JPS5820268B2 - ウロキナ−ゼ精製法 - Google Patents
ウロキナ−ゼ精製法Info
- Publication number
- JPS5820268B2 JPS5820268B2 JP2046577A JP2046577A JPS5820268B2 JP S5820268 B2 JPS5820268 B2 JP S5820268B2 JP 2046577 A JP2046577 A JP 2046577A JP 2046577 A JP2046577 A JP 2046577A JP S5820268 B2 JPS5820268 B2 JP S5820268B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- urokinase
- adsorbed
- crude
- human urine
- gel
- Prior art date
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- Expired
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はウロキナーゼの精製法に関し、更に詳しくは人
尿またはそれに由来する粗製ウロキナーゼから高純度の
ウロキナーゼを工業的有利に取得する方法に関する。
尿またはそれに由来する粗製ウロキナーゼから高純度の
ウロキナーゼを工業的有利に取得する方法に関する。
ウロキナーゼは血清中に含まれるプラスミノーゲンを活
性化してフィブリン溶解能を有するプラスミンを生成す
る機能があるため、線溶系の賦活剤として有用であり、
末悄動脈血栓症や心筋硬そく症などの治療に広く臨床使
用されている。
性化してフィブリン溶解能を有するプラスミンを生成す
る機能があるため、線溶系の賦活剤として有用であり、
末悄動脈血栓症や心筋硬そく症などの治療に広く臨床使
用されている。
またウロキナーゼは近年抗ガン剤の増強剤としての用途
も開発され、その需要は急速に増大している。
も開発され、その需要は急速に増大している。
人尿からウロキナーゼを取得する方法としては従来より
種々の方法が知られており、例えば硫酸バリウム、ケイ
ソウ土、各種イオン交換樹脂などを用いる方法が知られ
ている。
種々の方法が知られており、例えば硫酸バリウム、ケイ
ソウ土、各種イオン交換樹脂などを用いる方法が知られ
ている。
本発明者らは人尿またはそれに由来する粗製ウロキナー
ゼから高純度のウロキナーゼを工業的有利に取得する方
法について種々研究を重ねた結果、Ｎ、Ｎ’−メチレン
ビスアクリルアミドで架橋されたアリルデキストランの
ゲルがウロキナーゼに対して特異的な吸着効果を有して
いることを見い出し本発明を完成するに至った。
ゼから高純度のウロキナーゼを工業的有利に取得する方
法について種々研究を重ねた結果、Ｎ、Ｎ’−メチレン
ビスアクリルアミドで架橋されたアリルデキストランの
ゲルがウロキナーゼに対して特異的な吸着効果を有して
いることを見い出し本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明はＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルア
ミドで架橋されたアリルデキストランのゲルを人尿また
はそれに由来する粗製ウロキナーゼとを接触させて上記
ゲルに人尿または粗製ウロキナーゼ中のウロキナーゼを
吸着させた後、吸着したウロキナーゼを溶出することを
特徴とするウロキナーゼの精製法である。
ミドで架橋されたアリルデキストランのゲルを人尿また
はそれに由来する粗製ウロキナーゼとを接触させて上記
ゲルに人尿または粗製ウロキナーゼ中のウロキナーゼを
吸着させた後、吸着したウロキナーゼを溶出することを
特徴とするウロキナーゼの精製法である。
本発明に用いられるＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルア
ミドで架橋されたアリルデキストランのゲルとしては、
例えばセファクリルＳ−２００スーパーフアイン（商品
名：ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）が好適
に挙げられる。
ミドで架橋されたアリルデキストランのゲルとしては、
例えばセファクリルＳ−２００スーパーフアイン（商品
名：ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）が好適
に挙げられる。
このセファクリルＳ−２００スーパーフアインは本来そ
れの有する網目構造に由来する分子篩効果を利用して分
子量の異なった物質を分子量の大きさに従って分離する
のに用いられているものであるが、本発明はセファクリ
ルＳ−２００スーパーフアインのかかる分子篩効果を利
用するものではなく、本発明者らが始めて見い出した全
く新しい効果、すなわちウロキナーゼに対する特異的な
吸着効果及び溶離効果を利用するものである。
れの有する網目構造に由来する分子篩効果を利用して分
子量の異なった物質を分子量の大きさに従って分離する
のに用いられているものであるが、本発明はセファクリ
ルＳ−２００スーパーフアインのかかる分子篩効果を利
用するものではなく、本発明者らが始めて見い出した全
く新しい効果、すなわちウロキナーゼに対する特異的な
吸着効果及び溶離効果を利用するものである。
以下、本発明方法を具体的に説明する。
まず、人尿またはこれに由来する粗製ウロキナーゼの溶
液を、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドで架橋さ
れたアリルデキストランのゲルを充填したカラムに流下
させて、ウロキナーゼをゲルに吸着させる。
液を、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドで架橋さ
れたアリルデキストランのゲルを充填したカラムに流下
させて、ウロキナーゼをゲルに吸着させる。
この吸着操作はｐ’Ｈ５〜７で行なうのが好ましく、ま
たカラムに流下する人尿または粗製ウロキナーゼ溶液の
電気伝導率は６ｍｍ ｈ ６／Ｃｒｆｔ以下に調整して
おくのが好ましい。
たカラムに流下する人尿または粗製ウロキナーゼ溶液の
電気伝導率は６ｍｍ ｈ ６／Ｃｒｆｔ以下に調整して
おくのが好ましい。
この条件でウロキナーゼはゲルに吸着され、大部分の不
純物は吸着されずにそのま＼流下する。
純物は吸着されずにそのま＼流下する。
次いでカラムをｐＨ５〜８の稀薄塩類溶液（例えば電気
伝導率６ｍｍｈｏＡ−ｒＩＬ以下の燐酸緩衝液）で洗浄
する。
伝導率６ｍｍｈｏＡ−ｒＩＬ以下の燐酸緩衝液）で洗浄
する。
洗浄液の量はカラム容量の２〜３倍量が好ましい。
この洗浄操作により不純物質は更に完全に除かれるが、
ウロキナーゼは吸着されたまま残る。
ウロキナーゼは吸着されたまま残る。
吸着しているウロキナーゼを溶出するには、カラムにｐ
Ｈ７〜１１の濃厚塩類溶液（例えば電気伝導率３０ ｍ
ｍｈｏ以上の燐酸緩衝液、食塩溶液またはアンモニア
水）を流下することによって容易に行なうことができる
。
Ｈ７〜１１の濃厚塩類溶液（例えば電気伝導率３０ ｍ
ｍｈｏ以上の燐酸緩衝液、食塩溶液またはアンモニア
水）を流下することによって容易に行なうことができる
。
かくして得られたウロキナーゼ溶出液は常法により硫安
塩析し、透析後、凍結乾燥することによりウロキナーゼ
を単離することができる。
塩析し、透析後、凍結乾燥することによりウロキナーゼ
を単離することができる。
尚、本発明の吸着操作及び溶出操作は上記の如きカラム
法以外に、バッチ法によっても行なうことができる。
法以外に、バッチ法によっても行なうことができる。
上記の如き本発明方法によれば、少量の吸着体の使用で
非常に高純度のウロキナーゼが得られること、吸着体を
繰り返し使用しうろこと、粗製ウロキナーゼ溶液のみな
らず人尿それ自体をも直接負荷できることなどの利点が
得られる。
非常に高純度のウロキナーゼが得られること、吸着体を
繰り返し使用しうろこと、粗製ウロキナーゼ溶液のみな
らず人尿それ自体をも直接負荷できることなどの利点が
得られる。
以下、実施例を挙げて本発明方法を説明するが、本発明
方法はこれら実施例に限定されるものではない。
方法はこれら実施例に限定されるものではない。
尚、実施例中ウロキナーゼの力価測定はプルーグらのフ
ィブリン平板法（Ｊ 、Ｐｌｏｕｇ等；Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｂｉｅｐｈｙｓ 、Ａｃｔａ 、 ２４ 、２７８（
１９５７年）〕によって行ない、力価表示はジョンソン
らの方法（Ａ 、 Ｊ 、 Ｊ ｏｈｎｓｏｎ等： Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｓ Ｄｉａｔｈｅｓ。
ィブリン平板法（Ｊ 、Ｐｌｏｕｇ等；Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｂｉｅｐｈｙｓ 、Ａｃｔａ 、 ２４ 、２７８（
１９５７年）〕によって行ない、力価表示はジョンソン
らの方法（Ａ 、 Ｊ 、 Ｊ ｏｈｎｓｏｎ等： Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｓ Ｄｉａｔｈｅｓ。
ｈａｅｍｏｒｒｈ（Ｓｔｕｔｔｇ、 ） 、 ２１ 、
２５９ （１９６９年）〕に従った。
２５９ （１９６９年）〕に従った。
実施例 １
セファクリルＳ−２００スパーフアイン（商品名：ファ
ルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）２７０７ｒＬｌ
をカラム（２，７４ＣｒＩＬＸ ４６ｃｒｒＬ）に充填
する。
ルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）２７０７ｒＬｌ
をカラム（２，７４ＣｒＩＬＸ ４６ｃｒｒＬ）に充填
する。
このカラムを０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐ）１６．０）で
緩衝化させた後、新鮮な人尿から抽出した粗製ウロキナ
ーゼ溶液（５０００年位／η蛋白質、８５００年位／ｍ
ｌ、 ｐＨ６，０、電気電導率２．５ｍｍｈｏ ／ｃｒ
ｎ ） ３１０ ｒｎｌを流下させる。
緩衝化させた後、新鮮な人尿から抽出した粗製ウロキナ
ーゼ溶液（５０００年位／η蛋白質、８５００年位／ｍ
ｌ、 ｐＨ６，０、電気電導率２．５ｍｍｈｏ ／ｃｒ
ｎ ） ３１０ ｒｎｌを流下させる。
この操作によりウロキナーゼはカラムに吸着され、大部
分の不純物は吸着されずに流出する。
分の不純物は吸着されずに流出する。
次いでカラムを０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６，０）
５５０ＴＬｌにて洗浄し、不純物を完全に除去する。
５５０ＴＬｌにて洗浄し、不純物を完全に除去する。
次いでカラムを０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨｓ、ｏ ）
５５０ｍｌにて洗浄した後、０．０１Ｍ燐酸緩衝液（
ｐＨ８，０）に溶かした１Ｍ食塩溶液３００ＴＬｌを流
下してウロキナーゼを溶出させる。
５５０ｍｌにて洗浄した後、０．０１Ｍ燐酸緩衝液（
ｐＨ８，０）に溶かした１Ｍ食塩溶液３００ＴＬｌを流
下してウロキナーゼを溶出させる。
このようにして得られたウロキナーゼ溶液の比活性は３
８０００年位／Ｔｎ９蛋白質であり、力価の回収率は原
料の粗製ウロキナーゼ溶液を１００％として６５％であ
った。
８０００年位／Ｔｎ９蛋白質であり、力価の回収率は原
料の粗製ウロキナーゼ溶液を１００％として６５％であ
った。
実施例 ２
セファクリルＳ−２００スーパーフアイン（商品名：フ
ァルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）１００７７１
１を０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６，０）にて洗浄する
。
ァルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）１００７７１
１を０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６，０）にて洗浄する
。
一方、成人男子より採集した新鮮法５１に冷水２１を加
えて希釈し、電気伝導率６ｍ ｍｈｏ／ｃｍ以下とする
。
えて希釈し、電気伝導率６ｍ ｍｈｏ／ｃｍ以下とする
。
これに前記セファクリルＳ−２００の全量を投与し、４
℃で１０分間かく拌すると尿中ウロキナーゼ゛はセファ
クリルＳ−２００スーパーフアインに全て吸着される。
℃で１０分間かく拌すると尿中ウロキナーゼ゛はセファ
クリルＳ−２００スーパーフアインに全て吸着される。
セファクリルＳ−２００スーパーフアインを口過により
集め、０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６，０） ２００ｍ
ｌ、次いで０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐ）ｌｓ、ｏ ）
２００ｍｌにて洗浄した後、０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）に溶かした１Ｍ食塩溶液２００ＴＬｌにけん
濁し、１０分間かく拌してウロキナーゼを溶出させる。
集め、０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６，０） ２００ｍ
ｌ、次いで０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐ）ｌｓ、ｏ ）
２００ｍｌにて洗浄した後、０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）に溶かした１Ｍ食塩溶液２００ＴＬｌにけん
濁し、１０分間かく拌してウロキナーゼを溶出させる。
次いで口過によりセファクリルＳ−２００スーパーフア
インを除去することによりウロキナーゼは０液中に全て
回収される。
インを除去することによりウロキナーゼは０液中に全て
回収される。
このようにして得られた０液の比活性は１５００．０年
位／ｍ９蛋白質であった。
位／ｍ９蛋白質であった。
Claims (1)
- ＩＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドで架橋された
アリルデキストランのゲルを人尿またはそれに由来する
粗製ウロキナーゼと接触させて上記ゲルに人尿または粗
製ウロキナーゼ中のウロキナーゼを吸着させた後、吸着
したウロキナーゼを溶出することを特徴とするウロキナ
ーゼの精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2046577A JPS5820268B2 (ja) | 1977-02-25 | 1977-02-25 | ウロキナ−ゼ精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2046577A JPS5820268B2 (ja) | 1977-02-25 | 1977-02-25 | ウロキナ−ゼ精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS53107478A JPS53107478A (en) | 1978-09-19 |
| JPS5820268B2 true JPS5820268B2 (ja) | 1983-04-22 |
Family
ID=12027830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2046577A Expired JPS5820268B2 (ja) | 1977-02-25 | 1977-02-25 | ウロキナ−ゼ精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5820268B2 (ja) |
-
1977
- 1977-02-25 JP JP2046577A patent/JPS5820268B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS53107478A (en) | 1978-09-19 |
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