JP6622416B2 - 骨修復のための注入可能な複合材料およびそれを調製する方法 - Google Patents

Description

本発明は、材料科学の分野、特に骨修復のための注入可能な複合材料およびそれを調製する方法に関する。複合材料は整形外科および美容整形の分野において広範に使用することができる。

損傷した骨組織の修復および再建は、整形外科医が世界中で直面する必要がある重要な課題である。骨移植材料がこれらの骨組織の修復に必要とされる。自家移植骨組織、すなわち患者独自の身体から採取された健常な骨組織は、損傷した骨組織の修復のための将来有望な標準物と世界中でみなされている。自家移植骨は、優れた骨誘導性、骨伝導性（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）、骨原性（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｃｉｔｙ）および安全性などの、骨組織を修復するのに必要とされる全ての特性を有する。しかしながら、自家移植骨を使用する場合、臨床的に避けられない欠点が存在する。骨組織は、自家移植骨を使用する場合、患者の身体のドナー部位から採取されることを必要とするので、この追加の手術が手術の期間およびコスト、患者の回復時間を増加させる。同時に、ドナー部位の損傷およびドナー部位から得られる骨組織の制限の両方が、現在顕著な問題となっている。

組織および器官のマトリクスは、様々な複合構造および機能タンパク質から構成され、多くの他の活性成分を含有する３次元ネットワークである。主な成分は、コラーゲン繊維、糖タンパク質、ムチンなどを含む。他の成分は、グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、およびコンドロイチン硫酸）、いくつかの脂質、および成長因子などの糖類である。これらの成分は、細胞接着のための優れた基材を提供し、その分解プロセスの間に大量の活性ペプチドを放出することができ、それにより、細胞増殖および分化を促進する。

理想的な生体材料のような生体組織マトリクスは組織操作および再生医療に必要とされるほぼ全ての特徴を有する。したがって、それは、種々の種類の組織および器官の修復および再生において広範に使用されている。現在、生体材料は、小腸、表皮、肝臓、脾臓、膀胱などの種々の組織から抽出される。それらの異なるマクロおよびミクロ構造、生体力学特性、インビボでの分解速度ならびに細胞−マトリクス相互作用のために、それらは異なる組織の修復および再生において使用されている。基本的に、市場の生体マトリクス製品の全ては膜の形態で存在し、それは大まかに２つのカテゴリーに分けられる：乾燥および水性膜。それらの用途は主に、皮膚潰瘍、腹膜再構成、軟組織再生、創傷治癒および髄膜外傷修復に焦点を合わせられている。

リン酸カルシウムベースのバイオセラミックは、ヒトの骨組織と同様の無機成分を有し、優れた生体適合性、生分解性および骨伝導性を有するので、それらは、長い間、骨修復材料の調製および修飾に使用されている。現在、一般に使用されているリン酸カルシウムバイオセラミックには、ヒドロキシアパタイト、β型リン酸三カルシウム、リン酸水素カルシウム、およびそれらの複合セラミックが含まれる。多数の研究により、リン酸カルシウムバイオセラミックは、骨の形成に必要とされるタンパク質を吸収／濃縮でき、骨芽細胞の増殖および分化を促進でき、それによって新たな骨の再生を誘導できることが示されている。最近の研究により、リン酸カルシウムバイオセラミックの分解の間に放出されるカルシウムおよびリン酸イオンは、骨環境における骨芽細胞および破骨細胞に良い影響を与え、骨修復および再生のプロセスの間に重要な役割を果たすことができることが示された。したがって、バイオセラミックの分解速度の調節もまた、それらの生物活性を調節する新たな手段となり、大きな可能性を有する。

現在、生物学的因子を含むほぼ全ての商業的に利用可能な骨修復材料は、化学的に精製されたＩ型コラーゲンを使用する。この種類のコラーゲンの欠点は、抽出プロセスが複雑であり、コラーゲンが抽出の間に変性し、その最適な生物学的性能を与えることができず、さらにその組成は比較的単純であり、骨修復プロセスの間に複雑なシグナル伝達経路の必要性を満たすことができず、さらに、高い毒性を有する化学架橋剤が、このようなコラーゲンの使用の間に必要とされ、移植の間に容易に免疫および炎症反応を誘発する可能性があることである。

本発明の目的は、骨修復のための注入可能な複合材料およびそれを調製する方法を提供することである。この新規の複合材料は主に２種類の材料から構成される。したがって、強力な生物活性および細胞挙動調節能力などの天然生体マトリクスの様々な利点を有するだけでなく、骨修復プロセスの間にバイオセラミックなどの無機材料によって提供される骨成長を刺激する優れた骨形成能も有する。本発明の複合材料は、高い骨誘導性および骨原性を有する活性生体骨格（ｂｉｏｓｃａｆｆｏｌｄ）を有する。したがって、それらは、複数の生物学的機構によって骨欠損において新たな骨の再生を急速に誘導できる。その一方で、本発明において開発される材料はまた、多数の既存の骨修復材料において臨床効果に影響を与える、主な不都合な点を回避する。したがって、本発明は、骨欠損修復のための理想的な技術的解決法を提供する。

本発明の目的は以下の技術的解決策によって達成される。

骨修復のための注入可能な複合材料は、以下の原材料：１〜７重量部の生体組織マトリクス材料、１〜９重量部のバイオセラミックおよび２〜８重量部の生理食塩水または他の等張水溶液を含む。

好ましくは、生体組織マトリクス材料は、哺乳動物の軟組織から調製され、主にコラーゲン繊維から構成される、その天然架橋構造を維持する細胞外マトリクスである。

好ましくは、哺乳動物の軟組織は、ブタの軟組織、ウシの軟組織または人体の軟組織である。軟組織は、表皮、真皮、血管、横隔膜、筋腱、靱帯、大腸、小腸および神経組織を含む。

好ましくは、生体組織マトリクス材料は微小繊維形態を有する。微小繊維生体組織マトリクス材料は１〜１５００マイクロメーターの直径を有する。生体組織マトリクス材料の直径対長さのアスペクト比は０．０５〜０．９５の範囲である。

好ましくは、バイオセラミックは、強化相のための材料として、バイオガラス、またはストロンチウム、亜鉛、マグネシウムもしくはケイ素を含有する鉱物、またはストロンチウム、亜鉛、マグネシウムもしくはケイ素を含有する塩と置き換えられてもよい。

好ましくは、バイオセラミックは、ヒドロキシアパタイト［Ｃａ_５（ＰＯ_４）_３ＯＨ］、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム［α−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２またはβ−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２］、リン酸水素カルシウム［ＣａＨＰＯ_４］、リン酸水素カルシウム二水和物［ＣａＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ］、リン酸二水素カルシウム［Ｃａ（Ｈ_２ＰＯ_４）_２］、リン酸四カルシウム［Ｃａ_４（ＰＯ_４）_２Ｏ］、リン酸八カルシウム［Ｃａ_８Ｈ_２（ＰＯ_４）_６・５Ｈ_２Ｏ］、硫酸カルシウム［ＣａＳＯ_４］または炭酸カルシウム［ＣａＣＯ_３］である。

好ましくは、バイオセラミックは生体組織マトリクス材料内に粒子の形態で分散される。バイオセラミック粒子は生体組織マトリクス材料において３次元ネットワーク構造を形成する。

好ましくは、バイオセラミック粒子は１〜５００マイクロメートルの粒径を有する。

骨修復のための注入可能な複合材料を調製する方法は、以下の工程：
１）微小繊維生体組織マトリクス材料を調製する工程であって、以下の工程：
１．１）組織原材料を採取し、血液を洗い流し、０．５〜２センチメートル幅および４〜８センチメートル長の細長い小片に切断し、前記小片を−２０℃にて保存する工程と、
１．２）消毒し、滅菌する工程であって、０．１％の質量濃度でアンモニア水溶液を使用することによって組織原材料を滅菌し、組織原材料をその溶液中に浸し、６〜３６時間ゆっくりと振盪し、滅菌脱イオン水で十分に洗浄し、次いで滅菌生理食塩水ですすぐ、消毒し、滅菌する工程と、
１．３）消毒した組織原材料小片を粉砕器によって均質化する、組織を微粉化する工程と、
１．４）脱細胞化溶液で組織原材料を脱細胞化し、続いて残存しているデオキシリボ核酸をデオキシリボヌクレアーゼ溶液で除去し、α−ガラクトシド除去のための溶液でα−ガラクトシドを除去し、過酸化水素、酢酸およびペルオキシ酢酸の混合溶液によってウイルスを不活性化する工程と、
１．５）組織マトリクスを洗浄する工程であって、工程１．４）の処理から生じた残留物を除去するように、０．９％の質量濃度で生理食塩水を使用して工程１．５）における生成物を３回以上洗浄する、組織マトリクスを洗浄する工程と、
１．６）工程１．５）における生成物を３回以上滅菌脱イオン水で洗浄する工程と、
１．７）Ｃｏ６０ガンマ線、Ｘ線または電子ビームによる滅菌後、得られた生体組織マトリクス微小繊維を密閉容器内に密閉し、保存する、最終的に滅菌する工程であって、生体組織マトリクス材料は中性ｐＨで緩衝液中に保存され、緩衝液は生理食塩水およびリン酸緩衝液を含む、滅菌する工程と
を含む、微小繊維生体組織マトリクス材料を調製する工程と、
２）バイオセラミック微小粒子を調製する工程であって、以下の工程：
２．１）特定の用途に応じたバイオセラミックの機械的粉砕、高速ボールミル粉砕、およびふるい分けの工程の後、０．１〜５００マイクロメートルの粒径を有するバイオセラミック微小粒子を得、次いでウイルスを不活性化するために高温および高圧下でバイオセラミック微小粒子を消毒し、滅菌する工程と、
２．２）１：１〜１：５の比でバイオセラミック微小粒子を滅菌生理食塩水と混合し、十分に撹拌し、振動して、均一な懸濁液を得る工程と、
を含む、バイオセラミック微小粒子を調製する工程と、
３）工程１．７）において得られた生体組織マトリクス微小繊維を、微小繊維の重量の１〜５倍の重量の生理食塩水中に懸濁し、生体組織マトリクス微小繊維の均一な懸濁液を得るのに十分に振盪する工程と、
４）本発明による原材料の割合でバイオセラミック粒子を生体組織マトリクス微小繊維と混合する工程と、
５）ボルテックスミキサー上に混合物を配置し、バイオセラミック粒子が生体組織マトリクス微小繊維上に完全に吸収されるまで１時間十分に混合する工程と、
６）２００〜１００００ｒｐｍにて遠心分離することによって過剰な水を除去し、混合物を固体状態で底部に堆積させる工程と、
７）混合物の重量の１〜５倍の重量の生理食塩水を加え、それらをボルテックスミキサー上に配置して、均一な流体混合物を形成する工程であって、水分含有量の質量パーセントが２０〜８０％である、工程と、
８）得られた流体混合物を密閉容器に密閉し、保存し、ガンマ線、Ｘ線または電子ビームで滅菌する、最終的に滅菌する工程と
を含む。

好ましくは、工程１．１）において選択される組織原材料は、表皮、小腸、大腸、隔膜、膀胱、胃および筋腱を含む、哺乳動物の軟組織に由来する。

好ましくは、工程１．４）における脱細胞化溶液は、１リットル当たり１〜１０％のデオキシコール酸ナトリウム、２〜１５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、および１０〜５０ｍＭの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸を含有する。脱細胞化溶液のｐＨは６．８〜７．２である。デオキシリボヌクレアーゼ溶液は、１リットル当たり０．５〜５ｍｇのデオキシリボヌクレアーゼ、１０〜５０ｍＭの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、１〜２０ｍＭの塩化カルシウム、および１〜２０ｍＭの塩化マグネシウムを含有する。α−ガラクトシド除去のための溶液は、１リットル当たり０．２〜１０ｍｇのα−ガラクトシダーゼ、および２〜４０ｍＭの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸を含有する。α−ガラクトシド除去のための溶液のｐＨは５．０〜７．５である。ウイルスを不活性化するために使用される溶液は、０．１０％の過酸化水素、０．５０％の酢酸、および０．５０％のペルオキシ酢酸の混合溶液である。

さらに、バイオセラミック粒子および生体組織マトリクス材料を分散させるための溶液、すなわち工程７）からの生理食塩水は、血液、骨髄、または高濃度の血小板血漿と置き換えられる。

さらに、幹細胞を骨欠損に送達する手段を使用して、幹細胞を骨欠損に送達する方法であって、細胞懸濁液が、骨髄間充織幹細胞、脂肪由来幹細胞または血液から抽出された幹細胞を有して形成され、次いで本発明によって得られた骨修復のための複合材料と混合される、方法が提供される。

本発明の有益な効果は以下の通りである：本発明は、生体組織材料およびバイオセラミックに基づいた注入可能な生体複合材料ならびにそれを調製する方法に関する。複合材料は生体組織材料およびバイオセラミックを効果的に組み合わせ、注入可能な３次元足場生体材料を形成する。本発明による生体組織マトリクス材料は、さらなる物理的または化学的架橋を必要としない、天然に架橋された構造を有し、優れた生体適合性を有し、インビボで完全にゆっくり分解され得る微小繊維である。生体組織材料およびバイオセラミックは様々な様式で組み合わされてもよい。本発明の複合材料において、生体組織材料と混合した後の強化相としてのバイオセラミックは、インビボでの骨組織の再生のための良好な鋳型を提供でき、骨成長を効果的に誘導できる。本発明によって調製される注入可能な材料は、任意のサイズの骨欠損を途切れなく充填するために使用され得、その生物活性をさらに増強するために骨髄を含む生物学的因子がプロセスの間に加えられる。したがって、材料は、外傷、腫瘍切除、骨壊死、および感染などによって引き起こされる骨欠損において広範に使用され得る。

生体組織微小繊維の示差走査熱量計の図である。 生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料の注入性能を示す。 生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料の走査型電子顕微鏡画像である。Ａ．複合材料の典型的な形態；Ｂ．およびＣ．リン酸水素カルシウム微小粒子の分散；Ｄ．コラーゲン微小粒子の三重螺旋構造。 生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料を使用した頭蓋冠欠損修復の移植実験を示す。Ａ．修復後のマウス頭蓋冠欠損の肉眼的図（ｇｒｏｓｓ ｖｉｅｗ）；Ｂ．修復後のマウス頭蓋冠欠損のＸ線観測；Ｃ．修復後のマウス頭蓋冠欠損の組織学的染色。 生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料を新鮮な骨髄と混合した後のマウス頭蓋冠欠損を修復するための移植実験を示す。Ａ．修復後のマウスの頭蓋骨のＸ線観測；Ｂ．修復後のマウスの頭蓋骨のマイクロＣＴスキャン；Ｃ．マイクロＣＴスキャンの定量分析。 生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料を新鮮な骨髄と混合した後のマウスの頭蓋骨を修復した後の組織学的観察を示す。Ａ：フォン−コッサ染色（骨カルシウム沈着）；Ｂ．マッソン（ＭＡＳＳＯＮ）トリクローム染色法；Ｃ．ヘマトキシリン−エオシン染色法。

本発明を、実施例を参照して詳細に記載し、それらは本発明を限定するというより本発明を例示することを意図する。

実施例１：生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料の調製および特徴付け
１）脱細胞化し、抗原を抽出したブタの真皮から得、Ｃｏ６０ガンマ線によって滅菌した微小繊維生体組織マトリクス材料を秤量した。その材料を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で０．９％の生理食塩水に懸濁した。
２）材料を滅菌脱イオン水で３回以上洗浄した。調製した脱細胞化マトリクス微小繊維のパラメーターを図１に示した。それは０．０５〜０．９５の平均アスペクト比および４０〜１０００μｍの粒径分布を有する。
３）リン酸水素カルシウム微小粒子を秤量し、滅菌脱イオン水を加えて１０ｍｇ／ｍＬの均質な懸濁液を調製した。
４）リン酸水素カルシウム微小粒子を、４０ミクロンの孔経を有するフィルター膜に迅速に通過させ、その中において大きなサイズの凝集した粒子を除去した。
５）懸濁液を１２００ｒｐｍにて２分間遠心分離し、上清を除去した。
６）０．５ミリリットルの滅菌脱イオン水を１ｇのリン酸水素カルシウム微小粒子に加えて、繰り返しボルテックス振動し、撹拌することによってペーストを調製した。
７）リン酸水素カルシウム微小粒子を、４：６の脱細胞化微小繊維マトリクス対リン酸水素カルシウム微小粒子の質量比で脱細胞化微小繊維マトリクスに加えた。
８）リン酸水素カルシウム微小粒子および脱細胞化微小繊維マトリクスをボルテックスミキサー上に配置し、それらが均質に混合するように１時間完全に混合した。
９）混合物を１２００ｒｐｍにて２分間遠心分離し、上清を除去した。
１０）２重量部の滅菌生理食塩水を、４重量部の脱細胞化マトリクス微小繊維および６重量部のリン酸水素カルシウム微小粒子に加えた。
１１）注入可能な複合材料を十分な撹拌後に得た。図２に示すように、この材料は標準的な注射器を用いて患者の創傷に適用できる。
１２）複合材料をペーストとして保存し、その微小構造を図３に示した。走査型電子顕微鏡画像により、リン酸水素カルシウム微小粒子が、明らかな凝集なしに脱細胞化マトリクス微小繊維周囲に均一に分散されることが示される。さらに、高倍率下での画像により、脱細胞化マトリクスは多量のコラーゲン繊維からなり、コラーゲン繊維はその天然の三重螺旋構造を完全に維持し、ミセルとして複合材料内に分散することが示される。

実施例２：注入可能な生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料の骨欠損修復実験
本発明に従って調製した注入可能な生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料を使用して、胸腺を有さないヌードマウスのマウス頭蓋冠欠損モデルによるこの材料の骨形成能力を評価した。マウス（６症例）を麻酔し、次いでその頭部の毛を剃り落とした。１センチメートルの皮膚切開をマウス頭部の矢状縫合に沿って切断した。３．５ミリメートルの直径を有する円形欠損を、皮膚を離して置いた後、歯科用ドリルを用いて頭蓋骨に行った。骨欠損を本発明によって調製した材料で充填し、次いで創傷を縫合した。６週後、マウスを安楽死させた。修復後の頭蓋骨を肉眼で観察した。材料および周囲の骨組織は十分に融合したことが見出された。Ｘ線観測により、多量の骨が欠損において形成されることが示される。また、組織学的観察により、新たな骨が欠損内に首尾良く形成したことが示された。骨欠損は細胞により充填されることが見出される。骨カルシウム染色により、多量の骨カルシウムが欠損に沈着することが示される。骨欠損は、図４に示すように完全に架橋される。この実施例は、いかなる生物学的活性因子も幹細胞も加えずに、生体組織のみで大面積の骨欠損の修復を達成する初めての実施例である。

実施例３：新たな骨髄のための担体としての注入可能な生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料の骨欠損修復環境
実施例１において調製した注入可能な生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料を新たなマウス骨髄吸引物と混合して、ペースト状材料を調製した。実施例２において使用したマウスモデルを使用した。骨欠損を新たな骨髄吸引物を負荷した複合材料で充填し、次いで創傷を縫合した。６週後、Ｘ線観察により、骨欠損全体が新たに形成された骨組織で充填されたことが明らかになった。組織間隙は骨欠損の端部に見出されなかった。マイクロＣＴスキャンにより、骨欠損全体が新たに形成された骨組織で充填されるという同じ結果が示され、途切れのない接続が新たな骨とインプラントとの間で形成された。骨形成の定量的解析により、実施例１において調製した材料が、Ｈｅａｌｏｓ（登録商標）（Ｊ＆Ｊ製品）よりはるかに良好な骨を形成でき、その骨密度は自家移植の骨組織に近かったことが示された（図５）。組織学的観察により、骨欠損全体が石灰化骨組織により架橋されていることが示された。多量の骨梁が形成された。マッソントリクローム染色により、多量のコラーゲンが骨欠損部位に沈着したことが示され、骨芽細胞が新たな骨に見出され、それらが新たな骨の形成に関与していることが実証される。ヘマトキシリン−エオシン染色法の結果は以前の２つの染色法で得られた結果と一致した。線維組織は骨欠損周囲に見出されず、骨癒合が達成され、したがってこの実施例に記載される修復方法は実行可能な臨床的戦略である。

前述は、本発明のいくつかの特定の実施形態の例示のみであるが、本発明の保護範囲を限定すると解釈されるべきではない。本発明の趣旨に従って等価の変更または修飾が本発明の保護範囲内に入るとみなされる。

Claims (9)

1. 以下の原材料：１〜７重量部の生体組織マトリクス材料、１〜９重量部のバイオセラミックおよび２〜８重量部の生理食塩水または他の等張水溶液を含み、
   前記生体組織マトリクス材料が、哺乳動物の軟組織から調製され、主にコラーゲン繊維から構成される、その天然架橋構造を維持する細胞外マトリクスであり、
   前記生体組織マトリクス材料が微小繊維形状を有し、前記微小繊維生体組織マトリクス材料が１〜１５００マイクロメートルの直径を有し、前記微小繊維生体組織マトリクス材料のアスペクト比が０．０５〜０．９５の範囲であることを特徴とする、骨修復のための注入可能な複合材料。
2. 前記哺乳動物の軟組織が、ブタ由来の軟組織、ウシ由来の軟組織、または人体由来の軟組織であり、前記軟組織は、表皮、真皮、血管、横隔膜、筋腱、靱帯、大腸、小腸および神経組織を含むことを特徴とする、請求項１に記載の骨修復のための注入可能な複合材料。
3. 前記バイオセラミックが、ヒドロキシアパタイト、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸水素カルシウム二水和物、リン酸二水素カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、硫酸カルシウムまたは炭酸カルシウムであることを特徴とする、請求項１に記載の骨修復のための注入可能な複合材料。
4. 前記バイオセラミックが前記生体組織マトリクス材料内に粒子の形態で分散し、バイオセラミック粒子が前記生体組織マトリクス材料において３次元ネットワーク構造を形成し、前記バイオセラミック粒子が１〜５００マイクロメートルの粒径を有することを特徴とする、請求項３に記載の骨修復のための注入可能な複合材料。
5. 以下の原材料：１〜７重量部の生体組織マトリクス材料と、１〜９重量部のバイオガラス、またはストロンチウム、亜鉛、マグネシウムもしくはケイ素を含有する鉱物、またはストロンチウム、亜鉛、マグネシウムもしくはケイ素を含有する塩と、２〜８重量部の生理食塩水または他の等張水溶液と、を含み、
   前記生体組織マトリクス材料が、哺乳動物の軟組織から調製され、主にコラーゲン繊維から構成される、その天然架橋構造を維持する細胞外マトリクスであり、
   前記生体組織マトリクス材料が微小繊維形状を有し、前記微小繊維生体組織マトリクス材料が１〜１５００マイクロメートルの直径を有し、前記微小繊維生体組織マトリクス材料のアスペクト比が０．０５〜０．９５の範囲であることを特徴とする、骨修復のための注入可能な複合材料。
6. 以下の工程：
   １）微小繊維生体組織マトリクス材料を調製する工程であって、以下の工程：
   １．１）組織原材料を採取し、血液を洗い流し、０．５〜２センチメートル幅および４〜８センチメートル長の細長い小片に切断し、前記小片を−２０℃にて保存する工程と、
   １．２）消毒し、滅菌する工程であって、０．１％の重量パーセンテージでアンモニア水溶液を使用することによって前記組織原材料を滅菌し、前記組織原材料を前記溶液中に浸し、６〜３６時間ゆっくりと振盪し、滅菌脱イオン水で十分に洗浄し、次いで滅菌生理食塩水ですすぐ、消毒し、滅菌する工程と、
   １．３）消毒した組織原材料を粉砕器によって微小サイズまで均質化する、組織を微粉化する工程と、
   １．４）脱細胞化溶液で前記組織を脱細胞化し、続いて残存しているデオキシリボ核酸をデオキシリボヌクレアーゼ溶液で除去し、α−ガラクトシド除去のための溶液でα−ガラクトシドを除去し、過酸化水素、酢酸およびペルオキシ酢酸の混合溶液によってウイルスを不活性化する工程と、
   １．５）組織マトリクスを洗浄する工程であって、工程１．４）の処理から生じた残留物を除去するように、０．９％の重量パーセントで生理食塩水を使用して工程１．５）における生成物を３回以上洗浄する、組織マトリクスを洗浄する工程と、
   １．６）工程１．５）における生成物を３回以上滅菌脱イオン水で洗浄する工程と、
   １．７）Ｃｏ６０ガンマ線、Ｘ線または電子ビームによる滅菌後、得られた生体組織マトリクス微小繊維を密閉容器内に密閉し、保存する、最終的に滅菌する工程であって、生体組織マトリクス材料は中性ｐＨで緩衝液中に保存され、前記緩衝液は生理食塩水およびリン酸緩衝液を含む、滅菌する工程と
   を含む、微小繊維生体組織マトリクス材料を調製する工程と、
   ２）バイオセラミック微小粒子を調製する工程であって、以下の工程：
   ２．１）特定の用途に応じたバイオセラミックの機械的粉砕、高速ボールミル粉砕、およびふるい分けの工程の後、０．１〜５００ミクロンの粒径を有するバイオセラミック微小粒子を得、次いでウイルスを不活性化するために高温および高圧下でバイオセラミック微小粒子を消毒し、滅菌する工程と、
   ２．２）１：１〜１：５の比でバイオセラミック微小粒子を滅菌生理食塩水と混合し、十分に撹拌し、振動して、均一な懸濁液を得る工程と、
   を含む、バイオセラミック微小粒子を調製する工程と、
   ３）工程１．７）において得られた生体組織マトリクス微小繊維を、微小繊維の重量の１〜５倍の重量の生理食塩水中に懸濁し、生体組織マトリクス微小繊維の均一な懸濁液を得るのに十分に振盪する工程と、
   ４）請求項１に記載の原材料の割合でバイオセラミック粒子を生体組織マトリクス微小繊維と混合する工程と、
   ５）ボルテックスミキサー上に混合物を配置し、バイオセラミック粒子が生体組織マトリクス微小繊維上に完全に吸収されるまで１時間十分に混合する工程と、
   ６）２００〜１００００ｒｐｍにて遠心分離することによって過剰な水を除去し、混合物を固体状態で底部に堆積させる工程と、
   ７）混合物の重量の１〜５倍の重量の生理食塩水を加え、それらをボルテックスミキサー上に配置して、均一な流体混合物を形成する工程であって、水分含有量の質量パーセントが２０〜８０％である、工程と、
   ８）得られた流体混合物を密閉容器に密閉し、保存し、ガンマ線、Ｘ線または電子ビームで滅菌する、最終的に滅菌する工程と
   を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の骨修復のための注入可能な複合材料を調製する方法。
7. 工程１．４）における前記脱細胞化溶液は、１リットル当たり１〜１０％のデオキシコール酸ナトリウム、２〜１５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、および１０〜５０ｍＭの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸を含有し、前記脱細胞化溶液のｐＨは６．８〜７．２であり、前記デオキシリボヌクレアーゼ溶液は、１リットル当たり１０〜５０ｍＭの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、１〜２０ｍＭの塩化カルシウム、１〜２０ｍＭの塩化マグネシウムおよび０．５〜５ｍｇのデオキシリボヌクレアーゼを含有し、α−ガラクトシド除去のための前記溶液は、１リットル当たり０．２〜１０ｍｇのα−ガラクトシダーゼ、および２〜４０ｍＭの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸を含有し、α−ガラクトシド除去のための前記溶液のｐＨは５．０〜７．５であり、ウイルスを不活性化するために使用される溶液は、０．１０％の過酸化水素、０．５０％の酢酸、および０．５０％のペルオキシ酢酸の混合溶液であることを特徴とする、請求項６に記載の骨修復のための注入可能な複合材料を調製する方法。
8. 以下の工程：
   １）微小繊維生体組織マトリクス材料を調製する工程であって、以下の工程：
   １．１）組織原材料を採取し、血液を洗い流し、０．５〜２センチメートル幅および４〜８センチメートル長の細長い小片に切断し、前記小片を−２０℃にて保存する工程と、
   １．２）消毒し、滅菌する工程であって、０．１％の重量パーセンテージでアンモニア水溶液を使用することによって前記組織原材料を滅菌し、前記組織原材料を前記溶液中に浸し、６〜３６時間ゆっくりと振盪し、滅菌脱イオン水で十分に洗浄し、次いで滅菌生理食塩水ですすぐ、消毒し、滅菌する工程と、
   １．３）消毒した組織原材料を粉砕器によって微小サイズまで均質化する、組織を微粉化する工程と、
   １．４）脱細胞化溶液で前記組織を脱細胞化し、続いて残存しているデオキシリボ核酸をデオキシリボヌクレアーゼ溶液で除去し、α−ガラクトシド除去のための溶液でα−ガラクトシドを除去し、過酸化水素、酢酸およびペルオキシ酢酸の混合溶液によってウイルスを不活性化する工程と、
   １．５）組織マトリクスを洗浄する工程であって、工程１．４）の処理から生じた残留物を除去するように、０．９％の重量パーセントで生理食塩水を使用して工程１．５）における生成物を３回以上洗浄する、組織マトリクスを洗浄する工程と、
   １．６）工程１．５）における生成物を３回以上滅菌脱イオン水で洗浄する工程と、
   １．７）Ｃｏ６０ガンマ線、Ｘ線または電子ビームによる滅菌後、得られた生体組織マトリクス微小繊維を密閉容器内に密閉し、保存する、最終的に滅菌する工程であって、生体組織マトリクス材料は中性ｐＨで緩衝液中に保存され、前記緩衝液は生理食塩水およびリン酸緩衝液を含む、滅菌する工程と
   を含む、微小繊維生体組織マトリクス材料を調製する工程と、
   ２）バイオセラミック微小粒子を調製する工程であって、以下の工程：
   ２．１）特定の用途に応じたバイオセラミックの機械的粉砕、高速ボールミル粉砕、およびふるい分けの工程の後、０．１〜５００ミクロンの粒径を有するバイオセラミック微小粒子を得、次いでウイルスを不活性化するために高温および高圧下でバイオセラミック微小粒子を消毒し、滅菌する工程と、
   ２．２）１：１〜１：５の比でバイオセラミック微小粒子を滅菌生理食塩水と混合し、十分に撹拌し、振動して、均一な懸濁液を得る工程と、
   を含む、バイオセラミック微小粒子を調製する工程と、
   ３）工程１．７）において得られた生体組織マトリクス微小繊維を、微小繊維の重量の１〜５倍の重量の生理食塩水中に懸濁し、生体組織マトリクス微小繊維の均一な懸濁液を得るのに十分に振盪する工程と、
   ４）請求項１に記載の原材料の割合でバイオセラミック粒子を生体組織マトリクス微小繊維と混合する工程と、
   ５）ボルテックスミキサー上に混合物を配置し、バイオセラミック粒子が生体組織マトリクス微小繊維上に完全に吸収されるまで１時間十分に混合する工程と、
   ６）２００〜１００００ｒｐｍにて遠心分離することによって過剰な水を除去し、混合物を固体状態で底部に堆積させる工程と、
   ７）混合物の重量の１〜５倍の重量の血液、骨髄、または高濃度の血小板血漿を加え、それらをボルテックスミキサー上に配置して、均一な流体混合物を形成する工程であって、水分含有量の質量パーセントが２０〜８０％である、工程と、
   ８）得られた流体混合物を密閉容器に密閉し、保存し、ガンマ線、Ｘ線または電子ビームで滅菌する、最終的に滅菌する工程と
   を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の骨修復のための注入可能な複合材料を調製する方法。
9. 骨髄間充織幹細胞、脂肪由来幹細胞または血液から抽出された幹細胞から形成される細胞懸濁液と、請求項１〜５のいずれか一項に記載の骨修復のための複合材料と、を含むことを特徴とする、混合物。