JPS6411640B2

JPS6411640B2 -

Info

Publication number: JPS6411640B2
Application number: JP59036369A
Authority: JP
Inventors: Hokuri Eeritsuhi
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1983-03-03
Filing date: 1984-02-29
Publication date: 1989-02-27
Also published as: KR860001150B1; KR840008290A; ZA841395B; JPS59167597A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は純粋な白血球インタフエロンおよび線
維芽細胞インタフエロンの製造方法に関する。インターフエロンとは、体に対して特異的であ
りかつ抗ウイルス活性および免疫調節活性を有す
るタンパク質の１群であると解される。抗ウイル
ス作用はウイルス自体への直接の影響ではなく、
ウイルスの感染に対する保護の意味におけるウイ
ルスの標的細胞への作用によつて達成される。イ
ンターフエロンは癌腫瘍へ客観化可能な作用を及
ぼすことができ、このためインターフエロンは癌
の治療に適当であり、そして、たとえば、インタ
ーフエロンはマクロフアージおよびNK細胞を活
性化し、そして細胞膜の種々の免疫学的に意味の
ある構成成分の発現を増強する。今日、ヒトインターフエロン（α、βおよび
γ）は、組換えDNA技術のおかげで微生物学的
方法において、最大限に努力しても天然物質（白
血球、線維芽細胞、リンパ球）からの単離および
精製によつては入手することができない量で生産
することができる。この新規な技術は、初めて、インターフエロン
の徹底的な臨床試験および可能な広い範囲の治療
学的使用のための道を開き、そして活性物質の適
切な供給はこの活性物質を用いての処置を探究す
る人々にとつて可能であるように思われる。インターフエロン−cDNAのクローニングおよ
び、ことにE.coli中の、その直接発現の詳細は、
しばらくして、多くの刊行物の主題となつた。し
かして、たとえば、組換えインターフエロンの生
産は、たとえば、次の文献から知られている：J.
Interferon Res.１（1981）、381−390（Wetzel et
al.）、Nature 284（1980）、316−320（Nagata
et al.）、Nucleic Acids Res.８（1980）、4057−
4074（Goeddel et al.）、Nucleic Acids Res.10
（1982）、2487−2501（Devos et al.）、Nature
295（1982）、503−508（Gray et al.）、ならびに
ドイツ国公開明細書31 25 706号、同第31 38 096
号および同第31 44 469号。組換えインターフエロンは、微生物源である
（たとえば、組換えインターフエロンは好ましく
はE.coliから誘導される）ので、微生物または培
地からの単離後、初め一連の微生物不純物により
なお汚染されており、それらの汚染物の存在は、
このように生産されたインターフエロンの治療学
的使用のために阻害的である。したがつて、組換
え物質の精製はとくに重要な役割を演ずる。従
来、組換えインターフエロンの精製において、多
数の異る方法、ことにクロマトグラフイーが使用
されてきており、そして互いに組合わされてきた
（たとえば、ドイツ国特許出願公開明細書第31 25
706号）。なかでも、免疫吸着剤
（immunoadsorbents）、すなわち、抗インターフ
エロン抗体を用いるクロマトグラフイーは価値あ
る助剤であることが証明された。しかして、モノ
クローナル抗体による組換えヒト白血球インター
フエロン（HuIFN−α）の精製は、たとえば、
Staehelin et al.、J.Biol.Chem.256（1981）、
9750−9754およびSecher et al.、Nature 285
（1980）、446−450に記載されている。これらの免
疫吸着剤の高い特異性に関すると、これから、こ
のように精製された物質は汚染物質を事実上含有
せず、そして高度の純度を有することを仮定しな
くてはならない。しかしながら、モノクローナル抗体により大量
の組換え白血球インターフエロンを精製する場合
において、精製された物質はインターフエロンの
断片（末端アミノ酸配列の一部分が失われたイン
ターフエロン）を含有するばかりではなく、かつ
またインターフエロンのオリゴマー、たとえば、
二量体を含有することがわかつた。これらの望ま
しくない副生物は、抗体に対する匹敵する親和性
をもつ純粋なインターフエロンの生物学的活性の
一部分を有するにすぎない。式式中、Meはコバルト、ニツケル、亜鉛または
銅を意味する、の樹脂［Nature 258（1975）、598−599（Porath
et al.）から知られている］によるヒト線維芽細
胞インターフエロンを精製する方法は、今回ヨー
ロツパ特許明細書第11435号に記載されている。
さらに、Edy et al. J.Biol.Chem.252（1977）、
5934−5935には、前述の亜鉛キレート樹脂による
HuINF−βの有効な精製が記載されている。引
き続いて、Chadha et al.、J.gen.Virol.43
（1979）、701−706は、HuINF−βの場合におい
て有効に使用される亜鉛銅キレート樹脂で
HuINF−αは精製不可能であことを示し、しか
してEdy et al.（loc.cit.）により前になされた観
測を確証した。本発明により、組換え白血球インタフエロンま
たは線維芽細胞インタフエロンの精製がPorath
et al.に記載されている金属キレート樹脂の代わ
りに、式式中、Meは銅またはニツケルを意味する、の樹脂を使用することにより実施できることが、
今回発見された。前記樹脂は、原理的には、
Porath et al.の樹脂に構造的に類似するが、ア
ガロースマトリツクスとイミノ二酢酸基との間の
距離が短いことによつてPorath et al.の樹脂と
区別される。この樹脂およびその製造方法は、た
とえば、J.Chromatography 198（1980）、247
−255（HuberおよびPorath）からすでに知られ
ている。しかしながら、著者らはオリゴヌクレオ
チドおよびポリヌクレオチドの分別についての実
用性をもつぱら記載している。オリゴヌクレオチ
ドおよびポリヌクレオチドは、インターフエロン
と大きく異なる化合物の部類であるので、本発明
における組換えインターフエロンの精製、ことに
相同の（homologous）配列断片およびそれに関
連するオリゴマーからの組換え白血球インタフエ
ロンおよび線維芽細胞インタフエロンの分離に際
しての現存する問題の解決に前記樹脂を使用する
ことは当業者にとつて明らかな方法ではなかつ
た。したがつて、本発明は、予備精製されたインタ
ーフエロン溶液を、次の構造式式中、Meは銅またはニツケルを意味する、の金属キレート樹脂と接触させ、そして負荷され
た前記樹脂を洗浄用液体で処理することにより、
前記インターフエロンを純粋な形態で溶離するこ
とからなる、純すいな組換え白血球インタフエロ
ンまたは線維芽細胞インタフエロンの製造方法に
関する。本発明に従い使用可能な金属キレート樹脂は、
既知の方法、たとえば、HubertおよびPorath、
J.Chromatog.198（1980）、247に記載する方法に
おいて、アガロースをエピクロロヒドリンで処理
し、生ずるエポキシドをイミノ二酢酸二ナトリウ
ム塩と反応させ、そしてこの生成物を銅（）塩
またはニツケル塩、たとえば、硫酸銅または塩化
ニツケルで洗浄して銅塩またはニツケル塩に転化
することにより製造することができる。エピブロ
モヒドリンをエピクロロヒドリンの代わりに使用
できる。アガロースとして、標準化された製品、
好ましくはセフアロース（Sepharose ）
（Pharmcia、スウエーデン、ウプサラ）が便利に
使用される。セフアロース 4Bがことに好まし
い。セフアロースはアガロースゲルでできた顆粒
である。適当な銅の製造を以後に詳述する。１のアガロースゲル（Sepharose 4B、
Pharmcia）をガラスフリツト上で各回１の水
で２回洗浄し、４容の反応器に移し、そして水
で体積を1000mlにした。150mlの4NのNaOHおよ
び40mlのエピクロロヒドリンを添加した後、この
混合物を30℃で５時間かきまぜた。この活性化さ
れた樹脂をガラスフリツト上で中性になるまで水
洗し、650mlの水性2NのNa₂CO₃溶液で処理し、
そして水で体積を2000mlにした。次いで、100ｇ
のイミノ二酢酸ナトリウム塩を添加し、そしてこ
の混合物を65℃で20時間かきまぜた。この樹脂を
引き続いてカラム中で順次に、各場合、200mlの
水、水性CuSO₄・5H₂O（0.5重量％）、水、0.2M
の酢酸（0.2MのNaCl、0.1重量／容量％の
Tween20）および水で洗浄した。銅イオン濃度
は約９ミクロモル／mlの樹脂になつた。インターフエロンを負荷する前に、金属キレー
トのカラムで便利には水性緩衝液（PH約５〜８）
で平衡化する。この緩衝液はそれ自体銅またはニ
ツケルとキレートを形成せず、好ましくはリン酸
塩緩衝液PH７である。平衡化緩衝液（およびまた
溶離緩衝液）は、安定剤または乳化剤、たとえ
ば、ポリオキシエチレン−脂肪族アルコールエー
テル型、ポリオキシソルビタン−脂肪酸エステル
型またはトリトン（Triton）の安定剤または乳
化剤を含有することができる。このような安定剤
の添加は、高いインターフエロン濃度においてさ
え、問題を生じない手順を提供する。金属キレート樹脂は、同様な方法においてニツ
ケル塩（たとえば、NiCl₂）を使用して製造する
ことができる。溶離は、それ自体既知の方法において、銅また
はニツケルとキレートを形成しない水性緩衝液、
好ましくはリン酸塩または酢酸塩の緩衝液を用い
て実施する、ここでインターフエロンの断片、イ
ンターフエロンのモノマーおよびオリゴマーの保
持はPH値およびイオン強度の関数である。PH値を
低下しかつイオン強度を増加すると、まずインタ
ーフエロン断片が溶離され、次いでモノマーのイ
ンターフエロンが溶離され、最後に、たとえば、
希酢酸で、オリゴマーが溶離される。ある限界、
これは当業者にとつて自明である、の範囲内で、
溶離用緩衝液のイオン強度を高くすると、そのPH
値も高くなることがある。緩衝液のイオン強度
は、NaClのような中性塩の添加により増加させ
ることができる。断片およびオリゴマーを含有す
るインターフエロン溶液のPH値を、たとえば、PH
約５、に適当に調整することにより、モノマーお
よびオリゴマーのみが吸着され、一方断片は流過
する。溶離は一定のPH値において、あるいは直線的に
または不連続に低下するPH勾配を用いて実施する
ことができる。最適な溶離条件は存在する不純物
の量および種類、精製すべき物質の量、カラムの
寸法などに依存し、そして場合に応じて便利に決
定される。溶離用緩衝液が安定剤を含有する場合、安定剤
は溶離液を適当な担体、たとえば、セルロースを
用いるクロマトグラフイーに付すことより除去す
ることができる。本発明に従つて精製されるイン
ターフエロンは、最後にポリエチレングリコー
ル／水から結晶化することができる。白血球インターフエロンの精製は好ましくは銅
キレートカラムで実施し、そして線維芽細胞イン
ターフエロンの精製は好ましくはニツケルキレー
トカラムで実施する。次の実施例により、本発明の方法をさらに説明
する。出発物質として使用した組換え白血球ヒトイン
ターフエロン（rIFN−αA）は、Staehelin et
al.、J.Bilol.Chem.256（1981）、9750−9754に記
載されている方法に従いモノクローナル抗体で精
製することにより得た。 Goeddel et al.、Nucleic Acids Res.８、4057
−4074（1980）に従つて調製し、出発物質として
使用した、ヒト線維芽細胞インターフエロン
（rINF−β）を、Friesen et al.、Arch.
Biochem.Biophys.206、432−450（1981）の方法
に従い不動化されたトリアジン着色物質（たとえ
ば、Blue−Sepharose CL−6B 、Pharmacia
またはBlue Trisacryl Ｍ LKB）上でのクロ
マトグラフイーにより予備精製した。タンパク質含量の定量は、Lowry et al.、J.
Biol.Chem.193（1951）、265−275の方法に従い
標準としてアルブミンを使用して実施した。不純物（断片またはオリゴマー）の定量は、
Laemmli et al.、Nature 277（1970）、680−
685に記載されているようにSDS−PAGEにより
実施し、ただし電気泳動は非還元性条件（すなわ
ち、試料に２−メルカプトエタノールを添加しな
い）のもとに実施するように変更した。実施例１銅キレートカラム（169ml、５×8.5cm）を500
mlのリン酸塩緩衝液（0.05M、PH7.0、0.1重量／
容量％のツイーン20）で平衡化した。このカラム
にStaehelin et al.（前記引用文献）に従い得たモ
ノクローナルrINF−αA−抗体のカラムからの
1480mlの溶離液を４℃で負荷した。この溶離液
は、0.28mg／mlのタンパク質（23.5重量％に15kd
のインターフエロン断片で汚染されていた）を含
有しかつ4NのNaOHでPH７に調整されていた。
このカラムを、順次に、300mlの平衡化用緩衝液、
300mlの0.2のNaClをさらに含有する平衡用緩衝
液、および300mlの0.05Mの酢酸塩緩衝液PH5.6
（0.2MのNaClおよび0.1％のツイーン20を含有し
た）で洗浄した。インターフエロン断片をまず
0.05Mの酢酸塩緩衝液（0.2MのNaClおよび0.1％
のツイーン20を含有する）で5.6から4.0に低下す
るPH勾配において溶離した。次いで、256mgのモ
ノマーのインターフエロン（純度＞95％）を同一
の酢酸塩緩衝液、PH4.0で溶離した。 0.1重量／容量％のツイーンを含有するモノマ
ーのインターフエロンの溶液を、CM52セルロー
スカラムのクロマトグラフイーに付し、0.1Mの
酢酸アンモニウム緩衝液（PH５）で溶離して安定
剤を除去した。実施例２実施例１と同一の平衡化した銅キレートカラム
に、Staehelin et al.（前記引用文献）に従い得た
モノクローナルrINF−αA−抗体のカラムからの
2168mlの溶離液を４℃で負荷した。この溶離液
は、0.33mg／mlのタンパク質（27重量％に15kdの
インターフエロン断片で汚染されていた）を含有
しかつ4NのNaOHでPH4.5に調整されていた。次
いで、このカラムを0.05Mの酢酸塩緩衝液（PH
5.6；0.2MのNaClおよび0.1％のツイーン20を含
有した）で洗浄した。これらの条件のもとで、全
体の18.5kdのrINF−αAのみが吸着されたが、
15Kdの断片は吸着されず、引き続いて0.05Mの
酢酸塩緩衝液（PH４；0.2MのNaClおよび0.1％の
ツイーン20）で溶離した。402mgのインターフエ
ロン、純度＞95％が得られた。実施例３実施例１と同一の平衡化した銅キレートカラム
に、Staehelin et al.（前記引用文献）に従い得た
モノクローナルrINF−αA−抗体のカラムからの
1260mlの溶離液を４℃で負荷した。この溶離液
は、0.5mg／mlのタンパク質（34重量％にインタ
ーフエロンのオリゴマー；37kdのダイマー、55.5
Kgのトリマーおよび74kdのテトラマーで汚染さ
れていた）を含有しかつ4NのNaOHでPH７に調
整されていた。このカラムを初め300mlの0.05M
のリン酸塩緩衝液（PH７；0.1％のツイーン20）
で洗浄し、引き続いて0.05Mの酢酸塩塩緩衝液
（PH4.7；0.2MのNaClおよび0.1％のツイーン20を
含有した）で溶離し、95％の純度のモノマーのイ
ンターフエロンが得られた。150mgの二量体のイ
ンターフエロンは0.05MのPH4.0の酢酸塩緩衝液
（0.2MのNaClおよび0.1％のツイーン20）で溶離
され、そしてより高いオリゴマーは0.2Mの酢酸
（0.2MのNaClおよび0.1％のツイーン20を含有し
た）で溶離された。実施例４銅キレートカラム（295ml、５×15cm）を600ml
（0.05M、PH７、0.1％のツイーン20）で平衡化し
た。このカラムを、Staehelin et al.（前記引用文
献）に従い得たモノクローナルrINF−αA−抗体
のカラムからの3200mlの溶離液を４℃で負荷し
た。この溶離液は0.33mg／mlのタンパク質（24重
量％に15kdのインターフエロンの断片でおよび
11重量％のインターフエロンのオリゴマーで汚染
されていた）を含有した。15kdの断片は0.005M
の酢酸塩緩衝液（PH４；0.25MのNaClおよび0.1
％のツイーン20）で洗浄除去した。モノマーのイ
ンターフエロンを0.25Mの酢酸塩緩衝液（PH
3.4；0.25MのNaClおよび0.1％のツイーン20）で
溶離し、＞95％の純度の合計470mgが得られた。実施例５銅キレートカラム（1000ml、10×13cm）を2500
mlのリン酸塩緩衝液（0.05M、PH５、0.2Mの
NaCl、0.1％のツイーン20）で平衡化し、そして
このカラムにStaehelin et al.（前記引用文献）に
従い得たモノクローナルrINF−αA−抗体のカラ
ムからの10000mlの溶離液を４℃で負荷した。こ
の溶離液は、0.21mg／mlのタンパク質（３重量％
15kdのインターフエロン断片および７重量％に
15kdのインターフエロンのオリゴマーで汚染さ
れていた）を含有しかつ6NのNaOHでPH７に調
整されていた。この断片を平衡化用緩衝液の洗浄
により除去した。1700mgのモノマーのインターフ
エロン（純度＞95％）は、0.05Mの酢酸塩緩衝液
（PH4.5；0.25MのNaClおよび0.1％のツイーン20）
で溶離された。オリゴマーは0.2Mの酢酸（0.2M
のNaClおよび0.1％のツイーン20）で溶離するこ
とにより得られた。0.1重量／容量％のツイーン
を濃縮しかつ除去するため、モノマーのインター
フエロンの溶液をCM52セルロースカラムのクロ
マトグラフイーに付し、0.1Mの酢酸アンモニウ
ム緩衝液（PH５）で溶離した。 48.7mlのポリエチレングリコール4000（0.3ｇ／
ml）の水溶液を、ゆつくり４℃においてわずかに
かきまぜながら、４mg／mlのタンパク質を含有す
るセルロースカラムからの195mlの溶離液に添加
した。約５時間後、最初の結晶が形成し、これを
冷時に３日後に遠心により上澄みから分離し、冷
たい水性ポリエチレングリコール4000（0.3ｇ／
ml）で洗浄し、そして減圧乾燥した。収量：520
mg。数個の結晶を0.1Mの酢酸アンモニウム緩衝
液（PH５）中に溶解して得られた試料のゲル電気
永動および生物検定により、得られた結晶は無傷
のrINF−αAであることが立証された。実施例６銅イオンを銅キレートカラム（20ml、1.6×６
cm）から20mlのエチレンジアミン四酢酸二ナトリ
ウム塩の水溶液で、次いで100mlの水で洗浄除去
した。このカラムを引き続いて順次に各場合36ml
の0.05MのNiCl₂の水溶液、水、0.05Mの酢酸
（0.5、ＭのNaClを含有した）で洗浄した。このようにして得られたニツケルキレートカラ
ムを36mlのリン酸塩緩衝液（0.05M、PH7.2、10
重量／容量％のエチレングリコール、0.2Mの
NaCl）で平衡化した。Goeddl et al.、（前記引
用文献）に従い得られたブルーセフアロース
（Blue−Sepharose ）カラムからの38mlの溶離
液は、0.12mg／mlのタンパク質を含有し、これを
152mlのリン酸塩緩衝液（0.05M、PH7.2）で希釈
し、４℃においてニツケルキレートカラムに添加
した。このカラムを72mlの酢酸塩緩衝液
（0.05M、PH7.2、10重量／容量％のプロピレング
リコールおよび0.2MのNaCl）で洗浄し、次いで
酢酸塩緩衝液（0.05M、PH3.5、10重量／容量％
のプロピレングリコールおよび0.3MのNaCl）で
溶離した。3.75ｇ純粋な（純度＞95％）の線維芽
細胞インターフエロンが得られた。このカラムを
0.05Mの酢酸（0.5MのNaClを含有した）で洗浄
し、そしてこのカラムは再使用できる状態であつ
た。例７上記例１〜６に記載の銅キレートカラムおよび
同容量の、α−インタフエロン溶液およびβ−イ
ンタフエロン溶液を用いて、同様の処理条件下に
インタフエロンを製造した。結果を次表に示す。
インタフエロン活性はRubinstein等によりJ.
Virol.37、755頁（1981年）に記載された細胞変
性効果阻害検定法により測定し、そしてIFN−β
濃度はH.GallatiによりJ.Clin.Chem.Clin.
Biochem.20、907〜914頁（1982年）に記載され
たEIA試験法により測定した。【表】【表】これらの結果は前述した従来技術〔たとえば
Chadha等によるJ.gen.Virol.43、（1979年）、701
〜706頁〕に比較して、本発明による方法がこれ
らのインタフエロンを81〜95％の高収率で製造で
きることを示している。

Claims

【特許請求の範囲】１予備精製された組換え白血球インタフエロン
または線維芽細胞インタフエロン溶液を、式（式中、Meは銅またはニツケルを意味する）の金属キレート樹脂と接触させ、そして負荷され
た前記樹脂を洗浄用液体で処理することにより、
前記インタフエロンを純粋な形態で溶離すること
を特徴とする純粋な組換え白血球インタフエロン
または線維芽細胞インタフエロンの製造方法。２金属キレート樹脂が銅キレート樹脂である特
許請求の範囲第１項記載の方法。３金属キレート樹脂がニツケルキレート樹脂で
ある特許請求の範囲第１項記載の方法。４アガロースがセフアロース 4Bである特許
請求の範囲第１項記載の方法。５溶離を勾配溶離により行う特許請求の範囲第
１項記載の方法。６前記溶離を5.6から4.0に低下するPH勾配を用
いて行う特許請求の範囲第５項記載の方法。７溶離をPH3.5の酢酸塩緩衝液を用いて行う特
許請求の範囲第５項記載の方法。