DE3874527T2 - Trenn- und reinigungsverfahren fuer laktoferrin von milch unter verwendung einer sulfatverbindung. - Google Patents
Trenn- und reinigungsverfahren fuer laktoferrin von milch unter verwendung einer sulfatverbindung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung und Reinigung von Laktoferrin, das ein pharmakologisch wichtiges Milchprotein mit verschiedenen physiologischen Aktivitäten ist, aus Laktoferrin enthaltender Milch.
- Laktoferrin ist ein Eisen-bindendes Glykoprotein, das in einer exokrinen Flüssigkeit wie Milch vorkommt und die verschiedensten physiologischen Aktivitäten wie Bakteriostase gegen pathogene Bakterien, regulierende Funktion der Leukozytendifferenzierung, Verstärkung der bakteriziden Wirkungen der Granulozyten, Proliferation der Lymphozyten und Regulierungsfunktion der Eisenabsorption aufweist. Daher kann man sagen, daß Laktoferrin ein Milchprotein ist, das nicht nur unter dem Gesichtspunkt der Ernährung, sondern auch unter einem pharmakologischen Gesichtspunkt von Bedeutung ist.
- Deshalb sind bisher viele Anstrengungen unternommen worden, Verfahren zur Trennung und Reinigung von Laktoferrin aus Milch zu entwickeln. Da jedoch Laktoferrin ein Protein ist, das häufig mit anderen Milchproteinen wechselwirkt, war es schwierig, Laktoferrin mit Hilfe eines einfachen und leichten Verfahrens in hoher Reinheit und Ausbeute abzutrennen und zu reinigen.
- Mit anderen Worten ist zur Trennung von hochreinem Laktoferrin ein kompliziertes und somit zeitraubendes Verfahren nötig. Darüber hinaus ist die Ausbeute an Laktoferrin unvorteilhaft niedrig.
- Kürzlich ist ein Verfahren zur Trennung und Reinigung von Laktoferrin berichtet worden, bei dem Rohmilch über eine Affinitätssäule, die Heparin, das eine physiologische Affinität für Laktoferrin hat, mittels CNBr oder dergleichen an einen chromatographischen Träger wie Sepharose CL-6B (hergestellt von Pharmacia Labs., Inc.) gebunden enthält, gegeben wird. Dabei wird Laktoferrin abgetrennt und gereinigt (Blackberg, L. et al., FEBS Lett. 109, S. 180, 1980).
- Das Heparin wurde jedoch aus Leber oder Darm von Schweinen, Rindern und dergleichen extrahiert und isoliert. Unterschiede in der Extraktionsquelle führen zu Unterschieden in den Eigenschaften des Heparins. Deshalb ist es schwierig, eine große Menge Heparin mit einheitlichen Eigenschaften zu erhalten. Außerdem ist Heparin teuer. Folglich kann das Verfahren zur Trennung und Reinigung von Laktoferrin aus Milch unter Verwendung des chromatographischen Affinitätsträgers mit daran gebundenem und fixiertem Heparin nur im Labormaßstab angewandt werden. Mit anderen Worten- das oben vorgeschlagene bekannte Verfahren ist für den industriellen Maßstab unpraktikabel. Weiter bringt dieses Verfahren das Problem mit sich, daß sich am Träger fixiertes Heparin ablösen und gelegentlich und unangenehmerweise mit dem abgetrennten Laktoferrin vermischen könnte.
- Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Trennung und Reinigung von Laktoferrin aus Milch durch einen besonders einfachen Vorgang im industriellen Maßstab bereitzustellen. Eine zweite Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, um Laktoferrin aus Milch besonders wirksam in hoher Ausbeute und Reinheit abzutrennen und zu reinigen.
- Die vorliegende Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, Laktoferrin enthaltende Rohmilch derart mit einem sulfonierten vernetzten Polysaccharidharz in Kontakt zu bringen, daß das Laktoferrin durch das sulfonierte Harz adsorbiert werden kann, und dann das derart adsorbierte Laktoferrin davon zu eluieren und wiederzugewinnen.
- Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung wird anschließend beschrieben.
- Ein sulfoniertes vernetztes Polysaccharid, das für die vorliegende Erfindung verwendet wird, hat eine physiologische Affinität zu Laktoferrin so wie Heparin und ist Heparin in der physikalischen Stabilität überlegen.
- Dieses sulfonierte Harz kann in Mengen durch Veresterung eines Polysaccharids wie Agarose, Cellulose oder Chitin, das mit einem Vernetzungsmittel (z. B. Epichlorhydrin) vernetzt worden ist, mit wasserfreier Schwefelsäure oder Chlorsulfonsäure hergestellt werden. Das oben vernetzte Polysaccharid ist kommerziell erhältlich.
- Da Agarose jedoch weich ist, läßt sie sich leicht verformen. Daher wird für die Herstellung von Laktoferrin im industriellen Maßstab ein Träger wie Cellulose oder Chitin bevorzugt verwendet.
- Da so ein sulfoniertes vernetztes Polysaccharid in wäßrigen Lösungsmitteln unlöslich ist und hervorragende physikalische Stabilität aufweist, kann eine Affinitätssäule, gepackt mit diesem sulfonierten Harz, dem Durchlauf einer Rohflüssigkeit im industriellen Maßstab in ausreichender Weise standhalten.
- Beispiele für sulfonierte vernetzte Polysaccharidharze umfassen sulfoniertes Cellulofine, hergestellt durch Veresterung von vernetzter Cellulose (mit einer Aminogruppe) mit Schwefelsäure, und sulfoniertes Chitopearl, hergestellt durch Veresterung vernetzten Chitosans (das über eine Aminogruppe vernetzt ist) mit Schwefelsäure.
- Die Trennung und Reinigung von Laktoferrin aus Milch kann geeigneterweise dadurch ausgeführt werden, daß Rohmilch über eine Säule, gepackt mit dem sulfonierten vernetzten Polysaccharidharz, gegeben wird, oder dadurch, daß Rohmilch mit dem Harz gemischt und das entstehende Gemisch dann gerührt wird.
- In der vorliegenden Erfindung wird der Kontakt des sulfonierten Harzes mit der Laktoferrin enthaltenden Rohmilch bei einer Temperatur von 50ºC oder weniger, vorzugsweise bei Raumtemperatur, durchgeführt. Als erstes wird Rohmilch über die Säule gegeben, und die nicht durch die Säule adsorbierte Fraktion wird dabei eluiert. Anschließend wird die Säule mit einer 0,3 M wäßrigen Natriumchlorid-Lösung oder einer 0,01-0,02 M Pufferlösung von z. B. Natriumphosphat, Tris-HCl, Ammoniak-HCl oder Veronal (Handelsname), die eine 0,3 M wäßrige Natriumchlorid-Lösung enthält und einen pH von 5,0 bis 9,0 hat, gewaschen. Dann wird eine 0,4 M-1,5 M wäßrige Natriumchlorid-Lösung, vorzugsweise eine 1,0 M wäßrige Natriumchlorid-Lösung oder die oben erwähnte, eine 1,0 M wäßrige Natriumchlorid-Lösung enthaltende Pufferlösung, durch die Säule gegeben, so daß an der Säule adsorbiertes Laktoferin eluiert wird, wodurch Laktoferrin von der Milch abgetrennt werden kann.
- Gemäß der Erfindung kann die Abtrennung des Laktoferrin alternativ wie folgt erfolgen: zuerst wird Rohmilch mit dem sulfonierten Harz gemischt, und dieses Harz wird dann mittels Dekantieren oder Zentrifugation wiedergewonnen. Das so wiedergewonnene sulfonierte Harz, an das Laktoferrin adsorbiert ist, wird mit einer 0,3 M wäßrigen Natriumchlorid-Lösung oder einer eine 0,3 M wäßrige Natriumchlorid-Lösung enthaltenden Pufferlösung mit einem pH von 5,0 bis 9,0 gewaschen. Das Harz wird dann erneut mittels Dekantieren oder Zentrifugation wiedergewonnen. Eine 0,4-1,5 M wäßrige Natriumchlorid-Lösung oder die oben genannte, eine 0,4-1,5 M wäßrige Natriumchlorid-Lösung enthaltende Pufferlösung wird dem so wiedergewonnenen Harz zugesetzt, und ein Waschvorgang wird durchgeführt. Anschließend läßt man das Gemisch stehen. Durch Dekantieren oder Zentrifugation wird ein flüssiger, Laktoferrin enthaltender Überstand gesammelt, wodurch Laktoferrin von der Milch abgetrennt wird.
- Das so abgetrennte Laktoferrin wird unter Verwendung eines Elektrodialyse- (ED)- oder eines Reverse-Osmose-(RO)-Gerätes entsalzt, dann gefriergetrocknet und anschließend bei 40ºC oder weniger, vorzugsweise bei 4ºC, verwahrt. Diesbezüglich kann eine Regeneration des Harzes, von dem Laktoferrin abgetrennt worden ist, durch Waschen des Harzes mit einer 2 M wäßrigen Natriumchlorid- Lösung und anschließendem Durchleiten einer 0,15 M wäßrigen Natriumchlorid- Lösung erreicht werden.
- Das so erhaltene Laktoferrin hat eine Reinheit von 95% oder höher, wie es ein densitometrisches Muster einer SDS-Elektrophorese bestätigt.
- Beispiele für gemäß der Erfindung verwendete Rohmilch umfassen Kolostrum, Übergangsmilch (transitional milk), gewöhnliche Milch und Endmilch (final milk) von Säugern wie Mensch, Rind und Schaf ebenso wie bei niedriger Temperatur sterilisierte Milch und Molke.
- Wenn Laktoferrin von dieser Rohmilch gemäß der vorliegenden Erfindung abgetrennt und aufgereinigt wird, treten keine Probleme wie die Notwendigkeit einer langen Behandlungszeit und einer geringen Ausbeute an Laktoferrin auf, die den komplizierten Arbeitsweisen und -methoden der herkömmlichen Verfahren zugeschrieben werden können.
- Mit anderen Worten, gemäß der vorliegenden Erfindung kann Laktoferrin mit hoher Reinheit und hoher Ausbeute wiedergewonnen werden. Insbesondere bezweckt die vorliegende Erfindung, Laktoferrin aus Milch nur an ein sulfoniertes vernetztes Polysaccharidharz mit ausgezeichneter physikalischer Stabilität zu adsorbieren. Daher gibt es auch keine Probleme wie bei dem herkömmlichen Verfahren, bei dem ein chromatographischer Affinitätsträger, der das fixierte Heparin enthält, verwendet wird, wobei eines der oben genannten Probleme darin besteht, daß sich das Heparin vom Träger löst. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Trennung von Laktoferrin sehr wirksam ausgeführt werden, da das adsorbierte Laktoferrin unter Verwendung lediglich einer wäßrigen Natriumchlorid-Lösung leicht eluiert werden kann.
- Da das gemäß der Erfindung verwendete sulfonierte Harz durch Veresterung, aus Schwefelsäure und einem vernetzten Polysaccharid, dessen Rohmaterial als Cellulose oder Chitin in der Natur reichlich vorhanden ist, hergestellt werden kann, kann dieses Harz außerdem in großen Mengen hergestellt werden und ist günstigerweise zu niedrigen Kosten verfügbar.
- An Hand der Ergebnisse, die gemäß dem von Woodworth et al. (Protides Biol. Fluids Proc. Colloq. 14, S. 37, 1969) vorgeschlagenen Verfahren erhalten wurden, konnte gezeigt werden, daß das gemäß der vorliegenden Erfindung abgetrennte Laktoferrin eine Eisen-bindende Kapazität von 1,3 bis 2,1 mg Fe pro Gramm Laktoferrin hat, was beweist, daß das Laktoferrin seine ursprüngliche Eisen-bindende Kapazität besitzt. Daher kann das gemäß der Erfindung erhaltene Laktoferrin als Prophylaktikum, um Kinder vor pathogenen, Eisen erfordernden Bakterien zu schützen, und als therapeutisches Mittel gegen verschiedene Symptome, die auf pathogene Bakterien zurückgehen, verwendet werden.
- Außerdem kann gemäß der vorliegenden Erfindung die Laktoferrin-Lösung, abgetrennt und gereinigt nach dem oben beschriebenen Verfahren, direkt mit Eisen(III)-chlorid gemischt und dann gerührt werden. Das Gemisch kann dann durch ein ED- oder ein RO-Gerät gegeben werden, um mit Eisen gesättigtes Laktoferrin mit Leichtigkeit davon abzutrennen. Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung besonders nützlich, um die Absorption von Eisen im Darm zu erleichtern. Diesbezüglich ist bereits berichtet worden, daß mit Eisen gesättigtes Laktoferrin die Wirkung hat, die Absorption von Eisen im Darm zu verbessern (Cox, T.M. et al., Biochim. Biophys. Acta 588, S. 120, 1979).
- Die vorliegende Erfindung wird anschließend an Hand von Beispielen genauer beschrieben.
- Kommerziell erhältliches Cellulofine (Handelsname), eine vernetzte Cellulose, wurde mit wasserfreier Schwefelsäure in üblicher Weise verestert, um sulfoniertes Cellulofine zu bilden. 50 ml des so gebildeten sulfonierten Cellulofine wurden in eine Säule mit einem Durchmesser von 2 cm und einer Länge von 20 cm gepackt. Durch diese Säule wurden dann mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min 50 ml entfettetes menschliches Kolostrum gegeben. Anschließend wurde die Säule mit 300 ml einer 0,3 M wäßrigen Natriumchlorid-Lösung gewaschen, und das an die Säule adsorbierte Laktoferrin wurde dann mit 100 ml einer 1,0 M wäßrigen Natriumchlorid-Lösung eluiert. Die derart erhaltene Laktoferrin-Lösung wurde gegen einen Überschuß deionisiertes Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet, wodurch 110 mg menschlichen Laktoferrins erhalten wurden. Die Reinheit des wiedergewonnenen menschlichen Laktoferrins wurde mit einem densitometrischen Muster einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese zu 97% bestimmt. Die Menge an kombiniertem Eisen wurde mit einem Serumeisen-Bestimmungskit (hergestellt van Wako Junyaku Co., Ltd.) auf 0,2 mg Fe pro Gramm Protein gemessen. Außerdem wurde mit dem Woodworth-Verfahren bestätigt, daß die Gesamteisen-Bindungskapazität 100% betrug.
- Kommerziell erhältliches Chitopearl (Handelsname), ein vernetztes Chitosan, wurde mit wasserfreier Schwefelsäure in üblicher Weise verestert, um sulfoniertes Chitopearl zu bilden. 1 l des so gebildeten sulfonierten Chitopearl wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 8 cm und einer Länge von 20 cm gepackt. Durch diese Säule wurden dann mit einer Geschwindigkeit von 20 1/Stunde 50 l entfetteter Rindermilch gegeben. Anschließend wurde die Säule mit 5 l einer 0,3 M wäßrigen Natriumchlorid-Lösung gewaschen, und das an die Säule adsorbierte Laktoferrin wurde dann mit 3 l einer 1,0 M wäßrigen Natriumchlorid-Lösung eluiert. Die derart erhaltene Laktoferrin-Lösung wurde durch ein Gerät geringer Größe vom Typ ED (TS-210; hergestellt von Tokuyama Soda Co., Ltd.) entsalzt, mit einem UF-Gerät (DH-2; hergestellt von Amicon Co., Ltd.) zehnfach konzentriert und dann gefriergetrocknet.
- Die Menge des so wiedergewonnenen Laktoferrin betrug 6 g. Die Reinheit des Laktoferrin wurde zu 95% bestimmt. Die Menge an kombiniertem Eisen war 0,2 mg Fe pro Gramm Protein. Außerdem wurde bestätigt, daß die Gesamteisen-Bindungskapazität 98% betrug.
- In diesem Beispiel wurde Laktoferrin mittels Batch-Verfahren durch Mischen von Rohmilch mit einem sulfonierten Harz abgetrennt und gereinigt.
- Durch das in Beispiel 2 verwendete sulfonierte Chitopearl wurde zunächst eine 2,0 M wäßrige Natriumchlorid-Lösung und dann eine 0,15 M wäßrige Natriumchlorid-Lösung geleitet, um das sulfonierte Chitopearl zu regenerieren.
- Ein Liter des derart regenerierten Chitopearl wurde mit 100 l Käsemolke (cheese whey) gemischt und dann 1 Stunde gerührt. Das erhaltene Gemisch wurde mit 5 l einer 0,3 M wäßrigen Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Anschließend wurde das an das sulfonierte Chitopearl-Gemisch adsorbierte Laktoferrin mit 3 l einer 1,0 M wäßrigen Natriumchlorid-Lösung eluiert. Der so erhaltenen Laktoferrin-Lösung wurden 50 mg Eisen(ITI)-chlorid zugesetzt. Dann wurde weiter gerührt. Nach der Verwendung eines Reverse Osmose- Geräts (MRG 10 moled; hergestellt von Mitsubishi Rayon Co., Ltd.) zur Durchführung von Entsalzung und Konzentrierung (zehnfach) wurde ein Gefriertrocknen durchgeführt, so daß 4,8 g mit Eisen gesättigtes Rinderlaktoferrin erhalten wurden. Die Reinheit des wiedergewonnenen Rinderlaktoferrin war 95%, die Menge des kombinierten Eisen betrug 1,3 mg Fe pro Gramm Protein. Außerdem wurde bestätigt, daß der Sättigungsgrad des Eisen 93% oder mehr betrug.
Claims (5)
1. Verfahren zur Trennung und Reinigung von Laktoferrin aus Milch, dadurch
gekennzeichnet, daß es die Schritte umfaßt, die Laktoferrin enthaltende
Rohmilch mit einem sulfonierten vernetzten Polysaccharid-Harz in Kontakt zu
bringen, so daß das Laktoferrin durch das sulfonierte Harz adsorbiert werden
kann, und anschließend das adsorbierte Laktoferrin zu eluieren.
2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kontakt dadurch erzielt wird,
daß Laktoferrin enthaltende Rohmilch auf eine Affinitätssäule gegeben wird,
die das sulfonierte vernetzte Polysaccharid-Harz enthält.
3. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das adsorbierte Laktoferrin mit einer
Pufferlösung, die eine 0,4 bis 1,5 M wäßrige Natriumchlorid-Lösung enthält,
eluiert und anschließend einer Elektrodialyse oder reverser Osmose zur
Entsalzung der Laktoferrin-Lösung unterworfen wird.
4. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei das adsorbierte Laktoferrin mit einer
Pufferlösung, die eine 0,4 bis 1,5 M wäßrige Natriumchlorid-Lösung enthält,
eluiert und anschließend einer Elektrodialyse oder reverser Osmose zur
Entsalzung der Laktoferrin-Lösung unterworfen wird.
5. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das vernetzte Polysaccharid Cellulose
oder Chitin ist.
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