KR20220027842A - 해양 이매패류의 껍데기의 유기광물층에 함유된 분자를 단리하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 해양 이매패류(bivalve mollusc)의 껍데기의 내부 아라고나이트 유기-광물층 및 외부 칼사이트 유기-광물층에 함유된 성분의 전부 또는 일부를 분리, 추출 및/또는 단리하기 위한 동시 및/또는 순차적인 단계를 포함하는 방법이다.

Description

해양 이매패류의 껍데기의 유기광물층에 함유된 분자를 단리하는 방법
본 발명은 핀크타다 맥시마- 마가리티페라- 마르텐시이- 퓨카타, 뿐만 아니라 트리다크나 기가스- 맥시마- 하이포퍼스 하이포퍼스- 데레사- 테바로아- 크로세아- 스쿠아모사, 포르세라너스와 같은 해양 이매패류(bivalve molluscs)의 껍데기의 내부 아라고나이트 유기-광물층 및 외부 칼사이트 유기-광물층에 함유된 성분의 전부 또는 일부를 분리, 추출 및/또는 단리하기 위한 동시 및/또는 순차적인 단계의 실행에 관한 것이다. 이러한 추출된 성분의 조합 및 재배열은 정형외과 수술, 최소 침습 수술, 구강 및 악안면 수술, 피부과, 미용 의학(aesthetic medicine) 및 피부미용(dermocosmetics)에 사용하기 위한 의료 기기 및 치료 목적 제제의 제형에 사용된다.
위에서 언급된 이매패류의 껍데기의 내부 아라고나이트 유기-광물층의 구조 및 물리-화학적인 조성은 두 가지 분획을 함유한다: 사방정계에서 결정화되는 준안정(metastable), 다형성(polymorphic), 생물기원 형태(biogenic form)의 탄산 칼슘 CaCO3인 아라고나이트 생결정으로 구성된 광물 분획, 및 주로 단백질 및 비-단백질 성분, 색소(멜라닌, 베타-카로틴 등), 지방산 및 총 지질, 특히 다중불포화(polyunsaturated)로 구성된 유기 분획.
동일한 이매패류의 외부 칼사이트의 껍데기의 유기-광물층은 또한, 능면체 결정계에서 결정화되는 탄산칼슘의 또 다른 다형성 형태인 칼사이트의 프리즘(prisms)으로 구성된 광물 분획, 및 가용성 및 불용성 단백질 및 비-단백질 성분, 색소 및 금속으로 구성된 유기 분획으로 구성된다. 상기 외부 칼사이트 유기-광물층은 멜라닌 색소 및 포르피린 및 효소와 관련된 금속이 내부 아라고나이트 유기-광물층보다 풍부하다.
일반적으로, 위에서 언급된 이매패류의 껍데기의 내부 아라고나이트 및 외부 칼사이트 유기-광물층의 유기 분획에 함유된 활성 분자는 저온 가수분해(cold hydrolysis)에 의해 추출된 단백질 및 비-단백질 성분이다. 이러한 성분은 단백질, 폴리펩타이드 및 다당류뿐만 아니라, 생체-단량체, 아미노산 및 단당류를 포함하는 가용성 및 불용성 생체고분자이다. 그들 모두는 무엇보다도 수많은 생물학적 및 약리학적 골-유도 및 치유 특성을 가지고 있다. 이러한 특성은 성장 인자와 관련된 당단백질의 존재 때문이다. 그러나, 이러한 분자를 추출하는데 일반적으로 사용되는 공정은 모든 분자, 특히 관심 있는 특성을 가지는 저분자량 분자, 주로 글루코사민뿐만 아니라 지질 및 다중불포화 지방산과 같은 항생체모방체(antibiomimetics)를, 색소, 메탈로엔자임(metalloenzymes) 및 메탈로포르피린(metalloporphyrins)을 잊지 않고 추출하는 것을 가능하게 하지 않는다. 언급된 이매패류의 껍데기의 내부 아라고나이트 유기-광물층의 유기 분획은 그 중에서도 지방산 및 총 지질(팔미트산, 스테아르산)을 함유하는 것으로 알려져 있으며; 이는 0.2% 내지 3%의 비율로 고도불포화 지방산이 가장 풍부한 천연 해양 생체재료이다. 이들은 수산화 및 비-수산화 세라마이드, 콜레스테롤 설페이트 및/또는 아세테이트, 트리글리세리드 및 오메가-3s로 대표되는 대부분이 극성(polar) 및 무극성(apolar) 화합물이다.
지방산이 항염증 및 면역 특성을 가지는 것이 알려져 있고, 류마티스 관절염 및 자가면역 질환에서 특정 종양 과정의 발달을 억제하는 역할을 하는 것으로 보이며, 이러한 동일한 지질 및 지방산은 막 트랜스글루타미나제 억제 특성을 갖는 피부 표층의 단백질인 필라그린(특정 피부병에 관여하는 불용성 단백질 중합체의 세트)의 과발현을 유도하므로, 따라서, 치료 목적을 위한 제제의 제형화에 있어서의 이점을 이해할 수 있다.
이러한 이유로, 해양 이매패류(bivalve molluscs)의 껍데기의 내부 아라고나이트 및 외부 칼사이트 유기-광물층에 함유된 분자의 단리를 최적화하는 공정이 필요하다.
껍데기의 내부 아라고나이트 및 외부 칼사이트 유기-광물층에 함유된 분자의 분리, 정제 및 물리-화학적 반응성을 최적화하고, 그들의 특성을 강화하기 위해, 일련의 기계적, 음향적(acoustic), 물리적 및 화학적 단계를 구현할 수 있는 공정을 통해 이러한 요구를 충족한 것은 본 발명자들의 공로이다.
따라서, 본 발명의 첫번째 주제는 다음의 단계를 포함하는 해양 이매패류(bivalve mollusc)의 껍데기의 아라고나이트 유기-광물층 및/또는 칼사이트 유기-광물층에 함유된 분자를 단리하는 공정이다.
(a) 아라고나이트 유기-광물층 및/또는 칼사이트 유기-광물층을 분쇄하여 아라고나이트 분말 및/또는 칼사이트 분말을 수득하는 단계;
(b) 상기 아라고나이트 분말 및/또는 상기 칼사이트 분말에 열을 침투(hot percolationg)시켜 하기를 수득하는 단계;
- 한편으로는, 포화 아라고나이트 용액 및/또는 포화 칼사이트 용액, 상기 포화 아라고나이트 용액은 아라고나이트 액체상 및 아라고나이트 고체상을 포함하고, 상기 포화 칼사이트 용액은 칼사이트 액체상 및 칼사이트 고체상을 포함하며, 및
- 다른 한편으로는, 아라고나이트 침투 분말 및/또는 칼사이트 침투 분말;
(c) 상기 포화 아라고나이트 용액 및/또는 상기 포화 칼사이트 용액을 분리하여 하기를 수득하는 단계;
- 한편으로는, 상기 아라고나이트 액체상 및/또는 상기 칼사이트 액체상, 및
- 다른 한편으로는, 상기 아라고나이트 고체상 및/또는 상기 칼사이트 고체상; 및
(d) 상기 아라고나이트 침투 분말 및/또는 상기 칼사이트 침투 분말을 초임계 CO2 처리하여 하기를 수득하는 단계;
- 한편으로는, 초임계 CO2-처리된 아라고나이트 분말 및/또는 초임계 CO2-처리된 칼사이트 분말, 및
- 다른 한편으로는, 상기 아라고나이트 유기-광물층 및/또는 상기 칼사이트 유기-광물층에 함유된 가용성 분자의 전부 또는 일부.
본 발명의 목적을 위해, "초임계 CO2-처리된 아라고나이트 분말"은 상기 아라고나이트 유기-광물층에 함유된 가용성 분자의 전부 또는 일부가 제거된 분말을 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, "초임계 CO2-처리된 칼사이트 분말"은 칼사이트 유기-광물층에 함유된 가용성 분자의 전부 또는 일부가 제거된 분말을 의미한다.
생산 방법에 따라, 상기 해양 이매패류는 핀크타다 맥시마(Pinctada Maxima), 핀크타다 마가리티페라(Pinctada Margaritifera), 핀크타다 마르텐시이(Pinctada Martensi), 핀크타다 퓨카타(Pinctada Fucata), 트리다크나 기가스(Tridacnae Gigas), 트리다크나 맥시마(Tridacnae Maxima), 트리다크나 하이포퍼스 하이포퍼스(Tridacnae Hippopus Hippopus), 트리다크나 데레사(Tridacnae Derasa), 트리다크나 테바로아(Tridacnae Tevaroa), 트리다크나 크로세아(Tridacnae Crocea), 트리다크나 스쿠아모사(Tridacnae Squamosa), 트리다크나 포르세라너스(Tridacnae Porcelanus) 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 껍데기는 분쇄 단계 (a) 전에, 한편으로는, 아라고나이트 유기-광물층, 및, 다른 한편으로는, 칼사이트 유기-광물층을 수득하기 위한 밀링 단계를 거칠 수 있으며, 상기 밀링 단계는 선택적으로 세정, 초음파 처리, 헹굼, 살균, 건조, 등장욕(isotonic bath)에의 침지 및 이들의 혼합으로부터 선택된 껍데기의 전처리 단계가 선행된다.
일 실시양태에 따르면, 상기 밀링 단계에서 수득되거나 및/또는 상기 분쇄 단계 (a)에서 사용되는 칼사이트 유기-광물층은 분말상일 수 있고, 2 mm 내지 500 μm 사이의 입자 크기를 가질 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 상기 분쇄 단계 (a)는 플레니터리 분쇄(planetary grinding)에 의해 수행될 수 있다.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 단계 (a)의 플레니터리 분쇄는 하나 이상의 사이클, 특히 2개의 사이클을 포함할 수 있다. 각각의 플레니터리 분쇄 사이클은, 예를 들어, 건식 또는 습식 방법에 의해 수행될 수 있으며, 특히 상기 제1 분쇄 사이클은 건식 방법에 의해 수행될 수 있고, 상기 제2 사이클은 습식 방법에 의해 수행될 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 분쇄 단계 (a)는 하기와 같이 수행될 수 있다:
- 상기 아라고나이트 유기-광물층 및/또는 상기 칼사이트 유기-광물층을 파쇄하여 파쇄된 아라고나이트 분말 및/또는 파쇄된 칼사이트 분말을 수득하는 단계; 그 뒤
- 상기 파쇄된 아라고나이트 분말 및/또는 상기 파쇄된 칼사이트 분말을 분쇄하여 아라고나이트 분말 및/또는 칼사이트 분말을 수득하는 단계.
특정 실시양태에 따르면, 파쇄된 아라고나이트 분말 및/또는 파쇄된 칼사이트 분말의 분쇄는 전술한 바와 같이 플레니터리 분쇄에 의해 수행될 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 상기 파쇄된 아라고나이트 분말 및/또는 상기 파쇄된 칼사이트 분말은 10 μm 내지 2 mm 사이의 입자 크기를 가질 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 분쇄 단계 (a)에서 수득된 아라고나이트 분말 및/또는 칼사이트 분말은 50 nm 내지 300 μm 사이의 입자 크기를 가질 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 열 침투 단계 (b)는 30°C 초과, 특히 35°C 내지 75°C, 특히 40°C 내지 50°C의 온도를 가지는 액체로 습식 체질함으로써 수행될 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 열 침투 단계 (b)에서 사용되는 액체는 수용액, 특히 메탄올을 포함하는 수용액, 요소 용액을 포함하는 수용액 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 상기 수용액은 1% 내지 10% 메탄올, 특히 2% 내지 7%, 보다 특히 4.5% 내지 5.5% 메탄올을 함유할 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 상기 열 침투 단계 (b)는 하기를 포함하는 체진동기(sieve shaker)로 수행될 수 있다:
- 액체 주입구용 파이프를 수용하기 위한 개구부가 장착된 덮개,
- 아라고나이트 침투 분말 및/또는 칼사이트 침투 분말을 수집하기 위한 복수의 체, 특히 2 내지 10 개의 체, 보다 특히 5 내지 7 개의 체, 더욱 특히 6 개의 체, 및 2 개의 연속적인 체의 기공의 직경은 액체의 흐름 방향으로 감소됨,
- 포화 아라고나이트 용액 및/또는 포화 칼사이트 용액을 수집하기 위한 도관이 장착된 수집 바닥.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 상기 체진동기는 액체 흐름 방향으로 기공 직경이 315 μm, 250 μm, 125 μm, 45 μm, 20 μm 및 10 μm인 6 개의 체를 포함할 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 아라고나이트 침투 분말 및/또는 상기 칼사이트 침투 분말은 상기 체진동기의 체 직경 중 가장 작은 직경을 가지는 체 직경보다 큰 입자 크기, 특히 10 μm 초과의 입자 크기, 보다 특히 10 μm 내지 300 μm의 입자 크기를 가질 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 포화 아라고나이트 용액의 아라고나이트 액체상은 상기 아라고나이트 유기-광물층에 함유된 수-용성 및 지-용성 분자를 포함할 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 포화 아라고나이트 용액의 아라고나이트 고체상은 하기를 포함할 수 있다:
- 불용성 단백질 및 비-단백질 분자와 같은 아라고나이트 유기-광물층에 함유된 불용성 분자, 및
- 상기 체진동기의 체 직경 중 직경이 가장 작은 체의 직경 이하의 입자 크기, 특히 10 μm 이하, 특히 50 nm 내지 10 μm의 입자 크기를 가지는 분말.
일 실시양태에 따르면, 상기 포화 칼사이트 용액의 칼사이트 액체상은 칼사이트 상기 유기-광물층에 함유된 수-용성 및 지-용성 분자를 포함할 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 포화 칼사이트 용액의 칼사이트 고체상은 하기를 포함할 수 있다:
- 불용성 단백질 및 비-단백질 분자와 같은 칼사이트 유기-광물층에 함유된 불용성 분자, 및
- 체진동기의 체의 직경 중 직경이 가장 작은 체의 직경 이하의 입자 크기, 특히 10 μm 이하, 특히 50 nm 내지 10 μm의 입자 크기를 가지는 분말.
구현의 바람직한 실시양태에 따르면, 분리 단계 (c)는 원심분리에 의해 수행되고, 회수된 액체상은 상청액으로 지징되고, 회수된 고체상은 펠릿으로 지칭된다.
일 실시양태에 따르면, 상기 아라고나이트 펠릿 분말 및/또는 상기 칼사이트 펠릿 분말, 특히 아라고나이트 펠릿 분말은 구형화 단계(spheronisation step)를 거칠 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 아라고나이트 펠릿 및/또는 상기 칼사이트 펠릿, 특히 칼사이트 펠릿은 초임계 CO2 처리 단계 (d)를 거칠 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 초임계 CO2 처리 단계 (d)는 하기를 포함하는 설비에서 실행될 수 있다:
- 기체 상태의 CO2 주입구 및 저장 탱크,
- 기체 CO2를 액체 CO2로 변환하기 위한 응축기,
- 액체 CO2 저장 탱크,
- 액체 CO2를 초임계 CO2로 변환하기 위한 열 교환기,
- 가용성 분자의 추출이 일어나는 반응기, 및
- 하나 이상의 추출기.
상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득되는 가용성 분자는 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 가용성 분자이다.
가용성 지방산, 지질 및 색소는 본 특허 출원의 발명자들에 의해 출원된 FR 3 037 801에 개시된 가용성 생체고분자 추출 공정에 의해 수득될 수 없다.
특정 실시양태에 따르면, 상기 초임계 CO2-처리된 아라고나이트 분말의 입자 크기는 상기 아라고나이트 침투 분말의 입자 크기 이하, 특히 상기 아라고나이트 침투 분말의 입자 크기와 동일하다.
특정 실시양태에 따르면, 상기 초임계 CO2-처리된 칼사이트 분말의 입자 크기는 상기 칼사이트 침투 분말의 입자 크기 이하, 특히 상기 칼사이트 침투 분말의 입자 크기와 동일하다.
특정 실시양태에 따르면, 원심분리에 의해 수행된 상기 분리 단계 (c) 후에, 단리 공정은 다음 단계를 포함할 수 있다:
(e) 아라고나이트 상청액 및/또는 칼사이트 상청액을 여과하여 여과된 아라고나이트 상청액 및/또는 칼사이트 상청액을 수득하는 단계;
(f) 상기 여과된 아라고나이트 상청액 및/또는 상기 칼사이트 상청액을 농축하여 아라고나이트 농축물 및/또는 칼사이트 농축물을 수득하는 단계;
(g) 상기 아라고나이트 농축물 및/또는 상기 칼사이트 농축물을 초음파 처리하여 아라고나이트 콜로이드 에멀젼 및/또는 칼사이트 콜로이드 에멀젼을 수득하는 단계.
일 실시양태에 따르면, 상기 여과 단계 (e)는 셀라이트 베드(Celite bed) 또는 멤브레인 상에서 수행될 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 아라고나이트 농축물 및/또는 상기 칼사이트 농축물은 Mn, Fe, Zn, Ba, Sr, Mg, Cu, Al, Ni, V, Cr, Mo 및 이들의 혼합물로부터 선택된 하나 이상의 금속을 포함할 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 초음파 처리 단계 (g)는 20 kHz 내지 200 kHz 사이의 주파수에서 소노트로이드(sonotrode)로 수행될 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 공정은 초임계 CO2 처리 단계 (d) 후에, 다음 단계를 포함할 수 있다:
(h) 초임계 CO2-처리된 아라고나이트 분말 및/또는 초임계 CO2-처리된 칼사이트 분말을 냉산 가수분해(cold acid hydrolysis)하여 상기 분말에 존재하는 불용성 분자를 추출하는 단계; 및
(i) 세척 및 초원심분리하여 상기 불용성 분자를 단리 및 회수하는 단계.
상기 냉산 가수분해 단계 (h) 및 세척 및 초원심분리 단계 (i) 동안 회수된 불용성 분자는 불용성 생체고분자, 불용성 유기 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 불용성 분자이다.
일 실시양태에 따르면, 상기 냉산 가수분해 단계 (h)는 하기와 같이 수행될 수 있다:
- 10°C 미만, 특히 5°C 미만, 더욱 특히 1 내지 4°C 사이의 온도에서, 및
- 아세트산을 포함하고, pH가 산성, 특히 6 미만, 더욱 특히 4.5 미만인 수용액으로.
특정 실시양태에 따르면, 상기 냉산 가수분해 단계 (h) 및 세척 및 초원심분리 단계 (i)는 1회 또는 수회 수행될 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 회수된 불용성 분자는 건조되어 불용성 분자의 건조 추출물을 수득할 수 있다.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 상기 분쇄 단계 (a)는 상기 아라고나이트 유기-광물층 및 상기 칼사이트 유기-광물층에 대해 별도로 수행되어 상기 아라고나이트 분말 및 상기 칼사이트 분말이 수득된다.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 상기 열 침투 단계 (b)는 상기 아라고나이트 분말 및 상기 칼사이트 분말에 대해 별도로 수행되어 하기가 수득된다.
- 한편으로는, 상기 포화 아라고나이트 용액, 및, 다른 한편으로는, 상기 아라고나이트 침투 분말, 및
- 한편으로는, 상기 포화 칼사이트 용액, 및, 다른 한편으로는, 상기 칼사이트 침투 분말.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 상기 분리 단계 (c)는 상기 포화 아라고나이트 용액 및 상기 포화 칼사이트 용액에 대해 별도로 수행되어 하기가 회수된다:
- 한편으로는, 상기 아라고나이트 액체상 및, 다른 한편으로는, 상기 아라고나이트 고체상, 및
- 한편으로는, 상기 칼사이트 액체상, 및, 다른 한편으로는, 상기 칼사이트 고체상.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 상기 분리 단계 (c)는 상기 포화 아라고나이트 용액 및 상기 포화 칼사이트 용액에 대해 원리심리에 의해 별도로 수행되어 하기가 회수된다:
- 한편으로는, 상기 아라고나이트 상청액, 및, 다른 한편으로는, 상기 아라고나이트 펠릿, 및
- 한편으로는, 상기 칼사이트 상청액, 및, 다른 한편으로는, 상기 칼사이트 펠릿.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)는 상기 아라고나이트 침투 분말, 및 상기 칼사이트 침투 분말 및 상기 칼사이트 펠릿의 혼합물에 대해 별도로 수행된다.
특정 실시양태에 따르면:
- 상기 분쇄 단계 (a)는 상기 아라고나이트 유기-광물층 및 상기 칼사이트 유기-광물층에 대해 별도로 수행되어 상기 아라고나이트 분말 및 상기 칼사이트 분말이 수득되고;
- 상기 열 침투 단계 (b)는 상기 아라고나이트 분말 및 상기 칼사이트 분말에 대해 별도로 수행되어 하기가 수득되며;
- 한편으로는, 상기 포화 아라고나이트 용액, 및, 다른 한편으로는, 상기 아라고나이트 침투 분말, 및
- 한편으로는, 상기 포화 칼사이트 용액, 및, 다른 한편으로는, 상기 칼사이트 침투 분말,
- 상기 분리 단계 (c)는 상기 포화 아라고나이트 용액 및 상기 포화 칼사이트 용액에 대해 원심분리에 의해 별도로 수행되어 하기가 회수되고;
- 한편으로는, 상기 아라고나이트 상청액, 및, 다른 한편으로는, 상기 아라고나이트 펠릿,
- 한편으로는, 상기 칼사이트 상청액, 및, 다른 한편으로는, 상기 칼사이트 펠릿, 및
- 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)는 상기 아라고나이트 침투 분말, 및 상기 칼사이트 침투 분말 및 상기 칼사이트 펠릿의 혼합물에 대해 별도로 수행된다.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 상기 여과 단계 (e)는 상기 아라고나이트 상청액 및 상기 칼사이트 상청액에 대해 별도로 수행되어 상기 여과된 아라고나이트 상청액 및 상기 여과된 칼사이트 상청액이 수득된다.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 상기 농축 단계 (f)는 상기 여과된 아라고나이트 상청액 및 상기 여과된 칼사이트 상청액의 혼합물에 대해 수행되어 농축물의 혼합물이 수득된다.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 상기 초음파 처리 단계 (g)는 상기 농축물의 혼합물에 대해 수행되어 콜로이드 에멀젼의 혼합물이 수득된다.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 상기 냉산 가수분해 단계 (h)는 초임계 CO2-처리된 아라고나이트 분말 및 초임계 CO2-처리된 칼사이트 분말의 혼합물에 대해 수행되어 상기 분말의 혼합물로부터 불용성 분자가 추출된다.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 상기 세척 및 초원심분리 단계 (i)는 수행되어 상기 냉산 가수분해 단계 (h) 동안 초임계 CO2-처리된 아라고나이트 분말 및 CO2-처리된 칼사이트 분말의 혼합물로부터 추출된 불용성 분자가 단리 및 회수된다.
특정 실시양태에 따르면:
- 상기 여과 단계 (e)는 상기 아라고나이트 상청액 및 상기 여과된 칼사이트 상청액에 대해 별도로 수행되어 상기 여과된 아라고나이트 상청액 및 상기 여과된 칼사이트 상청액이 수득되고;
- 상기 농축 단계 (f)는 상기 여과된 아라고나이트 상청액 및 상기 여과된 칼사이트 상청액의 혼합물에 대해 수행되어 농축물의 혼합물이 수득되며;
- 상기 초음파 처리 단계 (g)는 상기 농축물의 혼합물에 대해 수행되어 콜로이드 에멀젼의 혼합물이 수득되고;
- 상기 냉산 가수분해 단계 (h)는 초임계 CO2-처리된 아라고나이트 분말 및 초임계 CO2-처리된 칼사이트 분말의 혼합물에 대해 수행되어 상기 분말의 혼합물로부터 불용성 분자가 추출되며; 및
- 상기 세척 및 초원심분리 단계 (i)는 수행되어 상기 냉산 가수분해 단계 (h)에서 초임계 CO2-처리된 아라고나이트 분말 및 CO2-처리된 칼사이트 분말의 혼합물로부터 추출된 불용성 분자가 단리 및 회수된다.
바람직한 실시양태에 따르면,
- 상기 분쇄 단계 (a)는 상기 아라고나이트 유기-광물층 및 상기 칼사이트 유기-광물층에 대해 별도로 수행되어 상기 아라고나이트 분말 및 상기 칼사이트 분말이 수득되고;
- 상기 열 침투 단계 (b)는 상기 아라고나이트 분말 및 상기 칼사이트 분말에 대해 별도로 수행되어 하기가 수득되며;
- 한편으로는, 상기 포화 아라고나이트 용액, 및, 다른 한편으로는, 상기 아라고나이트 침투 분말, 및
- 한편으로는, 상기 포화 칼사이트 용액, 및, 다른 한편으로는, 상기 칼사이트 침투 분말,
- 상기 분리 단계 (c)는 상기 포화 아라고나이트 용액 및 상기 포화 칼사이트 용액에 대해 원심분리에 의해 별도로 수행되어 하기가 수득되고:
- 한편으로는, 상기 아라고나이트 상청액, 및, 다른 한편으로는, 상기 아라고나이트 펠릿, 및
- 한편으로는, 상기 칼사이트 상청액, 및, 다른 한편으로는, 상기 칼사이트 펠릿;
- 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)는 상기 아라고나이트 침투 분말, 및 상기 칼사이트 침투 분말 및 상기 칼사이트 펠릿의 혼합물에 대해 별도로 수행되며;
- 상기 여과 단계 (e)는 상기 아라고나이트 상청액 및 상기 여과된 칼사이트 상청액에 대해 별도로 수행되어 상기 여과된 아라고나이트 상청액 및 상기 여과된 칼사이트 상청액이 수득되고;
- 상기 농축 단계 (f)는 상기 여과된 아라고나이트 상청액 및 상기 여과된 칼사이트 상청액의 혼합물에 대해 수행되어 농축물의 혼합물이 수득되며;
- 상기 초음파 처리 단계 (g)는 농축물의 혼합물에 대해 수행되어 콜로이드 에멀젼의 혼합물이 수득되고;
- 상기 냉산 가수분해 단계 (h)는 초임계 CO2-처리된 아라고나이트 분말 및 초임계 CO2-처리된 칼사이트 분말의 혼합물에 대해 수행되어 상기 분말의 혼합물로부터 불용성 분자가 추출되며; 및
- 상기 세척 및 초원심분리 단계 (i)는 수행되어 상기 냉산 가수분해 단계 (h)에서 초임계 CO2-처리된 아라고나이트 분말 및 CO2-처리된 칼사이트 분말의 혼합물로부터 추출된 불용성 분자가 단리 및 회수된다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명의 단리 공정은 하기를 수득하는 것을 가능하게 한다:
- 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 상기 아라고나이트 고체상 및/또는 상기 칼사이트 고체상, 상기 고체상은 구형화될 수 있음,
- 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 가용성 분자,
- 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 상기 아라고나이트 콜로이드 에멀젼 및/또는 상기 칼사이트 콜로이드 에멀젼, 또는
- 상기 냉산 가수분해 단계 (h) 및 세척 및 초원심분리 단계 (i) 동안 회수된 불용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 불용성 분자.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 본 발명의 단리 공정은 하기를 수득하는 것을 가능하게 한다:
- 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 아라고나이트 고체상, 상기 아라고나이트 고체상은 선택적으로 구형화됨,
- 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에멀젼의 혼합물,
- 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 가용성 분자, 및
- 상기 냉산 가수분해 단계 (h) 및 세척 및 초원심분리 단계 (i) 동안 회수된 불용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 불용성 분자,
상기 분리 단계 (c)가 원심분리에 의해 수행되면, 그 다음 본 발명의 단리 공정은 상기 아라고나이트 고체상 대신에 상기 아라고나이트 펠릿 및/또는 상기 칼사이트 고체상 대신에 상기 칼사이트 펠릿을 수득하는 것을 가능하게 하며, 상기 펠릿은 선택적으로 구형화된다.
본 발명의 또 다른 주제는 하기를 포함하는 조성물이다:
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 상기 아라고나이트 고체상 및/또는 상기 칼사이트 고체상, 상기 고체상은 선택적으로 구형화됨,
및 하기로부터 선택된 적어도 하나의 성분:
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 가용성 분자,
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 상기 아라고나이트 및/또는 상기 칼사이트 콜로이드 에멀젼, 및
- 상기 냉산 가수분해 단계 (h) 및 세척 및 초원심분리 단계 (i) 동안 회수된 불용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 불용성 분자.
특정 실시양태에 따르면, 조성물은 하기를 포함할 수 있다:
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 상기 아라고나이트 고체상, 상기 아라고나이트 고체상은 선택적으로 구형화됨,
및 하기로부터 선택된 적어도 하나의 성분:
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 가용성 분자,
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에멀젼의 혼합물,
- 상기 냉산 가수분해 단계 (h) 및 세척 및 초원심분리 단계 (i) 동안 회수된 불용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 불용성 분자.
일 실시양태에 따르면, 상기 조성물은 이들 화합물의 혼합으로부터 생성될 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 조성물은 또한 에센셜 및 식물성 오일의 혼합물을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 상기 조성물은 하기를 포함한다:
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 상기 아라고나이트 고체상 및/또는 상기 칼사이트 고체상, 상기 고체상은 선택적으로 구형화됨,
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 상기 아라고나이트 및/또는 상기 칼사이트 콜로이드 에멀젼.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 상기 조성물은 하기를 포함할 수 있다:
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 상기 아라고나이트 고체상, 상기 아라고나이트 고체상은 선택적으로 구형화됨, 및
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에멀젼의 혼합물.
특정 실시양태에 따르면, 상기 조성물은 하기를 포함할 수 있다:
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 상기 아라고나이트 고체상 및/또는 상기 칼사이트 고체상, 상기 고체상은 선택적으로 구형화됨,
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초임계 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 가용성 분자, 및
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 상기 아라고나이트 및/또는 칼사이트 콜로이드 에멀젼.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 상기 조성물은 하기를 포함할 수 있다:
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 상기 아라고나이트 고체상, 상기 아라고나이트 고체상은 선택적으로 구형화됨,
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 가용성 분자, 및
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에멀젼의 혼합물.
특정 실시양태에 따르면, 상기 조성물은 하기를 포함할 수 있다.
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 상기 아라고나이트 고체상 및/또는 상기 칼사이트 고체상, 상기 고체상은 선택적으로 구형화됨,
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 가용성 분자,
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 상기 아라고나이트 및/또는 칼사이트 콜로이드 에먼젼, 및
- 상기 냉산 가수분해 단계 (h) 및 세척 및 초원심분리 단계 (i) 동안 회수된 불용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 불용성 분자.
매우 특정한 실시양태에 따르면, 상기 조성물은 하기를 포함할 수 있다:
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 상기 아라고나이트 고체상, 상기 아라고나이트 고체상은 선택적으로 구형화됨,
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 가용성 분자,
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에먼젼의 혼합물, 및
- 상기 냉산 가수분해 단계 (h) 및 세척 및 초원심분리 단계 (i) 동안 회수된 불용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 불용성 분자.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명과 관련된 조성물에 포함된 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 상기 아라고나이트 고체상은 원심분리에 의해 수행되는 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 상기 아라고나이트 펠릿으로 대체될 수 있으며, 상기 아라고나이트 펠릿은 선택적으로 구형화된다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명과 관련된 조성물에 포함된 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 상기 칼사이트 고체상은 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 원심분리에 의해 수행되는 상기 분리 단계 (c) 동안 회수되는 칼사이트 펠릿으로 대체될 수 있으며, 상기 칼사이트 펠릿은 선택적으로 구형화된다.
본 발명의 또 다른 주제는 의약품으로서 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 조성물이다.
본 발명의 또 다른 주제는 상기 기재된 바와 같은 조성물이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 치료적 처리(therapeutic treatment) 방법이다.
일 실시양태에 따르면, 상기 치료적 처리는 피부 질환의 치료, 피부 질환의 예방으로부터 선택된다.
일 실시양태에 따르면, 상기 피부 질환은 피부염(dermatitis), 백반증(vitiligo) 및 건선(psoriasis)과 같은 피부병으로부터 선택된다.
일 실시양태에 따르면, 상기 조성물은 국소적으로 투여될 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 조성물은 또한 골 대체물(bone substitute), 시멘트(cement), 임플란트(implant), 골합성 장치(osteosynthesis devices), 치료용 의료용 장치로 사용될 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 골 대체물은 특히 진공 주사기에 포장된 압출성 골 대체물, 다공성 콜라겐 지지체를 갖는 골 대체물, 동물 또는 인간 기원의 미네날 스크린(mineral screen)을 가지는 골 대체물 및 이들의 혼합으로부터 선택될 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 시멘트는 스텐트 시멘트, 경피적 척추성형술(vertebroplasty) 및 경피적 풍선척추성형술(kyphoplasty)의 최소 침습 수술(minimally invasive surgery)을 위한 주입가능한 시멘트로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 주제는 상기 기재된 바와 같은 조성물의 비-치료적 사용이다.
본 발명의 또 다른 주제는 상기 기재된 바와 같은 조성물이 이를 필요로 하는 사람에서 적용되는 비-치료적 처리 방법이다.
일 실시양태에 따르면, 상기 조성물은 화장품, 특히 안검하수(ptosis), 피부 함몰(dermocutaneous depressions), 깊은(deep) 및 표면(superficial) 주름의 치료, 신체 노화(body ageing)의 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 주제는 배양 배지, 특히 줄기세포 또는 전구 세포의 성숙 및/또는 증식을 위한 배양 배지로의 상기 기재한 바와 같은 조성물의 사용이다.
일 실시양태에 따르면, 배양 배지로 사용되는 조성물은 하기를 포함할 수 있다:
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 상기 아라고나이트 고체상 및/또는 상기 칼사이트 고체상, 상기 고체상은 선택적으로 구형화됨,
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 가용성 분자, 및
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 상기 아라고나이트 및/또는 칼사이트 콜로이드 에멀젼.
일 실시양태에 따르면, 배양 배지로 사용되는 조성물은 하기를 포함할 수 있다:
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 원심분리에 의해 수행된 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 상기 아라고나이트 펠릿 및/또는 상기 칼사이트 펠릿, 상기 펠릿은 선택적으로 구형화됨,
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 가용성 분자, 및
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 상기 아라고나이트 및/또는 칼사이트 콜로이드 에멀젼.
본 발명의 또 다른 주제는 하기를 포함하는 또 다른 조성물이다:
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 가용성 분자,
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 상기 아라고나이트 및/또는 칼사이트 콜로이드 에멀젼.
특정 실시양태에 따르면, 상기 다른 조성물은 하기를 포함할 수 있다:
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 분자, 특히 적어도 가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 가용성 색소 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 가용성 분자,
- 단리 공정과 관련하여 상기 기재된 바와 같이 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에멀젼의 혼합물.
본 발명의 또 다른 주제는 의약품으로서 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 또 다른 조성물이다.
본 발명의 또 다른 주제는 상기 기재된 바와 같은 또 다른 조성물이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 치료적 처리 방법이다.
일 실시양태에 따르면, 상기 치료적 처리는 만성 자가면역 병리(chronic autoimmune pathologies)로부터 선택된다.
일 실시양태에 따르면, 상기 만성 자가면역 병리는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 크론병(Crohn's disease), 동맥경화증(arteriosclerosis), II 형 당뇨병(type II diabetes), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 건선(psoriasis) 및 건선 관절염(psoriatic arthritis), 특히 건선일 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 상기 다른 조성물은 근육 내, 정맥내 및/또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 아라고나이트 및 칼사이트 분말, 즉, 분쇄 단계 (a) 동안 분말로 환원된 껍데기의 내부 아라고나이트 및 외부 칼사이트 유기-광물층의 열 침투 단계 (b)를 실행하는 공정으로 구성된다. 상기 열 침투 단계 (b)로부터 생성된 상기 포화 용액은 이어서 원심분리에 의해 수행되는 분리 단계 (c)를 거친 후 선택적으로 농축 단계 (f) 및 초음파 처리 단계 (g)를 거칠 수 있다. 상기 열 침투 단계 (b)의 대상이 된 분말의 전부 또는 일부는 초임계 CO2 처리 단계 (d)를 거친다. 상기 열 침투 단계 (b) 및 초임계 CO2 처리 단계 (d) 동안 확보된 상기 아라고나이트 및 칼사이트 분말뿐만 아니라 상기 아라고나이트 유기-광물층 및/또는 상기 칼사이트 유기-광물층의 상기 열 침투 단계 (b)로부터 생성된 액체 용액을 원심분리하여 수행된 상기 분리 단계 (c)로부터 생성된 분말(이하, 아라고나이트 및/또는 칼사이트 펠릿)은 냉산 가수분해 (단계 (h))를 겪을 수 있다.
껍데기의 전처리(Pre-treatment of shells)
해당 이매패류(molluscs)의 껍데기는, 세척 후, 예를 들어, UC38 타입의 살균(bactericidal), 소독(disinfectant), 살바이러스(virucidal) 제제를 사용하여 50°C의 정수 용액에서 30분 동안 초음파 처리를 받았다. 이렇게 처리된 껍데기를 예를 들어, 약 50°C 온도의 정수로 헹군 다음, 2.5% 안정화된 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액에 30 분 동안 담그고, 5 분 동안 정수로 헹구었다. 그 다음 수술용 Calbenium® 용액에 1 시간 동안 담그고, 공기 흐름으로 건조시킨 다음, 고압멸균 백(autoclavable bag)에 포장하였다.
그 다음 상기 껍데기는 하나 이상의 멸균 단계를 거칠 수 있다. 상기 멸균 단계는 각각 132°C에서 85 분 동안 3회의 연속 "의료용 프리온(medical prion)" 멸균으로 구성될 수 있다. 상기 멸균된 껍데기는 공기 흐름에서 건조되어 따로 보관될 수 있다.
상기 껍데기는 등장성 “해양 플라즈마(marine plasma)" 수조에 담글 수 있다. 이 단계는 껍데기가 너무 오랫동안 해양 환경을 벗어나거나 및/또는 연속적인 처리를 받은 경우 변형되었을 수 있는, 상기 껍데기의 아라고나이트 및 칼사이트 유기-광물층의 초기 물 및 광물 함량을 유리하게 재-평형화(re-equilibrate)할 수 있다. 이 담금 단계는 최대 48 시간 동안 지속될 수 있다. 예를 들어, 상기 등장성 "해양 플라즈마"의 광물 함량은 하기와 같을 수 있다: Na 12.88 mg/L, Br 66.3 mg/L, Zn 0.083 mg/L, K 493 mg/L, P 0.707 mg/L, Ca 442 mg/L, Mg 1.29 mg/L, Cu 0.007 mg/L. 그 다음 껍데기를 공기-건조시키고 따로 보관하였다.
껍데기의 밀링, 파쇄 및 분쇄 단계 (a).
상기 껍데기의 아라고나이트 유기-광물층 및 칼사이트 유기-광물층을 별도로 처리하기 위하여, 상기 칼사이트 유기-광물층은 밀링 단계를 거칠 수 있다. 이 밀링 단계는 결이 거친(coarse-grained) 다이아몬드 밀링 휠을 사용하여, 예를 들어, 2 내지 4°C 사이의 온도에서 여과 및 냉각된 해수의 흐름 하에서 수행될 수 있다. 그 다음 그레인(grain) 크기가 2 mm 내지 500 μm인 분말 밀링 제품이 수득된다. 상기 밀링 제품은 상기 칼사이트 유기-광물층이 제거된 아라고나이트 유기-광물층과 함께 따로 보관된다.
상기 아라고나이트 유기-광물층은 FRITSCH Pulverisette 1 Premium Line zirconium oxide jaw 및 wall grinder에서 그레인 크기가 10 μm 내지 2 mm인 파쇄된 아라고나이트 분말이 수득될 때가지 파쇄될 수 있다.
그 다음 이 파쇄된 아라고나이트 분말은 플레니터리 분쇄(planetary grinding)에 의해 분쇄될 수 있다. 플레니터리 분쇄는 지르코늄 통(bowl) 및 지르코늄 볼(ball)을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 25 개의 직경이 20 mm인 지르코늄 볼 및 300 g 의 파쇄된 아라고나이트 분말을 각각 이전에 영하 30 °C에서 24 시간 동안 동결된 500 mL 용량의 2 개의 지르코늄 통에 넣는다. 그 다음 상기 통을 500 rpm의 속도에서 각각 5 분씩 2 번의 그라운딩 주기 동안 FRITSCH Pulverisette 5 PL 형 플레니터리 분쇄기의 그라인딩 챔버에 도입한다.
분쇄를 최적화하고 상기 분말이 통의 벽 및 볼 표면에 막히는(clogging) 것을 방지하기 위해, 두 번째 그라인딩 사이클은 예를 들어, 높은 끓는점과 낮은 증기압을 가지는 액체 형태의 첨가제, 예를 들어, 주사용수(WFI) 또는 이소프로판올 또는 에탄올과 같은 알코올을 첨가함으로써 습식으로 수행될 수 있다.
2 내지 4°C 사이에서 냉장된 WFI는 점도가 3.5 MPa인 콜로이드 용액이 수득될 때까지 각 통에 첨가될 수 있다. 두 번째 그라인딩 사이클이 끝나면, 입자 크기가 50 nm 내지 300 μm 사이인 아라고나이트 분말이 수득되고 따로 보관될 수 있다.
이러한 작업은, 특히 아라고나이트 유기-광물층의 광물 분획으로부터 생결정(biocrystals)의 분리 및 파쇄(fracturing)를 허용한다.
상기 칼사이트 유기-광물층의 밀링 생성물은 상기 아라고나이트 유기-광물층에서 수행되는 것과 동일한 분쇄 단계를 거칠 수 있으며, 이 분쇄 단계에서 50 nm 내지 300 μm 사이의 입자 크기를 갖는 칼사이트 분말이 또한 수득될 수 있다.
분쇄 단계에 의해 수득된 상기 아라고나이트 및 칼사이트 분말은 열 침투 단계를 거치기 전에 25 kGy에서 감마선으로 멸균될 수 있다.
열 침투 단계 (b).
열 침투는 가용성 성분의 습식 추출을 허용하는 투과성 매체(permeable medium)를 통한 여과 공정이다.
열 침투는 두 가지 이유로 유리한 것으로 판명되었다. 한편으로는 분쇄 단계 후의 상기 아라고나이트 분말을 광학현미경으로 관찰한 결과, 다른 직경의 그레인의 덩어리가 유기 잔류물에 의해 서로 달라붙어 있는 것으로 나타났다. 다른 한편으로는, 예를 들어, 메탄올의 존재하에서 열 침투는 상기 아라고나이트 유기-광물층의 유기 분획의 단백질-결합 지질을 가용화하는 것을 가능하게 한다.
이 현상은 상기 아라고나이트 유기-광물층을 구성하는 성분의 구조 및 물리-화학적 성질로 설명할 수 있다.
용해도 테스트는 접착 특성을 가진 이러한 유기 잔류물이 상기 아라고나이트 유기-광물층 및 상기 칼사이트 유기-광물층의 가용성 및 불용성 결정내 및 층간 유기 성분으로 구성되어 있음을 보여준다. 열 침투는 상기 아라고나이트 침투 분말의 현미경 관찰에서 광택이 있는 외관(shiny appearance)을 회복한(regained) 아라고나이트 분말 그레인의 세척을 허용한다. 침투는 습식 체질로 수행될 수 있다.
습식 체질은 위에서 아래로 구성되는, Filtra 타입 체진동기로 수행될 수 있다:
- 물 유입구용 파이프를 수용하기 위한 개구가 장착된 덮개,
- 위에서 아래로 기공 직경을 가지는 6 개의 체: 315, 250, 125, 45, 20 및10 μm,
- 침투로부터 물을 수집하기 위한 파이프가 장착된 수집 바닥.
상기 체진동기의 매개변수는 최대 진폭(maximum amplitude), 약 5 분 동안 지속되는 진동 시간(vibration time)으로 설정된다.
500 g에서1 kg의 정의된 양의 아라고나이트 분말을 상부 체에 넣어 다양한 두께의 투과성 필터를 만들 수 있고; 상기 체진동기에 돌출된 탱크는 지질을 가용화하기 위하여 45°C에서 5% 메탄올이 첨가된 WFI로 채워진다. 다른 실시양태에 따르면, 고분자량 단백질을 절단하기 위하여, 카오트로픽제(chaotropic agent)로서 요소 용액이 4 mol/L농도로 침투 전에 WFI에 첨가될 수 있다. 상기 용액은 여과막과 같은 역할을 하는 분말에 분무되며, 와류(vortex)를 생성하여 체진동기의 진동에 의해 여과력이 최적화된다.
상기 열 침투 단계 (b)에서, 더 작은 직경의 아라고나이트 분말의 그레인은 가장 큰 직경을 가지는 첫 번째 체에서 하부 체로 WFI 용액에 의해 운반될 수 있으며, 그들의 직경에 따라 가장 작은 직경을 가지는 마지막 체까지 침전될 수 있다. 예를 들어, 상기 마지막 체는 직경이 10 μm 보다 큰 그레인을 보유하여 10 μm 이하의 그레인을 통과시킬 수 있도록 10 μm 의 직경을 가질 수 있다.
상기 침투 생성물은 액체상 및 고체상으로 구성된 포화 용액이고, 상기 액체상은 상기 아라고나이트 유기-광물층의 수용성 및 지용성 성분의 전부 또는 일부를 함유하고, 상기 고체상은 직경이 마지막 체의 직경보다 작거나 같은, 특히 50 nm 내지10 μm인 아라고나이트 유기-광물층 및 아라고나이트 그레인의 불용성 성분을 함유한다.
상기 열 침투 단계 (b)는 또한 직경이 마지막 체의 직경보다 클 수 있는, 특히 10 μm 보다 클 수 있는 아라고나이트 그레인을 함유하는 침투 아라고나이트 분말을 생성한다.
상기 열 침투 단계 (b)는 상기 칼사이트 유기-광물층의 분쇄 단계 (a)로부터 생성된 칼사이트 분말에 동일한 방식으로 적용될 수 있다.
분리 단계 (c).
상기 열 침투 단계 (b)로부터 생성된 포화 용액으로부터 액체상 및 고체상을 분리하기 위하여, 분리 단계 (c)를 포화 용액에 적용하여 한편으로는 액체상을, 및 다른 한편으로는, 고체상을 회수할 수 있다. 예를 들어, 이 분리 단계 (c)는 원심분리에 의해 수행될 수 있으며, 회수된 액체상을 상청액이라 하고 회수된 고체상을 펠릿이라 할 수 있다. 여기서는 이 예만 설명하지만 당업자는 이 단계 (c)를 수행하기 위해 원심분리와 다른 분리 기술을 구현하는 방법을 알고 있을 것이다.
원심분리에 의해 수행되는 상기 분리 단계 (c)는 각각 300 mL의 용액을 함유하는 4 개의 바이알을 수용할 수 있는 4 개의 바스켓이 장착된 2-리터 Lisa-타입 원심분리기에서 수행될 수 있다. 회전 속도는 18000 rpm으로 증가할 수 있고, 온도는 5°C로 설정되고, 회전 시간은 20 분으로 설정된다.
상기 아라고나이트 펠릿 및/또는 상기 칼사이트 펠릿은 예를 들어, 오븐에서 25°C에서 12시간 동안 건조될 수 있다. 상기 아라고나이트 펠릿 및/또는 상기 칼사이트 펠릿은 10 μm 내지 50 nm 사이의 입자 크기를 가질 수 있으며, 불용성 단백질 및 비-단백질 성분을 함유할 수 있다. 그 다음 상기 아라고나이트 펠릿은 구형화되고 25 kGy에서 감마선으로 멸균을 위해 따로 보관될 수 있다. 칼사이트 펠릿은 따로 보관될 수 있다.
원심의 분리 단계 (c)는 1 회 이상 수행될 수 있다.
초임계 CO 2 처리 단계 (d).
관심 있는 가용성 분자는 가장 흔히 내부 결정(intracrystalline)이며, 아라고나이트 또는 칼사이트 여부에 관계없이 탄산칼슘 생결정(biocrystal)의 산 가수분해에 의한 용해를 필요로 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로, 본 발명의 공정은 초임계 CO2 처리 단계 (d)를 포함한다.
초임계 상태에서 CO2는 매우 특별한 하기 특성을 가지는 것으로 알려져 있다: 확산 계수, 잔류 오염물을 생성하지 않고, 지방뿐만 아니라 다소 저분자량 및 무극성인 가용성 성분을 추출할 수 있는 가능성을 가진다. 또한 바이러스 및 박테리아에 대한 살균 특성을 가진다. 또한, 공용매를 추가하면 용매력이 증가한다. 또한 낮은 점도 계수(coefficient of viscosity)를 가지고 표면 장력이 부족하여 침투력이 증가하며, 이는 특히 초임계 일 때 CO2를 포함한 기체에 투과성인 친수성 생체재료인 아라고나이트 및 칼사이트 생결정의 물리-화학적 성질에 의해 촉진된다.
초임계 CO2 처리를 위한 반응기의 설치는 5 가지 주요 요소를 포함한다:
- 기체 상태의 CO2의 주입구 및 저장 탱크,
- 기체 CO2를 액체 CO2로 변환하기 위한 응축기,
- 액체 CO2 저장 탱크,
- 액체 CO2를 초임계 CO2로 번환하기 위한 열 교환기,
- 가용성 분자의 추출이 일어나는 반응기, 및
- 하나 이상의 추출기.
상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)는 다음 절차에 따라 상기 아라고나이트 침투 분말에 적용될 수 있다:
상기 초임계 CO2 교환기에 연결된, 적당한 크기의 반응기에, 상기 열 침투 단계 (b) 후에 체에 수집된 상기 아라고나이트 침투 분말을 넣는다. 초임계 CO2를 방출하기 위해 교환기의 밸브가 열리면, 관심 있는 분자(가용성 생체고분자, 지방산, 지질, 색소)의 추출 반응이 일어나는 반응기로 후자(latter)가 주입된다. 배출구에서, 용해된 물질은 반응기에 연결된 1개 또는 두 개의 추출기에서 그들의 성질에 따라 회수되며, 온도 및 압력을 낮추면 건조 형태로 침전된다. 상기 CO2는 배출시 다시 기체 상태가 되어, 새로운 추출 사이클에 사용하기 위해 회수된다.
결과는, 한편으로는 초임계 CO2 처리된 아라고나이트 분말, 및, 다른 한편으로는, 상기 아라고나이트 유기-광물층으로부터의 가용성 성분으로, 그 다음, 25 kGy에서 감마선으로 멸균되고 따로 보관될 수 있다.
상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)는 상기 칼사이트 침투 분말 및 선택적으로 칼사이트 펠릿에 동일한 방식으로 적용될 수 있다.
여과 단계 (e).
원심분리에 의해 수행된 상기 분리 단계 (c) 후에, 상기 아라고나이트 상청액 및/또는 상기 칼사이트 상청액은 여과 단계 (f)에서 여과되어 여과된 아라고나이트 상청액 및/또는 여과된 칼사이트 상청액을 수득한 다음, 따로 보관될 수 있다.
예를 들어, 상기 여과 단계 (f)는 셀라이트 베드 또는 멤브레인에서 수행될 수 있다.
농축 단계 (f).
상기 여과된 아라고나이트 상청액 및/또는 상기 여과된 칼사이트 상청액은 예를 들어, 40°C의 온도, 10 rpm의 가열 플라스크 회전 속도 및 23.33 mbar의 진공에서 Buchi 타입 회전 증발기(Rotavapor)에서 농축될 수 있다.
이 농축 단계 (f)는 최대 1/4의 농축 계수를 가지는 아라고나이트 농축물 및/또는 칼사이트 농축물을 생성한다. 이 농축물은 그 안에 포함된 금속, 즉, Mn, Fe, Zn, Ba, Sr, Mg, Cu, Al, Ni, V, Cr, Mo으로부터 나오는 색소의 존재로 인해 노란색에서 오렌지, 빨간색에서 갈색 또는 회색으로 다양한 타색 착색(allochromatic colouring)을 가질 수 있다.
초음파 처리 단계 (g).
유리하게는, 상기 농축 단계 (f)로부터 생성된 상기 아라고나이트 농축물 및/또는 상기 칼사이트 농축물의 물리-화학석 특성을 음화학(sonochemistry)에 의한 초음파 처리 단계 (g)를 적용함으로써 수정 및 최적화하는 것이 가능하다.
초음파 처리는 농축물의 초기 점도에 의존하여 20 kHz 내지 200 kHz 사이의 주파수에서, 예를 들어, 소노트로이드를 사용하여 액체 매질에서 기계적 및 음파(acoustic waves)를 사용하는 공정이다. 유리하게는, 초음파 처리는 반응을 촉진하고 가속화하여 활성 가용성 분자의 약리학적 특성을 수정하고 증가시키게 할 수 있다.
실제로, 캐비테이션(cavitation)은 반응성이 높은 하이드록실화 라디칼의 형성을 유발하여, 그 결과 반응 수율이 향상되고, 관심 있는 분자가 서로 반응하는 시간이 감소하여 일부 분자의 항라디칼 특성이 기하급수적으로 상승한다.
처리할 용액은 전기 아크의 형성을 피하기 위하여, 표면 및 벽으로부터 최소 1 cm 떨어진 곳에 소노트로이드의 팁을 담근 초음파 탱크에 넣을 수 있다.
상기 초음파 처리 단계 (g)는 30 분 동안 적용될 수 있으며, 그 후는 농축물의 점도 증가가 관찰될 수 있다. 상기 농축물은 물리-화학적 변형과 콜라겐 성분의 배열 덕분에 안정적인 콜로이드 에멀젼의 형태가 된다. 그 다음 상기 콜로이드 에멀젼은 정밀여과, 멸균 여과 또는 25 kGy 감마선에 의해 멸균될 수 있다. 제품은 5°C의 온도에서 보관될 수 있다.
냉산 가수분해 단계 (h) 및 세척 및 초원심분리 단계 (i).
상기 초임계 CO2-처리된 아라고나이트 분말 및/또는 상기 초임계 CO2-처리된 칼사이트 분말에 함유된 생체고분자 및 기타 불용성 성분을 수집하기 위하여, 상기 분말은 냉산 가수분해를 거칠 수 있다.
상기 초임계 CO2-처리된 아라고나이트 분말 및 상기 초임계 CO2-처리된 칼사이드 분말을 혼합하여 2°C에서 발열원-없는 물로 채워진 적절한 용량의 냉장 가수분해 반응기에 넣을 수 있다. 가능한 이온, 미네랄 매트릭스/단백질 상호작용을 약화시키기 위하여 이온 강도를 미리 조절할 수 있다. NaCl은 30 분 동안 교반하면서 용액에 0.5 mol로 첨가되며, 즉, 비율에 의존하여 분말 1 kg에 물 25 리터 및 NaCl 5 리터이다. 그 다음, 예를 들어, 18000 g에서 1차 원심분리가 수행된다. 펠릿은 80% 아세트산이 같은 비율로 첨가된 적절한 양의 발열원 없는 물에 용해된다. 전체는 일정한 교반하에서, 4.5 미만의 pH에서 1 내지 4 °C 사이의 온도에서 유지된다. 이를 분해하기 위해 발열원이 없는 물로 희석된 에멀젼이 수득된다: 용해되지 않은 탄산칼슘의 존재 또는 부재는 옥살산으로 확인된다. 이는 거즈(gauze) 및 경사법(decantation)을 통해 제거된다. 이 단계에서, 불용성 단백질 및 기타 성분, 불용성 색소를 포함하는 현탁액이 수득되며, 이는 예를 들어, 18000 g에서 연속적으로 원심분리된다. 상기 원심분리 펠릿은 탄산칼슘 잔류물을 용해시기키 위해 5%로 희석된 동일한 양의 아세트산에서 교반하면서 다시 취한다. 상기 원심분리 펠릿을 동일한 양의 비발열성 물로 2 회 세척하고 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH를 7로 조정한다.
각각의 세척은 초원심분리로 이어지며, 마지막에 불용성 단백질의 젖은 페이스트가 수득되며, 이는 동결건조 또는 분무에 의해 건조된다. 상기 수득된 건조 생성물을 입자 크기가 10 μm 내지 50 nm 사이의 회색 분말로 분쇄하고, 25 kGy에서 감마선으로 멸균하고 따로 보관된다.
이러한 여러 단계가 끝나면 하기를 수득할 수 있다:
- 상기 아라고나이트 분말의 상기 열 침투 단계 (b) 후 원심분리에 의해 수행된 상기 분리 단계 (c) 동안 회수된 펠릿으로부터 유래하는 50 nm 내지10 μm 사이의 입자 크기를 가지는 구형화된 아라고나이트 그레인의 멸균된 분말,
- 가용성 고분자, 가용성 유기 색소(베타-카로틴), 금속, 메탈로프로테인 (metalloproteins), 메탈로엔자임, 성장 인자, 당단백질, 글루코사민, 다중불포화 지질 및 지방산을 포함하는 초음파 처리 단계 (g)로부터 유래하는 콜로이드 에멀젼,
- 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)로부터의 생체고분자 및 가용화 유기 색소, 및
- 상기 가수분해 단계 (h) 및 세척 및 초원심분리 단계 (i)로부터 회수된 불용성의, 소위 지지체 및 구조적 생체고분자, 불용성 색소.
이러한 모든 추출물은 의료 기기의 제형화, 정형외과 수술, 최소 침습 수술, 피부과, 구강내과, 악안면 수술, 미용 의학에서의 사용을 위한 치료적 목적의 제제 및 피부미용 제품의 제형화에 전체 또는 일부를 사용하도록 의도된다.
다음의 비제한적 실시예는 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 적용을 예시한다.
실시예
실시예 1: 관절성형술(arthroplasty)에 사용하기 위한 밀봉 시멘트(sealing cement)의 제형
고관절, 어깨, 무릎 또는 임의의 다른 관절의 골관절염은 노화 및 관절 제약의 조합된 작용으로 인해 가장 흔한 관절 병리(joint pathology)인 것으로 알려져 있다.
관절 표면의 연골 코팅이 마모되고 점진적인 악화로 인해 변화가 생겨 고관절 질환에서 발생하는 것과 같은 통증과 기능적 노쇠가 발생하기 때문에, 결국 보철물(prosthesis)이 필요하다. 상기 보철물은 일반적으로 장골(iliac bone)의 관골구(acetabulum)에 이식된 반구형의 컵(hemispherical cup), 대퇴골 간부(femoral shaft)에 이식되고 반구형의 머리(hemispherical head)에서 끝나는 스템(stem)으로 구성된다. 이 두 부분은 폴리에틸렌 또는 세라믹 인서트를 통해 서로 연결된다. 대퇴부 보철물의 스템 및 컵은 일반적으로 메틸 메타크릴레이트-기반 외과용 시멘트로 밀봉되거나 또는 밀착된다.
메틸 메타크릴레이트-기반 외과용 시멘트를 사용할 때 종종 발생하는 수술후 합병증(post-operative complications) (온도가 70°C 이상으로 상승하는 응결 반응), 시멘트의 노화 및 수축을 고려하면, 합병증은 일반적으로 시멘트 없이 보철물이 재밀봉되거나 때때로 밀착되는 것으로 끝난다: 목표는 임플란트 주변의 뼈 재성장에 의한 생리학적 기계적 고정을 달성하는 것이며, 때때로 그 자체가 재생 과정의 선호하는 합성 생체 재료로 덮여 있기도 하다.
이러한 이유로, 이 실시예는 하기와 같은 백분율의 제형을 가지는 밀봉 시멘트이다:
95　g 원심분리에 의해 수행되는 상기 분리 단계 (c)에서 수득되고 구형화된 아라고나이트 분말 (50 nm 내지10 μm 사이의 입자 크기),
4　g 탄산 칼슘 (carbonated calcium carbonate),
1　g 인산수소나트륨(sodium hydrogen phosphate),
90　mL 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에멀젼,
5　g 카르복시메틸 셀룰로오즈 나트륨
50 nm 내지 10 μm 사이의 입자 크기를 가지는 구형화된 아라고나이트 분말의 사용은 다음과 같은 이유로 정당화된다: 구형화는 초기에 시멘트의 더 나은 주입성과 유동성을 보장하고, 골 전도에 필수적인 10 내지 100 μm의 기공을 가지는 상호 연결된 다공성의 생성을 촉진하기 위한 것이다.
밀봉 시멘트는 일단 건조되면, 뼈를 수용하는 뼈의 압축 강도와 적어도 같아야 하는 것으로 알려져 있다. 상기 아라고나이트 유기-광물층의 압축 영률(Young's modulus)은 141 MPa이고, 피질골(cortical bone)의 압축 영률이 131 MPa임을 알면, 상기 시멘트가 기존 시멘트보다 더 나은 고정 및 하중 분포뿐만 아니라 더 나은 저항을 제공하는데 완벽하게 적합함을 이해할 수 있다.
상기 시멘트 제형에서 탄산 칼슘(carbonated calcium carbonate)이 존재하는 것은 탄산화 공정에서 탄산 칼슘에 의해 얻어지는 가소성, 접착성 및 응집성으로 인해 정당화된다.
가용성 및 불용성 단백질인, "시그널(signal)" 분자는 세포 분화 및 증식뿐만 아니라 골형성을 자극하여 뼈 구조를 구축하는데 중용한 역할을 한다. 탄산 칼슘(carbonated calcium carbonate)을 첨가하면 전체에 가소성, 접착성 및 가단성을 부여하고, 아라고나이트 그레인의 구형화에 의해 선호되어, 취급 및 삽입이 더 쉬어진다.
응결 촉진제(setting accelerator)를 추가하면 준비 시간, 초기 응결 시간 및 최종 응결 시간을 수정할 수 있다. 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에멀젼을 혼합물에 첨가하면, 유체의 균질하고 안정적인 페이스트를 수득할 수 있다.
상기 시멘트는 종아리의 태퇴골(femoral shaft)에서 스텐트 스템을 실험적으로 밀봉하는데 사용되었다. 수술 후 X-ray는 보철 스템 주변의 치밀화를 보여주었으며, 이는 상기 내부 아라고나이트 유기-광물층의 광물 분획의 주요 성분인 탄산칼슘의 존재의 특징으로, 상기 시멘트가 새로운 뼈로 변형되는 동안 점진적으로 감소하고 수용된 뼈와 융합되는 치밀화를 보여주었다.
4 개월 째의 조직검사는, 피질(cortex)의 얇아짐 없이 보철 스템 주위에 새로운 골이 존재하는 것을 보여주었으며, 이는 상기 시멘트가 자가해면골(autologous cancellous bone)과 피질골로 변환되었음을 시사한다.
이러한 발견은 특히 "BMP2-유사" 효과와 그들의 골-유도 특성을 가지는 저분자량 당단백질, 항생체모방(antibiomimetic) 특성을 가지는 아미노글리코사이드, 색소, 아미노산 및 글리코사미노글리칸을 포함한 단백질의 존재로 설명될 수 있다.
실시예 2: 골관절 보철물(osteoarticular prostheses)의 교정을 위한 성형 가능한 골 대체물
고관절, 어깨 또는 무릎 보철물 재치환술(knee prosthesis revision) 동안 잔류 메틸 메타크릴레이트 시멘트의 제거는 모든 잔류 시멘트를 제거하기 위한 접근을 수행해야 하기 때문에 뼈 구조의 심각한 부식을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. 재건 골합성(Reconstructive osteosynthesis)은 자가 이식편 또는 합성 골 대체물을 사용하며, 이는 보철물을 밀봉하기 위한 외과용 시멘트의 사용을 배제하지 않는다.
그렇기 때문에 이 실시예는 접근 절차를 수행해야 하는 필요성으로 인한 물질 손실을 채울 뿐만 아니라, 새로운 보철물을 밀봉하는데에도 사용되는 골 대체물이다. 상기 실시예의 대체물의 제형은 다음과 같다.
85　g 원심분리에 의해 수행되는 상기 분리 단계 (c)에서 수득되고 및 구형화된 아라고나이트 분말 (10 μm 내지200 μm 사이의 입자 크기),
2.5　g 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)서 수득된 가용성 생체고분자,
2.5　g 상기 냉산 가수분해 단계 (h) 및 세척 및 초원심분리 단계 (i)에서 수득된 불용성 생체고분자,
5　g 탄산 칼슘(carbonated calcium carbonate),
75　mL 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에멀젼,
5　g 인산수소나트륨.
상기 아라고나이트 분말의 입도측정(granulometry)은 골 대체물의 골-유도 특성 및 항생체모방 특성과 관련된 신속한 골-전도에 도움이 되도록, 개방적이고 상호연결된 다공성의 생성을 촉진하도록 선택된다.
상기 실시예의 골 대체물의 다양한 용도가 제시된다.
포도상구균 패혈증(staphylococcal sepsis)으로 골수정(medullary nail)의 파열 후 상완골 골절(humerus fracture)의 감소 실패 후, 팔꿈치에 누공이 생긴 중요한 임상 사례의 입원 환경에서의 회복(Inpatient recovery).
골절된 정형외과적 재료를 제거한 후, 괴사조직을 트리밍하고 골유합판(osteosynthesis plate)을 삽입한 후, 예방적 항생제(antibiotic prophylaxis) 없이 골 대체물을 사용하였다.
항생체모방 특성은 사용 전에 본 발명에 따른 제품에 대한 미생물 부하 시험(microbial load tests)에 의해 확인되었으며, 이는 특히 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스페르길루스 브라실리엔시스(Aspergillus brasiliensis), 황색 포두구균(Staphylococcus aureus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 고초균(Bacillus subtilis)의 균주에서 미생물 증식의 억제를 입증했다.
수술 후 추적관찰은 감염성 에피소드(infectious episode)의 진정이 관찰되었고, 수술 후 3 개월에 X-ray에서는 골 조직의 회복이 관찰되었다.
골 대체물은 또한, 2년에 걸쳐 골수정을 이용한 정형외과적 실패와 2 번의 장골 이식을 시도 한 후, 15 cm 길이의 대퇴골 하부 1/3의 분쇄된 작은 조각 골절의 치료를 재개한 또 다른 중용한 임상 사례에서 병원 환경(hospital setting)에서 사용되었으며, 다음의 임상 양상(clinical picture)을 가진다: 횡문근 용해(rhabdomyolysis), 코마(coma) 및 생명 유지(life support). 외부 고정 장치의 배치, 정형외과 재료 및 뼈 격리 장치(bone sequestration)의 제거 후, 예시된 골 대체물은 물질의 손실의 치수에 맞게 실린더로 성형되었고 원위 및 근위 단편(fragments) 사이에 배치되었다. 수술 후 4 개월에는 단일 지지(unipodal support)가 7 개월에는 거의 정상 보행이 가능했다. 방사선학적 대조군은 정상 두께의 피질골의 재건뿐만 아니라 복원된 대퇴골의 근위 및 원위 단편 사이의 골수관(medullary canal) 투과성을 보여주었다.
이러한 모든 관찰은 골 대체물의 골-유도 특성뿐만 아니라 골-전도성 및 항생체모방 특성, 및 수혜자의 국부적 전신 조절의 제어에 의존할 수 있는 능력을 입증했다.
본 발명자들은 또한 최소 침습 수술, 경피적 풍선척추성형술, 경피적 척추성형술, 골다공증, 골절 및 척추 압박의 치료에서 골 대체물의 사용을 제안한다.
임상적으로, 수술 부위의 습도에도 불구하고 37°C의 체온에서 골 대체물의 급속한 경화가 관찰된다.
한편, 골 대체물의 응집력, 가소성 및 접착 특성은 탈혼합(demixigng)으로 인한 혈관 누출(vascular leakage) 가능성을 상당하게 제한한다.
상기 실시예의 골 대체물은 악안면 수술 및 구강내에서도 사용할 수 있다.
실시예 3: 증증 난치성 피부병의 치료를 위한 국소 제제
패치 형태(patches)로 발생하는 팔꿈치 및 두피의 건선과 같은 특정 형태의 피부병은 때때로 국소 더마코르티코이드를 비롯한 임의의 치료에 난치성인 것으로 알려져 있다. 이것이 본 발명자들이 판상 건선(plaque psoriasis)에 적합한 제제를 제안하는 이유이다. 실제로, 각질형성(keratogenesis)의 가속화는 피부 각질층이 무질서로 두꺼워지게 하여 국소 침투를 방지하는 증식성 케라틴 플라크(keratin plaques)의 형성을 초래한다.
상기 실시예의 국소 제제의 제형은 하기와 같다:
20　g 원심분리에 의해 수행되는 상기 분리 단계 (c)에서 수득되고 구형화된 아라고나이트 분말 (50 nm 내지10 μm의 입자 크기),
2　g 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)서 수득된 가용성 생체고분자,
5　g 요소,
10　g 알란토인,
3　g 살리실산,
60　mL 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에멀젼,
1 mL 에센셜 오일 및 식물성 오일의 혼합물,
부형제 W/O q.s. 100　g
상기 실시예의 국소 제제에 사용된 에센셜 및 식물 오일의 혼합물의 제형은 다음과 같다:
1 mL 라벤듈라 앵구스티폴리아(Lavandula angustifolia)
1 mL 카마이멜룸 노빌레(Chamaemelum nobile)
1 mL 멜라루카 앨터니폴리아(Melaleuca alternifolia)
1.5 mL 헬리크리섬 이탈리쿰(Helychrisum italicum)
1 mL 주니퍼러스 옥시세드루스(Juniperus oxycedrus)
1.5 mL 미르투스 커뮤니스(Myrtus communis)
20 mL 아르가니아 스피노사(Argania spinosa)
50 mL 페르시아 아메리카나(Persea Americana)
10 mL 보라고 오피키날리스(Borago officinalis),
13 mL 밀 배아(Wheat germ)
실제로, 2 내지 5°C 사이의 온도에서 유지되는 겔이 얻어질 때까지 20 g의 아라고나이트 분말, 2g의 가용성 생체고분자, 30 ml의 콜로이드 에멀젼을 포함하는 용액이 준비된다.
5 g의 요소, 10 g의 알란토인, 3 g의 살리실산 및 30 mL의 콜로이드 에멀젼을 함유하는 혼합물 또한 준비된다.
전체가 완전히 용해될 때까지 30 분 동안 혼합한 다음, 24 시간 동안 25℃의 오븐에 넣고 6 시간 마다 교반하여 CO2의 방출을 제어한다. 그 다음, 모든 성분을 블렌더에 넣고 1 시간 동안 혼합한다.
실시예 4: 백반증 치료를 위한 국소 제제
백반증은 치료가 어렵고 시간이 많이 걸리는 비-전염성 및 심각한 피부병으로, 세계 인구의 0.5 내지 2%에 영향을 미치고 진행을 예측할 수 없으며, 심리-사회적 파장이 매우 큰 것으로 알려져 있다. 이는 확산 반점(patche), 부위별 또는 일반화된 피부의 탈색소화를 유발한다. 이는 피부의 주요 색소인 멜라닌을 생성하는 세포인 멜라닌 세포(melanocytes)가 소실되어 흰색 반점(white patches)이 나타나는 것으로 나타난다.
치료 가능성은 제한적이다. UVB의 사용으로부터 더모코르티코이트 및 바이오시밀러, 국소 제제, 및 최후의 수단으로, 멜라닌 세포의 외과적 이식술(surgical grafts) 또는 얇은 피부 이식술에 이르기까지 다양하다. 현재까지 백반증에 대한 효과적인 보편적인 치료법은 없다. 또한, 제안된 대부분의 치료법은 당혹스럽거나 또는 심각한 부작용이 있을 수 있다. 또한, 백반증은 마찰 부위의 미세외상(microtrauma)에 의해 우발적으로 제거되는 각질 세포의 취약성으로 인해, 종종 피부 표면의 변화 및 얇아짐을 동반한다. 기저막(basement membrane) 및 인접 각질 세포와의 응집 및 부착 문제로 인해, 성숙 기능 장애로 인해, 멜라닌 세포, 모구(hair bulbs), 멜라닌의 저장소가 소실되기도 한다.
백반증의 생리병태학(physiopathology)을 고려하여, 본 발명자들은 모든 유형의 줄기세포, 특히 멜라닌 세포, 각질 세포 및 섬유아세포의 성숙, 동원(recruitment), 증식 및 분화를 유도함으로써 피부 영역의 대사를 변형시키기 위한 국소 제제를 제안한다.
이러한 국소 대사 유도는 모세관 신생으로 인한 피부 표면의 점진적인 재착색으로 나타난다.
상기 실시예의 국소 제제의 제형은 다음과 같다:
20　g 원심분리에 의해 수행되는 상기 분리 단계 (c)에서 수득되고 구형화된 아라고나이트 분말 (50 nm 내지10 μm의 입자 크기),
2　g 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)서 수득된 가용성 생체고분자,
5　g 상기 냉산 가수분해 단계 (h) 및 세척 및 초원심분리 단계 (i)에서 수득된 불용성 생체고분자,
40　mL 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에멀젼,
0.5　mL 에센셜 오일 및 식물성 오일의 혼합물,
5 g 요소,
부형제 O/W q.s. 100　g
실제로, 2 내지 5°C 사이의 온도에서 유지되는 겔이 얻어질 때까지 20 g의 구형화된 아라고나이트 분말, 2g의 가용성 생체고분자, 5 g의 불용성 생체고분자, 30 ml의 콜로이드 에멀젼이 혼합된다.
5 g의 요소 및 10 g의 콜로이드 에멀젼 또한 준비되고, 완전히 용해될 때까지 30 분 동안 혼합된다.
그 다음 모든 성분이 블랜더에서 1 시간 동안 혼합된다. 생성된 제제는 24 시간 동안 25℃의 오븐에 넣고 6 시간 마다 교반하여 CO2의 방출을 제어한다
국소 제제의 성분은, 무엇보다도, MBP-유사 특성을 가지는 저분자량 당단백질로, TNFβ, EGF, TGFβ를 포함하고, 표피의 기저층(basal layer)의 모든 세포주(cell lines) 및 특히 멜라닌 세포에서 합성, 증식, 성숙에 생물학적 활성을 가진다. 또한 자연적으로 멜라닌 합성에 필수적인 역할을 하는 비타민 A의 전구체인 베타-카로틴과 같은 유리 색소를 함유한다: 또한 생물학적 조직의 착색에 관여하는 메탈로포르피린, 메탈로엔자임 형태로 효소가 있는 포르피린과 관련된 멜라닌 색소를 포함한다.
한편, 상기 실시예의 국소 제제의 에센셜 및 식물성 오일의 혼합물은 100 mL 당 다음의 제형을 가진다:
이브닝 프림로즈(Evening primrose) 45 mL
밀 배아(Wheat germ) 50 mL,
피페린(Piperine) 1 mL,
헬리크리섬 이탈리쿰(Helycrisum italicum) 1 mL,
멜라루카 알터니폴리아(Melaleuca alternifolia) 1 mL
라벤듈라 앵구스티폴리아(Lavandula angustifolia) 1 mL,
샐비아 오시날리스(Salvia oficinalis) 1 mL
이들 추출물은 본 발명에 따른 국소 성분의 모든 특성을 강화하기 위한 것이다.
상기 아라고나이트 분말은 멜라닌 합성에 필수적인 티로신 및 시스테인을 함유한 거의 모든 아미노산을 함유하고 있는 것으로 관찰되었다. 초순수 칼슘과 관련된 이러한 모든 요소는 염증 감소, 국소 면역 시스템 강화, 외피의 재착색 및 성분의 생체이용률에 근본적인 역할을 한다.
상기 국소 제제의 약리학적 특성 및 천연 성분들의 상호작용은 또한 멜라노좀(melanosomes)의 자극 및 증식뿐만 아니라 멜라노좀에 존재하는 기질 멜라닌을 주변 각질 세포(케라티노사이트)로 전달하는 작용을 하며, 이는 멜라닌 저장고인 모낭의 재생뿐만 아니라 표피 집단의 회전율을 보장한다.
한편, 성장인자 또는 사이토카인과 관련된 저분자량 단백질과 같이 초음파 처리후 콜로이드 에멀젼에 함유된 관심 있는 가용성 분자는 또한 다면 발현성(pleiotropic) 특성을 가지고 있어, 단일항 산소(1O2)가 다중불포화 지방산의 이중 결합에 결합하는 것을 방지하여 지질 과산화를 억제하는 것으로 알려져 있다. 이것은 일반적으로 피부 표면에 유해한 새로운 자유 라디칼의 생성의 원인이 되는 열화, 이러한 산, 단백질 및 생체분자의 열화를 방지하는 효과를 가진다.
이전 치료 경험이 없는 백반증의 치료에는 국소 제제가 권장된다; 그러나, 오래된 백반증 또는 눈에 띄는 결과가 없이 반복적인 치료를 받은 경우, 일반적으로 멜라닌 세포 및 각질 세포의 이동뿐만 아니라 모근의 손실을 유발한다. 기저층까지, 본 발명에 따른 국소 제제의 보다 적극적이고 더 깊은 침투를 유발하기 위한 목적으로, 후자의 적용을 의료용 이온삼투 장치(medical iontophoresis device)의 사용과 결합하는 것이 가능하고, 그 원리는 전극의 극성에 따라 선택한 방향으로 이온을 이동시키는 전극의 사용하여 낮은 강도의 갈바닉 전류를 피부에 적용하여 이온화 가능한 제품의 경피적 침투를 촉진하는 것이다.
실시예 5: 주름 및 피부 함몰을 교정하기 위한 화장료 제제
본 발명자들은 안검하수, 피부 함몰, 깊은 및 표면 주름의 교정, 신체 노화의 예방을 위해 본 발명에 따른 조성물의 미용학적 사용을 제안한다.
상기 실시예의 조성물의 제형은 다음과 같다:
29　g 원심분리에 의해 수행되는 상기 분리 단계(c)에서 수득되고 구형화된 아라고나이트 분말 (10 내지 45　μm의 입자 크기),
1g 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 생체고분자,
70　mL 카르복실메틸 셀룰로오즈 나트륨 겔, 다음으로 구성됨:
68　mL의 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에멀젼, 및 2　g의 카르복실메틸 셀룰로오즈 나트륨.
실제로, 카르복실메틸 셀룰로오즈 나트륨 용액이 먼저 제조된다: 68 mL의 콜로이드 에멀젼, 2g의 카르복실메틸 셀룰로오즈 나트륨을 믹서에 넣는다. 상기 혼합물을 20 분 동안 교반하고 겔이 형성될 때까지 5℃에서 12 시간 동안 저온에 두었다.
이 기간이 끝나면, 29 g의 구형화된 아라고나이트 분말 및 1 g의 가용성 생체고분자를 이전에 수득된 70 mL의 겔과 혼합하였다.
조성물은 0.4 mm/20 mm 나사 바늘(screwed needles)이 장착된 1 mL 주사기에 포장된 다음, 이중 포장되고, 25 kGy 감마선으로 멸균된다.
깊은 또는 표면 주름에서, 피부 안검하수(dermocutaneous ptosis)에서의 조성물의 주입은 볼륨 특성에 더하여 피부의 강건성, 유연성 및 견고함을 담당하는 I형 콜라겐을 생성하는 섬유아세포의 성숙 및 증식의 자극이 유도된다.
이 조성물은 물리-화학적 구성으로 인해 상당한 이점이 있으며, 이는 수술 후 통증 및 염증 현상이 없는 천연 성분의 특성이다. 더욱이, 예시된 조성물은 수혜자의 국소 전신 조절(local systemic regulation)에 의존하고 장기간 동안 그 교정 효과를 생성한다.
실시예 6: 보호, 태닝 가속(tan-accelerating) 피부미용 제제
태닝은 멜라닌 세포에 의한 멜라닌 생성의 증가를 통해 피부를 착색함으로써 태양, 보다 정확하게는 UVA 및 UVB 광선에 의한 손상에 대한 피부의 방어 및 적응 반응이다: 이것이 태닝이다. 태양에 과도하게 노출되면 시스템이 통제 불능 상태가 되며, 그로 인한 산화 스트레스는 일광 화상(sunburn), 알레르기(allergies), 색소 침착(pigmentation spots), 화상(burns), 피부 노화(skin ageing)를 유도하며, 반복적인 과다 노출은 결국 세포의 마이크로 RNA의 변화를 일으켜 이들의 악화와 피부암의 출현을 일으킨다는 사실을 잊지 말아야 한다.
이러한 이유로, 멜라닌 세포가 산화 스트레스를 이겨내고 더 많은 멜라닌을 생성하도록 돕는 여러 타입의 성분을 함유하는 보호 제품이 개발되었다. 각각의 개인은 더 많거나 더 적은 멜라닌을 생성한다; 이들은 인종과 피부 타입에 고르지 않게 분포되어 있다. 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌에는 검은색 유멜라닌(eumelanins)과 빨간색-노란색 페오멜라닌(pheomelanins)의 두 종류가 있다: 유멜라닌은 태양 손상에 더 저항력이 있으며 검은색 또는 갈색 피부를 가진 개인에 의해 더 많이 생성된다. 페오멜라닌은 피부가 밝거나 붉은 개인에게 우세하다. 그들은 태양의 공격에 더 빨리 손상되고 태양으로 인한 산화 스트레스로부터 피부를 덜 보호한다.
본 발명에 따른 공정의 설명에서, 본 발명자들은 다중불포화 지방산, 멜라닌 합성을 촉진하는 티로신 및 시스틴, 피부 착색에 근본적인 역할을 하는 메탈로엔자임, 국소 먼역 시스템을 강화하는 사이토카인, 및 멜라닌 세포의 자극 동안 기질 멜라닌의 존재를 강조했다.
이러한 이유로, 선스크린 제조를 위한 이 실시예의 조성물은 다음과 같은 제형을 가진다:
10 g 원심분리에 의해 수행되는 상기 분리 단계 (c)에서 수득되고 구형화된 아라고나이트 분말 (50 nm 내지10 μm 사이의 입자 크기),
5 g 상기 냉산 가수분해 단계 (h) 및 초원심분리 단계 (i)에서 수득된 불용성 생체고분자,
1 g 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 생체고분자,
20 mL 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에멀젼,
10 mL 농축 코코 누시페라 용액(Coco Nucifera solution)
0.05 mL 아스코빌 팔미테이트,
부형제 q.s. 100 mL
실제로, 구형화된 10 g의 아라고나이트 분말, 5 g의 불용성 생체고분자, 1 g의 가용성 생체고분자, 20 mL의 콜로이드 에멀젼, 10 mL의 농축 코코 누시페라 용액, 0.05 mL의 아스코빌 팔미테이트가 준비된다. 상기 혼합물을 블랜더에 넣고 1 시간 동안 혼합하였다. 그 다음 부형제를 혼합물에 첨가하였다: 크림이 수득될때까지 전체를 1 시간 동안 혼합하였다.
실험 조건에서 발견된 보호 계수(protection facto)는 10 내지 40 사이이다.
상기 조성물은 빨간머리부터 금발에 이르기까지 밝은 피부를 가진 12 명의 개인을 대상으로 테스트되었고, 이들의 태양 노출은 항상 홍반(erythema), 화상 및 태닝 부족을 초래하였다. 여름 햇빛과 함께 10 일에 걸처 실시예의 조성물을 적용하면 테스트된 모든 개인이 홍반 또는 화상의 발생을 피할 수 있을 뿐만 아니라 멜라닌 생성 자극으로 인한 균일한 태닝 결과를 보장할 수 있었다.
본 발명의 공정의 단계는 참고로 언급된 이매패류(molluscs)의 껍데기의 내부 아라고나이트 및 외부 칼사이트 유기-광물층에 함유된 활성 분자의 전체를 수득하는 것을 가능하게 했다.
실시예 7: 생물 요법(biotherapy)에 사용하기 위한 주입 용액의 생산
해부학(anatomy), 병태생리학(pathophysiology), 번식(reproduction) 및 그들의 생활권(biotope)과의 상호작용에 대한 연구를 통해, 본 특허에 인용된 이매패류(bivalve molluscs)는 두 개의 순차적인 과정에 따라 외벽 공동(cavity)으로 배출되어 외벽 유체(extra-pallial fluid)를 형성하는 유기 및 무기 성분을 합성하여 껍데기를 구성하는 것으로 알려져 있다: 이온 수송, 당단백질 합성을 포함하는 제1 세포 공정(cellular process) 및 제2 물리화학적 공정.
이러한 공정의 결과로 내부 아라고나이트 및 외부 칼사이트 층에서 본 발명에 기재된 모든 활성 분자가 발견된다: 따라서, 내부 아라고나이트 층에는 성장인자, 저분자량 당단백질(8 내지 50 kDa), 인터루킨, 케모카인, TNF(공통 조상 유전자에서 파생된 그룹), TGF, 프로스타글란딘 등이 발견된다.
전임상 및 임상 관찰은 언급된 이매패류(molluscs)의 아라고나이트 및 칼사이트 유기-광물층의 유기 분획에 함유된 사이토카인이 수용 숙주(recipient host)에 국소적으로 전신적으로 의존함으로써 측분비 작용 방식을 갖는다는 것을 입증하는 것으로 보인다. 언급된 이매패류(bivalve molluscs)의 면역 방어의 대사 활동에서 유래하는 이러한 사이토카인은 외벽 유체(extra-pallial fluid)에서 발견되며 이러한 이매패류(mollusc)의 내부 아라고나이트 및 외부 칼사이트 층의 가용성 분자의 일부이다.
이것이 본 발명자들이 생물요법, 특히 류마티스성 다발성 관절염, 크론병, 동맥경화증, II 형 당뇨병, 강직성 척추염, 궤양성 대장염, 중증 건선 및 건선 관절염과 같은 특성 만성 자가염중성 병리에서 사용될 수 있는 주입 용액의 사용을 제안하는 이유이다.
건선은 각질세포, 수지상 세포, 및 T-림프구 간의 상호작용에 의해 상호 활성 과정을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이들 3가지 세포 유형에 의해 생성되는 염증성 사이트카인, TNFα, IL-23 및 IL-17 은 이들이 생산하는 사이토카인 폭풍으로 인해 병리학에서 우세하다. 면역생물학적 치료는 활성화가 건선의 발병 및 지속을 촉진하는 이들 3 가지 사이토카인의 효과를 차단하는 특성을 가지며, 후자의 병인은 다인성으로 남아 있다. 이들 치료제는 인터루킨 IL-17 및 IL-22뿐만 아니라 IL-23의 생성을 방지함으로써 수지상 세포의 기능을 억제하는 것을 목표로 하는 항-사이토카인 모노클로랄 항체 덕분에 사이토카인의 작용을 차단한다.
염증성 질환의 치료에서 생물학적 생물요법 제제는 효과가 입증되었지만, 잠복 결핵(latent tuberculosis) 및 림프종(lymphoma), 비정형 기회감염(opportunistic infections), 바이러스 감염(viral infections)(대상포진(shingles)), B형 또는 C 형 간염(hepatitis), 탈수초화(demyelinating), 종양(neoplastic), 심혈관(cardiovascular), 간독성(hepatotoxicity), 혈구 감소(cytopenia), 과콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia)뿐만 아니라 주사 부위 반응 및 폐 및 소화기 합병증의 재활성화를 보고한 최근의 메타-분석에서 보여주듯이 부작용이 없는 것은 아니다.
열 침투, 원심분리, 농축, 초음파 처리 및 초임계 CO2 처리 단계는 사이토카인 및 성장 인자와 같은 활성 분자를 추출을 가능하게 한다. 이러한 분자는 여러 가지 표현형 특성(phenotypic traits)을 결정하고 국소 전신 활성을 갖는 다면적 특성을 가지며, 많은 병리에 공통적인 TNFα, 인터루킨 IL-23, IL-17와 같은 염증의 사이토카인에서 조직 항성성 조절, 특히 항염증에 참여한다.
이 실시예에서 근육내, 정맥내 및/또는 피하 주사 생물요법 용액은 다음과 같이 제형화될 수 있다:
2g 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에 의해 수득된 가용성 생체고분자,
상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에멀젼, q.s, 100 mL
실제로, 가용성 생체고분자를 콜로이드 에멀젼에 첨가한 다음 완전히 용해될 때까지 6 시간 마다 교반하면서 25℃의 오븐에 12 시간 동안 위치시켰다. 그 다음 전체가 크림핑 앰플에 포장되어 25 kGy에서 감마선으로 멸균되었다.
실시예 8: 동물 및 인간 줄기 세포 및 전구 세포의 성숙 및 증식을 위한 배양 배지
조직, 기관 및 시스템의 구축, 성장 및 복구는 먼저 줄기 세포 마커에 의해, 그 다음 전구 세포 마커에 의해 경고되는, 다양한 성장 인자 또는 사이토카인의 작용에 의존하는 것으로 알려져 있다.
또한, 다능성 줄기 세포는 다른 조직, 기관 및 시스템에 대해 여러 세포주를 생성하는 것으로 알려져 있다. 전구 세포는 줄기 세포의 발전된 단계임에도 불구하고 분열 특성이 제한적이다. 그들은 조직 복구의 기초이며, 감소된 이동성으로 인해 표적 조직에 매우 근접하여 발견된다.
시험관 내 연구는 언급된 이매패류(molluscs)의 내부 아라고나이트 및 외부 칼사이트 층의 유기 분획에 함유된 가용성 분자의 강화 작용을 입증했다.
따라서, 본 발명자들은 또한 동물 및 인간 줄기 세포 및 전구 세포의 성숙 및 증식을 위한 배양 배지의 제조를 제안한다.
이러한 매체는 하기를 포함한다:
- 5　g 원심분리에 의해 수행되는 상기 분리 단계 (c)에서 수득되고 구형화된 아라고나이트 분말 (50 nm 내지10 μm 사이의 입자 크기),
- 2　g 상기 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 생체고분자,
- 0.4　g 글루코오스,
- 2　mL 자가 인간 혈청,및
- 상기 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 콜로이드 에멀젼: q.s. 100 g.
실제로, 이러한 배양 배지는 자가 전구 세포, 근육 또는 골막 전구 세포로의 증식을 위해, 호기성 및 혐기성일 수 있는 생물반응기에 0 내지 15일의 인큐베이션 기간 동안, 배치된다.
실제로, 전구 세포는 일반적인 방식으로 효소 소화에 의해 추출되는 생검에 의해 수득된다. 인큐베이션 후, 상기 제제는 모든 타입의 조직 재생과 같은 적응증에 대해 공여 대상자에게 사용될 있다: 심각한 화상(severe burns), 광범위한 상처(extensive wounds), 근육 파괴(muscle destruction), 광범위한 물질 손실, 치주 질환(periodontal diseases). 일상적인 수술 중에 주사나 최소 침습 수술로 사용할 수 있다.
실시예 9: “경구(per os)" 투여용 캡슐 생산
"경구" 투여로 상기 언급된 병리의 주입에 의한 치료를 계속할 목적으로, 본 발명자들은 하기 조성물을 제안한다.
- 60 g 구형화된 아라고나이트 분말,
- 1 g 가용성 생체고분자,
- 2 g 불용성 생체고분자,
- 10 g 아세로라 가루, 및
- 콜로이드 에멀젼 q.s. 100 g.
실제로, 아라고나이트 분말, 가용성 및 불용성 생체고분자 및 아세로라 분말은 콜로이드 에멀젼과 혼합된다. 상기 혼합물을 10 분 동안 혼합한 다음 점도가 102 Pa?인 페이스트가 수득될 때까지 30℃ 오븐에서 3시간 동안 넣었다.
전체는 0.8 mL 용량의 내산성 식물성 캡슐에 포장되어, 용해가 지연된다.

Claims (13)

  1. 다음 단계를 포함하는 해양 이매패류(bivalve mollusc)의 껍데기의 아라고나이트 유기-광물층(aragonitic organo-mineral layer) 및/또는 칼사이트 유기-광물층(calcitic organo-mineral layer)에 함유된 분자를 단리하는 방법:
    (a) 아라고나이트 유기-광물층 및/또는 칼사이트 유기-광물층을 분쇄하여 아라고나이트 분말 및/또는 칼사이트 분말을 수득하는 단계;
    (b) 상기 아라고나이트 분말 및/또는 상기 칼사이트 분말에 열을 침투(hot percolationg)시켜 하기를 수득하는 단계;
    - 한편으로는, 포화 아라고나이트 용액 및/또는 포화 칼사이트 용액, 상기 포화 아라고나이트 용액은 아라고나이트 액체상 및 아라고나이트 고체상을 포함하고, 상기 포화 칼사이트 용액은 칼사이트 액체상 및 칼사이트 고체상을 포함하며, 및
    - 다른 한편으로는, 아라고나이트 침투 분말 및/또는 칼사이트 침투 분말;
    (c) 상기 포화 아라고나이트 용액 및/또는 상기 포화 칼사이트 용액을 분리하여 하기를 수득하는 단계;
    - 한편으로는, 상기 아라고나이트 액체상 및/또는 상기 칼사이트 액체상, 및
    - 다른 한편으로는, 상기 아라고나이트 고체상 및/또는 상기 칼사이트 고체상; 및
    (d) 상기 아라고나이트 침투 분말 및/또는 상기 칼사이트 침투 분말을 초임계 CO2 처리하여 하기를 수득하는 단계;
    - 한편으로는, 초임계 CO2-처리된 아라고나이트 분말 및/또는 초임계 CO2-처리된 칼사이트 분말, 및
    - 다른 한편으로는, 상기 아라고나이트 유기-광물층 및/또는 상기 칼사이트 유기-광물층에 함유된 가용성 분자의 전부 또는 일부.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 해양 이매패류는 핀크타다 맥시마(Pinctada Maxima), 핀크타다 마가리티페라(Pinctada Margaritifera), 핀크타다 마르텐시이(Pinctada Martensi), 핀크타다 퓨카타(Pinctada Fucata), 트리다크나 기가스(Tridacnae Gigas), 트리다크나 맥시마(Tridacnae Maxima), 트리다크나 하이포퍼스 하이포퍼스 (Tridacnae Hippopus Hippopus), 트리다크나 데레사(Tridacnae Derasa), 트리다크나 테바로아(Tridacnae Tevaroa), 트리다크나 크로세아(Tridacnae Crocea), 트리다크나 스쿠아모사(Tridacnae Squamosa), 트리다크나 포르세라너스 (Tridacnae Porcelanus) 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 방법.
  3. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 열 침투 단계 (b)는 온도가 30℃를 초과하는 액체로 습식 체질(wet sieving)하여 수행되는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 열 침투 단계 (b)에서 사용되는 액체는 수용액, 특히 메탄올을 포함하는 수용액, 요소 용액을 포함하는 수용액 또는 이들의 혼합물인 방법.
  5. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분리 단계 (c)는 원심분리에 의해 수행되고, 회수된 액체상은 상청액으로 지칭되고 회수된 고체상은 펠릿으로 지칭되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 원심분리에 의해 수행된 상기 분리 단계 (c) 후에, 다음의 단계를 포함하는 방법:
    (e) 아라고나이트 상청액 및/또는 칼사이트 상청액을 여과하여 여과된 아라고나이트 상청액 및/또는 칼사이트 상청액을 수득하는 단계;
    (f) 상기 여과된 아라고나이트 상청액 및/또는 상기 칼사이트 상청액을 농축하여 아라고나이트 농축물 및/또는 칼사이트 농축물을 수득하는 단계;
    (g) 상기 아라고나이트 농축물 및/또는 상기 칼사이트 농축물을 초음파 처리하여 아라고나이트 콜로이드 에멀젼 및/또는 칼사이트 콜로이드 에멀젼을 수득하는 단계.
  7. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 초임계 CO2 처리 단계 (d) 후에, 다음의 단계를 추가로 포함하는 방법:
    (h) 초임계 CO2-처리된 아라고나이트 분말 및/또는 초임계 CO2-처리된 칼사이트 분말을 냉산 가수분해(cold acid hydrolysis)하여 상기 분말에 존재하는 불용성 분자를 추출하는 단계; 및
    (i) 세척 및 초원심분리하여 상기 불용성 분자를 단리 및 회수하는 단계.
  8. 하기를 포함하는 조성물:
    - 제1항에 정의된 바와 같은 분리 단계 (c) 동안 회수된 아라고나이트 고체상 및/또는 칼사이트 고체상,
    및 하기로부터 선택된 적어도 하나의 성분:
    - 제1항에 정의된 바와 같은 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 분자,
    - 제6항에 정의된 바와 같은 초음파 처리 단계 (g)에서 수득된 아라고나이트 콜로이드 에멀젼 및/또는 칼사이트 콜로이드 에멀젼, 및
    - 제7항에 정의된 바와 같은 냉산 가수분해 단계 (h) 및 세척 및 초원심분리 단계 (i) 동안 회수된 불용성 분자.
  9. 제 8 항에 있어서,
    의약품으로 사용하기 위한 조성물.
  10. 배양 배지, 특히 줄기 세포 또는 전구 세포의 성숙 및/또는 증식을 위한 배양 배지로서의 제8항에 따른 조성물의 용도.
  11. 안검하수, 피부 함몰, 깊은 및 표면 주름의 교정, 및/또는 신체 노화 예방을 위한 제8항에 따른 조성물의 미용 용도.
  12. 하기를 포함하는 조성물:
    - 제1항에 정의된 바와 같은 초임계 CO2 처리 단계 (d)에서 수득된 가용성 분자, 및
    - 제6항에 정의된 바와 같은 초음파 처리 단계(g)에서 수득된 아라고나이트 콜로이드 에멀젼 및/또는 칼사이트 콜로이드 에멀젼.
  13. 제12항에 있어서,
    의약품으로 사용하기 위한 조성물.

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