JPS641117B2 - - Google Patents
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- JPS641117B2 JPS641117B2 JP54097847A JP9784779A JPS641117B2 JP S641117 B2 JPS641117 B2 JP S641117B2 JP 54097847 A JP54097847 A JP 54097847A JP 9784779 A JP9784779 A JP 9784779A JP S641117 B2 JPS641117 B2 JP S641117B2
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明はヒト由来細胞から誘発・産生されたイ
ンターフエロンを工業的規模において回収する方
法に関するものである。 インターフエロンはウイルスその他の物質の刺
激によりヒトを含む動物細胞から産生されるある
種の糖蛋白質である。このものはウイルスや細菌
又は原虫の細胞内増殖を阻止する機能をもつてい
るが、この機能は動物種に特異的であることか
ら、医薬としてヒトに用いる場合はヒトの細胞か
ら産生されたインターフエロンを得る必要があ
る。ヒトのインターフエロンを大量に得るために
は、ヒトリンパ球、ヒト繊維芽細胞又はヒト株化
リンパ芽球等を大量に集め、これらの細胞に適当
な刺激を与えてインターフエロンを産生させ、こ
の産生されたインターフエロンを収率よく回収し
なければならない。しかし従来の回収法は複雑な
操作と長い時間を要しており、工業的規模で行う
には不適なだけでなく、収率も低いという欠点が
あつた。 発明者は長年にわたつてインターフエロンを簡
易な操作で収率よく回収する方法を研究し、ベン
トナイトや酸性白土などのケイ酸を含有する組成
物がインターフエロンを特異的に吸着することを
見出し、さらにこの吸着体からインターフエロン
を溶出させる研究を続け、水溶性多糖類を含有す
る水溶液を用いるとインターフエロンが吸着体か
ら特異的に溶出されることを見出し、これらの新
しい知見に基づいて本発明を完成し、インターフ
エロンを工業的規模において簡易な操作で収率よ
く回収することに成功した。 本発明はヒト由来細胞から誘発・産生されたイ
ンターフエロンを含む水溶液とケイ酸(SiO2)
を含有する組成物を接触させてこの組成物にイン
ターフエロンを吸着させ、吸着されたインターフ
エロンを水溶性多糖類を含有する水溶液により溶
出させるのである。 本発明におけるヒト由来細胞としては白血球、
リンパ球、腹腔、肺、脾等の細胞のような網内系
細胞、培養ヒトリンパ芽球様細胞等あらゆる公知
のインターフエロン産生細胞を利用できるが、好
ましいものは産生能等の点からヒト白血球および
培養ヒトリンパ芽球様細胞であり、培養ヒトリン
パ芽球様細胞としては特にナマルバ
(Namalwa)株が好ましい。ナマルバ株は20種
のバーキツトリンパ腫および白血病患者由来の株
化リンパ球の中から選出された株化細胞であり、
現在この細胞はインターフエロンを最もよく産生
する細胞として知られている(Intern.J.Cancer
第11巻、327号、1973年およびJ.Clinical
Microbiol.第1巻、第1号、1975年)。 ケイ酸(SiO2)を含有する組成物としてはベ
ントナイト、酸性白土、カオリン、ケイ酸アルミ
ン酸マグネシウムおよびこれらに相応する化合物
が使用できる。ケイ酸を含有する組成物の使用濃
度は0.001〜2.0w/v%の範囲であり、通常は
0.01〜1.0w/v%の濃度で使用する。ケイ酸含有
組成物とインターフエロンを含む水溶液の接触
は、通常はバツチ式操作によりケイ酸含有組成物
をインターフエロン水溶液に添加する。この接触
はPH5〜9で行うのが有利であり、温度は室温で
よく、接触時間は1〜5時間であり、撹拌するの
が有利である。このような接触操作によりインタ
ーフエロンはケイ酸含有組成物に吸着され、その
吸着は極めて特異的である。 吸着されたインターフエロンの溶出はその水溶
液とケイ酸含有組成物を分離し、この組成物を洗
浄したのち水溶性多糖類を含有する水溶液によつ
ておこなう。この水溶液のPHは1.5〜9.0に調整さ
れていることが好ましく、その濃度は通常0.001
〜2.0w/v%である。水溶性多糖類としてはヘ
パリン、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫
酸、セルロース硫酸、カルボキシメチルセルロー
ス、ヒドロキシエチルスターチ、シバクロンブル
ーF3GA結合デキストランが例示され、このよう
な水溶性多糖類を用いることによりインターフエ
ロンは特異的に溶出される。 溶出されたインターフエロンは粗精製されたも
のを出発物質とした場合はそのまゝ又は安定剤を
加えて脱塩透析し、除菌過し、分注したのち凍
結乾燥を行つて乾燥製剤とし、原料段階を出発物
質とした場合は脱塩、透析、濃縮等の処理を行つ
て粗精製し、次に公知の精製法を行つて高純度に
精製したのち製剤処理を行つて乾燥製剤とする。
本発明に組合せる精製法を例示すると、エタノー
ル分画法(Tissue Culture Association:In
Proceedings of a Tissue Culture
Association Work Shop In Vitro論文3号、
1973年)、弱酸性および弱塩基性イオン交換体を
用いるカラムクロマトグラフイーとゲル過を組
み合せた精製方法(特公昭51―34442号)、塩化ア
ンモニウムあるいはデキストランを用いた精製法
〔Ann.Med.Exp.Fenn.44,265〜273,1966,およ
び同45,20〜29(1967)〕、強酸性陽イオン交換体
による分画法(特願昭52―156019号:出願人 株
式会社ミドリ十字)等である。 本発明に係るインターフエロンの回収率は50%
を越えるから回収率において従来法よりも優れて
いるし、回収操作はインターフエロン水溶液とケ
イ酸含有組成物との接触及び水溶性多糖類水溶液
によるインターフエロンの溶出であり、これらの
操作はいずれも簡易であつて作業工程を大巾に簡
略化できるから、工業的規模におけるインターフ
エロンの製法として極めて好適である。 次に本発明の実験例および実施例を説明する
が、本発明はこれらの実験例、実施例に限定され
るものではない。又実験例や実施例におけるイン
ターフエロンの活性は、ヴエシクラー・ストマテ
イテイス・ウイルス(Vesicular stomatitis
virus)とヒト羊膜由来のFL細胞を用い、50%プ
ラツク減少法により測定した。インターフエロン
の力価は被検試料と同時に測定したスタンダー
ド・インターフエロンの力価より国際単位(IU)
に換算した(最新医薬29(4)660、1974)。 実験例 ヒト静脈由来のリンパ球の培養系から得た粗製
インターフエロン液5(比活性3000IU/mg蛋
白)を用いてインターフエロンの吸着材料及び溶
出条件の実験を行つた。用いた吸着材料及び溶出
条件は第1表の通りである。この実験は粗製イン
ターフエロン液を遠心分離して上清を集め、これ
に各種吸着剤を1w/v%の割合で添加し、室温
で約2時間撹拌したのち、遠心分離して吸着剤を
回収した。この吸着剤を洗浄したのち、各種溶出
液にてインターフエロンを溶出させた。インター
フエロンを含む溶出液を透析し、濃縮したのちそ
の活性を測定して回収率を計算した。その結果水
溶性多糖類を含有する溶出液は著明な効果を示し
た。
ンターフエロンを工業的規模において回収する方
法に関するものである。 インターフエロンはウイルスその他の物質の刺
激によりヒトを含む動物細胞から産生されるある
種の糖蛋白質である。このものはウイルスや細菌
又は原虫の細胞内増殖を阻止する機能をもつてい
るが、この機能は動物種に特異的であることか
ら、医薬としてヒトに用いる場合はヒトの細胞か
ら産生されたインターフエロンを得る必要があ
る。ヒトのインターフエロンを大量に得るために
は、ヒトリンパ球、ヒト繊維芽細胞又はヒト株化
リンパ芽球等を大量に集め、これらの細胞に適当
な刺激を与えてインターフエロンを産生させ、こ
の産生されたインターフエロンを収率よく回収し
なければならない。しかし従来の回収法は複雑な
操作と長い時間を要しており、工業的規模で行う
には不適なだけでなく、収率も低いという欠点が
あつた。 発明者は長年にわたつてインターフエロンを簡
易な操作で収率よく回収する方法を研究し、ベン
トナイトや酸性白土などのケイ酸を含有する組成
物がインターフエロンを特異的に吸着することを
見出し、さらにこの吸着体からインターフエロン
を溶出させる研究を続け、水溶性多糖類を含有す
る水溶液を用いるとインターフエロンが吸着体か
ら特異的に溶出されることを見出し、これらの新
しい知見に基づいて本発明を完成し、インターフ
エロンを工業的規模において簡易な操作で収率よ
く回収することに成功した。 本発明はヒト由来細胞から誘発・産生されたイ
ンターフエロンを含む水溶液とケイ酸(SiO2)
を含有する組成物を接触させてこの組成物にイン
ターフエロンを吸着させ、吸着されたインターフ
エロンを水溶性多糖類を含有する水溶液により溶
出させるのである。 本発明におけるヒト由来細胞としては白血球、
リンパ球、腹腔、肺、脾等の細胞のような網内系
細胞、培養ヒトリンパ芽球様細胞等あらゆる公知
のインターフエロン産生細胞を利用できるが、好
ましいものは産生能等の点からヒト白血球および
培養ヒトリンパ芽球様細胞であり、培養ヒトリン
パ芽球様細胞としては特にナマルバ
(Namalwa)株が好ましい。ナマルバ株は20種
のバーキツトリンパ腫および白血病患者由来の株
化リンパ球の中から選出された株化細胞であり、
現在この細胞はインターフエロンを最もよく産生
する細胞として知られている(Intern.J.Cancer
第11巻、327号、1973年およびJ.Clinical
Microbiol.第1巻、第1号、1975年)。 ケイ酸(SiO2)を含有する組成物としてはベ
ントナイト、酸性白土、カオリン、ケイ酸アルミ
ン酸マグネシウムおよびこれらに相応する化合物
が使用できる。ケイ酸を含有する組成物の使用濃
度は0.001〜2.0w/v%の範囲であり、通常は
0.01〜1.0w/v%の濃度で使用する。ケイ酸含有
組成物とインターフエロンを含む水溶液の接触
は、通常はバツチ式操作によりケイ酸含有組成物
をインターフエロン水溶液に添加する。この接触
はPH5〜9で行うのが有利であり、温度は室温で
よく、接触時間は1〜5時間であり、撹拌するの
が有利である。このような接触操作によりインタ
ーフエロンはケイ酸含有組成物に吸着され、その
吸着は極めて特異的である。 吸着されたインターフエロンの溶出はその水溶
液とケイ酸含有組成物を分離し、この組成物を洗
浄したのち水溶性多糖類を含有する水溶液によつ
ておこなう。この水溶液のPHは1.5〜9.0に調整さ
れていることが好ましく、その濃度は通常0.001
〜2.0w/v%である。水溶性多糖類としてはヘ
パリン、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫
酸、セルロース硫酸、カルボキシメチルセルロー
ス、ヒドロキシエチルスターチ、シバクロンブル
ーF3GA結合デキストランが例示され、このよう
な水溶性多糖類を用いることによりインターフエ
ロンは特異的に溶出される。 溶出されたインターフエロンは粗精製されたも
のを出発物質とした場合はそのまゝ又は安定剤を
加えて脱塩透析し、除菌過し、分注したのち凍
結乾燥を行つて乾燥製剤とし、原料段階を出発物
質とした場合は脱塩、透析、濃縮等の処理を行つ
て粗精製し、次に公知の精製法を行つて高純度に
精製したのち製剤処理を行つて乾燥製剤とする。
本発明に組合せる精製法を例示すると、エタノー
ル分画法(Tissue Culture Association:In
Proceedings of a Tissue Culture
Association Work Shop In Vitro論文3号、
1973年)、弱酸性および弱塩基性イオン交換体を
用いるカラムクロマトグラフイーとゲル過を組
み合せた精製方法(特公昭51―34442号)、塩化ア
ンモニウムあるいはデキストランを用いた精製法
〔Ann.Med.Exp.Fenn.44,265〜273,1966,およ
び同45,20〜29(1967)〕、強酸性陽イオン交換体
による分画法(特願昭52―156019号:出願人 株
式会社ミドリ十字)等である。 本発明に係るインターフエロンの回収率は50%
を越えるから回収率において従来法よりも優れて
いるし、回収操作はインターフエロン水溶液とケ
イ酸含有組成物との接触及び水溶性多糖類水溶液
によるインターフエロンの溶出であり、これらの
操作はいずれも簡易であつて作業工程を大巾に簡
略化できるから、工業的規模におけるインターフ
エロンの製法として極めて好適である。 次に本発明の実験例および実施例を説明する
が、本発明はこれらの実験例、実施例に限定され
るものではない。又実験例や実施例におけるイン
ターフエロンの活性は、ヴエシクラー・ストマテ
イテイス・ウイルス(Vesicular stomatitis
virus)とヒト羊膜由来のFL細胞を用い、50%プ
ラツク減少法により測定した。インターフエロン
の力価は被検試料と同時に測定したスタンダー
ド・インターフエロンの力価より国際単位(IU)
に換算した(最新医薬29(4)660、1974)。 実験例 ヒト静脈由来のリンパ球の培養系から得た粗製
インターフエロン液5(比活性3000IU/mg蛋
白)を用いてインターフエロンの吸着材料及び溶
出条件の実験を行つた。用いた吸着材料及び溶出
条件は第1表の通りである。この実験は粗製イン
ターフエロン液を遠心分離して上清を集め、これ
に各種吸着剤を1w/v%の割合で添加し、室温
で約2時間撹拌したのち、遠心分離して吸着剤を
回収した。この吸着剤を洗浄したのち、各種溶出
液にてインターフエロンを溶出させた。インター
フエロンを含む溶出液を透析し、濃縮したのちそ
の活性を測定して回収率を計算した。その結果水
溶性多糖類を含有する溶出液は著明な効果を示し
た。
【表】
実施例 1
ヒト静脈由来のリンパ球をヒトアルブミン0.25
%添加MEM培地で培養し、センダイウイルスに
よりインターフエロンを産生させ、その後塩酸に
よりPH2に調整してインデユーサーとして用いた
センダイウイルスを不活化し、この粗製インター
フエロン液を遠心分離して上清を集めた。 この上清1にベントナイト1.0gを添加して
室温で2時間撹拌し、インターフエロンをベント
ナイトに吸着させた。このベントナイトを遠心分
離して集め、1%硫安液を用いて3回懸濁、遠心
を繰返し、その都度ベントナイトを洗浄して不純
物質を除去した。洗浄したベントナイトにヘパリ
ンナトリウム0.5w/v%液を10ml加え、INの塩
酸でPH2.5に修正し、室温にて1時間撹拌しつつ
インターフエロンを溶出させた。この溶出操作を
3回行つて溶出液を合わせ、溶出液の総量を
0.05Mトリスバツフアー(PH7.2)により透析し
て精製インターフエロンを得た。回収率は出発培
養液の粗製インターフエロン活性を100%として
57%であり、精製度は1000倍であつた。 精製インターフエロンの濃縮液を除菌過し、
分注し、凍結乾燥を行つて乾燥製剤とした。この
製剤をマウスおよびウサギに100万IU/Kg投与し
て7日間観察を行つたが、体重の増加、減少、立
毛等の異常は認められなかつた。 実施例 2 株化ヒトリンパ芽球にセンダイウイルスをかけ
てインターフエロンを産生させ、その後センダイ
ウイルスを不活性化し、インターフエロンを含有
する培養液を得た。この培養液20にベントナイ
トを0.1%濃度に加えて室温で1時間撹拌し、イ
ンターフエロンをベントナイトへ吸着させた。こ
のベントナイトを遠心分離して集め、1Mの塩化
ナトリウム液約2を用いてベントナイトを洗浄
し不純物質を除去した。 この洗浄したベントナイトにコンドロイチン硫
酸1%溶液200mlを加え、1Nの塩酸でPH2.5に修
正し、室温にて1時間撹拌しつつインターフエロ
ンを溶出させた。この溶出操作を2回行つて溶出
液を合わせ溶出液の総量を0.9%塩化ナトリウム
液により透析して精製インターフエロンを得た。
回収率は出発培養液の粗製インターフエロン活性
を100%として70%であり、精製度は760倍であつ
た。 このものの乾燥製剤をマウスおよびウサギにつ
いて実施例1と同じ実験を行つたが異常は認めら
れなかつた。 実施例 3 実施例1で得たインターフエロンを含有する上
清20に酸性白土10gを加え、4℃で2時間撹拌
してインターフエロンを酸性白土に吸着させた。
この酸性白土を遠心分離して集め、PH7.0の1%
イミダゾール液1を用いて酸性白土を洗浄して
不純物質を除去した。洗浄した酸性白土にデキス
トラン硫酸の1%溶液200mlを加え、1Nの塩酸で
PH3.0に修正し、室温にて1時間撹拌しつつイン
ターフエロンを溶出させた。この溶出操作を2回
行つて溶出液を合わせ、溶出液の総量を0.05%プ
ルロニツクF86(Wyandotte Chem.Corp.)を含
有する0.02Mトリスバツフアー(PH7.2)により
透析して精製インターフエロンを得た。回収率は
出発培養液の粗製インターフエロン活性を100%
とした85%であり、精製度は700倍であつた。 このものの乾燥製剤をマウスおよびウサギにつ
いて実施例1と同じ実験を行つたが、異常は認め
られなかつた。
%添加MEM培地で培養し、センダイウイルスに
よりインターフエロンを産生させ、その後塩酸に
よりPH2に調整してインデユーサーとして用いた
センダイウイルスを不活化し、この粗製インター
フエロン液を遠心分離して上清を集めた。 この上清1にベントナイト1.0gを添加して
室温で2時間撹拌し、インターフエロンをベント
ナイトに吸着させた。このベントナイトを遠心分
離して集め、1%硫安液を用いて3回懸濁、遠心
を繰返し、その都度ベントナイトを洗浄して不純
物質を除去した。洗浄したベントナイトにヘパリ
ンナトリウム0.5w/v%液を10ml加え、INの塩
酸でPH2.5に修正し、室温にて1時間撹拌しつつ
インターフエロンを溶出させた。この溶出操作を
3回行つて溶出液を合わせ、溶出液の総量を
0.05Mトリスバツフアー(PH7.2)により透析し
て精製インターフエロンを得た。回収率は出発培
養液の粗製インターフエロン活性を100%として
57%であり、精製度は1000倍であつた。 精製インターフエロンの濃縮液を除菌過し、
分注し、凍結乾燥を行つて乾燥製剤とした。この
製剤をマウスおよびウサギに100万IU/Kg投与し
て7日間観察を行つたが、体重の増加、減少、立
毛等の異常は認められなかつた。 実施例 2 株化ヒトリンパ芽球にセンダイウイルスをかけ
てインターフエロンを産生させ、その後センダイ
ウイルスを不活性化し、インターフエロンを含有
する培養液を得た。この培養液20にベントナイ
トを0.1%濃度に加えて室温で1時間撹拌し、イ
ンターフエロンをベントナイトへ吸着させた。こ
のベントナイトを遠心分離して集め、1Mの塩化
ナトリウム液約2を用いてベントナイトを洗浄
し不純物質を除去した。 この洗浄したベントナイトにコンドロイチン硫
酸1%溶液200mlを加え、1Nの塩酸でPH2.5に修
正し、室温にて1時間撹拌しつつインターフエロ
ンを溶出させた。この溶出操作を2回行つて溶出
液を合わせ溶出液の総量を0.9%塩化ナトリウム
液により透析して精製インターフエロンを得た。
回収率は出発培養液の粗製インターフエロン活性
を100%として70%であり、精製度は760倍であつ
た。 このものの乾燥製剤をマウスおよびウサギにつ
いて実施例1と同じ実験を行つたが異常は認めら
れなかつた。 実施例 3 実施例1で得たインターフエロンを含有する上
清20に酸性白土10gを加え、4℃で2時間撹拌
してインターフエロンを酸性白土に吸着させた。
この酸性白土を遠心分離して集め、PH7.0の1%
イミダゾール液1を用いて酸性白土を洗浄して
不純物質を除去した。洗浄した酸性白土にデキス
トラン硫酸の1%溶液200mlを加え、1Nの塩酸で
PH3.0に修正し、室温にて1時間撹拌しつつイン
ターフエロンを溶出させた。この溶出操作を2回
行つて溶出液を合わせ、溶出液の総量を0.05%プ
ルロニツクF86(Wyandotte Chem.Corp.)を含
有する0.02Mトリスバツフアー(PH7.2)により
透析して精製インターフエロンを得た。回収率は
出発培養液の粗製インターフエロン活性を100%
とした85%であり、精製度は700倍であつた。 このものの乾燥製剤をマウスおよびウサギにつ
いて実施例1と同じ実験を行つたが、異常は認め
られなかつた。
Claims (1)
- 1 ヒト由来細胞から誘発・産生されたインター
フエロンを含む水溶液とケイ酸(SiO2)を含有
する組成物を接触させてこの組成物にインターフ
エロンを吸着させ、吸着されたインターフエロン
を水溶性多糖類を含有する水溶液により溶出させ
ることを特徴とするインターフエロンの回収法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9784779A JPS5620519A (en) | 1979-07-30 | 1979-07-30 | Recovery of interferon |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9784779A JPS5620519A (en) | 1979-07-30 | 1979-07-30 | Recovery of interferon |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5620519A JPS5620519A (en) | 1981-02-26 |
JPS641117B2 true JPS641117B2 (ja) | 1989-01-10 |
Family
ID=14203115
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9784779A Granted JPS5620519A (en) | 1979-07-30 | 1979-07-30 | Recovery of interferon |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5620519A (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3215508C2 (de) * | 1982-04-26 | 1986-11-06 | Kernforschungszentrum Karlsruhe Gmbh, 7500 Karlsruhe | Verfahren zur Verbesserung der Radionuklid-Rückhalteeigenschaften von Verfestigungen radioaktiver Abfälle |
US4723000A (en) * | 1983-07-05 | 1988-02-02 | Biospectrum, Inc. | Human interferon gamma and interleukin-2 |
EP0157771A1 (en) * | 1983-10-17 | 1985-10-16 | Chem-Nuclear Systems, Inc. | Improved solidification of aqueous radioactive waste using insoluble compounds of magnesium oxide |
JPH0664194B2 (ja) * | 1987-05-21 | 1994-08-22 | 九州電力株式会社 | 使用済イオン交換樹脂のセメント固化処理方法 |
-
1979
- 1979-07-30 JP JP9784779A patent/JPS5620519A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5620519A (en) | 1981-02-26 |
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