CN114080229A - 用于分离海洋双壳软体动物壳的有机矿物层中所含分子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种包括用于分开、提取和/或分离海洋双壳软体动物壳的内文石有机矿物层和外方解石有机矿物层中所含的全部或部分组分的同时和/或顺次步骤的方法。

Description

用于分离海洋双壳软体动物壳的有机矿物层中所含分子的 方法

技术领域

本发明涉及用于分开、提取和/或分离海洋双壳软体动物壳的内文石有机矿物层和外方解石有机矿物层中包含的全部或部分组分的同时和/或顺次步骤的实施，所述海洋双壳软体动物为诸如：大珠母贝(Pinctada Maxima)-黑蝶真珠蛤(Margaritifera)-马氏珠母贝(Martensi)-合浦珍珠贝(Fucata)，以及库氏砗磲(Tridacnae Gigas)-长砗磲(Maxima)-菱砗磲(Hippopus Hippopus)-无鳞砗磲(Derasa)-魔鬼砗磲(Tevaroa)-番红砗磲(Crocea)-鳞砗磲(Squamosa)、瓷口砗磲(Porcelanus)。这些提取组分的组合和重排用于配制医疗设备和治疗导向制剂，用于整形外科、微创外科、口腔颌面外科、皮肤科、美容医学和皮肤化妆品。

背景技术

上述软体动物壳内文石有机矿物层的结构和物理化学组成包含两个级分：由文石生物晶体组成的矿物级分，在正交系统中结晶的亚稳态、多晶型、生物成因形式的碳酸钙CaCO₃，以及主要由蛋白质和非蛋白质组分、色素(黑色素、β-胡萝卜素等)、脂肪酸和总脂类(尤其是多不饱和脂类)组成的有机级分。

相同软体动物壳的外方解石有机矿物层也由矿物级分和有机级分组成，所述矿物级分由在菱面体系统中结晶的方解石棱柱(碳酸钙的另一种多晶型)组成，并且有机级分也由可溶性和不溶性蛋白质和非蛋白质成分、色素和金属组成。外方解石有机矿物层比内文石有机矿物层更富含黑色素和与卟啉和酶相关的金属。

通常，上述软体动物壳内文石和外方解石有机矿物层的有机级分中所含的活性分子是通过冷水解提取的蛋白质和非蛋白质组分。这些组分是可溶性和不溶性生物聚合物，包括蛋白质、多肽和多糖，以及生物单体、氨基酸和单糖。它们都具有许多生物学和药理学、骨诱导和愈合特性等。这些特性是由于与生长因子相关的糖蛋白的存在。但是，通常用于提取这些分子的方法并不能提取所有分子，尤其是那些具有所需特性的低分子量分子，主要是抗生物质，诸如糖胺，以及脂质和多不饱和脂肪酸，而没有忘记色素、金属酶和金属卟啉。已知所述软体动物壳的内文石有机矿物层的有机级分尤其含有脂肪酸和总脂类(棕榈酸、硬脂酸)；它是多不饱和脂肪酸含量最丰富的天然海洋生物材料，比例为0.2％-3％。这些主要是极性和非极性化合物，以羟基化和非羟基化神经酰胺、硫酸胆固醇和/或醋酸酯、甘油三酯和omega-3s为代表。

当已知脂肪酸具有抗炎和免疫特性时，它们似乎在某些肿瘤过程、类风湿性关节炎和自身免疫疾病的发展中发挥抑制作用，并且这些相同的脂质和脂肪酸诱导丝聚蛋白、具有膜转谷氨酰胺酶抑制特性的皮肤表层的蛋白质(涉及某些皮肤病的一组不溶性蛋白质聚合物)的过度表达，因此它们在配制用于治疗目的的制剂中的优势是可以理解的。

技术问题

因此，需要一种方法来优化海洋双壳软体动物壳的内文石和外方解石有机矿物层中所含分子的分离。

发明人的功劳是，他们已经通过一种可以实施一系列机械、声学、物理和化学步骤的方法来满足这一需求，以优化壳的内文石和外方解石有机矿物层中所含分子的分离、纯化和物理化学反应性，并增强它们的性能。

发明内容

因此，本发明的第一个主题是用于分离海洋双壳软体动物壳的文石有机矿物层和/或方解石有机矿物层中所含分子的方法，其包括以下步骤：

(a)将文石有机矿物层和/或方解石有机矿物层研磨以获得文石粉和/或方解石粉；

(b)热渗滤所述文石粉和/或所述方解石粉以获得：

-一方面，饱和文石溶液和/或饱和方解石溶液，所述饱和文石溶液包含文石液相和文石固相，并且所述饱和方解石溶液包含方解石液相和方解石固相，和

-另一方面，文石渗滤粉和/或方解石渗滤粉；

(c)分离所述饱和文石溶液和/或所述饱和方解石溶液以回收：

-一方面，文石液相和/或方解石液相，和

-另一方面，文石固相和/或方解石固相；以及

(d)用超临界CO₂处理所述文石渗滤粉和/或所述方解石渗滤粉以获得：

-一方面，超临界CO₂处理的文石粉和/或超临界CO₂处理的方解石粉，和

-另一方面，包含在所述文石有机矿物层和/或所述方解石有机矿物层中的全部或部分可溶性分子。

为了本发明的目的，“超临界CO₂处理的文石粉”是指已经去除了包含在文石有机矿物层中的所有或一些可溶性分子的粉末。

为了本发明的目的，“超临界CO₂处理的方解石粉”是指已经去除了包含在方解石有机矿物层中的所有或一些可溶性分子的粉末。

取决于生产方法，海洋双壳软体动物可以选自大珠母贝、黑蝶真珠蛤、马氏珠母贝、合浦珍珠贝、库氏砗磲、长砗磲、菱砗磲、无鳞砗磲、魔鬼砗磲、番红砗磲、鳞砗磲、瓷口砗磲及其混合物。

根据一个实施方案，壳可以在研磨步骤(a)之前经历碾磨步骤以获得，一方面，文石有机矿物层和，另一方面，方解石有机矿物层，任选地，在所述碾磨步骤之前是预处理壳的步骤，其选自清洁、超声处理、漂洗、灭菌、干燥、浸入等渗浴及其混用。

根据一个实施方案，在碾磨步骤中获得和/或在研磨步骤(a)中使用的方解石有机矿物层可以是粉末状的并且粒径为2mm-500μm。

根据一个具体实施方案，研磨步骤(a)可以通过行星式研磨进行。

根据一个非常具体的实施方案，步骤(a)的行星式研磨可以包括一个或多个循环，特别是两个循环。例如，每个行星研磨循环可以通过干法或湿法进行，特别是第一研磨循环可以通过干法进行并且第二循环可以通过湿法进行。

根据一个实施方案，研磨步骤(a)可以通过以下方式进行：

-粉碎文石有机矿物层和/或方解石有机矿物层以获得粉碎的文石粉和/或粉碎的方解石粉，然后

-研磨粉碎的文石粉和/或粉碎的方解石粉以获得文石粉和/或方解石粉。

根据一个具体实施方案，粉碎的文石粉和/或粉碎的方解石粉的研磨可以通过如上所述的行星式研磨进行。

根据一个实施方案，粉碎的文石粉和/或粉碎的方解石粉的粒径可以为10μm-2mm。

根据一个实施方案，在研磨步骤(a)中获得的文石粉和/或方解石粉的粒径可以为50nm-300μm。

根据一个实施方案，热渗滤步骤(b)可以通过用温度高于30℃，特别是35℃-75℃，尤其是40℃-50℃的液体湿筛进行。

根据一个实施方案，在所述热渗滤步骤(b)中使用的液体可以是水溶液，特别是包含甲醇的水溶液、包含尿素溶液的水溶液或其混合物。

根据一个具体实施方案，该水溶液可以含有1％-10％的甲醇，特别是2％-7％的甲醇，更特别是4.5％-5.5％的甲醇。

根据一个具体实施方案，热渗滤步骤(b)可以用振动筛进行，该振动筛包括：

-带有开口的盖，以接收用于液体入口的管，

-用于收集文石渗滤粉和/或方解石渗滤粉的多个筛，特别是2-10个筛，更特别地5-7个筛，甚至更特别地6个筛，并且在液体流动方向上两个连续筛孔的孔径减小，

-带有导管的收集底部，以收集饱和文石溶液和/或饱和方解石溶液。

根据一个非常具体的实施方案，振动筛可包括6个筛，所述筛在液体流动方向上的孔径为315μm、250μm、125μm、45μm、20μm和10μm。

根据一个实施方案，文石渗滤粉和/或方解石渗滤粉的粒径可以大于振动筛的筛直径中最小直径的筛的直径，特别是粒径大于10μm，更特别是粒径为10μm-300μm。

根据一个实施方案，饱和文石溶液的文石液相可包括包含在文石有机矿物层中的水溶性和脂溶性分子。

根据一个实施方案，饱和文石溶液的文石固相可以包含：

-文石有机矿物层中所含的不溶性分子，诸如不溶性蛋白质和非蛋白质分子，和

-粒径小于或等于筛直径的粉末，所述筛的直径在振动筛的筛直径中最小，特别是粒径小于或等于10μm，特别是50nm-10μm。

根据一个实施方案，饱和方解石溶液的方解石液相可包括包含在方解石有机矿物层中的水溶性和脂溶性分子。

根据一个实施方案，饱和方解石溶液的方解石固相可以包含：

-方解石有机矿物层中所含的不溶性分子，诸如不溶性蛋白质和非蛋白质分子，和

-粒径小于或等于筛直径的粉末，所述筛的直径在振动筛的筛直径中最小，特别是粒径小于或等于10μm，特别是50nm -10μm。

根据实施的优选实施方案，分离步骤(c)通过离心进行并且回收的液相称为上清液并且回收的固相称为沉淀(pellet)。

根据一个实施方案，文石丸粒粉和/或方解石丸粒粉，特别是文石丸粒粉，可以经历球化步骤。

根据一个实施方案，文石丸粒粉和/或方解石丸粒粉，特别是方解丸粒粉，可以经历超临界CO₂处理步骤(d)。

根据一个实施方案，超临界CO₂处理步骤(d)可以在包括以下的装置中实施：

-用于气态CO₂的入口和储存罐，

-用于将气态CO₂转化为液态CO₂的冷凝器，

-液态CO₂储存罐，

-用于将液态CO₂转化为超临界CO₂的热交换器，

-发生可溶分子提取的反应器，和

-一个或多个提取器。

在超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子至少是可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物中的那些。

可溶性脂肪酸、脂质和色素不能通过本专利申请的发明人提交的FR3 037 801中公开的可溶性生物聚合物提取方法获得。

根据一个具体实施方案，超临界CO₂处理的文石粉的粒径小于或等于文石渗滤粉的粒径，特别是等于文石渗滤粉的粒径。

根据一个具体实施方案，超临界CO₂处理的方解石粉的粒径小于或等于方解石渗滤粉的粒径，特别是等于方解石渗滤粉的粒径。

根据一个具体实施方案，所述分离方法可在所述通过离心进行的分离步骤(c)之后包括以下步骤：

(e)过滤所述文石上清液和/或所述方解石上清液以获得经过滤的文石上清液和/或经过滤的方解石上清液；

(f)将所述经过滤的文石上清液和/或所述经过滤的方解石上清液进行浓缩以获得文石浓缩物和/或方解石浓缩物；

(g)对所述文石浓缩物和/或所述方解石浓缩物进行超声处理以获得文石胶体乳液和/或方解石胶体乳液。

根据一个实施方案，过滤步骤(e)可以在硅藻土床或膜上进行。

根据一个实施方案，文石浓缩物和/或方解石浓缩物可以包含至少一种选自Mn、Fe、Zn、Ba、Sr、Mg、Cu、Al、Ni、V、Cr、Mo及其混合物的金属。

根据一个实施方案，超声处理步骤(g)可以用超声波发生器以20kHz-200kHz的频率进行。

根据一个实施方案，该方法可以在所述超临界CO₂处理步骤(d)之后包括以下步骤：

(h)冷酸解所述超临界CO₂处理的文石粉和/或所述超临界CO₂处理的方解石粉以提取存在于所述粉末中的不溶性分子；以及

(i)洗涤并超速离心以分离并回收所述不溶性分子。

在冷酸解(h)以及洗涤并超速离心(i)的步骤中回收的不溶性分子至少是来自不溶性生物聚合物、不溶性有机颜料及其混合物的那些。

根据一个实施方案，冷酸解步骤(h)可以通过以下进行：

-在低于10℃，特别是低于5℃，更特别是在1-4℃的温度下，和

-使用包含乙酸并且其pH为酸性，特别是低于6，更特别是低于4.5的水溶液。

根据一个具体实施方案，冷酸解(h)以及洗涤并超速离心(i)的步骤可以进行一次或多次。

根据一个实施方案，然后可以干燥回收的不溶性分子以获得不溶性分子的干提取物。

根据一个非常具体的实施方案，分别对文石有机矿物层和方解石有机矿物层进行研磨步骤(a)以获得文石粉和方解石粉。

根据一个非常具体的实施方案，分别对文石粉和方解石粉进行热渗滤步骤(b)以获得：

-一方面，饱和文石溶液，和另一方面，文石渗滤粉，和

-一方面，饱和方解石溶液，和另一方面，方解石渗滤粉。

根据一个非常具体的实施方案，分别对饱和文石溶液和饱和方解石溶液进行分离步骤(c)以回收：

-一方面，文石液相，和另一方面，文石固相，和

-一方面，方解石液相，和另一方面，方解石固相。

根据一个非常具体的实施方案，通过离心并分别对饱和文石溶液和饱和方解石溶液进行分离步骤(c)以回收：

-一方面，文石上清液，和另一方面，文石沉淀，以及

-一方面，方解石上清液，和另一方面，方解石沉淀。

根据一个非常具体的实施方案，分别对文石渗滤粉以及方解石渗滤粉和方解石沉淀的混合物进行超临界CO₂处理步骤(d)。

根据一个特定实施方案：

-分别对文石有机矿物层和方解石有机矿物层进行研磨步骤(a)以获得文石粉和方解石粉；

-分别对文石粉和方解石粉进行热渗滤步骤(b)以获得：

-一方面，饱和文石溶液，和另一方面，文石渗滤粉，和

-一方面，饱和方解石溶液，和另一方面，方解石渗滤粉；

-通过离心并分别对饱和文石溶液和饱和方解石溶液进行分离步骤(c)以回收：

-一方面，文石上清液，和另一方面，文石沉淀，和

-一方面，方解石上清液，和另一方面，方解石沉淀；以及

-分别对文石渗滤粉以及方解石渗滤粉和方解石沉淀的混合物进行超临界CO₂处理步骤(d)。

根据一个非常具体的实施方案，分别对文石上清液和方解石上清液进行过滤步骤(e)以获得经过滤的文石上清液和经过滤的方解石上清液。

根据一个非常具体的实施方案，对经过滤的文石上清液和经过滤的方解石上清液的混合物进行浓缩步骤(f)以获得浓缩物的混合物。

根据一个非常具体的实施方案，对浓缩物的混合物进行超声处理步骤(g)以获得胶体乳液的混合物。

根据一个非常具体的实施方案，对超临界CO₂处理的文石粉和超临界CO₂处理的方解石粉的混合物进行冷酸解步骤(h)，以从所述粉末混合物中提取不溶性分子。

根据一个非常具体的实施方案，进行洗涤并超离心步骤(i)以分离并回收在冷酸解步骤(h)期间从超临界CO₂处理的文石粉和CO₂处理的方解石粉的混合物中提取的不溶性分子。

根据一个特定实施方案：

-分别对文石上清液和经过滤的方解石上清液进行过滤步骤(e)以获得经过滤的文石上清液和经过滤的方解石上清液；

-对经过滤的文石上清液和经过滤的方解石上清液的混合物进行浓缩步骤(f)以获得浓缩物的混合物；

-对浓缩物的混合物进行超声处理步骤(g)以获得胶体乳液的混合物；

-对超临界CO₂处理的文石粉和超临界CO₂处理的方解石粉的混合物进行冷酸解步骤(h)，以从所述粉末的混合物中提取不溶性分子；以及-进行洗涤并超离心步骤(i)以分离并回收在冷酸解步骤(h)中从超临界CO₂处理的文石粉和CO₂处理的方解石粉的混合物中提取的不溶性分子。

根据一个优选实施方案：

-分别对文石有机矿物层和方解石有机矿物层进行研磨步骤(a)以获得文石粉和方解石粉；

-分别对文石粉和方解石粉进行热渗滤步骤(b)以获得：

-一方面，饱和文石溶液，和另一方面，文石渗滤粉，和

-一方面，饱和方解石溶液，和另一方面，方解石渗滤粉；

-通过离心并分别对饱和文石溶液和饱和方解石溶液进行分离步骤(c)以回收：

-一方面，文石上清液，和另一方面，文石沉淀，和

-一方面，方解石上清液，和另一方面，方解石沉淀；以及

-分别对文石渗滤粉以及方解石渗滤粉和方解石沉淀的混合物进行超临界CO₂处理步骤(d)；

-分别对文石上清液和经过滤的方解石上清液进行过滤步骤(e)以获得经过滤的文石上清液和经过滤的方解石上清液；

-对经过滤的文石上清液和经过滤的方解石上清液的混合物进行浓缩步骤(f)以获得浓缩物的混合物；

-对浓缩物的混合物进行超声处理步骤(g)以获得胶体乳液的混合物；

-对超临界CO₂处理的文石粉和超临界CO₂处理的方解石粉的混合物进行冷酸解步骤(h)以从所述粉末的混合物中提取不溶性分子；和

-进行洗涤并超离心步骤(i)以分离并回收在冷酸解步骤(h)中从超临界CO₂处理的文石粉和CO₂处理的方解石粉的混合物中提取的不溶性分子。

根据一个具体实施方案，本发明的分离方法可以获得：

-在分离步骤(c)期间回收的文石固相和/或方解石固相，所述固相可以被球化，

-在超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的可溶性分子，

-在超声处理步骤(g)中获得的文石胶体乳液和/或方解石胶体乳液，或

-在冷酸解(h)以及洗涤并超速离心(i)步骤中回收的不溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的不溶性分子。

根据一个非常具体的实施方案，本发明的分离方法可以获得：

-在分离步骤(c)期间回收的文石固相，所述文石固相任选地被球化，

-步骤(g)中获得的胶体乳液的混合物，

-在超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的可溶性分子，和

-在冷酸解(h)以及洗涤并超速离心(i)步骤中回收的不溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的不溶性分子。

当分离步骤(c)通过离心进行时，则本发明的分离方法可以获得代替文石固相的文石沉淀和/或代替方解石固体的方解石沉淀，所述沉淀任选地被球化。

本发明的另一个主题是组合物，其包含：

-在如上文关于分离方法所述的分离步骤(c)期间回收的文石固相和/或方解石固相，所述固相任选地被球化，

和至少一种选自以下的组分：

-在如上文关于分离方法所述的超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的可溶性分子，

-在如上文关于分离方法所述的超声处理步骤(g)中获得的文石和/或方解石胶体乳液，和

-在冷酸解(h)以及洗涤并超速离心(i)步骤中回收的不溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的不溶性分子。

根据一个具体实施方案，该组合物可以包含：

-在如上文关于分离方法所述的分离步骤(c)期间回收的文石固相，所述文石固相任选地被球化，

和至少一种选自以下的组分：

-在如上文关于分离方法所述的超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的可溶性分子，

-在如上文关于分离方法所述的超声处理步骤(g)中获得的胶体乳液的混合物，

-在冷酸解(h)以及洗涤并超速离心(i)步骤中回收的不溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的不溶性分子。

根据一个实施方案，该组合物可以由这些化合物的混合产生。

根据一个实施方案，该组合物还可以包括精油和植物油的混合物。

根据一个具体实施方案，该组合物包含：

-在如上文关于分离方法所述的分离步骤(c)期间回收的文石固相和/或方解石固相，所述固相任选地被球化，

-在如上文关于分离方法所述的超声处理步骤(g)中获得的文石和/或方解石胶体乳液。

根据一个非常具体的实施方案，该组合物可以包含：

-在如上文关于分离方法所述的分离步骤(c)期间回收的文石固相，所述文石固相任选地被球化，和

-在如上文关于分离方法所述的超声处理步骤(g)中获得的胶体乳液的混合物。

根据一个具体实施方案，该组合物可以包含：

-在如上文关于分离方法所述的分离步骤(c)期间回收的文石固相和/或方解石固相，所述固相任选地被球化，

-在如上文关于分离方法所述的超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的可溶性分子，和

-在如上文关于分离方法所述的超声处理步骤(g)中获得的文石和/或方解石胶体乳液。

根据一个非常具体的实施方案，该组合物可以包含：

-在如上文关于分离方法所述的分离步骤(c)期间回收的文石固相，所述文石固相任选地被球化，

-在如上文关于分离方法所述的超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子，特别是至少可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物中的可溶性分子，和

-在如上文关于分离方法所述的超声处理步骤(g)中获得的胶体乳液的混合物。

根据一个具体实施方案，该组合物可以包含：

-在如上文关于分离方法所述的分离步骤(c)期间回收的文石固相和/或方解石固相，所述固相任选地被球化，

-在如上文关于分离方法所述的超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子，特别是至少可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物中的可溶性分子，

-在如上文关于分离方法所述的超声处理步骤(g)中获得的文石和/或方解石胶体乳液，和

-在冷酸解(h)以及洗涤并超速离心(i)步骤中回收的不溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的不溶性分子。

根据一个非常具体的实施方案，该组合物可以包含：

-在如上文关于分离方法所述的分离步骤(c)期间回收的文石固相，所述文石固相任选地被球化，

-在如上文关于分离方法所述的超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子，特别是至少可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物中的可溶性分子，

-在如上文关于分离方法所述的超声处理步骤(g)中获得的胶体乳液的混合物，和

-在冷酸解(h)以及洗涤并超速离心(i)步骤中回收的不溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的不溶性分子。

根据一个特定实施方案，包括在本发明所涉及的组合物中的在分离步骤(c)期间回收的文石固相可以被在通过离心进行的分离步骤(c)期间回收的文石沉淀代替，所述文石沉淀任选地被球化。

根据一个特定实施方案，包括在本发明所涉及的组合物中的在分离步骤(c)期间回收的方解石固相可以如上文关于分离方法所述的被在通过离心进行的分离步骤(c)期间回收的方解石沉淀代替，所述方解石沉淀任选地被球化。

本发明的另一个主题是如上所述的组合物，其用作药品。

本发明的另一个主题是治疗方法，其中将上述组合物施用于有需要的受试者。

根据一个实施方案，治疗性处理选自治疗皮肤病、预防皮肤病。

根据一个实施方案，皮肤病选自皮炎、皮肤病(诸如白斑和牛皮癣)。

根据一个实施方案，可以局部施用该组合物。

根据另一个实施方案，该组合物还可用作骨替代物、接合剂、植入物、骨接合装置、治疗中的医疗装置。

根据一个实施方案，骨替代物可以选自可挤出的骨替代物，特别是包装在真空注射器中的骨替代物、具有多孔胶原支持物的骨替代物、具有动物或人来源的矿物筛的骨替代物及其混合物。

根据一个实施方案，所述接合剂选自支架骨接合剂、用于椎体成形术和椎体后凸成形术中的微创手术的可注射骨接合剂。

本发明的另一个主题是上述组合物的非治疗用途。

本发明的另一个主题是非治疗性处理方法，其中将上述组合物施用于有需要的人。

根据一个实施方案，该组合物可用于化妆品中，尤其是用于治疗上睑下垂、皮肤凹陷、深层和浅表皱纹、防止机体老化。

本发明的另一个主题是上述组合物作为培养基的用途，特别是作为用于干细胞或祖细胞成熟和/或增殖的培养基的用途。

根据一个实施方案，用作培养基的组合物可以包含：

-在如上文关于分离方法所述的分离步骤(c)期间回收的文石固相和/或方解石固相，所述固相任选地被球化，

-在如上文关于分离方法所述的超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的可溶性分子，和

-在如上文关于分离方法所述的超声处理步骤(g)中获得的文石和/或方解石胶体乳液。

根据一个实施方案，用作培养基的组合物可以包含：

-在如上文关于分离方法所述的通过离心进行的分离步骤(c)期间回收的文石沉淀和/或方解石沉淀，所述沉淀任选地被球化，

-在如上文关于分离方法所述的超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的可溶性分子，和

-在如上文关于分离方法所述的超声处理步骤(g)中获得的文石和/或方解石胶体乳液。

本发明的另一个主题是另一种组合物，其包含：

-在如上文关于分离方法所述的超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的可溶性分子，

-在如上文关于分离方法所述的超声处理步骤(g)中获得的文石和/或方解石胶体乳液。

根据一个具体实施方案，组合物可以包含：

-在如上文关于分离方法所述的超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子，特别是至少来自可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、可溶性色素及其混合物的可溶性分子，

-在如上文关于分离方法所述的超声处理步骤(g)中获得的胶体乳液的混合物。

本发明的另一个主题是如上所述的其他组合物，其用作药品。

本发明的另一个主题是治疗性处理的方法，其中将如上所述的其他组合物施用于有需要的受试者。

根据一个实施方案，治疗性处理选自慢性自身免疫病。

根据一个实施方案，慢性自身免疫病可以是类风湿性关节炎、克罗恩病、动脉硬化、II型糖尿病、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、银屑病和银屑病关节炎，特别是银屑病。

根据一个实施方案，其他组合物可以通过肌内、静脉内和/或皮下注射施用。

具体实施方式

本发明包括实施文石粉和方解石粉的热渗滤步骤(b)的方法，即在研磨步骤(a)期间将壳的内文石有机矿物层和外方解石有机矿物层还原成粉末。由热渗滤步骤(b)产生的饱和溶液然后可以经历通过离心进行的分离步骤(c)，随后任选地进行浓缩步骤(f)和超声处理步骤(g)。已成为热渗滤步骤(b)主题的全部或部分粉末经历超临界CO₂处理步骤(d)。在热渗滤(b)和超临界CO₂处理(d)步骤期间放在一边的文石粉和方解石粉，以及由分离步骤(c)产生的粉末(该分离步骤(c)通过对由文石有机矿物层的热渗滤步骤(b)产生的液体溶液进行离心来进行)和/或方解石有机矿物层(以下称为文石沉淀和/或方解石沉淀)可以经历冷酸解(步骤(h))。

壳的预处理。

相关软体动物壳在清洗后，在50℃的自来水溶液中用UC38型杀菌、消毒、杀病毒制剂进行超声波处理，例如30分钟。然后，将如此处理的壳例如用温度约50℃的自来水冲洗，然后浸入2.5％稳定的次氯酸钠溶液中30分钟，用自来水冲洗5分钟。然后，将它们浸入外科

溶液1小时，通过空气流干燥，然后包装在可高压灭菌的袋中。

然后，这些壳可以经历一个或多个灭菌步骤。灭菌步骤可以由三个连续的“医学朊病毒”灭菌组成，在132℃下每次灭菌85分钟。然后，可以将经过灭菌的壳在空气流中干燥并放在一边。

可以将壳浸入等渗“海洋等离子体”浴中。该步骤可以有利地重新平衡壳的文石有机矿物层和方解石有机矿物层的初始水和矿物质含量，如果壳离开海洋环境太久和/或经历连续处理，则这些含量可能已经改变。该浸渍步骤可持续长达48小时。例如，等渗“海洋血浆”中的矿物质含量可能如下：Na 12.88mg/L、Br 66.3mg/L、Zn 0.083mg/L、K 493mg/L、P0.707mg/L、Ca 442mg/L，Mg 1.29mg/L，Cu 0.007mg/L。然后，将壳风干并放在一边。

壳的碾磨、压碎和研磨步骤(a)。

为了分别处理壳的文石有机矿物层和方解石有机矿物层，方解石有机矿物层可以经历碾磨步骤。该碾磨步骤可使用粗粒金刚石研磨轮进行，例如，在温度为2-4℃的经过过滤和冷却的海水流下进行。然后，获得粒径为2mm-500μm的粉状碾磨产品。将碾磨产品与文石有机矿物层一起放在一边，该文石有机矿物层已不含方解石有机矿物层。

文石有机矿物层可以在FRITSCH Pulverisette 1 Premium Line氧化锆颚式和壁式研磨机中粉碎，直至获得粒径为10μm-2mm的粉碎的文石粉。

然后，可以通过行星研磨来研磨这种粉碎的文石粉。可以使用锆碗和锆球进行行星研磨。例如，将25个直径为20mm的锆球和300g粉碎的文石粉放入两个容量分别为500mL的锆碗中，预先在-30℃下冷冻24小时。然后，将碗以400rpm的速度引入FRITSCHPulverisette 5PL型行星研磨机的研磨室进行2个研磨循环，每次5分钟。

为了优化研磨并防止粉末堵塞碗壁和球表面，可以湿法进行第二次研磨循环，例如通过添加液体形式的具有高沸点和低蒸气压的添加剂，例如注射用水(WFI)或醇(诸如异丙醇或乙醇)。

可以将WFI(在2-4℃冷藏)添加到每个碗中，直至获得粘度为3.5MPa的胶体溶液。在第二次研磨周期结束时，可以获得粒径为50nm-300μm的文石粉并放在一边。

特别地，这些操作允许从文石有机矿物层的矿物级分中分离和破碎生物晶体。

方解石有机矿物层的研磨产物可以经历与文石有机矿物层所经历的研磨步骤相同的研磨步骤，最后也可以获得粒径为50nm-300μm的方解石粉末。

可以在经历热渗滤步骤之前用25kGy的伽马辐射将通过研磨获得的文石粉和方解石粉灭菌。

热渗滤步骤(b)。

热渗滤是一种通过可渗透介质的过滤过程，允许对可溶性组分进行湿提取。

热渗滤被证明是有利的，原因有二。一方面，研磨后文石粉的光学显微观察显示不同直径的颗粒被有机残留物粘在一起。另一方面，热渗滤，例如在甲醇存在下，可以溶解文石有机矿物层的有机级分的蛋白质结合脂质。

这种现象可以通过文石有机矿物层成分的结构和物理化学性质来解释。

溶解度测试表明，这些具有粘合性能的有机残留物由文石有机矿物层和方解石有机矿物层的可溶和不可溶的晶内和层间有机组分组成。热渗滤允许洗涤文石粉颗粒，在文石渗滤粉的显微镜观察下，文石粉颗粒恢复其光泽外观。可以通过湿筛进行渗滤。

可以使用Filtra型振动筛进行湿筛分，所述振动筛从上到下包括：

-带有开口的盖，以接收用于进水口的管，

-6个筛，孔径从上到下：315、250、125、45、20和10μm，

-带有导管的收集底部，以收集渗滤液中的水。

振动筛的参数设置为最大振幅，振动时间持续约5分钟。

规定量的文石粉(500g-1kg)可以放置在上部筛中，以制成厚度可变的可渗透过滤器；悬在振动筛上方的罐中装有45℃的WFI，向其中加入5％的甲醇以溶解脂质。根据另一个实施方案，可以在渗滤之前将浓度为4mol/L的尿素溶液作为离液剂添加到WFI中，以裂解高分子量蛋白质。将溶液喷洒到粉末上，它的作用类似于过滤膜，通过振动筛的振动产生涡流来优化其过滤能力。

在热渗滤步骤(b)中，较小直径的文石粉颗粒可由WFI溶液从具有最大直径的第一个筛运送到根据它们的直径沉降的下层的筛，直至具有最小直径的最后一个筛。例如，最后一个筛的直径可以为10μm，它保留直径大于10μm的颗粒，允许10μm或更小的颗粒通过。

渗滤产物是由液相和固相组成的饱和溶液，所述液相含有文石有机矿物层的全部或部分水溶性和脂溶性组分，所述固相包含文石有机矿物层和文石颗粒的不溶组分，其直径小于或等于最后一个筛的直径，特别是为50nm-10μm。

热渗滤步骤(b)还产生含有文石颗粒的渗透文石粉，其直径可以大于最后一个筛的直径，特别是大于10μm。

热渗滤步骤(b)可以以相同的方式应用于由方解石有机矿物层的研磨步骤(a)产生的方解石粉。

分离步骤(c)。

为了从热渗滤步骤(b)产生的饱和溶液中分离液相和固相，可以对饱和溶液施用分离步骤(c)以回收，一方面，液相，和另一方面，固相。例如，可以通过离心进行该分离步骤(c)，回收的液相称为上清液，回收的固相称为沉淀。此处仅描述了该实例，但技术人员将知道如何实施不同于离心的分离技术以进行该步骤(c)。

通过离心进行的分离步骤(c)可以在装有4个篮子的2升Lisa型离心机中进行，该篮子能够容纳4个小瓶，每个小瓶含有300mL的溶液。转速可提高到18 000rpm，温度设置为5℃，旋转时间设置为20分钟。

可以干燥文石沉淀和/或方解石沉淀，例如在25℃的烘箱中干燥12小时。文石沉淀和/或方解石沉淀的粒径可以为10μm-50nm并且可以包含不溶性蛋白质和非蛋白质组分。然后，可以将文石沉淀球化并放在一边，通过25kGy的伽马辐射进行灭菌。可以将方解石沉淀放在一边。

离心分离步骤(c)可以进行一次或多次。

超临界CO₂处理步骤(d)。

已知目标可溶性分子通常是晶内的，并且需要通过碳酸钙生物晶体的酸解溶解，无论是文石还是方解石。为此，本发明的方法包括超临界CO₂处理步骤(d)。

已知处于超临界状态的CO₂具有非常特殊的特性：扩散系数、提取低分子量和非极性的可溶性成分以及脂肪的可能性，而不会产生污染残留物。它还具有对抗病毒和细菌的消毒特性。此外，共溶剂的添加增加了其溶解能力。它还具有低粘度系数和缺乏表面张力，这增加了其渗透能力，这得益于文石和方解石生物晶体的物理化学性质、亲水性生物材料、对气体有渗透性(包括CO₂)，当它处于超临界状态时更是如此。

用于处理超临界CO₂的反应器的安装包括5个主要元件：

-用于气态CO₂的入口和储存罐，

-用于将气态CO₂转化为液态CO₂的冷凝器，

-液态CO₂储存罐，

-用于将液态CO₂转化为超临界CO₂的热交换器，

-发生可溶分子提取的反应器，和

-一个或多个提取器。

超临界CO₂处理步骤(d)可根据以下程序施用于文石渗滤粉：

在连接到超临界CO₂交换器的足够大小的反应器中，放置在热渗透步骤(b)之后收集在筛中的文石渗滤粉。当交换器的阀门打开以释放超临界CO₂时，后者被注入反应器中，在那里发生目标分子(可溶性生物聚合物、脂肪酸、脂质、色素)的提取反应。在出口处，溶解的物质在连接到反应器的一个或两个提取器中根据它们的性质被回收，其中温度和压力的降低导致它们以干燥形式沉淀。CO₂在出口时再次变成气态，在那里它被回收用于新的提取循环。

结果，一方面是超临界CO₂处理的文石粉末，另一方面是来自文石有机矿物层的可溶性组分，然后可以用25kGy的伽马辐射灭菌并将其放在一边。

超临界CO₂处理步骤(d)可以以相同的方式施用于方解石渗滤粉并且任选地施用于方解石沉淀。

过滤步骤(e)。

在通过离心进行分离步骤(c)之后，可以在过滤步骤(f)中过滤文石上清液和/或方解石上清液以获得经过滤的文石上清液和/或经过滤的方解石上清液，然后将其放在一边。

例如，过滤步骤(f)可以在硅藻土床或膜上进行。

浓缩步骤(f)。

经过滤的文石上清液和/或经过滤的方解石上清液可以例如用Buchi型旋转蒸发仪在40℃的温度、10rpm的加热烧瓶转速和23.33毫巴的真空下浓缩。

该浓缩步骤(f)产生文石浓缩物和/或方解石浓缩物，其浓缩因子高达1/4。这种浓缩物可以具有从黄色到橙色、从红色到棕色或灰色的异色着色，这是由于来自其中所含金属(即Mn、Fe、Zn、Ba、Sr、Mg、Cu、Al、Ni、V、Cr、Mo)的颜料的存在。

超声处理步骤(g)。

有利地，可以通过超声波化学法通过使浓缩步骤(f)产生的文石浓缩物和/或方解石浓缩物经历超声处理步骤(g)来改变和优化其物理化学性质。

超声处理是在液体介质中使用机械波和声波的方法，例如使用超声波发生器，频率为20kHz-200kHz，取决于浓缩物的初始粘度。有利地，超声处理可以触发并加速反应，从而改变和增强活性可溶性分子的药理学和药效学特性。

事实上，空化导致高活性羟基化自由基的形成，这导致反应产率的提高，目标分子彼此反应时间的减少以及其中一些抗自由基特性的指数增强。

可将待处理的溶液置于超声波槽中，其中超声波发生器浸入其中，其尖端距表面和壁至少1cm，以避免形成电弧。

超声处理步骤(g)可以施用30分钟，之后可以观察到浓缩物的粘度增加。由于物理化学改性和胶原成分的排列，浓缩物随后呈稳定的胶体乳液形式。然后，可以通过微滤、灭菌过滤或25kGy伽马辐射对胶体乳液进行灭菌。产品可在5℃的温度下保存。

冷酸解步骤(h)以及洗涤并超离心步骤(i)。

为了收集包含在超临界CO₂处理的文石粉和/或超临界CO₂处理的方解石粉中的生物聚合物和其他不溶性组分，然后可以对所述粉末进行冷酸解。

超临界CO₂处理的文石粉和超临界CO₂处理的方解石粉可以合并并放置在充满2℃无热原水的足够容量的冷冻水解反应器中。可以预先调整离子强度以减弱可能的离子、矿物基质/蛋白质相互作用。将0.5mol的NaCl添加到溶液中并搅拌30分钟，即根据比例，1kg粉末与25升水和5升NaCl的比例。例如，然后在18000g下进行第一次离心。将沉淀吸收在足量的无热原水中，其中以相同的比例添加了80％的乙酸。在不断搅拌下，整体保持在1-4℃的温度下，pH值低于4.5。获得乳液，用无热原水稀释以使其破裂；用草酸检查是否存在未溶解的碳酸钙。这是通过纱布和倾析消除的。在该步骤中以获得不溶性蛋白质和其他组分(包括不溶性色素)的悬浮液，将其连续例如以18000g离心。离心沉淀在搅拌下再次加入等量的5％稀醋酸，以溶解任何碳酸钙残留物。离心沉淀用相同量的无热原水洗涤两次，并通过添加氢氧化钠溶液将pH值调至7。

每次洗涤后进行超速离心，最后得到不溶性蛋白质的湿糊状物，通过冷冻干燥或喷雾干燥。将获得的干燥产品研磨成粒径为10μm-50nm的灰色粉末，用25kGy的伽马辐射灭菌并放在一边。

在这些不同的步骤结束时，可以获得：

-球化文石颗粒的无菌粉末，其粒径为50nm-10μm并源自在文石粉末的热渗透步骤(b)之后通过离心进行的分离步骤(c)期间回收的沉淀，

-源自超声处理步骤(g)的胶体乳液，其由可溶性聚合物、可溶性有机色素(β-胡萝卜素)、金属、金属蛋白、金属酶、生长因子、糖蛋白、糖胺、多不饱和脂质和脂肪酸组成，

-来自超临界CO₂处理步骤(d)的生物聚合物和可溶性有机颜料，以及

-不溶性，所谓的载体和结构生物聚合物，从水解(h)以及洗涤并超速离心(i)步骤中回收的不溶性色素。

所有这些提取物都旨在全部或部分用于医疗器械的配制、治疗用制剂，用于整形外科、微创外科、皮肤科、口腔科、颌面外科、美容医学以及在皮肤美容产品的制剂中。

以下非限制性实施例说明了如上所述的本发明的施用。

实施例

实施例1:用于关节成形术的密封接合剂的配制

众所周知，髋关节、肩关节、膝关节或任何其他关节的骨关节炎是最常见的关节病变，这是由于老化和关节约束的共同作用。

这是因为关节表面的软骨涂层会磨损，逐渐恶化会导致疼痛和功能性阳痿，诸如髋关节疾病中发生的变化，其最终需要假肢。假体通常由植入髂骨髋臼的半球形杯、植入股骨干并终止于半球形头部的柄组成。这两个部分通过聚乙烯或陶瓷插入件铰接在一起。股骨假体的柄和杯通常用基于甲基丙烯酸甲酯的外科骨接合剂密封，或被压实。

鉴于使用甲基丙烯酸甲酯类外科骨接合剂时，有时会遇到术后并发症(温度升高至70℃以上时发生凝固反应)、接合剂的老化和收缩，这些并发症通常以假体重新密封或有时不使用接合剂而被压实而告终；目的是通过植入物周围的骨再生来实现生理机械锚固，植入物本身有时会覆盖有利于再生过程的合成生物材料。

出于这个原因，本实施例是一种密封接合剂，具有以下百分比配方：

95g在通过离心并球化进行的分离步骤(c)中获得的文石粉(粒径为50nm-10μm)，

4g碳酸化碳酸钙，

1g磷酸氢钠，

90mL在超声处理步骤(g)中获得的胶体乳液，

5g羧甲基纤维素钠。

使用粒径为50nm-10μm的球化文石粉是合理的，原因如下：球化最初是为了确保接合剂具有更好的可注射性和流动性，并促进形成相互连接的孔隙，其中10-100μm的孔隙对骨传导至关重要。

已知接合剂密封胶一旦干燥，其抗压强度必须至少等于接受骨的抗压强度。已知文石有机矿物层的压缩杨氏模量是141MPa，皮质骨的杨氏模量是131MPa，因此可以理解，接合剂非常适合提供更好的锚固和载荷分布，以及更好的优于传统接合剂的抗性。

接合剂配方中碳酸化碳酸钙的存在是合理的，因为碳酸钙在碳酸化过程中获得了可塑性、粘附性和内聚性。

可溶性和不溶性蛋白质是刺激细胞分化和增殖以及成骨的“信号”分子，在构建骨骼结构中起着关键作用。添加碳酸钙赋予整体可塑性、粘合性和延展性，这有利于文石颗粒的球化，使处理和插入更容易。

添加促凝剂可以修改制备时间、初凝时间和终凝时间。将在超声处理步骤(g)中获得的胶体乳液添加到混合物中，可以获得流体、均匀和稳定的糊状物。

接合剂用于实验性地密封小腿股骨干中的支架柄。术后X射线显示假体柄周围致密化，其特征是存在碳酸钙，这是内文石有机矿物层矿物部分的主要成分，在接合剂转化为新骨并与受体骨融合的过程中，致密化将逐渐降低。然后，假体表现得像一个压实的假体。

在4个月时进行的活检显示，假体柄周围存在新形成的骨，皮质没有变薄，表明骨接合剂转化为自体松质骨和皮质骨。

这些发现可以通过具有“BMP2样”作用的低分子量糖蛋白及其骨诱导特性、具有仿生特性的氨基糖苷类、色素、氨基酸和包括糖胺聚糖在内的蛋白质的存在来解释。

实施例2：用于修复骨关节假体的可成形骨替代物

已知在髋关节、肩关节或膝关节假体翻修过程中，去除残留的甲基丙烯酸甲酯接合剂会导致骨骼结构显著腐烂，因为需要采取方法去除所有残留的接合剂。重建接骨术使用自体移植物或使用合成骨替代物，这并不排除使用外科接合剂来密封假体。

这就是为什么该实施例是这样一种骨替代物，它不仅用于填补因需要进行进入程序而造成的物质损失，而且还用于密封新假体。该实施例的替代物的配方如下：

85g在分离步骤(c)中通过离心并球化获得的文石粉(粒径为10μm-200μm)，

2.5g在超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性生物聚合物，

2.5g在冷酸解(h)以及洗涤并超速离心(i)步骤中获得的不溶性生物聚合物，

5克碳酸化碳酸钙，

75mL在超声处理步骤(g)中获得的胶体乳液，

5克磷酸氢钠。

选择文石粉的粒径以有利于产生开放和互连的孔隙，有利于快速骨传导，这与骨替代物的骨诱导特性相关，也与它的抗菌特性相关。

展示了该实施例的骨替代物的各种用途。

一例危重临床病例的住院康复，在因葡萄球菌败血症导致的髓钉破裂后未能减少肱骨骨折，在肘部造瘘。

在去除骨折的骨科材料、修剪坏死组织并放置接骨板后，使用骨替代物，无需抗生素预防。

在使用前对根据本发明的产品进行的微生物负荷试验证实了抗菌特性，其显示出对微生物增殖，特别是对白色念珠菌、巴西曲霉、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌株的抑制。

术后随访显示感染发作的镇静，并且术后3个月的X射线显示骨组织恢复原状。

该骨替代物还用于医疗环境中的另一例危重临床病例，该病例在使用髓钉进行骨科治疗并在2年内尝试两次髂骨移植失败后(具有以下临床表现：横纹肌溶解症、昏迷和生命维持)，恢复治疗股骨下三分之一处的粉碎性小碎片骨折，长15cm。在放置外固定器、移除骨科材料和骨隔离后，示例性骨替代物被塑造成具有物质损失尺寸的圆柱体，并放置在远端和近端碎片之间。术后4个月允许单足支撑，7个月时步态接近正常。放射学检查不仅显示正常厚度的皮质骨重建，而且还显示修复股骨近端和远端骨折块之间髓管的透化。

所有这些观察结果都凸显了骨替代物的骨诱导特性，以及其骨传导和抗菌特性，以及它依赖于接受者的局部系统调节的能力。

本发明人还提出了骨替代物在微创手术、椎体后凸成形术、椎体成形术、骨质疏松症、骨折和椎骨压缩的治疗中的用途。

临床上，尽管手术部位潮湿，但在37℃的体温下观察到骨替代物的快速硬化。

另一方面，骨替代物的内聚力、可塑性和粘合特性大大限制了由于分层导致血管渗漏的可能性。

该实施例的骨替代物也可用于颌面外科和口腔科。

实施例3：用于治疗重度难治性皮肤病的局部制剂

已知某些形式的皮肤病，诸如肘部和头皮的牛皮癣(以斑块形式出现)有时对任何治疗都是难治的，包括局部皮肤皮质激素。这就是发明人提出适用于斑块状银屑病的制剂的原因。事实上，角质形成的加速导致皮肤角质层无政府状态增厚，导致增生性角蛋白斑块的形成，从而阻止局部渗透。

本实施例的局部制剂的配方为：

20g在通过离心并球化进行的分离步骤(c)中获得的文石粉(粒径为50nm-10μm)，

2g在超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性生物聚合物，

5g尿素，

10g尿囊素，

3g水杨酸，

60mL在超声处理步骤(g)中获得的胶体乳液，

1mL精油和植物油的混合物

赋形剂W/O q.s.100g

用于本实施例的局部制剂中的精油和植物油的混合物的配方如下：

1mL薰衣草

1mL果香菊

1mL互生叶白千层

1.5mL Helychrisum italicum

1mL杜松

1.5mL香桃木

20mL摩洛哥坚果

50mL鳄梨

10mL琉璃苣

13mL小麦胚芽

在实践中，制备含有20g文石粉末、2g可溶性生物聚合物、30mL胶体乳液的溶液，直至获得保持在2℃-5℃的温度下的凝胶。

还制备了含有5g尿素、10g尿囊素、3g水杨酸和30mL胶体乳液的混合物。

将整体混合30分钟直至完全溶解，然后置于25℃的烘箱中24小时并每6小时搅拌以控制CO₂的释放。然后，将所有组分置于混合器中混合1小时。

实施例4：用于治疗白癜风的局部制剂

已知白癜风为难以治疗且耗时的非传染性且严重的皮肤病，具有非常显著的心理-社会影响，其影响世界人口的0.5-2％且其发展不可预测。它或者通过扩散斑，或者通过局部或全身导致皮肤脱色。其表现为由于黑素细胞(产生黑色素的细胞，皮肤的主要色素)消失而出现白斑。

治疗可能性受到限制。它们的范围从使用UVB到皮皮质激素(dermocorticoids)和生物类似物，局部制剂，并且作为最后的手段，到黑素细胞的外科移植物或薄皮肤移植物。迄今为止，对于白癜风还没有有效的普遍治疗方法。此外，大多数建议的治疗可能具有尴尬或严重的副作用。此外，白癜风通常伴随着皮肤表面的改变和变薄，这是由于角化细胞的脆弱性，所述角化细胞被摩擦区域中的微创伤意外消除。也存在黑素细胞和毛球(黑色素贮库)的消失，这是由于它们的成熟功能障碍以及与基底膜和相邻角质细胞的粘合和附着问题。

考虑到白癜风的病理生理学，本发明人提出了局部制剂，其旨在通过诱导所有类型的干细胞，特别是黑素细胞，角质细胞和成纤维细胞的成熟、募集、增殖和分化来改变皮肤区域的代谢。

这些局部代谢诱导还表现为由毛细血管血管生成引起的皮肤表面的进行性再着色。

本实施例的局部制剂的配方如下：

20g在通过离心并球化进行的分离步骤(c)中获得的文石粉(粒径为50nm-10μm)，

2g在超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性生物聚合物，

5g在冷酸解步骤(h)以及洗涤并超速离心步骤(i)中获得的不溶性生物聚合物，

40mL在超声处理步骤(g)中获得的胶体乳液，

0.5mL精油和植物油的共混物，

5g脲

赋形剂O/W q.s.100g

在实践中，将20g球形文石粉、2g可溶性生物聚合物、5g不溶性生物聚合物、30mL胶体乳液混合，直至获得凝胶，凝胶保持在2℃-5℃之间。

还制备了5g尿素和10mL胶体乳液，将其混合30分钟直至完全溶解。

然后，所有成分在搅拌器中混合1小时：将所得制剂置于温度为25℃的烘箱中24小时，每6小时搅拌一次，以控制CO₂的释放。

局部制剂的成分包括具有BMP样特性的低分子量糖蛋白，包括TNFβ、EGF、TGFβ，它们在表皮基底层所有细胞系的合成、增殖、成熟，尤其是黑素细胞的合成、增殖和成熟中具有生物活性。它还天然地含有游离色素，诸如β-胡萝卜素，维生素A的前体，其在黑色素的合成中起着至关重要的作用；还有以金属卟啉、金属酶的形式与卟啉、酶结合的黑色素，其参与生物组织的着色。

另一方面，该实施例局部制剂的精油和植物油混合物每100ml具有以下配方：

月见草45mL,

小麦胚芽50mL,

胡椒碱1mL，

Helycrisum italicum 1mL，

互生叶白千层1mL,

薰衣草1mL，

山艾1mL

这些提取物旨在增强根据本发明的局部药物组分的所有性能。

观察到文石粉含有几乎所有氨基酸，包括黑色素合成所必需的酪氨酸和半胱氨酸。所有这些与超纯钙相关的元素，在减轻炎症、增强局部免疫系统、表皮的再吸收和成分的生物利用度方面起着重要作用。

局部制剂的药理特性和天然成分的相互作用也对黑素体的刺激和增殖以及黑素体中存在的基质黑素转移到周围的角质形成细胞具有作用，其确保表皮细胞群的更替以及毛囊的再生、黑色素的储存。

另一方面，已知超声处理后胶体乳液中所含的可溶性相关分子，诸如与生长因子或细胞因子相关的低分子量蛋白质，也具有多效性，其通过阻止单线态氧(¹O₂)与多不饱和脂肪酸双键的结合来抑制脂质过氧化。这总体上具有防止这些酸、蛋白质和生物分子的劣化的作用，这种劣化导致产生对皮肤表面有害的新自由基。

任何之前的白癜风治疗中均推荐局部制剂；但是，在陈旧性白癜风或已经经受重复处理而没有可见结果的白癜风的情况下，其通常导致黑素细胞和角质细胞的迁移以及毛球的消失，为了激发根据本发明的局部药物更活跃且更深地渗透到基底层，可以将后者的应用与医学离子电渗装置的使用结合起来，其原理是通过利用电极向皮肤施加低强度的直流电流来促进可电离产品的经皮渗透，所述电极使离子根据电极的极性沿选定方向迁移。

实施例5：用于矫正皱纹和皮肤凹陷的化妆品制剂。

发明人提出根据本发明的组合物的化妆品用途，用于矫正上睑下垂、皮肤凹陷、深层和浅表皱纹，以防止机体衰老。

本实施例的组合物的配方如下所示：

29g在通过离心并球化进行的分离步骤(c)中获得的文石粉(粒径为10-45μm)，

1g在超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性生物聚合物，

70mL羧甲基纤维素钠凝胶，其本身由以下成分组成：

68mL在超声处理步骤(g)中获得的胶体乳液和2g羧甲基纤维素钠。

在实践中，首先制备羧甲基纤维素钠溶液：将68mL胶体乳液、2g羧甲基纤维素钠放入混合器中。将混合物搅拌20分钟，并在5℃的低温下放置12小时，直至形成凝胶。

在此期间结束时，将29g球化文石粉和1g可溶性生物聚合物与先前获得的70mL凝胶混合。

将该组合物包装在配备有0.4mm/20mm螺纹针头的1ml注射器中，然后对其进行双重包裹，并用25kGy的γ辐射灭菌。

将该组合物注射在深层和浅表皱纹、皮肤上睑下垂中，除了其丰盈(volumising)特性外，还可刺激成纤维细胞的成熟和增殖，产生负责皮肤的滋润、柔软性和紧致性的I型胶原。

由于其物理化学组成，组合物具有显著的优势，其天然成分导致疼痛及术后发炎现象不存在。此外，该实施例的组合物取决于受试者的局部系统性调节并在很长的一段时间内产生矫正效果。

实施例6：保护性助晒(tan-accelerating)皮肤美容制剂

晒黑(Tanning)是皮肤对由阳光造成的伤害的防御及调节反应，更准确地说，是通过UVA和UVB射线，通过黑素细胞增加黑色素的产生使皮肤着色：这就是晒黑。过度暴露在阳光下会导致系统失控，由此产生的氧化应激会导致晒伤、过敏、色素斑、烧伤、皮肤老化，且不要忘记，反复过度暴露最终会导致细胞的微RNA发生改变，从而导致细胞退化和皮肤癌的出现。

为此，已发展保护性产品，其包含多种类型的成分，帮助黑色素细胞对抗氧化应激并产生更多黑色素。每个个体产生或多或少的黑色素，其依种族及皮肤类型分布不均。由黑色素细胞产生的黑色素有两种，黑色的真黑色素(eumelanins)与红黄色的棕黑色素(pheomelanins)：真黑色素对阳光伤害的抵抗力更强，黑色或棕色皮肤的个体会产生更多的真黑素；黑色素主要存在于浅色或红色皮肤的个体中。它们会因阳光的伤害而迅速改变，对皮肤的保护作用也会减弱，从而减少阳光引起的氧化应激。

在对根据本发明的方法的描述中，发明人强调了多不饱和脂肪酸、酪氨酸和胱氨酸的存在，它们促进黑色素、在皮肤着色中起基础作用的金属酶、增强局部免疫系统的细胞因子，以及刺激黑素细胞时产生的基质黑色素的合成。

因此，本实施例中用于制备防晒霜的组合物具有以下配方：

10g在通过离心并球化进行的分离步骤(c)中获得的文石粉(粒径为50nm-10μm)，

5g通过冷酸解(h)以及洗涤并超离心(i)步骤获得的不溶性生物聚合物，

1g在超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性生物聚合物，

20mL在超声波处理步骤(g)中获得的胶体乳液，

10mL浓缩椰子汁(Coco Nucifera solution)

0.05mL抗坏血酸棕榈酸酯，

赋形剂q.s.100mL。

在实践中，制备了10g球化文石粉、5g不溶性生物聚合物、1g可溶性生物聚合物、20mL胶体乳液、10mL浓缩椰子汁、0.05mL抗坏血酸棕榈酸酯。将混合物放在搅拌器中搅拌1小时。然后，将赋形剂添加到混合物中：整个混合物混合1小时，直至获得乳膏。

在实验条件下发现的保护系数为10-40。

在十二名浅肤色的个体身上测试该组合物，这些人从红发到金发，在阳光下经常会出现红斑，甚至灼伤和缺乏晒黑。在夏季阳光下10天内施用该实施例的组合物，使所有测试的个体不仅能够避免红斑或灼伤的发生，而且能够确保因黑色素生成的刺激而产生均匀的棕褐色。

本发明方法的步骤使得能够获得参考文献中提到的软体动物壳的内文石和外方解石有机矿物层中所含活性分子的总量。

实施例7：用于生物治疗的可注射溶液的生产

从解剖学、病理生理学、生殖学以及与它们的(群落)生境的相互作用的研究中可知，本专利中引用的双壳软体动物通过合成在大脑皮层外腔中排泄的有机和无机成分，按照两个顺序过程形成大脑皮层外液，从而构建其壳：包括离子转运、糖蛋白合成的第一细胞过程和第二物理化学过程。

通过这些过程，在内文石层和外方解石层中发现了本专利中描述的所有活性分子；因此，在内文石层中发现生长因子、低分子量糖蛋白(8-50kDa)、白细胞介素、趋化因子、TNF(源自共同祖先基因的一组)、TGF、前列腺素等。

临床前和临床观察似乎表明，上述软体动物的文石和方解石有机矿物层的有机部分中所含的细胞因子具有旁分泌作用模式，在局部系统性地依赖于受体宿主。这些细胞因子(源自上述双壳软体动物免疫防御的代谢活动)存在于大脑皮层外液中并且是这些软体动物内文石层和外方解石层可溶性分子的一部分。

这就是为什么发明人建议使用可用于生物治疗的可注射溶液，特别是用于某些慢性自身炎症性疾病，诸如类风湿性多关节炎、克罗恩病、动脉硬化、II型糖尿病、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、严重银屑病和银屑病性关节炎。

已知银屑病是角质形成细胞、树突状细胞和T淋巴细胞相互激活的结果。这3种细胞类型(TNFα、IL-23和IL-17)产生的炎性细胞因子在此病理学中占优势，这是由于它们产生的细胞因子风暴所致。免疫生物学治疗具有阻断这3种细胞因子作用的特性，这3种细胞因子的激活有利于银屑病的出现和持续，后者的病因仍然是多因素的。由于抗细胞因子单克隆抗体旨在通过阻止IL-23以及白细胞介素IL-17和IL-22的产生来抑制树突状细胞的功能，因此这些疗法阻断了细胞因子的作用。

最近的一项荟萃分析表明，生物治疗剂在治疗炎症性疾病方面已被证明是有效的，但并非没有副作用，该荟萃分析报告了潜伏性结核和淋巴瘤、非典型和机会性感染、病毒感染(带状疱疹)、乙型或丙型肝炎、脱髓鞘、肿瘤、心血管、肝毒性、细胞减少、高胆固醇血症以及注射部位反应和肺部和消化道并发症的再激活。

热渗滤、离心、浓缩、超声和超临界CO₂处理步骤允许提取活性分子，诸如细胞因子和生长因子。这些分子具有决定多种表型性状和局部系统活性的多效性，其参与组织内稳态调节，特别是抗炎，对在许多病理学中很常见的炎症细胞因子(诸如TNFα、白细胞介素IL-23、IL-17等)进行调节。

本实施例中的肌内、静脉内和/或皮下注射生物治疗溶液可按照如下配制：

2g在超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性生物聚合物，

在超声波处理步骤中获得的胶体乳液(g)q.s.100mL。

在实践中，将可溶性生物聚合物添加到胶体乳液中，然后在25℃的烘箱中放置12小时，每6小时搅拌一次，直至完全溶解。然后，将整体包装在卷曲安瓿中，用25kGy的γ辐射灭菌。

实施例8：用于动物和人干细胞和祖细胞的成熟和增殖的培养基

众所周知，组织、器官和系统的构建、生长和修复取决于不同生长因子或细胞因子的作用，首先由干细胞标记物发出警报，然后由祖细胞标记物发出警报。

还知道，多能干细胞可以为不同的组织、器官和系统产生多个细胞系。祖细胞是干细胞的高级步骤，尽管分裂特性有限；它们是组织修复的基础，并且由于其移动性降低，被发现与靶组织非常接近。

体外研究强调了上述软体动物内文石层和外方解石层有机部分中所含可溶性分子的增强作用。

因此，发明人还提出了制备用于动物和人干细胞和祖细胞的成熟和增殖制备培养基。

这种培养基包含：

-5g在通过离心并球化进行的分离步骤(c)中获得的文石粉(粒径为50nm-10μm)，

-2g在超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性生物聚合物，

-0.4g葡萄糖，

-2mL自体人血清，和

-在超声波处理步骤中获得的胶体乳液(g)：q.s.100g。

在实践中，将此类培养基放置在生物反应器中，该生物反应器可为需氧或厌氧，将自体祖细胞、肌肉或骨膜祖细胞引入其中进行增殖，孵育期为0-15天。

在实践中，祖细胞是通过活检获得的，通常通过酶消化提取。孵育后，该制剂可用于供体受试者的适应症，诸如所有类型的组织再生：严重烧伤、大面积创伤、肌肉破坏、大量物质损失、牙周病。它可以在常规手术中使用，无论是注射还是微创手术。

实施例9：用于“每os”施用的胶囊的生产

为了通过“每os”继续施用通过注射治疗上病症，发明人提出以下组合物：

-60g球化文石粉，

-1g可溶性生物聚合物，

-2g不溶性生物聚合物，

-10g金虎尾(acerola)粉，和

-胶体乳液q.s.100g。

在实践中，将文石粉、可溶性和不溶性生物聚合物以及金虎尾粉与胶体乳液混合。将混合物混合10分钟，然后在30℃的烘箱中放置3小时，直至获得粘度为10²Pa.s的糊状物。

将整体包装在容量为0.8mL、延迟溶解的耐酸植物胶囊中。

Claims (13)

1.用于分离海洋双壳软体动物壳的文石有机矿物层和/或方解石有机矿物层中所含分子的方法，其包括以下步骤：

(a)将文石有机矿物层和/或方解石有机矿物层研磨获得文石粉和/或方解石粉；

(b)热渗滤所述文石粉和/或所述方解石粉以获得：

-一方面，饱和文石溶液和/或饱和方解石溶液，所述饱和文石溶液包含文石液相和文石固相，并且所述饱和方解石溶液包含方解石液相和方解石固相，以及

-另一方面，文石渗滤粉和/或方解石渗滤粉；

(c)分离所述饱和文石溶液和/或所述饱和方解石溶液以回收：

-一方面，文石液相和/或方解石液相，和

-另一方面，文石固相和/或方解石固相；以及

(d)用超临界CO₂处理所述文石渗滤粉和/或所述方解石渗滤粉以获得：

-一方面，超临界CO₂处理的文石粉和/或超临界CO₂处理的方解石粉，和

-另一方面，包含在所述文石有机矿物层和/或所述方解石有机矿物层中的全部或部分可溶性分子。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述海洋双壳软体动物选自大珠母贝、黑蝶真珠蛤、马氏珠母贝、合浦珍珠贝、库氏砗磲、长砗磲、菱砗磲、无鳞砗磲、魔鬼砗磲、番红砗磲、鳞砗磲、瓷口砗磲及其混合物。

3.根据前述权利要求之一所述的方法，其中所述热渗滤步骤(b)通过用温度高于30℃的液体湿筛进行。

4.根据权利要求3所述的方法，其中在所述热渗滤步骤(b)中使用的液体是水溶液，特别是包含甲醇的水溶液、包含尿素溶液的水溶液或其混合物。

5.根据前述权利要求之一所述的方法，其中所述分离步骤(c)通过离心进行并且回收的液相称为上清液并且回收的固相称为沉淀。

6.根据权利要求5所述的方法，其在所述通过离心进行的分离步骤(c)之后包括以下步骤：

(e)过滤所述文石上清液和/或所述方解石上清液以获得经过滤的文石上清液和/或经过滤的方解石上清液；

(f)将所述经过滤的文石上清液和/或所述经过滤的方解石上清液进行浓缩以获得文石浓缩物和/或方解石浓缩物；

(g)对所述文石浓缩物和/或所述方解石浓缩物进行超声处理以获得文石胶体乳液和/或方解石胶体乳液。

7.根据前述权利要求之一所述的方法，其进一步在所述超临界CO₂处理步骤(d)之后包括以下步骤：

(h)冷酸解所述超临界CO₂处理的文石粉和/或所述超临界CO₂处理的方解石粉以提取存在于所述粉末中的不溶性分子；以及

(i)洗涤并超速离心以分离并回收所述不溶性分子。

8.组合物，其包含：

-在如权利要求1所定义的分离步骤(c)期间回收的文石固相和/或方解石固相，

和至少一种选自以下的组分：

-在如权利要求1所定义的超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子，

-如权利要求6所定义的在超声处理步骤(g)中获得的文石胶体乳液和/或方解石胶体乳液，和

-在如权利要求7所定义的冷酸解(h)以及洗涤并超速离心(i)步骤中回收的不溶性分子。

9.根据权利要求8所述的组合物，其用作药品。

10.根据权利要求8所述的组合物作为培养基的用途，特别是作为用于干细胞或祖细胞的成熟和/或增殖的培养基的用途。

11.根据权利要求8所述的组合物用于矫正上睑下垂、皮肤凹陷、深层和浅表皱纹和/或用于防止机体老化的美容用途。

12.组合物，其包含：

-在如权利要求1所定义的超临界CO₂处理步骤(d)中获得的可溶性分子，和

-在如权利要求6所定义的超声处理步骤(g)中获得的文石胶体乳液和/或方解石胶体乳液。

13.根据权利要求12所述的组合物，其用作药品。