KR20180021095A - 천연 해양 생체재료의 조성을 변경하여 수득한 반합성 분말 물질, 이의 제조 방법, 및 이의 용도 - Google Patents

천연 해양 생체재료의 조성을 변경하여 수득한 반합성 분말 물질, 이의 제조 방법, 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탄산염화작용(carbonation)에 의해 변형된 탄산칼슘(calcium carbonate) 및 불용성 및 가용성 생체고분자(biopolymer)를 첨가한 분말 형태인 천연 해양 생체재료, 즉 진주조개과(Pinctadae), 구체적으로 백접패(Pinctada maxima), 흑접패(Pinctada margaritifera) 및 트리다크나(Tridacna), 구체적으로 트리다크나 기가스(Tridacna gigas), 트리다크나 맥시마(Tridacna maxima), 트리다크나 데레사(Tridacna derasa), 트리다크나 테보라(Tridacna tevoroa), 트리다크나 스쿠아모사(Tridacna squamosa), 트리다크나 크로세아(Tridacna crocea), 하이포퍼스 하이포퍼스(Hippopus hippopus), 하이포퍼스 포르세라너스(Hippopus porcellanus)를 포함하는 군으로부터 선택되는 이매패류(bivalve molluscs) 껍데기(shell)의 아라고나이트 내층(aragonitic inner layer)로부터 유래된 분말 반합성 물질에 관한 것이다; 또한 이의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

천연 해양 생체재료의 조성을 변경하여 수득한 반합성 분말 물질, 이의 제조 방법, 및 이의 용도
본 발명은 일반적으로 진주조개과(Pinctadae), 구체적으로 백접패(Pinctada maxima), 흑접패(Pinctada margaritifera) 및 트리다크나(Tridacna) : 트리다크나 기가스(Tridacna gigas), 트리다크나 맥시마(Tridacna maxima), 트리다크나 데레사(Tridacna derasa), 트리다크나 테보라(Tridacna tevoroa), 트리다크나 스쿠아모사(Tridacna squamosa), 트리다크나 크로세아(Tridacna crocea), 하이포퍼스 하이포퍼스(Hippopus hippopus), 하이포퍼스 포르세라너스(Hippopus porcellanus)와 같은 이매패류(bivalve molluscs) 껍데기로부터 유래된 천연 해양 생체재료로부터 수득한 분말 반합성 생체흡수성(bioabsorbable) 물질에 관한 것이다.
일반적으로 외상, 종양, 이영양증(dystrophic) 또는 퇴행성 기원의 골 물질의 충진(filling) 손실에 사용되는 물질은 인산칼슘 시멘트(calcium phosphate cement), 생체-고분자 및 동물 또는 인간 기원의 물질이다.
인공기관(prostheses)을 봉합하기 위해, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA)만이 항생제, 개시제, 활성제, 불투명화제(opacifier) 또는 착색제와 선택적으로 배합되어 사용되고 있다. 관내인공삽입물(endoprostheses)은 일반적으로 PMMA 시멘트로 밀봉되는데, 이의 단점, 특히 시멘트의 중합(polymerization) 동안 생성되는 발열반응(exothermic reaction), 생성된 골세포 괴사(osteocyte necrosis), 시간 경과에 따른 시멘트의 수축(shrinkage) 및 노화로 인한 인공 기관의 유동성(mobility) 유발이 잘 알려져 있으며, 이에 대부분의 경우, 수술 후 10 내지 15년 이내에 반복해야 할 필요가 있다.
이러한 모든 물질은 생체 적합성(biocompatible)을 지니며, 일부는 인산칼슘 시멘트와 같이 골전도(osteoconduction) 특성이 주장되나, 거의 생리활성(bioactive)이 없으며, 대다수는 비활성이다.
주사 가능한 시멘트는 인산(phosphoric acid), HPMC의 수용액 또는 겔, 0.1 몰(mole)의 화학량론적 물(stoichiometric water), 황산 또는 시트르산(citric acid)일 수 있는 미네랄 상(mineral phase) 및 액상(liquid phase)으로 구성된다.
골 대체제로 사용되는 합성 또는 소(bovine) 기원의 생체재료는 기본적으로 골전도 특성을 나타내며, 일반적으로 완전한 생체흡수성을 지니지는 않는다.
이들 중 일부, 특히 고분자의 경우에는, 주변 조직 또는 전신 질환 조직에 장기간 해로운 영향을 줄 수 있는 분해 산물이 방출된다는 것이 밝혀졌다. 생체흡수(bioabsorption)는 환자에 따라 다르다.
더욱이, 거의 모든 골 대체제는 생리활성이 없어서, 이러한 점은 동물 기원의 콜라겐 또는 생체흡수되는 기타 물질과 그들을 배합시킬 필요가 있으며, 생리학적 반응과는 상이하고 더 중요한 주요 염증 반응을 유도하게 된다.
분말 또는 과립 형태의 골 대체제의 주요 문제점은 자가 혈액(autologous blood), 생리식염수(saline solution) 또는 임의의 기타 액체 담체(liquid carrier)와 함께 사용시, 원위치에서 이들의 응집력(cohesion) 및 유지력(maintenance)을 촉진하는, 접착성 및 가소성 특성을 가지는 "응고물(coagulum)"을 형성하지 않는다는 것이다.
인간의 뼈는 43%의 무기 성분(inorganic component), 32%의 유기 성분(organic component) 및 25%의 물로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다. 상기 유기 성분은 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오넥틴(osteonectin), 오스테오폰틴(osteopontin), BSP(bone sialoprotein), 프로테오글리칸(proteoglycans), 피브로넥틴(fibronectin), 성장 인자 및 골형성 단백질(bone morphogenic protein)로 대표되는 97%의 Ⅰ형, Ⅲ형, Ⅳ형 및 Ⅴ형 콜라겐을 포함하는 콜라겐 단백질 90%와 비-콜라겐 단백질(non-collagen protein) 10%로 구성된다. 상기 비-콜라겐 단백질은 손상된 조직의 골 형성(osteogenesis) 및 회복(repair) 과정에 필수적인 역할을 한다.
무기 분획물은 주로 인산칼슘의 결정(crystals) 형태인 수산화 인회석(hydroxyapatite)으로 구성되며, 또한, 상기 분획물은 나트륨, 칼륨, 구리, 아연, 스트론튬, 플루오린, 알루미늄 및 규소와 같은 기타 미네랄을 극소량 함유하고 있다. 이러한 모든 요소는 세포 대사(cellular metabolism) 뿐만 아니라 치유 및 골 재생에 있어 중요한 역할을 한다.
일반적으로 진주조개과, 구체적으로 백접패, 흑접패 및 트리다크나, 구체적으로 트리다크나 기가스, 트리다크나 맥시마, 트리다크나 데레사, 트리다크나 테보라, 트리다크나 스쿠아모사, 트리다크나 크로세아, 하이포퍼스 하이포퍼스, 하이포퍼스 포르세라너스와 같은 이매패류 껍데기의 구조 및 성분에 대한 조사 결과, 3 내지 5%의 유기 분획물로 이루어진 진주 내층을 포함하며, 그 자체는 콜라겐 단백질 및 비-콜라겐 단백질, 본질적으로 불용성 및 가용성 생체고분자로 구성되어 있는 것으로 나타났다. 또한, 상기 진주 내층은 필수적으로 탄산칼슘, 미네랄 및 금속 이온으로 이루어진 95 내지 97%를 나타내는 무기 분획물과 3%의 물을 함유하고 있다. 본 발명에 관련된 연체동물(molluscs) 껍데기의 구조에 대한 조사 결과, 아라고나이트 내층과는 구조적으로 상이한 칼사이트 외층으로도 이루어져 있으나, 불용성 및 가용성 생체고분자로 이루어진 유기 분획물 또한 함유하고 있는 것으로 나타났다.
몇몇 간행물은 상기 언급한 해양 연체동물로부터 유래된 천연 생체재료의 골유도(osteoinduction) 및 골전도(osteoconduction) 특성을 입증하였다.
이러한 특성은 치아, 뼈, 피부, 근육, 점막 등과 같은 장기 구조에 기여하는 것과 유사한 구조 단백질이 확인된 유기 분획물을 포함하는 생체고분자의 존재로 인해 발생한다. 또한, 물질대사 및 생화학적 과정(효소학, 면역학, 막 수용체, 신호 분자 등)과 관련된 유사한 기능성 단백질도 존재한다. 구조 단백질 중에서 특히 콜라겐이 대표적이며, 이와 같이 Ⅰ형, Ⅱ형, Ⅲ형 및 관련 콜라겐이 확인되었다.
유리 아미노산(free amino acid) 이외에도, 프로테오글리칸(스몰 펩타이드(small peptide)에 결합된 탄수화물), 및 BMP, TNFβ, TGFβ, PGF 등과 관련된 일반적으로 성장 인자로 여겨지는 저분자량의 당 단백질(glycoprotein)을 포함하는 당 단백질(콜라겐 및 탄수화물의 결합)의 존재가 확인되었다.
더욱이, 생리학적 치유 과정 및 세포 및 조직 재생에 있어서 특정 비-콜라겐 분자가 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
전술한 연체동물의 껍데기 내층의 유기-미네랄 복합체(organo-mineral complex)의 치유, 재생, 신생혈관 생성 및 골유도 특성, 다양한 콜라겐 및 성장 인자의 존재와 관련된 특성이 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 입증되었다.
골 조직 및 당해 연체동물 껍데기의 아라고나이트의 물리화학적 조성을 비교하면, 본 발명자들은 골 조직에서 32%, 그리고 아라고나이트에서 3 내지 5%의 퍼센티지(percentage)로 존재하는 유기 성분의 상당한 유사성에 주목한다. 기본적으로 인산칼슘인 뼈에 대한 미네랄 상(mineral phases) 43%는 아라고나이트에서 탄산칼슘의 형태로 95 내지 97%를 나타내며, 기타 미네랄의 비율은 매우 유사하다.
천연 해양 생체재료의 유기 분획물에 함유된 생체고분자의 역할을 고려하여, 본 발명자들은 신규한 반합성 하이브리드(hybrid) 생체재료의 조성에 상기 생체고분자의 비율을 증가시킴으로써 조성을 변형시키는 것이 적절하다는 것을 밝혀냈다.
당해 연체동물 껍데기의 아라고나이트 내층 및 칼사이트 외층의 유기 분획물은 석회화된(calcified) 조직의 미네랄화(mineralization) 및 성장에 관여하는 골형성(osteogenic) 특성을 갖는 가용성의 확산가능한(diffusible) 분자를 함유하는 것으로 알려져 있다. 아라고나이트의 주변-결정질(peri-crystalline) 및 층상(interlamellar) 외피에서 불용성 구조 단백질의 존재 또한 입증되었다.
더욱이, 본 발명과 관련된 연체동물 껍데기의 칼사이트 외층의 유기 분획물에 함유된 분자는 껍데기의 아라고나이트 내층에 함유된 것과 유사하다.
이러한 이유로, 생체결정 및 진주층 시험의 아라고나이트로 구성된 입계 층상(intercrystalline lamellae)과 밀접하게 관련된 유기 분자 뿐만 아니라 당해 연체동물 껍데기의 칼사이트 외층에 함유된 것도 추출하고 농축하는 것이 적절한 것으로 보인다.
생체재료(biomaterial)의 유기 분획물의 생체고분자를 추출하는 것은 가용성 및 불용성 분자를 제공하는 것을 목적으로 한다. 상기 목적은 이와 같이 수득한 생체재료의 세포 및 조직 재생, 치유, 골유도, 및 신생혈관 생성(angiogenesis)의 특성을 최적화하기 위해, 추출된 불용성 및 가용성의 생체고분자를 보충함에 의해 유기-무기 구조적 비율을 증가시키는 것이다.
따라서, 본 발명자들은 트리다크나 맥시마, 트리다크나 기가스, 트리다크나 데레사, 트리다크나 테보라, 트리다크나 스쿠아모사, 트리다크나 크로세아, 하이포퍼스 하이포퍼스, 하이포퍼스 포르세라너스, 백접패, 흑접패 및 기타 진주조개과로부터 선택되는 연체동물 껍데기로부터 시작하여 가용성 및 불용성 생체고분자, 및 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘물질을 모두 첨가함으로써 요건을 충족시킨 물질을 수득하는 것이 가능하다는 것을 밝혀냈다.
따라서 변형된, 본 발명에 따른 신규한 분말 반합성 생체흡수성 물질은 예를 들어, 골 대체제, 주사용 시멘트 또는 관내인공삽입물(endoprostheses) 밀봉용 시멘트를 제조하거나, 생체흡수성 골접합술(osteosynthesis) 장치 및 성형된 임플란트를 제조하기 위한 것이다.
따라서, 일 양태에 따르면, 본 발명은 탄산염화작용(carbonation)에 의해 변형된 탄산칼슘(calcium carbonate) 및 불용성 및 가용성 생체고분자(biopolymer)를 첨가한 천연 해양 생체재료로부터 유래된 분말(pulverulent) 반합성(semisynthetic) 물질에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 반합성 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 반합성 물질에 사용되는 가용성 및 불용성 생체고분자 또는 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
최종적으로 본 발명은 예를 들어, 골 대체제, 주사용 시멘트 또는 관내인공삽입물(endoprostheses) 밀봉용 시멘트의 제조, 또는 이외에 생체흡수성 골접합술(osteosynthesis) 장치 및 성형된 임플란트 제조를 위한 반합성 물질 또는 이의 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘 및 불용성 및 가용성 생체고분자를 첨가한 천연 해양 생체재료로부터 유래된 분말 반합성 물질에 관한 것이다.
본 발명에 따른 물질은 천연 해양 생체재료, 즉 진주조개과(Pinctadae), 구체적으로 백접패(Pinctada maxima), 흑접패(Pinctada margaritifera) 및 트리다크나(Tridacna), 구체적으로 트리다크나 기가스(Tridacna gigas), 트리다크나 맥시마(Tridacna maxima), 트리다크나 데레사(Tridacna derasa), 트리다크나 테보라(Tridacna tevoroa), 트리다크나 스쿠아모사(Tridacna squamosa), 트리다크나 크로세아(Tridacna crocea), 하이포퍼스 하이포퍼스(Hippopus hippopus), 하이포퍼스 포르세라너스(Hippopus porcellanus)를 포함하는 군으로부터 선택되는 이매패류(bivalve molluscs) 껍데기(shell)의 아라고나이트 내층(aragonitic inner layer)로부터 유래된 것으로, 상기 아라고나이트 층(aragonitic layer)은 분말 형태이다.
본 발명에 따른 분말 반합성 물질은 생체흡수성(bioabsorbable)이다.
일 구체예에 따르면, 입도분포(granulometry)는 5㎚ 내지 100㎛, 바람직하게는 20㎚ 내지 50㎛, 더욱 바람직하게는 50㎚ 내지 20㎛이다.
상기 가용성 및 불용성 생체고분자는 진주조개과, 구체적으로 백접패, 흑접패 및 트리다크나, 구체적으로 트리다크나 기가스, 트리다크나 맥시마, 트리다크나 데레사, 트리다크나 테보라, 트리다크나 스쿠아모사, 트리다크나 크로세아, 하이포퍼스 하이포퍼스, 하이포퍼스 포르세라너스를 포함하는 군으로부터 선택되는 이매패류 껍데기의 아라고나이트 내층 및/또는 칼사이트 외층으로부터 추출된 것이다.
상기 고분자 추출 방법은 본 명세서 하기에 기술된다.
특정 구체예에 따르면, 상기 추출된 가용성 생체고분자 및 불용성 생체고분자는 출발 생체재료에 존재하는 것에 상응하는 가용성 생체고분자 대 불용성 생체고분자의 비율로 첨가된다.
본 발명의 반합성 물질에 사용된 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘은 천연 육생(natural terrestrial), 천연 해양(natural marine) 또는 침강성 탄산칼슘(precipitated calcium carbonate) 유래 또는 아라고나이트 층(aragonitic layer) 추출 후 탄산염화작용에 의해 변형된 불용성 및 가용성 생체고분자의 무기 분획물로부터 유래된 것이다. 사방정계(orthorhombic system) 또는 능면체 결정계(rhombohedral system)에서 결정화된(crystallized) 탄산칼슘은 800 내지 1100℃의 열처리를 따른 경우에, 열분해(thermolysis) 및 산화(oxidation)에 의해 상당한 접착력 및 가소성(plasticity)이 나타나 쉽게 모델링 될 수 있는 새로운 성질이 생기는 것으로 알려져 있다. 이 현상은 다음과 같은 반응을 따르는 탄산염화작용(carbonation)이다 :
탄산칼슘(CaCO3) + 열처리 → 칼슘하이드록사이드(Ca(OH)2) + 이산화탄소(CO2) → 탄산칼슘(CaCO3) + 물(H2O)
상기 반응에서, 20 내지 40분 시간 동안 온도를 상승시키고 유지하는 동안, 상기 탄산칼슘은 화학적으로 변형되어 석회(lime)가 되고, 이후 CO2 및 주변 습기의 작용하에서 무정형(amorphous) 탄산칼슘이 된다. 이 화학적 변형은 주변(ambient) 습도측정(hygrometry)에 따라 며칠에 걸쳐 발생한다.
따라서, 본 발명에 따른 분말 반합성 물질은 추출된 불용성 및 가용성 생체고분자가 보충된 유기 분획물, 및 퇴적물(sedimentary) 또는 녹석(madrepore) 해양 기원의 탄산칼슘, 또는 탄산염화작용 과정에 의해 변형된 퇴적물 또는 침전된 육생 기원이 보충된 미네랄 분획물인 천연 해양 물질로부터 유래된 분말을 포함한다.
특정 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 분말 반합성 물질은 5㎚ 내지 100㎛, 바람직하게는 20㎚ 내지 50㎛, 더욱 바람직하게는 50㎚ 내지 20㎛의 입도분포(granulometry) 갖는 분말 형태의 아라고나이트, 불용성 및 가용성의 추출된 생체고분자, 및 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘을 포함한다.
불용성 및 가용성의 추출된 생체고분자를 첨가함에 의해, 초기 물질의 유기 분획물의 비율은 바람직하게는 출발 물질에 존재하는 불용성 생체고분자와 가용성 생체고분자간의 비율에 대해 1% 내지 10% 범위로 증가된다. 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘을 첨가함에 의해, 초기 물질의 미네랄 분획물의 비율은 원하는 물리화학적(physicochemical) 특성에 따라, 1% 내지 10% 범위로 증가된다.
특정 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 반합성 물질은 다음을 포함한다:
5㎚ 내지 100㎛, 바람직하게는 20㎚ 내지 50㎛, 더욱 바람직하게는 50㎚ 내지 20㎛의 입도분포(granulometry) 갖는 분말 형태의 아라고나이트 100g ;
1g 내지 50g, 바람직하게는 5g 내지 25g, 더욱 바람직하게는 10g 내지 15g의 불용성 및 가용성의 추출된 생체고분자 ; 및
0.5 내지 50g, 바람직하게는 1g 내지 25g, 더욱 바람직하게는 2g 내지 10g의 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘.
생체고분자 추출 동안, 본 발명자들은 본 발명을 수행하기 위해 사용한 연체동물의 아라고나이트 내층(aragonitic inner layer) 및 칼사이트 외층(calcitic outer layer)에서 불용성 생체고분자의 비율이 2.6% 내지 4.3%이고, 가용성 생체고분자의 비율이 총 중량의 0.4% 내지 0.7%임을 입증하였다. 생체고분자는 가용성 생체고분자 대 불용성 생체고분자의 비율이 원래의 천연 생성물의 비율과 유사한 방식으로 본 발명에 따른 물질에 첨가된다.
또한, 전술한 바와 같이, 본 발명은 분말 반합성 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 따르면, 구성 요소는 개별적으로 제조되고, 이후 본 발명에 따른 물질을 수득하기 위해 혼합된다. 따라서, 천연 해양 생체재료로부터 유래된 분말 물질, 천연 해양 생체재료로부터 추출된 불용성 및 가용성 생체고분자 및 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘을 제조한다.
보다 구체적으로, 상기 제조방법은 진주조개과, 구체적으로 백접패, 흑접패 및 트리다크나, 구체적으로 트리다크나 기가스, 트리다크나 맥시마, 트리다크나 데레사, 트리다크나 테보라, 트리다크나 스쿠아모사, 트리다크나 크로세아, 하이포퍼스 하이포퍼스, 하이포퍼스 포르세라너스를 포함하는 군으로부터 선택되는 이매패류 껍데기의 아라고나이트 내층 및/또는 칼사이트 외층으로부터 추출된 불용성 및 가용성 고분자인 분쇄 천연 생체재료, 및 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘을 혼합하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 분쇄 천연 생체재료는 연체동물 껍데기의 아라고나이트 내층이다. 파쇄(grinding)는 20㎚ 내지 50㎛의 평균 입도분포(granulometry)를 얻기 위해 수행된다. 수득된 입자는 분말의 유동성(flowability) 및 압축성(compressibility)을 개선하기 위해 구형화 될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 불용성 및 가용성 생체고분자는 가수분해(hydrolysis) 후 역삼투(reverse osmosis)와 결합된 접선 한외여과(tangential ultrafiltration) 및 초원심분리(supercentrifugation)에 의해 각각 추출된다. 추출 전에, 연체동물 껍데기의 아라고나이트 내층 및/또는 칼사이트 외층을 가교결합(crosslinked) 시킬 수 있다. 추출을 용이하게 하기 위해, 연체동물 껍데기의 아라고나이트 내층 및/또는 칼사이트 외층을 250㎛ 내지 50㎛의 입도분포(granulometry)로 분쇄하고 체질(sieved) 한다.
이러한 다양한 단계는 본 명세서 하기에 계속 기술된다.
원료로서 사용된 상기 천연 해양 생체재료는 진주조개과, 구체적으로 백접패, 흑접패 및 트리다크나, 구체적으로 트리다크나 기가스, 트리다크나 맥시마, 트리다크나 데레사, 트리다크나 테보라, 트리다크나 스쿠아모사, 트리다크나 크로세아, 하이포퍼스 하이포퍼스, 하이포퍼스 포르세라너스를 포함하는 군으로부터 선택된다.
각 구성 성분은 동일한 해양 생체재료 또는 상이한 해양 생체재료로부터 유래 될 수 있다.
선택된 껍데기를 세척하여 오염 제거하고, 선택적으로 가교결합 시키며, 칼사이트 층은 내층으로부터 분리한다. 내층을 파쇄한다. 파쇄된 내층의 일부는 본 발명에 따른 물질의 기본 성분(base component)을 구성한다. 용해성 및 불용성 생체고분자는 칼사이트 층 및/또는 내층으로부터 추출된다. 생체고분자 추출 후에 회수된 미네랄 부분으로부터 유래 될 수 있는 탄산칼슘은 탄산염화작용에 의해 변형된다. 이와 같이 추출된 생체고분자 및 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘을 이전에 수득한 상기 기본 성분에 첨가한다.
본 발명에 따른 방법의 특정 구체예는 하기에 상세히 기술된다. 당연히, 통상의 기술자라면, 이 방법의 조건을 특정 출발 생체재료 및 원하는 최종 용도에 맞게 조정할 수 있을 것이다.
I. 성분의 제조 :
긁어서 착생생물(epibiont)을 제거한 후, 선택된 해양 생체재료로부터 수득한 껍데기는 다음과 같이 처리되었다:
I.1) 껍데기의 오염 제거 :
껍데기를 2% 활성 염소의 차아염소산염(hypochlorite) 용액이 첨가된 주 급수(mains water)의 베스(bath)에 담궈 오염을 제거하였다.
I.2) 껍데기의 초음파 처리 :
껍데기를 세척한 후, 예를 들어 55℃ 온도의 미생물학적으로 검사된 주 급수가 채워진 탱크에서 초음파로 처리하였으며, 여기에 세정액 및 소독액을 127 중량부(part)의 물에 대해 1 중량부의 희석 용액으로 첨가하였다. 처리 시간은 40 kHz의 주파수에서 30분간 하였다.
I.3) 껍데기의 세척 처리 및 건조 :
껍데기를 90℃ 온도의 탈염수(demineralized water) 베스에서 예를 들어 20분간 세척한 후 칼베늄®(Calbenium®)을 2%의 희석액으로 30분간 첨가하였다. 세척한 후 건조하였다.
I.4) 껍데기의 가교결합(crosslinking) :
또 다른 구체예에 따르면, 생물학적 특성이 강화된 천연 기원의 생체재료를 부여하기 위해, 특히 세포 대사(cellular metabolism)를 최적화하고 항-라디칼(anti-radical) 특성을 강화하기 위한 측면에서, 껍데기는 하기와 같이 가교결합 될 수 있다:
가변 용량(variable capacity)의 반투명 유리 또는 플라스틱 용기에 10% 리보플라빈(riboflavin)을 첨가한 주 급수(mains water)의 혼합물을 준비하였다; 전체는 20℃ 이상의 온도로 유지되며, 혼합물의 교반은 UVA 방사선에 대해 수직적인 유동을 생성한다.
상기 껍데기를 그 내부에 수직적으로 배치하였으며, 2300 마이크로줄(microjoule)/㎠의 세기(intensity)로 180분 동안 365 나노미터/초(second)의 파장을 갖는 UVA 램프로 양면에 방사선을 조사하였다. 전체는 처리 기간 동안 진공 상태로 유지되었다.
상기 껍데기를 세척한 후, 40℃의 고온 공기류로 건조시켰다.
2014년 1월 10일에 출원된 특허 출원 FR 14 50204에 기술된 방법을 사용할 수도 있다.
I.5) 칼사이트 외층(calcitic outer layer)의 제거 :
껍데기의 칼사이트 외층은 미립자(fine-grain) 그라인딩 휠(grinding wheel)로 분쇄하여 제거하였다.
상기 생성물은 사용전까지 보관되었으며, "칼사이트 외층으로부터의 생체고분자의 추출용 배치(batch)"로 구성되었다.
I.6) 분쇄(grinding) 후 노출된 진주층 시험 동결 :
본 발명에 따라, 진주층 시험은 -18℃의 온도에서 120분 동안 동결하였다.
I.7) 진주층 시험 파쇄(crushing) 및 배치 회수 :
진주층 시험은 예를 들어 텅스텐 카바이드 턱(tungsten carbide jaws)을 가진 파쇄기(crusher)에서 흡입(aspiration)하면서 파쇄를 수행한 후, 나노 입자(nano-grain)를 포함하는 부유 입자(suspended particles)를 회수하였다.
파쇄 작업은 적어도 3회 반복하였으며 체질(sieving) 후 2개의 배치를 따로 보관하였다 :
- 20 마이크론(micron) 내지 50 나노미터(nanometre)의 무작위 입도분포를 가진 제1 배치는 하기에 "아라고나이트 혼합 배치(aragonite mixed batch)"로 지칭되었으며, 본 발명에 따른 생성물의 아라고나이트 혼합 부분으로 구성될 것이다. "아라고나이트 혼합 배치"는 두 가지 유기 및 무기 성분을 포함하는 분쇄 후 수득된 분말 형태를 의미한다.
- 250 내지 50 마이크론의 입도분포를 갖는 제2 배치는 불용성 및 수용성 생체고분자 추출을 위해 사용전까지 보관되었다. 이것을 "아라고나이트 내층으로부터의 생체고분자 추출용 배치"라고 지칭하였다.
레이저 입도 분석기(laser granulometer)는 수득한 분말의 입자 크기 및 크기 범위를 측정하기 위해 사용될 것이다.
I.8) 아라고나이트 혼합 배치의 구형화 :
상기 아라고나이트 혼합 배치는 구형화(spherification)에 의해 입자를 균일하게 하고자 기계적 처리를 하였으며, 이 목적은 마찰에 의해 입자의 모서리 및 가장자리를 둥글게 하는 것이다.
이러한 처리는 수득된 분말의 유동성(flowability) 및 압축성(compressibility)을 촉진시키는 효과를 가지며, 따라서 본 발명에 따른 물질, 구체적으로 골 대체제, 밀봉용 시멘트, 주사용 시멘트, 생체흡수성 골접합술(osteosynthesis) 장치 및 성형된 임플란트로서 사용할 때 고밀도화(densification) 및 입자 간 결합(inter-particle bond)을 촉진시킨다.
이러한 구형화 단계에 대해, 하기와 같은 절차가 채택될 수 있다 : 다양한 너비의 유리 블레이드(blade)를 가지는 예를 들어, 수평 회전축이 있는 유리 또는 지르코늄(zirconium)으로 제조된 원통형 용기(cylindrical container)에 아라고나이트 혼합 배치로부터의 분말 물질 및 오토클레이브(autoclave)로 멸균한 경질 목재(hard wood), 예를 들어, 떡갈나무(oak) 몇몇 ㎟ 칩의 동일 중량부(parts) 혼합물을 넣었다.
상기 용기는 처리된 생성물의 양 및 용기 크기에 따라 다양한 시간 및 다양한 속도로 회전시켰다.
구형화 처리가 끝나면, 아라고나이트 혼합 배치 및 칩 혼합물 전체를 15분 동안 연속적으로 교반하면서 충분한 양의 물이 채워진 불활성 용기에서 회수하였다. 30분 동안 방치한 후, 표면에 떠있는 나무 칩을 흡입(suction)하여 제거하였다.
이후, 상기 용액을 20 마이크론의 직경을 갖는 메쉬(mesh)가 있는 나일론 필터로 여과하였으며, 잔여물(residue)은 40℃의 로타베이퍼®(Rotavapor®)로 건조시키고 포장하였다.
또 다른 구체예에 따르면, 1 내지 3㎜ 범위의 무작위 직경을 갖는 입자 형태의 염화나트륨(sodium chloride)의 동일 중량부를 아라고나이트 혼합 배치에 또한 첨가할 수 있다. 처리 후, 90℃의 온수로 용해시키고 나일론 필터로 여과한 후, 90℃의 열수로 세척하고 40℃의 고온 공기류로 건조시킴으로써 염화나트륨을 제거한다.
Ⅱ. 생체고분자의 추출
Ⅱ.1 불용성 생체고분자의 추출 :
본 발명에 따르면, 생체고분자 추출을 위한 단계 I.5)에서 수득된 아라고나이트 내층 배치로부터의 적당한 양의 분말을 충분한 양의 탈염수와 함께 규정된 양의 25% 시트르산(citric acid)이 첨가된 가수분해 반응기(hydrolysis reactor)로 주입되도록 하여 혼합하였다; 전체를 4 내지 5℃ 사이를 변동하는 온도에서 연속적으로 교반하면서 냉각시켰다. 본 발명자들은 pH 및 표면 장력(surface tension)을 낮추는 특성 때문에 시트르산의 사용을 선호하였다.
pH-미터(pH-meter)로 모니터링된 pH는 2.5N 소듐하이드록사이드(sodium hydroxide)를 첨가함으로써 pH4.5 이상으로 유지하여 생체고분자의 분해(degradation)를 방지하였다; 이후 가수 분해물(hydrolysate) 100 리터당 5N 소듐하이드록사이드 0.1 리터를 첨가하여 마지막 단계에서는 pH7로 되돌렸다.
일단 분말이 완전히 용해되면, 가수 분해물은 저장 탱크로 옮겨 계속적으로 교반하고, 이후 원심 분리기로 옮겨, 사이클론(cyclone)에서 18 내지 20,000G의 힘을 가하였다.
필요한 경우 비탁법(turbidimetry)으로 용액을 확인하고, 필요한 경우 시트르산으로 보정한 후, 온도를 4 내지 5℃로 유지하면서 조작을 반복하였다.
비탁법에 따른 결과에 따라, 가수 분해물을 다시 초원심분리할 수 있다.
초원심분리의 각 사이클(cycle)에서, 수집된 불용성 생체고분자의 잔여물을 세척하고 따로 보관하였다. 잔여물을 세척한 물은 옥살산(oxalic acid)을 처리하여 칼슘의 유무를 확인하였다.
따라서, 잔여물은 동결 건조(lyophilization), 또는 지오드레이션(Zeodration) 공법 (제올라이트를 사용한 수화(hydration))에 의해 건조된, 갈색을 띠는 젖은 케이크(cake)의 형태로 모든 불용성 생체고분자를 함유하여 초원심분리 제일 마지막에 수득되며, 처리 마지막에 본 발명자들은 원심력의 작용하에 단백질의 코일링(coiling)으로 인해, 2 내지 3㎜ 직경인 회색의 소구체(spherules)를 갖는다.
추출된 불용성 생체고분자를 5 마이크론 내지 100 나노미터의 무작위 입도분포를 갖는 분말이 수득될 때까지 예를 들어 유성형 밀(planetary mill)에서 분쇄하고, 체질(sieving) 후에 회수하였다.
Ⅱ.2 가용성 생체고분자의 추출 :
투과물(permeate) 및 세척수(wash water)는 접선 한외여과(tangential ultrafiltration) 장치, 예를 들어 1 kDa의 차단(cut-off) 지점을 갖는 카세트로 운반되어 탈염되었다.
2.0 mol/L의 충분한 양의 황산(sulphuric acid)을 투과물에 첨가하여 황산칼슘염(calcium sulphate salt)을 침전시킨다.
상기 용액을 여과하고, 투과물을 33℃ 비등점(boiling point)의 진공하에서 로타베이퍼®(Rotavapor®)로 농축시켜 결정(crystal) 형태의 시트르산을 제거하였다.
저분자량 단백질 뿐만 아니라 1가(mono-) 및 다가 이온(multivalent ion)을 함유하는 증류액을 얻었다.
상기 카세트의 차단(cut-off) 지점은 모든 단백질, 특히 초저분자량 단백질을 함유하지 않으므로, 상기 증류액은 역삼투(reverse osmosis)를 따른다.
상기 증류액을 40 내지 80 bar의 압력 구배의 영향하에서, 예를 들어 0.0001 마이크론의 기공 직경을 갖는 반-선택적(semi-selective) 멤브레인을 통한 투과에 의해 액상 분리(liquid-phase separation) 처리하고자 이동시켰다.
증류액은 철, 마그네슘, 아연 등과 같은 모든 1가 및 다가 이온을 함유하기 위해 통과된다.
역삼투 멤브레인 상에서 회수된 잔류액(retentate)을 수집하고 발열성 물(apyrogenic water)로 얻은 후, 진공하에서 예를 들어 로타베이퍼®(Rotavapor®)로 40℃ 온도에서 농축시킨 다음, 지오드레이션(Zeodration) 공법 또는 동결 건조(cryodessication)로 동결 건조시켰다.
매우 미세한 회백색(greyish-white) 분말이 수득되며, 이를 사용전까지 보관하고, 이후 예를 들어 유성형 밀(planetary mill)에서 분쇄하여 5 마이크론 내지 100 나노미터 범위의 무작위 입도분포를 갖는 분말을 체질(sieving) 후에 수득하였다.
투과물에 브래드포드 비색법(Bradford's colorimetric method)으로 처리되는 용액 앨리쿼트(aliquot)를 취하여 단백질 유무를 확인하였다.
Ⅱ.3 칼사이트 외층에서 생체고분자 추출을 위한 배치로부터 생체고분자 추출
또 다른 구체예에 따르면, 칼사이트 외층으로부터의 생체고분자 추출은 아라고나이트 내층으로부터의 생체고분자와 동일하게 수행된다.
Ⅲ. 탄산칼슘의 탄산염화작용 :
사방정계(orthorhombic system) 또는 능면체 결정계(rhombohedral system)에서 결정화된(crystallized) 탄산칼슘은 800 내지 1100℃의 열처리를 따른 경우에, 열분해(thermolysis) 및 산화(oxidation)에 의해 상당한 접착력 및 가소성(plasticity)이 나타나 쉽게 모델링 될 수 있는 새로운 성질이 생기는 것으로 알려져 있다. 이 현상은 다음과 같은 반응을 따르는 탄산염화작용(carbonation)이다 :
탄산칼슘(CaCO3) + 열처리 → 칼슘하이드록사이드(Ca(OH)2) + 이산화탄소(CO2) → 탄산칼슘(CaCO3) + 물(H2O)
상기 반응에서, 20 내지 40분 시간 동안 온도를 상승시키고 유지하는 동안, 상기 탄산칼슘은 화학적으로 변형되어 석회(lime)가 되고, 이후 CO2 및 주변 습기의 작용하에서 무정형(amorphous) 탄산칼슘이 된다. 이 화학적 변형은 주변(ambient) 습도측정(hygrometry)에 따라 며칠에 걸쳐 발생한다.
다른 구체예에 따르면, 탄산칼슘 이외의 모든 칼슘염(calcium salt)은 침전(precipitation) 화학 반응에 의해 탄산염화작용에 의해 변형될 수 있는 탄산칼슘을 생성시킬 수 있다. 따라서, 예를 들어, 수산화칼슘(calcium hydroxide), 아세트산 칼슘(calcium acetate), 옥살산 칼슘(calcium oxalate), 황산칼슘(calcium sulphate) 또는 시트르산 칼슘(calcium citrate)으로부터 탄산염화된 탄산칼슘을 수득하는 것이 가능하다; 이들 침전에 대한 공지된 화학 공정을 수행하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 있다.
상기 탄산칼슘은 또한 생체고분자 추출 후, 일반적으로 진주조개과, 구체적으로 백접패, 흑접패 및 트리다크나, 구체적으로 트리다크나 기가스, 트리다크나 맥시마, 트리다크나 데레사, 트리다크나 테보라, 트리다크나 스쿠아모사, 트리다크나 크로세아, 하이포퍼스 하이포퍼스, 하이포퍼스 포르세라너스와 같은 이매패류 껍데기의 아라고나이트 내층으로부터 유래된 것일 수 있다. 또한, 녹석(madrepore) 기원일 수 있다.
Ⅳ. 아라고나이트 혼합 배치, 추출된 불용성 및 가용성 생체고분자, 및 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘으로부터의 혼합물 제형
유기 분획물의 원하는 비율에 따라 결정된, 내부 아라고나이트 및 외부 칼사이트 2개의 배치로부터 추출된 불용성 및 가용성 생체고분자의 양, 및 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘의 결정된 양을 아라고나이트 혼합 배치의 규정된 양과 혼합하여 본 발명에 따른 생성물의 제형을 구성하였다.
균질한 분말이 수득될 때까지 혼합을 예를 들어, 나이프 혼합기(knife mixer)에서 수행한 다음, 이를 포장하였다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 물질 손실의 치유 및 재생을 위한 경우, 화상, 상처, 궤양 또는 홍반성 피부 병변 치료를 위한 경우 또는 장치 또는 성형된 임플란트 제조에 있어서, 임시 제형의 골 대체제로서의 본 발명에 따른 물질의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 분말 반합성 물질은 시간이 지나면서 시차를 둔 생체흡수(bioabsorption) 되는 봉합사(suture thread)를 포함하는 제어된 생체흡수성을 지닌 장치 또는 성형된 임플란트 제조에 사용될 수 있다.
또한, 임시 사용을 위한 골 대체제, 다공성 콜라겐 지지체가 있는 골 대체체, 동물 또는 인간 기원의 미네랄 구조가 있는 골 대체제, 생체흡수성 골접합술(osteosynthesis) 장치 및 성형된 임플란트, 제어된 생체흡수성을 지닌 장치, 관내인공삽입물(endoprostheses) 밀봉용 시멘트, 척추성형술(vertebroplasty), 경피적 척추후굴복원술(kyphoplasty) 및 골 종양 수술에서 최소침습수술(minimally invasive surgery)을 위한 주사용 시멘트에 대한 제제의 제형으로 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 생성물은 세균 및 바이러스 오염 제거, 임의의 색소(pigments) 제거, 및 면역원성(immunogenicity) 중화를 위한 기계적 및 열화학적(thermochemical) 처리를 한 목욕해면(Spongia officinalis)과 같은 다공성 콜라겐 지지체와 결합될 수 있다. 목욕해면은 콜라겐과 관련된 탄산염화된 경질단백질(scleroprotein)의 섬유로 전환되어 이루어지는 해면질로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다. 이 단백질은 용해도가 낮아 모든 조직, 결합조직(connective tissue), 힘줄(tendon), 골조직(bone tissues), 근섬유(muscle fiber), 피부, 모발 및 손톱을 보호 및 지지하는 역할을 한다. 해면질은 구조 및 저장 콜라겐 단백질이다 ; 이것은 불활성이고, 불수용성(water-insoluble)이며, 소수성이고 쉽게 변성되지 않는다. 이것은 골전도(osteoconduction)에 적합한 다공성 지지체를 구성한다. 따라서, 이는 골 대체제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 물질과 배합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 물질은 탈수 또는 반수화(hemi-hydrated)된 황산칼슘(calcium sulphate), 방해석(calcite), 무수 칼슘 하이드록시포스페이트(anhydrous calcium hydroxyphosphate), β-TCP, 및 수산화칼슘(calcium hydroxide)과 같은 칼슘염과 결합될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 물질은 동물 또는 인간 유래 골 조직의 미네랄 구조와 결합될 수 있다.
또한, 생체흡수성 고분자, 예컨대, 콜라겐, 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 전분(starch), 알지네이트(alginate), 또는 생체흡수성 합성 고분자, 예컨대, 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리(DL-락티드-co-글리콜리드) (poly(DL-lactide-co-glycolide)), 폴리(L-락티드) (poly(L-lactide)), 또는 아크릴 고분자(acrylic polymer), 예컨대, 폴리하이드록시에틸(polyhydroxyethyl), 메틸메타크릴레이트(methylmethacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 뿐만 아니라, 분말 형태의 약물(medicinal substances), 예컨대, 비-스테로이드성의 항-염증제(non-steroidal anti-inflammatory drugs), 항생제, 항암제(antimitotic) 또는 치료 목적을 가진 임의의 기타 물질과 결합될 수 있다.
본 발명자들은 메틸메타크릴레이트(methylmethacrylate) 밀봉 시멘트의 사용과 관련된 문제점을 고려하여, 본 발명에 따른 생성물로 제조된 밀봉 시멘트를 제안하는데, 이는 자연적으로 방사선 불투과성(radiopaque)을 지니고, 접착성이 있는 성질로 인해 관내인공삽입물(endoprosthesis)의 기계적인 초기 유지를 보이며, 신호 분자(signal molecule), 바이오미네랄화(biomineralization) 개시제의 존재에 의해 유도되는, 골모방(osteomimetic), 골유도(osteoinductive), 골전도(osteoconductive), 및 생리활성(bioactive) 특성으로 인하여 이차적으로 조직 통합을 이끌어낸다.
상기 신호 분자는 생체내 원위치(in situ)에서 바이오미네랄화(biomineralization)의 국부적 내인성 요소(local endogenous factor)를 자극하여, 화생골(metaplastic bone)의 형성을 유도한다.
또 다른 목적에 따르면, 본 발명은 칼슘염, 천연 또는 합성 고분자, 콜라겐, 및 동물 또는 인간 기원의 뼈 조직의 미네랄 구조를 포함하는 조성물에서 본 발명에 따른 물질에 사용되거나 전술한 방법의 단계 Ⅲ에 따라 제조된 탄산염화작용에 따른 탄산칼슘의 용도에 관한 것이다.
또한, 생체흡수성 고분자, 예컨대, 콜라겐, 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 전분(starch), 알지네이트(alginate), 또는 생체흡수성 합성 고분자, 예컨대, 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리(DL-락티드-co-글리콜리드) (poly(DL-lactide-co-glycolide)), 폴리(L-락티드) (poly(L-lactide)), 또는 아크릴 고분자(acrylic polymer), 예컨대, 폴리하이드록시에틸(polyhydroxyethyl), 메틸메타크릴레이트(methylmethacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 뿐만 아니라, 분말 형태의 약물(medicinal substances), 예컨대, 비-스테로이드성의 항-염증제(non-steroidal anti-inflammatory drugs), 항생제, 항암제(antimitotic) 또는 치료 목적을 가진 임의의 기타 물질과 결합될 수 있다.
아라고나이트 및 칼사이트 층의 유기 분획물에 함유된 상기 불용성 및 가용성 생체고분자는 골(bone) 및 연골(cartilage)과 같은 경조직(hard tissue), 및 피부, 근육 및 점막(mucosae)과 같은 연조직(soft tissue) 둘다의 치유 및 재생 특성을 갖는 것으로 알려져 있다. 비-콜라겐 생체고분자(non-collagen biopolymer) 중 일부, 특히 저분자량 당단백질(glycoprotein)은 BMP, TNFβ, EGPF, TGFβ, IGF, FGF 등과 같은 성장 인자(growth factors) 뿐만 아니라 염증 매개자(mediators)인 사이토카인과 연관될 수 있다.
또한, 본 발명은 칼슘염, 천연 또는 합성 고분자, 콜라겐, 동물 또는 인간 기원의 뼈 조직의 미네랄 구조를 포함하는 분말 조성물에 대한 첨가제로서, 본 발명에 따른 물질에 사용되거나 전술한 방법의 단계 Ⅱ에 의해 추출된 가용성 및 불용성 생체고분자의 용도에 관한 것이다. 이들은 또한 생체흡수성 고분자, 예컨대, 콜라겐, 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 전분(starch), 알지네이트(alginate), 또는 생체흡수성 합성 고분자, 예컨대, 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리(DL-락티드-co-글리콜리드) (poly(DL-lactide-co-glycolide)), 폴리(L-락티드) (poly(L-lactide)), 또는 아크릴 고분자(acrylic polymer), 예컨대, 폴리하이드록시에틸(polyhydroxyethyl), 메틸메타크릴레이트(methylmethacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 뿐만 아니라, 분말 형태의 약물(medicinal substances), 예컨대, 비-스테로이드성의 항-염증제(non-steroidal anti-inflammatory drugs), 항생제, 항암제(antimitotic) 또는 치료 목적을 가진 임의의 기타 물질과 결합될 수 있다. 또한 이들은 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘과 결합될 수 있다.
본 발명은 오로지 예시를 위해 제공된, 하기 실시예 및 첨부된 도면의 원조로 보다 상세히 기술될 것이다 :
도 1 및 도 2는 혼합물의 사진이다 :
- 전혈(whole blood)을 포함한 진주층 분말 및 탄산칼슘 (No. 1) 및
- 전혈을 포함한 진주층 분말 및 탄산염화작용에 따른 탄산칼슘 (No. 2)
전혈을 첨가한 후 각각 2분 및 15분에 촬영하였다.
실시예 :
본 발명에 따른 산물의 약리학적 성질을 확인하기 위해, 본 발명자들은 치료 목적을 지니는 제제를 제형화하여 임상 관찰 기록용으로 사용하였다.
실시예 1 :
본 발명에 따른 분말 반합성 물질은 다음과 같이 제조되었다 :
I. 성분의 제조 :
긁어서 착생생물(epibiont)을 제거한 후, 껍데기는 다음과 같이 처리되었다:
I.1) 껍데기의 오염 제거 :
껍데기를 2% 활성 염소의 차아염소산염(hypochlorite) 용액이 첨가된 주 급수(mains water)의 베스(bath)에 담궈 오염을 제거하였다.
I.2) 껍데기의 초음파 처리 :
껍데기를 세척한 후 55℃ 온도의 미생물학적으로 검사된 주 급수가 채워진 탱크에서 초음파로 처리하였으며, 여기에 세정액 및 소독액을 127 중량부(part)의 물에 대해 1 중량부의 희석 용액으로 첨가하였다. 처리 시간은 40 kHz의 주파수에서 30분간 하였다.
I.3) 껍데기의 세척 처리 및 건조 :
껍데기를 90℃ 온도의 탈염수(demineralized water) 베스에서 20분간 세척한 후 칼베늄®(Calbenium®)을 2%의 희석액으로 30분간 첨가하였다. 세척한 후 건조하였다.
I.4) 칼사이트 외층(calcitic outer layer)의 제거 :
껍데기의 칼사이트 외층은 미립자(fine-grain) 그라인딩 휠(grinding wheel)로 분쇄하여 제거하였다.
상기 생성물은 사용전까지 보관되었으며, "칼사이트 외층으로부터의 생체고분자의 추출용 배치(batch)"로 구성되었다.
I.5) 분쇄(grinding) 후 노출된 진주층 시험 동결 :
단계 I.4)에서 수득한 진주층 시험은 -18℃의 온도에서 120분 동안 동결하였다.
I.6) 진주층 시험 파쇄(crushing) 및 배치 회수 :
진주층 시험은 ESSA® 유형의 텅스텐 카바이드 턱(tungsten carbide jaws)을 가진 파쇄기(crusher)에서 흡입(aspiration)하면서 파쇄한 후, 나노 입자(nano-grain)를 포함하는 부유 입자(suspended particles)를 회수하였다.
파쇄 작업은 적어도 3회 반복하였으며 체질(sieving) 후 2개의 배치를 따로 보관하였다 :
- 20 마이크론(micron) 내지 50 나노미터(nanometre)의 무작위 입도분포를 가진 제1 배치는 하기에 "아라고나이트 혼합 배치(aragonite mixed batch)"로 지칭되었으며, 본 발명에 따른 생성물의 아라고나이트 혼합 부분으로 구성될 것이다. "아라고나이트 혼합 배치"는 두 가지 유기 및 무기 성분을 포함하는 분쇄 후 수득된 분말 형태를 의미한다.
- 250 내지 50 마이크론의 입도분포를 갖는 제2 배치는 불용성 및 수용성 생체고분자 추출을 위해 사용전까지 보관되었다. 이것을 "아라고나이트 내층으로부터의 생체고분자 추출용 배치"라고 지칭하였다.
수득된 분말의 입자 크기 및 범위는 레이저 입도 분석기(laser granulometer)를 사용하여 측정하였다.
I.7) 아라고나이트 혼합 배치의 구형화 :
상기 아라고나이트 혼합 배치는 구형화(spherification)에 의해 입자를 균일하게 하고자 기계적 처리를 하였으며, 이 목적은 마찰에 의해 입자의 모서리 및 가장자리를 둥글게 하는 것이다.
다양한 너비의 유리 블레이드(blade)를 가지는 수평 회전축이 있는 지르코늄(zirconium)으로 제조된 원통형 용기(cylindrical container)에 아라고나이트 혼합 배치로부터의 분말 물질 및 오토클레이브(autoclave)로 멸균한 경질 목재(hard wood), 예를 들어, 떡갈나무(oak) 5㎟ 칩의 동일 중량부(parts) 혼합물을 넣었다.
상기 용기는 처리된 생성물의 양 및 용기 크기에 따라 다양한 시간 및 다양한 속도로 회전시켰다.
구형화 처리가 끝나면, 아라고나이트 혼합 배치 및 칩 혼합물 전체를 15분 동안 연속적으로 교반하면서 충분한 양의 물이 채워진 불활성 용기에서 회수하였다. 30분 동안 방치한 후, 표면에 떠있는 나무 칩을 흡입(suction)하여 제거하였다.
이후, 상기 용액을 20 마이크론의 직경을 갖는 메쉬(mesh)가 있는 나일론 필터로 여과하였으며, 잔여물(residue)은 40℃의 로타베이퍼®(Rotavapor®)로 건조시키고 포장하였다.
Ⅱ. 생체고분자의 추출
Ⅱ.1 불용성 생체고분자의 추출 :
생체고분자 추출을 위한 아라고나이트 내층 배치로부터의 적당한 양의 분말을 충분한 양의 탈염수가 있는 구역 I의 공급 탱크에 흡입하고, 규정된 양의 25% 시트르산(citric acid)이 첨가된 구역 Ⅱ의 가수분해 반응기(hydrolysis reactor)로 주입되도록 하여 혼합하였다; 전체를 4 내지 5℃ 사이를 변동하는 온도에서 연속적으로 교반하면서 냉각시켰다. pH-미터(pH-meter)로 모니터링된 pH는 2.5N 소듐하이드록사이드(sodium hydroxide)를 첨가함으로써 pH4.5 이상으로 유지하여 생체고분자의 분해(degradation)를 방지하였다; 이후 가수 분해물(hydrolysate) 100 리터당 5N 소듐하이드록사이드 0.1 리터를 첨가하여 마지막 단계에서는 pH7로 되돌렸다.
일단 분말이 완전히 용해되면, 가수 분해물은 저장 탱크로 옮겨 계속적으로 교반하고, 이후 원심 분리기로 옮겨, 사이클론(cyclone)에서 18 내지 20,000G의 힘을 가하였다.
필요한 경우 비탁법(turbidimetry)으로 용액을 확인하고, 필요한 경우 시트르산으로 보정한 후, 온도를 4 내지 5℃로 유지하면서 조작을 반복하였다.
비탁법에 의해 제공된 결과에 따라, 가수 분해물을 다시 초원심분리 하였다.
초원심분리의 각 사이클(cycle)에서, 수집된 불용성 생체고분자의 잔여물을 세척하고 따로 보관하였다. 잔여물을 세척한 물은 옥살산(oxalic acid)을 처리하여 칼슘의 유무를 확인하였다.
따라서, 잔여물은 동결 건조(lyophilization)에 의해 건조된, 갈색을 띠는 젖은 케이크(cake)의 형태로 모든 불용성 생체고분자를 함유하여 초원심분리 제일 마지막에 수득되며, 처리 마지막에 본 발명자들은 원심력의 작용하에 단백질의 코일링(coiling)으로 인해, 2 내지 3㎜ 직경인 회색의 소구체(spherules)를 갖는다.
추출된 불용성 생체고분자를 5 마이크론 내지 100 나노미터의 무작위 입도분포를 갖는 분말이 수득될 때까지 유성형 밀(planetary mill)에서 분쇄하고, 체질(sieving) 후에 회수하였다.
Ⅱ.2 가용성 생체고분자의 추출 :
투과물(permeate) 및 세척수(wash water)는 15㎥의 표면적을 제공하도록 직렬로 설치된 각 1 kDa의 접선 한외여과(tangential ultrafiltration) 카세트(cassette) 조립용 장치인 밀리포어®(Millipore®)에 5 bar의 압력과 시간당 10 내지 15 리터의 유속으로 운반되어 40℃의 온도에서 탈염되었다.
2.0 mol/L의 충분한 양의 황산(sulphuric acid)을 투과물에 첨가하여 황산칼슘염(calcium sulphate salt)을 침전시킨다.
상기 용액을 여과하고, 투과물을 33℃ 비등점(boiling point)의 진공하에서 로타베이퍼®(Rotavapor®)로 농축시켜 결정(crystal) 형태의 시트르산을 제거하였다.
저분자량 단백질 뿐만 아니라 1가(mono-) 및 다가 이온(multivalent ion)을 함유하는 증류액을 얻었다.
상기 카세트의 차단(cut-off) 지점은 모든 단백질, 특히 초저분자량 단백질을 함유하지 않으므로, 상기 증류액은 역삼투(reverse osmosis)를 따른다.
그 다음, 상기 증류액을 40 내지 80 bar의 압력 구배의 영향하에서, 0.0001 마이크론의 멤브레인 기공 직경을 갖는 반-선택적(semi-selective) 멤브레인을 통한 투과에 의해 액상 분리(liquid-phase separation) 처리하고자 이동시켰다.
증류액은 철, 마그네슘, 아연 등과 같은 모든 1가 및 다가 이온을 함유하기 위해 통과된다.
역삼투 멤브레인 상에서 회수된 잔류액(retentate)을 수집하고 발열성 물(apyrogenic water)로 얻은 후, 진공하에서 로타베이퍼®(Rotavapor®)로 40℃ 온도에서 농축시킨 다음, 지오드레이션(Zeodration) 공법으로 동결 건조시켰다.
매우 미세한 회백색(greyish-white) 분말이 수득되며, 이를 사용전까지 보관하고, 이후 유성형 밀(planetary mill)에서 분쇄하여 5 마이크론 내지 100 나노미터 범위의 무작위 입도분포를 갖는 분말을 체질(sieving) 후에 수득하였다.
투과물의 단백질 유무는 브래드포드 비색법(Bradford's colorimetric method)으로 처리되는 용액 앨리쿼트(aliquot)를 취하여 확인하였다.
Ⅲ. 탄산칼슘의 탄산염화작용 :
상기 생체고분자 추출 후 회수한 탄산칼슘을 800 내지 1100℃에서 20 내지 40분간 열처리를 지속하였으며, 이후 대기 중에서 천천히 냉각시켰다. 이 현상은 다음과 같은 반응을 따르는 탄산염화작용(carbonation)이다 :
탄산칼슘(CaCO3) + 열처리 → 칼슘하이드록사이드(Ca(OH)2) + 이산화탄소(CO2) → 탄산칼슘(CaCO3) + 물(H2O)
상기 반응에서, 탄산칼슘은 화학적으로 변형되어 석회(lime)가 되고, 이후 이산화탄소 및 습도의 작용에 의해 다시 무정형(amorphous) 탄산칼슘이 된다. 이 화학적 변형은 주변(ambient) 습도측정(hygrometry)에 따라 며칠에 걸쳐 발생한다.
Ⅳ. 아라고나이트 혼합 배치, 추출된 불용성 및 가용성 생체고분자, 및 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘으로부터의 혼합물 제형
생체고분자를 추출하는 동안, 사용된 껍데기의 아라고나이트 내층 및 칼사이트 외층에서 2.6% 내지 4.3%로 나타낸 불용성 생체고분자의 비율 및 0.4% 내지 0.7%로 나타낸 가용성 생체고분자의 비율이 입증되었다.
본 발명에 따른 물질은 아라고나이트 혼합 배치, 단계 Ⅱ.1에서 수득한 불용성 고분자, 단계 Ⅱ.2에서 수득한 가용성 고분자 및 상기 단계 Ⅲ에서 수득한 탄산염화작용에 따른 탄산칼슘을 혼합하여 제조하였다. 각 성분의 구체적인 양은 하기 실시예 각각에 명시되어 있다.
균질한 분말이 수득될 때까지 혼합을 나이프 혼합기(knife mixer)에서 수행한 다음, 이를 포장하였다.
실시예 2 :
하기에 기술된 바와 같이 가교결합(crosslinking) 단계가 단계 I.3의 마지막에 추가된다는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 절차를 따른다.
10% 리보플라빈(riboflavin)이 첨가된 주 급수의 혼합물을 반투명 유리 또는 플라스틱 용기에 준비하였다; 전체는 20℃ 이상의 온도로 유지되며, 혼합물의 교반은 UVA 방사선에 대해 수직적인 유동을 생성한다.
상기 껍데기를 그 내부에 수직적으로 배치하였으며, 2300 마이크로줄(microjoule)/㎠의 세기(intensity)로 180분 동안 365 나노미터/초(second)의 파장을 갖는 UVA 램프로 양면에 방사선을 조사하였다. 전체는 처리 기간 동안 진공 상태로 유지되었다.
상기 껍데기를 세척한 후, 40℃의 고온 공기류로 건조시켰다.
실시예 3 :
탄산염화된 탄산칼슘의 점착성(adhesiveness) 및 응집력(cohesion) 특성은 다음과 같이 입증되었다:
실시예 1의 절차의 단계 I.7의 마지막에 수득한 1g의 분말화된 진주층을 각각 함유하는 Dappen No. 1 및 No. 2로 각각 지정된 2개의 다펜 컵(Dappen cup)에 다음을 첨가하였다 :
- 천연 탄산칼슘 (Dappen No. 1) 0.1g,
- 실시예 1의 절차의 단계 Ⅲ에서 수득한 탄산염화작용에 따른 천연 탄산칼슘 (Dappen No. 2) 0.1g.
혼합 후, 각 다펜 컵(Dappen cup)의 내용물을 2cc의 전혈(whole blood)과 혼합하였다.
각각의 다펜 컵(Dappen cup) 사진은 전혈과 혼합한 후 2분 (도 1) 및 15분 (도 2)에 촬영되었다.
도 1(1)에 도시된 바와 같이, Dappen No. 1의 혼합물은 적색 분말의 형태로 남아 있다; 응고물(coagulum)이 형성되지 않았다. 15분 후, 응고물이 형성되지 않았다 (도 2(1)).
도 1(2)에 도시된 바와 같이, Dappen No. 2의 혼합물은 응고물을 빠르게 형성하고 점차적으로 적색에서 갈색으로 변색되며, 케이크(cake) 형태가 되고, 모델링이 가능하며, 15분 후에 끈적거리며 경화되었다(도 2(2)).
실시예 4 : 임시의 골 대체제용 제형
치명적인 임상 사례는 골접합술(osteosynthesis)로 치료받은 1년생 암망아지 관골(cannon bone)의 비스듬한 골절이었다. 4개의 나사 골절, 작은 파편이 있는 분쇄된 2차 골절에 따른 패혈증을 동반한 가관절증(pseudarthrosis)으로 인한 골접합술 실패 후, 유일한 대안으로 동물의 안락사를 남겨두었으며, 본 발명에 따른 물질을 하기 제형으로 사용하기로 결정하였다:
· 실시예 1의 단계 I.8에서 생성된, 50 나노미터 내지 20 마이크론의 입도분포를 갖는 아라고나이트 혼합 배치 40g;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.2에서 수득한 불용성의 추출된 생체고분자 0.070g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.1에서 수득한 가용성의 추출된 생체고분자 0.010g ;
· 실시예 1의 절차의 단계 Ⅲ에서 생성된 탄산염화된 탄산칼슘 2g ;
· 뼈 부골편(sequestra) 제거 후 물질 손실의 위치에 길이 10㎝ 및 직경 2㎝인 실린더(cylinder) 형태로 모델링되는 응고물을 형성하는 자가 유래 정맥혈 10㎖.
압박붕대로 보호된 사지(limb)에 석고를 발랐다. 수술 후 방사선 촬영(radiography)은 본 발명에 따른 골 대체제의 존재 및 부착(adhesion)을 나타내었으며, 응고화(consolidation) 4개월 후에, 암망아지는 질주하고 장애물을 점프할 수 있었다. 후에 X-선(X-ray)은 수강(medullary canal)의 재건을 통한 골간(bone shaft)의 완전한 복원을 나타내었다.
또한, 동일한 제형을 실온에서 2.5㎖의 주사용 증류수(WFI)를 사용하여 임시 응고물을 제조하여 사용하였다.
실시예 5 : 피부 치유 크림의 제형
본 발명에 따른 생성물의 제제는 하기 퍼센티지(percentage) 제형으로 제조되었다 :
· 실시예 2에 따라 수득된 50 나노미터 내지 20 마이크론의 입도분포를 갖는 아라고나이트 혼합 배치 10g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.2에서 수득한 불용성의 추출된 생체고분자 0.035g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.1에서 수득한 가용성의 추출된 생체고분자 0.005g ;
· 탄산염화된 탄산칼슘 0.5g ;
· 100㎖에 대해, 에센션 오일 함유 복합체 15방울 :
라벤더 스파이크(Lavandula spica) : 1㎖
살비아 오피시날리스(Salvia officinalis) : 2㎖
로사 루비기노사(Rosa rubiginosa) : 10㎖
헬리크리섬 이타리쿰(Helichrysum italicum) : 1.5㎖
밀배아 식물성 오일(Wheatgerm vegetable oil) : 50㎖
달맞이꽃 오일(Evening primrose oil) : 10㎖
스위트 아몬드 오일(Sweet almond oil) : 20㎖
수중 유형 에멀젼(oil in water(O/W) Emulsion), q.s. 100g
상기 제제는 높이 32㎝, 너비 18㎝로 말 흉골(sternal)의 플래스트런(plastron), 목의 기저부에서 뒷무릎 관절까지의 피부 괴사(cutaneous necrosis)에 적용되었다. 임상 관찰은 28일만에 외피가 완전히 치유되면서, 다양한 건막(aponeurotic), 피하(subcutaneous) 및 피부면(cutaneous planes)의 복원, 및 변색 없이 모발의 동시 재성장과 함께 높이 및 너비에서 하루 당 1cm의 탁월한 치유를 나타내었다.
실시예 6 : 건선 치료용 피부학적 제제의 제형
잘 알려진 바와 같이, 건선(psoriasis)은 아포토시스(apoptosis) 없이 가속화된 세포 재생을 특징으로 하는 피부의 염증성 질환으로, 플라그(plaque)로서 두꺼운 크러스트(crust)의 형성을 초래한다. 코르티코스테로이드(corticosteroid) 요법과 콜타르(coal tar) 및 푸바 요법(PUVA(psoralen ultraviolet A) therapy)에 근거한 국소 치료법을 제외하고는, 결과가 가변적이고 실망스러우며, 환자에게 위험한 부작용이 있는 더 과격한 치료법이 있다.
본 발명에 따른 생성물의 제제는 하기 퍼센티지(percentage) 제형에 따라 제조되었다 :
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.2에서 수득한 불용성의 추출된 생체고분자 3g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.1에서 수득한 가용성의 추출된 생체고분자 0.45g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅲ에서 수득한 탄산염화된 탄산칼슘 0.5g ;
· 100㎖ 대해, 에센션 오일 함유 복합체 10방울 :
라벤더 스파이크(Lavandula spica) : 1㎖
살비아 오피시날리스(Salvia officinalis) : 2㎖
로사 루비기노사(Rosa rubiginosa) : 10㎖
헬리크리섬 이타리쿰(Helichrysum italicum) : 1.5㎖
밀배아 식물성 오일(Wheatgerm vegetable oil) : 50㎖
달맞이꽃 오일(Evening primrose oil) : 10㎖
스위트 아몬드 오일(Sweet almond oil) : 20㎖
수중 유형 에멀젼(oil in water(O/W) Emulsion), q.s. 100g
상기 에멀젼은 몸통, 등, 팔 및 다리 수준에서 심한 건선의 병변에 매일 적용되었다. 세 번째 적용 후, 염증 현상의 완화, 피부 각질(skin flakes), 그리고 가려움증 및 중첩 감염(superimposed infection)의 완화를 나타내는 외관상 현저한 개선이 있는 홍조의 소실이 관찰되었다. 임상 징후의 개선은 불용성 및 가용성 생체고분자의 부영양적(eutrophic), 소염(antiphlogistic), 및 재생(regenerative) 특성을 반영한다.
실시예 7 : 화상용 피부 드레싱의 제형
실시예 1의 단계 Ⅱ에 따라 추출된 불용성 및 가용성 생체고분자의 연조직(soft tissue) 재생의 예외적인 특성은 각질 형성 세포(keratinocyte) 이식 실패 후 심각한 2도 및 3도 화상의 경우에 하기의 제형으로 입증되었다 :
100g에 대해 :
· 실시예 2에 따라 수득된 50 나노미터 내지 20 마이크론의 입도분포를 갖는 아라고나이트 혼합 배치 50g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.2에서 수득한 불용성의 추출된 생체고분자 0.174g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.1에서 수득한 가용성의 추출된 생체고분자 0.026g ;
· 체리라우렐수(Cherry laurel water)를 포함한 갈렌의 왁스(Galen's Wax)
상기 제제는 밀봉드레싱(occlusive dressing) 하에 모든 화상 부위에 적용되었으며, 매 72시간 마다 반복하여 적용하였다.
반복적인 임상 시험에서 삼출 현상(exudative phenomenon)의 완화, 현저한 신생혈관 생성(angiogenesis), 통증 완화, 혈액 침윤 부위의 재-상피화(re-epithelialization) 및 섬유 조직 형성 장력(fibroplastic strain)의 현저한 감소를 나타내었다.
실시예 8 : 생체흡수성의 성형된 골 대체제용 제형
본 발명에 따른 물질은 생체흡수성 골접합술(osteosynthesis) 장치 및 성형된 임플란트(implants)를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따라, 100g에 대해 하기를 준비하였다:
· 실시예 1의 단계 I.8에서 수득한 50 나노미터 내지 20 마이크론의 입도분포를 갖는 아라고나이트 혼합 배치 80g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.2에서 수득한 불용성의 추출된 생체고분자 0.139g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.1에서 수득한 가용성의 추출된 생체고분자 0.021g ;
· 마크로골 400(macrogol 400) 20g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅲ에서 수득한 탄산염화된 탄산칼슘 4g ;
사출 성형(extrudable) 및 성형 가능한(mouldable) 균일한 가소성이 있는 페이스트(paste)가 수득될 때까지 상기 전체를 실온에서 10분 동안 혼합기(mixer)에서 혼합하였다.
골접합술(osteosynthesis) 장치 및/또는 임플란트의 삽입을 위한 가능한 영역의 구조에 대한 적절한 형태의 몰드 캐비티(mould cavities)는 디지털 모델링(digital modelling)에 의해 생성되었다.
상기에서 수득한 충분한 양의 페이스트를 하나 이상의 몰드 캐비티를 포함하는 몰드의 압축 챔버 내로 주입하였다.
이후, 전체를 100 내지 220 N으로 점차 증가하는 압력하에서 압축하였다; 상기 압력은 가변 시간 동안 유지되고, 서서히 0으로 감소한다.
몰드에서 일단 제거하여 40℃에서 건조시키고 이중 포장으로 포장한 장치는 25 kGy에서 이온화 방사선(ionizing radiation)으로 멸균하였다.
실시예 9 : 제어된 생체흡수성을 지닌 골 대체제용 제제
신혈관 형성(neovascularization) 및 뼈 리모델링에 관여하는 세포에 의한 콜로니화(colonization)를 가능하게 하기 위해, 골 대체제 또는 생체흡수성을 지닌 장치의 생체흡수는 5 내지 100 마이크론으로 변화되어야 하는 상호연결된 기공 직경과 직접적으로 연관된다는 것이 밝혀졌다.
이는 본 발명자들이 상호연결된 다공성(porosity)이 제어된 골 대체제 또는 성형된 임플란트 제조를 제안한 이유이다.
이 목적을 위해, 100g에 대해 하기 제제를 제조하였다.
· 실시예 2에서 수득한 50 나노미터 내지 20 마이크론의 입도분포를 갖는 아라고나이트 혼합 배치 80g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.2에서 수득한 불용성의 추출된 생체고분자 0.139g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.1에서 수득한 가용성의 추출된 생체고분자 0.021g ;
· 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(hydroxypropyl methylcellulose (HPMC)) 50% 용액 20㎖ ;
· 5/0 내지 12/0 범위의 직경을 갖는 20㎣ 가닥의 흡수성 합성 모노-필라멘트(mono-filament) 봉합사(suture thread) 길이 5㎜.
이러한 흡수성 실(thread)은 글리콜산(glycolic acid), 글리콜릭 코폴리머(glycolic copolymer), ε-카프로락톤 폴리글락틴(ε-caprolactone polyglactin)(바이크릴 레피드(vicryl rapide) 또는 조사된(irradiated)), 키토산(chitosan)과 같은 고분자이다. 이러한 실은 12 내지 90일의 시차를 두고 흡수된다.
이전 실시예에서와 같이, 상기 페이스트는 몰드 캐비티에 주입된 다음 압축되었다. 상기 장치 또는 임플란트를 몰드에서 제거하여 건조시킨 후, 이중 포장으로 포장하고 전술한 바와 같이 25 kGy에서 멸균하였다.
실시예 10 : 주사 가능한 골 대체제 및 관내인공삽입물( endoprosthesis ) 밀봉 시멘트용 제제
시멘트는 100g에 대해 하기 조성물로 제조되었다 :
· 본 발명에 따른 물질 80g은 다음으로 구성된다 :
· 단계 I.8에서 수득한 50 나노미터 내지 20 마이크론의 입도분포를 갖는 아라고나이트 혼합 배치 73g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.2에서 수득한 불용성의 추출된 생체고분자 2.702g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.1에서 수득한 가용성의 추출된 생체고분자 0.405g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅲ에서 생성된 탄산염화된 탄산칼슘 3.699g ;
· 50%의 고-점성(high-viscosity) 수용액(aqueous solution) HPMC 20g.
이와 같이 수득한 생성물을 직선(straight) 또는 각진(angled) 팁(tip)을 사용하여, 예를 들어 0.5㎤ 내지 1㎤의 가변 용량(variable capacity)의 주사기로 진공하에서 또는 제어된 대기(atmosphere) 하에서 포장하고, 약 4℃의 저온에서 저장하였다.
밀봉 시멘트로도 사용할 수 있는 상기 제제는, 예를 들어 수강(medullary cavity) 내 인공삽입물(prosthesis)의 끝(tail)을 밀봉하는 동안, 밀봉 생성물이 순환계(circulatory system)로 통과하는 것을 피할 수 있게 한다.
또한, 상기 조성물로 인한, 폐기관계(pulmonary system)에 영향을 줄 수 있는 위험 요소인 휘발성 물질의 방출은 일어나지 않는다.
이러한 조성물은 또한 최소침습수술(minimally invasive surgery)에서 척추성형술(vertebroplasty) 및 척추후굴복원술(kyphoplasty)을 위해 제안된다.
실시예 11 : 콜라겐 지지체를 포함한 골 대체제용 제제
골 대체제는 하기 조성물로 제조되었다 :
100g에 대한 제제 :
· 실시예 1의 단계 I.8에서 수득한 50 나노미터 내지 20 마이크론의 입도분포를 갖는 아라고나이트 혼합 배치 50g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.2에서 수득한 불용성의 추출된 생체고분자 0.087g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.1에서 수득한 가용성의 추출된 생체고분자 0.013g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅲ에서 수득한 탄산염화된 탄산칼슘 2.5g ;
· 마크로골 400(macrogol 400) 50g.
상기 전체는 약 10 Pa-s의 점도를 갖는 겔(gel)이 수득될 때까지 혼합되었다.
2㎜ 크기의 단편으로 환원된 목욕해면(Spongia officinalis) 30g을 상기 겔에 첨가하였다.
상기 전체는 약 108 Pa-s의 점도를 갖는 균일한 페이스트가 수득될 때까지 혼합되었다. 상기 전체는 골접합술 장치 또는 임플란트용 몰드 캐비티를 포함하는 몰드로 주입되었다. 몰드를 제거한 후, 장치 또는 임플란트를 40℃의 고온 기류하에서 건조시키고 이중 포장으로 포장하였으며, 통용되는 프로토콜(protocol)에 따라 멸균하였다.
실시예 12 : 골 대체제용 제제
또 다른 구체예에 따르면, 아라고나이트 분획물 단독 및/또는 칼사이트 분획물로부터 추출된 생체고분자를 특정 성질, 특히 그들이 가지고 있지 않은 골유도(osteoinductive) 또는 골모방(osteomimetic) 성질을 최적화하거나 유도하기 위해, 합성 또는 천연 기원의 임의의 다른 생체재료에 첨가할 수 있다.
따라서, 특정 칼슘염과 같은 골유도 대체제는, 100g에 대한 제형에 따라 아라고나이트 층으로부터 추출된 생체고분자를 보충하였다 :
· 50 내지 250 마이크론 범위의 입도분포를 갖는, βTCP 과립 95g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.2에서 수득한 불용성의 추출된 생체고분자 4.4g ;
· 실시예 1의 단계 Ⅱ.1에서 수득한 가용성의 추출된 생체고분자 0.6g.
자가 혈액(autologous blood)과 혼합된 상기 제제는, 상악 중절치(upper central incisor) 정점(apex)의 낭종(cyst) 제거술(exeresis)에 의해 생성된 골 결함(bone defect)에 삽입되었다.
동시에, βTCP 단독은 상악 송곳니의 치근단 육아종(periapical granuloma) 제거술에 의해 생성된 물질 손실에 압축되었다.
2주에 수행된 방사선 검사는 골전도(osteoconduction)만을 나타낸, βTCP의 과립이 뚜렷하게 보이는 제2 캐비티(cavity)에서 보다 βTCP와 불용성 및 가용성의 추출된 생체고분자 혼합물을 처리한 낭종(cyst) 캐비티에서 더 크고 빠른 골 고밀도화(densification)를 보였는데, 이는 낭종 캐비티에서 골유도(osteoinduction)와 골전도(osteoconduction)가 동시에 일어나고, βTCP가 새로운 특성을 획득한 것을 나타낸다.

Claims (17)

  1. 탄산염화작용(carbonation)에 의해 변형된 탄산칼슘(calcium carbonate) 및 불용성 및 가용성 생체고분자(biopolymer)를 첨가한 천연 해양 생체재료(biomaterials)로부터 유래된 분말(pulverulent) 반합성(semisynthetic) 물질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 천연 해양 생체재료는 진주조개과(Pinctadae), 구체적으로 백접패(Pinctada maxima), 흑접패(Pinctada margaritifera) 및 트리다크나(Tridacna), 구체적으로 트리다크나 기가스(Tridacna gigas), 트리다크나 맥시마(Tridacna maxima), 트리다크나 데레사(Tridacna derasa), 트리다크나 테보라(Tridacna tevoroa), 트리다크나 스쿠아모사(Tridacna squamosa), 트리다크나 크로세아(Tridacna crocea), 하이포퍼스 하이포퍼스(Hippopus hippopus), 하이포퍼스 포르세라너스(Hippopus porcellanus)를 포함하는 군으로부터 선택되는 이매패류(bivalve molluscs) 껍데기(shell)의 아라고나이트 내층(aragonitic inner layer)인 것을 특징으로 하고, 상기 아라고나이트 층(aragonitic layer)은 분말 형태인 것인, 반합성 물질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분말 형태인 상기 천연 생체 재료는 5㎚ 내지 100㎛, 바람직하게는 20㎚ 내지 50㎛, 더욱 바람직하게는 50㎚ 내지 20㎛의 입도분포(granulometry)를 갖는 것을 특징으로 하는, 반합성 물질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불용성 및 가용성 생체고분자는 진주조개과(Pinctadae), 구체적으로 백접패(Pinctada maxima), 흑접패(Pinctada margaritifera) 및 트리다크나(Tridacna), 구체적으로 트리다크나 기가스(Tridacna gigas), 트리다크나 맥시마(Tridacna maxima), 트리다크나 데레사(Tridacna derasa), 트리다크나 테보라(Tridacna tevoroa), 트리다크나 스쿠아모사(Tridacna squamosa), 트리다크나 크로세아(Tridacna crocea), 하이포퍼스 하이포퍼스(Hippopus hippopus), 하이포퍼스 포르세라너스(Hippopus porcellanus)를 포함하는 군으로부터 선택되는 이매패류(bivalve molluscs) 껍데기의 아라고나이트 내층(aragonitic inner layer) 및/또는 칼사이트 외층(calcitic outer layer)으로부터 추출되는 것을 특징으로 하는, 반합성 물질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘은 천연 육생(natural terrestrial), 천연 해양(natural marine) 또는 침강성 탄산칼슘(precipitated calcium carbonate) 유래 또는 아라고나이트 층(aragonitic layer) 추출 후의 불용성 및 가용성 생체고분자의 무기 분획물로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 반합성 물질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생체흡수성(bioabsorbable)인 것을 특징으로 하는, 반합성 물질.
  7. 진주조개과(Pinctadae), 구체적으로 백접패(Pinctada maxima), 흑접패(Pinctada margaritifera) 및 트리다크나(Tridacna), 구체적으로 트리다크나 기가스(Tridacna gigas), 트리다크나 맥시마(Tridacna maxima), 트리다크나 데레사(Tridacna derasa), 트리다크나 테보라(Tridacna tevoroa), 트리다크나 스쿠아모사(Tridacna squamosa), 트리다크나 크로세아(Tridacna crocea), 하이포퍼스 하이포퍼스(Hippopus hippopus), 하이포퍼스 포르세라너스(Hippopus porcellanus)를 포함하는 군으로부터 선택되는 이매패류(bivalve molluscs) 껍데기의 아라고나이트 내층 및/또는 칼사이트 외층으로부터 추출된 불용성 및 가용성 고분자인 분쇄 천연 생체재료, 및 탄산염화작용에 의해 변형된 탄산칼슘을 혼합한 것을 포함하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 반합성 물질의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 분쇄 천연 생체재료는 진주조개과(Pinctadae), 구체적으로 백접패(Pinctada maxima), 흑접패(Pinctada margaritifera) 및 트리다크나(Tridacna), 구체적으로 트리다크나 기가스(Tridacna gigas), 트리다크나 맥시마(Tridacna maxima), 트리다크나 데레사(Tridacna derasa), 트리다크나 테보라(Tridacna tevoroa), 트리다크나 스쿠아모사(Tridacna squamosa), 트리다크나 크로세아(Tridacna crocea), 하이포퍼스 하이포퍼스(Hippopus hippopus), 하이포퍼스 포르세라너스(Hippopus porcellanus)를 포함하는 군으로부터 선택되는 이매패류(bivalve molluscs) 껍데기의 아라고나이트 내층을 분쇄하여 수득하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 분쇄(grinding) 후 구형화(spherification) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불용성 및 가용성 생체고분자는 가수분해(hydrolysis) 후 역삼투(reverse osmosis)와 결합된 접선 한외여과(tangential ultrafiltration) 및 초원심분리(supercentrifugation)에 의해 각각 추출되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 연체동물(molluscs) 껍데기의 아라고나이트 내층(aragonitic inner layer) 및/또는 칼사이트 외층(calcitic outer layer)은 추출 전에 가교결합된(crosslinked) 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 연체동물(molluscs) 껍데기의 아라고나이트 내층 및/또는 칼사이트 외층은 추출 전에 250㎛ 내지 50㎛의 입도분포(granulometry)로 분쇄 및 체질된(sieved) 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  13. 물질 손실의 치유 및 재생을 위해, 화상, 상처, 궤양 또는 홍반성 피부 병변 치료를 위해 또는 장치 또는 성형된 임플란트 제조에 있어서, 임시 제형의 골 대체제로서의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 분말 반합성 물질, 또는 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 물질의 용도.
  14. 시간이 지나면서 시차를 둔 생체흡수(bioabsorption) 되는 봉합사(suture thread)를 포함하는 제어된 생체흡수성을 지닌 장치 또는 성형된 임플란트 제조에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 분말 반합성 물질, 또는 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 물질의 용도.
  15. 임시 사용을 위한 골 대체제, 사출 성형 가능한(extrudable) 골 대체제에 대한 제제의 제형, 구체적으로, 진공 상태의 주사기에 포장된, 다공성 콜라겐 지지체가 있는 골 대체체, 동물 또는 인간 기원의 미네랄 구조가 있는 골 대체제, 생체흡수성 골접합술(osteosynthesis) 장치 및 성형된 임플란트, 제어된 생체흡수성을 지닌 장치, 관내인공삽입물(endoprostheses) 밀봉용 시멘트, 및 척추성형술(vertebroplasty) 및 경피적 척추후굴복원술(kyphoplasty)에서 최소침습수술(minimally invasive surgery)을 위한 주사용 시멘트에 대한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 분말 반합성 물질, 또는 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 물질의 용도.
  16. 칼슘염, 천연 또는 합성 고분자, 콜라겐, 및 동물 또는 인간 기원의 뼈 조직의 미네랄 구조를 포함하는 조성물에서 가소성이 있고, 모델링가능(modellable) 하고, 접착성이 있는 첨가제로서의, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 물질에 사용된 탄산염화작용으로 처리된 탄산칼슘의 용도.
  17. 칼슘염, 천연 또는 합성 고분자, 콜라겐, 및 동물 또는 인간 기원의 뼈 조직의 미네랄 구조를 포함하는 분말 조성물에서 첨가제로서의, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 물질에 사용된 불용성 및 가용성의 추출된 생체고분자의 용도.
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