JPS63255300A - 硫酸エステル化物を用いて乳からラクトフエリンを分離、精製する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 崖！上皇五王立！ 本発明は、種々の生理的活性を有し、薬理学的・にも重
要な乳蛋白質であるラクトフェリンを、それを含有する
乳から有効に分離、精製する方法に関する。

′とその５　今 ラクトフェリンは、乳等の外分泌液中に存在する鉄路合
性の糖蛋白質であって、病原性細菌に対する静菌作用、
白血球の分化調節作用及び殺菌力増強作用、リンパ球の
増殖作用及び鉄吸収調節作用等の種々の生理的活性を有
するため、栄養学的のみならず薬理学的にも重要な乳蛋
白質であるといえる。

したがって、従来からも乳からラクトフェリンを分離、
精製する方法が検討されてきたが、ラクトフェリンは非
常に反応性に冨んだ分子構造を有する蛋白質であり、か
つ他の乳蛋白質とも相互作用を示すため、高純度のラク
トフェリンを、簡易な操作により高収率で分離、精製す
るのが困難とされていた、すなわち、高純度のラクトフ
ェリンを分離するには、工程が煩雑となり、分離に長時
間を要し、加うるにラクトフェリンの回収率も著しく低
いという問題があった。

最近、ラクトフェリンの分離精製法として、ラクトフェ
リンと生物学的親和性を持つヘパリンをセファロースＣ
Ｌ−６Ｂ　（ファルマシア社製）のようなりロマトグラ
フイー用担体にＣＮＢｒなどにより固定化したアフイニ
テイ−カラムに通液してラクトフェリンを分離、精製す
る方法（Ｂｌａｃｋｂｅｒｇ、Ｌ。

ｅｔ、ａｌ　ｒエフイービーニス　レターズＪ　　（Ｆ
ＥＢ　Ｓ　ＬＥＴＴ、）　１０９，１８０　（１９８０
））が報告された。

しかし、ヘパリンは豚や牛などの肝臓又は腸から抽出精
製されるものであり、その抽出源が違えばヘパリンの性
状も異なるため、同一性状のヘパリンを大量に入手する
のが困難であり、かつ高価である。したがって、ヘパリ
ンを結合させて固定化したアフィニティークロマトグラ
フィー用担体を用いて乳からラクトフェリンを分離、精
製する方法は、実験的規模に限られ、大量の乳を処理す
る工業規模での方法には実用性が乏しい。さらに、上記
方法では担体に固定化させたヘパリンが脱落して分離し
たラクトフェリンに混入する恐れもあるという問題もあ
る。

Ｕが　°　しようとする晋題 本発明は、畝上の状況に鑑みなされたものであって、ヘ
パリンと同様なラクトフェリンに対して生物学的親和性
を有し、かつ物理的安定性の優れた硫酸エステル化物を
用いて乳からラクトフェリンを工業的規模で簡易な操作
により、高純度かつ高収率で極めて効率的に分離、精製
するための方法を提供することにある。

以下本発明の詳細な説明する。

又里至盪底 本発明の特徴は、架橋型ポリサッカライドの硫酸エステ
ル化物に、ラクトフェリ・ン含有原料乳を接触させてラ
クトフェリンを吸着させ、次いで吸着ラクトフェリンを
溶出して回収することにある。

量　を　°　るための 本発明で用いる架橋型ポリサッカライドの硫酸エステル
化物は、アガロース、セルロース並びにキチンなどのポ
リサッカライドを、架橋剤、例えばエピクロルヒドリン
などで架橋したもの（市販されている）を無水硫酸やク
ロルスルホン酸などで硫酸エステル化して得られるもの
であって、大量に調製し得る。

しかし、アガロースは軟らかく変形し易いため、ラクト
フェリンを工業的規模で取得することを目的とする場合
には、セルロースやキチン等硬質の担体を用いる方が望
ましい。

この架橋型ポリサッカライドの硫酸エステル化物は、水
性溶媒に不溶性であり、物理的安定性にも優れているの
で、該硫酸エステル化物を充填して成るアフイニテイ−
カラムは工業的規模での通液操作にも十分耐えることが
できる。

架橋型ポリサッカライドの硫酸エステル化物としては、
架橋型セルロース（アミノ基を有する）を硫酸エステル
化した硫酸化セルロファイン並びに架橋型キトサン（ア
ミノ基を介して架橋）を硫酸エステル化した硫酸化キト
バール等を例示し得る。

これらの架橋型ポリサッカライドの硫酸エステル化物を
用いて乳からラクトフェリンを分離、精製するには、該
硫酸エステル化物を担体として充填したカラムに原料乳
を通液するか、もしくは原料乳に上記硫酸エステル化物
を混合して攪拌することにより行うとよい。

本発明では、硫酸エステル化物との接触は５０℃以下の
温度、好ましくは室温で行い、原料乳のカラムへの通液
によりカラムに対する非吸着画分を溶出させた後、０．
３Ｍ食塩水もしくは０．３Ｍ食塩を含むｐＨ５，０〜９
．０のリン酸ナトリウム、トリス−■Ｃ１゜アムモニア
ー〇ＣＩ又はベロナール等の０．ＯＩＭ〜０．０２Ｍ緩
衝液でカラムを洗浄し、次いで０．４Ｍ〜１．５Ｍ食塩
水、好ましくは１．０Ｍ食塩水もしくは１．０Ｍ食塩水
を含む上記緩衝液を通液してカラムに吸着しているラク
トフェリンを溶出することにより、乳からラクトフェリ
ンを分離できる。

または、原料乳と硫酸エステル化物を混合した後に該エ
ステル化物をデカンテーションもしくは遠心分離により
回収する。このエステル化物を０．３Ｍ食塩水又は０．
３Ｍ食塩水を含むｐｌ＋　５．０〜９．０の緩衝液で洗
浄し、再びデカンテーションもしくは遠心分離してエス
テル化物を回収する。このエステル化物に０．４〜１．
５Ｍの食塩水もしくは０．４〜１．５Ｍの食塩水を含む
上記緩衝液を加え、よ（洗った後に静置する。デカンテ
ーション又は遠心分離によって上澄液を回収することに
より乳からラクトフェリンを分離し得る。

分離されたラクトフェリンは電気透析（Ｅ　Ｄ）装置も
しくは逆浸透（ＲＯ）装置により脱塩した後、凍結乾燥
して４０℃以下、好ましくは４℃で保存する。なお、上
記によりラクトフェリンを分離した後の上記エステル化
物は２Ｍ食塩水で洗浄し、さらに０．１５Ｍ食塩水を通
液することにより再生できる。

上述のようにして得られたラクトフェリンは、ＳＤＳ電
気泳動図より、純度９５％以上であることが確認される
。

本発明において用いられる原料乳としては、ヒト並びに
牛や山羊等の哺乳動物の初乳、移行孔、常乳、末期乳等
を例示でき、さらに低温殺菌した乳及びホエー等も使用
できる。

主皿五四玉 本発明に従って、これらの原料乳からラクトフェリンを
分離、精製すると、従来法にみられる操作や工程の煩雑
さに起因する処理時間の長いこと及び回収率の低いこと
等の問題が解決される。

すなわち、本発明によるとラクトフェリンを高純度でか
つ高収率で回収できる。特に、本発明では、物理的安定
性の優れた架橋型ポリサッカライド硫酸エステル化物の
みを用いて乳中のラクトフェリンを吸着するものである
から、従来のヘパリンを固定化したアフィニティークロ
マトグラフィー用担体を用いる場合にみられるようなヘ
パリンが担体から脱落する等の懸念もなく、さらに、上
記吸着したラクトフェリンも食塩水のみの使用で容易に
溶出できるので、分離操作を極めて効率に行うことがで
きる。。

また、本発明で用いる架橋型ポリサッカライド硫酸エス
テル化物は、資源的に豊富なセルロースやキチンを原料
とする架橋型ポリサッカライドを硫酸エステル化して得
られるので、大量に調製でき安価に入手し得る利点があ
る。

さらに、本発明に従って分離、精製されたラクトフェリ
ンは、その鉄結合能を−ｏｏｄｗｏｒｔｈ　らの方法〔
「ブロタイドスバイオロジカルフルーイドスブロシーデ
イングコロキュームＪ　（ＰｒｏｔｉｄｅｓＢｉｏｌ、
Ｆｌｕｉｄｓ　Ｐｒｏｃ、Ｃｏ１）ｏｑ、）１４．３７
（１９６６９）に準じて測定した結果、ラクトフェリン
１ｇ当り１．３〜２．１ｗ＋ｇの鉄結合能を示すことか
ら、本来の鉄結合能を完全に保有していることが立証さ
れる。したがって、本発明により得られるラクトフェリ
ンは、鉄要求性病原菌に由来する乳児の感染防御のため
の予防薬及び該病原菌によってもたらされる各症状の治
療薬として利用できる。

更に、本発明では前記方法により分離、精製したラクト
フェリン溶液に、直接塩化第二鉄を混合し良く攪拌した
後、そのままＦＤ装置又はＲＯ装置に通すことにより、
鉄飽和型ラクトフェリンを簡易に分離することができる
ので、特にラクトフェリンの腸管での鉄吸収の促進にも
有効に利用できる。因に、鉄飽和型ラクトフェリンが腸
管からの鉄の吸収を向上させる効果を有することは報告
されている（Ｃｏｘ、Ｔ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ　ｒバイオ
ケミアバイオフイジクスアクタＪ　（Ｂｉｏｃｈｉｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）５８８．１２０（１９７９
）　）　。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。

実施例１ 市販の架橋セルロースであるセルロファイン（商品名）
を常法により無水硫酸で硫酸エステル化した硫酸化セル
ロファイン５０＋ｓ　１２を、直径２ｃ＋ｎ、長さ２０
ｃＩｌｌＯカラムに充填し、このカラムに脱脂したヒト
初乳５ｈｉｔを１０ｓ　Ｉｌ　／ｓｉｎ、で通液した。

次いでカラムを０．３Ｍ食塩水３００１）１で洗浄した
後、１．０Ｍ食塩水１００ｗｊ！でカラムに吸着してい
るラクトフェリンを溶出した。得られたラクトフェリン
溶液を十分量の脱イオン水に対して透析を行った後、凍
結乾燥してヒトラクトフェリン１）０＋ｓｇを得た。

回収したヒトラクトフェリンの純度は、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動図より９７％と測定され、鉄路
合量は血清鉄測定キット（和光純薬社製）により０．２
ａ＋ｇ　Ｆｅ７ｇ蛋白質であった。また、総鉄結合能は
−ｏｏｄｗｏｒｔｈの方法により、１００％と算定され
た。

実施例２ 市販の架橋型キトサンであるキトパール（商品名）を常
法により無水硫酸で硫酸エステル化した硫酸エステル化
キトパール１ｊ！を、直径８ｃｍ、長さ２０ｃｍのカラ
ムに充填し、このカラムに脱脂した牛乳５０Ａを２０１
　／ｈｒ、で通液した。次いでカラムを０．３Ｍ食塩水
５１で洗浄した後、１．０Ｍ食塩水３１でカラムに吸着
しているラクトフェリ・ンを溶出した。得られたラクト
フェリン溶液を小型のＥＤ装置（ＴＳ−２１０、徳山ソ
ーダ社製）を用いて脱塩した後、ＵＦ装置ｆ　（ＤＨ−
２、アミコン社製）で１０倍に濃縮して凍結乾燥した。

回収したラクトフェリンは６ｇであり、純度は９５％と
測定され、また、その鉄路合量は０．２ｍｇ　Ｆｅ７ｇ
蛋白質と測定され、総鉄結合能は９８％であることがｔ
ａ認された。

実施例３ 本例は、ラクトフェリンの分離、精製を、バッチ方式に
より原料乳と硫酸エステル化物を混合して行う態様を示
したものである。

実施例２において使用した硫酸化キトパールに２．０Ｍ
食塩水と、更に０．１５Ｍ食塩水を通液して該硫酸化キ
トパールを再生した。

この再生硫酸化キトパールｌβとチーズホエー１００１
とを１時間攪拌下に混合し、次いでゲル状の混合物を０
．３−食塩水５１で洗浄した後、１．０？１食塩水３１
で上記ゲル状混合物に吸着しているラクトフェリンを溶
出した。得られたラクトフェリン溶液に塩化第二鉄５０
ｍｇを添加し、よく攪拌して逆浸透装置（ＭＲＧ　１０
型、三菱レーヨン社製）で脱塩及び濃縮（１０倍）した
後、凍結乾燥し、鉄飽和型ウシラクトフェリン４．８ｇ
を得た０回収したウシラクトフェリンは純度９５％であ
り、鉄路合量は１．３＋ｗｇ　Ｆｅ７ｇ蛋白質と測定さ
れ、鉄の飽和度が９３％以上であると確認された。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）架橋型ポリサッカライドの硫酸エステル化物に、
   ラクトフエリン含有原料乳を接触させてラクトフエリン
   を吸着させ、次いで吸着ラクトフエリンを溶出すること
   を特徴とする乳からラクトフエリンを分離、精製する方
   法。
2. （２）架橋型ポリサッカライドの硫酸エステル化物から
   成るアフイニテイ−カラムに、ラクトフエリン含有原料
   乳を通して接触させる特許請求の範囲第（１）項記載の
   方法。
3. （３）吸着ラクトフエリンを０．４〜１．５Ｍ食塩水を
   含む緩衝液で溶出した後、電気透析もしくは逆浸透に付
   して脱塩する特許請求の範囲第（１）項又は第（２）項
   のいずれかに記載の方法。