CN110092827A - 一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，该方法包括将发酵液进行离心和加热处理后依次进行初级超滤、二级超滤，随后使用30％的酒精和6mol/L的尿素将包裹在重组人血清白蛋白份子中的杂质去除，再进行蛋白复性、洗脱、透析，得到去杂液，最后将所得去杂液依次进行阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析，得到所述高纯度重组人血清白蛋白。通过此方法获得的重组人血清白蛋白具有纯度高、杂质少、不易降解、稳定性高等优势，具有良好的应用前景。最终获得基因重组人血清白蛋白的纯度达到了医药级(纯度大于99.999999％)的水平，完全符合美国药典和日本药典对注射剂级基因重组人血清白蛋白的要求。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法。
背景技术
目前，随着经济条件的发展，人们对医疗健康的关注度越来越高。人血清白蛋白(HSA)在近几十年的临床治疗中发挥了各种各样的作用。血液制品白蛋白的用量也是供不应求，由于血液制品的安全性的提高，白蛋白由血液制得的产量十分有限，运用生物基因技术生产一种血液替代品变为热点。
经过数年，科研人员成功的使用多种表达系统实现了重组人血清白蛋白(rHSA)的表达。但是其中发酵液中杂质较多，主要成份为杂蛋白、核酸、脂肪酸、色素、多糖、热原物质及各种各样的蛋白酶等。重组白蛋白的分离与血浆蛋白质相比，存在一些挑战：目标产物在表达系统中的产量低；产物数量级是克或者毫克；会产生附加产物蛋白酶，蛋白酶可能会使目标蛋白分解；发酵液成分构成复杂，包含有重组人血白蛋白、酵母菌的菌体、色素、盐类离子、细胞排泄物等；在发酵液过程中会伴有内毒素产生，但是人血浆内没有内霉素。因此纯化对质量要求十分严格，因此从发酵液中分离、纯化目标产物是重组人血清白蛋白产业化的重要环节。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，通过此方法获得的重组人血清白蛋白具有纯度高、杂质少、不易降解、稳定性高等优势。
本发明所采用的技术方案为：
(1)将含有重组人血清白蛋白的发酵液进行离心处理，目的除去发酵液中的菌体等杂质，随后加入热稳定剂进行加热，目的灭活蛋白酶，得到重组人血清白蛋白上清液；
(2)对重组人血清白蛋白上清液依次进行初级超滤、二级超滤，对上清液中的重组人血清白蛋白进行粗提，得到重组人血清白蛋白超滤液；
(3)将重组人血清白蛋白超滤液加入到预先平衡好的Ni-NTA层析柱中，依次使用去杂蛋白溶液、去杂液、平衡液对Ni-NTA层析柱进行冲洗，随后使用蛋白洗脱液进行洗脱，使用透析液对洗脱下的蛋白进行透析，得到重组人血清白蛋白透析液；使用去杂液能够使重组人血清白蛋白的结构被部分变性而其二硫键不被破坏，从而使吸附及包裹在其内部的色素等杂质暴露，进而与重组人血清白蛋白分离；
(4)对所述重组人血清白蛋白透析液依次进行阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析，得到所述高纯度重组人血清白蛋白。
进一步的，步骤(1)中，将所述含有重组人血清白蛋白的发酵液在转速4000-8000r/min离心处理15-35min。
进一步的，步骤(1)中，所述热稳定剂为辛酸钠和乙酰色氨酸钠的混合物，质量比为(2-4):1；所述加热温度为66-70℃，所述加热时间为20-40min。
进一步的，步骤(2)中，所述初级超滤采用的为分子质量为80kD的超滤膜，所述初级超滤的pH值为6.8-7.2，所述初级超滤的操作压力为0.14-0.16MPa。
进一步的，步骤(2)中，所述二级超滤采用的超滤膜的分子质量为10kD、30kD或50kD中的任一种，所述二级超滤的pH值为6.8-7.2，所述二级超滤的操作压力为0.14-0.16MPa。
进一步的，步骤(3)中，所述去杂蛋白溶液组成为20mmol/L的Tris-HCl、300mmol/L的NaCl和5mmol/L咪唑，所用体积为柱体积的2-4倍。
进一步的，步骤(3)中，所述去杂液的组成为20mmol/L的Tris-HCl、20-40％的酒精和4-8mol/L的尿素，所述体积为柱体积的8-12倍。
进一步的，步骤(3)中，所述平衡液的组成为20mmol/L的Tris-HCl和300mmol/L的NaCl，所用体积为柱体积的5-9倍。
进一步的，步骤(3)中，所述蛋白洗脱液的组成为20mmol/L的Tris-HCl、300mmol/L的NaCl和300mmol/L咪唑，所用体积为柱体积的5-10倍。
进一步的，步骤(3)中，所述透析液的组成为20mmol/L的Tris-HCl和50mmol/L的NaCl，所述透析温度为2-6℃，所述透析次数为1-3次，每次透析时间为1-3h，每次使用的透析液的体积为柱体积的80-120倍。
进一步的，步骤(4)中，所述阳离子交换层析的阳离子/疏水复合填料为BestaroseDiamond MMC；阴离子交换层析的阴离子交换介质具有DEAE基团；所述疏水层析的填料为Phenyl Sepharose HP或Phenyl Bestarose FF中的任一种。
进一步的，本发明所制备的重组人血清白蛋白分子量为66.5kDa，等电点4.6-5.0，纯度大于99.999999％，多糖残留低于5ng/ml，内毒素含量小于0.2EU/ml，符合美国药典和日本药典对医药级基因重组人血清白蛋白的要求。
本发明的有益效果为：
1、本发明采用两步超滤法对重组人血清白蛋白上清液进行分离纯化，基于上清液中各物质分子量的不同，此方法能够有效分离得到重组人血清白蛋白。本发明优化了膜分子质量、pH和操作压力等，得到了一种分离重组人血清白蛋白的简便高效的方法。
2、本发明使用Ni-NTA层析柱将蛋白吸附于柱体上，然后使用去杂液使柱体上的重组人血清白蛋白的结构被部分变性而其二硫键不被破坏，从而使吸附及包裹在其内部的色素等杂质暴露，进而与重组人血清白蛋白分离，使用此方法可以在不影响蛋白收率的前提下高效的去除其中的色素等杂质。
3、通过对阳离子交换层析、阴离子交换层析和疏水层析等关键操作条件的优化，使得其更加高效的纯化重组人血清白蛋白。
4、通过本发明方法获得的重组人血清白蛋白具有纯度高、杂质少、不易降解、稳定性高等优势，具有良好的应用前景。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，具体处理方法包括以下步骤：
(1)将含有重组人血清白蛋白的发酵液在转速4000r/min离心处理15min，随后加入质量比为2:1的热稳定剂辛酸钠和乙酰色氨酸钠，随后在66℃下加热20min，得到重组人血清白蛋白上清液；
(2)对重组人血清白蛋白上清液依次进行初级超滤、二级超滤，初级超滤采用的为分子质量为80kD的超滤膜，二级超滤采用的超滤膜的分子质量为10kD，两次超滤的pH值均为6.8，超滤的操作压力均为0.14MPa，得到重组人血清白蛋白超滤液；
(3)将重组人血清白蛋白超滤液加入到预先平衡好的Ni-NTA层析柱中，首先使用柱体积2倍的去杂蛋白溶液对Ni-NTA层析柱进行冲洗，去杂蛋白溶液组成为20mmol/L的Tris-HCl、300mmol/L的NaCl和5mmol/L咪唑；再使用柱体积8倍的去杂液对Ni-NTA层析柱进行冲洗，去杂液的组成为20mmol/L的Tris-HCl、20％的酒精和4mol/L的尿素；随后使用柱体积5倍的平衡液对Ni-NTA层析柱进行冲洗，平衡液的组成为20mmol/L的Tris-HCl和300mmol/L的NaCl；使用柱体积5倍的蛋白洗脱液进行洗脱，蛋白洗脱液的组成为20mmol/L的Tris-HCl、300mmol/L的NaCl和300mmol/L咪唑；最后使用柱体积80倍的透析液对洗脱下的蛋白进行透析，透析液的组成为20mmol/L的Tris-HCl和50mmol/L的NaCl，温度为2℃，透析1次，透析时间为1h，得到重组人血清白蛋白透析液；
(4)对所述重组人血清白蛋白透析液进行阳离子交换层析，阳离子/疏水复合填料为Bestarose Diamond MMC；选用DEAE-Sepharose作为阴离子交换介质进行阴离子交换层析；最后进行疏水层析，填料为Phenyl Sepharose HP，得到所述高纯度重组人血清白蛋白，其分子量为66.5kDa，等电点4.6-5.0，纯度大于99.999999％，多糖残留低于5ng/ml，内毒素含量小于0.2EU/ml。
实施例2
本实施例提供了一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，具体处理方法包括以下步骤：
(1)将含有重组人血清白蛋白的发酵液在转速6000r/min离心处理35min，随后加入质量比为4:1的热稳定剂辛酸钠和乙酰色氨酸钠，随后在70℃下加热40min，得到重组人血清白蛋白上清液；
(2)对重组人血清白蛋白上清液依次进行初级超滤、二级超滤，初级超滤采用的为分子质量为80kD的超滤膜，二级超滤采用的超滤膜的分子质量为50kD，两次超滤的pH值均为7.2，超滤的操作压力均为0.16MPa，得到重组人血清白蛋白超滤液；
(3)将重组人血清白蛋白超滤液加入到预先平衡好的Ni-NTA层析柱中，首先使用柱体积4倍的去杂蛋白溶液对Ni-NTA层析柱进行冲洗，去杂蛋白溶液组成为20mmol/L的Tris-HCl、300mmol/L的NaCl和5mmol/L咪唑；再使用柱体积12倍的去杂液对Ni-NTA层析柱进行冲洗，去杂液的组成为20mmol/L的Tris-HCl、40％的酒精和8mol/L的尿素；随后使用柱体积9倍的平衡液对Ni-NTA层析柱进行冲洗，平衡液的组成为20mmol/L的Tris-HCl和300mmol/L的NaCl；使用柱体积10倍的蛋白洗脱液进行洗脱，蛋白洗脱液的组成为20mmol/L的Tris-HCl、300mmol/L的NaCl和300mmol/L咪唑；最后使用柱体积120倍的透析液对洗脱下的蛋白进行透析，透析液的组成为20mmol/L的Tris-HCl和50mmol/L的NaCl，温度为6℃，透析次数为3次，每次透析时间为3h，得到重组人血清白蛋白透析液；
(4)对所述重组人血清白蛋白透析液进行阳离子交换层析，阳离子/疏水复合填料为Bestarose Diamond MMC；选用DEAE-聚乙烯基作为阴离子交换介质进行阴离子交换层析；最后进行疏水层析，填料为Phenyl Bestarose FF，得到所述高纯度重组人血清白蛋白，其分子量为66.5kDa，等电点4.6-5.0，纯度大于99.999999％，多糖残留低于5ng/ml，内毒素含量小于0.2EU/ml。
实施例3
本实施例提供了一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，具体处理方法包括以下步骤：
(1)将含有重组人血清白蛋白的发酵液在转速8000r/min离心处理25min，随后加入质量比为3:1的热稳定剂辛酸钠和乙酰色氨酸钠，随后在68℃下加热30min，得到重组人血清白蛋白上清液；
(2)对重组人血清白蛋白上清液依次进行初级超滤、二级超滤，初级超滤采用的为分子质量为80kD的超滤膜，二级超滤采用的超滤膜的分子质量为30kD，两次超滤的pH值均为7，超滤的操作压力均为0.15MPa，得到重组人血清白蛋白超滤液；
(3)将重组人血清白蛋白超滤液加入到预先平衡好的Ni-NTA层析柱中，首先使用柱体积3倍的去杂蛋白溶液对Ni-NTA层析柱进行冲洗，去杂蛋白溶液组成为20mmol/L的Tris-HCl、300mmol/L的NaCl和5mmol/L咪唑；再使用柱体积10倍的去杂液对Ni-NTA层析柱进行冲洗，去杂液的组成为20mmol/L的Tris-HCl、30％的酒精和6mol/L的尿素；随后使用柱体积7倍的平衡液对Ni-NTA层析柱进行冲洗，平衡液的组成为20mmol/L的Tris-HCl和300mmol/L的NaCl；使用柱体积7倍的蛋白洗脱液进行洗脱，蛋白洗脱液的组成为20mmol/L的Tris-HCl、300mmol/L的NaCl和300mmol/L咪唑；最后使用柱体积100倍的透析液对洗脱下的蛋白进行透析，透析液的组成为20mmol/L的Tris-HCl和50mmol/L的NaCl，温度为4℃，透析次数2次，每次透析时间为2h，得到重组人血清白蛋白透析液；
(4)对所述重组人血清白蛋白透析液进行阳离子交换层析，阳离子/疏水复合填料为Bestarose Diamond MMC；选用DEAE-Sephedex作为阴离子交换介质进行阴离子交换层析；最后进行疏水层析，填料为Phenyl Sepharose HP，得到所述高纯度重组人血清白蛋白，其分子量为66.5kDa，等电点4.6-5.0，纯度大于99.999999％，多糖残留低于5ng/ml，内毒素含量小于0.2EU/ml。
对比例1
对比例1与实施例3的区别仅在于超滤操作不同，本对比例中不进行初级超滤和二级超滤。
对比例2
对比例1与实施例3的区别仅在于超滤操作不同，本对比例中的热稳定剂仅使用辛酸钠。
对比例3
对比例1与实施例3的区别仅在于Ni-NTA层析过程中不使用去杂液冲洗。
实验例
实施例3所述纯化方法与对比例1-3所述纯化方法的对比
取实施例3和对比例1-3所述纯化方法所得重组人血清白蛋白进行纯度、多糖残留、内毒素含量的测定，并进行对比，结果如表1所示。
表1实施例3和对比例1-3所得重组人血清白蛋白各指标对比
| 组别 | 纯度 | 多糖残留 | 内毒素含量 |
| 实施例3 | 99.999999％ | 2ng/ml | 0.05EU/ml |
| 对比例1 | 89.2％ | 9ng/ml | 0.8EU/ml |
| 对比例2 | 93.8％ | 6ng/ml | 0.6EU/ml |
| 对比例3 | 95.7％ | 7ng/ml | 0.7EU/ml |
由上表中的数据可以看出，实施例3和对比例1-3所得重组人血清白蛋白各指标均有明显差异，实施例3所得重组人血清白蛋白纯度、多糖残留、内毒素含量均高于对比例1-3，纯度为99.999999％，多糖残留为2ng/ml，内毒素含量为0.05EU，符合美国药典和日本药典对医药级基因重组人血清白蛋白的要求。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将含有重组人血清白蛋白的发酵液进行离心处理，随后加入热稳定剂进行加热，得到重组人血清白蛋白上清液；
(2)对重组人血清白蛋白上清液依次进行初级超滤、二级超滤，得到重组人血清白蛋白超滤液；
(3)将重组人血清白蛋白超滤液加入到预先平衡好的Ni-NTA层析柱中，依次使用去杂蛋白溶液、去杂液、平衡液对Ni-NTA层析柱进行冲洗，随后使用蛋白洗脱液进行洗脱，使用透析液对洗脱下的蛋白进行透析，得到重组人血清白蛋白透析液；
(4)对所述重组人血清白蛋白透析液依次进行阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析，得到所述高纯度重组人血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，将所述含有重组人血清白蛋白的发酵液在转速4000-8000r/min离心处理15-35min。
3.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述热稳定剂为辛酸钠和乙酰色氨酸钠的混合物，质量比为(2-4):1；所述加热温度为66-70℃，所述加热时间为20-40min。
4.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述初级超滤采用的为分子质量为80kD的超滤膜，所述初级超滤的pH值为6.8-7.2，所述初级超滤的操作压力为0.14-0.16MPa。
5.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述二级超滤采用的超滤膜的分子质量为10kD、30kD或50kD中的任一种，所述二级超滤的pH值为6.8-7.2，所述二级超滤的操作压力为0.14-0.16MPa。
6.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述去杂蛋白溶液组成为20mmol/L的Tris-HCl、300mmol/L的NaCl和5mmol/L咪唑，所用体积为柱体积的2-4倍；
所述去杂液的组成为20mmol/L的Tris-HCl、20-40％的酒精和4-8mol/L的尿素，所述体积为柱体积的8-12倍。
7.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述平衡液的组成为20mmol/L的Tris-HCl和300mmol/L的NaCl，所用体积为柱体积的5-9倍；
所述蛋白洗脱液的组成为20mmol/L的Tris-HCl、300mmol/L的NaCl和300mmol/L咪唑，所用体积为柱体积的5-10倍。
8.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述透析液的组成为20mmol/L的Tris-HCl和50mmol/L的NaCl，所述透析温度为2-6℃，所述透析次数为1-3次，每次透析时间为1-3h，每次使用的透析液的体积为柱体积的80-120倍。
9.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，所述阳离子交换层析的阳离子/疏水复合填料为Bestarose Diamond MMC；阴离子交换层析的阴离子交换介质具有DEAE基团；所述疏水层析的填料为Phenyl SepharoseHP或Phenyl Bestarose FF中的任一种。
10.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，所制备的重组人血清白蛋白分子量为66.5kDa，等电点4.6-5.0，纯度大于99.999999％，多糖残留低于5ng/ml，内毒素含量小于0.2EU/ml。
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2019
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