SE468537B - Foerfarande foer att utvinna proteiner fraan mjoelk - Google Patents

Description

468 557 2 Det skulle därför vara önskvärt att ha tillgång till ett förfarande vilket medger att proteiner lätt kan extraheras ur ett medium som är så komplicerat som hel mjölk, vilken framför allt innefattar fetter, små lipidklot och kaseinceller, utan att förfarandet har de ovannämnda olägenheterna med blockering eller kravet att mediet måste förbehandlas. f Ändamålet med föreliggande uppfinning är att utveckla ett sådant förfarande.

I samband med uppfinningens tillkomst har det visat sig att användningen av sura polysackarider, som kan gelas vid lämpliga betingelser, möjliggör isolering och rening av olika proteiner ur mjölk. Ändamålet med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett förfarande för rening och isolering av proteiner genom behandling i närvaro av en sur polysackarid som kan gelas vid lämpliga betingelser. Ett annat ändamål med uppfinningen är att åstadkomma ett förfarande för rening av proteiner, vilket inte resulterar i en signifikant förändring av det medium, ur vilket proteinerna extraheras. Ännu ett ändamål med uppfin- ningen är att åstadkomma ett förfarande för extraktion av pro- teiner som möjliggör att isoleringen av proteinerna kan genom- föras mycket snabbare än vid användningen av andra förfaranden samtidigt som man undviker blockering av hartser samt even- tuell förbehandling av mediet. Ytterligare ett ändamål med uppfinningen är att åstadkomma ett reningsförfarande som möjlig- gör behandling av proteinerna från mjölk med ett isolelektriskt pH som är större än 7,5.

Förfarandet enligt uppfinningen för rening av proteiner, vars isoelektriska pH är större än 7,5, kännetecknas därav, att (1) det medium, som innehåller det erfordrade proteinet, bringas att passera över partiklar av en gelbar sur polysacka- ou rid i gelform, vilka partiklar inte är mindre än 0,5 mm i sin kortaste dimension, varvid halten av sur polysackarid i gelen är mellan 1 och 8 viktprocent och gelen används i ett viktför- hållande av 1 till 20% i en lösning, i vilken den är olöslig, och att (2) proteinerna utvinnes i en saltlösning, i vilken koncentrationen av joner är större än 0,05 viktprocent per vo- lym (i det följande uttryckt som vikt/volym). 4:0 468 537 3 Det har nu överraskande visat sig att det var möjligt att rena och isolera de ovannämnda proteinerna endast när partik- larna av gelbar sur polysackarid var större än 0,5 mm i sin kortaste dimension.

Detta är speciellt oväntat eftersom tidigare använda hart- ser behövde ha en specifik yta för absorption som var så stor som möjligt, nämligen upp till 700 m2/g för att man skulle kun- na uppnå extraktion av proteinerna.

Vid förfarandet enligt uppfinningen har de geler som bil- dats av de gelbara sura polysackariderna endast låg protein- genomträngningsförmåga, och till följd härav är absorptionen begränsad till ytan, vilket avsevärt minskar gelens specifika yta, som kan vara mellan 2 x lO“3 och 0,2 m2/g.

De gelbara sura polysackariderna som används enligt före- liggande uppfinning väljs bland alginater och karrageniner.

Dessa sura polysackarider gelar när de bringas i kontakt med en lösning som innehåller katjoner, såsom framför allt alkalimetall- och alkaliska jordartsmetallkatjoner, de i järn- serien och även ammoniumkatjonen.

Det har även överraskande visat sig att de erfordrade pro- teinerna kan absorberas på den sura polysackaridgelen.

Det visade sig vidare att metoden för framställning av den sura polysackaridgelen var synnerligen viktig för att förfaran- det enligt uppfinningen skulle lyckas.

När den valda sura polysackariden är ett alginat, framställs gelen vanligen genom att en vattenlösning av ett lösligt algi- natsalt, vanligen natriumsaltet, bringas i kontakt med en mot- jon för att åstadkomma gelbildning. Man använder vanligen en CaCl2-lösning.

Det har emellertid visat sig att för erhållande av en gel, som kan användas vid förfarandet enligt uppfinningen, måste algignatkoncentrationen i gelen ligga mellan väl definierade gränser, i föreliggande fall mellan l och 8 viktprocent, varvid resten består av vatten.

När alginatkoncentrationen i gelen ligger under ca. 1%, minskas gelens stabilitet avsevärt till följd av överskott på vatten, som gör den oanvändbar för rening av proteiner. Med en koncentration över 8% å andra sidan iakttas en viskositetsök- 468 537 4 ning, som inte längre medger hantering av mediet med lätthet, vilket sålunda gör det praktiskt taget omöjligt att framställa gelen.

En gel som erhålls under goda betingelser kan användas i a form av pärlor, remsor, trådar, fibrer eller t.o.m. tyg.

Enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning används C natriumalginat i en vattenlösning och utfälls med CaCl2.

Gelen, erhållen i erfordrad form, placeras sedan i en CaCl2-lösning, så att den alltid föreligger i närvaro av den jon, som är ansvarig för gelbildning.

Enligt en utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen har den mjölk eller den mjölkvassla som behandlas en kalcium- koncentration vilken är tillräcklig för att säkerställa stabi- lisering av alginatgelen.

När karragenin väljs som den sura polysackariden, framställs gelen vanligen genom användning av ett lösligt karrageninsalt i en vattenlösning. Man använder vanligen natriumsaltet och placerar detta i kontakt med en motjon för åstadkommande av gelbildning. En lösning av KCl, NH4Cl eller RbCl används i all- mänhet.

Det har vidare visat sig att för att man skall erhålla en gel, som kan användas vid förfarandet enligt uppfinningen, måste koncentrationen av karragenat i gelen ligga inom välde- finierade gränser, i föreliggande fall mellan l och 8%, varvid resten utgörs av vatten.

När karragenatkoncentrationen i gelen är under ca. 1%, minskas gelens stabilitet avsevärt till följd av överskott på vatten, som gör gelen oanvändbar för rening av proteiner. Med en koncentration över 8% å andra sidan iakttas en viskositets- ökning, som inte längre medger hantering av mediet med lätthet, varigenom det blir praktiskt taget omöjligt att framställa ge- len.

En vid goda betingelser erhållen gel kan användas i form av pärlor, remsor, trådar, fibrer eller t.o.m. tyg.

Enligt en utföringsform av uppfinningen används natriumkar- ragenat i vattenlösning och gelas med KCl.

Gelen, erhållen i erfordrad form, placeras sedan i en KCl- lösning, så att den alltid finns i närvaro av den jon som är ansvarig för gelningen. 468 537 5 Vilken sur polysackarid som än används för bildning av ge- len, kan den sistnämnda även innehålla en metalloxid som är olöslig vid användningsbetingelserna. Titan-, zirkonium-, kisel- och aluminiumoxider, sepiolit, och analoger därav kan nämnas speciellt som exempel på oxider som kan användas. Mängden till- satt oxid överstiger vanligen inte 3 viktprocent. Inte desto mindre kan emellertid större mängder användas utan att det med- för någon betydande effekt.

Enligt förfarandet enligt uppfinningen används den sålunda erhållna gelen i en lösning i vilken den förblir olöslig i en mängd som uppgår till mellan 1 och 20 volymprocent i förhållan- de till proteinlösningen. Denna mängd beror även på koncentra- tionen av protein som skall absorberas.

Vad beträffar de proteiner som kan separeras genom förfa- randet enligt uppfinningen måste dessa ha ett isoelektriskt pH av minst 7,5. Bland de exempel på mjölkproteiner som kan iso- leras och renas genom förfarandet enligt uppfinningen må nämnas speciellt laktoferrin, laktoperoxidas, vissa immunoglobuliner och andra liknande proteiner. De proteiner som adsorberas på den sura polysackaridgelen måste sedan utvinnas.

Det är klart att förfarandet enligt uppfinningen kan använ- das för isolering av andra proteiner, som kan föreligga i and- ra medier, med användning av betingelser som kan bestämmas av fackmannen.

I det fall då en alginatgel används, kan de proteiner som adsorberats på gelen på det här sättet elueras med CaCl2 när gelen är ett kalciumalginat eller med en blandning av joner som innehåller CaCl2 i tillräckliga mängder.

Saltkoncentrationen i den lösning som används för att eluera proteinerna från alginatgelen är inte kritisk; den beror på det använda saltet, på proteinerna och på lösningens pH-värde.

När CaCl2 används, används sålunda en koncentration av minst O,l% vikt/volym.

Det salt som används för att eluera proteinet från gelen kan men behöver inte vara detsamma som det som används för att adsorbera proteinet. När två olika salter används måste de gi- vetvis vara förlikbara, dvs. de får inte reagera under bildning av en fällning. 468 537 6 Innan en ny eluering igångsätts tvättas vanligen behållaren och alginatgelen med en saltlösning, vars koncentration är till- räcklig för att inte destabilisera gelen. I flertalet fall an- vänds en CaCl2-lösning med en koncentration av 0,l% vikt/volym.

Förfarandet enligt uppfinningen för isolering och rening av proteiner kan genomföras kontinuerligt eller satsvis.

Enligt en utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen i satsvis form framställs kalciumalginatgelen och införs till- sammans med proteinlösningen i en behållare och det hela omrörs under en tid av från l0 minuter till 24 timmar, beroende på den erfordrade procentuella extraktionen och som en funktion av koncentrationen av det protein som skall extraheras i lös- ningen och av koncentrationen och egenskaperna hos de förore- nande materialen. Gelen tvättas med en CaCl2-lösning vid en koncentration av minst O,l% vikt/volym, alginatgelen elueras_ sedan med en CaCl2-lösning vid en koncentration över O,l% vikt/volym och proteinet utvinns sålunda i form av en lösning.

Enligt en utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen i kontinuerlig form framställs kalciumalginatet och införs företrädesvis i en kolonn som innehåller en fast bädd eller en fluidiserad bädd och det tillförda materialet bringas att passera genom kolonnen vid ett LHSV mellan 0,1 och 3.

Gelen tvättas med en CaCl2-lösning vid en koncentration av minst 0,l% vikt/volym. Alginatgelen elueras sedan med en CaCl2- lösning vid en koncentration över O,l% vikt/volym och proteinet utvinns sålunda i form av en lösning.

I det fall då en karrageningel används kan de sålunda ad- sorberade proteinerna på den här gelen elueras med användning av en vattenlösning av vilket vattenlösligt organiskt eller oorganiskt salt som helst. När gelen är ett K- eller NH4-karra- geniat är det emellertid lämpligt att använda KCl eller NH4Cl eller en blandning av joner som innehåller KCl eller NH4Cl i tillräckliga mängder.

Saltkoncentrationen i den lösning som används för att elu- era proteinerna från karrageningelen är inte kritisk; den be- ror på det använda saltet, på proteinet och på lösningens pH- värde. Vid användning av KCl används sålunda en koncentration av minst O,l%.

.JA 'ö- un: nan.. 468 537 7 Det salt som används för att eluera proteinet från gelen kan men behöver inte vara samma som används för att absorbera proteinet. När två olika salter används måste de givetvis vara förlikbara, dvs. de får inte reagera under bildning av en fäll- ning.

Innan en ny eluering påbörjas tvättas vanligen behållaren och karrageningelen med en saltlösning, vars koncentration är tillräcklig för att inte destabilisera gelen. I flertalet fall används en KCl-lösning med en koncentration av 0,l% vikt/volym.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning för isolering och rening av proteiner kan genomföras kontinuerligt eller sats- vis. Enligt en utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen i satsvis form framställs en kaliumkarragenatgel och hälls i en behållare, vilken innehåller proteinlösningen, och det hela omrörs under en tid från 10 minuter till 24 timmar, beroende på den procentuella extraktion som erfordras och som en funk- tion av koncentrationen av protein som skall extraheras i lös- ningen och på koncentrationen och egenskaperna hos de förore- nande materialen. Gelen tvättas med en KCl-lösning vid en kon- centration av minst O,l% vikt/volym, karrageningelen elueras sedan med en KCl-lösning, vars koncentration är högre O,l% vikt/volym och proteinet utvinns sålunda i form av en lösning.

Enligt en utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen i kontinuerlig form framställs en K-karragenatgel och införs företrädesvis i en kolonn innehållande en fast bädd eller en fluidiserad bädd och satsen bringas att passerar vid ett LHSV mellan 0,1 och 3. Gelen tvättas med en KCl- eller NH4Cl~lÖSnin9 vid en koncentration av minst O,l% vikt/volym. Gelen tvättas med en KCl- eller NH4Cl-lösning vid en koncentration av minst O,l% vikt/volym. Karagenatgelen elueras sedan med en KCl-lös- ning, vars koncentration är över 0,l% vikt/volym och proteinet utvinns sålunda som en lösning.

Följande exempel används för att bättre åskådliggöra för- farandet enligt uppfinningen men begränsar inte uppfinningens omfattning.

Exempel_l En alginatgel framställdes i form av trådar med en längd av ca. 5 cm och en diameter av ca. l mm som den kortaste dimensionen 468 537 8 genom strängsprutning av en homogen vattenlösning som innehöll 30 g/l natriumalginat och 20 g/l titanoxid i en vattenlösning innehållande 30 g/l CaCl2.

Söt opastöriserad mjölkvassla framställdes separat genom långsam koagulering av färsk mjölk vid 320C i närvaro av 0,03 volymprocent löpe med en styrka av 7000. Denna mjölkvassla kännetecknades av ett pH av 6,6 vid 20°C och av att den inne- höll 4% laktos, 0,35% lipider och 0,7% proteiner (inklusive 0,00l% laktoperoxidas och 0,003% laktoferrin).

Efter tillsättning av 200 g alginatgel till 5 l mjölkvass- la omrördes blandningen 18 timmar vid 400. Gelen separerades genom filtrering genom en metallsikt och tvättades sedan tre gånger, varje gång med 5 1 av en vattenlösning som innehöll 3 g/l CaCl2.

De substanser som var fästa vid gelen utvanns genom tvätt- ning av gelen två gånger i 1 l av en vattenlösning som inne- höll 50 g/l CaCl2, under omröring 2 timmar vid 40C.

De 2 l lösning som erhölls på detta sätt innehöll ca 250 mg proteiner, inklusive 130 mg laktoferrin och 20 g laktoper- oxidas.

Exempel_2 En vattenlösning innehållande 30 g/l alginat framställdes. 3 liter av denna lösning sprutades in i en lösning som innehöll 30 g/l CaCl2, varigenom kalciumalginatgelpärlor bil- dades med en genomsnittlig diameter av 1,2 mm. Den specifika ytan hos detta absorberande material var 2 x l0'3 m2/g. 200 ml pärlor placerades i en kolonn med en diameter av 5 cm för erhållande av en bädd av gel som var ll cm hög. l3 volymer mjölk behandlades, dvs. 2,575 l helmjölk inne- hållande ca 5% laktos, 4% lipid, 0,9% salt och 3,3% proteiner, inklusive ca. 0,008% laktoferrin och 0,003% laktoperoxidas.

Det LHSV, vid vilket mjölken bringades att passera genom gelkolonnen, var 1,5.

När mjölken hade bringats att passera genom kolonnen, över- fördes gelen till en behållare, i vilken den tvättades 5 gånger i följd med 300 ml varje gång av en vattenlösning innehållande 3 g/l CaCl2. Gelen frånskildes genom dekantering och filtre- ring på ett nylonfilter varje gång. 11:, 468 557 9 De på gelen adsorberade proteinerna utvanns genom tvätt- ning av gelen två gånger i 300 ml av en vattenlösning som inne- höll 3% CaCl2,under omröring 2 timmar vid 40C.

På detta sätt erhållna eoo ml lösning innehöll en. 260 ml proteiner, inklusive 31 mg laktoperoxidas och 125 mg laktofer- rin. Extraktionsutbytet var 72%.

Som jämförelse kan nämnas att samma kolonn fylldes med ett agarharts som var tvärbundet med polyakrylamid. Det här hart- set är det som vanligen användes för isolering av proteiner.

Den helmjölk vars sammansättning har beskrivits ovan bring- ades att passera genom detta harts vid samma driftsbetingelser, och efter mindre än l timme var kolonnen fullständigt igensatt.

Exempel_3 En alginatgel framställdes i form av trådar med en längd av ca. 10 cm och en diameter av ca. 1,5 mm som den kortaste dimensio- nen genom strängsprutning av en homogen vattenlösning som inne- höll 30 g/l natriumalginat och 5 g/l titanoxid i en vattenlös- ning som innehöll 30 g/l CaCl2.

Man behandlade den helmjölk vars sammansättning anges i exempel 2 och som innehåller framför allt 3,3% proteiner, in- klusive 0,008% laktoferrin och 0,003% laktoperoxidat.

Efter tillsättning av 100 g alginat till 20 1 helmjölk om- rördes blandningen 8 timmar vid l0°C. Gelen frånskildes genom filtrering genom en metallsikt och tvättades sedan tre gånger med 500 ml av en lösning som innehöll 1 g/l CaCl2.

De material som satt fast på gelen utvanns genom tvättning av gelen två gånger i 300 ml varje gång av en vattenlösning S0m innehöll 10 9/1 CäCl2 och 40 g/l NaCl under omröring 30 minuter vid l0°C.

Sålunda erhållna 600 ml lösning innehöll ca,3 g proteiner, inklusive l g laktoferrin och 125 mg laktoperoxidas tillsammans med ca. 0,5 g fettsubstans.

Claims (14)

468 537 10 2515113333.

1. Förfarande för att kontinuerligt eller satsvis från mjölk utvinna proteiner. vars isoelektriska pH är större än 7.5. k ä n n e t e c k n a t därav. att (l) det medium. som innehåller det önskade proteinet. brinaas att passera över partiklar av en aelbar sur polysackarid i zelform. varvid dessa partiklars kortaste dimension inte är mindre än 0.5 mm och halten sur polysackarid i :elen är mellan 1 och 8 viktprocent. varjämte denna ael används i ett viktför- hållande av 1 - 20% i en lösning. i vilken den är olöslia. och därav. (2) att proteinerna utvinns i en saltlösning i vilken koncentrationen av joner är större än 0.05% vikt/volym. varvid de önskade proteinerna adsorberas på polysackaridpartiklarna. partiklarna avskiljs från det medium som innehöll proteinerna. partiklarna tvättas och proteinet elueras från nämnda partiklar medelst den nämnda saltlösningen.

2. Förfarande enligt krav 1. k ä n n e t e c k n a t därav. att en gelbar sur polysackarid som är vald bland alginater och karrageniner används.

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav. att den gelbara sura polysackariden gelas genom att placeras i kontakt en lösning som innehåller katjoner valda bland alkalimetall- eller alkaliska jordartsmetallkatjoner. de i järnserien och ammoniumkatjonen. U.

4. Förfarande enligt något av kraven 2 och 3. k ä n n e - t e c k n a t därav. att alginatet gelas med en lösnina av CaCl2.

5. Förfarande enligt något av kraven 2 och 3. k ä n n e - t e c k n a t därav. att karrageninen gelas med en lösning av KCl eller av NHuCl eller RbCl.

6. Förfarande enligt något av kraven 1 -_5. k ä n n e - t e c k n a t därav. att en sur polysackaridael med en specifik yta mellan 2 x 1O'3 och 0.2 m2/2 används.

7. Förfarande enligt något av kraven 1 - 6. k ä n n e - t e c k n a t därav. att en sur polysackaridgel används i form av pärlor. remsor. fibrer. trådar eller tyg.

8. Förfarande enligt något av kraven 1 - 7. k ä n n e - 468 537 11 t e c k n a t därav. att den sura polysackaridgelen innehåller en mängd som inte överstiger 3 viktprocent. räknat på gelens vikt. av en metalloxid som är olöslíg vid de använda betingelserna.

9. Förfarande enligt krav 8. k ä n n e t e c k n a t därav. att metalloxiden väljs ur den grupp som består av titan-, zirkonium-, kisel- och aluminiumoxider. sepiolit och andra analoger.

10. Förfarande enligt något av kraven 1 - 9. k ä n n e - t e c k n a t därav. att mjölkproteiner behandlas. vilka är valda speciellt från laktoferrin. laktoperoxidas. immunoglo- buliner och andra analoger.

11. Förfarande för utvinning av proteiner från mjölk enligt något av kraven 1 - 10. k ä n n e t e c k n a t därav. att en alginatgel hälls i en lämplig behållare som innehåller lösningen av proteiner. att det hela omrörs under en tid från 10 minuter till 2U timmar. att gelen tvättas med en CaCl2-lösning. att alginatgelen elueras med en CaCl2- lösning och att proteinerna utvinns som en lösning.

12. Förfarande för utvinning av proteiner från mjölk enligt något av kraven 1 - 10. k ä n n e t e c k n a t därav. att en karrageningel hälls i en lämplig behållare som innehåller lösningen av proteiner. att det hela omrörs under en tid från 10 minuter till 2U timmar. att gelen tvättas med en saltlösning vald bland KCl. NHuCl eller RbCl. att karrage- ningelen elueras med en lösning av samma salt och att proteinerna utvinns som en lösning.

13. Förfarande för utvinning av proteiner från mjölk enligt något av kraven 1 - 10. k ä n n e t e c k n a t därav. att en alginatgel hälls i en kolonn som innehåller en fast eller fluidiserad bädd. att materialet som innehåller proteinerna bringas att passera genom alginatgelen vid ett LHSV (liquid hourly space velocity) mellan 0.1 och 3. att gelen tvättas med en CaCl2-lösning. att alginatgelen sedan elueras med en CACl2-lösning och att proteinerna utvinns som en lösning.

14. Förfarande för utvinning av proteiner enligt något av kraven 1 - 10. k ä n n e t e c k n a t därav. att en 468 557 12 karrageningel hälls i en kolonn som innehåller en fast eller fluidiserad bädd. att materialet som innehåller lösninzen av proteiner bringas att passera genom karrageningelen vid ett LHSV (liquid hourly space Velocity) mellan 0.1 och 3. att gelen tvättas med en saltlösning vald bland KC1. NHuCl eller RbCl. att_karrageningelen sedan elueras med en lösning av samma salt och att proteinerna utvinns som en lösning.