JPH051280B2 - - Google Patents

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JPH051280B2
JPH051280B2 JP58186187A JP18618783A JPH051280B2 JP H051280 B2 JPH051280 B2 JP H051280B2 JP 58186187 A JP58186187 A JP 58186187A JP 18618783 A JP18618783 A JP 18618783A JP H051280 B2 JPH051280 B2 JP H051280B2
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JP
Japan
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hbs antigen
acid
hbs
antigen
raw material
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JP58186187A
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Keishin Sugawara
Chikahide Nozaki
Fukusaburo Hamada
Fumio Miake
Shinya Ootomo
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KAGAKU OYOBI KETSUSEI RYOHO KENKYUSHO
Original Assignee
KAGAKU OYOBI KETSUSEI RYOHO KENKYUSHO
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Publication date
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011Details
    • C12N2730/10011Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

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Description

【発明の詳现な説明】 本発明型肝炎りむルスの衚面抗原以䞋
HBs抗原ず略称するの粟補法、さらに詳しく
は、組換えDNA技術を利甚した組換え䜓により
産生されるHBs抗原の工業的粟補法に関するも
のである。 発明の技術的背景ず産業䞊の利甚分野 型肝炎は、型肝炎りむルス以䞋HBVず
略称するによ぀お起こり、疫孊的にも、臚床的
にも非垞に重倧なる問題を含む、いただ有効な治
療察策が芋出されおいない疟病である。これは䞖
界䞭に広く分垃しおいるが、特にアゞア、アフリ
カ地域に倚発し問題ずな぀おいる。 予防する察策ずしおは、HBs抗原を有効成分
ずするワクチンが最も有効であるず考えられ、実
甚化段階に入぀おいる。すなわち、キダリアヌず
称される型肝炎りむルス朜䌏持続感染者の血挿
より埗られるHBs抗原を高床に粟補し、これを
䞍掻化しお型肝炎ワクチンが぀くられおいる。 しかしながら、このように血液由来のワクチン
は原料を血液にもずめるため、たた型肝炎りむ
ルスあるいは他の血液由来のりむルスなどの感染
性の因子の残存を吊定するために、チンパンゞヌ
による安党性確認詊隓が必芁であるこず、怜定甚
のチンパンゞヌの確保が非垞に困難であるこずな
どの問題点もあり、補造䞊に倚くの制玄がある。 このような懞案を解消する方策ずしお、組換え
DNA技術を利甚しお、倧腞菌や、酵母菌にHBs
抗原蛋癜質をコヌドするHBVのDNAを導入、発
珟させるこずにより、ワクチンの原材料ずなる
HBs抗原のみを倧量に䜜り出す研究が倚くの研
究者らによ぀お掚進されおきた。最近、これら組
換え䜓によるHBs抗原の発珟が成功を収め、特
に組換え酵母によるHBs抗原の産生に぀いおは、
工業的応甚を可胜ずする段階に至぀た。なお、実
甚化のためには、残された重芁課題ずしお、組換
え䜓によ぀お産生されたHBs抗原を、ワクチン
材料あるいは蚺断甚詊薬材料ずなしうる皋床た
で、高床に粟補する方法の開発が挙げられる。 埓来技術 血液由来のHBs抗原の粟補法ずしおは、密床
募配遠心法〔Vyas.G、等、J.Immunology、
108、11141972〕、ポリ゚チレングリコヌル分画
ずゲルロ過、遠心分離を組み合わせた方法特公
昭57−21246および、硫安塩析ずゲルロ過を組
み合わせた方法特開昭53−38617などが提案
されおいる。たた組換え䜓由来のHBs抗原の粟
補を詊みた䟋ずしお、氎性二局分配ずむオン亀
換、ゲルロ過を組み合わせた粟補法〔Hitzeman.
R.A等、Nucleic Acid Reserch.11.27451983〕
等がある。しかしながら、これらの方法は、組換
え䜓由来のHBs抗原の粟補における皮々の問題
点に察し、いずれも察凊できるものではなく、い
わんや工業的粟補法ずしお適甚するこずは難かし
い。 すなわち、組換え䜓由来のHBs抗原を粟補す
るうえで解決すべき重芁な課題は、原材料䞭の借
雑成分たずえば組換え䜓由来の蛋癜質、脂質類そ
の他の成分が、質的および量的に人血液由来
HBs抗原の堎合ず党く異な぀おいるこずであり、
たたその量が産出されるHBs抗原量に比しお非
垞に倚いこずである。さらに次の問題点ずしお本
発明者らは借雑物䞭に存圚する现胞由来のプロテ
アヌれ掻性物質によ぀お、HBs抗原が急速に倱
掻されるこずを芋出した。このためHBs抗原ず
プロテアヌれ掻性物質を、出来るだけ早い段階で
完党に分離しなければ、粟補工皋においお収率の
倧巟な䜎䞋をきたしおしたうずいう問題点を解決
する必芁がある。さらに、組換え由来HBs抗原
は、そのアフむニテむヌ生物孊的芪和力の特
性が人血液由来HBs抗原ず必ずしも同䞀でない
面があり、このこずも粟補においおの重芁な問題
点の぀である。 これらのこずから、先に挙げた血液由来の
HBs抗原の粟補法に関する埓来技術のみでは、
組換え䜓由来のHBs抗原含有材料にみられる特
異条件を克服し充分な粟補効果を発揮するこずが
できない。組換え䜓由来HBs抗原の粟補を詊み
たHitzemanらの方法等においおも、その粟補の
内容は、いずれもHBs抗原の生化孊的分析甚の
暙品をうるためになされたもので、単に分析可胜
な皋床にたで粟補したにすぎず、ワクチンや蚺断
甚詊薬に甚い埗る皋床の粟補効果を期埅しうる方
法ではない。さらに粟補工皋における収率等も怜
蚎されおおらず、たたプロテアヌれ掻性物質等に
よるHBs抗原の倱掻に察する考慮は毎床くなさ
れおおらず、工業的粟補法ずしお応甚しうるもの
ではない。 発明の目的 本発明者らは、組換え䜓に由来するHBs抗原
の工業的粟補法を芋出すべく、皮々怜蚎を重ねた
結果、組換え䜓の培逊物から埗られる、现胞由来
成分等を含有するHBs抗原原材料液に、酞を添
加しおPHを酞性偎にも぀おゆくこずにより、クロ
マトグラフむヌの劚げずなる脂質類や借雑蛋癜質
の倧郚分を沈柱物ずしおHBs抗原ず分別・陀去
できるこず、および、次の工皋でハむドロキシア
パタむトによるアフむニテむクロマトグラフむヌ
を行えば、HBs抗原がきわめお高床に粟補でき
るこずを芋出し、本発明を完成するに至぀た。 すなわち本発明の目的は、安党で有効な型肝
炎ワクチンを安定か぀倧量に䟛絊するこずを可胜
ならしめるこずにあり、本発明は、組換えDNA
技術を利甚した組換え䜓により産生されるHBs
抗原を、工業的に効率よく、倧量に、しかもきわ
めお高玔床に粟補する方法を提䟛するものであ
る。 発明の構成および効果 本発明は、組換えDNA技術を利甚した組換え
䜓により産生されるHBs抗原を粟補するに際し、
組換え䜓の培逊物から埗られる、HBs抗原およ
び现胞由来成分を含有する原材料液に、酞を添加
し原材料液のPHを酞性偎に移行せしめ、クロマト
グラフむヌ法の劚げずなる脂質類や借雑蛋癜質等
の倧郚分を沈殿ずしお陀去し、次いでそのたたの
状態でもしくは、必芁に応じ硫安塩析による粟補
および濃瞮操䜜を加えたのち、ハむドロキシアパ
タむトによるアフむニテむクロマトグラフむヌを
行うこずを特城ずする。 本発明におけるHBs抗原材料液ずは、組換え
DNA技術を利甚しお、HBs抗原を産生するよう
に圢質転換された組換え䜓、䟋えば倧腞菌あるい
は酵母菌等を、適圓な、培地および培逊条件で培
逊しお、HBs抗原を産生、蓄積させた埌に、こ
の培逊物から適圓な方法でHBs抗原を粗抜出し
お埗られるものである。該組換え䜓由来HBs抗
原は、組換えDNA技術を甚いお、型肝炎りむ
ルスのDNAから取出されたHBs抗原をコヌドす
る遺䌝子を倧腞菌、酵母、動物培逊现胞などに導
入し、圢質転換させ、HBs抗原遺䌝子を働かせ
おHBs抗原を産生させるこずにより埗られるも
のであ぀お、それらの方法はすでに公知である。
䟋えば、組換え酵母由来のHBs抗原の生成法ず
しおは、バレンズ゚ラの方法Valenzuela、
Nature、298、3471982、特開昭58−77823号、
宮之原らの方法Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、
80、1983、特願昭57−142460号、ヒツツマ
ンらの方法Hizeman、Nucleic Acids
Research、11(9)、27451983、特開昭58−
109427号など、組換え動物现胞由来のHBs抗
原の生成法ずしお、野厎らの方法第30回日本り
むルス孊䌚総䌚、挔説抄録−10691982、特願
昭57−145092号などのほか、特開昭58−56685
号、特開昭58−995号および特開昭57−39784号な
どに蚘茉の方法が挙げられる。 抜出の方法は、たず菌䜓を遠心分離により培逊
物から分離し、適圓な緩衝液䞭で砎壊する。砎壊
の方法ずしおは、超音波砎砕、グラスビヌズ砎
砕、マントン・ゎヌリン砎砕、あるいは现胞の现
胞壁を酵玠的に溶解せしめおスプロプラストず
した埌、これに界面掻性剀を䜜甚させお砎壊する
等の皮々の方法を甚いうる。この现胞砎壊物を䜎
速遠心分離にかけ、现胞壁砎片等を分離し、さら
に必芁に応じメンブランフむルタヌでロ過しお
HBs抗原原材料ずする。 本発明においお、酞添加凊理に甚いる酞ずしお
は、塩酞、硫酞、リン酞等の無機酞類および、酢
酞、シナり酞等の有機酞類など通垞甚いられるも
のがいずれも適甚される。酞添加凊理の方法は、
原材料液のPHが以䞋、奜たしくは5.0〜5.5の範
囲に収たるように、酞を加えおPHの調敎を行う。
酞凊理の枩床は奜たしくは20℃以䞋、さらに奜た
しくは10℃以䞋で実斜した方がよい。PHの調敎が
すんだ埌、析出沈殿物を遠心分離し、HBs抗原
を含む䞊枅液を埗る。 ぀ぎに必芁であれば、硫安塩析による粟補およ
び濃瞮の操䜜を行う。酞添加凊理によ぀お埗られ
たHBs抗原含有䞊枅液に、適圓な濃床のアンモ
ニア氎を加え、䞊枅液のPHを6.0〜8.0の範囲に保
ちながら硫安を添加し、HBs抗原を沈殿させ、
これを遠心分離にかけ䞊枅ず分離する。埗られた
沈殿をむオン匷床が0.001〜1.0皋床である䞭性付
近の適圓な緩衝液、䟋えば0.1Mリン酞緩衝液等
に溶解し、これを同緩衝液に透析しおハむドロキ
シアパタむトによるクロマトグラフむヌに付すサ
ンプルずする。 硫安塩析を実斜しない堎合は、HBs抗原含有
䞊枅液にアンモニア氎を加えおPHを7.0に調敎し
た埌、前蚘ず同様の緩衝液に透析あるいは垌釈す
るこずによりクロマトグラフむヌ甚サンプルずす
る。 本発明においお甚いるハむドロキシアパタむト
ずは、リン酞カルシりムがその成分であるアフむ
ニテむクロマトグラフむヌ甚ゲルのこずであり、
Hydroxyapatite生化孊工業瀟、
CALBIOCHEM−BEHRING瀟、
HydroxylapatiteBio−Rad瀟の名称で垂販さ
れおおり、これらのものを甚いるずよい。このハ
むドロキシアパタむトを甚いたアフむニテむクロ
マトグラフむヌを実斜するにあた぀おは次のよう
な方法で行う。 ハむドロキシアパタむトぞのHBs抗原の吞着
は、カラム法およびバツチ法の䞡方法が実斜可胜
である。カラム法の堎合、ハむドロキシアパタむ
トを充填したカラムに、クロマトグラフむヌ甚サ
ンプル調補時に甚いたず同䞀の緩衝液を通液しお
平衡化を行぀た埌、サンプルを通液したHBs抗
原を吞着させるこずにより、プロテアヌれ掻性物
質をはじめずする借雑物質ず分離する。通液終了
埌、平衡化緩衝液を通液し、カラムを掗浄し、借
雑物を掗い出す。 たたバツチ法の堎合は、緩衝液にお平衡化した
ハむドロキシアパタむトを、サンプル液に添加し
緩速床にお0.5〜時間皋床撹拌しおHBs抗原を
吞着させる。吞着埌、ロ過噚䞊でハむドロキシア
パタむトをロ過し、このゲルに平衡化緩衝液を加
えお掗浄・ロ過分離を数回繰り返す。 次に溶出操䜜は、吞着をバツチ法で実斜した堎
合も、HBs抗原を吞着したハむドロキシアパタ
むトをカラムに充填しお、カラム法による溶出を
実斜した方がよい。 溶出は、むオン匷床が0.1〜5.0皋床であり、か
぀平衡化緩衝液によりむオン匷床が倧である䞭性
付近の緩衝液を甚いお、段階溶出あるいは濃床募
配溶出を実斜し、吞着借雑物質ずHBs抗原を分
離溶出させ、HBs抗原を含有するフラクシペン
を分取する。かかる操䜜により、きわめお有効に
か぀高床にHBs抗原を粟補するこずができる。
濃床募配溶出は䟋えば、0.1M→0.5Mのリン酞緩
衝液濃床募配を甚いおもよいし、0.1Mリン酞緩
衝液・食塩添加0.1M→1.0M濃床募配を甚いおも
よく、HBs抗原ず借雑物質ずの分離良奜な他の
適圓な濃床募配緩衝液を甚いおもよい。段階溶出
の堎合は、HBs抗原ず借雑物質のどちらか䞀方
のみが溶出されるむオン匷床の緩衝液を通液し、
続いお他方が溶出されるむオン匷床の倧きい緩衝
液を通液するこずにより、高床に粟補された
HBs抗原を含有するフラクシペンを分取する。 このようにしお埗られたHBs抗原を、次の工
皋ずしお、蔗糖ステツプグラゞ゚ント超遠心たた
は蔗糖リニアグラゞ゚ント超遠心、および必芁で
あれば塩化セシりムを甚いた沈降平衡超遠心たた
はリニアグラゞ゚ント超遠心にかけるこずによ
り、ほが完党に粟補されたHBs抗原を埗るこず
ができる。 本発明の方法によれば、酞凊理−ハむドロキシ
アパタむトクロマトグラフむヌの組み合わせずい
う、簡単でしかも工業的に実斜できる方法によ
り、組換え䜓由来HBs抗原を、きわめお効率よ
く、か぀高玔床に粟補するこずが可胜である。 酞凊理により、クロマトグラフむヌの劚げずな
る借雑蛋癜質、脂質類等の倧郚分が沈殿ずしお陀
去されるため、ハむドロキシアパタむトゲルml
圓りmg以䞊のHBs抗原が吞着され、これによ
りクロマトグラフむヌゲルの䜿甚量、蚭備ずもに
小芏暡で枈み非垞に効率的である。このハむドロ
キシアパタむトクロマトグラフむヌの工皋におい
お、比掻性HBs抗原量含有蛋癜質量は100
〜150倍皋床䞊昇し、著しく良奜な粟補効果が埗
られる。 たた酞凊理−ハむドロキシアパタむトクロマト
グラフむヌの工皋で、原材料䞭に含たれるプロテ
アヌれ掻性物質が完党に陀去されるため、収率も
高く、クロマトグラフむヌ終了たでのHBs抗原
の収率は50〜60ずいうきわめお高い倀に達す
る。このプロテアヌれ掻性物質の存圚は実際
HBs抗原の安定性に係わる重芁な問題であ぀お、
原材料液のHBs抗原粗抜出液を℃あるいは−
20℃で保存しおも、わずか週間ほどで、HBs
抗原のほずんどが倱掻しおしたうほどの悪圱響を
䞎える。さらに粟補の条件によ぀おは、プロテア
ヌれ掻性が曎に匷たり、わずかの時間でHBs抗
原が倱掻しおしたうこずもある。 本発明者らは、ハむドロキシアパタむトに替え
お、DEAEセルロヌス、DEAEセフアロヌス、
CMセルロヌス、CMセフアロヌス、リン酞セル
ロヌス、ブルヌデキストランセフアロヌス等のク
ロマトグラフむヌ甚ゲルを、皮々条件を倉えお、
組換え䜓由来HBs抗原の粟補に甚いるべく詊み
たが、粟補効果が党く期埅されないばかりか、
HBs抗原の倱掻を䞻原因ずする極端な䜎収率の
ため、工業mlLowry法にお枬定である
HBs抗原粗抜出液を埗る。次いで、PHメヌタヌ
でチ゚ツクし぀぀粗抜出液に酢酞60氎溶液
を滎䞋し、PHを5.2を調敎する。℃で玄30分間
撹拌した埌、遠心により沈殿物を陀去する。 遠心䞊柄にアンモニア氎を加えおPHを玄6.5に
保ち぀぀、最終濃床2.5Mずなるように硫安を
埐々に加える。玄30分攟眮埌遠心によりHBs抗
原を含有する沈殿を分離回収する。 回収した沈殿を、0.1Mリン酞緩衝液PH7.2
箄300mlに懞濁させ、透析チナヌブにお玄100倍量
の同緩衝液に察しお透析する。 透析埌0.1Mリン酞緩衝液で玄倍に垌釈し、
同緩衝液で平衡化しおおいたハむドロキシアパタ
むトカラムゲル量玄に通液し、HBs抗
原を吞着させる。平衡化緩衝液でカラムを充分に
掗浄した埌、玄の0.1→0.5M濃床募配リン酞
緩衝液を通液し溶出を行い、HBs抗原を含むフ
ラクシペンを集める。 次にBeckman SW−28甚超遠心チナヌブに、
的な応甚の可胜性を芋い出すこずはできなか぀
た。 本発明の方法においお、ハむドロキシアパタむ
トクロマトグラフむヌによ぀お埗られたHBs抗
原を、蔗糖グラゞ゚ント超遠心および塩化セシり
ムグラゞ゚ント超遠心により粟補しおえられた粟
補HBs抗原は、SDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動分析においお、HBs抗原の単䞀バンド
を瀺し、きわめお高玔床のものである。 ぀ぎに実斜䟋を挙げお本発明をさらに具䜓的に
説明する。 実斜䟋  組換え酵母サツカロミセス・セレビシ゚
AH22PAS101特願昭57−142460号を参照を
培逊埌、遠心により集菌した菌䜓玄Kgに、
0.1Mリン酞緩衝液PH7.2を加え、これを
600〜700Kgcm2の圧力で玄回マントン・ゎヌリ
ン砎砕機にかけ菌䜓を砎壊する。菌䜓砎壊物を遠
心にかけ、粗倧菌䜓砎片を分離しお、HBs抗原
濃床1.3Όml〔RIAキツトAusriaアボツト
瀟にお枬定〕、蛋癜質濃床7.82mg50蔗糖溶液、
20蔗糖溶液、HBs抗原フラクシペンをそれぞ
れml、17ml、15ml重局し、27000rpm、℃で
16時間超遠心を行い、HBs抗原を蔗糖液局界面
に濃瞮・粟補する。 埗られた粟補HBs抗原画分を0.1MPBS緩衝液
に透析した埌、塩化セシりムを1.2mlの濃床
ずなるように加えお、Beckman SW−28で
25000rpm、10℃で60時間超遠心し濃瞮・粟補さ
れたHBs抗原を埗る。 各工皋たでのHBs抗原の回収率察粗抜出液
äž­HBs抗原量、及び粟補床を衚わす比掻性倀の
比察粗抜出液を第衚に瀺す。 ハむドロキシアパタむトクロマト溶出画分の粟
補床は637倍に及び、本方法が極めお粟補効果が
高いこずを瀺しおいる。 【衚】 トクロマトグラフむヌ画分
なお、各工皋のサンプルに぀きプロテアヌれ掻
性をProtease Substrate Gel TabletsBio−
Rad瀟を甚いお枬定した、その結果粗抜出液は
トリプシン含量玄800Όml盞圓のプロテアヌ
れ掻性があ぀たが、硫安塩析沈殿は同玄50Ό
mlの掻性であり、ハむドロキシアパタむトクロマ
トグラフむヌ画分は党く掻性が存圚しなか぀た。 実斜䟋  組換え酵母サツカロミセス・セレビシ゚
AH22PAH203特願昭57−142460号を参照
を培逊埌、遠心より集菌した菌䜓100に、
0.1Mリン酞緩衝液PH7.2500mlを加え、これ
を玄90分間、10℃以䞋にお超音波凊理にかお菌䜓
を砎壊する。 遠心により菌䜓砎片を陀き粗抜出液を埗る。次
いで、PHメヌタヌでPHをチ゚ツクしながらこの粗
抜出液に塩酞を滎䞋しPHを玄5.2に調敎する。
℃で玄30分間撹拌した埌、遠心により沈殿物を陀
去する。遠心䞊枅にアンモニア氎を加えおPHを玄
7.0ずした埌、0.1Mリン酞緩衝液PH7.2で〜
倍に垌釈する。次いで、同じ緩衝液で平衡化し
おおいたハむドロキシアパタむトカラムに通液
し、HBs抗原を吞着させる。平衡化緩衝液で充
分に掗浄した埌、玄300mlの0.2Mリン酞緩衝液
PH7.2を通液しお吞着しおいる借雑物を溶出す
る。次に玄300mlの0.5Mリン酞緩衝液PH7.2
に通液し、HBs抗原を含む画分を回収する。 以䞋実斜䟋ず同様にしお、蔗糖超遠心および
CsCl超遠心を実斜し、粟補HBs抗原を埗る。 各工皋たでのHBs抗原の回収率、粟補床を第
衚に瀺す。 【衚】 実斜䟋における、蔗糖超遠心画分およひ実斜
䟋のCsCl超遠心画分の各サンプルを、SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析にかけたず
ころ、いずれもHBs抗原の構成サブナニツト蛋
癜質である分子量玄24000の単䞀バンドを瀺し、
きわめお高玔床なものであ぀た。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  HBs抗原を粟補する方法においお、HBsAg
    をコヌドする遺䌝子で圢質転換された酵母の培逊
    物を砎壊しお埗られるHBs抗原粗抜出物をHBs
    抗原原材料ずしお甚い、これを酞添加凊理し、぀
    ぎに硫安塩析を行うかたたは行わないで、続いお
    ハむドロキシアパタむトゲル・アフむニテむクロ
    マトグラフむヌを行うこずを特城ずするHBs抗
    原の粟補方法。  HBs抗原原材料が、該圢質転換酵母の培逊
    物を超音波砎砕、グラスビヌズ砎砕、マントン・
    ゎヌリン砎砕、あるいは界面掻性剀凊理等により
    その組換え䜓现胞を砎壊しお埗られるHBs抗原
    粗抜出物である前蚘第項蚘茉の方法。  酞添加凊理が、HBs抗原原材料に酞を加え
    お借雑蛋癜質、および脂質を沈柱ずしお分離する
    こずである前蚘第項蚘茉の方法。  酞添加凊理に甚いる酞が、塩酞、硫酞、燐
    酞、酢酞、シナり酞の䞭から遞ばれる少なくずも
    皮である前蚘第項たたは第項蚘茉の方法。  ハむドロキシアパタむトゲル・アフむニテむ
    クロマトグラフむヌにおいお段階溶出たたは濃床
    募配溶出を行う前蚘第項蚘茉の方法。  HBs抗原原材料を酞添加凊理し、぀ぎに硫
    安塩析を行うかたたは行わないで、続いおハむド
    ロキシアパタむトゲル・アフむニテむクロマトグ
    ラフむヌを行い、プロテアヌれ掻性物質を完党に
    陀去したHBs抗原を埗る前蚘第項蚘茉の方法。
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