WO1988008006A1 - Process for separating and purifying lactoferrin from milk using sulfate compound - Google Patents

Process for separating and purifying lactoferrin from milk using sulfate compound Download PDF

Info

Publication number
WO1988008006A1
WO1988008006A1 PCT/JP1988/000353 JP8800353W WO8808006A1 WO 1988008006 A1 WO1988008006 A1 WO 1988008006A1 JP 8800353 W JP8800353 W JP 8800353W WO 8808006 A1 WO8808006 A1 WO 8808006A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
milk
lactoferrin
adsorbed
separating
saline
Prior art date
Application number
PCT/JP1988/000353
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Kawakami
Morimasa Tanimoto
Shunichi Dousako
Original Assignee
Snow Brand Milk Products Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Snow Brand Milk Products Co., Ltd. filed Critical Snow Brand Milk Products Co., Ltd.
Priority to DE8888903358T priority Critical patent/DE3874527T2/de
Publication of WO1988008006A1 publication Critical patent/WO1988008006A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/832—Milk; colostrum

Definitions

  • the present invention provides a method for effectively separating and purifying lactofrin, which is a pharmacologically important milk protein having various physiological activities, from milk containing the same. About.
  • Lactfurin is an iron-binding glycoprotein present in exocrine fluids such as milk, and it has a bacteriostatic action against pathogenic bactericidal activity, a regulatory action on leukocyte differentiation and an enhancement of bactericidal activity. Since it has various physiological activities such as its action, lymphocyte proliferation and iron absorption regulation, it is an important milk protein not only nutritionally but also pharmacologically. No.
  • lactofurin is a highly reactive protein having a molecular structure that is highly reactive and interacts with other milk proteins. It was difficult to separate and purify kutferin in a high yield by a simple operation. In other words, the separation of high-purity lactoferrin requires a complicated process, requires a long time for separation, and requires high power lactoferrin. The problem was that the recovery rate was extremely low.
  • cephaloferrin has been used as a method of separating and purifying lactoferrin.
  • -Chromatographic support such as SUS 6B (Falmacia Co., Ltd.), which is suitable for A method for separating and purifying lactoferrin through a raw material solution through an affinity column with immobilized heparin, which has biological affinity, [Blackberg, L. et. al "FBS Letters J (FEBS LETT.) 109, 180 (1980)] was reported.
  • heparin is extracted and purified from liver or intestine such as pigs and cattle, and the properties of norin differ depending on the source of its extraction. It is difficult and expensive to obtain heparin in large quantities. Therefore, using a carrier for affinity chromatography to which henolin is bound and immobilized, the fermentation of milk from milk is separated.
  • implementation of the purification method is limited to an experimental scale, and is not practical on an industrial scale where a large amount of milk is processed.
  • the heparin immobilized on the carrier may fall off and be mixed into the separated lactate ferrine. .
  • a first object of the present invention is to provide a method for separating and purifying lactofrin from milk on an industrial scale by a simple operation.
  • a second object of the present invention is to provide a method for separating and purifying lactopurine from milk with high efficiency and high purity and high yield. .
  • a feature of the present invention is that a lactoferrin-containing raw material milk is brought into contact with a sulfated ester of a crosslinked polysaccharide to adsorb lactoferrin. Then, the adsorbed lactoferrin is eluted and recovered.
  • the sulfated ester of the crosslinked polysaccharide used in the present invention has the same biological affinity for lactoferrin as henolin, However, it has better physical stability.
  • the sulfated ester is obtained by crosslinking a polysaccharide such as agarose, cellulose and chitin with a cross-linking agent [eg epichlorohydrin]. It can be prepared in large quantities because it can be obtained by subjecting the bridged product (commercially available) to esterification with sulfuric anhydride, chlorosulfonic acid, or the like.
  • agarose is soft and easily deformed. Therefore, if the purpose is to obtain lactoferrin on an industrial scale, the cell mouth must be closed. It is preferable to use a rigid carrier such as chitin.
  • the esterified sulfate of such a cross-linked polysaccharide is insoluble in an aqueous solvent and has excellent physical stability. Therefore, the esterified sulfate is filled with the esterified sulfate. The resulting ram can withstand the flow operation on an industrial scale.
  • sulfated ester of cross-linked polysaccharide Is a selenium sulfate fin in which bridge-type cellulose (having an amino group) is esterified, or a cross-linked chitosan (cross-linked via an amino group).
  • bridge-type cellulose having an amino group
  • a cross-linked chitosan cross-linked via an amino group
  • the sulfated product is used as a carrier. ⁇ It may be done by passing the raw milk through the prepared column, or by mixing the raw milk with the above-mentioned sulfated ester and stirring.
  • the contact between the sulfated ester and the raw milk containing lactoferrin is carried out at a temperature of 50 ° C. or less, preferably at room temperature.
  • the pH is adjusted to 0.3M salt solution or 0.3M salt solution containing 0.3M salt. 5.
  • Q ⁇ 9.
  • QM or 1.0M saline is passed through the column and adsorbed on the column. By eluting lactoferrin, lactoferrin can be separated from milk.
  • a lactobrin it is possible to separate a lactobrin in the following manner. First, mix the raw milk and the esterified sulfate After that, the esterified product is recovered by decantation or centrifugation. The esterified product thus obtained is washed with 0.3 M saline or a buffer solution containing 0.3 M saline at a pH of 5.0 to 9.0, and then decanted or centrifuged again to give an ester. Collect compounds. The esterified product thus obtained may be added to 0.4 to 1.5 M saline or 0.4 to 1.5 M salt solution.
  • the separated lactoferin is desalted by electrodialysis (ED) or reverse osmosis (R0) equipment, and then lyophilized to 40 or less, preferably Store at 4 ° C.
  • ED electrodialysis
  • R0 reverse osmosis
  • the above-mentioned esterified product after separating the lactofurin by the above method is washed with 2M saline, and further passed with 0.15M saline. Can be played back.
  • the purity of the lactoferrin obtained as described above is confirmed to be 95% or more.
  • Examples of the raw material milk used in the present invention include human colostrum, transitional milk, normal milk, end-stage milk, etc. of humans and mammals such as cattle and goats. Examples include sterilized milk and whey.
  • the fert Separation and purification of the protein solve problems such as a long processing time and a low recovery rate, which are caused by complicated operations and steps in the conventional method.
  • lactoferrin can be recovered with high purity and high yield.
  • lactic acid phenol in milk is adsorbed using only a crosslinked polysaccharide sulfate esterified compound having excellent physical stability. Therefore, the heparin falls off from the carrier as in the case of using a conventional affinity chromatography carrier with immobilized heparin. There are no concerns such as squats. Further, in the present invention, the adsorbed lactoferrin can be easily eluted by using only saline, so that the separation operation can be performed extremely efficiently.
  • the crosslinked polysaccharide sulfate esterified compound used in the present invention is a cross-linked polysaccharide made from cellulose abundant as a raw material. Since it can be obtained by sulphating the sulfide, there is an advantage that it can be prepared in large quantities and can be obtained at low cost.
  • the lactoferrin isolated and purified according to the present invention has its iron binding ability determined by the method of W00dw0rth et al. ("Protoid noise"). Results of lj determination in accordance with "Professional Biologics Procolding Colour” (Protides Biol. Fluids Proc. Co 11 oq.) 14, 37 (19669). 1.3 to 2.1 mg iron per liter The ability shows that it possesses the original iron binding ability. Therefore, the fractfurin obtained by the present invention is provided by a prophylactic agent and the pathogen for the protection of the infection of an infant derived from an iron-requiring pathogen. It can be used as a treatment for each symptom.
  • the present invention after the ferrite chloride solution separated and purified by the above method is directly mixed with ferric chloride and stirred well, the FD device or R0 By passing through a device, it is possible to easily separate the saturable lactoferrin, and therefore the present invention is also useful for promoting iron absorption particularly in the intestinal tract.
  • iron-saturated lactoferrin has an effect of enhancing the absorption of iron from the intestinal tract [Cox. TM et " Ano's “Physics Factor” (Binchim. Biophys. Acta) 588 120 (1978)] o
  • Example 1 Example 1
  • a commercially available crosslinked cellulose cell mouth fin (trade name) was esterified with sulfuric anhydride according to a conventional method to give a sulfated cell mouth fin 5 (i, 2 cm in diameter).
  • a 20 cm long column was filled, and 5 OmJ of human colostrum defatted was passed through the column at a speed of 10 mmi ⁇ .
  • the column was adsorbed to the column with 1.0 M saline IOUJU, and the eluate of lactoferrin was eluted.
  • the lactoprine solution was dialyzed against a + amount of deionized water, and then lyophilized to obtain lactogram.
  • the purity of the recovered human fermentin can be determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the amount of iron bound was 0.2 mg Fe / g protein by a serum iron measurement kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the total iron binding capacity was calculated to be 100% according to Woodworth's method.
  • Chitopearl (trade name), which is a commercially available frame-type chitosan (trade name), is esterified with sulfuric anhydride using a conventional method to give esterified chitopearl sulfate 1 with a force of 8 cm in diameter and 20 cm in length.
  • 50 £ of skimmed milk was passed through the column at a rate of 20 £ Z hr.
  • the column was washed with 5 0 of 0.3 M saline, and then lactopurin adsorbed on the column was eluted with 3 1 of 1.0 M saline.
  • the obtained lactophylene solution was desalted using a small ED device (TS-210, manufactured by Tokuyama Soda Co., Ltd.), followed by a UF device (DH_2, manufactured by Amicon). It was concentrated 10 times and freeze-dried.
  • the recovered human phytoferrin was 6 g, the purity was determined to be 95%, and the amount of iron binding was determined to be 0.2 mg Fe / g protein, and the total iron binding was determined. It was confirmed that the performance was 98%.
  • Example 3 This example shows an embodiment in which lactpurin is separated and purified by mixing raw milk and sulfated ester according to the batch method.
  • the sulfated kit pearl used in Example 2 was passed through a 0.2M saline solution and then a 0.15M saline solution to regenerate the sulfated kit pearl.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

明 細 書
硫酸エ ス テル化物を用 いて乳か ら ラ ク 卜 フ ユ リ ン を分 離、 精製す る 方法
技 術 分 野
本発明 は 、 種々 の生理的活性を有 し 、 薬理学的 に も 重要な乳蛋 白質であ る ラ ク 卜 フ リ ン を 、 それを含有 す る 乳か ら有効に分離、 精製す る方法に関す る 。
景
背
ラ ク 卜 フ リ ン は、 乳等の外分泌液中 に存在す る鉄 結合性の糖蛋 白質であ っ て 、 病原術性殺菌に対す る 静菌 作用 、 白血球の分化調節作用及び殺菌力増強作用 、 リ ン パ球の増殖作用及び鉄吸収調節作用等の種 々 の生理 的活性 を有す る た め、 栄養学的のみな らず薬理学的 に も 重要な乳蛋 白質であ る と い え る 。
し た が っ て 、 従来か ら も乳か ら ラ ク 卜 フ ェ リ ン を分 離、 精製す る 方法が検討さ れて き た。 し か し 、 ラ ク 卜 フ ユ リ ン は非常 に反応性 に富ん だ分子構造を有す る 蛋 白質で あ り 、 かつ他の乳蛋 白質 と も相互作用 を示す た め 、 高純度の ラ ク 卜 フ ェ リ ン を 、 簡易 な操作に よ り 高 収率で分離、 精製す る のが困難であ っ た。 す なわ ち、 高純度の ラ ク 卜 フ ェ リ ン を分離す る に は、 工程が煩雑 と な り 、 ま た分離に長時間 を要 し 、 力□ う る に ラ ク ト フ ェ リ ン の回収率 も著 し く 低い と い う 問題があ っ た。
最近、 ラ ク 卜 フ ェ リ ン分離精製法 と し て 、 セ フ ァ ロ —ス Cい 6 B ( フ- 'ア ルマ シア社製） の よ う なク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー用担体に CNBrな ど に よ り 、 ラ ク 卜 フ ェ リ ン に 対 して生物学的親和性を持つへパ リ ン を固定化 し た ァ フ ィ ニティ 一カ ラ ム に、 原料液を通 し て ラ ク ト フ エ リ ン分離、 精製する方法 [ Blackberg, L. et al 「エ フ ィ ー ビ一 エス レ タ ーズ J (F E B S LETT. ) 109, 180 (1980) ]が報告された。
し か し 、 へパ リ ン は豚や牛な どの肝臓又は腸か ら抽 出精製さ れた も のであ り 、 その抽出源の違い に応じへ ノ リ ン の性状 も異なる ため、 同一性状のへパ リ ン を大 量 に入手す る の は困難であ り 、 かつ高価であ る 。 し た がっ て 、 へノ リ ン を結合さ せて固定化 し たァ フ ァ ニテ ィ ーク ロ マ ト グラ フ ィ ー用担体を用 いて、 乳か ら ラ ク 卜 フ ェ リ ン分離、 精製する方法の実施は、 実験的規模 に限 ら れ、 大量の乳を処理す る工業規模では実用性が 乏 し い。 さ ら に、 上記方法では、 担体に固定化させた へパ リ ン が脱落 し て 、 分離されたラ ク 卜 'フ ェ リ ン に混 入す る 恐れ も あ る と い う 問題も あ る 。
発 明 の 開 示
本発明 の第 1 の 目 的は、 乳か ら ラ ク ト フ リ ン を簡 易 な操作に よ り 工業的規模で分離 ' 精製す る方法を提 供す る こ と に あ る 。 本発明 の第 2 の 目 的は高純度かつ 高収率で極めて効率的 に、 乳か ら ラ ク ト フ ヱ リ ン を分 離 · 精製す る ための方法を提供す る こ と にあ る 。 本発明の特徴は、 架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド の硫酸ェ ス テル化物 に 、 ラ ク ト フ ヱ リ ン含有原料乳を接触さ せ て ラ ク 卜 フ ェ リ ン を吸着さ せ、 次いでそ の吸着された ラ ク 卜 フ ェ リ ン を溶出 し て回収す る こ と に あ る 。
発明 を実施す る ための最良の形態
本発明 で用 い る架撟型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド の硫酸エス テル化物 は 、 へノ リ ン と 同様な ラ ク 卜 フ ェ リ ン に対す る 生物学的親和性を有 し 、 し か も それよ り 物理的安定 性の優れ .た も のであ る 。 該硫酸エス テル化物は、 ァガ ロ ー ス 、 セ ル ロ ース並びに キ チ ン な どの ポ リ サ ヅ カ ラ ィ ド を架橋剤 [例え ばェ ピク ロ ル ヒ ド リ ン な ど ] で架 橋 し た も の （市販さ れて い る ） を 、 無水硫酸や ク ロ ル スルホ ン酸な どで硫酸エス テル化 し て得 られる も ので あ っ て 、 大量 に調製 し得る 。
し か し 、 ァ ガロ ース は軟 ら か く 変形 し易い ため、 ラ ク 卜 フ エ リ ン を工業的規模で取得す る こ と を 目 的 と す る 場合 に は 、 セル口 一スゃ キチ ン等硬質の担体を用 い る 方が望 ま し い。
こ の よ う な架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド の硫酸エス テル 化物は 、 水性溶媒に不溶性であ り 、 物理的安定性に優 れて い る ので 、 該硫酸エス テル化物を充塡 し て成る ァ フ ィ 二テ ィ 一力 ラ ム は工業的規模での通液操作 に も充 分耐 え る こ と がで き る 。
架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド の硫酸エス テル化物 と し て は、 架撟型セルロ ース （ ア ミ ノ 基を有す る ） を硫酸ェ ス テル化 し た硫酸セソレ口 フ ァ イ ンや、 架橋型キ ト サン ( ア ミ ノ 基を介 して架橋） を硫酸エステル化 し た硫酸 ィ匕キ 卜 パ一ル等を例示 し得る 。
こ れ ら の架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド の硫酸エステル化 物を用 いて乳か ら ラ ク 卜 フ リ ン を分離、 精製す る に は、 該硫酸エステル化物を担体 と して充塡し たカ ラ ム に原料乳を通液する か、 も し く は原料乳に上記硫酸ェ ス テ ル化物 を混合 し て 攪拌す る こ と に よ り 行 う と よ い
本発明では、 硫酸エステル化物 と：ラ ク 卜 フ ェ リ ン含 有原料乳 と の接触は 50°C以下の温度、 好ま し く は室温 で行 う 。 本発明では、 まず原料乳のカ ラ ムへの通液に よ り 、 カ ラ ム に対 し て吸着 し ない分を溶出させた後、 0.3M食塩水 も し く は 0.3M食塩を含む pH 5. Q〜9. Q の リ ン 酸ナ ト リ ウ ム 、 卜 リ ス - HC1、 ア ン モニ ア - HC1又はべ ロ ナール等の 0.01 M 〜 0. G 2 M 緩衝液でカ ラ ム を洗浄す る 。 次いで 0.4M〜 1.5M食塩水、 好ま し く は 1. QM食塩水 も し く は 1.0M食塩水を含む上記緩衝液を力 ラ ム に通液 し て 、 カ ラ ム に吸着 して い る ラ ク ト フ エ リ ン を溶出す る こ と に よ り 、 乳 か ら ラ ク 卜 フ ェ リ ン を分離 で き る 。
ま た、 本発明では、 次の よ う に し て ラ ク ト フ ヱ リ ン を分離 し得'る 。 ま ず原料乳 と硫酸エス テル化物を混合 し た後 に該エステル化物をデカ ン テ一 シ ヨ ン も し く は 遠心分離 に よ り 回収す る 。 こ う し て得 られたエス テル 化物 を 0.3M食塩水又は 0.3M食塩水を含む pH 5.0〜 9.0 の緩衝液で洗浄 し 、 再びデカ ン テー シ ヨ ン も し く は遠 心分離 し てエステル化物を回収す る 。 こ う し て得 られ た エ ス テ ル化物 に 0. 4 〜 1 · 5 M食塩水 も し く は 0.4 〜
1. 5Mの食塩水含む上記緩衝液を加え 、 よ く 洗っ た後 に 静置す る 。 デカ ン テ一 シ ヨ ン又は遠心分離に よ っ て上 澄液を 回収す る こ と に よ り 乳か ら ラ ク ト フ ヱ リ ン を分 離 し得 る 。
分離さ れた ラ ク 卜 フ エ リ ン は電気透析 （ED)装置 も し く は逆浸透 （R0)装置に よ り 脱塩 し た後、 凍結乾燥 し て 4 0 で以下、 好ま し く は 4 °Cで保存す る 。 なお、 上記 方法 に よ り 、 ラ ク 卜 フ ユ リ ン を分離 し た後の上記エス テル化物は 2M食塩水で洗浄 し 、 さ ら に 0. 15M 食塩水を 通液す る こ と に よ り 再生で き る 。
上述 し た よ う に し て 得 ら れ た ラ ク 卜 フ ェ リ ン は 、 SDS 電気泳動図 に よ り 、 純度 95 %以上であ る こ と が確 認さ れる 。
本発明 に お いて用 し、 られる 原料乳 と し て は、 ヒ 卜 並 びに牛や山羊等の哺乳動物の初乳、 移行乳、 常乳、 末 期乳等 を例示で き 、 さ ら に低温殺菌 し た乳及びホエ ー 等 も 挙げ られ る 。
本発明 に従 っ て 、 こ れ ら の原料乳か ら ラ ク 卜 フ ェ リ ン を分離、 精製する と 、 従来法にみ られる操作や工程 の煩雑さ に起因する 、 処理時間の長い こ と 及び回収率 の低い こ と 等の問題が解決される 。
すなわち 、 本発明 に よ る と 、 ラ ク 卜 フ ェ リ ン を高純 度でかつ高収率で回収で き る 。 特に、 本発明では、 物 理的安定性の優れた架撟型ポ リ サ ツ カ ラ イ ド硫酸エス テル化物のみを用 いて乳中の ラ ク 卜 フ エ リ ン を吸着す る も のであ る か ら、 従来のへパ リ ン を固定化 し たァ フ ィ ニティ 一 ク ロ マ 卜 グラ フ ィ 一用担体を用 い る場合に み られる よ う なへパ リ ンが担体か ら脱落す る等の懸念 がない。 さ ら に、 本発明では、 吸着 し たラ ク ト フ エ リ ン が食塩水のみの使用で容易に溶出で き る ので、 分離 操作を極めて効率的 に行 う こ と がで き る 。
ま た、 本発明で用 い られる架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド 硫酸エ ス テル化物は、 資源的に豊富なセルロ ースゃキ チ ン を原料 と す る架撟型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド を硫酸エス テルイヒ し て得 られる ので、 大量に調製で き安価に入手 し得る 利点があ る 。
さ ら に、 本発明 に従っ て分離、 精製さ れたラ ク ト フ エ リ ン は 、 そ の 鉄 結 合 能 を W 00 d w 0 r t h ら の 方 法 ( 「プ ロ タ イ ド ス ノ イ ォ ロ ジカ ル フ ル一ィ ド ス プロ シーデ イ ン グ コ ロ キ ュ ーム 」 （Protides Biol. Fluids Proc. C o 11 o q . ) 14 , 37 ( 19669 ) に準 じ て lj定 し た結果、 ラ ク ト フ ヱ リ ン lg 当 り 1.3 〜 2. 1 mgの鉄結 合能を示す こ と か ら 、 本来の鉄結合能を保有 し て い る こ と が立証 さ れる 。 し たがっ て 、 本発明 に よ り 得 られ る ラ ク 卜 フ リ ン は、 鉄要求性病原菌に 由来す る乳児 の感染防御の ため に予防薬及び該病原菌に よ っ て も た ら さ れ る 各症状の治療薬 と し て利用 で き る 。
さ ら に 、 本発明では、 前記方法に よ り 分離、 精製 し た ラ ク 卜 フ リ ン溶液に 、 直接塩化第二鉄を混合 し良 く 攪拌 し た後、 そ の ま ま FD装置又は R0装置に通す こ と に よ り 、 銖飽和型ラ ク 卜 フ ェ リ ン を簡易 に分離す る こ と がで き る ので、 特に腸管での鉄吸収の促進に も本発 明 は役立つ 。 因 に 、 鉄飽和型ラ ク 卜 フ ェ リ ン が腸管か ら の鉄の吸収 を向上さ せ る効果を有す る こ と は報告さ れて い る [ Cox. T. M. et 「 ノ ィ オケ ミ ア ノ\ 'ィ オ フ イ ジ ク ス ァ ク タ 」 （ Binchim. Biophys. Acta) 588 120 (1978) ] o
以下 に実施例 を示 し て本発明 を具体的 に説明 す る 。 実施例 1
市販の架橋セルロ ーズであ る セル口 フ ァ イ ン （商品 名 ） を常法 に よ り 無水硫酸で硫酸エス テル化 し た硫酸 ィ匕セル口 フ ァ イ ン 5( iを 、 直径 2cm , 長さ 20cmのカ ラ ム に充塡 し 、 こ のカ ラ ム に脱脂 し た ヒ 卜 初乳 5 OmJを、 10 m m i π .の速度で、 通液 し た。 次いでカ ラ ム を 0.3 M 食塩水 300iiteで洗浄 し た後、 1. 0M食塩水 I OOJUでカ ラ ム に吸着 し て し、 る ラ ク 卜 フ エ リ ン を溶出 し た。 得 られ た ラ ク ト フ ヱ リ ン溶液を +分量の脱イ オ ン水に対 し て 透析 を行 つ た後、 .凍結乾燥 し て ヒ 卜 ラ ク 卜 フ ェ リ ン l lOmg を得 た 。 回収 し た ヒ 卜 ラ ク 卜 フ ェ リ ン の純度 は、 S D S ポ リ ア ク リ ルア ミ ド ゲル電気泳動図に よ り 97
% 測定さ れ、 鉄結合量は血清鉄測定キ ッ 卜 （和光純 薬社製） に よ り 0.2mg Fe/g蛋白質であ っ た。 ま た、 総 鉄結合能は Woodworth の方法によ り 、 100% と算定さ れた。
実施例 2
市販の架撟型キ ト サンであ る キ ト パール （商品名 ） を常法 に よ り 無水硫酸で硫酸エステル化 し た硫酸エス テル化キ ト パール 1 を、 直径 8cm , 長さ 20cmの力 ラ ム に充塡 し 、 こ のカ ラ ム に脱脂 し た牛乳 50 £ を 20 £ Z hr . の速度で通液 し た。 次いでカ ラ ム を 0 · 3 M食塩水 5 £ で洗浄 し た後、 1 · 0M食塩水 3 £ でカ ラ ム に吸着 し て い る ラ ク ト フ ヱ リ ン を溶出 し た。 得 られたラ ク 卜 フ エ リ ン溶液を小型の ED装置 （ TS-210、 徳山 ソ一ダ社製） を用 いて脱塩 し た後、 UF装置 （ DH_2、 ア ミ コ ン社製） で 10倍に濃縮 して凍結乾燥 し た。
回収 し た ヒ ト ラ ク ト フ エ リ ン は 6gであ り 、 純度は 95 % と測定さ れ、 ま た、 その鉄結合量は 0.2mg Fe/g蛋白 質 と 測定さ れ、 総鉄結合能は 98 %であ る こ と が確認さ れた。
実施例 3 本例 は 、 ラ ク ト フ ヱ リ ン を分離、 精製を 、 バ ッ チ方 式 よ り 原料乳 と 硫酸エス テル化物 と を混合 し て行 う 態 様を示す も のであ る 。
実施例 2 に おいて使用 し た硫酸化キ 卜 パ一ルに 0. 2M 食塩水、 つづ いて 0. 15M 食塩水を通液 し て該硫酸化キ 卜 パールを再生 し た。
こ の再生硫酸化キ 卜 パール 1 £ と チーズホエ ー 100 •β と を 1 時間攪拌下に混合 し 、 次いで こ のゲル状の混 合物を 0. 3 Μ食塩水 5 £ で洗浄 し た。 その後、 1. 0Μ食塩 水 3 £ で上記ゲル状混合物に吸着 し て い る ラ ク 卜 フ エ リ ン を溶出 し た。 得 られた ラ ク 卜 フ ェ リ ン溶液に塩化 第二鉄 50mgを添加 し 、 よ く 攪拌 し て逆浸透装置 （ MRG 10型、 三菱 レ ー ヨ ン社製） で脱塩及び濃縮 （ 10倍） し た後、 凍結乾燥 し 、 鉄飽和型 ゥ シ ラ ク 卜 フ リ ン 4. 8g を得 た 。 回収 し た ゥ シ ラ ク 卜 フ ェ リ ン は純度は 95 % で あ り 、 鉄結合量は 1. 3mg Fe/g蛋 白質 と 測定さ れ、 総の 飽和度は 93 %以上であ る と 確認さ れた。

Claims

請 求 の 範 囲
( 1 ) 架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド の硫酸エステル化物に、 ラ ク 卜 フ ェ リ ン含有原料乳を接触させて ラ ク 卜 フ エ リ ン を吸着さ せ、 次いで吸着ラ ク 卜 フ ェ リ ン を溶出 す る こ と を特徴 と す る 、 乳か ら ラ ク ト フ ヱ リ ン を分 離、 精製す る方法。
(2) 前記接触が、 架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド の硫酸エス テル化物か ら成る ァ フ ィ 二テ ィ 一カ ラ ム に、 ラ ク ト フ ェ リ ン含有原料乳を通 して なされる請求項 1 記載 の方法。
(3) 吸着ラ ク 卜 フ ェ リ ン を 0. 4〜 1..5M食塩水を含む緩 衝液で溶出 し た後、 電気透析 も し く は逆浸透に付 し て脱塩す る 請求項 1 記載の方法。
(4) 吸着ラ ク 卜 フ リ ン を 0. 4〜 1. 5M食塩水を含む緩 衝液で溶出 し た後、 電気透析 も し く は逆浸透に付 し て脱塩す る 請求項 2 記載の方法。
(5) 前記架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド がセルロ ース又はキ チ ン であ る 請求項 1 記載の方法。
PCT/JP1988/000353 1987-04-10 1988-04-07 Process for separating and purifying lactoferrin from milk using sulfate compound WO1988008006A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE8888903358T DE3874527T2 (de) 1987-04-10 1988-04-07 Trenn- und reinigungsverfahren fuer laktoferrin von milch unter verwendung einer sulfatverbindung.

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP62088450A JPH0725800B2 (ja) 1987-04-10 1987-04-10 硫酸エステル化物を用いて乳からラクトフエリンを分離、精製する方法
JP62/88450 1987-04-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1988008006A1 true WO1988008006A1 (en) 1988-10-20

Family

ID=13943137

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1988/000353 WO1988008006A1 (en) 1987-04-10 1988-04-07 Process for separating and purifying lactoferrin from milk using sulfate compound

Country Status (6)

Country Link
US (1) US4997914A (ja)
EP (1) EP0348508B1 (ja)
JP (1) JPH0725800B2 (ja)
DE (1) DE3874527T2 (ja)
NZ (1) NZ224200A (ja)
WO (1) WO1988008006A1 (ja)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0438750B1 (en) * 1990-01-23 1993-10-27 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Lactoferrin hydrolyzate for use as an antibacterial agent
US5290685A (en) * 1990-02-22 1994-03-01 Meiji Milk Products Company Limited Method for separation and concentration of phosphopeptides
DE4234728A1 (de) * 1992-10-15 1994-04-21 Peter Prof Dr Bartholmes Verfahren für die Gewinnung und die Umpufferung und/oder Einengung von gelösten Makromolekülen eines Makromolekülegemisches
US6096870A (en) * 1994-01-05 2000-08-01 Sepragen Corporation Sequential separation of whey
DE69524386D1 (de) * 1994-02-16 2002-01-17 Pharming Intellectual Pty Bv Isolierung von lactoferrin aus milch
JP3112637B2 (ja) 1994-09-30 2000-11-27 雪印乳業株式会社 骨強化剤
JP4306828B2 (ja) * 1998-03-31 2009-08-05 雪印乳業株式会社 病原性細菌感染防御剤
WO2004082397A1 (en) * 2003-03-21 2004-09-30 Upfront Chromatography A/S Method for high throughput volumes in the fractionation of bio-molecules by chromatographic systems
CN100528223C (zh) 2003-05-07 2009-08-19 雪印乳业株式会社 皮肤胶原产生促进剂
US20040259770A1 (en) * 2003-06-19 2004-12-23 Rush University Medical Center Method for determining leukocyte activation
US7547770B2 (en) * 2003-11-03 2009-06-16 Advanced Protein Systems Colostral fractionation process
WO2005085287A1 (en) * 2004-03-03 2005-09-15 En-N-Tech, Inc. Treatments for contaminant reduction in lactoferrin preparations and lactoferrin-containing compositions
US20070212367A1 (en) * 2006-03-13 2007-09-13 Keech Andrew M Novel immunologically active peptide fragments of a proline-rich polypeptide isolated from colostral mammalian fluids for treatment of viral and non-viral diseases or diseased conditions
JP2007332072A (ja) 2006-06-15 2007-12-27 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 歯質硬度維持剤
JP2008189637A (ja) 2007-02-08 2008-08-21 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 自己免疫疾患予防剤
JP2008214237A (ja) 2007-03-02 2008-09-18 Snow Brand Milk Prod Co Ltd Ｒａｎｋｌ産生抑制剤
CN101646448B (zh) 2007-03-12 2017-02-08 雪印惠乳业株式会社 生长激素分泌促进剂
DK2902409T3 (en) 2007-07-10 2018-04-16 Glanbia Nutritionals Ireland Ltd PROCEDURE FOR REMOVAL OF ENDOTOXIN FROM PROTEINS
DK2208735T3 (da) * 2007-11-01 2012-01-02 Megmilk Snow Brand Co Ltd Næringsmiddel til fremme af differentiering af osteoblast og inhibering af differentiering af osteoklast
ATE542832T1 (de) * 2007-11-01 2012-02-15 Megmilk Snow Brand Co Ltd Nahrungsmittel zur inhibierung der osteoclastbildung
CA2704042C (en) 2007-11-01 2017-06-20 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Bone resorption inhibitory food material for inhibiting bone resorption
MY160058A (en) 2007-11-01 2017-02-15 Megmilk Snow Brand Co Ltd Bone-reinforcing food material
JP5993308B2 (ja) 2011-01-26 2016-09-14 雪印メグミルク株式会社 感覚改善剤
JP6240066B2 (ja) 2012-05-02 2017-11-29 雪印メグミルク株式会社 軟骨形成促進剤
JP6395350B2 (ja) 2013-03-28 2018-09-26 雪印メグミルク株式会社 筋萎縮防止剤
JP6309202B2 (ja) 2013-03-28 2018-04-11 雪印メグミルク株式会社 タンパク質組成物およびその製造方法
EP3766354A4 (en) 2018-03-12 2021-12-15 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. PROCESS FOR PRODUCING AN AQUEOUS SOLUTION CONTAINING LACTOFERRIN
US20210388058A1 (en) 2018-11-06 2021-12-16 Arhel Projektiranje In Inzeniring D.O.O. Method for manufacturing highly purified lactoferrin and lactoperoxidase from milk, colostrum and acid or sweet whey
RU2717340C1 (ru) * 2018-12-20 2020-03-23 Общество с ограниченной ответственностью "НПК "Альтернативные технологии" Способ получения лактоферрина

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61246198A (ja) * 1985-02-07 1986-11-01 オレオフイナ・ソシエテ・アノニム 蛋白の精製法
JPH06219523A (ja) * 1993-01-20 1994-08-09 Murata Mach Ltd コンベア装置

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ180199A (en) * 1976-03-04 1978-11-13 New Zealand Dev Finance Method of testing for the presence of elevated plasma liprotein concentration
NZ187246A (en) * 1976-03-04 1980-05-27 New Zealand Dev Finance Hydrophilic hydroxy c2-c4 alkylated crosslinked regenerated cellulose
US4175183A (en) * 1977-03-01 1979-11-20 Development Finance Corporation Of New Zealand Hydroxyalkylated cross-linked regenerated cellulose and method of preparation thereof
FR2505615A1 (fr) * 1981-05-15 1982-11-19 Elf Aquitaine Procede d'extraction de lactoferrine et d'immunoglobulines du lait
JPS61145200A (ja) * 1984-12-19 1986-07-02 Snow Brand Milk Prod Co Ltd ウシラクトフェリンの分離精製法
FR2584727B1 (fr) * 1985-07-11 1988-06-17 Roussel Uclaf Procede d'extraction de proteines du lait, produits, application du procede, et compositions pharmaceutiques
IE61701B1 (en) * 1986-07-17 1994-11-30 Morinaga Milk Industry Co Ltd Process for producing bovine lactoferrin in high purity

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61246198A (ja) * 1985-02-07 1986-11-01 オレオフイナ・ソシエテ・アノニム 蛋白の精製法
JPH06219523A (ja) * 1993-01-20 1994-08-09 Murata Mach Ltd コンベア装置

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEMICAL ABSTRACTS, Vol. 100, No. 15, 9 April 1984 (09. 04. 84) (Columbus, Ohio, U.S.A.) "Metal-Chelate Affinity Chromatography as a Separation Tool", page 271, see Abstract No. 117326k, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1983, 413 (Biochem. Eng. 3), 300-6 *
CHEMICAL ABSTRACTS, Vol. 106, No. 25, 22 June 1987 (22. 06. 87) (Columbus, Ohio, U.S.A.) "The Purification of Lactoferrin from Human whey by Batch Extraction", page 345, see Abstract No. 210506c, Anal. Biochem., 1987, 162(1), 296-300 *
See also references of EP0348508A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP0348508A1 (en) 1990-01-03
US4997914A (en) 1991-03-05
DE3874527D1 (de) 1992-10-15
JPH0725800B2 (ja) 1995-03-22
EP0348508A4 (en) 1989-10-12
NZ224200A (en) 1990-02-26
DE3874527T2 (de) 1993-03-25
JPS63255300A (ja) 1988-10-21
EP0348508B1 (en) 1992-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO1988008006A1 (en) Process for separating and purifying lactoferrin from milk using sulfate compound
US5516675A (en) Separation of lactoperoxidase, secretory component and lactoferrin from milk or whey with a cation exchange resin
US4436658A (en) Process of extraction of lactoferrine and immunoglobulins of milk
EP0253395B1 (en) A process for producing bovine lactoferrin in high purity
FI91032C (fi) Menetelmä laktoperoksidaasin ja laktoferriinin puhtaiden fraktioiden talteenottamiseksi maitoseerumista
JP2920427B2 (ja) κ−カゼイングリコマクロペプチドの製造法
JPH03501974A (ja) 血漿蛋白質のクロマトグラフィーによる分離
PL168353B1 (pl) Sposób wytwarzania zatezonego, standaryzowanego ludzkiego c z y n n i k a von Willebranda o wysokiej czystosci PL PL PL PL PL PL PL
JP2622686B2 (ja) ｋ−カゼイングリコマクロペプチドの製造法
CA1328950C (en) Process for selectively separating the alpha-lactalbumin from the proteins of whey
JP2974434B2 (ja) 分泌性コンポネント含有組成物
EP0418704B1 (en) Process of separating, purifying and recovering milk proteins capable of binding iron
EP0285576A2 (en) A method for the selective deproteinization of whey
JP2568151B2 (ja) アンジオジェニンの単離方法
JPS6034916A (ja) 第１ｘ因子および他のビタミンｋ依存性タンパク質の高純度精製
JP3161846B2 (ja) 牛乳ホエ−中のシアル酸結合ペプタイドの分離法
JPS63255299A (ja) 乳からラクトフエリンを分離、精製する方法
JP2985158B2 (ja) 活性の高いラクテニン画分の回収方法
JP2963081B2 (ja) 乳およびその副生物からラクトフェリンを分離、 精製する方法
CN117904243A (zh) 一种源于湖羊的抗菌肽及其应用
JPH1129600A (ja) 乳からラクトフェリンを分離、精製する方法
JPS62209099A (ja) 殺菌された抗プラスミン溶液の製造方法
JPH05292879A (ja) 牛乳に含まれる非蛋白態窒素成分の精製法及び 精製物
JPH03176500A (ja) リポコルチン類の精製方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1988903358

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1988903358

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1988903358

Country of ref document: EP