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kularsieb bereits eine Proteinfraktion zuzuführen, welche in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch fraktioniertes Fällen mittels Salzen und/oder Lösungsmitteln, von der Hauptmenge der das erfindungsgemäss zu isolierende Protein begleitenden Proteine befreit worden ist, um die bei der Gel-Elektrophorese bzw, der Chroi matographie aufzuarbeitende Substanzmenge möglichst gering zu halten und damit eine schärfere Auflösung der Banden (Fraktionen) erzielen zu können, Zwecks Isolieren des bei der Gelscheiben-Elektrophorese mit typischer Geschwindigkeit relativ zu andern Proteinen wandernden Protein-Metall-Chelats ist es jedoch nicht unbedingt erforderlich, eine Gel-Elektrophorese vorzunehmen oder zu chromatographieren, sondern es können auch, wenn auch in weniger vorteilhafter Weise,
andere für das Fraktionieren von Proteinen an sich bekannte
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an dem bei der Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von 9, 4 als auch bei einem pH-Wert von 3, 8 in Form von kanpp beieinanderliegenden Banden langsamer als Albumin, jedoch schneller als y-Glo- bulin wandernden Protein-Metall-Chelat mittels Gelscheiben-Elektrophorese zu überprüfen ; sobald mittels des Orientierungshilfsmittels"Gelscheiben-Elektrophorese"irgendeine Kombination von Fraktionierschritten als brauchbar erkannt worden ist, kann diese Kombination von Fraktionierschritten ohne weitere Kontrolle durch Gelscheiben-Elektrophorese, stets die gleiche Proteinquelle vorausgesetzt, routinemässig wiederholt werden.
Unter Ausnutzung dieser Erkenntnisse ist das Verfahren zur Herstellung eines neuen wasserlöslichen ProteinMetall-Chelats, welches bei der Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von 9, 4 als auch bei einem PH-Wert von 3,8 in Form von knapp beieinanderliegenden Banden langsamer als Albumin, jedoch schneller als y-Globulin wandert, dadurch gekennzeichnet, dass eine Lösung (hergestellt durch Extrahieren einer natürlichen Eiweissquelle, beispielsweise Rinderleber, mit ein zweiwertiges Metallion, vorzugsweise Mn++, und gegebenenfalls einen Puffer enthaltendem Wasser in bekannter Weise,
wobei neben andern bekannten Verfahrensschritten jedenfalls ein kurzzeitiges Erhitzen einer das erwünschte Protein enthaltenden Lösung auf eine Temperatur bis höchstens 750C zwecks Abtrennens der wärmelabilsten Proteine von leichter und schwerer löslichen Stoffen vorgesehen ist), erforderlichenfalls unter Transchelatieren, zur Abtrennung von andern Proteinen, wie Albuminen oder y-Globulinen, einem oder mehreren Trennungsverfahren, die an sich bekannt sind, darunter vorzugsweise der Gelelektrophorese oder Chromatographie, unterworfen wird, wobei ein 0, 1 bis 1, 0% Metalle enthaltendes Chelat isoliert wird, in welchem zumindest 65% des Metallgehaltes aus zumindest einem der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co und Cu besteht,
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Verfahren zum Isolieren von einheitlichen Proteinen aus Proteingemischen, obwohl prinzipiell beim Isolieren von einheitlichen Proteinen aus Proteingemischen keine andern als an sich bekannte Fraktionierschritte zur Verfügung stehen, es also prinzipiell nur möglich ist, aus Lösungen von Proteinen einzelne Proteine bzw. Proteingemische mittels Mhungsmitteln oder anorganischen Salzen oder mittels Pufferlösungen beim isoelektrischen Punkt fraktioniert zu fällen, aus erzeugten Fällungen bzw, auch aus den eingesetzten Ausgangsstoffen einzelne Proteine bzw.
Proteinfraktionen selektiv unter Verwendung von organische Lösungsmittel und/oder anorganische Salze enthaltenden wässerigen Lösungen zu extrahieren, Lösungen von Proteinen auf chromatographischem Wege aufzuarbeiten und durch kurzzeitiges Erhitzen von Lösungen von Proteinen auf bestimmte Temperaturen
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selektiv Fällungen zu erzeugen. So wird beispielsweise beim auf die Herstellung einer injizierbaren Arginase abzielenden Verfahren gemäss der USA-Patentschrift Nr. 2, 663,668 ebenso wie beim erfindungsgemässen Ver- fahren eine natürliche Eiweissquelle, beispielsweise Rinderleber, mit ein zweiwertiges Metallion, u. zw.
Mn'*"*' und/oder Co++, enthaltendem Wasser bei einem ebenfalls für das erfindungsgemässe Verfahren in Frage kom- menden pH-Wert von 7, 0 bis 9, 5 extrahiert und anschliessend aus der erhaltenen Lösung durch fraktioniertes
Fällen mittels Aceton als zweite Fällung eine arginasereiche Fraktion erhalten, worauf aus einer wässerigen Lö- sung dieser arginasereichen Fraktion zunächst durch Erhitzen auf 60 bis 800C und dann durch Zusetzen von Salzen des zweiwertigen Bleis noch störendeFremdproteine ausgefällt werden und aus der erhaltenen klaren Lösung mittels Aceton Arginase ausgefällt wird, die sodann noch durch Zusatz von weiteren Cobaltsalzen zusätzlich aktiviert werden kann.
Bei diesem bekannten, eine Weiterentwicklung bereits früher bekannter Verfahren zum Isolieren von Arginase aus natürlichen Eiweissquellen darstellenden Verfahren wurde offensichtlich die Arginasewirkung der jeweils erhaltenen Proteinfraktionen als Orientierungshilfsmittel dafür herangezogen, ob es sich bei der in Betracht gezogenen Proteinfraktion um eine brauchbare oder unbrauchbare Fraktion handelt, wobei jedoch diese Entscheidung rein routinemässig im Hinblick auf die seit langem bekannte Wirkung der Arginase getroffen werden konnte.
In Kenntnis der Eigenschaft des erfindungsgemäss herstellbaren Protein-Metall-Chelats bei der Gelscheiben-Elektrophorese, das oben genannte Wanderungsverhalten zu zeigen, kann zwar ebenfalls die Entscheidung über die auszuwählende und weiterzuverarbeitende Fraktion rein routinemässig getroffen werden, jedoch war es, um zur Erfindung zu gelangen, eben erst erforderlich, zu erkennen, dass in natürlichen Eiweissquellen überhaupt ein in Form des oben angegebenen Chelats isolierbares Protein vorliegt und trotz des äusserst geringen Gehaltes natürlicher Eiweissquellen an diesem Protein aus diesen Eiweissquellen in Form des oben angegebenenMetall-Chelats nach an sich bekannten Methoden zum Fraktionieren von Proteinen isolierbar ist.
Durch die USA-Patentschrift Nr. 2, 663,668 und auch durch die übrige bisher bekannte und das Fraktionieren von Eiweissstoffe betreffende Literatur wird weder die Existenz des in einem erfindungsgemäss herstellbaren Protein-Metall-Chelat enthaltenen Proteins noch die Möglichkeit, dieses Protein-Metall-Chelat aus natürlichen Eiweissquellen zu gewinnen, nahegelegt.
Die Struktur des erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats isolierbaren Proteins ist, ebenso wie für die weitaus meisten Proteine, nicht geklärt, Strukturuntersuchungen, welche sich in der Regel über mehrere Jahrzehnte erstrecken, sind im Gange. Die für die Kennzeichnung der Struktur eines Proteins zumindest erforderliche Aminosäurensequenz ist unbekannt, Im folgenden werden die bisher vorliegenden Ergebnisse der Struktur-
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darauf hindeutet, dass im erfindungsgemäss isolierbaren Protein-Metall-Chelat auch Nicht-Proteine enthalten sind.
Diese Tatsache wird durch unter Verwendung eines Jod-Schiff-Indikators durchgeführte Gelscheiben-Elektrophorese bestätigt, Nach saurer Hydrolyse des Proteins durchgeführte Prüfungen mit Zuckerreagentien weisen auf die Anwesenheit einer geringen Menge an Kohlehydrat hin, welches wahrscheinlich covalent an das Protein gebunden ist.
Der isoelektrische Punkt des erfindungsgemäss herstellbaren Protein-Metall-Chelats liegt etwa bei einem pH-Wert von 5, 5 t 0, 3. Je nachdem, von welcher Seite her man sich an den isoelektrischen Punkt heranbewegt, wird das Protei n-Metall-Chelat bei pH-Werten von 4, 0 bis 6,0 teilweise oder vollständig unlöslich, wes-
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sollen, um durch Fällungserscheinungen eine Verringerung der Ausbeute zu vermeiden ; ein pH-Wert unterhalb 1, 0 bzw, ein PH-Wert oberhalb 11, 0 soll vermieden werden, da. dann die Gefahr einer Denaturierung des Protein-Metall-Chelats besteht.
Das Infrarotspektrum des erfindungsgemäss isolierbaren Metall-Chelats eines Proteins ist, bei pH = 7 bestimmt, typisch für Proteine, In der untenstehenden Tabelle sind die Ultraviolettabsorptionsspektren dieses
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05PH = 7 in 0, 05 m Phosphatpuffer und bei PH = 13 in 0, 15 m KCI, wobei der pH-Wert mit 1 n KOH auf 13 eingestellt wurde, dargestellt.
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Ultraviolett-Absorptionsspektren des neuen Protein-Metall-Chelats
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<tb>
<tb> Optische <SEP> Dichte
<tb> PHl. <SEP> 5 <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> PH <SEP> 13, <SEP> 0 <SEP>
<tb> nm <SEP> #=-.-5 <SEP> #=-.15 <SEP> H2O <SEP> Puffer <SEP> KCI-KOH
<tb> 0,560 <SEP> mg/ml <SEP> 0, <SEP> 434 <SEP> mg/ml <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP> mg/ml <SEP> 0, <SEP> 492 <SEP> mg/ml <SEP> 0,492 <SEP> mg/ml
<tb> 310 <SEP> 0, <SEP> 066 <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> 0,035 <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 0, <SEP> 126 <SEP>
<tb> 300 <SEP> 0, <SEP> 102 <SEP> 0,030 <SEP> 0, <SEP> 090 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> 0, <SEP> 280 <SEP>
<tb> 295 <SEP> 0, <SEP> 145 <SEP> 0,066 <SEP> 0, <SEP> 184 <SEP> 0, <SEP> 13 <SEP> 0, <SEP> 353 <SEP>
<tb> 290 <SEP> 0, <SEP> 236 <SEP> 0, <SEP> 129 <SEP> 0, <SEP> 372 <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP> 0, <SEP> 430 <SEP>
<tb> 285 <SEP> 0, <SEP> 320 <SEP> 0,
<SEP> 190 <SEP> 0, <SEP> 510 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0,429
<tb> 284 <SEP> 0, <SEP> 342 <SEP> 0, <SEP> 204 <SEP> 0, <SEP> 540 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 430 <SEP>
<tb> 283 <SEP> 0, <SEP> 355-0, <SEP> 560 <SEP>
<tb> 282 <SEP> 0, <SEP> 369 <SEP> 0, <SEP> 219 <SEP> 0, <SEP> 570 <SEP> 0, <SEP> 29 <SEP> 0, <SEP> 438 <SEP>
<tb> 281--0, <SEP> 580 <SEP>
<tb> 280 <SEP> 0, <SEP> 377 <SEP> 0, <SEP> 244 <SEP> 0, <SEP> 585 <SEP> 0, <SEP> 30 <SEP> 0, <SEP> 430 <SEP>
<tb> 279-0, <SEP> 226 <SEP> 0, <SEP> 590 <SEP>
<tb> 278 <SEP> 0, <SEP> 384 <SEP> 0, <SEP> 227 <SEP> 0, <SEP> 592 <SEP> 0,30 <SEP> 0, <SEP> 420 <SEP>
<tb> 277-0, <SEP> 228 <SEP> 0, <SEP> 590
<tb> 276 <SEP> 0, <SEP> 385 <SEP> 0, <SEP> 226 <SEP> 0,588 <SEP> 0, <SEP> 30 <SEP> 0, <SEP> 411 <SEP>
<tb> 275 <SEP> 0, <SEP> 385 <SEP> 0, <SEP> 225 <SEP> 0, <SEP> 580 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 410 <SEP>
<tb> 270 <SEP> 0,
<SEP> 364 <SEP> 0, <SEP> 206 <SEP> 0, <SEP> 538 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 422 <SEP>
<tb> 265 <SEP> 0, <SEP> 330 <SEP> 0, <SEP> 279 <SEP> 0, <SEP> 475 <SEP> 0, <SEP> 23 <SEP> 0, <SEP> 471 <SEP>
<tb> 260 <SEP> 0, <SEP> 284 <SEP> 0, <SEP> 144 <SEP> 0, <SEP> 400 <SEP> 0, <SEP> 19 <SEP> 0, <SEP> 592 <SEP>
<tb> 255 <SEP> 0, <SEP> 247 <SEP> 0, <SEP> 117 <SEP> 0, <SEP> 337 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0,845
<tb> 250 <SEP> 0, <SEP> 226 <SEP> 0, <SEP> 104 <SEP> 0, <SEP> 315 <SEP> 0, <SEP> 13 <SEP> 1, <SEP> 150 <SEP>
<tb> 245 <SEP> 0, <SEP> 263 <SEP> 0, <SEP> 134 <SEP> 0, <SEP> 402 <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP> 1, <SEP> 45 <SEP>
<tb> 240 <SEP> 0, <SEP> 432 <SEP> 0, <SEP> 272 <SEP> 0, <SEP> 190 <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP> 1, <SEP> 70 <SEP>
<tb> 230---1, <SEP> 80 <SEP>
<tb>
Wie der Tabelle entnommen werden kann,
sind die im sauren Milieu und im alkalischen Milieu ermittelten Absorptionsspektren des Protein-Metall-Chelats beträchtlich verschieden von dem bei PH = 7 erhaltenen Absorptionsspektrum.
Bei der Gelscheiben-Elektrophorese auf Polyacrylamid gibt das erfindungsgemäss isolierbare Metall-Chelat des Proteins ein typisches Bild mit drei nahe beieinanderliegenden Banden sowohl bei einem pH-Wert von 9, 4 als auch bei einem pH-Wert von 3, 8 (fliessendes Gel). (Diese Arbeitsweise beruht auf den Arbeiten von Ornstein und Davis, Ann. N. Y. Acad. Sci. 121 [1964], S. 321 und 404, und von Williams und Reisfeld, Nature 195 [1962], S. 281).
Typische Elektrophorogramme des Protein-Metall-Chelats enthält die untenstehende Tabelle,
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<tb>
<tb> pH <SEP> 9,4 <SEP> pH <SEP> 3,8
<tb> Breite <SEP> Abstand <SEP> vom <SEP> Relative <SEP> Breite <SEP> Abstand <SEP> vom <SEP> Relative
<tb> in <SEP> mm <SEP> Ursprung <SEP> Intensität <SEP> in <SEP> mm <SEP> Ursprung <SEP> Intensität
<tb> in <SEP> mm1 <SEP> in <SEP> % <SEP> in <SEP> mm1 <SEP> in <SEP> %
<tb> oberes
<tb> Band <SEP> 1,0 <SEP> 11, <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 16,5 <SEP> 100
<tb> mittleres
<tb> Band <SEP> 1,0 <SEP> 14,0 <SEP> 89-93 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 20,0 <SEP> 53-56
<tb> unteres
<tb> Band <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 18, <SEP> 0 <SEP> 48-52 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 22,0 <SEP> 94-96
<tb>
1 oberer Rand, Gesamtlänge des fliessenden Gels :
56 mm
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jenes chelatierende Metall, welches im Protein-Metall-Chelat mit dem höchsten Anteil enthalten ist. Obzwar in den die stärkste Wirkung zeigenden Chelaten der grösste Teil des Metallgehaltes auf physiologisch wesentli- che zweiwertige Metalle zurückzuführen ist, enthalten typische Metallchelate auch andere Metalle, welche häufig während der Fraktionierschritte vom Protein, insbesondere dann aus Anlagenteilen aufgenommen werden, wenn in den aufzuarbeitenden Lösungen die Konzentration der erwünschten physiologisch wesentlichen zweiwertigen Metallionen gering ist.
Falls zumindest im letzten Fraktionierschritt in den aufzuarbeitenden Lösungen eine ausreichend hohe Konzentration an physiologisch wesentlichen zweiwertigen Metallionen aufrechterhalten wird, gelingt es, Protein-Metall-Chelate herzustellen, in welchen von den insgesamt vorliegenden chelatisierenden Elementen nur 10% physiologisch unwesentliche Elemente, beispielsweise Al, Si oder B, sind.
Da das erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein ziemlich wärmeempfindlich ist, ist es gemäss der Erfindung zweckmässig, mit Ausnahme des kurzzeitigen Erhitzens alle Verfahrensschritte bei einer Temperatur unterhalb 50C durchzuführen. Das zwecks Abtrennens der wärmelabilsten Proteine vorzunehmende kurzzeitige Erhitzen einer das erwünschte Protein enthaltenden Lösung erfolgt gemäss der Erfindung zweckmässig auf eine Temperatur von mindestens 50 C, vorzugsweise auf eine Temperatur von 50 bis 650C bei einer Erhitzungsdauer von 5 bis 10 min. Hiebei ist zu beachten, dass die Temperatur und die Dauer der Wärmebehandlung einander umgekehrt proportional sind. Das in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein ist bei Temperaturen oberhalb 750C nur kurze Zeit beständig.
Soferne es nicht möglich ist, wie beispielsweise beim flash-Pasteurisieren, das Erhitzen und das Abkühlen in kürzester Zeit vorzunehmen, soll das Gemisch nicht über 750C erhitzt werden. Blosses Erwärmen auf Temperaturen unterhalb 500C zeitigt wenig zufriedenstellende Ergebnisse, da einige der unerwünschten wärmelabilen Proteine bei solchen niedrigen Temperaturen noch ziemlich beständig sind. Das erwünschte Protein ist bei 550C 15 bis 30 min und bei 650C etwa 3 bis 8 min beständig, womit es möglich ist, bei Zerstörung der wärmelabilen Proteine übliche Heiz- und Kühleinrichtungen zu verwenden.
Da, wie erwähnt, das erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein bei einem PHWert unter 1, 0 bzw. bei einem PH-Wert oberhalb 11,0 instabil ist und in Nähe des isoelektrischen Punktes (PHWert = 5,5) nicht so löslich ist, ist es gemäss der Erfindung zweckmässig, bei allen Fraktionierschritten bei einem pH-Wert zwischen 1 und 4 oder zwischen 6 und 11, vorzugsweise 7 bis 8, zu arbeiten, soferne es nicht bezweckt ist, aus einer Lösung dieses Proteins dieses Protein auszufällen, in welchem Falle gemäss der Erfindung der pH-Wert einer dieses Protein enthaltenden Lösung auf einen Wert zwischen 4 und 6, insbesondere auf etwa 5, 5, zu bringen ist.
Da das erfindungsgemäss inForm eines Metall-Chelats zu isolierendeProtein in Form eines Chelats wesentlich stabiler ist, ist es gemäss der Erfindung zweckmässig, sämtliche Fraktionierschritte in Anwesenheit eines
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005wärmelabilsten Proteine durch kurzzeitiges Erhitzen einer das erwünschte Protein enthaltenden Lösung zweckmässig, da, wie erwähnt, dieses Protein in Form eines Chelats am stabilsten ist und damit während des Erhitzens nur eine geringe Menge des erwünschten Proteins zerstört wird.
Da der in den einzelnen Fraktionierschritten, beispielsweise selektive Fällungen mittels Salzen oder Lö-
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flüsse zu stabilisieren. Zu diesem Zwecke wird gemäss der Erfindung am besten in an Puffersubstanz 0, bis 0, 20molaren, vorzugsweise mindestens 0,05molaren, insbesondere 0, molaren, Lösungen gearbeitet. Als Puffer können hiebei gemäss der Erfindung partiell neutralisierte organische oder anorganische Säuren, z. B. Gemische aus Tris- (hydroxymethyl)-aminomethan (im folgenden kurz als Tris bezeichnet) einerseits und einer Dicarbonsäure, wie Maleinsäure oder Bernsteinsäure, Phosphorsäure oder einer Aminosäure, z. B. Glycin, anderseits, verwendet werden,
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens wird zweckmässig die natürliche Eiweissquelle, beispielsweise tierische Organe bzw.
Gewebe, wie Leber, Niere, Hoden, Pankreas, Placenta, Darmschleimhaut, Thymus, Lunge oder Milz von Kaninchen, Schafen, Rindern, Schweinen oder Menschen, bzw, ein daraus in an sich bekannter Weise durch Behandeln mit organischen Lösungsmitteln, wie Toluol oder Aceton, erhaltenes Trok-
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8 Ä,erhalten wird, aus welcher, wie bereits erwähnt, bereits durch Gel-Elektrophorese oder mittels Molekularsieben das erwünschte Protein-Metall-Chelat auf Grund seines Wanderungsverhaltens bei der Gel-Elektrophorese abgetrennt werden kann, wobei jedoch zwecks Erzielung eines ausreichenden Trenneffektes die Gel-Elektrophorese oder das Fraktionieren mittels eines Molekularsiebes mehrmals vorzunehmen ist, um schliesslich die einzelnen Fraktionen weit genug auseinanderziehen zu können.
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Um jedoch im Rahmen der Gel-Elektrophorese oder im Rahmen des Fraktionieren mittels Molekularsieben nicht zu grosse Substanzmengen aufarbeiten zu müssen, ist es gemäss der Erfindung zweckmässig, vor dem Frak- tionieren durch Gel-Elektrophorese oder dem Fraktionieren mittels eines Molekularsiebes eine an erwünschtem
Protein angereicherte Fraktion durch fraktioniertes Fällen mittels Salzen, insbesondere Ammonsulfat, und/oder i mit mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, insbesondere Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, niedere aliphati- sche Alkohole, wie Isopropanol und/oder Äthanol, herzustellen. Naturgemäss ist es im Zuge dieser Fällungen zweckmässig, stets in eine Puffersubstanz und ein Salz eines zweiwertigen Metalls enthaltenden wässerigen Lö- sungen zu arbeiten.
Naturgemäss ist aus den hiebei erhaltenen Fraktionen das erwünschte Protein umso leichter mittels GelElektrophorese oder Molekularsieben abzutrennen, je weitergehender unerwünschte Begleitstoffe entfernt wor- den sind, jedoch kann jede der in Frage kommenden Fraktionen im Prinzip durch die Gel-Elektrophorese oder mittels Molekularsieben aufgearbeitet werden.
Eine Möglichkeit, zu einer an erwünschtem Protein angereicherten Fraktion zu kommen, besteht gemäss der Erfindung darin, dass die durch Extraktion der Eiweissquelle bzw. des hieraus erhaltenen Trockenpulvers er- haltene wässerige Lösung zwecks Ausfällens von weniger als das in Form eines Chelats zu isolierende Protein löslichen Stoffen zu 40 bis 450/0 mit Ammonsulfat gesättigt oder mit etwa 0,5 Vol -Teilen Aceton oder Äthanol versetzt wird, wobei zwecks Ausfällens allenfalls vorhandener Pigmente vor oder nach dem Fällen der weniger löslichen Stoffe die jeweils vorliegende Lösung mit, vorzugsweise 10% ihres Volumens, eines heterocyclischen
Amins, z. B. Pyridin oder Piperidin, oder mit etwa 15% ihres Volumens eines Gemisches aus Äthanol und Chlo- roform (etwa 2 : 1) versetzt wird.
Hiebei kann gemäss der Erfindung zwecks Abtrennens der wärmelabilen Pro- teine die erhaltene Lösung rasch, z. B. unter kräftigem Rühren, auf 590C erhitzt, etwa 15 min auf dieser Tem- peratur gehalten und dann rasch, z. B. mittels einer Kältemischung, auf etwa 3 C abgekühlt werden, wobei vor oder nach dem Abtrennen der wärmelabilen Proteine ein das erwünschte Protein enthaltender Niederschlag da- durch hergestellt werden kann, dass die erhaltene Lösung entweder zu 58 bis 7eo mit Ammonsulfat gesättigt oder mit der zwei- bis vierfachen Menge der zum Fällen der weniger löslichen Proteine erforderlichen Menge an Lösungsmittel (vorzugsweise Aceton oder Äthanol) versetzt wird.
Der das erwünschte Protein enthaltende
Niederschlag wird zwecks Weiterverarbeitung zweckmässig in einem ein zweiwertiges Metallion enthaltenden
Puffer gelöst.
Eine weitere Möglichkeit, zu einer an erwünschtem Protein angereicherten Fraktion zu gelangen, besteht gemäss der Erfindung darin, dass die durch Extraktion der Eiweissquelle bzw. des hieraus erhaltenen Trockenpul- vers erhaltene wässerige Lösung zwecks Abtrennens von leichter als das in Form eines Chelats zu isolierende
Protein löslichen Stoffen mit dem gleichen Volumen an kaltem Aceton versetzt und der erhaltene Niederschlag in ein zweiwertiges Metallion, vorzugsweise Mn+, enthaltendem Puffer (pH-Wert etwa 7,6) gelöst wird.
Im
Anschluss daran kann gemäss der Erfindung so vorgegangen werden, dass zwecks Abtrennens der wärmelabilen
Proteine die erhaltene Lösung rasch auf 600C erhitzt, bis etwa 20 min nach Beginn des Erhitzens auf dieser
Temperatur gehalten und dann rasch auf 50C abgekühlt wird, worauf aus der erhaltenen Lösung eine das er- wünsche Protein enthaltende Fraktion durch Zusetzen von etwa 0,9 Vol, -Teilen Äthanol ausgefällt wird und sodann der erhaltene Niederschlag in einem ein zweiwertiges Metallion enthaltenden Puffer gelöst wird.
Schliesslich kann gemäss der Erfindung die erhalteneLösung zwecks Abtrennens der leichter als das in Form eines Chelats zu isolierende Protein löslichen Stoffe einer fraktionierten Fällung mit Ammonsulfat unterworfen werden, wobei die bei einer 60 bis 75% der Sättigungskonzentration desAmmonsulfats betragenden Konzentration an Ammonsulfat anfallenden Niederschläge in einem ein zweiwertiges Metallion enthaltenden Puffer suspendiert werden und aus der erhaltenen Suspension Unlösliches entfernt wird.
Die so erhaltenen Lösungen des erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats zu isolierenden Proteins, insbesondere die von den wärmelabilen Proteinen, den leichter löslichen und den schwerer löslichen Stoffen befreiten Lösungen, können gemäss der Erfindung derFeinreinigung durch Gegenstromextraktion, Gel-Elektrophorese oder Chromatographieren, z. B. Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie oder Chromatgraphie in mit lonenaustauschharzen oder Gelen wie Silikagel oder vernetztes Dextran (Molekülsieb) gefüllten Kolonnen, unterworfen werden. Bei der Feinreinigung genügt es im allgemeinen, eine Absorptionsbande bei 280 nm zeigende Fraktionen aufzufangen, da nur solche Fraktionen das erfindungsgemäss in Form eines MetallChelats zu isolierende Protein enthalten.
Bei dieser Feinreinigung wird das erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein von allenfalls vorhandenen Resten an Albuminen oder y-Globulinen abgetrennt ; insbesondere das weitgehende Abtrennen der Albumine vom erfindungsgemäss zu isolierenden Protein ist wesentlich, da die Albumine die pharmakologische Wirksamkeit des erfindungsgemäss in Form eines MetallChelats zu isolierenden Proteins wesentlich stärker beeinträchtigen als y-Globuline.
Da voraussetzungsgemäss ein 0, 1 bis 1, 0% Metalle aufweisendes Chelat zu isolieren ist, in welchem zu-
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welchem zumindest 400/0 des Metallgehaltes von einem zweiwertigen Metall mit einem Ionenradius von 0, 65 bis 0,79 , insbesondere Magnesium, gebildet sind.
Da die im letzten Fraktionierschritt anfallenden Lösungen des erwünschten Protein-Metall-Chelats noch ziemliche Mengen an Puffersubstanz und Salzen zweiwertiger Metalle gelöst enthalten, ist es gemäss der Erfin- dung zweckmässig, aus diesen Lösungen die Puffersubstanz und die Salze zweiwertiger Metalle durch Dialyse zu entfernen, wobei zweckmässig zuerst durch Dialyse gegen eine etwa 0, 001molare Lösung eines Salzes eines zweiwertigen Metalls, insbesondere Mg, in entsalztem Wasser die Konzentration der Lösung an Puffersubstanz auf weniger als 10-6 m gebracht wird und dann durch Dialyse gegen entsalztes Wasser die Konzentration der Lö- sung an dem Salz eines zweiwertigen Metalls auf weniger als 10-7 m gebracht wird.
Da das erfindungsgemäss herstellbare Protein-Metall-Chelat im trockenen Zustand und, bei tiefer Temperatur gelagert, am beständigsten ist, ist es gemäss der Erfindung zweckmässig, das Protein-Metall-Chelat enthaltende Lösungen, insbesondere erhaltene Lösungen des reinen Chelats, gefrierzu1roclmen.
Die Erfindung wird im folgenden durch Ausführungsbeispiele näher erläutert : Beispiel l : l kg frische, vom Bindegewebe befreite Ochsenleber wurde in fünf oder sechs Stücke zerteilt, anschliessend mit Leitungswasser gespült und zerkleinert. Kleinere Mengen der zerkleinerten Ochsenleber (200 g) wurden in einem Schneidmischer mit 200 ml kalter isoosmotischer Cl-Lösung innerhalb 20 sec homogenisiert, worauf unmittelbar anschliessend im Mischer das Homogenisat innerhalb 20 sec bei -100C mit 200 ml Aceton vermischt wurde. Das mit Aceton behandelte Homogenisat wurde sodann unter Rühren in ein 2,5 l auf - 100C gekühlten Acetons enthaltendes 10 l-Becherglas gegossen.
Sobald der letzte Anteil der zerkleinerten Ochsenleber in der angegebenen Weise behandelt worden war, wurde der Inhalt des Becherglases mit kaltem Aceton auf 10 l aufgefüllt und durchgemischt. Die Temperatur wurde anschliessend einige Minuten auf 4 C gehalten. Die klare überstehende Flüssigkeit wurde nun abdekantiert, worauf der Inhalt des Becherglases mit Aceton auf 10 l aufgefüllt wurde. Nach dem Abgiessen der klaren überstehenden Flüssigkeit wurde die Suspension rasch auf einem Buchner-Trichter filtriert, welcher oben abgedeckt ist, um den Zutritt von Luft so weitgehend als möglich auszuschalten. Noch bevor der am Trichter befindliche Filterkuchen völlig trocken war, wurde mit 2 l kaltem Aceton gewaschen.
Das Waschen wurde so lange fortgesetzt, bis die Teilchen vollständig trocken waren. Der Filterrückstand wurde zerkleinert, auf einem Filterpapier ausgebreitet und unter Stickstoff getrocknet. Das erhaltene Pulver wird noch kalt fein gemahlen und bei 40C im Vakuum gelagert. Die Ausbeute
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standene, nahezu weisse Niederschlag wurde im 10- bis 15fachen seines Gewichts an 0, 10m Tris-Maleat-Mg++- Puffer aufgenommen und 1/2 h kalt stehengelassen, worauf ein allenfalls verbliebener Rückstand abzentrifugiert und verworfen wurde.
Die nunmehr vorliegende Lösung des erfindungsgemäss in Form eines Chelats zu isolierenden Proteins (befreit vom Hauptteil der leichter löslichen und der schwerer löslichen Stoffe) wurde nun einer Feinreinigung durch Gel-Elektrophorese unter Verwendung von quervernetztem Polyacrylamid als Gel unterworfen.
Hiebei wurde ein für Produktionszwecke entwickeltes Gerät verwendet, in welchem ein 32 cm langer, 10 cm breiter und 1 cm starker Block aus einem 5 bis 7 Gew.-% quervernetztes Polyacrylamid enthaltenden Gel in der Elektrophoresekammer untergebracht war, die ihrerseits mit den Seitenflächen grösster Abmessungen vertikal angeordnet war und im Bereiche dieser Seitenflächen mittels eines laufend umgewälzten und gekühlten Gemisches aus Äthylenglykol und Wasser gekühlt werden konnte, so dass es möglich war, bei einer Spannung von 600 bis 1000 V und mit einer Stromstärke von 200 bis 500 mA zu arbeiten.
Der Gel-Block wurde in der ElektrophoreseKammer dieses Gerätes durch Polymerisieren eines im Vakuum entgasten und blasenfrei in die ElektrophoreseKammer eingebrachten Gemisches aus wässerigen Lösungen von Acrylamid, N. N'-Methylenbisacrylamid und Hilfsstoffen hergestellt, wobei folgende Lösungen verwendet wurden :
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<tb>
<tb> a) <SEP> In-HCl <SEP> 480 <SEP> ml
<tb> Tris- <SEP> (hydroxymethyl)-aminomethan <SEP> 363 <SEP> g
<tb> Tetramethyläthylendiamin <SEP> 4, <SEP> 6 <SEP> ml
<tb> 1-\ <SEP> 0 <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> b) <SEP> Acrylamid <SEP> 280 <SEP> g
<tb> N, <SEP> N'-Methylenbisacrylamid <SEP> 7, <SEP> 36 <SEP> g
<tb> HO <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> c) <SEP> Ammoniumpersulfat <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> HZO <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb>
Das in die Elektrophorese-Kammer eingebrachte Gemisch bestand aus 1 Vol.-Teil eines Gemisches aus 1 Vol, -Teil der Lösung a), 2 Vol -Teilen der Lösung b) und 1 Vol, -Teil Wasser einerseits und 1 Vol.-Teil der Lösung c) anderseits.
Mit diesem Gemisch wurde die Elektrophorese-Kammer bis 16 mm unterhalb ihres oberen Randes gefüllt, worauf das Gel in der Elektrophorese-Kammer mit einer 0, 001loigen wässerigen Lösung von als Markierungsfarbe dienendem Bromphenolblau vorsichtig überschichtet wurde und nach abgeschlossener Polymerisation der Überschuss an wässeriger Lösung des Bromphenolblaues sorgfältig entfernt wurde. Nun wurde die in der oben angegebenen Weise hergestellte wässerige Lösung des erfindungsgemäss zu isolierenden Proteins in O, 10m Tris-Maleat-MgH-Puffer mit einem zu einem Gel polymerisierbaren Gemisch vermischt und das erhaltene Gemisch auf das in der Elektrophorese-Kammer befindliche Gel aufgebracht und dort unter Lichteinwirkung auspolymerisiert.
Das zu einem Gel polymerisierbare Gemisch wurde unter Verwendung folgender Lösungen hergestellt :
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<tb>
<tb> d) <SEP> ImHgPO <SEP> 256 <SEP> ml
<tb> Tris- <SEP> (hydroxymethyl)-aminomethan <SEP> 57 <SEP> g
<tb> H, <SEP> auf <SEP> J000 <SEP> ml
<tb> (PH <SEP> 6, <SEP> 9) <SEP>
<tb> e) <SEP> Acrylamid <SEP> 100 <SEP> g
<tb> N, <SEP> N'-Methylenbisacrylamid <SEP> 25 <SEP> g
<tb> H2O <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> c) <SEP> Ammoniumpersulfat <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> H2O <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb>
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Teil Wasser hergestelltes Gemisch mit 1 Vol. -Teil der Lösung c) vermischt.
Nachdem das in die Elektrophorese-Kammer eingebrachte Proben-Gel auspolymerisiert war, wurde die Elektrophorese-Kammer in den Pufferbehälter eingebracht, welcher mit einer aus 60 g Tris- (hydroxymethyl)-aminomethan, 288 g Glycin und der
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bis nach 3 h die Markierungsfarbe das Gel nahezu zur Gänze durchquert hatte. Zu diesem Zeitpunkt befand sich das erfindungsgemäss zu isolierende Protein-Metall-Chelat in einem Bereich, welcher etwa um 30% des von der
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Markierungsfarbe zurückgelegten Wanderungsweges vom Ursprungspunkt entfernt war. Das erfindungsgemäss zu isolierende Protein-Metall-Chelat war gut getrennt von den beträchtlich rascher wandernden Albuminen und ebenfalls gut getrennt von den wesentlich langsamer wandernden y-Globulinen.
Nach abgeschlossener Elektrophorese wurde das erwünschte Protein-Metall-Chelat aus dem Gel mittels eines Querstromes an 0, Im Tris-Maleat-Puffer, welcher an Mg++ 0, 001molar war, ausgewaschen, wobei das Fortschreiten des Isolierens durch Bestimmung der UV-Absorption bei 280 nm verfolgt wurde. Die Einheitlichkeit des so erhaltenen Protein-MetallChelats wurde durch analytisch durchgeführte Gelscheiben-Elektrophorese noch überprüft, Aus dem erhaltenen Eluat wurde das zu isolierende Protein-Metall-Chelat dadurch gewonnen, dass dieses Eluat zunächst erschöpfend gegen 0, 001 m Tris-Maleat-Mg++-Puffer und dann gegen entsalztes Wasser dialysiert und dann das erhaltene Dialysat gefriergetrocknet wurde. Hiebei wurde ein weisses, flaumiges Pulver in einer Menge erhalten, die etwa 16% des durch Ammonsulfat ausgefällten Produktes ausmacht.
Die Ausbeute an Protein-Metall-Chelat betrug, bezogen auf Trockengewicht der eingesetzten Ochsenleber, 0, 02%.
Beispiel 2 : Soferne nichts anderes angegeben ist, wurden alle Arbeitsgänge in einem kalten Raum (2 bis 50C) vorgenommen.
Frische Rinderleber wurde vermahlen und in einen Kunststoffbehälter eingefüllt, worauf kaltes destilliertes Wasser in einer Menge von 2 l pro kg Leber unter Rühren zugegeben und der pH-Wert des erhaltenen Gemisches mit 0, ln-NaOH auf 7,5 bis 7,6 eingestellt wurde. Dem Gemisch wurde nun so viel an 2m-MnS04-Lösung zugegeben, dass das Gemisch an Mangan 0,05molar wurde. Der pH-Wert wurde sodann auf 7,6 eingestellt, worauf so viel frisches kaltes Wasser zugegeben wurde, dass auf 1 kg Leber insgesamt 3 l Wasser kamen. Nun wurden pro kg Leber 50 ml Toluol zugesetzt, worauf die Mischung über Nacht im kühlgehaltenen Raum gerührt wurde, Am darauffolgenden Morgen wurde die Suspension durch Gaze aus Kunststoffäden filtriert, worauf das Filtrat mit dem 1 1/2fachen Volumen an kaltem Aceton (-10 C) unter gelindem Rühren versetzt wurde.
Die Zugabe des Acetons erfolgte über ein Glasrohr, welches weit genug unter die Oberfläche des Gemisches ragte. Der entstandene Niederschlag wurde unmittelbar darauf durch Abzentrifugieren isoliert und sogleich in etwa 25 Vol.-% an 0,05m Maleat-Mn++-Puffer, bezogen auf das Volumen des Filtrats vor Zugabe des Acetons, suspendiert. Die Mischung wurde in der Kälte mehrere Stunden gerührt, über Gaze aus Kunststoffäden filtriert und durch Zentrifugieren geklärt.
Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde in einem Kessel aus rostfreiem Stahl unter Rühren rasch auf 60 C erhitzt und bis 20 min nach Beginn des Erhitzens auf dieser Temperatur gehalten. Die Mischung wurde sodann so rasch wie möglich auf 5 C gekühlt, worauf der entstandene voluminöse Niederschlag im kalten Raum durch langsames Absaugen über eine grosse Filterfläche abfiltriert wurde, Die Temperatur des klaren Filtrats wurde auf 2 bis 50C gebracht, worauf 0,9 Vol.-Teile denaturiertes Äthanol (-10 C) mittels eines Tropftrichters über ein sich bis weit unter die Oberfläche des Gemisches erstreckendes Glasrohr unter starkem Rühren und bei einer Temperatur von höchstens 5 C zugegeben wurden. Nach vollständiger Zugabe des Alkohols wurde das Gemisch gerade so lange in einem kalten Raum verwahrt, bis sich der Niederschlag zusammengeballt und abgesetzt hatte.
Der Niederschlag wurde durch Absaugen mit niedrigem Unterdruck isoliert und unmittelbar anschliessend in kaltem 0, 001m Maleat-Mn++ -Puffer von PH 7, 0 gelöst. Die Menge an verwendetem Puffer betrug etwa 4 ml/g Niederschlag. Die Lösung wurde durch Zentrifugieren geklärt, worauf die überstehende Flüssigkeit abgetrennt und der Niederschlag mit kleinen Mengen kalter Pufferlösung mehrmals extrahiert wurde. Die überstehenden Flüssigkeiten werden miteinander vereinigt und gefriergetrocknet, Das erhaltene Pulver stellte ein Gemisch aus erwünschtem Protein, Arginase und andern Enzymen, Albumin und andern, unwesentlichen Proteinen dar.
Zwecks weiterer Aufarbeitung wurde das so erhaltene Pulver im 12fachen seines Schüttvolumens an kaltem 0, 2m-Tris-Puffer gelöst, welcher an Mg++ 0, 001molar war und einen pH-Wert von 7,8 besass. Die so erhaltene Lösung wurde mit kalter gesättigter Ammonsulfatlösung behandelt, welche ebenfalls an Mg++ 0, 001molar war. Pro 1000 ml Pufferlösung wurden hievon Anteile zu je 375 ml gegeben, wobei die Pufferlösung jeweils zu 15,30, 45,60 und 75% an Ammonsulfat gesättigt wurde. In jedem Falle erfolgte die Zugabe der Ammonsulfatlösung tropfenweise bei 0 bis 50C und unter Rühren. Es wurde weitere 10 min gerührt, worauf der entstandene Niederschlag durch Zentrifugieren bei 4500 Umdr/min während 30 min bei 0 C abgetrennt wird, Von den 5 erhaltenen Fällungen wurde die erste (A), welche die unerwünschten Proteine hohen Molekulargewichts enthält, verworfen.
Die zweite und die dritte Fällung (B und C) wurden vereinigt und enthalten Arginase und andere Enzyme (welche erwünschtenfalls isoliert werden können), Auch die vierte und die fünfte Fällung (D und E), welche das mit Albumin und verschiedenen ändern Proteinen niedrigeren und höheren Molekulargewichts verunreinigte erwünschte Protein enthalten, wurden miteinander vereinigt. Die zuletzt vorliegende überstehende Flüssigkeit, welche Proteine niedrigen Molekulargewichts und weitere unerwünschte Verunreinigungen enthält, wurde verworfen. Die Fällungen D und E wurden in 0,03m Tris-Mg++-Puffer, welcher an Mg++ 0, 001molar ist und einen pH-Wert von 7, 8 besass, in einer Menge gelöst, dass eine möglichst genau 10% igue Lösung erhalten wurde, Die so erhaltene Lösung wurde gegen kalten Puffer dialysiert, bis die Reaktion auf Sulfationen negativ war.
Die dialysierte Lösung wurde durch Zentrifugieren geklärt, worauf die überstehende Flüs-
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sigkeit durch ein feinporiges Filter filtriert wurde. Das erhaltene Filtrat wurde direkt auf den Kopf einer Chro- matographiersäule (76 x 456 mm) aufgegeben, welche mit SephadexG-100 (Pharmacia, Schweden ; Kationen- austauscher auf Basis eines dreidimensional vernetzten Glucosepolymerisats) gefüllt war. Das Sephadex wurde nach den Vorschriften des Herstellers gequollen, auf einen definierten Zustand gebracht und gewaschen. Die so vorbereitete Kolonne wurde mit 0, 03m Tris- (0, 001m Mg++) -puffer von PH 7, 8 ins Gleichgewicht gebracht und auf eine Durchflussgeschwindigkeit von etwa 20 ml pro Stunde eingestellt.
Nachdem die Probe auf die Kolonne aufgegeben worden war, wurde sie innerhalb 30 bis 45 min mit den ersten 3 cm des Kunstharzbettes ins Gleichgewicht gebracht, worauf mit dem Fraktionieren begonnen wurde. Es wurden Einzelfraktionen zu je 10 ml aufgefangen. Das Auftreten der Scheitel wird durch Bestimmung der Proteinkonzentration mittels der Absorption bei 280 nm erkannt. Vor dem Auftreten des erwünschten Proteins ergaben sich zwei Scheitelwerte, die auf Albumin und andere unerwünschte Proteine ähnlichen oder höherenMolekulargewichts zurückzuführen sind. Diese Scheitelwerte zeigenden Fraktionen wurden verworfen. Das erwünschte Protein fand sich in jener Fraktion des gesamten Eluats, welche die Kubikzentimeter von 130 bis 170 umfassen. Diese Fraktionen wurden zwecks weiterer Aufarbeitung vereinigt.
Beim weiteren Eluieren der Kolonne, insbesondere beim Erhöhen der Ionenkonzentration des Puffers, flossen aus der Kolonne restliche Proteine niedrigen Molekulargewichts enthaltende Eluate ab. Die Proteine niedrigen Molekulargewichts wurden aus der Kolonne entfernt, um diese für die nächste Charge zu reinigen.
Die das erwünschte Protein enthaltenden, miteinander vereinigten Fraktionen werden gegen eine 0, 0Olmo- lare Lösung von Mg++ in entsalztem Wasser dialysiert, bis sie weniger als 10-sm Tris-Puffer enthielten. Anschliessend wurde gegen entsalztes Wasser, welches 1 bis 5. 10-3 o-Phenanthrolin oder Äthylendiamintetraessig- säuresalze enthielt, weiter dialysiert, bis die Konzentration an Mg++ auf weniger als 10-7m verringert worden war. Die erhaltene Lösung wurde durch Zentrifugieren geklärt, worauf die überstehende Flüssigkeit gefriergetrocknet wurde.
75 kg frische Rinderleber, welche 70% Wasser enthält und 22, 5 kg Trockensubstanz lieferte, ergab eine Ausbeute von etwa 200 g (1%) des das Mn++ -Chelat enthaltenden Zwischenproduktes. 200 g dieses Zwischenproduktes lieferten 17, 5 g (0, 080to) Feststoffe in Form der Fraktionen D und E. Bei Chromatographie über Sephadex wurden aus den Fraktionen D und E 2,9 g des erwünschten Protein-Metall-Chelats erhalten, was, bezogen auf Trockengewicht der Leber, einer Ausbeute von 0, 0140/0 entsprach.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines neuen wasserlöslichen Protein-Metall-Chelats, welches bei der Gel- scheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von 9, 4 als auch bei einem pH-Wert von 3, 8 in Form von knapp beieinanderliegenden Banden langsamer als Albumin, jedoch schneller als y-Globulin wandert, dadurch gekennzeichnet, dass eine Lösung (hergestellt durch Extrahieren einer natürlichen Eiweissquelle, beispielsweise Rinderleber, mit ein zweiwertiges Metallion, vorzugsweise Mn++, und gegebenenfalls einen Puffer enthaltendem Wasser in bekannter Weise,
wobei neben andern bekannten Verfahrensschritten jedenfalls ein kurzzeitiges Erhitzen einer das erwünschte Protein enthaltenden Lösung auf eine Temperatur bis höchstens 750C zwecks Abtrennens der wärmelabilsten Proteine von leichter und schwerer löslichen Stoffen vorgesehen ist), erforderlichenfalls unter Transchelatieren, zur Abtrennung von andern Proteinen, wie Albuminen oder y-Globulinen, einem oder mehreren Trennungsverfahren, die an sich bekannt sind, darunter vorzugsweise der Gelelektrophorese oder Chromatographie, unterworfen wird, wobei ein 0, 1 bis l, Olo Metalle enthaltendes Chelat isoliert wird, in welchem zumindest 65% des Metallgehaltes aus zumindest einem der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co und Cu besteht.