JPS5937072B2 - ウロキナ−ゼの精製法 - Google Patents
ウロキナ−ゼの精製法Info
- Publication number
- JPS5937072B2 JPS5937072B2 JP8231077A JP8231077A JPS5937072B2 JP S5937072 B2 JPS5937072 B2 JP S5937072B2 JP 8231077 A JP8231077 A JP 8231077A JP 8231077 A JP8231077 A JP 8231077A JP S5937072 B2 JPS5937072 B2 JP S5937072B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- urokinase
- units
- column
- activity
- crude
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Filtering Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はウロキナーゼの精製法に関し、更に詳しくは人
尿またはそれに由来する粗製ウロキナーゼから発熱性物
質を除去し、かつ高純度のウロキナーゼを工業的有利に
取得する方法に関する。
尿またはそれに由来する粗製ウロキナーゼから発熱性物
質を除去し、かつ高純度のウロキナーゼを工業的有利に
取得する方法に関する。
ウロキナーゼは血清中に含まれているプラスミノーゲン
を活性化してフィブリン溶解能を有するプラスミンを生
成する機能があるため、線溶系の賦活剤として有用であ
り、末梢動脈血栓症や心筋硬そく症なとの治療に広く臨
床使用されている。
を活性化してフィブリン溶解能を有するプラスミンを生
成する機能があるため、線溶系の賦活剤として有用であ
り、末梢動脈血栓症や心筋硬そく症なとの治療に広く臨
床使用されている。
またウロキナーゼは近年抗ガン剤の増強剤としての用途
も開発され、その需要は急速に増大している。
も開発され、その需要は急速に増大している。
ウロキナーゼの精製法としては、燐酸セルロース、アン
バーライトＩＲＣ−５０、カルボキシメチルデキストラ
ン、カルボキシメチルセルロースの如きイオン交換体を
用いる方法、シリカゲル、ガラスピース、多孔性ガラス
、カーボワックス処理多孔性ガラス、ケイ酸アルミニウ
ムマグネシウム、活性化ケイソウ士、ヒドロキシルアパ
タイト、ベントナイトの如き物理化学的吸着剤を用いる
方法、アクリルニトリル系繊維、シアノアルキル化セル
ロース、ポリエチレンイミン含有ポリアミド繊維、寒天
の如き特異的吸着剤を用いる方法等種種の方法が知られ
ている。
バーライトＩＲＣ−５０、カルボキシメチルデキストラ
ン、カルボキシメチルセルロースの如きイオン交換体を
用いる方法、シリカゲル、ガラスピース、多孔性ガラス
、カーボワックス処理多孔性ガラス、ケイ酸アルミニウ
ムマグネシウム、活性化ケイソウ士、ヒドロキシルアパ
タイト、ベントナイトの如き物理化学的吸着剤を用いる
方法、アクリルニトリル系繊維、シアノアルキル化セル
ロース、ポリエチレンイミン含有ポリアミド繊維、寒天
の如き特異的吸着剤を用いる方法等種種の方法が知られ
ている。
ところでウロキナーゼを注射用薬剤として用いる場合に
は、充分なる比活性を有すると共に発熱性物質が除去さ
れていなければならないが、前記の精製法にては発熱性
物質が除去されない。
は、充分なる比活性を有すると共に発熱性物質が除去さ
れていなければならないが、前記の精製法にては発熱性
物質が除去されない。
従来、ウロキナーゼ中の発熱性物質の除去については種
々の方法が報告されているが、ウロキナーゼの回収率が
悪いなどの欠点がある。
々の方法が報告されているが、ウロキナーゼの回収率が
悪いなどの欠点がある。
本発明者らは、かかる欠点を解決すべく種々研究を重ね
た結果、人尿またはそれに由来する粗製ウロキナーゼを
Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドで架橋されたア
リルデキストランゲルによりゲルろ過することにより発
熱性物質を含まない高純度のウロキナーゼを高収率で取
得することができることを見い出し、本発明を完成する
に至った。
た結果、人尿またはそれに由来する粗製ウロキナーゼを
Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドで架橋されたア
リルデキストランゲルによりゲルろ過することにより発
熱性物質を含まない高純度のウロキナーゼを高収率で取
得することができることを見い出し、本発明を完成する
に至った。
本発明で用いられるＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルア
ミドで架橋されたアリルデキストランゲルとしては、例
えば七フアクリルＳ−２００スーパーファイン（商品名
、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）が好適に
挙げられる。
ミドで架橋されたアリルデキストランゲルとしては、例
えば七フアクリルＳ−２００スーパーファイン（商品名
、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）が好適に
挙げられる。
以下、本発明方法を具体的に説明する。
まず、上記ゲルをｐＨ約６〜１１の濃厚塩類溶液（例え
ば電気伝導率５０ｍｍｈｏ１０ｍ以上のリン酸緩衝液、
食塩溶液）で緩衝化した後カラムに充填するか、上記ゲ
ルをカラムに充填した後前記濃厚塩類溶液で緩衝化する
。
ば電気伝導率５０ｍｍｈｏ１０ｍ以上のリン酸緩衝液、
食塩溶液）で緩衝化した後カラムに充填するか、上記ゲ
ルをカラムに充填した後前記濃厚塩類溶液で緩衝化する
。
次いでこのカラムに人尿または、これに由来する粗製ウ
ロキナーゼの溶液をかけ、前記の濃厚塩類溶液にてゲル
ろ過を行なう。
ロキナーゼの溶液をかけ、前記の濃厚塩類溶液にてゲル
ろ過を行なう。
かくすることにより、発熱性物質の大部分はウロキナー
ゼよりも先に溶出し、また不純蛋白も除去できるので、
ウロキナーゼ活性分画を集めるときにより発熱性物質を
含まない高純度のウロキナーゼを高収率に取得すること
ができる。
ゼよりも先に溶出し、また不純蛋白も除去できるので、
ウロキナーゼ活性分画を集めるときにより発熱性物質を
含まない高純度のウロキナーゼを高収率に取得すること
ができる。
得られたウロキナーゼ活性分画は常法により硫安塩析し
、透析後、凍結乾燥することによりウロキナーゼを単離
することができる。
、透析後、凍結乾燥することによりウロキナーゼを単離
することができる。
以下、実施例を挙げて本発明方法を説明するが、本発明
方法はこれら実施例により限定されるものではない。
方法はこれら実施例により限定されるものではない。
向、実施例中ウロキナーゼの力価測定はプロラグらのフ
ィブリン平板法ＣＪ 、 ｐｌｏｕｇら、Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、 ２４．２７８（１
９５７））にて測定し、力価表示はジョンソンらにより
定められた国際単位（Ａ、Ｊ、Ｊｏ−ｈｎｓｏｎら、Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｓ、Ｄｉａｔｈｅｓ、ｈａｅｍｏｒｒｈ（
Ｓｔｕｔｔｇ、）、２１．２５９（１９６９））によっ
た。
ィブリン平板法ＣＪ 、 ｐｌｏｕｇら、Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、 ２４．２７８（１
９５７））にて測定し、力価表示はジョンソンらにより
定められた国際単位（Ａ、Ｊ、Ｊｏ−ｈｎｓｏｎら、Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｓ、Ｄｉａｔｈｅｓ、ｈａｅｍｏｒｒｈ（
Ｓｔｕｔｔｇ、）、２１．２５９（１９６９））によっ
た。
実施例 １
セファクリルＳ−２００スーパーフアイン（商品名、フ
ァルマシア・ファイン・ケミカルズ社製：２００ ｍ
ｌをカラム（２，ＩＣｒｒＬＸ ５８ｃＩｒＬ）に充填
し、０．８Ｍ食塩含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８
，０）で緩衝化する。
ァルマシア・ファイン・ケミカルズ社製：２００ ｍ
ｌをカラム（２，ＩＣｒｒＬＸ ５８ｃＩｒＬ）に充填
し、０．８Ｍ食塩含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８
，０）で緩衝化する。
次いで、新鮮人尿から調製した粗製ウロキナーゼを０．
８ Ｍ食塩含有０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ８，０
）に溶解して得た粗製ウロキナーゼ溶液５ｍ１（全活性
：３００，０００単位、比活性二５，５００単位／■蛋
白質、電気伝導率：６０ｍ ｍｈ ｏ／Ｃｌｌ１）をカ
ラムにかけ、０．８Ｍ食塩含有０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ８，０）を３０ ｍ ｌ ／ｈ ｒの流速で流し
てゲルろ過を行なう。
８ Ｍ食塩含有０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ８，０
）に溶解して得た粗製ウロキナーゼ溶液５ｍ１（全活性
：３００，０００単位、比活性二５，５００単位／■蛋
白質、電気伝導率：６０ｍ ｍｈ ｏ／Ｃｌｌ１）をカ
ラムにかけ、０．８Ｍ食塩含有０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ８，０）を３０ ｍ ｌ ／ｈ ｒの流速で流し
てゲルろ過を行なう。
溶出液を４ｍｌずつ採取し、ウロキナーゼ活性の高いフ
ラクション３１〜３４を集める。
ラクション３１〜３４を集める。
かくして得られるウロキナーゼ分画の比活性は３９，０
００単位／■蛋白質であり、粗製ウロキナーゼ溶液から
の活性収率は９１％であった。
００単位／■蛋白質であり、粗製ウロキナーゼ溶液から
の活性収率は９１％であった。
上記ウロキナーゼ分画を非発熱性の蒸留水１００倍量に
対し一夜透析し、これを３，０００単位／ｋｇ家兎体重
で投与して発熱性物質試験を行なった。
対し一夜透析し、これを３，０００単位／ｋｇ家兎体重
で投与して発熱性物質試験を行なった。
その結果、体温上昇度（０Ｃ）は０．２０゜０．２０
、０．３０で、日本薬局方策９版の規準により、発熱性
物質陰性であると認められた。
、０．３０で、日本薬局方策９版の規準により、発熱性
物質陰性であると認められた。
また、上記ゲルろ過により発熱性物質はワラクシタン２
１付近に溶出していることが認められた。
１付近に溶出していることが認められた。
向、粗製ウロキナーゼ溶液について発熱性物質試験を行
なったところ、１，５００単位／ｋｇ家兎体重で投与し
たときの体温上昇度（’Ｑは１．２５゜１．３０，１．
４５であった。
なったところ、１，５００単位／ｋｇ家兎体重で投与し
たときの体温上昇度（’Ｑは１．２５゜１．３０，１．
４５であった。
実施例 ２
（１）アンバーライトＪＲＣ−５０（商品名、ローム・
アンド・バース社製） ５０ ｍ ｌをカラム（１，５
Ｃ１ｒＬＸ ２８ｃ１１１）に充填し、０．１ Ｍ食塩
含有０、１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，２）で緩衝
化する。
アンド・バース社製） ５０ ｍ ｌをカラム（１，５
Ｃ１ｒＬＸ ２８ｃ１１１）に充填し、０．１ Ｍ食塩
含有０、１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，２）で緩衝
化する。
次いで、新鮮人尿から調製した粗製ウロキナーゼを０．
１Ｍ食塩含有０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，２
）に溶解して得た粗製ウロキナーゼ溶液１００ ｍ ｌ
（全活性： ４５．０．０００単位、比活性：１，５
００単位／７ｎ９蛋白質、電気伝導率：２０ ｍ ｍｈ
ｏ／（！ ）をカラムに流し、ウロキナーゼを吸着させ
る。
１Ｍ食塩含有０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，２
）に溶解して得た粗製ウロキナーゼ溶液１００ ｍ ｌ
（全活性： ４５．０．０００単位、比活性：１，５
００単位／７ｎ９蛋白質、電気伝導率：２０ ｍ ｍｈ
ｏ／（！ ）をカラムに流し、ウロキナーゼを吸着させ
る。
次いで、カラムを０．１ Ｍ食塩含有０．１ Ｍ ＩＪ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，２）で充分洗浄後、０．５Ｍ食塩
含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５，２）１５０ ｍ
ｌにて溶出し、ウロキナーゼ活性の高い分画を集める
。
ン酸緩衝液（ｐＨ６，２）で充分洗浄後、０．５Ｍ食塩
含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５，２）１５０ ｍ
ｌにて溶出し、ウロキナーゼ活性の高い分画を集める
。
かくして得られたウロキナーゼ溶出液の比活性は２３，
０００単位／■蛋白質であり、粗製ウロキナーゼ溶液か
らの活性収率は６８％であった。
０００単位／■蛋白質であり、粗製ウロキナーゼ溶液か
らの活性収率は６８％であった。
上記ウロキナーゼ溶出液を実施例１と同様に一夜透析し
、これを３．０００単位／ｋｇ家兎体重で投与して発熱
性物質試１験を行なったところ、体温上昇度（”Ｃ）は
ｉ、ｏ ５ 、１．１０ 、１．００で、発熱性物質陽
性であった。
、これを３．０００単位／ｋｇ家兎体重で投与して発熱
性物質試１験を行なったところ、体温上昇度（”Ｃ）は
ｉ、ｏ ５ 、１．１０ 、１．００で、発熱性物質陽
性であった。
そこで、上記ウロキナーゼ溶出液を下記の如く処理して
発熱性物質の除去を行なった。
発熱性物質の除去を行なった。
（２）セファクリルＳ−２００スーパーフアイン（商品
名、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）２００
ｍｌをカラム（２，１ｃｒｒＬ×５８Ｃ１ｒＬ）に充填
し、０．８Ｍ食塩含有０．０１Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ
８，０）で緩衝化する。
名、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）２００
ｍｌをカラム（２，１ｃｒｒＬ×５８Ｃ１ｒＬ）に充填
し、０．８Ｍ食塩含有０．０１Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ
８，０）で緩衝化する。
次いで上記（１）で得られたウロキナーゼ溶出液１５ｍ
１（全活性：３００．０００単位、比活性：２３，００
０単位／■蛋白質）をカラムにかけ、以下実施例Ｉと同
様にしてゲルろ過を行なう。
１（全活性：３００．０００単位、比活性：２３，００
０単位／■蛋白質）をカラムにかけ、以下実施例Ｉと同
様にしてゲルろ過を行なう。
溶出液を４ｍｌずつ採取し、ウロキナーゼ活性の高いフ
ラクション３１〜３５を集める。
ラクション３１〜３５を集める。
かくして得られるウロキナーゼ分画（２０ｍｌ）の比活
性は９１，０００単位／４蛋白質であり、前記（１）の
ウロキナーゼ溶出液からの活性収率は９６％であった。
性は９１，０００単位／４蛋白質であり、前記（１）の
ウロキナーゼ溶出液からの活性収率は９６％であった。
上記ウロキナーゼ分画を実施例１と同様に一夜透析後、
３，０００単位／ｋｇ家兎体重で投与し、発熱性物質試
験を行なった。
３，０００単位／ｋｇ家兎体重で投与し、発熱性物質試
験を行なった。
その結果、体温上昇度ＣＯは０．００ 、０．１５ 、
０．０５で、発熱性物質陰性であった。
０．０５で、発熱性物質陰性であった。
Claims (1)
- １ 人尿またはそれに由来する粗製ウロキナーゼをＮ、
Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドで架橋されたアリル
デキストランゲルによりゲルろ過することを特徴とする
ウロキナーゼの精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8231077A JPS5937072B2 (ja) | 1977-07-08 | 1977-07-08 | ウロキナ−ゼの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8231077A JPS5937072B2 (ja) | 1977-07-08 | 1977-07-08 | ウロキナ−ゼの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5417180A JPS5417180A (en) | 1979-02-08 |
| JPS5937072B2 true JPS5937072B2 (ja) | 1984-09-07 |
Family
ID=13770977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8231077A Expired JPS5937072B2 (ja) | 1977-07-08 | 1977-07-08 | ウロキナ−ゼの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5937072B2 (ja) |
-
1977
- 1977-07-08 JP JP8231077A patent/JPS5937072B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5417180A (en) | 1979-02-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Seegers et al. | Further studies on the purification of thrombin | |
| US4743680A (en) | Method for purifying antihemophilic factor | |
| US4172071A (en) | Chromophore blue adsorbent method for the purification of preparations having an interferon type activity | |
| EP0217379A2 (en) | Thrombolytic composition and a process for production thereof | |
| JP2651307B2 (ja) | 血液凝固ｉｘ因子を含有する複合体 | |
| US3943245A (en) | Purification of plasminogen | |
| US4314994A (en) | Process for obtaining a plasminogen activator | |
| US4380511A (en) | Purification of bovine thrombin | |
| JPS58201794A (ja) | ヒトインターフェロンβの濃縮精製法 | |
| JPH02504587A (ja) | ７ａ因子に富む画分の製造方法及び医薬としてのその用途 | |
| NL7905045A (nl) | Werkwijze voor de bereiding van zuivere urokinase. | |
| JPS5937072B2 (ja) | ウロキナ−ゼの精製法 | |
| JPH0734743B2 (ja) | プラスミノーゲン活性化剤 | |
| JPS5816874B2 (ja) | ウロキナ−ゼの精製法 | |
| JPS62191042A (ja) | 血液凝固第８因子吸着体およびそれを用いた血液凝固第８因子の精製法 | |
| JP2521551B2 (ja) | 抗血友病因子の製造方法 | |
| JPS61236726A (ja) | 組織プラスミノーゲン・アクチベータの精製方法 | |
| JPS6230755B2 (ja) | ||
| JPS5932116B2 (ja) | ウロキナ−ゼの精製法 | |
| JPS631290B2 (ja) | ||
| JPS60152421A (ja) | ヒト胎盤性プラスミノ−ゲン活性化因子、及びそれとヒトプラスミノ−ゲン活性化阻害因子との結合物、及びそれらの製法 | |
| KR790001376B1 (ko) | 우로키나제의 정제 및 회수법 | |
| JPS5921595B2 (ja) | ウロキナ−ゼの精製法 | |
| SU979508A1 (ru) | Способ получени иммобилизованного плазминогена | |
| JPS6140392B2 (ja) |