CN107771087B

CN107771087B - 通过改性天然海洋生物材料组合物获得的半合成粉末材料，其制备方法及其应用

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Publication number: CN107771087B
Application number: CN201680036156.2A
Authority: CN
Inventors: G·坎普拉塞; S·坎普拉塞
Original assignee: MBP Mauritius Ltd
Current assignee: MBP Mauritius Ltd
Priority date: 2015-06-23
Filing date: 2016-06-20
Publication date: 2021-04-23
Anticipated expiration: 2036-06-20
Also published as: WO2016207525A1; JP2018519910A; FR3037801A1; AU2016282441A1; BR112017025181B1; EP3673924B1; FR3037802A1; RS63562B1; PT3313465T; CA2988783C; HUE059867T2; IL280072A; PT3673926T; PL3673924T3; KR20180021095A; ES2928583T3; PH12017502267B1; RU2708670C2; AU2020202702A1; JP2021176563A

Abstract

本发明涉及衍生自天然海洋生物材料的粉状半合成材料，即粉状形式的双壳软体动物的壳的文石内层，所述双壳软体动物选自Pinctadines，特别是大珠母贝、合浦珠母贝，和砗磲，特别是库氏砗磲、长砗磲、无鳞砗磲、魔鬼砗磲、鳞砗磲、番红砗磲、砗蚝、瓷口砗磲,其添加有不溶的和可溶的生物聚合物以及通过碳酸化转化的碳酸钙；本发明还涉及其制备方法及其用途。

Description

通过改性天然海洋生物材料组合物获得的半合成粉末材料，其制备方法及其应用

发明领域

本发明涉及粉状半合成生物可吸收材料，其从衍生自双壳软体动物的壳的天然海洋生物材料获得，所述双壳软体动物为诸如一般的 Pinctadines(牡蛎)，特别是大珠母贝(Pinctada maxima)、合浦珠母贝(margaritifera)，和砗磲(巨蛤)：库氏砗磲(Tridacnagigas)、长砗磲(maxima)、无鳞砗磲(derasa)、魔鬼砗磲(tevaroa)、鳞砗磲(squamosa)、番红砗磲(crocea)、砗蚝(Hippopus hippopus)、瓷口砗磲(Hippopus porcelanus)。

发明背景

通常，用于填充创伤的、肿瘤的、营养不良的或退行性起源的骨物质损失的材料是磷酸钙接合剂、生物共聚物和动物或人类来源的材料。

对于密封假体，仅使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，任选地与抗生素、引发剂、活化剂、遮光剂或着色剂组合。通常使用PMMA 接合剂密封内置假体，其缺点是众所周知的，特别是在接合剂聚合过程中产生的放热反应、导致的骨细胞坏死、随时间推移的接合剂的收缩及其老化，这在大多数情况下引起假体的移动性并且需要在手术后的10-15年内重复。

所有这些材料都是生物相容的，并且其中一些要求有骨传导性能，诸如磷酸钙接合剂；很少材料有生物活性，并且大多数是惰性的。

可注射接合剂由矿物相和液相组成，所述液相可以是磷酸、 HPMC的水溶液或凝胶、0.1摩尔化学计量的水、硫酸或柠檬酸。

用作骨替代物的合成的或牛来源的生物材料基本上显示骨传导性能并且通常不是完全生物可吸收的。

对于其中的一些，特别是聚合物，发现了降解产物的释放，其可能对周围病变组织或全身病变组织长期有害。这种生物可吸收性是依赖于患者的。

此外，几乎所有的骨替代物都没有生物活性。这使得将它们与动物源的胶原蛋白或与生物可吸收的其他物质结合成为必然，所述其他物质在受体中主要诱导大于并且不同于生理反应的炎症反应。

粉末或微粒形式的骨替代物的主要缺点是，在使用期间，无论是用自体血、盐溶液或其他任何液体载体，它们都不会形成促进它们凝聚并且保持在位点上或位点中的具有粘附性的和塑性的“凝结物”。

已知人骨由43％的无机组分、32％的有机组分和25％的水组成。有机组分由90％的胶原蛋白(包含97％的I型、III型、IV型和V型胶原)和10％的非胶原蛋白组成，所述非胶原蛋白的代表是骨钙素、骨连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液蛋白、蛋白聚糖、纤维连接蛋白、生长因子和骨形态发生蛋白。这些非胶原蛋白在骨发生和受损组织的修复过程中起至关重要的作用。

无机部分主要由磷酸钙晶体形式的羟基磷灰石组成；该部分还含有非常少量的其它矿物，诸如钠、钾、铜、锌、锶、氟、铝和硅。所有这些元素在细胞代谢以及愈合和骨再生中起重要作用。

对双壳软体动物的壳的构造和组成的研究已经表明它包括由3-5 ％有机部分构成的珍珠内层，它本身由胶原蛋白和非胶原蛋白，基本上不溶的和可溶的生物聚合物组成，所述双壳软体动物为诸如一般的 Pinctadines，特别是大珠母贝、合浦珠母贝，和砗磲，特别是库氏砗磲、长砗磲、无鳞砗磲、魔鬼砗磲、鳞砗磲、番红砗磲、砗蚝、瓷口砗磲。珍珠内层还含有95-97％的无机组分和3％的水，所述无机组分基本上由碳酸钙、矿物和金属离子组成。对本发明涉及的软体动物的壳的构造的研究还表明，它由与文石内层结构不同的方解石外层组成，但也含有由不溶的和可溶的生物聚合物构成的有机部分。

一些出版物已经证明了衍生自上述海洋软体动物的文石层的天然生物材料的骨诱导和骨传导性能。

这些性能是由有机部分中含有的生物聚合物的存在所致，其中已经鉴定了与有助于诸如牙、骨、皮肤、肌肉、粘膜等器官的构造的结构蛋白类似的结构蛋白。也存在与参与代谢和生物化学过程(酶学、免疫学、膜受体、信号分子等)的功能蛋白类似的功能蛋白。这些结构蛋白中的特别代表是胶原蛋白：因此，已经鉴定了I型、II型、III 型和相关的胶原蛋白。

除游离氨基酸外，已经鉴定了通常认为蛋白聚糖(与小肽结合的碳水化合物)和糖蛋白(胶原蛋白和碳水化合物相连)的存在，所述糖蛋白包含低分子量糖蛋白，通常认为是与BMP、TNFβ、TGFβ、PGF 等有关的生长因子。

此外，已知某些非胶原蛋白分子在生理愈合过程中以及在细胞和组织再生中具有基础性作用。

上述软体动物的壳的内层的有机物-矿物复合物的愈合、再生、血管生成和骨诱导性能，即与这些各种胶原蛋白和生长因子的存在有关的性能已经在体外和体内被证明。

如果我们对比骨组织和所讨论的软体动物的壳的文石的物理化学组成，我们注意到在骨组织中存在的32％的有机组分和在文石中存在的3-5％的有机组分高度类似。骨中43％的矿物相(基本上是磷酸钙)以碳酸钙的形式占文石的95-97％；其他矿物的比例非常类似。

考虑到天然海洋生物材料的有机部分中含有的生物聚合物的作用，发明人发现通过增加这些生物聚合物在半合成杂化生物材料组合物中的比例来改变其组成是有意义的。

已知所讨论的软体动物的壳的文石内层和方解石外层的有机部分含有可溶的可扩散分子，其具有参与钙化组织的矿化和生长的成骨性能。也已经证明文石的晶体周围和层间包层中存在不溶的结构蛋白。

此外，壳的方解石外层的有机部分中含有的分子与本发明涉及的软体动物的壳的文石内层中含有的分子类似。

这就是为什么不仅提取和浓缩与生物晶体和组成珍珠测试的文石的晶间薄层紧密相关的有机分子，而且提取和浓缩讨论的那些软体动物的壳的方解石外层中含有的有机分子似乎是有意义的。

提取生物材料的有机部分的生物聚合物的目标是提供可溶的和不溶的分子。目的是通过补充提取的不溶的和可溶的生物聚合物来增加有机-无机结构的比例，以优化所得的生物材料的细胞和组织再生、愈合、骨诱导和血管生成的性能。

因此，本发明人发现，可以从选自长砗磲、库氏砗磲、无鳞砗磲、魔鬼砗磲、鳞砗磲、番红砗磲、砗蚝、瓷口砗磲、大珠母贝、合浦珠母贝、和其它Pinctadines的软体动物的壳开始，通过添加可溶的和不溶的生物聚合物以及通过碳酸化转化的碳酸钙来获得满足这些要求的材料。

因此改性后，根据本发明的粉状半合成生物可吸收材料旨在用于制造，例如骨替代物、可注射的接合剂或用于密封内置假体的接合剂、或用于制作生物可吸收的骨接合装置和模制植入物。

因此，根据第一方面，本发明涉及衍生自天然海洋生物材料的粉状半合成材料，其添加有不溶的和可溶的生物聚合物和通过碳酸化转化的碳酸钙。

本发明还涉及该半合成材料的制备方法。

本发明还涉及组合物，其包含在该半合成材料中采用的可溶的和不溶的生物聚合物或通过碳酸化转化的碳酸钙。

本发明最后涉及该半合成材料或该组合物用于制造例如骨替代物、可注射的接合剂或用于密封内置假体的接合剂、或用于制作生物可吸收的骨接合装置和模制植入物中的用途。

发明详述

根据第一方面，本发明涉及衍生自天然海洋生物材料的粉状半合成材料，其添加有不溶的和可溶的生物聚合物和通过碳酸化转化的碳酸钙。

根据本发明的材料衍生自天然海洋生物材料，即双壳软体动物的壳的文石内层，所述双壳软体动物选自Pinctadines，特别是大珠母贝、合浦珠母贝，和砗磲，特别是库氏砗磲、长砗磲、无鳞砗磲、魔鬼砗磲、鳞砗磲、番红砗磲、砗蚝、瓷口砗磲，所述文石层为粉状形式。

根据本发明的粉状半合成材料是生物可吸收的。

根据一个实施方案，粒度为5nm-100μm，优选为20nm-50μm，甚至更优选为50nm-20μm。

不溶的和可溶的生物聚合物提取自双壳软体动物的壳的文石内层和/或方解石外层，所述双壳软体动物选自Pinctadines，特别是大珠母贝、合浦珠母贝，和砗磲，特别是库氏砗磲、长砗磲、无鳞砗磲、魔鬼砗磲、鳞砗磲、番红砗磲、砗蚝、瓷口砗磲。

下面描述提取这些聚合物的方法。

根据具体的实施方案，提取的可溶的生物聚合物和不溶的生物聚合物的添加比例以对应于起始生物材料中存在的可溶的生物聚合物和不溶的生物聚合物的比例。

在本发明的半合成材料中采用的通过碳酸化转化的碳酸钙衍生自天然陆地、天然海洋或沉淀的碳酸钙，或衍生自提取不溶的和可溶的生物聚合物后的文石层的无机部分，其通过碳酸化转化。已知碳酸钙在正交晶系或菱形晶系中结晶，当在800-1100℃进行热处理时，经过热解和氧化，反映出相当大的粘合力和塑性的新性能，使得易于建模。该现象是碳酸化，其根据以下反应进行：

CaCO₃+热处理→Ca(OH)₂+CO₂→CaCO₃+H₂O

在该反应中，温度升高并保持20-40min，碳酸钙化学转化成石灰，然后在CO₂和环境湿度的作用下，其变成无定形碳酸钙。取决于环境湿度，该化学转化需要几天时间。

因此，根据本发明的粉状半合成材料包含衍生自天然海洋材料的粉末，所述天然海洋材料的有机部分补充有提取的不溶的和可溶的生物聚合物，并且矿物部分补充有通过碳酸化过程转化的沉积物或石珊瑚海洋来源的、或沉积物或沉淀的陆地来源的碳酸钙。

根据具体的实施方案，根据本发明的粉状半合成材料包括粒度为 5nm-100μm，优选为20nm-50μm，甚至更优选为50nm-20μm的粉状形式的文石、提取的不溶的和可溶的生物聚合物和通过碳酸化转化的碳酸钙。

通过添加提取的不溶的和可溶的生物聚合物，优选地相对于起始材料中存在的不溶的生物聚合物和可溶的生物聚合物之间的比率，初始材料的有机部分的比率增加1％-10％。通过添加由碳酸化转化的碳酸钙，取决于所需的物理化学性能，初始材料的矿物部分的比率增加 1％-10％。

根据具体的实施方案，根据本发明的半合成材料包括：

100g粒度为5nm-100μm，优选为20nm-50μm，甚至更优选为 50nm-20μm的粉状形式的文石；

1g-50g，优选5g-25g，甚至更优选10g-15g提取的不溶的和可溶的生物聚合物；和

0.5g-50g，优选1g-25g，甚至更优选2g-10g通过碳酸化转化的碳酸钙。

在提取生物聚合物期间，发明人表明，在用于进行本发明的软体动物的文石内层和方解石外层中，不溶生物聚合物的比率为总重量的 2.6％-4.3％，可溶生物聚合物的比率为总重量的0.4％-0.7％。以使得可溶生物聚合物与不溶生物聚合物的比例与原始天然产物中的比例类似的方式将生物聚合物添加到根据本发明的材料中。

如上文所述，本发明还涉及制备粉状半合成材料的方法。

根据本发明的方法，分别制备构成元素，然后混合，以获得根据本发明的材料。因此，制备衍生自天然海洋生物材料的粉状材料、提取自天然海洋生物材料的不溶的和可溶的生物聚合物以及通过碳酸化转化的碳酸钙。

更特别地，该制备方法包括混合磨碎的天然生物材料，提取自双壳软体动物的壳的文石内层和/或方解石外层的不溶的和可溶的聚合物，以及通过碳酸化转化的碳酸钙，所述双壳软体动物选自 Pinctadines，特别是大珠母贝、合浦珠母贝，和砗磲，特别是库氏砗磲、长砗磲、无鳞砗磲、魔鬼砗磲、鳞砗磲、番红砗磲、砗蚝、瓷口砗磲。

在具体的实施方案中，磨碎的天然生物材料是软体动物的壳的文石内层。进行研磨以获得20nm-50μm的平均粒度。所得颗粒可以被球化以改善粉末的流动性和可压缩性。

在根据本发明的方法中，不溶的和可溶的生物聚合物在水解后后分别通过超速离心以及通过切向超滤与反渗透的偶联来提取。在提取前，可以将软体动物的壳的文石内层和/或方解石外层交联。为了便于提取，将软体动物的壳的文石内层和/或方解石外层磨碎并且筛分至粒度为250μm-50μm。

下面依次描述这些不同的步骤。

用作原料的天然海洋生物材料选自Pinctadines，特别是大珠母贝、合浦珠母贝，和砗磲，特别是库氏砗磲、长砗磲、无鳞砗磲、魔鬼砗磲、鳞砗磲、番红砗磲、砗蚝、瓷口砗磲。

每种组分可以衍生自相同的海洋生物材料或不同的海洋生物材料。

将选择的壳清洁，去污，任选地交联，并且分离方解石层和内层。将内层磨碎。磨碎的内层的一部分构成根据本发明的材料的基础组分。从方解石层和/或内层提取可溶的和不溶的生物聚合物。通过碳酸化转化碳酸钙，其可以衍生自提取生物聚合物后回收的矿物部分。将因此提取的生物聚合物和通过碳酸化转化的碳酸钙添加到先前获得的基础组分中。

下面详细描述根据本发明的方法的具体实施方案。当然，本领域技术人员将能够根据具体的起始生物材料和所需的最终用途调整该方法的条件。

I.组分的制备：

通过刮取去除体表寄生物后，经过以下处理从选择的海洋生物材料获得壳：

I.1)将壳去污：

通过将壳浸泡在添加有2％活性氯的次氯酸盐溶液的自来水浴中去污。

I.2)超声波处理壳：

然后在其中添加有稀释度为1份溶液对127份水的清洁和消毒溶液的装有微生物检查过的自来水的箱中，例如在55℃下冲洗并且用超声波处理壳。在约40kHz的频率下，处理时间约30min。

I.3)冲洗并且干燥壳：

然后，例如将壳在90℃的软化水浴中冲洗20min，所述软化水浴中添加有2％稀释度的

30min。然后冲洗并干燥壳。

I.4)将壳交联：

根据另一个实施方案，为了使天然来源的生物材料具有增强的生物学性能，特别是考虑到细胞代谢的优化和抗自由基性能的加强，可以根据以下将壳交联：

在容量可变的半透明玻璃容器或塑料容器中，制备添加有10％核黄素的自来水的混合物；整体温度维持在20℃以上，并且搅拌混合物以产生垂直于UVA照射的流动。

将壳垂直放置在其中，并且在两侧以波长为365纳米/秒的UVA 灯，在2300微焦每平方厘米的强度下，照射180min。在处理过程中，整体保持在真空状态。

然后将壳冲洗并且在40℃的热空气流中干燥。

也可以使用2014年1月10日提交的专利申请FR1450204中描述的方法。

I.5)去除方解石外层：

用细晶砂轮通过研磨去除壳的方解石外层。

产物放在一侧，并且构成“用于从方解石外层提取生物聚合物的批料”。

I.6)冷冻研磨后暴露的珍珠测试：

根据本发明，将珍珠测试在-18℃的温度下冷冻120min。

I.7)粉碎珍珠测试并回收批料：

然后，例如在带有碳化钨夹具的粉碎机中进行珍珠测试的粉碎，并抽吸，以回收也含有纳米颗粒的悬浮颗粒。

粉碎操作至少重复3次，筛分后留出2个批料：

-随机粒度为20微米-50纳米的第一批料将构成根据本发明的产物的文石混合部分，在下文中称为“文石混合批料”。“文石混合批料”是指研磨后获得的粉状形式，其包括有机和无机两种组分。

-将粒度为250-50微米的第二批料放在一侧，用于提取不溶的和可溶的生物聚合物。它将被称为“用于从文石内层提取生物聚合物的批料”。

使用激光粒度计来确定所得粉末的粒度尺寸和尺寸范围。

I.8)文石混合批料的球化：

文石混合批料经过机械处理以通过球化使颗粒均匀化，目标是通过磨擦使颗粒的角和边缘圆整。

该处理具有改善所得粉末的流动性和可压缩性的效果，并且当使用根据本发明的材料时，特别是作为骨替代物、密封接合剂、可注射的接合剂、生物可吸收的骨接合装置和模制植入物时，促进致密化和颗粒间结合。

该球化步骤可以采取以下程序：将等份的来自文石混合批料的粉状材料与已在高压釜中灭菌的硬木(例如橡木)的几mm²的碎片的混合物放入由例如玻璃或锆制作的具有水平旋转轴的圆柱形容器中，其具有宽度可变的玻璃片。

取决于容器的尺寸和待处理产物的量，该容器以可变的时间和可变的速度旋转。

在球化处理结束时，将全部混合物、文石混合批料和碎片，在连续搅拌约15min的装有足量水的惰性容器中回收。静置后，漂浮在表面上的木头碎片通过抽吸去除。

然后用具有20微米直径的网的尼龙过滤器过滤溶液，然后将残余物在40℃下的

中干燥并且包装。

根据另一个实施方案，也可以将等份的随机直径为1-3mm的颗粒形式的氯化钠添加到文石混合批料中。处理后，通过用90℃的热水溶解并且在尼龙过滤器上过滤去除氯化钠，然后用90℃的热水洗涤并且在40℃的热空气流中干燥。

II.生物聚合物的提取

II.1不溶生物聚合物的提取：

根据本发明，将来自步骤I.5)中获得的用于从文石内层提取生物聚合物的批料的适量粉末与足量的软化水混合，然后注入到添加有限定量的25％柠檬酸的水解反应器中；整体在4-5℃波动的温度下冷却，连续搅拌。由于其降低pH和表面张力的性能，发明人提倡使用柠檬酸。

通过添加2.5N的氢氧化钠，将用pH计监测的pH保持在4.5以上以防止生物聚合物的降解；然后通过在每100升水解产物中添加0.1 升5N的氢氧化钠，在步骤结束时使PH回到7。

一旦粉末完全溶解，将水解产物转移到储存箱中，继续搅拌，然后转移到离心分离器中，在旋风中受到18-20 000G的力。

通过比浊法检查溶液后，必要时重复操作，并且必要时用柠檬酸校正，同时保持温度为4-5℃。

取决于比浊法的结果，水解产物可以再次经过超速离心。

在超速离心的每个循环中，将收集的不溶生物聚合物的残余物洗涤并且放置在一边。用草酸处理洗涤残余物的水以检查是否存在钙。

因而，在最后一次超速离心结束时，获得含有所有不溶生物聚合物的湿润褐色饼状物形式的残余物，其通过冷冻干燥，或Zeodratation (使用沸石进行水合)干燥；在处理结束时，我们获得直径为2-3mm 的灰色小球，其产生自离心力作用下的蛋白质卷曲。

将提取的不溶生物聚合物在例如行星式研磨机中磨碎，筛分后回收，直至获得随机粒度为5微米-100纳米的粉末。

II.2可溶生物聚合物的提取：

将渗透物和洗涤水送往例如具有1kd截止点的试剂盒的切向超滤装置中脱盐。

在渗透物中添加足量的2.0mol/L的硫酸，以引起硫酸钙盐的沉淀。

将溶液过滤，并且在真空、沸点33℃下，将渗透物在

中浓缩以去除晶体形式的柠檬酸。

含有低分子量蛋白质以及单价和多价离子的馏出物被延展。

由于试剂盒的截止点不保留所有的蛋白质，特别是那些非常低分子量的蛋白质，将馏出物被进行反渗透。

在40-80bar的压力梯度作用下，将馏出物转移通过例如孔径为0.0001微米的半选择性膜渗透以进行液相分离处理。

使馏出物通过，以保留所有的单价和多价离子，诸如铁、镁、锌等。

收集在反渗透膜上回收的滞留物并且用无热原水延展，然后例如在真空、40℃下，在

中浓缩，然后通过Zeodratation或冷冻干燥冻干。

获得非常细的灰白色粉末，将其放在一侧，然后例如在行星式研磨机中磨碎，以在筛分后获得随机粒度为5微米-100纳米的粉末。

通过Bradford色度法处理等分溶液来检查渗透物是否存在蛋白质。

II.3从用于从方解石外层提取生物聚合物的批料中提取生物聚合物

根据另一个实施方案，用与从文石内层提取生物聚合物相同的方式从方解石外层提取生物聚合物。

III.碳酸钙的碳酸化：

已知碳酸钙在正交晶系或菱形晶系中结晶，当在800-1100℃进行热处理时，经过热解和氧化，反映出相当大的粘合力和塑性的新性能，使得易于建模。该现象是碳酸化，其根据以下反应进行：

CaCO₃+热处理→Ca(OH)₂+CO₂→CaCO₃+H₂O

根据其它实施方案，除碳酸钙以外的所有钙盐可以通过沉淀的化学反应产出可以通过碳酸化转化的碳酸钙。因此，可以从例如氢氧化钙、乙酸钙、草酸钙、硫酸钙或柠檬酸钙开始获得碳酸钙；进行这些沉淀的已知化学过程在本领域技术人员的技能范围内。

在提取生物聚合物后，碳酸钙也可以来自双壳软体动物的壳的文石内层，所述双壳软体动物为诸如一般的Pinctadines，特别是大珠母贝、合浦珠母贝，和砗磲：库氏砗磲、长砗磲、无鳞砗磲、魔鬼砗磲、鳞砗磲、番红砗磲、砗蚝、瓷口砗磲。它也可以是石珊瑚来源的。

IV.从文石混合批料、提取的不溶的和可溶的生物聚合物、和通过碳酸化转化的碳酸钙开始的混合物制剂

将根据所需有机部分的比率确定的提取自内层文石和外层方解石两个批料的一定量的不溶的和可溶的生物聚合物，和通过碳酸化转化的确定量的碳酸钙，与限定量的文石混合批料混合以构成根据本发明的产物的制剂。

例如，混合在刀式混合器中进行，直到获得均匀的粉末，然后将该粉末包装。

根据另一方面，本发明涉及根据本发明的材料用作即时配制的骨替代物、用于物质损失的愈合和再生、用于治疗烧伤、疮、溃疡或红斑性皮肤损伤或用于制造装置或模制植入物的用途。

根据本发明的粉状半合成材料还可用于制造生物吸收可控的装置或模制植入物，其包括生物吸收在时间上错开的缝合线。

它也可以用于配制以下制剂：即时使用的骨替代物、具有多孔胶原蛋白支撑体的骨替代物、具有动物来源或人类来源的矿物结构的骨替代物、生物可吸收的骨接合装置和模制植入物、生物吸收可控的装置、用于密封内置假体的接合剂、以及在椎体成形术、椎体后凸成形术和骨肿瘤手术中用于微创手术的可注射的接合剂。

根据另一个实施方案，根据本发明的产物可以与旨在去除细菌和病毒污染、去除任何色素并且中和免疫原性的经过机械和热化学处理的诸如沐浴角骨海绵(Spongiaofficinalis)的多孔胶原蛋白支撑体组合。已知沐浴角骨海绵由海绵硬蛋白构成，其反过来由与胶原蛋白有关的碳酸硬蛋白的纤维组成。该蛋白溶解度低并且起到保护和支撑以下所有组织的作用：结缔组织、肌腱、骨组织、肌纤维、皮肤、头发和指甲。海绵硬蛋白是结构性的储存的胶原蛋白；它是惰性的、不溶于水的、疏水的并且不易变性的。它构成了适合于骨传导的多孔支撑体。因此它可以与根据本发明的材料组合以用于制作骨替代物。

根据本发明的材料可以与诸如脱水或半水合硫酸钙、方解石、无水羟基磷酸钙、β-TCP和氢氧化钙的钙盐组合。根据本发明的材料可以与动物或人类来源的骨组织的矿物结构组合。

它也可以与以下组合：生物可吸收聚合物，诸如胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、淀粉、海藻酸盐；或可吸收合成聚合物，诸如聚乙交酯、聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)、聚(L-丙交酯)；或丙烯酸类聚合物，诸如聚羟乙基、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯；以及粉状形式的药物，诸如非甾体类抗炎药、抗生素、抗有丝分裂剂，或具有治疗目的的其他任何物质。

考虑到与使用甲基丙烯酸甲酯密封接合剂有关的缺点，发明人建议用本发明的产物制造的密封接合剂，其是天然不透射线的，由于其粘合性能而对内置假体进行主要的机械保持，其次由于它的骨模拟、骨诱导、骨传导和生物活性性能，导致通过信号分子(生物矿化引发剂)的存在诱导组织整合。

这些信号分子在原位刺激生物矿化的局部内源性因素，导致形成化生骨。

根据另一个目标，本发明涉及在本发明的材料中使用的或根据上述方法的步骤III制备的经历碳酸化的碳酸钙在组合物中的用途，所述组合物包括钙盐、天然或合成聚合物、胶原蛋白、动物或人类来源的骨组织的矿物结构。

已知文石层和方解石层的有机部分中含有的不溶的和可溶的生物聚合物具有愈合和再生的性能，既可以是诸如骨和软骨等的硬组织，也可以是诸如皮肤、肌肉和粘膜等的软组织。这些非胶原蛋白生物聚合物中的某些，特别是低分子量糖蛋白，可以与诸如BMP、TNFβ、 EGPF、TGFβ、IGF、FGF等的生长因子，以及细胞因子、炎症介质相联。

本发明还涉及根据本发明的材料中采用的或通过上述方法的步骤II提取的可溶的和不溶的生物聚合物作为粉末组合物中的添加剂的用途，所述粉末组合物包括钙盐、天然或合成聚合物、胶原蛋白、和动物或人类来源的骨组织的矿物结构。它们也可以与以下组合：生物可吸收聚合物，诸如胶原、透明质酸、壳聚糖、淀粉、海藻酸盐；或可吸收合成聚合物，诸如聚乙交酯、聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)、聚(L-丙交酯)；或丙烯酸类聚合物，诸如聚羟乙基、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯；以及粉状形式的药物，诸如非甾体类抗炎药、抗生素、抗有丝分裂剂，或具有治疗目的的其他任何物质。它们也可以与通过碳酸化转化的碳酸钙组合。

借助于纯粹为了说明而给出的以下实施例和附图将更详细地描述本发明，其中：

图1和图2是混合物的照片，该混合物为：

-具有全血的珍珠粉和碳酸钙(1号)和

-具有全血的珍珠粉和经过碳酸化的碳酸钙(2号)

在添加全血后2min、15min分别取该混合物。

实施例：

为了验证根据本发明的产物的药理学性能，发明人配制了具有治疗目标的制剂，并且将它们用于记录临床观察。

实施例1：

如下制备根据本发明的粉状半合成材料：

I.组分的制备：

在通过刮取去除体表寄生物后，将壳进行以下处理：

I.1)将壳去污：

I.2)将壳超声波处理：

I.3)冲洗并且干燥壳：

然后将壳在90℃的软化水浴中冲洗20min，所述软化水中添加有 2％稀释度的

30min。然后冲洗并干燥壳。

I.4)去除方解石外层：

用细晶砂轮通过研磨去除壳的方解石外层。

I.5)冷冻研磨后暴露的珍珠测试：

根据本发明，将步骤I.4)获得的珍珠测试在-18℃的温度下冷冻 120min。

I.6)粉碎珍珠测试并回收批料：

然后在带有

型碳化钨夹具的粉碎机中进行珍珠测试的粉碎，并抽吸，以回收也含有纳米颗粒的悬浮颗粒。

粉碎操作至少重复3次，筛分后留出2个批料：

使用激光粒度计来确定所得粉末的粒度尺寸和尺寸范围。

I.7)文石混合批料的球化：

将文石混合批料经过机械处理以通过球化使颗粒均匀化，目标是通过磨擦使颗粒的角和边缘圆整。

将等份的来自文石混合批料的粉状材料与已在高压釜中灭菌的硬木(例如橡木)的5mm²碎片的混合物放入由锆制作的具有水平旋转轴的圆柱形容器中，其具有宽度可变的玻璃片。

取决于容器的尺寸和待处理产物的量，容器以可变的时间和可变的速度旋转。

在球化处理结束时，将全部混合物，文石混合批料和碎片，在连续搅拌15min的装有足量水的惰性容器中回收。静置30min后，漂浮在表面上的木头碎片通过抽吸去除。

然后将溶液用具有20微米直径的网的尼龙过滤器过滤，然后将残余物在40℃下

中干燥并且包装。

II.生物聚合物的提取

II.1不溶生物聚合物的提取：

通过在区域I的进料箱中抽吸，将来自用于从文石内层中提取生物聚合物的批料中的适量粉末与足量的软化水混合，以注入在区域II 中的添加有限定量的25％柠檬酸的水解反应器中；整体在4-5℃波动的温度下冷却，连续搅拌。通过添加2.5N的氢氧化钠，将用pH计监测的pH保持在4.5以上以防止生物聚合物的降解；然后通过在每100 升水解产物中添加0.1升5N的氢氧化钠，在步骤结束时使PH回到7。

取决于比浊法的结果，水解产物可以再次经过超速离心。

因而，在最后一次超速离心结束时，获得含有所有不溶生物聚合物的湿润的褐色饼状物形式的残余物，其通过冷冻干燥来干燥；在处理结束时，我们获得直径为2-3毫米的灰色小球，其产生自离心力作用下的蛋白质卷曲。

将提取的不溶生物聚合物在行星式研磨机中磨碎，筛分后回收，直至获得随机粒度为5微米-100纳米的粉末。

II.2可溶生物聚合物的提取：

在压力为5bar、流速为10-15升每小时、温度为40℃下，将渗透物和洗涤水送往串联安装以提供15m²表面积的每个1kDa的切向超滤试剂盒

的组配装置中脱盐。

将溶液过滤，并且在真空、沸点33℃下，将渗透物在

中浓缩以去除晶体形式的柠檬酸。

含有低分子量蛋白质以及单价和多价离子的馏出物被延展。

由于试剂盒的截止点不保留所有的蛋白质，特别是那些非常低分子量的蛋白质，将馏出物进行反渗透。

在40-80bar的压力梯度作用下，将馏出物转移通过例如孔径为 0.0001微米的半选择性膜渗透以进行液相分离处理。

收集在反渗透膜上回收的滞留物并且用无热原水延展，然后在真空、40℃下，在

中浓缩，然后通过Zeodratation冻干。

获得非常细的灰白色粉末，将其放在一侧，然后在行星式研磨机中磨碎，以在筛分后获得随机粒度为5微米-100纳米的粉末。

III.碳酸钙的碳酸化：

将提取上述生物聚合物后回收的碳酸钙在800-1100℃下进行热处理，持续20-40分钟，然后在空气中慢慢冷却。这个现象是碳酸化，其根据以下反应进行：

CaCO₃+热处理→Ca(OH)₂+CO₂→CaCO₃+H₂O

在这个反应中，碳酸钙化学转化成石灰，然后在CO₂和环境湿度的作用下，其再次变成无定形碳酸钙。取决于环境湿度，该化学转化需要几天时间。

生物聚合物提取期间，证明了在使用的壳的文石内层和方解石外层中，不溶生物聚合物的比率为2.6％-4.3％，可溶生物聚合物的比率为0.4％-0.7％。

通过混合文石混合批料、步骤II.1中获得的不溶聚合物、步骤II.2 中获得的可溶聚合物以及上述步骤III中获得的经过碳酸化的碳酸钙来制备根据本发明的材料。下面给出的每个实施例中限定了各种组分的具体含量。

混合在刀式混合器中进行，直到获得均匀的粉末，然后将该粉末包装。

实施例2：

除了在步骤I.3结束时添加下述的交联步骤之外，遵循上文实施例1的程序。

在半透明玻璃容器或塑料容器中制备添加有10％核黄素的自来水的混合物；整体温度维持在20℃以上，并且搅拌混合物以产生垂直于UVA照射的流动。

将壳垂直放置在其中，并且在两侧以波长为365纳米/秒的UVA 灯，在2300微焦每平方厘米的强度下，照射180min。在整个处理过程中，整体保持在真空状态。

然后将壳冲洗并在40℃的热空气流中干燥。

实施例3：

如下验证碳酸钙的粘粘附和凝聚性：

向分别命名为Dappen 1号和Dappen 2号的两个各自含有1g在实施例1程序的步骤I.7的最后获得的珍珠粉末的Dappen杯中，添加以下物质：

-0.1g天然碳酸钙(Dappen 1号)，

-0.1g经过碳酸化的天然碳酸钙，其从实施例1程序的步骤III 获得(Dappen 2号)。

混合后，将每个Dappen杯的内含物与2cc全血混合。

与全血混合后2min(图1)和然后15min(图2)，拍摄每个Dappen 杯的照片。

如图1(1)所示，Dappen 1号中的混合物保持红色粉末的形式；没有形成凝结物。15min后，没有形成凝结物(图2(1))。

如图1(2)所示，Dappen 2号中的混合物迅速形成凝结物，颜色从红色逐渐变为棕色，结块，可以被模制，15min后变粘稠并变硬 (图2(2))。

实施例4：用于即时骨替代物的制剂

一个重要的临床病例是通过骨接合治疗的1岁小雌马猛撞的斜形骨折。在骨接合失败后(反映为4个螺钉断裂，假关节有败血症，随后是具有小碎片的粉碎性继发性骨折，使动物的安乐死成为唯一的替代方案)，决定使用根据本发明的具有下述制剂的材料：

·40g从实施例1的步骤I.8获得的粒度为50纳米-20微米的文石混合批料；

·0.070g在实施例1的步骤II.2中获得的提取的不溶生物聚合物；

·0.010g在实施例1的步骤II.1中获得的提取的可溶生物聚合物；

·2g从实施例1程序的步骤III获得的碳酸化的碳酸钙；

·10ml自体静脉血以形成凝结物，模制成长10厘米、直径2厘米的圆柱体形状，将其置于死骨的骨消融后的物质损失中。

将压缩保护的肢体放入石膏中。术后X光照相显示根据本发明的骨替代物的存在和粘附，然后在4个月时固结，之后，小雌马能够驰骋并跳跃障碍物。随后的X光照相显示具有重建的髓管的骨干完全恢复。

也使用相同的制剂，在室温下用2.5ml注射用水(WFI)即时制作凝结物。

实施例5：配制皮肤愈合霜剂

用以下百分比的配方制备根据本发明的产物的制剂：

·10g根据实施例2获得的粒度为50纳米-20微米的文石混合批料；

·0.035g在实施例1的步骤II.2中获得的提取的不溶生物聚合物；

·0.005g在实施例1的步骤II.1中获得的提取的可溶生物聚合物；

·0.5g碳酸化的碳酸钙；

·15滴精油复合物，以100ml计，该精油复合物包括：

穗状薰衣草(Lavandula spica)：1ml

鼠尾草(Salvia officinalis)：2ml

锈红蔷薇(Rosa rubiginosa)：10ml

蜡菊(Helichrysum italicum)：1.5ml

小麦胚芽植物油(Wheatgerm vegetable oil)：50ml

月见草油(Evening primrose oil)：10ml

甜杏仁油(Sweet almond oil)：20ml

O/W乳液适量，至100g。

将该制剂施用于马胸腹部从颈底部至膝关节，高度为32厘米，宽度为18厘米的皮肤坏死。临床观察显示在高度和宽度上每天1厘米的出色愈合，伴随各种腱膜的、皮下的和皮肤面的重建，并且同时毛发再生而不变色，28天内皮肤完全愈合。

实施例6：配制用于治疗牛皮癣的皮肤病制剂

众所周知，牛皮癣是一种皮肤炎症性疾病，其特征在于细胞更新加速，没有凋亡，这导致厚结壳成为斑块。除了类皮质甾酮疗法和基于煤焦油和PUVA疗法的局部治疗(其结果是可变的并且令人失望的)，还有对患者具有危险副作用的更激烈的治疗。

用下述百分比的配方制备根据本发明的产物的制剂：

·3g在实施例1的步骤II.2中获得的提取的不溶生物聚合物；

·0.45g在实施例1的步骤II.1中获得的提取的可溶生物聚合物；

·0.5g在实施例1的步骤III中获得的碳酸化的碳酸钙；

·10滴精油复合物，以100ml计，其含有：

穗状薰衣草：1ml

鼠尾草：2ml

锈红蔷薇：10ml

蜡菊：1.5ml

小麦胚芽植物油：50ml

月见草油：10ml

甜杏仁油：20ml

O/W乳液适量，至100g。

每天将该乳液施用于躯干、背部、手臂和腿部层面上的严重牛皮癣的病灶上。在第三次施用后，观察到发红消失，表明炎症现象减轻，皮肤剥落、瘙痒症和重叠感染减轻，外观显著改善。临床症状的改善反映了不溶的和可溶的生物聚合物的富营养化、消炎和再生性能。

实施例7：用于灼伤的皮肤敷料制剂

在角质细胞移植失败后，用以下制剂在深度二级和三级烧伤的情况下证明根据实施例1的步骤II提取的不溶的和可溶的生物聚合物的软组织再生的出色性能：

以100g计：

·50g根据实施例2获得的粒度为50纳米-20微米的文石混合批料；

·0.174g在实施例1的步骤II.2中获得的提取的不溶生物聚合物；

·0.026g在实施例1的步骤II.1中获得的提取的可溶生物聚合物；

·具有樱桃月桂水的Cérat de Galien(Galen's Wax)适量，至100g。

在封闭敷料下，将制剂施用于所有烧伤区域，并且每72小时重复一次。

反复的临床检查已经显示渗出现象的缓解、显著的血管生成、疼痛缓解、血液浸润区域的再上皮化和纤维弹性组织的特别减少。

实施例8：用于生物可吸收的模制骨替代物的制剂

根据本发明的材料可以用于制作生物可吸收的骨接合装置和模制植入物。

根据本发明，以100g计，如下制备：

·80g在实施例1的步骤I.8中获得的粒度为50纳米-20微米的文石混合批料；

·0.139g在实施例1的步骤II.2中获得的提取的不溶生物聚合物；

·0.021g在实施例1的步骤II.1中获得的提取的可溶生物聚合物；

·20g聚乙二醇400；

·4g在实施例1的步骤III中获得的碳酸化的碳酸钙。

室温下，将整体在混合器中混合10min直至获得可挤出并且可模制的均匀的塑性糊状物。

通过对插入骨接合装置和/或植入物的可能区域的解剖学的数字建模来产生合适形状的模腔。

将预足量的先获得的糊状物注入到包括一个或多个模腔的模具的压缩室中。

然后在逐渐从100增加至220N的压力下压缩整体；压力保持可变的时间，逐渐减小到0。

一旦从模具中移除、在40℃下干燥，并且包装成双层包装，用 25kGy的电离照射对该装置灭菌。

实施例9：具有可控的生物可吸收性的骨替代物的制剂

已经发现，骨替代物或生物可吸收装置的生物吸收性与相互连接的孔的直径直接相关，所述孔的直径必须在5-100微米变化，以允许通过新生血管和参与骨重建的细胞的定殖。

这就是为什么发明人建议制作具有可控的相互连接的孔隙度的骨替代物或模制植入物的原因。

为此目的，以100g计，制作以下制剂：

·80g在实施例2中获得的粒度为50纳米-20微米的文石混合批料；

·0.139g在实施例1的步骤II.2中获得的提取的不溶生物聚合物；

·0.021g在实施例1的步骤II.1中获得的提取的可溶生物聚合物；

·20ml 50％的羟丙基甲基纤维素(HPMC)溶液；

·20mm³可吸收的合成的单丝缝合线股线，其长度为5mm，直径为5/0-12/0。

这些可吸收线是诸如乙醇酸、乙醇酸共聚物、ε-己内酯聚乳酸(快薇乔缝线或照射的)、壳聚糖的聚合物。这些线表现出12-90天的交错吸收。

如前述实施例中那样，将糊状物注入到模具的空腔中，然后压缩。然后将装置或植入物从模具中取出，干燥，包装成双层包装，并且如先前一样在25kGy下灭菌。

实施例10：用于可注射的骨替代物和内置假体密封接合剂的制剂

以100g计，用以下组成制备接合剂：

·80g根据本发明的材料，其组成为：

·73g在步骤I.8结束时获得的粒度为50纳米-20微米的文石混合批料；

·2.702g在实施例1的步骤II.2中获得的提取的不溶生物聚合物；

·0.405g在实施例1的步骤II.1中获得的提取的可溶生物聚合物；

·3.699g从实施例1的步骤III获得的碳酸化的碳酸钙；

·20g在高粘度水溶液中的50％的HPMC。

将所得产物在真空下或在可控气氛下包装在可变容量(例如 0.5cm³-1cm³)的在约4℃的温度下冷藏储存的具有直的或倾斜的尖端的注射器中。

这种也可用作密封接合剂的制剂可以避免密封产品进入循环系统，例如在髓腔中的假体尾部的密封期间。

此外，由于它的组成，它不会引起具有影响肺系统风险的挥发性物质的释放。

还建议该组合物用于微创手术中的椎体成形术和椎体后凸成形术。

实施例11：用于具有胶原蛋白支撑体的骨替代物的制剂

用以下组成制作骨替代物：

以100g计，制剂为：

·50g在实施例1的步骤I.8中获得的粒度为50纳米-20微米的文石混合批料；

·0.087g在实施例1的步骤II.2中获得的提取的不溶生物聚合物；

·0.013g在实施例1的步骤II.1中获得的提取的可溶生物聚合物；

·2.5g在实施例1的步骤III中获得的碳酸化的碳酸钙；

·50g聚乙二醇400。

将整体混合直至获得粘度约为10Pa-s的凝胶。

将30g尺寸降至2mm碎片的沐浴角骨海绵添加到该凝胶中。

将整体混合，直至获得粘度约为10⁸Pa-s的均匀糊状物。将整体注入用于骨接合装置或植入物的包括模腔的模具中。脱模后，将装置或植入物在40℃的热空气流下干燥，包装在双层包装中并且根据目前的方案灭菌。

实施例12：用于骨替代物的制剂

根据另一个实施方案，可以将提取自单独的文石部分和/或提取自方解石部分的生物聚合物添加到合成或天然来源的其他任何生物材料中，以优化或诱导它们缺乏的某些性能，特别是骨诱导或骨模拟性能。

因此，用提取自文石层的生物聚合物补充诸如某些钙盐的骨传导替代物，根据以100g计的制剂为：

·95g粒度为50-250微米的βTCP微粒；

·4.4g在实施例1的步骤II.2中获得的提取的不溶生物聚合物；

·0.6g在实施例1的步骤II.1中获得的提取的可溶生物聚合物。

将这种制剂与自体血混合，插入到上部中切牙顶端囊肿产生的骨缺损中。

与此同时，将βTCP单独压实到通过在上犬齿的根尖肉芽肿切除术所致的物质损失中。

在2周时进行的放射学检查表明，用混合物βTCP+提取的不溶的和可溶的生物聚合物处理的囊腔中的骨致密化比在第二腔中的骨致密化更大且更快，在所述第二腔中βTCP颗粒是明显的，其仅表达骨传导，而在囊腔中，骨诱导伴随着骨传导，表明βTCP取得了新性能。

Claims

1.一种衍生自天然海洋生物材料的粉状半合成材料，其添加有不溶的和可溶的生物聚合物以及通过碳酸化转化的碳酸钙，

其中所述天然海洋生物材料是双壳软体动物的壳的文石内层，所述双壳软体动物选自Pinctadines和砗磲，所述文石内层为粉状形式；

其中所述不溶的和可溶的生物聚合物提取自双壳软体动物的壳的文石内层和/或方解石外层，所述双壳软体动物选自Pinctadines和砗磲，并且

其中所述通过碳酸化转化的碳酸钙衍生自天然陆地、天然海洋或沉淀的碳酸钙，或衍生自提取不溶的和可溶的生物聚合物后的文石层的无机部分。

2.根据权利要求1所述的半合成材料，其特征在于，所述Pinctadines选自大珠母贝和合浦珠母贝，并且所述砗磲选自库氏砗磲、长砗磲、无鳞砗磲、魔鬼砗磲、鳞砗磲、番红砗磲、砗蚝、瓷口砗磲。

3.根据权利要求1所述的半合成材料，其特征在于，粉状形式的所述天然生物材料的粒度为5nm-100μm。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的半合成材料，其特征在于，所述半合成材料是生物可吸收的。

5.制备根据权利要求1-4中任一项所述的材料的方法，包括混合磨碎的天然海洋生物材料、提取自双壳软体动物的壳的文石内层和/或方解石外层的不溶的和可溶的聚合物，以及通过碳酸化转化的碳酸钙，所述双壳软体动物选自Pinctadines和砗磲。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述磨碎的天然生物材料通过研磨所述双壳软体动物的壳的文石内层获得，所述双壳软体动物选自Pinctadines和砗磲。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括研磨后的球化步骤。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述不溶的和可溶的生物聚合物在水解后分别通过超速离心以及通过切向超滤与反渗透的偶联来提取。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在提取前，将所述软体动物的壳的文石内层和/或方解石外层交联。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在提取前，将所述软体动物的壳的文石内层和/或方解石外层磨碎并且筛分至粒度为250μm-50μm。

11.根据权利要求1-4中任一项所述的粉状半合成材料或根据权利要求5-10中任一项所述的方法获得的粉状半合成材料在制造包括生物吸收在时间上错开的缝合线的生物吸收可控的装置或包括生物吸收在时间上错开的缝合线的生物吸收可控的模制植入物中的用途。

12.根据权利要求1-4中任一项所述的粉状半合成材料或根据权利要求5-10中任一项所述的方法获得的粉状半合成材料用于配制以下制剂的用途：即时使用的骨替代物、生物可吸收的骨替代物、生物吸收可控的装置、密封内置假体的接合剂、以及在椎体成形术和椎体后凸成形术中用于微创手术的可注射的接合剂。

13.根据权利要求1-4中任一项所述的材料中采用的经过碳酸化的碳酸钙在组合物中作为塑性的、可模制的并且粘合性的添加剂的用途，所述组合物包括天然或合成聚合物、和动物或人类来源的骨组织的矿物结构。

14.根据权利要求1-4中任一项所述的材料中采用的提取的不溶的和可溶的生物聚合物在粉状组合物中作为添加剂的用途，所述粉状组合物包括天然或合成聚合物、以及动物或人类来源的骨组织的矿物结构。