JPS61246198A - 蛋白の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はミルク中に或いはその誘導物例えばラクトセリ
ウム（Ｉａｃｔｏｓｅｒｉｕｍ）乳漿中に存在する蛋白
の精製法に関する。特に本発明は蛋白を金属イオンでゲ
ル化しうる酸性多糖類の存在下において、適当な条件で
処理することによる該蛋白の精製又は抽出法に関する。

更に特に本発明は等電点ｐＨが７．５より大きいミルク
中に或いはその誘導物中に存在する蛋白例えば待にラク
トフェリン、ラクトペルオキシダーゼ及び他の同族体の
、本方法による抽出又は精製法に関する。

蛋白例えばラクトフェリン及びラクトパーオキシグーゼ
が栄養の分野において或いは治療の分野において多くの
用途を有することは良く知られている。

常に増大する需要の結果として、種々の媒体に及び種々
の蛋白に適用することのできる現時点では普通でない１
つの方法に到達しうろことＣま明らかに望ましい。

即ち色囲特許第２，５０５．６１５号におｌ、）で、ミ
ルクから２つの個々の蛋白を抽出する方法ｈ〜すでに提
案されているが、この方法は特にミルクσ）ｐＨを変え
ることを必要とする。更に、この特許に記述する方法は
多孔性及び顕微鏡的ビーズの形をした無機吸着剤物質例
えばシリカの粉末を第１」用し、これは樹脂の急速な閉
塞を避けるためにカゼイン及び脂質を含まない媒体中で
処理することを必要とする。

粒子が無機粉末ビーズよりも細かくないイオン交換樹脂
を利用する方法も提案されて（する力（、これもその多
孔性構造が故に急速に閉塞されると（１つ欠点をもって
いる。

直径が５０ミクロンないし数センチメートルで変化しつ
る醇化チタンのビーズを吸看斉ｊとして用いることも提
案されている。しかしながら、この種の物質はイオン濃
度を減するためにミルク及び／又は乳漿を予備処理する
ことを必要とし、結果として更なる操作と媒体の改変が
必要である。

それ故に、特に脂肪、脂質小滴及びカゼインミセルを含
んでなる全ミルクのように複雑な媒体から、閉塞又は溶
媒の予備処理の必要性という上述の欠点なしに、蛋白を
容易に抽出しつる方法に近づくことは望ましい。

本発明の目的はそのような方法を開発することである。

今回本発明者は、適当な条件下にゲル化しつる酸性多糖
類の使用がミルクからの種々の蛋白の分離及び精製を司
能にすることを発見した。

本発明の主題は、適当な条件−ドにゲル化しつる酸性多
糖類の存在下に６ける処理によって蛋白を＃ａ製且つ分
離する方法である。

本弁明の他の主題は、蛋白を抽出する媒体にかなりの変
化をもたらさずに蛋白を精製する方法である。

本発明の他の主題は、樹脂の閉塞並びに媒体の予備処理
を避けつつ、他の方法を用いるよりも非常に迅速に蛋白
を分離することができる蛋白のそのような抽出法である
。

本発明による蛋白の精製法は、く１〉必要とされる蛋白
を含有する媒体を、グル形で用いられるゲル化しつる酸
性多糖類の粒子上を通過ざま、但しこれらの粒子その最
短寸法がＱ、５ｍｍより小さくなく、ゲル中の酸性多糖
類の含量が１〜８重量％であり、またこのゲルをこれが
不溶の溶液中において１〜２０重壜％の割合で使用し、
そして（２）蛋白を、イオンの濃度が０．０５％ｗ／ｖ
（ＩＩ／容量）よりも大きい塩溶液で回収する、ことを
特徴とする。

今（ロ）本発明者は、ゲル化しつる酸性多糖類の粒子が
その最短寸法において０．５１１１１！ｌよりも小さく
ない場合にはじめて上述の蛋白を精製且つ分離すること
が可能であるということを予期を越えて発見した。

これは、従来使用された樹脂が蛋白の抽出を達成するた
めに７００ｍ”／（］までのできるだけ大きい吸着のた
めの比表面積をＨすることが必要であったから、なおざ
ら予想Ｃぎないことである。

今や本発明の方法において、ゲル化しつる酸性多糖類か
ら製造されるゲルは、低い蛋白透過性のみを朽し、この
結果として吸着は２Ｘ１０−３〜０．２１１１’／９で
あってよいゲルの比表面積をかなり減する表面に限定さ
れる。

本発明において使用されるゲル化しつる酸性多糖類は、
アルギネート及びカラギーニン（ｃａｒｒａ−ｇｅｅｎ
ｉｎ）から選択される。

のもの及び更にアンモニウムカチオンを含有する溶液と
接触させるとゲル化する。

本発明者は、必要とされる蛋白が酸性多糖類ゲル上に吸
着しつるということも予期を越えて発見した。

更に酸性多糖類ゲルの調製法が本発明の方法の成功に非
常に重装であることも発見された。

選択した酸性多糖類がアルギネートである場合、ゲルは
司溶性のアルギネートゲル、普通はナトリウム塩の水溶
液をとり、次いでこれを対イオンと接触させてゲルを生
成せしめることにより普通製造される。一般にＣａＣｌ
＋溶液が使用されろ。

しかしながら本発明の方法で使用しうるゲルを得るには
、ゲル中のアルギネートの１１１度か十分定義される限
界内、本例では１〜８重間％におることが必要であり、
残りが水であることを特記する。

ゲル中のアルギネート濃度が約１％以下である場合、ゲ
ルの安定性は過剰の水の結果として力＼なり減ぜられ、
それが蛋白を精製するのに有用でなくなる。一方８％以
上の濃度では粘度の増加が観察され、最早や媒体を容易
に取り扱うことができなくなり、従ってゲルのｌｆｉ製
が実質的に不可能になる。

良好な条件下に得られるゲルはビーズ、バール、細片、
フィラメント、側ト或いは史に布の形で用いることがで
きる。

本発明の具体例によれば、アルギン酸ナトリウムを水溶
液にとり、そしでＣａＱｌ、で沈澱させる。

次いで必要な形で得られるゲルを、常にゲル化に対しｖ
ｍ＜イオンの存在にあるようにＣａＣ１ｘ溶液中に置く
。

本発明の方法の具体例によれば、ｒ８浬されるミルク又
は乳漿はアルギネートグルの安定化を保証するのに十分
なカルシウム濃度を有する。

カラギーニンを酸性多糖類として選択する場合、ゲルは
普通可溶性のカラギーニン塩を水溶液中に入れることに
よって製造される。一般にはナトリウム塩が用いられ、
対イオンとの接触でゲルを生成才しめる。ＫＣｌ　、Ｎ
Ｈ４ＣＩ又はＲｂ　Ｃ１の溶液が一般に使用される。

本発明の方法で使用しうるゲルを得るには、ゲル中のカ
ラギーニンの濃度が良く定義された範囲、即ち本例では
１〜８重量％内に存在しなければならず、残りが水から
なることを特記する。

ゲル中のカラギーネート濃度が約１％以下である場合、
ゲルの安定性は過剰の水の結果としてかなり減ぜられ、
それが蛋白を精製するのに有用でなくなる。一方８％以
上の濃度では粘度の増加が観察され、最早ヤ媒体を容易
に取り扱うことかできなくなり、従ってゲルの調製が実
質的に不ロ■能になる。

良好な条件下に得られるゲルはビーズ、バール、細片、
フィラメント、繊維、或いは更に布の形で用いることが
できる。

本発明の具体例によれば、ナトリ°ウムカラギーネート
を水溶液にとり、そしてＫＣｌで沈澱させる。

次いで必姿な形で得られるゲルを、常にゲル化（対して
働くイオンの存在にあるようにＫＣｌ溶液中に置く。

酸性多糖類をゲルの生成に使用する時には、後省に、使
用条件のもとに不溶性である金属酸化物を混入してもよ
い。チタン、ジルコニウム、珪素及びアルミニウムの酸
化物、けビオライト（ｓｅｐｉｏｌｉｔｅ　）　、及び
これらのｆｉｌ族体は使用しつる酸化物の例として特に
言及することかできる。

添加される酸化物の樋は普通３重湯％を纏えない。

それにも拘らず、それより多嬢も重大な影響を与えずに
使用することができる。

本発明の方法によれば、このようにして得たゲルは不溶
性のまま溶液中に、蛋白溶液に対し１〜２０容吊％に相
当する蟻で使用される。この量は吸着させる蛋白の濃度
にも依存する。

本発明の方法で分離しつる蛋白が関係する限りにおいて
、これらは少くとも７．５の′４＋電点Ｉ）Ｈを有ざな
ければならない。本発明の方法で分離且つ精製しつるミ
ルク蛋白の例の中で特に言及しうるちのはラクトフエー
リン、ラクトペルオキシダーゼ、ある種の免疫グロブリ
ン、及び四種の他の蛋白である。次いで酸性多糖類ゲル
上に吸着される蛋白を回収しなければならない。

本発明の方法は、同業者の決定することができる条件に
従えば、他の媒体中に存在しつる他の蛋白を分離するた
めに適用しうろことが明らかである。

アルギネートゲルを用いる場合、このようにしてグルに
吸着される蛋白は、ゲルがアルキン酸カルシウムの場合
ＣａＣｌ２で或いは十分な量のＣａＣ１＋を含有するイ
オンの混合物で流出させることができる。

蛋白をアルギネートゲルを流出させるために使用される
溶液中の塩の濃度は厳密でない：これは用いる塩に、蛋
白に及び溶液のＩＩＨに依存する。

即ちＣａＣ１ｔを用いる場合、少くとも０．１％Ｗ／Ｖ
の濃度が使用される。

蛋白をゲルから流出させるために用いる塩は、それを吸
着させるために用いたものと同一であってよいが、そう
である必要はない。２つの異なる塩を用いる場合、それ
らが適合しあわねばならない、即ら反応してそれ自体の
沈澱を生成してはならないということは明らかである。

普通新しい流出を再開する前に、容器とアルキネ−１〜
ゲルを、ｍ度がゲルを不安定化させない十分な濃度であ
る塩溶液で洗浄する。

本発明による蛋白の分離及び精製法は連続式又は非連続
式で行なうことかひきる。

非連続式の本発明の方法の具体例によれば、アルギル酸
カルシウムゲルを製造し、これをいずれ１つの容器中に
蛋白溶液と共に導入し、そして全体を、必要とされる抽
出％に依存して、溶液中の抽出すべき蛋白の濃度の関数
として、そして共存物質の濃度及び性質の関数として１
０分〜２４時間攪拌する。ゲルを少くとも０．１％Ｗ／
Ｖの濃度のＣａＣｌ２溶液で洗浄し、次いでアルギネー
トゲルを約０．１％Ｗ／Ｖ以上の濃度のＣａＣｌ　２溶
液で流出させ、このようにして蛋白を溶液として回収す
る。

連続式の本発明の方法の具体例によれば、アルギン酸カ
ルシウムゲルを製造し、これを好ましくは固定床又は流
動床を含むカラム中へ導入し、そして仕込み物を０．１
〜３のＬＨＳＶで通流さ往る。

ゲルを少くとも０．１％Ｗ／Ｖの濃度においてＣａＣｌ
２溶液で洗浄する。次いでアルギネートグルを０．１％
Ｗ／Ｖ以上の濃度のＣａＣｌ２溶液で流出させ、このよ
うにして蛋白を溶液として回収する。

カラギーニンゲルを用いる場合、このゲルに吸着された
蛋白は、水溶性の有機又は無機塩のいずれかの水溶液を
用いて流出させることかできる。

しかしながらゲルがＫ又はＮＨ＜カラギーニエートであ
る場合、ＫＣｌ又はＮ８４ＣＩ、或いはＫＣｌ叉１．１
ＮＨ４０１を十分な量で金石するイオンの混合物を用い
ることが好適ひある。

蛋白をカラギーニングルから流出さぼるために用いる溶
液の塩の濃度は１１Ｉ密でない；それは用いる塩に、蛋
白に、そし−Ｃ溶液のｐＨに依存する。

従ってＫＣｌを用いる場合には、少くとも（１１％の濃
度を用いる。

蛋白をゲルから流出さぼるために用いる塩は、それを吸
着さぼるために用いたものと同一であってよいが、そう
である必要はない、、、２つの異なる塩を用いる場合に
は、それらが適合しなければならない、即ち反応してそ
れ自体尤ｎを生成してはならないということは明白であ
る。

普通には、析しい流出を再開する前に、容器とカラギー
ニンゲルを、ｌ１ｌｆがゲルを不安定化させないために
十分である塩溶液で洗浄する。多くの場合に０．１％Ｗ
／Ｖの濃度を右するＫＣｌ溶液を用いる。

蛋白を分離且つ精製するための本発明の方法は、連続式
又は非連続式で行なうことができる。非連続式の本発明
の方法の具体例によれば、カリウム力ラギネートゲルを
製造し、これをいずれ１つの容器中に蛋白溶液と共に導
入し、そして全体を、必要とされる抽出％に依存して、
溶液中の抽出すべき蛋白の濃度の関数としで、そして共
存物質の濃度及び性質の関数として１０分〜２４時間攪
拌する。ゲルを少くとも０．１％Ｗ／Ｖ（１）１度のＫ
Ｃｌ溶液で洗浄し、次いでカラギーニンゲルを約０．１
％Ｗ／Ｖ以上の濃度のＫＣｌ溶液で流出さけ、このよう
にして蛋白を溶液として回収する。

連続式の本発明の方法の具体例によれば、カリウム力ラ
ギーネートゲルを製造し、これを好ましくは固定床又は
流動床を含むカラム中へ導入し、そして仕込み物を０．
１〜３のＬＨ３Ｖで通流させる。ゲルを少くとも０．１
％Ｗ／Ｖの濃度においてＫＣｌ又はＮ　Ｈ４Ｃｌ溶液で
洗浄する。次いでカラギーネートゲルを０．１％Ｗ／Ｖ
以上の濃度のＫＣｌ溶液で流出させ、このようにして蛋
白を溶液として回収する。

次の実施例を、本発明の方法より良く例示するために示
すが、これは本発明の範囲を限定するものではない。

支１１−１ アルギン酸ナトリウム３０　ｇ／ｌ及び酸化チタン２０
！ＩＩ／ｌを含有する均一な水溶液を、ＣａＣｌ２３０
Ｍ１を含りする水溶液中へ押出すことによって、長さ約
５ｃｍ及び最小寸法としての直径約１１１ＩＩ１１のフ
ィラメント形のアルギネートゲルを製造した。

別に、新しいミルクを、強度７０００のレンネット（ｒ
ｅｎｎｅｔ）　０　、０３容量％の存在下に３２℃でゆ
っくり凝固させることによって甘い、パスツール処理し
てない乳漿を製造した。この乳漿は２０℃で６．６のＩ
）Ｈとラクトース４％、１１１１賀０．３５％及び蛋白
０．７％（ラクトペルオキシダーゼ０．００１％及びラ
クトフェリン０．００３％を含む）の濃度とが特徴であ
った。

アルギネートゲル２００ｇを乳漿５１に添加した後、混
合物を４℃で第８時間攪拌した。ゲルを金属製ふるいで
のｒ過によって分離し、次いでそれぞれＣａＣ１ｔ　３
　！７／ｌを含有する水溶液５１で３回洗浄した。

次いでゲルを４℃で２時間攪拌しながら、ＣａＣｌ　ｓ
　５０　（１／Ｉを含む水溶液１１中で２回洗浄するこ
とによって、ゲルに固定された物質を回収した。

この方法で得た溶液２１はラクトフェリン１３０信σ及
びラクトペルオキシダーゼ２０ａＱを含む蛋白的２５０
１１１７を含有した。

支［１２ アルギネート３０（１／Ｉを含有する水溶液を調製した
。

この溶液３Ｉを、Ｃａ　Ｃｌ　ｅ　３００　／ｌ　ヲ含
む溶液中に噴霧し、このようにして平均直径約１゜２１
のアルギン酸カルシウムゲル した。この吸着剤物質の表面積は２Ｘ１０−’１／ｇで
あった。

このバール２００ＩＩｌｌを直径５ｃｍのカラム中に入
れて、高さ１１０Ｉ１１のゲル床とした。

ミルク１３容隋、即ちラクトール約５％、脂質４％、１
０．９％及びラクトフェリン約０．００８％とラフ［−
ペルオキシダーゼ０．００３％を含む蛋白３．３％を含
有する全ミルク２．５７５１を処理した。

ミルクのゲルカラムを通過するＬＨＳＶは１。

５であった。

ミルクを通流ざ才た後、ゲルを容器に移し、そこでそれ
を、Ｃａ　Ｃｌ　２　３　（１／ｌを含有する水溶ａ３
００ｍ＋で連続的に５回洗浄した。その度にゲルを傾斜
によって分離し、ナイロンフィルターぐｆ過した。

ゲルを４℃で２時間撹拌しながらＣａＣｌ　２３％を含
有する水溶液３００１中で３回洗浄することによって、
ゲルに＠着された蛋白を回収した。

この方法で得た溶液６００ｍｌは，ラクトペルオキシダ
ーゼ３　１ｒａａ及びラクトフェリン１２！Ｍσを含む
蛋白的２６０１１ｇを含有した。この抽出収率は７２％
であった。

比較の目的で同一のカラムに、普通蛋白の分離に使用さ
れるポリアクリルアミドで架橋した寒天樹脂を充填した
。

この樹脂中に上述した組成の全ミルクを同一の操作条件
下に通流させた。１時間以内の通流後にカラムは完全に
閉塞した。

実施例　３ アルギン酸ナトリウム３０１３／ｌ及び酸化チタン５　
ｇ／ｌを含有する均一な水溶液を、ＣａＣｌ２３０　ｇ
／ｌを含有する水溶液中へ押出すことによって、長さ約
１０ＣＩＩｌ及び最小寸法としての直径約１．５ｍｍの
フィラメント形のアルギネートゲルを製造した。

実施例２に記述した組成の、特にラクトフェリン０．０
０８％及びラクトペルオキシダーゼ０、００３％を含む
蛋白３．３％を含有する全ミルクを処理した。

アルギネート１００ｇを全ミルク２０１に添加した後、
混合物を１０℃で８時間攪拌した。このゲルを金属製の
ふるいでのｒ過によって分離し、そしてＱａ　ｃ＋　２
１　　ｇ／ｌを含む溶液５００１で３回洗浄した。

ゲルを１０℃で３０分間撹拌しながら、ＣａＣｌ　２１
０　（Ｊ／ｌ及びＮａ　Ｃ１４０Ｇ／’Ｉを含有する水
溶液３００ｍ１中で２回洗浄することにより、ゲルに固
定された物質を回収した。

このようにして得た溶液６００１は、ラクトフェリン１
９及びラクトペルオキシダーゼ１２５ｍｇを含む蛋白的
３ｇを、脂肪物質的０．５ｇと共に含有した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、等電点９Ｈが７．５よりも大きいミルク又はミルク
   誘導物から蛋白を精製する際に、（１）必要とされる蛋
   白を含む媒体を、ゲル形で用いられるゲル化しうる酸性
   多糖類の粒子上を通過させ、但しこれらの粒子はその最
   短寸法が０．５ｍｍより小さくなく、ゲル中の酸性多糖
   類の含量が１〜８重量％であり、またこのゲルをこれが
   不溶の溶液中において１〜２０重量％の割合で使用し、
   そして（２）蛋白を、イオンの濃度が０．０５％ｗ／ｖ
   よりも大きい塩溶液で回収する、該ミルク又はミルク誘
   導物から蛋白を精製する方法。 ２、アルギネート及びカラギーニンから選択されるゲル
   化しうる酸性多糖類を使用する特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３、ゲル化しうる酸性多糖類を、カリウム、ルビジウム
   、セシウム又はアルカリ土類金属カチオンから選択され
   るカチオン、鉄系のそれ、そしてアンモニウムカチオン
   を含有する溶液と接触させることによってゲル化させる
   特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、アルギネートをＣａＣｌ＿２の溶液でゲル化させる
   特許請求の範囲第２及び３項記載のいずれかの方法。 ５、カラギーニンをＫＣｌ又はＮＨ＿４Ｃｌ又はＲｂＣ
   １の溶液でゲル化させる特許請求の範囲第２及び３項記
   載のいずれかの方法。 ６、２×１０＾−＾３〜０．２ｍ＾２／ｇの比表面積を
   有する酸性多糖類ゲルを用いる特許請求の範囲第１〜５
   項記載のいずれかの方法。 ７、酸性多糖類ゲルを、パール、ビーズ、細片、繊維、
   フィラメント又は布の形で用いる特許請求の範囲第１〜
   ６項記載のいずれかの方法。 ８、酸性多糖類ゲルが、使用条件下に不溶性である金属
   酸化物の、ゲルの重量に基づいて３重量％を越えない量
   を混合する特許請求の範囲第１〜７項記載のいずれかの
   方法。 ９、金属酸化物をチタン、ジルコニウム、珪素及びアル
   ミニウムの酸化物、セピオライト、及び他の同族体を含
   んでなる群から選択する特許請求の範囲第８項記載の方
   法。 １０、特にラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、
   免疫グロブリン及び他の同族体から選択されるミルク蛋
   白を処理する特許請求の範囲第１〜９項記載のいずれか
   の方法。 １１、アルギネートゲルを、蛋白の溶液を含有する適当
   な溶液中に注ぎ、全体を１０分〜２４時間撹拌し、ゲル
   をＣａＣｌ＿２溶液で洗浄し、アルギネートゲルをＣａ
   Ｃｌ＿２溶液で流出させ、そして蛋白を溶液として回収
   する特許請求の範囲第１〜１０項記載のいずれかによる
   ミルク又はミルク誘導物からの蛋白の精製法。 １２、カラギーニンゲルを、蛋白の溶液を含有する適当
   な容器中に注ぎ、全体を１０分〜２４時間撹拌し、ゲル
   をＫＣｌ、ＮＨ＿４Ｃｌ又はＲｂＣ１から選択される塩
   の溶液で洗浄し、カラギーニンゲルを同一の塩の溶液で
   流出させ、そして蛋白を溶液として回収する特許請求の
   範囲第１〜１０項記載のいずれかによるミルク又はミル
   ク誘導物からの蛋白の精製法。 １３、アルギネートゲルを、固定又は流動床を含むカラ
   ム中へ注入し、蛋白を含有する仕込み物を０．１−３の
   ＬＨＳＶにおいてアルギネートゲル中を通過させ、そし
   てゲルをＣａＣｌ＿２溶液で洗浄し、次いでアルギネー
   トゲルをＣａＣｌ＿２溶液で流出させ、そして蛋白を溶
   液として回収する特許請求の範囲第１−１０項記載のい
   ずれかによるミルク又はミルク誘導物からの蛋白の精製
   法。 １４、カラギーニンゲルを、固定又は流動床を含むカラ
   ム中へ注入し、蛋白を含有する仕込み物を０．１〜３の
   ＬＨＳＶにおいてカラギーニンゲル中を通過させ、そし
   てゲルをＫＣｌ、ＮＨ＿４Ｃｌ又はＲｂＣ１から選択さ
   れる塩の溶液で洗浄し、次いでカラギーニンゲルを同一
   の塩の溶液で流出させ、そして蛋白を溶液として回収す
   る特許請求の範囲第１〜１０項記載のいずれかによる蛋
   白の精製法。 １５、特許請求の範囲１〜１４項記載のいずれかによる
   方法で分離且つ精製される７．５より大きい等電点ｐＨ
   を有するミルク又はミルク誘導物からの蛋白。