JPH02191226A - アルブミン製剤及びその製造方法 - Google Patents
アルブミン製剤及びその製造方法Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
れた血清アルブミン製剤及びその製造方法に関する。
ルブミンは血漿中に最も多く含まれている蛋白質で、血
液中で浸透圧の維持、栄養物質や代謝物質と結合してそ
の運搬などの機能を果たしている。上記血清アルブミン
を含有する製剤は、アルブミンの喪失及びアルブミン合
成低下による低アルブミン血症、出血性ショックなどの
治療に用いられている。アルブミン製剤は、そこに混入
してくる懸念のあるウィルスを不活化するために、通常
、アルブミン含有水溶液の状態での加熱処理が汎用され
ている。このような方法により製造される市販のアルブ
ミン製剤は、製剤中に凝集体(通常ポリマーと称される
ので、以下、ポリマーという)が存在することが知られ
ている。この凝集体は上記の加熱処理前には殆ど存在し
ないことから、加熱処理により熱に不安定な蛋白質が部
分的に変性して凝集化したものと考えられる。市販のア
ルブミン製剤は安全に広く使用されていることから、こ
の凝集体が特に人に害を及ぼすとは考えられていないが
、加熱変性物であることより、製剤中にできるだけ含ま
れていないことが好ましい。
酸性糖蛋白質が含まれており、該蛋白質は免疫抑制作用
を有する。α1−酸性糖蛋白質はアルブミンと物理化学
的性質の比較的よく似た蛋白質であり、分画法等の慣用
の手段では効率的に分離することが困難である。従って
、通常のアルブミン製剤中には免疫抑制作用を有するα
1−酸性糖蛋白質が残存するおそれがあり、製剤中から
できるだけ除去しておくことが望ましい。
発明者らが種々検討を重ねた結果、ポリマーの形成はア
ルブミン中に混入するポリマー形成因子(凝集体形成因
子)に起因し、該形成因子は熱に不安定な夾雑蛋白質(
主としてハプトグロビン)である知見を得、アルブミン
中のポリマー形成因子を除去することにより、加熱処理
されてもポリマー含量の少ないアルブミン製剤が得られ
、またαl−酸性糖蛋白質含量も低減できることを見出
し、本発明を完成した。即ち、本発明は、ポリマー含量
及びα1−酸性糖蛋白質含量が低減されたアルブミン製
剤及びその製造方法を提供することを目的とする。
剤は、血清アルブミン含量に対するポリマー含量が3重
量%以下であり、且つ血清アルブミン含量に対するα1
−酸性糖蛋白質含量が検出限界以下であることを特徴と
するものであり、また本発明のアルブミン製剤の製造方
法は、血清アルブミン含有水溶液を該水溶液中に含まれ
るポリマー形成因子を除去する工程に付した後、加熱処
理することを特徴とするものである。なお、ポリマー形
成因子の除去は、陰イオン交換体を用いる方法又はアフ
ィニティクロマトグラフィー法で行なうのが好ましい。
法の出発原料であるアルブミンの由来には特に制限がな
く、具体的には補乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ウサギ
等に由来するものが挙げられ、特にヒト由来のものが使
用される。アルブミンを調製するための出発原料として
は、例えば、コーン氏の冷アルコール分画によって得ら
れた第V画分等が例示される。
る水溶液を、該溶液中に含まれるポリマー形成因子を除
去する工程に付した後、加熱処理することにより得られ
る。
は、通常、0.1〜30%(W/ V 、特に明示のな
い限り以下同様)、好ましくは約1〜10%に調整され
る。
方法としては、ポリマー形成因子がハプトグロビン、a
I−酸性糖蛋白質等のアルブミンより等電点の低い蛋白
質であるので、これらを除去するために用いられる方法
であればいずれも使用することができ、例えば、陰イオ
ン交換体を用いる方法、アフィニティクロマトグラフィ
ーを用いる方法等が挙げられる。特にポリマー形成因子
の主成分であるハプトグロビンはアルブミンと物理化学
的性質が比較的よく似ており分画法で効率的に分離する
のは困難なので、陰イオン交換体を用いる方法又はアフ
ィニティクロマトグラフィーを用いる方法が好ましい。
用する場合、使用される陰イオン交換体としては陰イオ
ン交換基(例えば、ジエチルアミノエチル基等)を有す
る不溶性担体であればいずれも使用することができ、よ
り具体的には、この分野で慣用の陰イオン交換体、例え
ば、DEAE−セファロース0、Q−セファロース0(
いずれもファルマシア社製) 、DEAE−)ヨパール
0、QAE−トヨパール0(いずれも東ソー社製)、A
200セルロフアイン0(生化学工業社製)、陰イオン
交換樹脂等が例示され、ポリマー形成因子の除去率の点
からしてQ−セファロース、QAE−1ヨパール等の強
陰イオン交換体を用いるのが好ましい。
リマー形成因子を含むアルブミン含有水溶液を陰イオン
交換体と接触させることにより行われ、陰イオン交換体
の使用量はアルブミン含有水溶液中のポリマー形成因子
含量、陰イオン交換体の交換能等により適宜調整される
が、アルブミン1g当り、陰イオン交換体2〜5 xl
、通常311程度使用される。本方法はカラム法、バッ
チ法のいずれの方法にて行なってもよいが、ポリマー形
成因子の除去効率の面からカラム法にて行なうのが好ま
しい。
をpH4,8〜9.0程度、好ましくはpH4,9〜5
.5、より好ましくはpH5,1、塩濃度として0.0
01〜0.2Mの塩化ナトリウム程度、好ましくは0.
001〜0.05Mに調整し、溶出液[例えば、0.0
2M酢酸ナトリウム(pH5,1)]で平衡化した陰イ
オン交換体カラムを通過させ、次いで溶出液で展開して
非吸着分を回収することにより行われる。上記の操作は
アルブミンの変性を抑制するため、低温(通常、10℃
以下)にて行なうのが好ましい。
ルブミン含有水溶液に、陰イオン交換体を添加して接触
させ、10℃以下にて、30分〜2時間程度混和した後
、遠心分離等の手段により陰イオン交換体と分離し、上
清を回収することにより行われる。
トグラフィー法を採用する場合、該方法に使用される担
体としては、ハプトグロビン等のポリマー形成因子と特
異的親和性を有する物質を固定化した不溶性担体(以下
、アフィニティ担体という)が用いられる。不溶性担体
としてはセルロース、デキストラン等が例示され、また
ハプトグロビン等のポリマー形成因子と特異的親和性を
有する物質としては、夾雑蛋白質の種類に応じて種々の
物質が用い得るが、例えば、ハプトグロビンに対しては
抗ハプトグロビン抗体、ヘモグロビン等、α1−酸性糖
蛋白質に対しては抗α1−酸性糖蛋白質抗体等が例示さ
れる。これらの抗ハプトグロビン抗体、抗α1−酸性糖
蛋白質抗体等の抗体はこの分野で慣用の抗体産生法によ
り調製することができる。上記の特異的親和性を有する
物質と不溶性担体との結合は常法に準じて行なうことが
でき、例えば、ブロムシアン化されたセファロースを膨
潤させた後、塩基性緩衝液中で特異的親和性を有する物
質を不溶性担体にカップリングさせ、緩衝液で十分に洗
浄することにより調製される。
グロビン等のポリマー形成因子を含むアルブミン含有水
溶液を、アフィニティ担体と接触させることにより行わ
れ、例えば、それぞれの夾雑蛋白質と特異的親和性を有
する複数の物質を固定化したアフィニティ担体と接触さ
せたり、またハプトグロビンに対して特異的親和性を有
する物質を固定化したアフィニティ担体と接触させ、次
いでα1−酸性糖蛋白質に対して特異的親和性を有する
物質を固定化したアフィニティ担体と接触させ、さらに
必要に応じて他の夾雑蛋白質に対して特異的親和性を有
するアフィニティ担体と接触させることにより行われる
。
ハプトグロビン等のポリマー形成因子含量、該アフィニ
ティ担体の吸着能等により適宜調整されるが、アルブミ
ン1g当り、アフィニティ担体2〜5 xl、通常41
!程度使用される。本方法はポリマー形成因子の除去効
率の面がらカラム法にて行なうのが好ましく、例えば、
前記のアルブミン含有水溶液をpH4,0〜9.0程度
、好ましくはpH5,0〜8.0、より好ましくはpH
6,8に調整し、アルブミンの溶解用液で平衡化した上
記アフィニティ担体カラムを通過させ、必要に応じてカ
ラムを溶解用液で洗浄し、非吸着分を回収することによ
り行われる。上記の操作はアルブミンの変性を抑制する
ため、低温(通常10℃以下)にて行なうのが好ましい
。
ミン含有水溶液はポリマー形成因子含量が低減された溶
液である。
ルブミン含有水溶液は適当な濃度に調整し、例えば、バ
イアルに充填するなど所望の製剤形態に製剤化された後
、加熱処理されて本発明のアルブミン製剤が得られる。
あるウィルスを不活化するもので、アルブミン濃度5〜
20時間度、通常5又は20〜25%程度に調整した水
溶液として行われ、加熱温度としては、夾雑ウィルスを
不活化するに十分な温度及び時間行なえばよく、例えば
、50〜70℃、好ましくは約60℃で、5〜20時間
、好ましくは約10時間行われる。なお、上記の加熱処
理に際しては、必要に応じて、アルブミンの安定化剤、
例えば、N−アセチルトリプトファンナトリウム、カプ
リル酸ナトリウム等を単独で又は混合して添加してもよ
い。
ルブミン1g当り20〜60■、好ましくは401g程
度使用される。
対するポリマー含量が3重量%以下であり、且つアルブ
ミン含量に対するα1−酸性糖蛋白質含量が検出限界以
下である。
様な用量、用法にて使用される。
不活化されていると共にポリマー含量及びα1−酸性糖
蛋白質含量が極めて少なく、安全性、安定性等に優れた
製剤である。
ィルスが加熱処理により不活化され、また加熱処理によ
り生成するポリマーの形成因子であるハプトグロビン等
の熱に不安定な夾雑蛋白質が予め除去されているので、
ポリマー含量及び夾雑蛋白質含量の少ないアルブミン製
剤を得ることができる。
るが、本発明はこれらの実施例によってなんら限定され
るものではない。
をアセトンで脱アルコールし、アセトンパウダーを得た
。次いで、アルブミン濃度が10%となるように水に溶
解し、pHを5.1に調整した。この溶液をDEAE−
セファデックスカラムで処理した。溶出液に安定化剤と
してN−アセチルトリプトファンナトリウム及びカプリ
ル酸ナトリウムをそれぞれ20mM添加し、60℃で1
0時間加熱処理し、アルブミン製剤を得た。該製剤中の
ポリマー含量をゲル濾過分析法にて測定した。その結果
、ポリマー含量は、4回の繰り返し実験で3.0%以下
(アルブミン含量に対する相対重量%、ポリマー含量に
関して以下同様)であった。また、比較例として、DE
AE−セファデックス処理をしていない溶液に安定化剤
を添加し、同様に加熱した溶液中のポリマー含量を測定
した。
験の平均値)であった。
分を溶出させ、ゲル濾過法とセルロースアセテート膜電
気泳動法で分析した結果、吸着画分はハプトグロビンを
主体とする蛋白質であった。
M塩酸で15分間膨潤させ、水洗した後、塩基性緩衝液
[0,1M炭酸水素ナトリウム及び0.5M塩化ナトリ
ウム含有(pH8,3)]で洗浄した。ヒトヘモグロビ
ン(100■)を上記塩基性緩衝液(40yZ)に溶解
し、ここに上記膨潤したゲル(20yZ)を添加し2時
間攪拌した。
、4℃にて一夜攪拌した。ゲルを濾別し、塩基性緩衝液
で十分に洗浄した後、リン酸緩衝食塩水で平衡化した。
した。
水に溶解し、10%アルブミン溶液(炭酸ナトリウム及
び水酸化ナトリウムにてpH6゜8に調整)を調製した
。この溶液を、上記セファロースゲル(20if)を充
填したカラムにとおし、溶出液を2011ずつ分画した
。フラクションに2〜8について、−次免疫拡散法(M
ancini法)でハプトグロビンを定量した。また各
サンプル(511)をセントリカット−50にて211
に濃縮し、安定化剤溶液(11!中、N−アセチルトリ
プトファンナトリウム36■g及びカプリル酸ナトリウ
ム24a+g含有)を280μgを添加し、60℃にて
10時間加熱し、アルブミン製剤を得た。該製剤中のポ
リマー含量をゲル濾過分析法により測定した。
の関係を第1表に示す。
度が低いほどポリマー含量が低い結果となった。実施例
1及び2の結果を勘案すると、アルブミンより等電点の
低い夾雑蛋白質(主としてハプトグロビン)を除去する
ことによりポリマー含量を低減化できることが判明した
。
ペースト(300g、アルブミン含量110.2g)を
冷無菌蒸溜水1.21に溶解し、約1時間攪拌した。次
いで、10 (V/V)%酢酸を用いてpHを4.6に
調整した後、約−2℃にて濾過(フィルター:0.45
μm)L、さらに冷無菌蒸溜水1.2gを加え、0.8
M炭酸水素ナトリウムでpH5,1に調整し、アルブミ
ン水溶液を得た。
填し、0.5M塩化ナトリウム(500yf)で十分に
洗浄した後、0.02M酢酸ナトリウム(pH5,1)
で平衡化し、陰イオン交換体カラムを調製した。このカ
ラムに上記のアルブミン水溶液をとおし、さらに0.0
2M酢酸ナトリウム(1,247)で洗浄した。通過液
と洗浄液とを合わせ、IN水酸化ナトリウムにてp′H
を6.2に調整した後、透析・濃縮し、全量33ONI
Cアルブミン濃度:約28%)とした(以下、アルブミ
ン調整液という)。
N−アセチルトリプトファンナトリウム5.55g及び
カプリル酸ナトリウム3.89g含有)を39.611
添加し、0.IN水酸化ナトリウムにてpHを6.85
に調整した後、除菌濾過した。アルブミン濃度が25%
となるように調整した後、所定量をバイアルに分注し、
60℃にて10時間加熱処理してアルブミン製剤を得た
。
測定したところ、1.99%であった。
ない点以外は、上記製法と実質的に同様にして調製した
アルブミン製剤の加熱後のポリマー含量は6.49%で
あり、本発明の製造方法により得られたアルブミン製剤
のポリマー含量は著しく低いものである。
夾雑蛋白質含量の測定を一次免疫拡散法01Hcini
法: Mancini G、ら、l5vunoches
istry、第2巻、第3号、第235−254頁、1
985年)により行い、その結果を第2表に示す。なお
、この際、用いた抗α1−酸性糖蛋白質血清、抗ハプト
グロビン血清及び抗プレアルブミン血清は、ウサギを免
疫動物として常法により調製したものである。これらの
抗血清より作製した一次免疫拡散法ゲルを用い、それぞ
れに対応する夾雑蛋白質に対する沈降輪面積の標準曲線
を第1図〜第3図に示す。
アルブミン調整液は夾雑蛋白質含量の極めて少ないもの
であることが判明した。なお、第1図〜第3図から明ら
かなように、ハプトグロビンの検出限界は6.5■/d
iであり、α1−酸性糖蛋白質の検出限界は4■g/d
lであり、プレアルブミンの検出限界は4■g / d
Iである。
免疫拡散法による標準曲線を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、アルブミン製剤において、血清アルブミン含量に対
する凝集体含量が3重量%以下であり、且つ血清アルブ
ミン含量に対するα_1−酸性糖蛋白質含量が検出限界
以下であることを特徴とするアルブミン製剤。 2、アルブミン製剤の製造方法において、血清アルブミ
ン含有水溶液を、該水溶液中に含まれる凝集体形成因子
を除去する工程に付した後、加熱処理することを特徴と
するアルブミン製剤の製造方法。 3、凝集体形成因子の除去を、陰イオン交換体を用いる
方法又はアフィニティクロマトグラフィー法で行なう請
求項2記載のアルブミン製剤の製造方法。
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