CN102070714B

CN102070714B - 一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法

Info

Publication number: CN102070714B
Application number: CN 201010561294
Authority: CN
Inventors: 董悦生; 张帆; 修志龙
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2010-11-26
Filing date: 2010-11-26
Publication date: 2013-10-16
Anticipated expiration: 2030-11-26
Also published as: CN102070714A

Abstract

本发明提供一种操作简单、快速、有效的重组人血清白蛋白的纯化方法，重组人血清白蛋白溶液经过亲水性有机溶剂/无机盐双水相萃取、回收有机溶剂、加热除色素、结合方式的疏水层析和硼酸盐处理等步骤纯化后，可以得到电泳纯度大于99.9％，多糖含量不高于1.89μg/ml，色素比值A350/A280低的重组人血清白蛋白，同时经亲水性有机溶剂/无机盐双水相萃取的重组人血清白蛋白溶液具有不易降解、稳定性高的特点。本发明解决了人血清白蛋白分离纯化中分离步骤繁琐、多糖等杂质含量低的问题，具有很好的应用前景。

Description

一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种简便分离纯化重组人血清白蛋白(rHSA)的方法。经纯化后的rHSA具有高纯度和极低多糖含量，解决了制约人血清白蛋白分离纯化中分离步骤繁琐、多糖等杂质含量高的问题。

技术背景

人血清白蛋白(HSA)是人血中最丰富的蛋白，其作用为维持血液渗透压，结合以及运输营养物质。HSA一方面可作为临床药物，治疗因白蛋白损失、合成障碍、创伤失血引起的白蛋白含量下降。另一方面，可作为细胞培养的添加成分、药物的辅剂、赋形剂等，具有广泛的应用价值。

HSA主要有两种方式，一是从血液中提取，称为pHSA，目前广泛使用的冷乙醇沉淀法及硫酸铵、利凡诺、辛酸盐沉淀法都可用于从血液中分离纯化pHSA。因为HSA需求量大，目前存在着血液来源有限，不能满足需求的问题。二是利用基因重组技术，构建高效表达HSA的基因工程菌或重组细胞进行rHSA的生产，该方法解决了pHSA来源不足的问题，具有很好的应用前景。但rHSA发酵液，如来源于酵母菌的发酵液，组成复杂，含有蛋白酶、杂蛋白、核酸、脂肪酸、色素、多糖等杂质，其中蛋白酶易使rHSA变性、降解。多糖包括甘露聚糖、葡聚糖及糖蛋白等复合物，是引起过敏的抗原性物质，必须采用多步层析方法才能将其去除。

rHSA的分离已经有许多报道，常见的分离过程包括：rHSA的发酵液去除菌体和细胞后进行两步超滤、对上清液进行加热处理灭活蛋白酶，再进行阳离子交换层析、加热处理除色素、疏水层析、阴离子交换层析等初级的纯化过程，再经过鳌合树脂、硼酸或硼酸盐处理等进一步的纯化过程，得到稳定的、高纯度的rHSA(专利US5986062，专利CN1854155A)。也可以将过滤或者离心的rHSA上清液进行阳离子交换层析，然后使用蓝琼脂糖亲和层析介质，去除45kDa的降解片段和酵母抗原，再使用凝胶过滤层析、阴离子层析等纯化步骤，得到高纯度的rHSA(专利WO9731947)。专利CN100463921C公开了一种可耐受高盐型的阳离子交换介质，可以直接吸附发酵上清液中的rHSA，不需要将发酵上清液进行稀释处理，然后再经过疏水层析、阴离子交换等纯化步骤得到高纯度rHSA。

上述方法虽然能够得到高纯度的rHSA，但一般均需采用多步柱层析，操作复杂、处理时间长、成本高、收率低。一般采用阳离子交换层析介质以吸附方式捕获发酵液或发酵上清液中的rHSA，而绝大多数阳离子层析介质不能耐受高浓度盐，吸附时样品一般需要稀释，专利CN100463921C公开了不需对发酵上清液稀释的阳离子交换介质，但是该介质尚未商品化，影响其推广应用。从阳离子交换层析中洗脱的含有rHSA的溶液，一般采用流穿的方式进行疏水层析(专利US5986062，专利CN1854155A)，即在选用的层析条件下，rHSA不和疏水介质结合，疏水层析介质只吸附rHSA溶液中的杂蛋白、多糖等杂质。该方式去除多糖等杂质的能力有限，必须结合其他柱层析方法，如阳离子交换层析、阴离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等才能够使多糖含量达到一个较低的水平。目前尚未见使用少于3步柱层析的方法得到高纯度、低多糖含量的rHSA的报道。

另一方面，因为酵母及重组酵母的发酵液中均含有蛋白酶，这些蛋白酶对rHSA有比较强的降解作用，如不及时灭活将影响rHSA的收率，特别是目前普遍采用的阳离子交换层析中，因为在酸性条件下上样，蛋白酶对纯度和收率的影响更加显著。(Yeast，1996，12：1～16；生物技术通讯，2006，176：908-910)。专利US6617133对含rHSA溶液的稳定性进行了研究，不经过加热灭活蛋白酶处理的rHSA发酵上清液，在pH 6.0、室温下静置2小时后，蛋白回收率仅为80％。该发明公开了一种提高rHSA溶液稳定性的方法，即对发酵液或发酵上清液68℃下加热处理30min后，再通过扩张床等技术利用阳离子交换介质，直接从发酵液中提取rHSA。该方法能够有效地提高rHSA溶液的稳定性，但需对发酵液或发酵上清液进行加热处理，发酵液或发酵上清液体积大，操作复杂，能耗高，对rHSA的收率也有一定的影响。

由亲水性有机溶剂和无机盐形成的双水相，可以萃取金属络合物，中药有效成分和低分子二元醇等(天然产物研究与开发，2002，21(3)：75～77；《分析测试学报》，2006，18，647～649；专利CN101012151A；专利CN101012152A)，是一种新的提取分离方法。专利CN101481403A公开了一种采用双水相萃取的方法对酵母来源蛋白质发酵液进行固液分离的方法，解决了发酵法生产重组蛋白质中存在的菌体去除困难的问题，具有分离效果好，分离时间短，成本低的特点，但采用该方法尚不能得到多糖含量低的高纯度rHSA。

如何从rHSA溶液中快速、有效地分离纯化rHSA，避免其降解，并得到含极低水平多糖的rHSA产品，成为目前研究的重点及难点。

发明内容

本发明提供了一种操作简单、处理时间短、高收率、低成本，以获得低多糖含量、高纯度rHSA的方法，同时提供一种提高分离过程中rHSA稳定性的方法，以保证在分离纯化过程中降低蛋白酶对rHSA的降解作用，提高纯化收率。使用亲水性有机溶剂和无机盐形成的双水相体系对rHSA萃取时，能够大幅度降低多糖含量，并能提高纯化过程中rHSA的稳定性，简化分离纯化步骤，进而提高纯化收率。而rHSA的双水相萃取液经回收有机溶剂、加热去色素后，采用和现有技术不同的、以吸附为特征的疏水层析纯化后，再经过硼酸盐处理、阴离子层析等步骤纯化可以得到高纯度、低多糖含量的rHSA。

本发明的技术方案包括如下步骤：

本发明中的rHSA溶液是rHSA的基因工程菌或重组细胞的培养物、去除生物细胞后的上清液或是将去除生物细胞的上清液经过部分纯化的溶液。上述培养物可以通过rHSA的基因工程菌或重组细胞发酵获得，发酵液离心或过滤后可以得到上清液，上清液部分纯化的方法包括盐析等。

(1)双水相萃取向rHSA溶液中添加可溶性无机盐和亲水性有机溶剂并充分搅拌，通过调节可溶性无机盐、亲水性有机溶剂和含rHSA溶液比例形成双水相，上相即为富含rHSA的萃取相。在上述操作中，加入的可溶性无机盐占双水相体系的质量百分数为5％～35％，优选8％～30％；加入亲水性有机溶剂占双水相体系的质量百分数为5％～40％，优选8％～35％。可溶性无机盐为磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐、卤化物或其中二种以上的混合物；磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐、卤化物包括磷酸氢二钾、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、氯化钠、硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾等。亲水性有机溶剂为碳数不高于8的醇类、碳数不高于8的酮类或其二种以上的混合物；碳数不高于8的醇类包括乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、异丁醇或乙二醇等；碳数不高于8的酮类包括丙酮等。

(3)回收有机溶剂使用亲水性有机溶剂/无机盐双水相萃取得到的含有rHSA的溶液中含有有机溶剂，不利于rHSA吸附到疏水介质中，需要回收有机溶剂，但不恰当的有机溶剂回收方法容易使蛋白变性而影响收率。对双水相萃余相可以采用蒸馏和/或精馏的方法回收有机溶剂，蒸馏前需用酸或碱调节pH为5.5～9.0，蒸馏和/或精馏处理的温度为20～45℃，时间为15～60min，蒸馏和/或精馏时rHSA溶液中需要添加在一种或多种稳定剂、还原剂和色素螯合剂，稳定剂包括乙酰色氨酸，6～18个碳原子的有机羧酸及其盐，有机羧酸包括己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、棕榈酸和油酸等，有机羧酸盐包括上述有机羧酸的碱金属盐(钠盐、钾盐等)及碱土金属盐(钙盐)，优选终浓度为5～20mmol/L的辛酸钠。还原剂包括具有SH基团的低分子量化合物，如巯基乙醇、半胱氨酸、半胱胺、胱胺、3-巯基-1-丙胺、甲硫氨酸、还原谷胱甘肽等，优选终浓度为1～10mmol/L的半胱氨酸。色素螯合剂包括EDTA和EGTA，优选终浓度为1～10mmol/L的EDTA。回收有机溶剂后，rHSA溶液中有机溶剂含量低于20％，优选低于10％。

(4)加热除色素将回收有机溶剂后的rHSA溶液加热处理，可将蒸去有机溶剂的萃取相进行加热处理，以利于减弱萃取液中色素和rHSA结合力，使色素在后续的纯化过程中被去除。加热温度为60～80℃，加热时间为30min至5h，pH为5.0～8.0。

(5)疏水层析此层析步骤可以有效除去rHSA产品中分子量为10-50kDa的蛋白降解物、杂蛋白和多糖。rHSA与介质疏水基团的作用强度可通过改变样品溶液及平衡液的离子强度控制。在一定离子强度下，rHSA的降解片段与全长的rHSA相比，与介质疏水基团的作用更强。采用不同的洗脱条件，可将两者分开，实现有效除杂的目的。

加热处理后的rHSA溶液超滤、加无机盐并调节pH值后，使之流入装有疏水介质的色谱柱，使用含5～20mmol/L辛酸钠的无机盐溶液洗脱，得到纯化的rHSA；上样液pH为5.5～9.0，优选pH 6.0～8.0，无机盐溶液浓度为0.6～4.0mol/L，优选0.8～1.5mol/L，洗脱液pH为5.5～9.0，优选pH6.0～8.0，无机盐溶液浓度为0.01～0.5mol/L，优选0.1～0.4mol/L。

疏水层析过程中使用的无机盐，包括磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐、卤化物或其中二种以上的混合物，优选磷酸氢二钾、磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠、碳酸钠、碳酸钾、氯化钠或其中二种以上的混合物。疏水层析前添加盐时，可以采用添加盐溶液或添加固体盐颗粒的方式，为避免局部盐浓度过高造成蛋白盐析沉淀，最好采用添加盐溶液的方式。pH调节时，酸选自无机酸或有机酸的一种或几种，优选磷酸、盐酸、硫酸和醋酸，碱选自无机碱、碱性金属盐或有机碱的一种或几种。

疏水介质的基质是有机材料或无机材料。有机材料为天然聚合物，如交联琼脂糖、葡聚糖、纤维素、淀粉等，或者是合成聚合物，如聚二乙烯苯、聚苯乙烯等。无机材料中硅胶是最广泛使用的一种。基质优选交联琼脂糖。疏水性配基与rHSA有一个或多个作用位点，含有4-18个碳原子的烷基或苯基基团，优选含有苯基、丁基、辛基等基团的配基。

疏水层析中rHSA只能从与疏水介质结合部分得到。采用该方式，比流穿的方式更有利于提高蛋白纯度，降低其糖含量。

(6)硼酸盐处理通过硼酸/硼酸盐进一步处理含rHSA的溶液，也可以进一步降低具有抗原性的多糖类杂质含量。在经疏水层析纯化的rHSA溶液中加入四硼酸钠和氯化钙、调节pH值、并搅拌，离心或过滤去除沉淀，从上清液中回收rHSA。四硼酸钠的浓度为0.01～1.0mol/L，优选0.05～0.2mol/L，氯化钙的浓度为0.01～1.0mol/L，优选0.05～0.2mol/L，pH为pH 8.0～11.0，优选pH 9.0～10.0，搅拌时间为15min～10h，优选30min～2h；经过以上步骤的分离纯化可以得到高纯度、低多糖含量的rHSA。

如果因为发酵液质量原因，经上述操作得到的样品蛋白纯度不足或其他杂质含量较高时，可以选择性采用阴离子交换层析法进一步去除杂质、提高纯度。可以使用任何阴离子交换介质，包括二乙氨乙基(DEAE)基团和季氨乙基(QAE)基团等。优选弱阴离子交换介质，最好使用具有DEAE基团的阴离子交换介质，如DEAE-Sepharose、DEAE-Sephedex和DEAE-聚乙烯基等。上柱液的盐浓度为0.01～0.1mol/L，pH 6.0～8.0，优选pH 7.5～8.0。洗脱剂的盐浓度0.15～1.0mol/L，优选0.2～0.5mol/L；pH 6.0～8.0，优选pH 7.5～8.0。

本发明的有益效果是提供一种简便的rHSA纯化方法，rHSA溶液经过双水相萃取、回收有机溶剂、加热除色素、结合方式的疏水层析和硼酸盐处理等步骤纯化后，可以得到纯度高、多糖等杂质含量低的rHSA，rHSA的电泳纯度大于99.9％，多糖含量不高于1.89μg/ml，色素比值A350/A280优于pHSA，同时经亲水性有机溶剂/无机盐双水相萃取的rHSA溶液具有不易降解、稳定性高的特点。本发明解决了人血清白蛋白分离纯化中分离步骤繁琐、多糖等杂质含量高的问题，具有光明的应用前景。

附图说明

图1A是纯化后rHSA的圆二色光谱图(190～250nm)。

图1B是pHSA的圆二色光谱图(190～250nm)。

图2是纯化后rHSA和pHSA的UV扫描谱(300～700nm)。

具体实施方式

下述实施例仅用于详细说明本发明的rHSA发酵液的分离方法，不应理解为对本发明的限制。

实施例1rHSA的纯化

1)双水相固液分离处理

rHSA的发酵液由基因重组毕赤酵母发酵后得到，取该发酵液15L，在4℃下，加入4354.8g磷酸氢二钾，待盐溶解后，再加入4838.7g乙醇，充分搅拌。4℃静置3小时，形成双水相，分离后得到的萃取相中含有rHSA。

2)回收乙醇

将上述萃取相用盐酸调pH6.0后，分别加入终浓度为10mmol/L的辛酸钠、5mmol/L的半胱氨酸和EDTA，进行减压蒸馏回收乙醇，蒸馏温度为37℃，蒸馏时间为30min，气相色谱法测定，蒸馏后溶液中乙醇含量为53g/L。

3)加热除色素

将上述回收乙醇后的萃取相，60℃加热1h。

4)疏水层析纯化

将Phenyl Sepharose 6FF^TM疏水介质(Pharmacia公司产品)装入XK16/20柱内，柱床体积为15ml，用2倍柱床体积的缓冲液A(含0.8mol/L磷酸氢二钾的50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 6.0))平衡柱；将加热处理后的rHSA溶液超滤后，补加2mol/L磷酸氢二钾溶液至磷酸氢二钾终浓度为0.8mol/L，调pH 6.0。以2ml/min的流速流入上述Phenyl Sepharose 6FF^TM疏水柱内。上样结束后，用2倍柱床体积的缓冲液A洗脱未结合组分，采用含0.24mol/L的磷酸氢二钾，10mmol/L辛酸钠的50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 6.0)洗脱，收集含有rHSA的组分。

5)硼酸盐处理

将收集得到的洗脱液加入0.1mol/L四硼酸钠及0.1mol/L氯化钙，pH 9.0，30℃搅拌30min，5000rpm离心去沉淀，从上清液中回收rHSA。

纯化后rHSA分析：

i.纯度分析：

采用10％的还原SDS-PAGE，上样量10μg，考马斯亮蓝染色后呈单带，Gene-Tools软件分析纯度大于99.9％，native-PAGE及非还原SDS-PAGE未见明显聚体带，TSK3000(日本Tosoh公司)色谱柱分析显示单一峰。

ii分子量测定

对pHSA和采用上述工艺纯化后的rHSA进行脱盐处理后，然后使用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定分子量，纯化后的rHSA的分子量约为67,000，和pHSA相近。

iii.圆二色光谱分析：

圆二色光谱仪的石英样品池光程为1em，扫描测定波长范围为190～350nm，室温下测定。以波长为横坐标，平均残基摩尔椭圆度为纵坐标作图，绘制圆二色光谱图。结果表明采用上述方法纯化的rHSA和pHSA的圆二色光谱图一致。其中190～250nm的圆二色光谱图如附图1所示。

iv.等电点测定

用聚丙烯酰胺凝胶IEF3-9测定rHSA等电点为4.7～5.2，与血源白蛋白相同。

v.糖含量测定

采用苯酚硫酸法测定上述方法纯化后的rHSA的多糖含量为1.36μg/mg，pHSA中多糖含量为2.2μg/mg。

vi.色素水平测定

分别将采用上述工艺纯化后的rHSA溶液和pHSA产品浓缩至相同浓度，在300～700nm波长下进行全波长扫描，如图2所示，并由280，350，400，450，500nm的吸光率，计算A₃₅₀/A₂₈₀、A₄₀₀/A₂₈₀、A₄₅₀/A₂₈₀和A₅₀₀/A₂₈₀的比值，确定色素水平。pHSA溶液的A₃₅₀/A₂₈₀、A₄₀₀/A₂₈₀、A₄₅₀/A₂₈₀和A₅₀₀/A₂₈₀分别为0.037，0.03，0.026和0.025。纯化后的rHSA溶液A₃₅₀/A₂₈₀分别为0.028，0.019，0.012和0.011，纯化后rHSA的色素水平低于pHSA。

实施例2阴离子层析

取非正常发酵批次的rHSA发酵液，按照实施例1的方法进行纯化，得到rHSA含量为98.5％，多糖含量为3.0μg/mg，将该样品流入DEAE-Sepharose(Pharmacia公司产品)柱进行层析，上样液为含有50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 6.0，洗脱液为含0.8mol/L的氯化钠，10mmol/L辛酸钠的50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 8.0。收集rHSA组分，电泳纯度大于99.9％，多糖含量为1.75μg/mg。

实施例3双水相萃取的多糖去除

取不同批次的rHSA发酵液，加入质量百分数为18～20％的磷酸氢二钾，待盐溶解后，再加入质量百分数为18～20％的乙醇，充分搅拌，4℃静置3小时，形成双水相。分离后得到萃取相，用苯酚硫酸法测定发酵液上清及双水相萃取相的糖含量，根据发酵液及萃取相体积，计算多糖去除率。6批双水相萃取的多糖平均去除率为87.2％。

表1双水相萃取的多糖去除

^*：双水相萃取的多糖去除率(％)＝(1-萃取相的多糖含量/发酵上清液的多糖含量)×100％

实施例4双水相处理后rHSA的稳定性

将实施例1得到的双水相萃取液，使用Bradford法测定蛋白浓度为7.50g/L，pH值调至6.0，在室温下，静置10h，测定蛋白浓度为7.11g/L，回收率为94.8％，未经双水相萃取的发酵液上清在pH 6.0，静置10h后，蛋白回收率为65％。以上结果表明双水相萃取处理rHSA的发酵液，和不采用双水相及加热处理的样品相比(US6617133中不经过加热处理，在pH 6.0，室温下静置2小时，蛋白回收率仅为80％左右，见US6617133的Fig.1)，能够明显提高rHSA的稳定性。

实施例5疏水层析和硼酸盐处理的多糖去除

取实施例1步骤3)得到的加热处理后的rHSA溶液，按照实施例1中步骤4)的方法进行5批次疏水层析实验，用苯酚硫酸法测定疏水层析后的糖含量。如表2所示，疏水层析后，糖含量平均值可降至3.07μg/mg rHSA，疏水层析的多糖平均去除率为97.09％，双水相萃取和疏水层析的累积多糖去除率均值为99.63％，本步多糖去除率如再经硼酸盐处理后，糖含量平均值可降至1.61μg/mgrHSA，最高值为1.89μg/mg rHSA，低于pHSA产品的2.2μg/mg pHSA。

表2疏水层析的多糖去除

^*：累积多糖去除率(％)＝(1-纯化后rHSA的多糖含量/发酵上清液的多糖含量)×100％

实施例6无机盐对疏水层析的影响

取实施例1步骤3)得到的加热处理后的rHSA溶液，按照实施例1步骤4)的方法进行疏水层析，只将该过程中的无机盐溶液按照表3调整。

表3无机盐对疏水层析的影响

结果表明经过氯化钠、硫酸铵、磷酸氢二钾体系的疏水层析，均能够达到得到高纯度rHSA。

实施例7pH值对疏水层析的影响

取实施例1步骤3)得到的加热处理后的rHSA溶液，按照实施例1步骤4)的方法进行疏水层析，只将缓冲液的pH值调为6.0，7.0和8.0，纯化后电泳结果如表4所示：

表4.pH值对疏水层析的影响

表明在不同的pH值下均能得到高纯度的rHSA。

本发明对rHSA溶液使用双水相萃取得到的萃取液，加热处理去除色素后，使用商品化的介质，以结合方式进行疏水层析，可以得到纯度大于99.9％的rHSA，同时可以除去rHSA溶液中99.53％以上的多糖，再经硼酸盐处理后，可以得到多糖含量不高于1.89μg/mg rHSA的高纯度rHSA。和已知文献相比，简化了纯化步骤，提高了纯化收率，缩短了纯化时间，提高了产品的质量。

Claims

1.一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）双水相萃取：向获得的重组人血清白蛋白溶液中添加磷酸氢二钾和乙醇并充分搅拌，通过调节磷酸氢二钾、乙醇和含重组人血清白蛋白溶液比例形成双水相，上相即为富含重组人血清白蛋白的萃取相；加入的磷酸氢二钾占双水相体系的质量百分数为5%~35%；加入乙醇占双水相体系的质量百分数为5%~40%；所述重组人血清白蛋白溶液是表达体系为毕赤酵母的重组人血清白蛋白发酵液；

(2) 回收有机溶剂：对双水相萃余相采用蒸馏的方法回收有机溶剂，蒸馏前需用酸或碱调节pH为5.5~9.0，蒸馏处理的温度为20~45℃，时间为15~60min，蒸馏时重组人血清白蛋白溶液中添加终浓度为5~20 mmol/L的辛酸钠、1~10 mmol/L 的半胱氨酸和1~10 mmol/L的EDTA；回收有机溶剂后，重组人血清白蛋白溶液中有机溶剂含量低于20%；

（3）加热除色素：将回收有机溶剂后的重组人血清白蛋白溶液加热处理，加热温度为60~80℃，加热时间为30 min至5 h，pH为 5.0~8.0；

（4）疏水层析：将Phenyl Sepharose 6FF^TM疏水介质装入XK16/20柱内，柱床体积为15 ml，用2倍柱床体积的缓冲液A平衡柱；将加热处理后的rHSA溶液超滤后，补加2 mol/L磷酸氢二钾溶液至磷酸氢二钾终浓度为0.8 mol/L，调pH 6.0；以2 ml/min的流速流入上述Phenyl Sepharose 6FF^TM疏水柱内;上样结束后，用2倍柱床体积的缓冲液A洗脱未结合组分，采用pH 6.0、含0.24 mol/L的磷酸氢二钾，10 mmol/L辛酸钠的50 mmol/L磷酸钠缓冲液)洗脱，收集含有rHSA的组分；所述缓冲液A为pH 6.0，含0.8 mol/L磷酸氢二钾的50 mmol/L磷酸钠缓冲液；

（5）硼酸盐处理：在经疏水层析纯化的重组人血清白蛋白溶液中加入四硼酸钠和氯化钙、调节pH值、并搅拌，离心或过滤去除沉淀，从上清液中回收重组人血清白蛋白：四硼酸钠的浓度为0.01~1.0 mol/L，氯化钙的浓度为0.01~1.0 mol/L，pH为pH 8.0~11.0，搅拌时间为15 min~10 h。

2.根据权利要求1所述的一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法，其特征在于：所述方法进一步包括，选择性采用DEAE-Sepharose弱阴离子交换层析法去除杂质；上样液为含有50 mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 6.0，洗脱液为含0. 8 mol/L的氯化钠，10 mmol/L辛酸钠的50 mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 8.0。