CN100438930C

CN100438930C - 骨修复中用珍珠活性物质代替骨生长因子的受控释放方法

Info

Publication number: CN100438930C
Application number: CNB2006101144142A
Authority: CN
Inventors: 朱静; 申玉田; 凌涛; 阮华君
Original assignee: ZHEJIANG CHANGSHENGNIAO PHARMACEUTICAL CO Ltd; Tsinghua University
Current assignee: ZHEJIANG CHANGSHENGNIAO PHARMACEUTICAL CO Ltd; Tsinghua University
Priority date: 2006-11-09
Filing date: 2006-11-09
Publication date: 2008-12-03
Anticipated expiration: 2026-11-09
Also published as: CN1943802A

Abstract

本发明公开了属于生物医用材料技术领域，特别涉及一种骨修复中用珍珠活性物质代替骨生长因子的受控释放方法。利用骨材料内所含有的纯珍珠活性物质提取物和不同粒度与含量的珍珠粉在人体内的溶解速度不同，使其在骨修复的不同阶段先后降解：在初期作为骨修复的启动因子和加速剂，快速激活成骨机制；随后，珍珠粉开始溶解，但是小颗粒珍珠粉溶解快，先消耗掉，而大颗粒珍珠粉溶解慢，后消耗掉，这样，不同粒度的珍珠粉混合物在骨修复的不同阶段先后降解，从而在骨修复过程中可以连续不断的释放珍珠活性物质，并可以通过对珍珠活性物质提取物与珍珠粉含量和粒度的调控实现受控释放。本发明筛分分装的珍珠粉及其组合物生产工艺简单，利于规模化。

Description

骨修复中用珍珠活性物质代替骨生长因子的受控释放方法

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，特别涉及一种骨修复中用珍珠活性物质代替骨生长因子的受控释放方法。

背景技术

骨的老化和意外损伤往往不可避免，病变骨骼最终要被替换，骨植入修复是一种仅次于输血的人体组织移植。目前各种人工骨修复替代材料层出不穷，但主要起骨支架作用，不具有骨生长因子所特有的骨诱导活性。刘志强，周东风，周磊等在“广东牙病防治，2004，12(1)：73-75”上的“骨缺损修复的研究及进展”中报导，实际上人们所期望的骨修复过程是：多种生长因子和激活物在待修复部位受控释放，诱导邻近组织间充质细胞分化为成骨细胞或刺激成骨细胞加速增殖，并向待修复部位聚集，从而表现出明显的靶向诱导成骨活性，最终完成特定部位的骨修复。近年来，人们开始逐渐认识到生长因子在骨修复中不可替代的决定性调控作用，于是在骨修复临床中开始引入骨生长因子。但是骨生长因子极为昂贵，售价甚至高达8万元/克。

珍珠、蚌壳、骨同为生物矿化产物，三者在形成本质上极为相近，其生物矿化都是受其所含有的有机组分调控。蚌壳由棱柱层和珍珠层组成，蚌壳珍珠层是软体动物在正常的生理条件下生物矿化的产物，约含有1.2~3.3wt.％的有机组分，其余为碳酸钙，已有的研究表明这些少量的有机质内含有多种与骨生长相关的信号因子。Gerard Atlan和Evelyne Lopez等人在“Sci Paris/LifeSci，1997；320：253-8”.中自信地进行了蚌壳珍珠层粉的人体实验，显示了很强的成骨活性。目前，国内张荣庆等人张荣庆等在专利CN 1476906A“一种含有珍珠质的骨修复材料及其制备方法”中利用蚌壳珍珠层开发了一种含有珍珠质的骨修复材料，也获得了很好的成骨活性和刘金标等人在“珍珠层/聚乳酸组合人工骨体外相容性及降解实验研究.第一军医大学学报，2003，23(2)：130-133”中制备了适于用作骨缺损修复的可降解(蚌壳)珍珠层/聚乳酸复合材料，体外成骨细胞培养试验显示了材料具有很强的骨诱导能力。

与蚌壳珍珠层不同，珍珠是软体动物在抵抗外界损伤的积极生理条件下形成的特殊矿化产物。迄今为止，人们已经发现了24例人体珍珠，因此珍珠与人体内环境是完全相容的。珍珠富含多种生物活性物质，自古以来就是一种具有神奇的美容保健抗衰功效的天然药物。珍珠的主要成分为碳酸钙(含少量的磷酸钙、硅酸钙)、蛋白质、水分和多种微量元素包括：Fe、Al、Mg、Zn、Se、Cu、Mn、Ge、K、Sr等。珍珠中的蛋白质是一种含有20余种氨基酸的壳角蛋白(或称角质蛋白)，含量高达8wt.％，被称为珍珠活性物质，近年来的研究表明珍珠富含：独特的抗衰老因子-卟啉类化合物(PEG)、牛磺酸(2-氨基乙磺酸)、类胡萝卜素、光基欧磷氨基酸、几丁质等等。因此，珍珠可能含有多种骨生长所需要的生长因子、激活物和营养组分，预期具有更强的诱导成骨活性。

当前，国内外均有通过基因工程技术生产的重组人骨形态发生蛋白(rhBMP)，其中rhBMP2的活性最强。然而单纯的BMP植入人体后很快降解，起不到应有的效果，如果有合适的载体使其在体内实现控制释放，就能有效发挥作用，但是载体的筛选不仅难度大，而且载体与生长因子复合后又具有很多不确定性，尤其是几乎不可能找到一种同时适合多种生长因子的全能载体。另一方面，实际上骨的形成是多种生长因子网络协同作用下实现的，已知参与骨形成的生长因子有：骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)、转化生长因子、类胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生因子、血管内皮细胞生长因子等。在任何时候，骨细胞的微环境中都存在不止一种生长因子，因此用单一生长因子刺激骨形成，不一定能获得有意义的结果。

因此，骨修复过程中理想的生长因子运作过程是：生长因子在整个骨修复过程中缓慢控制释放，且多种生长因子协同作用。而珍珠作为多种已知和未知类骨生长因子的天然载体，其本身就是一个相互协调共同作用的有机整体，因此用珍珠内所特有的活性物质替代骨生长因子，进行人骨修复极具潜力。尤其是当前淡水珍珠的规模化养殖使得珍珠代替骨生长因子用于人骨修复在成本上成为可能，且具有优势。

我国珍珠产量占全世界产量的95％，但是珍珠产量的80～85％为不具有装饰价值的低档珍珠，包括不规则珍珠、杂色珍珠和小珍珠等等。当前，规模化养殖已经造成低档珍珠的大量积压，仅浙江诸暨市每年的积压量就高达300吨，价格急剧下跌，其售价仅为100～300元/公斤。目前我国珍珠业正在堕入“高产陷阱”，如何有效地处理和利用这些低档珍珠，提高低档珍珠的附加值，使珠农增收，拯救珍珠业，振兴地方经济，是整个珍珠产业发展面临的难题，业内人士普遍认识到加快低档珍珠的后续产业化开发是摆脱目前困境的唯一出路。

但是如何才能实现珍珠活性物质在骨修复过程中缓慢控制释放呢？珍珠少量的生物活性物质在纳米尺度上被包埋在90％以上的无机碳酸钙内，体内降解速度缓慢，难于吸收利用是历史上的“千年难题”。目前，在CN 1303715A、CN1425388A、CN 1695812A及一些医学或化工杂志上，报导了提高珍珠吸收效率所采用的方法，主要有两类：溶解和粉碎。珍珠的溶解一般是利用弱酸、酶等化学试剂将碳酸钙溶解掉，这样虽然使得珍珠的有机组分得以最大限度的裸露，但是珍珠的活性则不可避免的要大大降低。因此，为了确保珍珠的活性不被破坏，珍珠多以粉剂形式使用，为此人们已经开发了多种纯物理的珍珠破碎方法，利用纯物理方法珍珠被粉碎后，活性物质一定程度上被暴露，这样不仅有利于吸收，而且珍珠的活性得以保留，尤其是珍珠粉达到纳米尺度后，珍珠的完全吸收将成为可能。

发明内容

本发明的目的是利用珍珠既可能含有多种类骨生长因子，同时又是它们的天然载体的独特优势，用珍珠粉及其活性物质提取物代替昂贵的成骨生长因子，并实现局部受控释放的一种骨修复中用珍珠活性物质代替骨生长因子的受控释放方法。

本发明的依据：由于不同粒度的珍珠粉具有不同的溶解速度，因此珍珠活性物质的控制释放也成为可能。我们可以对骨修复材料内所含有的纯珍珠活性物质提取物和珍珠粉的粒度和含量进行人为设计，这样，由于溶解速度不同，纯珍珠活性提取物和不同粒度的珍珠粉在骨修复的不同阶段将先后降解，从而在骨修复过程中连续不断的释放珍珠活性物质，并且可通过设计进行受控释放。

本发明珍珠用于骨修复，其特征在于将珍珠、或者珍珠粉、或者其活性物质提取物直接用于骨修复，或者将它们的任意组合与其它骨修复材料或者人造骨复合后用于骨修复。这里，“其它骨修复材料或者人造骨”是高分子化合物、蛋白质材料、金属或陶瓷。

本发明用珍珠代替骨生长因子，其特征在于用珍珠粉及其活性物质提取物代替骨生长因子。

本发明珍珠活性物质受控释放方法，其特征在于，利用骨材料内所含有的纯珍珠活性物质提取物和不同粒度与含量的珍珠粉在人体内的溶解速度不同，使其在骨修复的不同阶段先后降解：在初期作为骨修复的启动因子和加速剂，快速激活成骨机制；随后，珍珠粉开始溶解，但是小颗粒珍珠粉溶解快，先消耗掉，而大颗粒珍珠粉溶解慢，后消耗掉，这样，不同粒度的珍珠粉混合物在骨修复的不同阶段先后降解，从而在骨修复过程中可以连续不断的释放珍珠活性物质，并可以通过对珍珠活性物质提取物与珍珠粉含量和粒度的调控实现受控释放。

所述不同粒度珍珠粉的混合物是从纳米级到毫米级(1nm-1mm)各种尺度珍珠粉的混合物，珍珠粉的含量为0-100wt.％。

本发明珍珠粉及其活性物质提取物在骨材料中的含量是：在1nm-1mm范围内任一尺度珍珠粉的含量为0-100wt％，活性物质提取物含量为0-100wt.％，但是全部含量的总合小于等于100wt％。具体的活性物质提取物和珍珠粉含量和粒度组合根据实际骨修复需要的时间和期望的修复过程来确定。

所述珍珠活性物质提取物为水可溶性蛋白、水不可溶性蛋白、或者是二者的组合物。

所述珍珠活性物质提取物及珍珠粉组合物的简单配制过程为：从市场上购买各种粒度包装的珍珠粉和珍珠活性物质提取物，使用前可以利用粉碎设备对所购买的珍珠粉作进一步粉碎处理。利用筛分设备对珍珠粉进行更窄粒度分布范围的筛分，并分装(此时可进行包装灭菌备用)。使用前可以利用激光粒度分析仪或者扫描电子显微镜或透射电子显微镜对珍珠粉进行粒度分布分析。将不同粒度的珍珠粉和活性物质提取物按不同的配比混合，待混合均匀后，将组合物包装灭菌备用。该组合物既可直接用于骨修复，也可与其它骨修复材料或者人造骨进一步复合后使用。使用时根据不同的需求选择不同的组合物，也可以根据需求用筛分后分装灭菌的珍珠粉配制所需要的珍珠粉组合物。

本发明的优点和积极效果：

(1)本发明所选用的材料体系中的珍珠粉和珍珠活性物质提取物均为商业化产品，生产厂家众多，也可以自制，来源广泛，适合大规模的工业生产。

(2)本发明筛分分装的珍珠粉及其组合物生产工艺简单，利于规模化。

(3)用本发明珍珠活性物质提取物和珍珠粉组合物代替骨生长因子，不仅赋予骨材料以骨诱导功能，而且极大的降低了骨修复的成本，市场前景广阔，经济效益可观。

(4)本发明珍珠活性物质控制释放技术可确保骨修复过程中珍珠活性物质的持续不断的释放，从而赋予骨材料以持续不断的成骨诱导活性。

附图说明

图1降解实验装置示意图(用于测定粉体在动态去离子水中的降解速率)

1-连接去离子水水槽；2-去离子水；3-滴定漏斗；4-降解产物；5-纳米珍珠粉、微米珍珠粉或微米CaCO₃(质量为0.01g)。

图2纳米珍珠粉(a)、微米珍珠粉(b)和纯CaCO₃粉(c)的原始形态。

图3MPP、NPP和MCP在流动去离子水中的降解曲线(滴定速率为100ml/h)。

具体实施方式

本发明利用珍珠的既含有多种类骨生长因子，同时又是它们的天然载体的独特优势，用珍珠粉及其活性物质提取物代替昂贵的成骨生长因子，并实现局部受控释放的一种珍珠活性物质代替骨生长因子受控释放的方法及医用用途。

实施例1：珍珠粉的自然降解

珍珠粉一旦实现了纳米化，则其降解速度和降解程度将大大提高。很显然，珍珠粉的降解必然与其独特的纳米有机-无机分级层次结构密切相关，与纯CaCO₃相比，珍珠粉的降解必然有其特殊性，此外珍珠粉的降解还将具有尺寸依赖性。本发明对纳米珍珠粉(NPP，主体粒径约为50-150nm，微米珍珠粉(MPP，主体粒径约为1-5μm)和纯CaCO₃试剂粉末(MCP，尺寸约1μm)在流动去离子水中进行了降解实验，实验装置如图1所示。三种粉末的原始形态如图2所示。所用珍珠粉均为浙江长生鸟药业有限公司产品。图3是上述三种粉末在流动去离子水中的降解曲线。由图可知：纯CaCO₃试剂粉末降解速度最快，5天后即近于全部降解；微米珍珠粉降解速度最慢，7天后大约降解70％，随后降解速度显著放慢，近于停止，剩余尚未降解的30％主要是较大的文石板片；与微米珍珠粉相比，纳米珍珠粉的降解速度明显要加快，7天后大约降解了90％。从珍珠粉降解曲线的总体走势来看，初期降解速度很快，这主要是归因于初期超细纳米珍珠粉的快速降解，但是随着降解的深入，较小的珍珠粉不断因降解而消失，而剩余较大的珍珠粉降解速度则相对要慢一些。可见，珍珠粉的降解速度对珍珠粉的粒度具有显著的依赖性，并且由于存在有机组分对CaCO₃隔离绑定作用，珍珠粉的降解速度要慢于纯CaCO₃试剂粉末。

将一定量的纳米和微米珍珠粉分别浸泡在静止和流动的去离子水中，同时选用CaCO₃试剂作为参比粉末，测定Ca²⁺离子浓度以考察珍珠粉的降解动力学。去离子水自身固有的Ca²⁺浓度为1.1×10^-4M。降解装置以滴定的方式连续不断的供应去离子水，这样不仅可以为降解提供一个动态的介质，而且对降解几乎不会施加任何外部扰动。用XD685型生化分析仪定期测定降解产物的Ca²⁺浓度。如果不考虑有机组分与Ca²⁺的交互作用，那么粉末的降解质量百分比(R％)可通过下式计算：

R％＝(C-C₀)V×M/(f₀m) (1)

这里C和C₀分别是降解产物和去离子水的Ca²⁺浓度(两者均为摩尔浓度)，V是降解产物的体积，f₀是初始粉末中CaCO₃的质量分数，m是初始粉末的质量，M是CaCO₃的摩尔质量。对于本研究，珍珠粉和纯CaCO₃粉末的f₀值分别是0.95和1，取C₀＝1.1×10^-4M，M＝100g/mol。上述式(1)测算相当麻烦，因此在相同降解条件下，对于上述纳米珍珠粉和微米珍珠粉(长生鸟药业有限公司的产品)的混合物，7天后的降解质量百分比(R_总％)实际按下面的经验公式(2)进行估算：

R_总％＝0.7+0.2x (2)

上式中x为上述纳米珍珠粉和微米珍珠粉混合物中纳米珍珠粉的质量百分比。

举例说明：

(1)相同降解条件下，纳米珍珠粉质量百分比为20％的上述混合物，7天后的降解质量百分数为74％。

(2)相同降解条件下，纳米珍珠粉质量百分比为60％的上述混合物，7天后的降解质量百分数为82％。

实施例2：

将长生鸟药业有限公司的超微珍珠粉产品(组分I)和纳米珍珠粉产品(组分II)在60℃下真空干燥3小时，其中超微珍珠粉的主体粒径约为1-5μm，纳米珍珠粉的主体粒径约为50-150nm，组分I和组分II分别取4克(40％wt.％)和6克(60％wt.％)，然后将它们一起在玛瑙研钵内混合1小时以获得两者的组合物，对该组合物在60℃下真空干燥2小时，最后将组合物包装灭菌备用。

实施例3：

对市场购买的普通微米珍珠粉在60℃下真空干燥3小时，然后用振动筛对其进行-100目和+120目的筛分以获得直径在132μm~154μm的珍珠粉(组分I)，随后对-120目的珍珠粉-325目和+350目的筛分以获得直径在48μm~50μm的珍珠粉(组分II)。将长生鸟药业有限公司的超微珍珠粉产品(组分III)和纳米珍珠粉产品(组分IV)在60℃下真空干燥3小时，其中超微珍珠粉的主体粒径约为1-5μm，纳米珍珠粉的主体粒径约为50-150nm；组分I、II、III、IV和珍珠活性物质提取物(市场购得)分别取1克(10％wt.％)、1克(10％wt.％)、2克(20％wt.％)、3克(30％wt.％)、3克(30％wt.％)，然后将它们一起在玛瑙研钵内混合1小时以获得五者的组合物，对该组合物在60℃下真空干燥2小时，最后将组合物包装灭菌备用。

实施例4：

对市场购买的普通微米珍珠粉在60℃下真空干燥3小时，然后用振动筛对其进行-100目和+120目的筛分以获得直径在132μm~154μm的珍珠粉(组分I)，随后对-120目的珍珠粉-325目和+350目的筛分以获得直径在48μm~50μm的珍珠粉(组分II)。将长生鸟药业有限公司的超微珍珠粉产品(组分III)和纳米珍珠粉产品(组分IV)在60℃下真空干燥3小时，其中超微珍珠粉的主体粒径约为1-5μm，纳米珍珠粉的主体粒径约为50-150nm；将组分I、II、III、IV和珍珠活性物质提取物在60℃下真空干燥2小时，最后将它们分别独立包装灭菌备用。

实施例5：

对市场购买的普通微米珍珠粉在60℃下真空干燥3小时，然后用振动筛对其进行-270目和+300目的筛分以获得直径在54μm~57μm的珍珠粉(组分I)。将长生鸟药业有限公司的超微珍珠粉产品(组分II)和纳米珍珠粉产品(组分III)在60℃下真空干燥3小时，其中超微珍珠粉的主体粒径约为1-5μm，纳米珍珠粉的主体粒径约为50-150nm，组分I、II、III和珍珠活性物质提取物分别取2克(20％wt.％)、2克(20％wt.％)、3克(30％wt.％)、3克(30％wt.％)，然后将它们一起在玛瑙研钵内混合1小时以获得四者的组合物，对该组合物在60℃下真空干燥2小时，最后将组合物包装灭菌备用。

实施例6：

将长生鸟药业有限公司的超微珍珠粉产品(组分I)和纳米珍珠粉产品(组分II)在60℃下真空干燥3小时，其中超微珍珠粉的主体粒径约为1-5μm，纳米珍珠粉的主体粒径约为50-150nm，组分I、组分II和珍珠活性物质提取物分别取3克(30％wt.％)、5克(50％wt.％)、2克(20％wt.％)，然后将它们一起在玛瑙研钵内混合1小时以获得三者的组合物，对该组合物在60℃下真空干燥2小时，最后将组合物包装灭菌备用。

临床使用中，可取上述组合物1克和灭菌的瑞邦骨泰固相磷酸钙盐粉末(市场购得)5克，将两者混合均匀后置于调皿中，再加入预先灭菌的瑞邦骨泰液相(市场购得)2.5ml，并充分搅拌，然后在其未完全固化前填入需要进行骨修复的部位。

临床使用中，亦可根据需要取上述组合物与脱蛋白骨、或者羟基磷灰石、或者聚乳酸、或者其它高分子化合物、蛋白质材料或陶瓷进行复合后使用。

Claims

1.一种骨修复中用珍珠活性物质代替骨生长因子的受控释放方法，其特征在于，利用骨材料内所含有的纯珍珠活性物质提取物和不同粒度与含量的珍珠粉在人体内的溶解速度不同，使其在骨修复的不同阶段先后降解：珍珠粉在初期作为骨修复的启动因子和加速剂，快速激活成骨机制；随后，珍珠粉开始溶解，但是从1nm-1mm内的纳米级到毫米级的各种尺度珍珠粉的混合物中，纳米级珍珠粉溶解快，先消耗掉，微米级到毫米级珍珠粉溶解慢，后消耗掉，这样，不同粒度的珍珠粉混合物在骨修复的不同阶段先后降解，从而在骨修复过程中连续不断的释放珍珠活性物质，并通过对珍珠活性物质提取物与珍珠粉含量和粒度的调控实现受控释放。

2.根据权利要求1所述骨修复中用珍珠活性物质代替骨生长因子的受控释放方法，其特征在于，所述不同粒度珍珠粉的混合物是从纳米级到毫米级即1nm-1mm内的各种尺度珍珠粉的混合物，珍珠粉的含量为10-100wt％。

3.根据权利要求1所述骨修复中用珍珠活性物质代替骨生长因子的受控释放方法，其特征在于，所述珍珠粉及其活性物质提取物在骨材料中的含量是：在1nm-1mm范围内任一尺度珍珠粉的含量为10-100wt％，活性物质提取物含量为10-100wt％，但是全部珍珠粉和活性物质提取物的含量的总和小于等于100wt％。

4.根据权利要求1～3中任何一项所述骨修复中用珍珠活性物质代替骨生长因子的受控释放方法，其特征在于，所述珍珠活性物质提取物为水可溶性蛋白、水不可溶性蛋白、或者是二者的组合物。

5.根据权利要求1所述骨修复中用珍珠活性物质代替骨生长因子的受控释放方法，其特征在于，所述珍珠活性物质提取物及珍珠粉组合物的简单配制过程为：从市场上购买各种粒度包装的珍珠粉和珍珠活性物质提取物，使用前利用粉碎设备对所购买的珍珠粉作进一步粉碎处理，利用筛分设备对珍珠粉进行更窄粒度分布范围的筛分，并分装和进行包装灭菌备用；使用前利用激光粒度分析仪或者扫描电子显微镜或透射电子显微镜对珍珠粉进行粒度分布分析；将不同粒度的珍珠粉和活性物质提取物按不同的配比混合，待混合均匀后，将组合物包装灭菌备用；该组合物既可直接用于骨修复，也可与其它骨修复材料或者人造骨进一步复合后使用；使用时根据不同的需求选择不同的组合物，或用筛分后分装灭菌的珍珠粉配制所需要的珍珠粉组合物。