈유래 무기질의 첨가량이 감소하게 되므로 목적하는 골이식에 의한 골형성, 골재생, 골유도 효과를 얻을 수 없다.
또한, 상기 탈회골기질 및 뼈유래 무기질은 이들 성분을 혼합한 상태로 사용할 수 있는데, 탈회골기질 및 뼈유래 무기질의 혼합물은 상기 골이식용 조성물 총 중량 대비 20~40 중량%로 사용할 수 있다.
만일 20중량% 미만으로 사용하게 되면, 골형성, 골재생, 골유도를 위한 주요성분의 양이 적어 목적하는 효과를 얻을 수 없는 문제점이 생기며, 반면 40 중량%를 초과하게 되면 상대적으로 골이식재의 손상 억제용 조성물의 첨가량이 감소하게 되어 멸균 과정에 따른 골이식재의 보호 효과를 얻을 수 없다.
또한, 해면골 또는 치밀골을 더 포함하는 경우, 탈회골기질; 뼈유래 무기질; 및 해면골 또는 치밀골의 혼합물 100 중량% 대비 상기 탈회골기질은 50~60 중량%, 상기 뼈유래 무기질은 10~20 중량%; 및 해면골 또는 치밀골 20~30 중량%로 함유될 수 있다.
특히 본 발명의 골이식용 조성물은 골형성 촉진, 골유도 증진, 골전도 촉진 및 골이식재의 손상 억제효과를 모두 갖는 특징이 있다.
골유도(osteoinduction)는 골의 재생을 유도하기 위해 일종의 신호기전을 이용하는 방식으로 이식된 골이 이식된 부위의 조직으로부터 체액과 세포의 영향에 의해서 다기능성의 중간엽세포를 이식 부위로 유도하고 뼈모세포로의 분화를 유발함으로써 새로운 골 생성을 자극하는 능력을 말한다. 이러한 능력은 BMP와 같이 골 기질에서 유래한 몇 가지 액상 단백질에 의해 이루어지며 이식된 골에 살아있는 세포가 존재하지 않아도 이루어진다. 또한 이러한 성질은 골로부터 미네랄을 제거하였을 때 발생하는 골유도 관련 단백질의 활성화에 의해 이루어진다.
골전도(osteoconduction)는 골이식재가 골결손부를 채워 골의 형성을 위한 연결구조역할을 하는 지지체 방식에 의존하는 방식이다. 모세혈관이나 혈관주위 조직들이 이식된 골 안으로 자라나게 함과 동시에 뼈모세포가 숙주의 조직으로부터 조직적으로 분열될 수 있도록 이식된 골이 하나의 지지체로 작용할 수 있는 능력을 말한다. 이식재는 골의 내부를 채움과 동시에 뼈조직과 혈관조직이 충분히 안으로 뻗어올 수 있도록 뼈와 유사한 크기의 입자와 충분한 다공성을 갖는 것이 중요하다.
또한, 골형성 및 골재생에는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast) 및 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast) 가 관여하며 서로 밀접한 연관성으로 골의 항상성이 유지된다. 예를 들어, 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand), 및 그의 유도 수용체인 OPG(osteoprotegerin)과 같은 물질의 부비를 통해 골흡수를 담당하는 파골세포의 분화를 조절함으로써 체내의 골 항상성을 유지한다.
이러한 점에서 본 발명의 골이식용 조성물은 골형성 촉진, 골유도 증진 및 골전도 촉진 효과가 매우 우수한 효과가 있어 골 이식이 필요한 각종 질환의 이식 재료로 사용할 수 있으며, 나아가 멸균 과정에 의한 골이식재의 손상도 효과적으로 억제할 수 있는 바 종래 골이식재에 비해 더 우수한 효과를 도출할 수 있다.
골 이식이 필요한 각종 질환으로는 골다공증, 골절, 골형성 장애, 부정교합 등이 있다. 골다공증(osteoporosis)은 낮은 골양과 골기질의 파괴로 골절의 위험과 골의 취약성이 증가되는 골격질환으로, 여러 가지 원인에 의하여 뼈의 질량이 감소하고 뼈 조직의 미세구조 퇴화로 골절 위험이 지속적으로 증가하게 된다. 골다공증은 뼈를 구성하는 미네랄(특히 칼슘)과 기질이 감소한 상태이며, 골재형성의 균형이 깨져서 파골작용이 조골작용보다 증가된 상태에서 발생한다. 정상적인 뼈 내부는 그물망처럼 치밀한 구조를 이루고 있으나, 골다공증의 경우에는 구조 사이의 간격이 넓어지고 미세구조가 얇아져 약해짐으로써 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 골절될 수 있는 상태로 진행된다. 또한 골절에도 본 발명의 조성물은 적용 가능한데, 골절은 뼈나 골 단판 또는 관절면의 연속성이 비정상적으로 끊어진 상태로, 골의 깨짐을 일컫는다. 골절을 유발하는 원인으로는 교통사고 등의 외상, 산업장에서 일어나는 안전사고, 골다공증, 골암, 대사이상 등의 질병으로 인한 골의 변화 및 스포츠나 하중으로 인한 반복적인 골에 대한 스트레스 등이 있다. 나아가 본 발명의 조성물은 골형성 장애(osteodystrophy)에도 사용할 수 있는데 골형성장애는 골이영양증이라고도 하며, 만성 신부전 등에 의해 발생되는 뼈의 질환이다. 선천적으로 비정상적인 신장기능에 의해 발생하며, 신장이 약해질 때 투석을 하지 않으면 사망한다. 이와 같은 뼈질환을 신성 골이영양증(Renal Osteodystrophy)이라고 불리운다. 골이영양증과 관계있는 뼈 질환으로는 골연화증(osteomalacia), 섬유성 골염(osteitis fibrosa) 등이 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 골형성 유도를 위한 골이식용 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 골질환 치료 또는 예방 방법을 제공할 수 있다.
상기 본 발명의 조성을 인간을 포함한 포유류에 이식이 가능하며, 유효성분을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 제제화하여 투여할 수 있다. 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및/또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 조성물은 뼈의 결손부위에 직접 주입 또는 직접 이식하는 방법을 통해 투여할 수 있다.
나아가 본 발명은 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose) 및 글리세린(glycerine)을 유효성분으로 함유하는 골이식재의 손상 억제용 조성물을 이용한 골형성 유도용 골이식재를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 골이식재 제조방법은 도면 1에 기재된 공정에 의해 제조될 수 있는데, 먼저 사용할 개체의 뼈(원자재)를 검사기준에 따라 혈액 검사 등을 수행하여 입고 검사를 실시한다. 이후 연조직, 혈액 및 골수 등을 제거하고 초음파세척기와 진탕기를 이용하여 세척한다. 이후 면역거부 반응을 일으킬 수 있는 세포 및 지방성분을 제거하기 위해 탈수 및 탈지공정을 수행한 후 다시 세척한 뒤 건조시킨다. 이때 상기 탈수는 95~100%의 에탄올을 이용하여 수행할 수 있다.
이후 지방까지 제거된 탈지된 뼈는 분쇄 및 탈회 과정을 수행하는데, 상기 분쇄는 100~1000㎛의 입도크기가 되도록 분쇄하며, 상기 탈회는 골유도 효과를 높이기 위해 무기질을 제거한 후 중화함으로써 수행한다. 구체적으로 상기 탈회는 분쇄된 뼈를 HCl 용액에 10~ 30분 동안 담가 무기질 함량이 8% 이하가 되도록 탈회한다.
탈회 과정이 완료되면 3차 증류수로 3번 이상 세척한다. 그리고 남아있는 수분 등을 제거하기 위해 동결건조하고, 정해진 규격 및 이물질잔존 여부 확인 등을 위한 품질검사를 실시하다.
그런 뒤, 건조된 뼈 분말과 부형제를 비율에 따라 혼합하고 반죽한 다음, 1차포장 즉, EO(Ethylene Oxide)가스 멸균된 1회용주사기에 충전하여 밀봉한다. 이후 2차포장을 수행하는데, 이는 1차포장이 완료된 제품을 진공포장용지에 넣고 진공한 후 다시 다른 포장용지에 넣고 이중으로 포장한다. 2차포장이 완료된 제품에 시리얼넘버,lot 넘버, 바코드등이 새겨진 라벨지를 부착한 후, 라벨링까지 마친 제품의 외관상태 및 오염상태 등의 확인을 위한 최종품질검사를 수행한다.
그런 뒤, 추적라벨지와 제품사용설명서등을 함께 종이재질의 Box로 최종 포장(3차 포장)한다. 이후 방사선(전자빔 또는 감마선)멸균을 실시하고, 생산기록과 시험기록등을 점검하여 합격제품만을 출고하는 과정을 통해 본 발명에 따른 골형성 유도용 골이식재를 제조한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
탈회골기질 및 뼈 유래 무기질을 함유한 골재생용 조성물의 제조
<1-1> 탈회골 기질의 준비
먼저 본 발명자들은 개의 뼈를 수술기구를 이용하여 연조직 및 불순물을 제거한 다음, 초음파 세척기와 진탕기를 이용하여 세척하였다. 이후 면역거부반응이 발생하지 않도록 먼저 99% 에탄올로 탈수하고, 실온 건조한 다음 바로 유기용매로 뼈 속의 지방을 모두 제거하였다. 이후 후드에서 건조시켰다. 지방까지 제거된 탈지된 뼈는 125~710㎛ 범위의 입도크기가 되도록 분쇄하였다. 그런 뒤, 분쇄된 뼈를 0.5N HCl 용액에 담가 무기질 함량이 8% 이하로 탈회시켰고 탈회과정이 끝나면 탈회된 뼈 분말을 회수하여 3차 증류수로 3회 이상 세척한 후, 뼈 분말에 남아있는 수분을 제거하기 위해 동결건조시켰다.
<1-2> 뼈 유래 무기질의 준비
상기 <1-1>에서 분리된 개의 뼈를 0.5N HCl 용액에 담가 탈회가 완료된 후, 탈회 뼈 분말을 분리하고 남은 탈회 용액을 2N NaOH 수용액을 첨가하여 방치한 후, 5000rpm으로 원심분리하여 침전물을 수득하였고, 3차 증류수로 침전물을 3차례 이상 세척하여 본 발명의 뼈 유래 무기질로 사용하였다.
상기 방법으로 제조한 개 뼈 유래의 무기질에 대한 성분 분석을 수행하였는데, 그 결과, 하기 표에 기재된 바와 같이 생체재료 소재로 사용할 수 있는 유용한 무기질 및 미량원소들이 함유되어 있는 것으로 나타났다.
Figure 112019020251543-pat00001
<1-3> 하이드록시에틸셀룰로스 ( HEC ) 및 글리세린 함유 수용액 준비
하기 표에 기재된 것과 같이 하이드록시에틸셀룰로스(HEC) 및 글리세린을 생리식염수와 함께 혼합하여 부형제로 사용할 수용액을 제조하였다.
Figure 112019020251543-pat00002
<1-4> 본 발명에 따른 골재생용 조성물의 제조
상기 <1-1> ~ <1-3>의 제조가 완료되면, 하기 표에 기재된 바와 같이 각 성분을 혼합하여 반죽하고 에틸렌옥사이드 가스로 멸균된 1회용 주사기에 충전하여 밀봉하였다. 이후 다시 이를 진공포장용기에 넣고 진공한 후, 다시 포장지로 2중 포장하였다. 포장이 완료된 본 발명의 조성물은 전자빔 조사로 멸균 처리함으로써 최종적으로 본 발명의 골재생용 조성물을 제조하였다. 이때 전자빔 조사는 ISO 11137에 따라 결정된 방사선분량을 이용하여 방사선(전자빔) 멸균방법을 수행하였으며, 방사선 조사량은 15k~20kGy, SAL of 10의-6승으로, 멸균선원은 10MeV 전자빔가속기로 수행하였다.
Figure 112019020251543-pat00003
참고로, 상기 해면골은 개 뼈의 부위 중에서 안쪽에 존재하는 부위를 추출한 후, 분쇄하여 사용하였다.
< 실험예 1>
본 발명의 하이드록시에틸셀룰로스 ( HEC ) 및 글리세린 함유 수용액의 특성분석
<1-1> 하이드록시에틸셀룰로스 ( HEC ) 첨가량에 따른 점성분석
본 발명자들은 탈회골기질을 이용하여 골이식재 조성물의 제조를 위해 종래의 부형제 대신 상기 실시예 <1-3>에서 제조한 하이드록시에틸셀룰로스(HEC) 및 글리세린 함유 수용액을 사용하였으며, 수용액에 함유된 주요 성분 중 하이드록시에틸셀룰로스(HEC)의 농도를 달리할 경우, 제조되는 수용액의 점도에 어떠한 변화가 있는지 분석하였다. 이는 본 발명의 골재생용 조성물의 농도가 너무 낮은 경우 물처럼 흘러내릴 수 있고 너무 높으면 조성물 내에 함유된 주요성분들의 작용을 억제할 수 있어 적절한 점도를 유지할 수 있는 최적의 하이드록시에틸셀룰로스(HEC) 농도를 확인하였다. 이를 위해 하기 표와 같이 하이드록시에틸셀룰로스의 농도를 각기 달리한 수용액을 제조하고 제조된 수용액의 점도를 확인하였다.
Figure 112019020251543-pat00004
분석결과, 상기 표에 기재된 바와 같이 1% 이하의 저농도에서는 물처럼 흘러내리기 때문에 사용하기에는 적합하지 않았고, 8%를 초과한 경우에는 거의 녹지 않아 수용액 및 본 발명의 골재생용 조성물의 제조가 어려운 것으로 나타났다. 따라서 HEC의 농도는 1~8%의 범위로 사용하는 것이 적절함을 알 수 있었다.
<1-2> 글리세린 첨가량에 따른 수분손실 억제효과
본 발명의 하이드록시에틸셀룰로스(HEC) 및 글리세린 함유 수용액에 대한 수분손실 억제효과를 측정하기 위해, HEC 농도는 4%로 고정시킨 후 글리세린의 농도를 0%, 20%, 40%, 60%, 80%로 달리한 수용액을 이용하여 본 발명의 골재생용 조성물을 제조한 후, 시간 경과에 따른 수분건조 정도를 분석하였다.
Figure 112019020251543-pat00005
분석 결과, 상기 표 5에 기재된 바와 같이, 시간 경과에 따라 수분 손실이 발생하는 것으로 나타났으며, 글리세린을 60%의 함량으로 첨가한 군이 가장 수분손실이 낮은 것으로 나타났으며, 60% 첨가군과 80% 첨가군은 큰 차이가 없었다. 따라서 글리세린의 첨가는 0~80%까지 첨가하여 사용할 수 있으나, 60%의 첨가가 가장 좋은 것으로 나타났다.
< 실험예 2>
본 발명의 하이드록시에틸셀룰로스 ( HEC ) 및 글리세린 함유 수용액의 단백질 보호효과 분석
골이식재의 제조 과정 중에 멸균 과정이 수반되는데, 이 과정에서 골이식재에 함유된 유용성분, 예컨대 성장인자 등의 단백질들이 다수 파괴되거나 손실되는 문제가 발생하고 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 하이드록시에틸셀룰로스(HEC) 및 글리세린 함유 수용액이 멸균 과정에서의 단백질 손실을 억제할 수 있는 작용을 하는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 즉 하기 표와 같이 HEC 및 글리세린의 농도를 달리한 수용액을 제조하고 상기 수용액에 BMP-2 단백질을 첨가한 후, 멸균 전후의 BMP-2 단백질 농도변화를 측정하였다.
Figure 112019020251543-pat00006
분석결과, 상기 표 6에 기재된 바와 같이, 본 발명의 수용액이 첨가되지 않은 대조군의 경우 멸균으로 인하여 BMP-2의 농도가 크게 감소된 반면, 본 발명의 수용액이 첨가된 군에서는 BMP-2의 농도감소가 월등히 억제된 것으로 나타났다. 따라서 본 발명자들은 본 발명에서 사용한 하이드록시에틸셀룰로스(HEC) 및 글리세린 함유 수용액은 단지 보습의 효과 이외에 멸균 과정에서의 단백질 감소 및 변성을 효과적으로 억제하는 기능이 있음을 알 수 있었다. 특히, 60%의 글리세린과 6% HEC이 함유된 수용액 및 60%의 글리세린과 8% HEC이 함유된 수용액은 약 94%의 BMP-2의 농도를 유지하는 것으로 나타나, 단백질의 손실이 거의 발생하지 않음을 알 수 있었다.
< 실험예 3>
본 발명의 하이드록시에틸셀룰로스 ( HEC ) 및 글리세린 함유 수용액에 의한 멸균 전후의 입도변화 , 콜라젠 분해도 및 성장인자 농도변화 분석
뼈조직은 멸균으로 인해 변성되어 입도가 작아지고, 이식한 후 쉽게 분해된다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 HEC 및 글리세린 함유 수용액이 이식재의 입도변화 및 콜라젠 분해도 변화를 감소시킬 수 있는지 확인하기 위해, 상기 제조예 1 및 비교예 1의 조성물에 대해 멸균 전후의 입도변화 및 콜라젠 분해도 변화를 측정하였다.
Figure 112019020251543-pat00007
그 결과, 상기 표 7에 나타낸 바와 같이 본 발명의 HEC 및 글리세린 함유 수용액이 함유된 골재생용 조성물의 경우, 멸균 전후의 골이식재의 입도 변화가 거의 없는 것으로 나타난 반면, 비교예 1의 경우 멸균 후 입도가 현저하게 감소된 것으로 나타났다.
콜라젠 분해도 분석 결과, 입도변화 결과와 마찬가지로 비교예1에 비해 제조예 1이 큰 변화가 없는 것으로 나타났다. 따라서 탈회골기질의 주성분인 콜라젠이 멸균 과정에서 손상되어 콜라젠 분해효소에 의하여 쉽게 분해되는 현상을 본 발명의 HEC 및 글리세린 함유 수용액이 효과적으로 억제하여, 궁극적으로 본 발명의 골재생용 조성물에 함유된 골충진재의 주성분들이 멸균에 의한 손상 및 변성으로부터 보호됨을 알 수 있었다.
< 실험예 4>
본 발명의 골재생용 조성물 이식에 따른 골형성 효과분석
<4-1> 동물모델에서 X-ray 영상분석을 통한 본 발명의 골재생용 조성물에 의한 골형성 효과
본 발명자들은 본 발명의 골재생용 조성물이 골형성 촉진 효과가 있는지 동물모델을 대상으로 확인하는 실험을 수행하였다. 이를 위해 실험용 개의 앞다리에 직경 8mm, 깊이 5mm의 결손을 내고, 그 부위에 본 발명의 골재생용 조성물을 이식한 후, 4주 및 8주째의 골형성 정도는 X-ray 영상법으로 확인하였다.
Figure 112019020251543-pat00008
그 결과, 상기 표 8 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 이식 후 4주 및 8주 후 평가 결과, 4번 처리군, 즉 본 발명의 골재생용 조성물을 처리한 군이 다른 처리군들에 비해 골형성이 보다 더 높은 것으로 나타났다.
<4-2> 조직형태 계측학적 분석
상기 실험예 <4-1>의 처리군의 시료를 대상으로 조직형태 계측분석을 통해 골재생 정도를 분석하였다. 조직형태 계측학적 측정은 3D Histech사(No. 3 Ov Street Budapest, HUNGARY )의 Pannoramic 250 Flash III를 이용하여 디지털이미지를 얻은 후 Caseviewer(ver.2.1, 3D Histech, HUNGARY)를 이용하여 이미지를 획득하였다. 또한 조직형태 계측학적 측정은 autocad의 curve 곡선을 이용하여 3point 지정해서 분석 위치를 확인하였으며, 영상 분석 소프트웨어는 Image Pro plus®(MediaCybernetics,Inc,USA)를 사용하였다.
Figure 112019020251543-pat00009
분석 결과, 상기 표 9 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 전체적으로 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 다른 처리군에서는 골형성이 진행되는 것으로 나타났으며, DBM+Gelatin(L-2)는 4주차와 8주차의 결과가 유사한 것으로 나타났고, 다른 군에서는 4주차에 비해 8주차의 신생골 면적비가 높게 나타났다. 한편, 본 발명의 골재생용 조성물을 처리한 군에서는 다른 군에 비해 신생골의 면적비가 가장 높게 나타나는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 골재새용 조성물이 가장 우수하게 골재생 효능을 가지고 있음을 알 수 있었다.
<4-3> Micro-CT 측정
상기 실험예 <4-1>에서 사용한 검체 시편을 미세단층촬영기(SkyScan1173;Bruker-CT, Kartuizersweg 3B 2550 Kontich, Belgium)에 측정하고자 하는 부위가 중앙이 오도록 고정 후 측정하였다. 측정에 사용된 소프트웨어는 SkyScan1173 control software(Ver 1.6, Bruker-CT)로 촬영조건은 관전압은 90 kVp, 관전류는 88 μA, 1mm 알루미늄 여과(Filter)를 이용하였고, 노출 시간은 500 ms, (2240 X 2240) pixels, 화소크기(Pixel size)는 29.83 μm, 회전각도는 0.3도, 180도 회전하여 총 800장의 고해상도 영상을 획득하였다. 단면재구성엔 Nrecon (Ver 1.7.0.4, Bruker-CT)을 이용하여 2240X2240Pixel의 이미지를 획득하였고, 단면이미지는 Dataviewer(Ver. 1.5.1.2, Bruker-CT)를 이용하여 축을 정렬하였다. 분석프로그램으론 Ct Analyzer(Ver. 1.14.4.1, Bruker-CT)를 사용하여 각각 영상에서 골소주와 골수강을 분리하여 분석하였다.
Figure 112019020251543-pat00010
분석 결과, 상기 표 10 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 다른 처리군에 비해 본 발명의 골재생용 조성물을 처리한 군에서 신생골 면적이 가장 큰 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명의 골재생용 조성물은 손상된 부위에 이식 또는 처리할 경우, 신생골을 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose) 2~8 중량% 및 글리세린(glycerine) 60중량%를 유효성분으로 포함하는 조성물; 개뼈 유래 탈회골기질; 개뼈 유래 무기질; 및 개뼈 유래 해면골;을 유효성분으로 모두 포함하며,
    상기 하이드록시에틸셀룰로스(HEC; hydroxyethyl cellulose) 2~8 중량% 및 글리세린(glycerine) 60중량%를 유효성분으로 포함하는 조성물은 골이식용 조성물 총 중량 대비 60~80 중량%로 함유하고,
    상기 개뼈 유래 탈회골기질; 개뼈 유래 무기질; 및 개뼈 유래 해면골은 골이식용 조성물 총 중량 대비 20~40 중량%로 함유하되,
    개뼈 유래 탈회골기질; 개뼈 유래 무기질; 및 개뼈 유래 해면골의 혼합물 100 중량% 대비 상기 탈회골기질은 50~60 중량%, 상기 무기질은 10~20 중량%; 및 상기 해면골은 20~30 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는,
    골형성 촉진, 골유도 증진, 골전도 촉진 및 방사선 멸균으로부터 골이식재 손상 억제를 위한 골이식용 조성물.
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