JP2010503396A

JP2010503396A - アルブミン融合タンパク質

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Publication number: JP2010503396A
Application number: JP2009528277A
Authority: JP
Inventors: マニ・サブラマニアン; デイビッド・カーター・スタンプ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 2006-09-14
Filing date: 2007-09-13
Publication date: 2010-02-04
Also published as: AU2007294805A1; WO2008033413A2; MX2009002816A; US20100254944A1; AU2007294805A2; BRPI0716744A2; CA2663352A1; WO2008033413A3; EP2068905A2; IL197580A0; KR20090064453A; EP2068905A4

Abstract

本発明は、アルブミン融合タンパク質を包含する。また、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子も本発明によって包含され、これらの核酸を含有するベクター、これらの核酸ベクターにより形質転換される宿主細胞、ならびにこれらの核酸、ベクター、および／または宿主細胞を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する方法も同様に本発明に包含される。さらに、本発明は、アルブミン融合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに本発明のアルブミン融合タンパク質を使用して、疾患、障害、または病状を治療、予防、または改善する方法を包含する。

Description

コンパクトディスクの配列表の参照
本出願は、以下に記載する「配列表」を参照し、この配列表は、「コピー１」、「コピー２」、および「ＣＲＦ」と表示される３つの同一のコンパクトディスク（ＣＤ−Ｒ）上に電子文書として提供される。これらのコンパクトディスクの各々は、ファイル「ＰＦ６１９ＰＰ５ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」（１９８，０００バイト、２００７年９月７日作成）を含み、このファイルは、参照することによってその全体が組み込まれる。

本発明は、概して、アルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくは変異体に融合される治療用タンパク質（少なくとも１つのポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらのフラグメントおよび変異体を含むがこれらに限定されない）に関する。本発明は、治療用アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、治療用アルブミン融合タンパク質、組成物、医薬組成物、処方物およびキットを包含する。また、治療用アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞も本発明に包含され、これらのポリヌクレオチドおよび／または宿主細胞を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する方法も同様に本発明に包含される。

その成熟形態において５８５アミノ酸のタンパク質（図１（配列ＩＤ１）に示す）であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）は、血清の浸透圧の相当な割合に関与し、また、内因性リガンドおよび外因性リガンドのキャリアとしても機能する。現在では、臨床的使用のためのＨＡは、ヒト血液からの抽出によって生成される。微生物における組み換えＨＡ（ｒＨＡ）の生成は、欧州特許第３３０４５１号および欧州特許第３６１９９１号に開示されている。

その天然状態または組み換え生成される場合の治療用タンパク質、例えば、インターフェロンおよび成長ホルモンは、典型的には、特に水溶液中に処方される場合に短い貯蔵寿命を呈する不安定分子である。投与のために処方される場合のこれらの分子の不安定性により、貯蔵の間、常に分子の多くを凍結乾燥または冷蔵しなければならなくなるため、分子の輸送および／または貯蔵が困難になる。貯蔵の問題は、病院環境外で医薬処方物を貯蔵および投薬しなければならない場合に特に深刻である。

不安定なタンパク質分子の貯蔵問題に対する実用的な解決策は、ほとんど提案されていない。したがって、投薬が容易で、好ましくは、必要な貯蔵後操作が最低限である単純な処方によって、安定化した、長期間持続するタンパク質治療用分子の処方物が必要である。

体内投与時に、その天然状態または組み換え生成される場合の治療用タンパク質、例えば、インターフェロンおよび成長ホルモンは、血流からの迅速なクリアランスにより、短いプラズマ安定性を呈する。したがって、このようなタンパク質によりもたらされる治療効果も短寿命である。したがって、所望の治療効果を体内で持続するためには、血流からの迅速なクリアランスにより、治療用分子を高頻度または高用量で投与しなければならない。しかしながら、治療用タンパク質の投与のために投薬スケジュールを増加することによって、患者の注射部位反応、副作用、および毒性が増加する。同様に、治療用タンパク質を高用量で投与することによって、通常、患者の毒性および副作用が増加する。

欧州特許第３３０４５１号欧州特許第３６１９９１号

提案されている治療用分子のプラズマ安定性増加に対する、化学結合を含む数少ない実用的な解決策は、患者への利益を限定する。概して、多くの場合、このような化学修飾治療用分子は、依然として高頻度の投薬スケジュールで投与され、患者に重大な注射部位反応、副作用、および毒性を残す。したがって、単に天然状態または組み換え生成されるよりも高いプラズマ安定性を体内で維持し、かつ低頻度で投与可能であることによって患者への潜在的な副作用を減少させる安定形態の治療用分子が必要とされる。

本発明は、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント（一部）もしくは変異体に融合される治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変異体）を含む、アルブミン融合タンパク質を包含する。また、本発明は、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント（一部）もしくは変異体に融合される治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変異体）をコードする核酸分子を含むか、あるいはこれらから成るポリヌクレオチドも包含する。また、本発明は、治療用タンパク質の貯蔵寿命を長期化し、非融合状態と比較して血漿安定性を向上させ、および／または体外もしくは体内での治療用タンパク質および／または溶液中（もしくは医薬組成物中）のその活性を安定化するのに十分な、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント（一部）もしくは変異体に融合される治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変異体）をコードする核酸分子を含むか、あるいはこれらから成るポリヌクレオチドも包含する。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアルブミン融合タンパク質も、本発明によって包含され、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞、ならびにこれら本発明のポリヌクレオチドおよび／または宿主細胞を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する方法も本発明によって包含される。

本発明の一態様において、アルブミン融合タンパク質は、表２に記載されるものと、このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。

また、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質および薬学的に許容可能な希釈剤もしくはキャリアを含む医薬処方物も包含する。このような処方物は、キットまたは容器中に存在し得る。このようなキットまたは容器は、治療用タンパク質の長期化した貯蔵寿命に関する説明書とともに包装され得る。このような処方物は、患者、例えば、哺乳動物またはヒトにおける疾患または疾患徴候を治療、予防、改善、または診断する方法において使用されてもよく、この方法は、医薬処方物を患者に投与するステップを含む。

他の実施形態において、本発明は、疾患または障害を予防、治療、または改善する方法を包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、表１の「適応症：Ｙ」列に列挙される疾患または障害を治療する方法を包含し、この方法は、このような治療、予防、または改善が所望される患者に、疾患または障害を治療、予防、または改善するのに有効な量において、表１の「治療用タンパク質：Ｘ」列に（治療される疾患または障害が、表１の「適応症：Ｙ」列に記載されるのと同じ行に）開示される治療用タンパク質に対応する治療用タンパク質または治療用タンパク質部分（またはそのフラグメントもしくは変異体）を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与するステップを包含する。

一実施形態において、表１または２に記載のアルブミン融合タンパク質は、長期化した貯蔵寿命を有する。

第２の実施形態において、表１または２に記載のアルブミン融合タンパク質は、表１に記載の、対応する非融合治療用分子よりも安定している。

さらに、本発明は、本発明の核酸分子（表１および２に記載のポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない）を含有するように修飾される、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するように修飾されるトランスジェニック生物を含む。

ヒトアルブミンの成熟形態のアミノ酸配列（配列番号１）およびこれをコードするポリヌクレオチド（配列番号２）を示す図である。配列番号２のヌクレオチド１から１７５５は、ヒトアルブミン（配列番号１）の成熟形態をコードする。ヒトアルブミンの成熟形態のアミノ酸配列（配列番号１）およびこれをコードするポリヌクレオチド（配列番号２）を示す図である。配列番号２のヌクレオチド１から１７５５は、ヒトアルブミン（配列番号１）の成熟形態をコードする。ヒトアルブミンの成熟形態のアミノ酸配列（配列番号１）およびこれをコードするポリヌクレオチド（配列番号２）を示す図である。配列番号２のヌクレオチド１から１７５５は、ヒトアルブミン（配列番号１）の成熟形態をコードする。ヒトアルブミンの成熟形態のアミノ酸配列（配列番号１）およびこれをコードするポリヌクレオチド（配列番号２）を示す図である。配列番号２のヌクレオチド１から１７５５は、ヒトアルブミン（配列番号１）の成熟形態をコードする。ｐＰＰＣ０００５クローニングベクター（ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ−３２７８）の制限マップを示す図である。ｐＳＡＣ３５酵母サッカロマイセスセレビシエ発現ベクター（Ｓｌｅｅｐｅｔａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：４２（１９９０））の制限マップを示す図である。Ｈｓ２９４Ｔ黒色腫細胞上のＣＩＤ３１６５（ＣＩＤ３１６５タンパク質）および組み換えＩＦＮａ（ｒＩＦＮａ）によってコードされたＩＦＮアルブミン融合タンパク質の抗増殖活性を比較する図である。細胞は、様々な濃度のＣＩＤ３１６５タンパク質またはｒＩＦＮａのいずれかでインキュベートされ、増殖は、３日間のインキュベートの後、ＢｒｄＵ取り込みによって測定された。ＣＩＤ３１６５タンパク質は、１０ｎｇ／ｍｌを上回る濃度において、細胞増殖の測定可能な阻害をもたらし、約２００ｎｇ／ｍｌで５０％の阻害を達成した。（■）＝ＣＩＤ３１６５タンパク質、（◆）＝ｒＩＦＮａ。ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞におけるＳＥＡＰ活性上のＩＦＮａアルブミン融合タンパク質の種々の希釈の効果を示す図である。アルブミンの上流に融合された１つの調製のＩＦＮａ（◆）が試験され、また、アルブミンの下流に融合された２つの異なる調製のＩＦＮａ（●）および（■）も試験された。治療されたサルにおける、構築物２２４９（ＣＩＤ２２４９タンパク質）において構成されるＤＮＡによってコードされるＩＦＮａアルブミン融合タンパク質の時間および投与量の、ＯＡＳ（頁４１）のｍＲＮＡレベルに対する効果を示す図である（実施例７６を参照）。時点毎：第１の棒＝ビヒクル対照、第２の棒＝３０ｕｇ／ｋｇのＣＩＤ２２４９タンパク質、第１日、静脈内、第３の棒＝３０ｕｇ／ｋｇのＣＩＤ２２４９タンパク質、第１日、皮下、第４の棒＝３００ｕｇ／ｋｇＣＩＤ２２４９タンパク質第１日、皮下、５番目の棒＝４０ｕｇ／ｋｇ組み換えＩＦＮａ第１日、第３日、第５日、皮下。慢性Ｃ型肝炎遺伝子１型に感染しており、かつリバビリン（ＰＥＧ−ＲＢＶ）と併用したペグインターフェロンαの少なくとも１つの治療レジメンに過去に反応しなかった患者（非反応者）における、０から２４週間のリバビリンと併用したＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの治療の後の、媒体ＨＣＶＲＮＡ変化（ｌｏｇ_１０ＩＵ／ｍ）によって測定される、ＨＣＶＲＮＡタイターの減少を示す図である。慢性Ｃ型肝炎遺伝子１型に感染しており、リバビリンと併用したインターフェロンの少なくとも１つの治療レジメンに過去に反応しなかった患者（非反応者）のうち、４８週間、リバビリンと併用した９００μｇ、１２００μｇ、１５００μｇ、または１８００μｇのＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂで２週間毎または４週間毎に治療した後（例えば、治療終了時つまりＥＴＲ）に、リアルタイム定量的ＰＣＲによって測定される、ＨＣＶＲＮＡ陰性を達成した者の割合を示す図である。リバビリン（ＰＥＧ＋ＲＢＶ）と併用したペグインターフェロンαの少なくとも１つの治療レジメンに過去に反応しなかった非反応者である患者のサブグループのうち、４８週間、リバビリンと併用して９００μｇ、１２００μｇ、１５００μｇ、または１８００μｇのＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂで２週間毎または４週間毎に治療した後に、ＥＴＲを有する者の割合を示す図である。４８週間のリバビリンと併用して９００μｇ、１２００μｇ、１５００μｇ、または１８００μｇのＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂで２週間毎または４週間毎に治療し、その後の２４週間のフォローアップ期間の後に、非反応者によって達成された全体的なウイルス持続陰性化（ＳＶＲ）割合を示す図である。４８週間のリバビリンと併用して９００μｇ、１２００μｇ、１５００μｇ、または１８００μｇのＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂで２週間毎または４週間毎に治療し、その後の２４週間のフォローアップ期間の後に、ＰＥＧ＋ＲＢＶ非反応者によって達成されたＳＶＲ割合を示す図である。

定義
以下の定義は、本明細書において使用する特定の用語を理解し易くするために提供される。

本明細書中で使用する際、「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１つの治療用タンパク質Ｘ（またはそのフラグメントもしくは変異体）にインフレームで結合される少なくとも１つの分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）を含むか、あるいはこれらから成る融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子、配列番号Ｙのアミノ酸配列（表２第６列に記載される）またはそのフラグメントもしくは変異体を含むか、あるいはこれらから成る融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子、配列番号Ｘに示される配列を含むか、あるいはこれから成るヌクレオチド配列を有する核酸分子、配列番号Ｚのアミノ酸配列を含むか、あるいはこれから成る融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子、表２または実施例に記載されるように生成される本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子、本発明の治療用アルブミン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子、表２に記載されるアルブミン融合構築物中に含まれるヌクレオチド配列を有する核酸分子、あるいはＡＴＣＣに寄託されるアルブミン融合構築物（表３に記載される）中に含まれるヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。

本明細書中で使用する際、「アルブミン融合構築物」は、少なくとも１つの分子の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで結合される少なくとも１つの分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから成る核酸分子、表２または実施例に記載されるように生成される少なくとも１つの分子の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで結合される少なくとも１つの分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから成る核酸分子、あるいは、例えば、次の要素（１）機能的な自己複製ベクター（シャトルベクター、発現ベクター、組み込みベクター、および／または複製系を含むがこれらに限定されない）、（２）転写の開始のための領域（例えば、調節可能プロモーターまたは誘導性プロモーター、構成プロモーターのようなプロモーター領域）、（３）転写の終結のための領域、（４）リーダー配列、および（５）選択マーカー、のうちの１以上をさらに含む、少なくとも１つの分子の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで結合される少なくとも１つの分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから成る核酸分子、を指す。治療用タンパク質およびアルブミンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの各々は、一旦アルブミン融合構築物の一部になると、アルブミン融合構築物の「一部」、「領域」、または「部分」と呼ばれる場合がある。

本発明は、概して、アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、アルブミン融合タンパク質と、アルブミン融合タンパク質、またはアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、疾患または障害を治療、予防、または改善する方法とに関する。本明細書中で使用する際、「アルブミン融合タンパク質」は、少なくとも１つの分子の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）への少なくとも１つの分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の融合によって形成されるタンパク質を指す。本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは変異体およびヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは変異体を含み、これらは、遺伝融合によって相互に関連付けられる（つまり、アルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の全部または一部をコードするポリヌクレオチドが、アルブミンの全部または一部をコードするポリヌクレオチドにインフレームで結合される核酸の翻訳によって生成される）。治療用タンパク質およびアルブミンタンパク質の各々は、一旦アルブミン融合タンパク質の一部になると、アルブミン融合タンパク質の「一部」、「領域」、または「部分」（例えば、「治療用タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」）と呼ばれる場合がある。一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、少なくとも１つの分子の治療用タンパク質Ｘまたはそのフラグメントもしくは変異体（治療用タンパク質Ｘの成熟形態を含むが、これに限定されない）および少なくとも１つの分子のアルブミンまたはそのフラグメントもしくは変異体（アルブミンの成熟形態を含むが、これに限定されない）を含む。

さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、宿主細胞によってプロセシングされ、周囲の培養培地に分泌される。発現に使用される宿主の分泌経路において発生する新生アルブミン融合タンパク質のプロセシングには、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合形成、適切な折り畳み、炭水化物の付加およびプロセシング（例えば、Ｎ結合型グリコシル化およびＯ結合型グリコシル化）、特異的タンパク質切断、および多量体タンパク質へのアセンブリが含まれるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、プロセシングされた形態である。さらなる実施形態において、「アルブミン融合タンパク質のプロセシングされた形態」は、Ｎ末端シグナルペプチド切断を受けたアルブミン融合タンパク質産物を指し、本明細書において「成熟アルブミン融合タンパク質」とも呼ばれる。

いくつかの事例において、本発明のアルブミン融合構築物を含有する代表的クローンを、アメリカンタイプカルチャーコレクション（本明細書において「ＡＴＣＣ（登録商標）」と呼ぶ）に寄託した。さらに、当該分野で既知の技術および本明細書中に記載の技術によって、寄託物から所定のアルブミン融合構築物を回収することが可能である。ＡＴＣＣ（登録商標）は、１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０−２２０９、ＵＳＡに位置する。ＡＴＣＣ（登録商標）寄託は、特許手続目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に準拠して行われた。

一実施形態において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質を含むか、あるいはこれらから成るアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質を含むか、あるいはこれらから成るアルブミン融合タンパク質を提供する。別の実施形態において、本発明は、表２に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質を含むか、あるいはこれらから成るアルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、表２において配列番号Ｙとしてその配列が示されるアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。他の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメント、ならびに血清アルブミンタンパク質を含むか、あるいはこれらから成るアルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な変異体ならびに血清アルブミンタンパク質を含むか、あるいはこれらから成るアルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、アルブミン融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は、血清アルブミンの成熟部分である。さらに、本発明は、これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも包含する。

さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントを含むか、あるいはこれらから成るアルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な変異体を含むか、あるいはこれらから成るアルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の成熟部分である。さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の細胞外可溶性ドメインである。代替実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の活性形態である。さらに、本発明は、これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。

さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントもしくは変異体、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントもしくは変異体を含むか、あるいはこれらから成るアルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の成熟部分および血清アルブミンの成熟部分を含むか、あるいはこれらから成るアルブミン融合タンパク質を提供する。さらに、本発明は、これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに包含する。

治療用タンパク質

上記のように、本発明のポリヌクレオチドは、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは変異体、およびヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは変異体を含むか、あるいはこれらから成るタンパク質をコードし、これらは、相互に、例えば遺伝融合によって関連付けられる。

追加の実施形態は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは変異体およびヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは変異体を含むか、あるいはこれらから成るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、これらは、互いに化学的結合によって連結されている。

本明細書中で使用する際、「治療用タンパク質」は、１つ以上の治療的および／または生物学的活性を有するタンパク質、ポリペプチド、抗体、ペプチドまたはそれらフラグメントもしくは変異体を指す。本発明によって包含される治療用タンパク質には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、および生物製剤が含まれるがこれらに限定されない（ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドという用語は、本明細書中で交換可能に使用される）。「治療用タンパク質」という用語は、特に、抗体ならびにそのフラグメントもしくは変異体を包含することを意図している。したがって、本発明のタンパク質は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは変異体、および／または抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含有し得る。さらに、「治療用タンパク質」という用語は、治療用タンパク質の内因性相関物または天然に存在する相関物を指し得る。

「治療的活性」を示すポリペプチドまたは「治療的に活性」であるタンパク質は、本明細書中に記載の治療用タンパク質または当該分野で既知の治療用タンパク質のうちの１つ以上等の、治療用タンパク質に関連付けられる１つ以上の既知の生物学的活性および／または治療的活性を保有するポリペプチドを意味する。非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、疾患、病状または障害を治療、予防、または改善するために有用なタンパク質である。非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、特定の細胞型（正常（例えば、リンパ球）または異常（例えば、癌細胞））に特異的に結合するタンパク質であってもよく、したがって、化合物（薬物または細胞傷害性薬剤）に対してその細胞型を特異的に標的とするために使用され得る。

ある実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質によって含まれ得る「治療用タンパク質」部分は、インターフェロンである。別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質の「治療用タンパク質」部分は、インターフェロンαである。追加の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質によって含まれ得る「治療用タンパク質」部分は、インターフェロンβ、インターフェロンγ、またはωインターフェロンを含むがこれらに限定されない。

追加の実施形態において、インターフェロンハイブリッドは、アルブミンのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合されて、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質を形成し得る。インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、抗ウイルス応答、細胞増殖の調節、および免疫応答の調節等のインターフェロン活性を増強し得るか、あるいはインターフェロン活性を抑制し得る（Ｌｅｂｌｅｕｅｔａｌ．、ＰＮＡＳＵＳＡ、７３：３１０７−３１１１（１９７６）、Ｇｒｅｓｓｅｒｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５１：５４３−５４５（１９７４）、およびＪｏｈｎｓｏｎ、ＴｅｘａｓＲｅｐｏｒｔｓＢｉｏｌＭｅｄ、３５：３５７−３６９（１９７７））。各インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、ウイルス感染（例えば、肝炎（例えば、ＨＣＶ）またはＨＩＶ）、多発性硬化症、または癌を処置、予防または改善するために使用可能である。

一実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンαインターフェロンαハイブリッド（本明細書中において、α−αハイブリッドと呼ばれる）を含む。例えば、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のα−αハイブリッド部分は、インターフェロンαＤに融合されるインターフェロンαＡから成るか、あるいはこれを含む。さらなる実施形態において、Ａ／Ｄハイブリッドは、インターフェロンαＤに共通のＢｇＩＩＩ制限部位において融合され、ここで、Ａ／ＤハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンαＡのアミノ酸１〜６２に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンαＤのアミノ酸６４〜１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｄハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含み得る。
ＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＸ_１ＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＴＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＤＬＬＤＫＦＣＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＭＱＥＥＲＶＧＥＴＰＬＭＮＸ_２ＤＳＩＬＡＶＫＫＹＦＲＲＩＴＬＹＬＴＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＬＳＬＳＴＮＬＱＥＲＬＲＲＫＥ（配列番号９９）、ここで、Ｘ_１はＲまたはＫであり、Ｘ_２はＡまたはＶである。追加の実施形態において、Ａ／Ｄハイブリッドは、共通のＰｖｕＩＩＩ制限部位において融合され、ここで、Ａ／ＤハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンαＡのアミノ酸１〜９１に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンαＤのアミノ酸９３〜１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｄハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含み得る。
ＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＸ_１ＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＭＱＥＥＲＶＧＥＴＰＬＭＮＸ_２ＤＳＩＬＡＶＫＫＹＦＲＲＩＴＬＹＬＴＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＬＳＬＳＴＮＬＱＥＲＬＲＲＫＥ（配列番号１００）、ここで、Ｘ_１はＲまたはＫであり、第２のＸ_２はＡまたはＶである。これらのハイブリッドは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，４１４，５１０号にさらに記載される。

追加の実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のα−αハイブリッド部分は、インターフェロンαＦに融合されるインターフェロンαＡから成るか、あるいはこれを含む。さらなる実施形態において、Ａ／Ｆハイブリッドは、共通のＰｖｕＩＩＩ制限部位において融合され、ここで、Ａ／ＦハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンαＡのアミノ酸１〜９１に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンαＦのアミノ酸９３〜１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｆハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含み得る。
ＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＸＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＭＥＡＣＶＩＱＥＶＧＶＥＥＴＰＬＭＮＶＤＳＩＬＡＶＫＫＹＦＱＲＩＴＬＹＬＴＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＦＳＬＳＫＩＦＱＥＲＬＲＲＫＥ（配列番号１０１）、ここで、ＸはＲまたはＫである。これらのハイブリッドは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，４１４，５１０号にさらに記載される。さらなる実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のα−αハイブリッド部分は、インターフェロンαＢに融合されるインターフェロンαＡから成るか、あるいはこれを含む。追加の実施形態において、Ａ／Ｂハイブリッドは、共通のＰｖｕＩＩＩ制限部位において融合され、ここで、Ａ／ＢハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンαＡのアミノ酸１〜９１に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンαＢのアミノ酸９３〜１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｂハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含み得る。
ＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＸ_１ＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５ＱＥＶＧＶＩＥＳＰＬＭＹＥＤＳＩＬＡＶＲＫＹＦＱＲＩＴＬＹＬＴＥＫＫＹＳＳＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＦＳＬＳＩＮＬＱＫＲＬＫＳＫＥ（配列番号１０２）、ここで、Ｘ_１はＲまたはＫであり、Ｘ_２からＸ_５は、ＳＣＶＭまたはＶＬＣＤである。これらのハイブリッドは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，４１４，５１０号においてさらに記載される。

別の実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンβインターフェロンαハイブリッド（本明細書において、β−αハイブリッドと呼ばれる）を含む。例えば、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のβ−αハイブリッド部分は、インターフェロンαＤ（インターフェロンα１とも呼ばれる）に融合される、インターフェロンβ１から成るか、あるいはこれを含む。さらなる実施形態において、β−１／αＤハイブリッドは融合され、ここで、Ｎ末端部分は、インターフェロンβ１のアミノ酸１〜７３に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンαＤのアミノ酸７４〜１６７に対応する。例えば、このβ−１／αＤハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含み得る。
ＭＳＹＮＬＬＧＦＬＱＲＳＳＮＦＱＣＱＫＬＬＷＱＬＮＧＲＬＥＹＣＬＫＤＲＭＮＦＤＩＰＥＥＩＫＱＬＱＱＦＱＫＥＤＡＡＬＴＩＹＥＭＬＱＮＩＦＡＩＦＲＱＤＳＳＡＡＷＤＥＤＬＬＤＫＦＣＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＭＱＥＥＲＶＧＥＴＰＬＭＮＸＤＳＩＬＡＶＫＫＹＦＲＲＩＴＬＹＬＴＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＬＳＬＳＴＮＬＱＥＲＬＲＲＫＥ（配列番号１０３）、ここで、ＸはＡまたはＶである。これらのハイブリッドは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，７５８，４２８号においてさらに記載される。

別の実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンαインターフェロンβハイブリッド（本明細書中において、α−βハイブリッドと呼ばれる）を含む。例えば、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のα−βハイブリッド部分は、インターフェロンβ１に融合される、インターフェロンαＤ（インターフェロンα１とも呼ばれる）から成るか、あるいはこれを含む。さらなる実施形態において、αＤ／β−１ハイブリッドは融合され、ここでＮ末端部分は、インターフェロンαＤのアミノ酸１〜７３に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンβ１のアミノ酸７４〜１６６に対応する。例えば、このαＤ／β−１ハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含み得る。
ＭＣＤＬＰＥＴＨＳＬＤＮＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＳＲＩＳＰＳＳＣＬＭＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＤＧＮＱＦＱＫＡＰＡＩＳＶＬＨＥＬＩＱＱＩＦＮＬＦＴＴＫＤＳＳＳＴＧＷＮＥＴＩＶＥＮＬＬＡＮＶＹＨＱＩＮＨＬＫＴＶＬＥＥＫＬＥＫＥＤＦＴＲＧＫＬＭＳＳＬＨＬＫＲＹＹＧＲＩＬＨＹＬＫＡＫＥＹＳＨＣＡＷＴＩＶＲＶＥＩＬＲＮＦＹＦＩＮＲＬＴＧＹＬＲＮ（配列番号１０４）。これらのハイブリッドは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，７５８，４２８号においてさらに記載される。

さらなる実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、α−αインターフェロンハイブリッド、α−βインターフェロンハイブリッド、およびβ−αインターフェロンハイブリッドの追加の組み合わせを含んでもよい。追加の実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンハイブリッドのアミノ酸配列に対して変異、置換、欠失、または付加を含むように修飾され得る。インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質に対するこのような修飾は、例えば、生成のレベルを改善し、安定性を増大し、活性を増大または減少し、あるいは新たな生物学的特性を付与するように行われ得る。

上述のインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、本発明によって包含され、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞およびベクターも同様に包含される。一実施形態において、上述のポリヌクレオチドによってコードされるインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、長期化した貯蔵寿命を有する。追加の実施形態において、上述のポリヌクレオチドによってコードされるインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、体外および／体内において、対応する非融合インターフェロンハイブリッド分子より長い血清半減期および／または溶液中（または医薬組成物中）でのより安定した活性を有する。

別の非限定的例において、「治療用タンパク質」は、生物学的活性、特に、疾患、障害、または感染を治療、予防、または改善するために有用な生物学的活性を有するタンパク質である。治療用タンパク質によって保有され得る生物学的活性の非包括的リストは、細胞のＨＩＶ−１感染の抑制、腸上皮細胞増殖の刺激、腸上皮細胞透過性の低下、インスリン分泌の刺激、気管支拡張および血管拡張の誘発、アルドステロンおよびレニン分泌の抑制、血圧調節、神経細胞成長の促進、免疫応答の増強、炎症の増強、食欲抑制、あるいは以下の「生物学的活性」の節に記載され、および／または表１（第２列）の所定の治療用タンパク質について開示される生物学的活性のうちの任意の１つ以上を含む。

一実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合を使用して、カテゴリＡのフィロ（エボラ）、アレナ（ピチンデ）、カテゴリＢのトガ（ＶＥＥ）、またはカテゴリＣのブンヤ（プントトロ）、フラビ（黄熱病、西ナイル）下に分類されるウイルス性因子を阻害する。例えば、ＣＰＥ阻害、ニュートラルレッド染色、およびウイルス収量アッセイを用いて、ＨＳＡ（ＣＩＤ３１６５タンパク質）のＩＮＦαが融合された下流の抗ウイルス活性を評価した。カニクイザルおよびヒトの被験体におけるＣＩＤ３１６５タンパク質の薬物動態および薬力学的活性について評価した。結果により評価された全ＲＮＡウイルスに対して、抗ウイルス活性が、好ましい安全指数で達成されたことが示された。ＩＣ５０値は、ＣＰＥアッセイにおいて＜０．１ｎｇ／ｍｌ（プンタトロＡ）から１９ｎｇ／ｍｌ（ＶＥＥ）の範囲であった。カニクイザルでは、ＣＩＤ３１６５タンパク質の半減期は９０時間であり、投与後最大１４日間検出可能であった。ヒト被験体では、ＣＩＤ３１６５タンパク質は、安全かつ十分耐性があった。単回注射投薬後のＣ_ｍａｘは、投与量に比例した。５００ｕｇコホートにおける平均Ｃ_ｍａｘは、２２ｎｇ／ｍｌであり、平均ｔ_１／２は１５０時間であった。２〜４週間以上毎に１回の投与は、薬物動態によって支持される。Ｃ型肝炎に対する抗ウイルス応答は、単回注射コホート（１２０〜５００ｕｇ）において、被験体の過半数で認められた。

さらなる実施形態においては、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合を使用して、Ｃ型肝炎および／または慢性Ｃ型肝炎感染（ＨＣＶ）を患う患者を治療する。インターフェロンαまたは白血球インターフェロンとしても既知であるインターフェロンαは、ＨＣＶに感染した患者の治療の標準治療である。「インターフェロンα」という用語は、高度の相同性を示す、抗ウイルス活性を有する関連ポリペプチド群を指す。ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合のインターフェロンα部分は、当該分野で既知の任意のインターフェロンαまたはそのフラグメントから成るか、あるいはこれを含む。本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のインターフェロンα部分の非限定的例として、表１の治療用タンパク質列に開示されるインターフェロンαタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、インターフェロンα部分は、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンα２ｃ、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンαｎ１、インターフェロンαｎ３、例えば、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（ＳｃｈｅｒｉｎｇＣｏｒｐ．、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、Ｎ．Ｊ．）、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）Ａ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、Ｎ．Ｊ．）、ベロフォー（Ｂｅｒｏｆｏｒ）αインターフェロン（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｇｅｌｈｅｉｍＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．、Ｒｉｄｇｅｆｉｅｄ、Ｃｏｎｎ．）、ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（登録商標）^）（Ｖｉｒａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＦＬ）、ＭＵＬＴＩＦＥＲＯＮ（商標）（Ｖｉｒａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＦＬ）、ＷＥＬＬＦＥＲＯＮ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＧｒｅａｔＢｒｉｔａｉｎ）、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．、ＴｈｏｕｓａｎｄｓＯａｋｓ、ＣＡ）、ＳＵＭＩＦＥＲＯＮ（登録商標）（住友、日本）、ＢＥＬＥＲＯＦＯＮ（登録商標）（ＮａｕｔｉｌｕｓＢｉｏｔｅｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＭＡＸＹ−ＡＬＰＨＡ（登録商標）（Ｍａｘｙｇｅｎ、ＲｅｄｗｏｏｄＣｉｔｙ、ＣＡ／Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、Ｎ．Ｊ．）等の任意の市販形態のインターフェロンα、または任意の精製インターフェロンα産物もしくはそのフラグメントから成るか、あるいはこれらを含む。さらなる実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のインターフェロンα部分は、持続放出または制御放出のために修飾または処方されるインターフェロンαから成るか、あるいはこれを含む。例えば、インターフェロンα部分は、インターフェロン−α−ＸＬ（ＦｌａｍｅｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）およびＬＯＣＴＥＲＯＮ（登録商標）（ＢｉｏＬｅｘＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ＯｃｔｏＰｌｕｓ、Ｐｉｔｔｓｂｏｒｏ、ＮＣ）を含むがこれらに限定されない市販の持続放出または制御放出型インターフェロンαから成るか、あるいはこれらを含む。追加の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のインターフェロンα部分は、化学的部分の付着によって修飾され得る。例えば、インターフェロンα部分は、ペグ化によって修飾され得る。したがって、追加の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のインターフェロンα部分は、インターフェロンα２ａ、２ｂ、またはコンセンサスインターフェロンのペグ化形態から成るか、あるいはこれらを含み、また、例えば、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ＳｃｈｅｒｉｎｇＣｏｒｐ．、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、Ｎ．Ｊ．）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、Ｎ．Ｊ．）、ＰＥＧ−ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（登録商標）（Ｖｉｒａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＦＬ）もしくはそのフラグメント等の、市販のペグインターフェロンαを含むがこれらに限定されない。しかしながら、本明細書中で使用する際、「ＩＦＮ−α−ＨＡＳ」融合は、当該分野で既知であるインターフェロンαタンパク質またはそのフラグメントのいずれかに融合されるＨＳＡを指す。

ＨＣＶに感染した患者は、ＨＣＶ感染の治療のためのインターフェロンレジメンを過去に経験したかに基づき、２つのカテゴリに分類される。「治療未経験患者」または「未経験患者」は、インターフェロンレジメンで治療したことにない患者である。「治療経験済み患者」または「経験済み患者」は、インターフェロンレジメンで治療したことのある、または現在治療中である患者である。「非反応者」は、インターフェロンレジメンで過去に治療したことがあるが、早期ウイルス量低下（ＥＶＲ）または治療終了時反応（ＥＴＲ）等の治療の主要評価項目を満たすことができなかった経験済み患者である。「再発者」は、インターフェロンレジメンで過去に治療したことがあり、かつＥＶＲまたはＥＴＲ等の治療の主要評価項目を達成したが、その後しばらく経ってＨＣＶ陽性になった経験済み患者である。しかしながら、本明細書中で使用する際、「ＨＣＶ患者」は、ＨＣＶに感染し、かつ未経験または経験積みの患者を指す。さらに、本明細書中で使用する際、「経験済み」の「ＨＣＶ患者」は、非反応者または再発者である。

さらに、Ｃ型肝炎ウイルスは、最も一般的な４つの遺伝子型である遺伝子１型、２型、３型、または４型を含む多数の遺伝子型に分類可能である。一般的に、ＨＣＶ患者を感染するＣ型肝炎ウイルスは、単一の遺伝子型を含む。しかしながら、肝炎ウイルスは、２つ以上の遺伝子型の組み合わせを含むことが可能である。さらにＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型は、既知のＨＣＶ遺伝子型のうちの１つの変異体であり得る。さらなる実施形態において、ＨＣＶ患者のＣ型肝炎ウイルスは、遺伝子１型、２型、もしくは３型、またはその変異体である。しかしながら、本明細書中で使用する際、「ＨＣＶ」は、任意の遺伝子型Ｃ型肝炎ウイルスまたはその組み合わせもしくは変異体を指す。

ＨＣＶを患う患者の標準的な治療レジメンは、リバビリン等の抗ウイルス剤と併用してインターフェロンαで治療することを伴う。一般的に、インターフェロンαは、毎日、１週間に２回、または毎週投与され、リバビリンは、少なくとも２４週、４８週、またはそれ以上の間毎日投与される。しかしながら、最近の研究では、ＨＣＶの治療のために、当該分野において既知である他の抗ウイルス剤も併用してインターフェロンαを使用している。したがって、さらなる実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合は、単体でまたは例えばリバビリン等の抗ウイルス剤と併用して、ＨＣＶ患者に投与され得る。別の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合は、例えば、リバビリンおよび／または他の抗ウイルス剤等の、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス剤と併用してＨＣＶ患者に投与され得る。

前述のように、ＨＣＶを患う患者の標準治療は、毎日、１週間に２回、毎週の投薬スケジュールで、リバビリン等の抗ウイルス剤と併用してインターフェロンで治療することを伴う。しかしながら、インターフェロンによる治療は、インフルエンザ様症状、倦怠感、不眠症、頭痛、吐き気、および鬱病を含むがこれらに限定されない重大な副作用と関連付けられ、これらは、治療の患者の忍容性を大幅に制限する可能性がある。標準治療が現在必要としているインターフェロンの頻繁な投与により、生活の質の低下した期間が長期化し、患者は完治する意欲を失ってしまう。このような頻繁な投与と生活の質の低下との組み合わせによって、療法を中断する患者の数が大幅に増えた。したがって、低頻度の投薬スケジュールによって、患者の生活の質にあまり影響を及ぼさず、かつ服薬する意欲をさらにもたらすような、改善された治療プロトコルが明らかに必要である。

投薬レジメンの主な目的は、ウイルスのレベルを可能な限り急速に定量限界未満に低下させ、治療によってウイルスの陰性を維持し、さらに治癒することである。ＨＣＶの分野において、定量限界未満のＨＣＶＲＮＡレベルとして定義される、第４週における迅速な抗ウイルス反応（ＲＶＲ）は、持続性抗ウイルス反応の強力で肯定的な予測因子である。第４週でＲＶＲを達成し、かつこのような陰性を第１２週まで維持する患者は、おそらく、治療レジメンの終了後にＨＣＶＲＮＡ陰性のままである。したがって、ＨＣＶＲＮＡ陰性を第４週で達成し、かつ持続性抗ウイルス反応（ＳＶＲ）に対する陰性を第１２週まで維持するＨＣＶ患者の数を最大限にするか、または治癒することが当該分野において必要である。

本発明は、低頻度の投薬の必要性と、ＲＶＲを第４週で最大化する必要性とを組み合わせる投薬スケジュールを提供する。一実施形態において、本発明は、単体でまたは抗ウイルスと併用してインターフェロンをＨＣＶ患者に対して、短期間において高頻度で投与し、その後、長期間において低頻度で投与することを含む投薬スケジュールを提供する。特定の実施形態において、投薬スケジュールは、短期間において、毎日、１週間に２回、毎週、または２週間毎に１回、単体でまたは抗ウイルス剤と併用してインターフェロンを投与し、その後、治療プロトコルの期間中において、２週間毎に１回、３週間毎に１回、または４週間毎に１回、抗ウイルス剤と併用して、インターフェロンを投与するステップを含む。別の実施形態において、インターフェロンは、インターフェロンαである。前述のように、本発明によって包含されるインターフェロンαは、当該分野において既知である任意のインターフェロンαまたはそのフラグメントもしくは変異体を含む。したがって、さらに別の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質またはペグインターフェロンを含むがこれらに限定されない長時間作用型インターフェロンαが投与される。本発明によって定義されるように、単体でまたは抗ウイルス剤と併用してインターフェロンαを投与する短期間には、１、２、３、４、５、６、７、または８週間以下が含まれるがこれらに限定されない。さらに、長期間には、少なくとも１６週間、少なくとも２０週間、少なくとも２４週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４０週間、少なくとも４６週間、少なくとも４８週間、少なくとも５０週間、少なくとも６０週間、またはそれ以上が含まれるがこれらだけに限定されない。具体的な実施形態において、インターフェロンαは、２〜４週間において１週間に１回、その後、治療プロトコルの期間中において１ヶ月に１回、単体でまたは抗ウイルス剤と併用して投与される。追加の具体的な実施形態において、インターフェロンαは、２〜４週間において２週間毎に１回、その後、治療プロトコルの期間中において１ヶ月に１回、単体でまたは抗ウイルス剤と併用して投与される。追加の実施形態において、インターフェロンαは、短期間においてより高いまたは多い投薬量で投与され、長期間においてより低い投薬量で投与される。

前述のように、ＣＩＤ３１６５タンパク質の薬物動態は、２〜４週間またはそれ以上毎に１回の投薬スケジュールを支持する。したがって、さらなる実施形態において、ＨＣＶ患者は、単体でまたは有効量の抗ウイルス剤と併用して、２〜４週間毎に１回投与することによってＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合で治療される。別の実施形態において、ＨＣＶ患者は、有効量の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス剤と併用して、２〜４週間毎に１回投与することによってＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合で治療される。追加の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合は、４週間毎に１回、ＨＣＶ患者に投与される。追加の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合は、４週間毎に１回より多く、ＨＣＶ患者に投与される。追加の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合は、４週間より長い間隔毎に１回、ＨＣＶ患者に投与され、この場合、治療は、有効量の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス剤の投与も含む。

別の実施形態において、ＨＣＶ患者は、少なくとも２４週間において、２週間または４週間毎に１回、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合で治療される。さらなる実施形態において、ＨＣＶ患者は、４８週間において、２週間または４週間に１回、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合で治療される。追加の実施形態において、ＨＣＶ患者は、遺伝子１型に感染している。別の実施形態において、ＨＣＶ患者は、遺伝子２型または３型に感染している。追加の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合は、リバビリンを含むがこれに限定されない少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される。

したがって、さらなる実施形態において、ＨＣＶ患者は、２週間毎と４週間毎の組み合わせによって、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合で治療される。ある実施形態において、ＨＣＶ患者は、治療レジメンの初期において、２週間に２回、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合で治療され、その後、残りの治療期間において、４週間毎に一度ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合で治療される。さらなる実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合によるこのような治療は、リバビリンを含むがこれに限定されない少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用する。追加の実施形態において、このような治療は、全部で２４週間または４８週間続く。

別の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合は、ＨＣＶの維持療法のために、低用量単剤療法として使用され得る。さらに追加の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合は、ＨＣＶを治療するために、リバビリンおよび１つ以上の他の抗ウイルス剤と併用して使用され得る。あるいは、別の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合は、ＨＣＶを治療するために、リバビリン以外の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス剤と併用して使用され得る。

追加の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合は、他のウイルス感染またはＨＣＶ感染と併発する他のウイルス感染の治療のために使用され得る。例えば、一実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合は、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）の治療のために使用され得る。追加の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の治療のために使用され得る。さらなる実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合は、ヘアリー細胞白血病、悪性黒色腫、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、多発性骨髄腫、または腎細胞癌を含むがこれらに限定されない癌の治療に使用され得る。

任意の治療レジメンの主な目的は、可能な限り迅速に疾患または障害を治療および改善し、疾患または障害の改善に関する治療の有効性を維持し、患者を治癒するようにすることである。さらに、薬物に対する即応は、多くの場合、治療に関する最終結果の肯定的な予測因子である。しかしながら、疾患または障害を患う患者のインターフェロンによる治療は、インフルエンザ様症状、倦怠感、不眠症、頭痛、吐き気、および鬱病を含むがこれらに限定されない重大な副作用に関連付けられる。このようなインターフェロン療法の副作用は、治療レジメンに関する患者の忍容性に影響を及ぼすため、かなりの数の患者が療法を中断してしまう。したがって、インターフェロン療法の早期有効性および忍容性を最大化するように設計される新しい治療プロトコルが必要とされる。

本発明は、疾患または障害を患う患者にインターフェロンを投与することを含む治療プロトコルを提供し、この場合、患者は、短期間では高頻度の投薬スケジュールで、長期間では低頻度の投薬スケジュールでインターフェロンを投与される。本明細書中で使用する際、投薬の頻度は、特定の期間に患者が受けるインターフェロンの投与の数を指す。例えば、投薬スケジュールには、毎日、１日に２回、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回等が含まれ得るがこれらに限定されない。したがって、本明細書中で使用する際、高頻度の投薬スケジュールは、低頻度の投薬スケジュールよりインターフェロンをより頻繁に受ける投薬スケジュールである。インターフェロンの治療の初期における投薬頻度の増加は、初期有効性を最大化するために、患者にインターフェロンを「フロントロードする」役割を果たす。その後の投薬頻度の低下は、残りの治療プロトコル中に有効性を維持する役割を果たすとともに、インターフェロン療法により発生する副作用の期間を減少させて忍容性を増加させる。高頻度の投薬スケジュールが有用である期間は、治療する疾患または障害に依存する。したがって、本明細書中において定義する場合、「短期間」は、患者の疾患または障害を除去する上で、インターフェロンの早期有効性を最大化するのに必要な期間を指す。低頻度投薬の「長期間」は、インターフェロンの最大有効性の期間の後の残りの治療期間を指す。例えば、短期間には、１、２、３、４、５、６、７、または８週間が含まれ得るがこれらに限定されない。長期間には、少なくとも１６週間、少なくとも２０週間、少なくとも２４週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４０週間、少なくとも４６週間、少なくとも４８週間、少なくとも５０週間、少なくとも６０週間、またはそれ以上が含まれ得るがこれらに限定されない。

追加の実施形態において、本発明は、短期間において、許容可能な安全性プロフィールを有する最大投薬量のインターフェロンを、疾患または障害を患う患者に投与し、その後、長期間において、維持投薬量のインターフェロンを投与することを含む治療プロトコルを提供する。本明細書中で使用する際、許容可能な安全性プロフィールを有する最大投薬量のインターフェロンは、患者において許容可能な安全性プロフィールを有することで既知である最高投薬量のインターフェロンである。特定の実施形態において、許容可能な安全性プロフィールを有する最大投薬量のインターフェロンは、本発明で提供される少なくとも標準投薬量である投薬量、または標準投薬量よりも少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高い投薬量が含まれるがこれらに限定されない。インターフェロンの投薬量は、当該分野で既知である基準によって決定され得る。非限定的な例として、投薬量は、後述のように、重量に基づいて（例えば、μｇ／ｋｇ）、または全処方濃度に基づき得る。さらに、本明細書中で使用する際、維持投薬量は、患者におけるインターフェロンの有効性を維持可能である、許容可能な安全性プロフィールを有する最大投薬量よりも少ない投薬量を指す。例えば、維持投薬量には、標準投薬量のインターフェロン、または最大投薬量の少なくとも半分、３分の１、４分の１、８分の１、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、またはそれ以上少ない投薬量が含まれるがこれらに限定されない。本明細書中において定義する際、「短期間」は、許容可能な安全性プロフィールを有する最大投薬量が、患者の疾患または障害を除去する上でインターフェロンの早期有効性を最大化することを可能にするのに必要な期間を指す。「長期間」は、インターフェロンの最大有効性の期間の後の残りの治療期間を指す。例えば、短期間には、１、２、３、４、５、６、７、または８週間が含まれ得るがこれらに限定されない。長期間には、少なくとも１６週間、少なくとも２０週間、少なくとも２４週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４０週間、少なくとも４６週間、少なくとも４８週間、少なくとも５０週間、少なくとも６０週間、またはそれ以上が含まれ得るがこれらに限定されない。

さらなる実施形態において、本発明は、短期間において、許容可能な安全性プロフィールを有する最大投薬量のインターフェロンを、疾患または障害を患う患者に投与し、その後、長時間において、維持投薬量のインターフェロンを投与することを含むプロトコルを提供し、その際、許容可能な安全性プロフィールを有する最大投薬量のインターフェロンは、維持投薬量のインターフェロンよりも高頻度の投薬スケジュールで投与される。

本明細書中で使用する際、「治療的活性」または「活性」は、その効果が、ヒトにおける望ましい治療結果と一致するか、あるいは非ヒト哺乳動物または他の種もしくは生物における所望の効果と一致する活性を指し得る。治療的活性は、体内または体外で測定され得る。例えば、望ましい効果は、細胞培養においてアッセイされ得る。このような体外アッセイまたは細胞培養アッセイは、通常、当該分野において記載される多くの治療用タンパク質に利用可能である。アッセイの例として、実施例の節または表１の「例示的な活性アッセイ」列（第３列）において本明細書中に記載されるアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。

細胞表面タンパク質および分泌タンパク質等の、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質は、多くの場合、１つ以上のオリゴ糖基の付着によって修飾される。グリコシル化と呼ばれる修飾は、タンパク質の物理的特性に劇的な影響を及ぼし得、タンパク質安定性、分泌、および局在化において重要であることが可能である。グリコシル化は、ポリペプチド骨格に沿った特定の位置において発生する。グリコシル化には通常、２つの主要な型があり、Ｏ結合型オリゴ糖により特徴化されるグリコシル化であって、セリン残基またはトレオニン残基に付着されるグリコシル化と、Ｎ結合型オリゴ糖によって特徴化されるグリコシル化であって、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列におけるアスパラギン残基に付着されるグリコシル化とであり、ここでＸは、プロリンを除く任意のアミノ酸であることが可能である。Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸としても既知）は、通常、Ｎ結合型オリゴ糖およびＯ結合型オリゴ糖の両方の末端残基である。タンパク質構造および細胞型等の変数は、異なるグリコシル化部位における鎖内の炭水化物ユニットの数および性質に影響を及ぼす。また、グリコシル化異性体は、所定の細胞型内の同一部位において共通する。

本発明のアルブミン融合タンパク質部分に対応する治療用タンパク質ならびにその類似体および変異体は、１つ以上の部位におけるグリコシル化が、発現される宿主細胞により、またはそれらの発現の他の条件に起因して、それらの核酸配列の操作の結果として変化するように修飾され得る。例えば、グリコシル化異性体は、例えば、アスパラギンのグルタミンの置換等のアミノ酸残基の置換または欠失によって、グリコシル化部位を廃止または導入することによって産生されてもよく、あるいは、非グリコシル化組み換えタンパク質は、例えば、大腸菌またはグリコシル化欠乏酵母等の、グリコシル化しない宿主細胞においてタンパク質を発現することによって産生され得る。これらの手法は、以下にさらに詳述され、また、当該分野において既知である。

治療用タンパク質、特に、表１に開示される治療用タンパク質、ならびにその核酸およびアミノ酸配列は、当該分野において既知であり、例えば、ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓＳｅｒｖｉｃｅｓＤａｔａｂａｓｅｓ（例えば、ＣＡＳレジストリ）、ＧｅｎＢａｎｋ、およびＧｅｎＳｅｑ（例えば、Ｄｅｒｗｅｎｔ）等の定期購読提供型データベース等の公のデータベースから入手可能である。本発明のポリヌクレオチドを誘導するために使用され得る治療用タンパク質の例示的なヌクレオチド配列は、表２の第７列「配列番号Ｘ」に示される。配列番号Ｘとして示される配列は、所定の治療用タンパク質（例えば、全長または成熟）をコードする野生型ポリヌクレオチド配列である場合があり、または場合により、配列は、その野生型ポリヌクレオチド配列となる（例えば、野生型治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、この場合、このポリヌクレオチドのＤＮＡ配列は、例えば、特定の種における発現のために最適化され、または野生型治療用タンパク質の変異体（すなわち、部位指向性変異体、対立遺伝子変異体）をコードするポリヌクレオチドである）。同一の行に記載される構築物を誘導するために、配列番号Ｘとして示される配列を使用することは、十分に、当業者の能力の範囲内である。例えば、配列番号Ｘが、全長タンパク質に対応するが、そのタンパク質の一部のみが、特定のＣＩＤを生成するために使用される場合、特定のフラグメントを増幅し、適切なベクターにこれをクローニングするために、ＰＣＲ等の分子生物学的技術に頼ることは、当業者の技術範囲内である。

本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する追加の治療用タンパク質には、表１の「治療用タンパク質Ｘ」の列（第１列）に開示される治療用タンパク質もしくはペプチド、またはそのフラグメントもしく変異体のうちの１つ以上が含まれるがこれらに限定されない。

表１は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質、または本発明のポリヌクレオチドによってコードされるアルブミン融合タンパク質の非包括的リストを提供する。第１列「治療用タンパク質Ｘ」は、治療用タンパク質分子を開示し、その次に、治療用タンパク質分子またはそのフラグメントもしくは変異体を含むか、あるいはこれらから成るタンパク質の学名および商標名を含む括弧が続く。「治療用タンパク質Ｘ」は、本明細書中で使用する際、個々の治療用タンパク質分子、またはこの列において開示される所定の治療用タンパク質分子と関連付けられる治療用タンパク質の群全体のいずれかを指し得る。「生物学的活性」列（第２列）は、治療用タンパク質分子に関連付けられる生物学的活性を記載する。第３列「例示的な活性アッセイ」は、治療用タンパク質：Ｘまたは治療用タンパク質Ｘ（またはそのフラグメント）部分を含むアルブミン融合タンパク質の治療的および／または生物学的活性を試験するために使用され得るアッセイを記載する参考文献を提供する。「例示的な活性アッセイ」列に引用される参考文献の各々は、表１の「生物学的活性」列に記載の対応する生物学的活性をアッセイするために、特に、参考文献に記載されるそれぞれの活性アッセイの記載に関して、参照することによってその全体が本明細書中に組み込まれる（例えば、それらの方法の節を参照）。第４列「適応症：Ｙ」は、治療用タンパク質Ｘまたは治療用タンパク質Ｘ（またはそのフラグメント）部分を含むアルブミン融合タンパク質によって、治療、予防、および／または改善され得る疾患、障害、感染、および／または症状を記載する。「構築物ＩＤ」列（第５列）は、参照される治療用タンパク質Ｘ（またはそのフラグメント）部分を含むか、あるいはこれらから成るアルブミン融合タンパク質をコードする、表２に開示される例示的なアルブミン融合構築物に対する関連付けを提供する。

表２は、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むか、あるいはこれから成る、本発明のポリヌクレオチドの非包括的リストを提供する。第１列「融合番号」は、各ポリヌクレオチドへの融合番号を示す。第２列「構築物ＩＤ」は、本発明のポリヌクレオチド毎の固有の数字による識別子を提供する。構築物ＩＤを使用して、表１の対応する行に列挙される所定の治療用タンパク質：Ｘに対応する治療用タンパク質部分を含むか、あるいはこれらから成る、アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを特定し得、ここで、この構築物ＩＤは、第５列に列挙される。「構築物名」列（第３列）は、所定のアルブミン融合構築物またはポリヌクレオチドの名称を提供する。

表２の第４列「説明」は、所定のアルブミン融合構築物の一般的な説明を提供し、第５列「発現ベクター」は、所定のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むか、あるいはこれらから成るポリヌクレオチドがクローニングされたベクターを列挙する。ベクターは、当該分野において既知あり、市販されるかまたは、他に記載される。例えば、実施例において記載するように、（１）所定のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（２）リーダー配列、（３）プロモーター領域、および（４）転写ターミネーターのうちの１つ以上を含むか、あるいはこれらのうちの１以上から成る「発現カセット」は、簡便なクローニングベクターにおいてアセンブリされてもよく、その後、例えば、酵母発現ベクターまたは哺乳動物発現ベクターを含む例えば発現ベクター等の、代替ベクターにアセンブリされ得る。一実施形態において、サッカロマイセスセレビシエにおける発現では、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むか、あるいはこれから成る発現カセットが、ｐＳＡＣ３５にクローニングされる。別の実施形態において、ＣＨＯ細胞における発現では、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むか、あるいはこれから成る発現カセットが、ｐＣ４にクローニングされる。さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードする核酸分子を含むか、あるいはこれらから成るポリヌクレオチドは、ｐＣ４：ＨＳＡにクローニングされる。またさらなる実施形態において、ＮＳ０細胞おける発現では、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むか、あるいはこれから成る発現カセットが、ｐＥＥ１２にクローニングされる。他の有用なクローニングおよび／または発現ベクターは、当業者に既知であり、また、本発明の範囲内である。

第６列「配列番号Ｙ」は、本発明のアルブミン融合タンパク質の全長アミノ酸配列を提供する。多くの場合、配列番号Ｙは、コードされるアルブミン融合タンパク質の非プロセシング形態を示し、言い換えれば、配列番号Ｙは、特定の構築物によってコードされるシグナル配列、ＨＳＡ部分、および治療部分全てを示す。配列番号Ｙをコードするポリヌクレオチド全てが、本発明により具体的に意図されている。これらのポリヌクレオチドを使用して、コードされたタンパク質を細胞から発現する場合、細胞の天然の分泌およびプロセシングステップは、表２の第４列および／または第１１列に列挙されるシグナル配列を欠くタンパク質を産生する。列挙されるシグナル配列の具体的なアミノ酸配列は、後に、本明細書中に示されるか、または当該分野において既知である。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、細胞によって産生されるアルブミン融合タンパク質（表２の第４列および／または第１１列に示されるリーダー配列を欠く）を含む。また、表２の第４列および／または第１１列に列挙される特定のリーダー配列なしで、配列番号Ｙを含むポリペプチドも、本発明の実施形態に含まれる。また、本発明の組成物は、医薬組成物を含む、これらの２つの実施形態も含む。さらに、表２の第４列および／または第１１列に列挙されるシグナル配列を、プロセシングされたアルブミン融合タンパク質の分泌を容易にするために、本明細書中で後述するシグナル配列等の異なるシグナル配列と置換することは、十分に、当業者の能力の範囲内である。

第７列「配列番号Ｘ」は、所定のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドが由来し得る親核酸配列を提供する。一実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドが由来し得る親核酸配列は、表１に示される治療用タンパク質をコードする野生型遺伝子配列を含む。代替実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドが由由来し得る親核酸配列は、例えば、治療用タンパク質をコードする野生型遺伝子配列の、合成コドンで最適化された変異体等の、表１に示される治療用タンパク質をコードする野生型遺伝子配列の変異体もしくは誘導体を含む。

第８列「配列番号Ｚ」は、親核酸配列（配列番号Ｘ）の推定翻訳物を提供する。この親配列は、特定の構築物を得るために使用される全長親タンパク質、親タンパク質の成熟部分、野生型タンパク質の変異体もしくはフラグメント、または記載される構築物を生成するために使用可能な人工配列であることが可能である。当業者は、配列番号Ｚに示されるこのアミノ酸配列を使用して、所定の構築物によってコードされるアルブミン融合タンパク質のどのアミノ酸残基が、治療用タンパク質によって提供されるかを判断可能である。さらに、同一の行に記載される構築物を得るために、配列番号Ｚとして示される配列を使用することは、十分に、当業者の能力の範囲内である。例えば、配列番号Ｚが、全長タンパク質に対応するが、そのタンパク質の一部のみが、特定のＣＩＤを生成するために使用される場合、特定のフラグメントを増幅し、適切なベクターにこれをクローニングするために、ＰＣＲ等の分子生物学的技術に頼ることは、当業者の技術範囲内である。

第９列および第１０列「配列番号Ａ」および「配列番号Ｂ」においてそれぞれ提供される増幅プライマーは、所定のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードする核酸分子を含むか、あるいはこれから成るポリヌクレオチドを生成するために使用される例示的なプライマーである。本発明の一実施形態において、第９列および／または第１０列において示される配列（配列番号Ａおよび／またはＢ）を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、対応する行の第７列に提供されるヌクレオチド配列（配列番号Ｘ）を含むか、あるいはこれから成る核酸分子をテンプレートＤＮＡとして使用して、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するために使用される。ＰＣＲ法は、当該分野において十分確立されている。追加の有用なプライマー配列は、当業者によって容易に想定および利用することができる。

代替実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーを重複ＰＣＲ反応において使用して、テンプレートＤＮＡ配列内で変異を生成することができる。ＰＣＲ方法は、当該分野において既知である。

表３に示すように、本出願において開示される特定のアルブミン融合構築物は、ＡＴＣＣ（登録商標）に寄託されている。

当該分野で既知の技術および本明細書中の他の箇所に記載される技術（例えば、実施例１０を参照）により、所定のアルブミン融合構築物を寄託物から回収することが可能である。ＡＴＣＣは、１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０−２２０９、ＵＳＡに位置する。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に準拠して行われた。

本発明のさらなる実施形態において、（１）所定のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（２）リーダー配列、（３）プロモーター領域、および（４）転写ターミネーターのうちの１つ以上を含むか、あるいはこれらから成る「発現カセット」が、１つのベクターから別のベクターへと移動または「サブクローニング」されることが可能である。サブクローニングされるフラグメントは、例えば、ＰＣＲ増幅（例えば、配列番号ＡまたはＢに示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用する）および／または制限酵素消化等の当該分野で既知の方法によって生成することができる。

いくつかの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療的活性および／または治療的活性に対応する生物学的活性、および／または表１の対応する行に列挙されるアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質の生物学的活性の能力を有する。さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療的に活性なタンパク質部分は、表２の配列番号Ｘの列に示される配列によりコードされるタンパク質のフラグメントまたは変異体であり、対応する治療用タンパク質の治療的活性および／または生物学的活性の能力を有する。

ポリペプチドおよびポリヌクレオチドのフラグメントおよび変異体

フラグメント

さらに、本発明は、表１に記載される治療用タンパク質、アルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のフラグメントを対象とする。

また、本発明は、表１に記載される治療用タンパク質、アルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のフラグメントをコードするポリヌクレオチドを対象とする。

タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失により、治療用タンパク質の１つ以上の生物学的機能の修飾または損失がもたらされるとしても、アルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質、他の治療的活性および／または機能的活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、リガンド結合能力）が依然として保持され得る。例えば、Ｎ末端欠失を有するポリペプチドの、ポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘発および／または結合する能力は、完全ポリペプチドの残基の過半数未満がＮ末端から除去される場合に、一般的に保持される。完全ポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫原活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法およびそうでなければ当該分野において既知の方法により容易に判断可能である。多数のＮ末端アミノ酸残基が欠失したムテインがいくつかの生物学的活性または免疫原活性を保持し得る可能性は低くない。実際は、６つのアミノ酸残基という少ない数で構成されるペプチドが、多くの場合、免疫学的応答を誘発することができる。

したがって、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質のフラグメントには、全長タンパク質、ならびに参照ポリペプチド（すなわち、表１に参照される治療用タンパク質、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分）のアミノ酸配列のアミノ末端から１つ以上の残基が欠失したポリペプチドが含まれる。具体的には、Ｎ末端欠失は、一般式ｍからｑにより記述され得、ここで、ｑは参照ポリペプチド（例えば、表１において参照される治療用タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、または表２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分）中のアミノ酸残基の総数を示す全整数であり、ｍは２からｑ−６の範囲の任意の整数として定義される。また、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明によって包含される。

さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応する血清アルブミンポリペプチドのフラグメントには、全長タンパク質、ならびに参照ポリペプチド（すなわち、血清アルブミン、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の血清アルブミン部分）のアミノ酸配列のアミノ末端から１つ以上の残基が欠失したポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態において、Ｎ末端欠失は、一般式ｍから５８５により記述され得、ここで、５８５は成熟ヒト血清アルブミン（配列番号１）中のアミノ酸残基の総数を示す全整数であり、ｍは２から５７９の範囲の任意の整数として定義される。また、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。追加の実施形態において、Ｎ末端欠失は、一般式ｍから６０９により記述されてもよく、ここで、６０９は全長ヒト血清アルブミン（配列番号３）中のアミノ酸残基の総数を示す全整数であり、ｍは２から６０３の範囲の任意の整数として定義される。また、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。

さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質のフラグメントには、全長アルブミン融合タンパク質、ならびにアルブミン融合タンパク質（例えば、表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物治療用タンパク質によってコードされるアルブミン融合タンパク質、または表２の第６列に開示されるアミノ酸配列を有するアルブミン融合タンパク質）のアミノ末端から１つ以上の残基が欠失したポリペプチドが含まれる。具体的には、Ｎ末端欠失は、一般式ｍからｑにより記述され得、ここでｑは、アルブミン融合タンパク質中のアミノ酸残基の総数を示す全整数であり、ｍは２からｑマイナス６の範囲の任意の整数として定義される。また、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。

前述のように、参照ポリペプチド（例えば、本発明の治療用タンパク質、血清アルブミンタンパク質、またはアルブミン融合タンパク質）のＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失により、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の修飾または損失がもたらされるとしても、他の機能的活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、リガンド結合能力）および／または治療的活性が依然として保持され得る。例えば、Ｃ末端欠失を有するポリペプチドの、完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘発および／または結合する能力は、完全または成熟ポリペプチドの残基の過半数未満がＣ末端から除去される場合に、一般的に保持される。参照ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが治療的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および／またはそうでなければ当該分野において既知の方法により容易に判断可能である。

本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質（例えば、表１に参照される治療用タンパク質、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分）のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失したポリペプチドをさらに提供する。具体的には、Ｃ末端欠失は、一般式１からｎによって記述され得、ここで、ｎは、６からｑ−１の範囲の任意の全整数であり、ｑは、参照ポリペプチド（例えば、表１において参照される治療用タンパク質、または表２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分）中のアミノ酸残基の総数を示す全整数である。また、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。

さらに、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミンまたは表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分）のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失したポリペプチドを提供する。具体的には、Ｃ末端欠失は、一般式１からｎによって記述され得、ここで、ｎは、６から５８４の範囲の任意の全整数であり、ここで、５８４は、成熟ヒト血清アルブミン（配列番号１）中のアミノ酸残基の総数マイナス１を示す全整数である。また、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。具体的には、Ｃ末端欠失は、一般式１からｎによって記載されてもよく、ここでｎは、６から６０８の範囲の任意の全整数であり、ここで、６０８は、血清アルブミン（配列番号３）中のアミノ酸残基の総数−１を示す全整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。

さらに、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失したポリペプチドを提供する。具体的には、Ｃ末端欠失は、一般式１からｎによって記述されて得、ここで、ｎは、６からｑ−１の範囲の任意の全整数であり、ｑは、本発明のアルブミン融合タンパク質中のアミノ酸残基の総数を示す全整数である。また、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。

さらに、上述のＮ末端欠失またはＣ末端欠失のいずれかを組み合わせても、Ｎ末端およびＣ末端が欠失した参照ポリペプチドを産生することが可能である。また、本発明は、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方から１つ以上のアミノ酸が欠失したポリペプチドも提供し、参照ポリペプチド（例えば、表１に参照される治療用タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によってコードされる治療用タンパク質部分、または血清アルブミン（例えば、配列番号１）、または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によってコードされるアルブミンタンパク質部分、またはアルブミン融合タンパク質、または本発明のポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によってコードされるアルブミン融合タンパク質）の残基ｍからｎを有するものとして一般的に記述されてもよく、ここで、ｎおよびｍは、上述のような整数である。また、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。

また、本明細書は、ここで説明する参照ポリペプチド配列（表１に参照される治療用タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、または表２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされる治療用タンパク質部分、または血清アルブミン（例えば、配列番号１）、または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分、または表２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミンタンパク質部分、またはアルブミン融合タンパク質、または本発明のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチドを含有するタンパク質、またはそのフラグメントを対象とする。いくつかの実施形態において、本明細書は、上述のようなＮ末端欠失およびＣ末端欠失のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチドを含有するタンパク質を対象とする。また、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。

本発明のポリペプチドのフラグメントは、アミノ酸配列がフラグメントである治療用タンパク質または血清アルブミンタンパク質のポリペプチド配列の治療的活性および／または機能的活性（例えば、生物学的活性）を示すアミノ酸配列を含むか、あるいはこれから成る。

他のポリペプチドのフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントを含む。生物学的に活性なフラグメントは、本発明のポリペプチドの活性と、必ずしも同一でないが、類似する、活性を呈するフラグメントである。フラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性または減少した望ましくない活性を含み得る。

変異体

「変異体」は、参照核酸またはポリペプチドとは異なるがそれらの本質的な特性は保持している、ポリヌクレオチドまたは核酸を指す。一般的に、変異体は全体的に密接に類似しており、多くの領域において、参照核酸またはポリペプチドと同一である。

本明細書中で使用する際、「変異体」は、それぞれ、治療用タンパク質（例えば、表１の「治療的」列を参照）、アルブミンタンパク質、および／またはアルブミン融合タンパク質と配列が異なるが、本明細書の他の箇所に記載されるかそうでなければ当該分野で既知のような、その少なくとも１つの機能的特性および／または治療的特性を保持している、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分、または本発明のアルブミン融合タンパク質を指す。一般的に、変異体は、全体的に非常に類似しており、多くの領域において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質、アルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質、および／またはアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列と同一である。また、これらの変異体をコードする核酸も本発明によって包含される。

また、本発明は、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質のアミノ酸配列（例えば、表１に開示される治療用タンパク質：Ｘのアミノ酸配列、または表１および２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分のアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは変異体）、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質のアミノ酸配列（例えば、表１および表２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分のアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントもしくは変異体）、および／またはアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらのアミノ酸配列から成るタンパク質も対象とする。また、これらのポリペプチドのフラグメントも提供される（例えば、本明細書中に記載されるフラグメント）。さらに、本発明に包含されるさらなるポリペプチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（例えば、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で、約４５℃で、フィルター結合ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションし、その後０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で約５０〜６５℃で１回以上洗浄する）、高度にストリンジェントな条件下で（例えば、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で、約４５℃で、フィルター結合ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で、約６８℃で１回以上洗浄する）、または当業者に既知である他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．、Ｅｄ．、１９８９、ＣｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＩｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ、６．３．１−６．３．６および２．１０．３を参照）。また、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明によって包含される

問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が、問い合わせアミノ酸配列の１００個毎に最大５つのアミノ酸の改変を含み得ることを除いて、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が問い合わせ配列に同一であることが意図される。言い換えれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列におけるアミノ酸残基の最大５％が、挿入、欠失、または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で発生し得、または参照配列中の残基間で個々に、もしくは参照配列内の１つ以上の連続する群においてのいずれかで散在される、これらの末端位置間の任意の位置において発生し得る。

実際に、任意の特定のポリペプチドが、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質またはそのフラグメント（例えば、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分またはアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分）のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、従来的に、既知のコンピュータプログラムを使用して判断可能である。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的な一致を判断するための方法は、全体的配列アライメントとも呼ばれ、Ｂｒｕｔｌａｇｅｔａｌ．（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して判断可能である。配列アライメントにおいて、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるか、または両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記全体的配列アラインメントの結果は、同一性割合で示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アライメントに使用される好適なパラメータは、マトリクス＝ＰＡＭ０、ｋ−組＝２、不一致ペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、ランダム化群長さ＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列の長さ、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００、または短い方の対象アミノ酸配列の長さである。

対象配列が、内部欠失のためではなくＮ末端またはＣ末端欠失に起因して問い合わせ配列よりも短い場合、結果に対して手動補正を行わなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性割合を計算する際に、対象配列のＮ末端短縮およびＣ末端短縮を考慮しないからである。問い合わせ配列に対して、Ｎ末端およびＣ末端で短縮されている対象配列に関し、同一性割合は、問い合わせ配列の総塩基の割合として、対応する対象残基と一致／整合しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整合されているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果によって判断される。次に、この割合は、上記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメータを使用して計算された同一性割合から差し引かれ、最終的な同一性割合のスコアに到達する。この最終的な同一性割合のスコアは、本発明の目的のために使用されるものである。問い合わせ配列と一致／整合されていない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基のみが、同一性割合のスコアを手動で調整する目的で考慮される。すなわち、問い合わせ残基のみが、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端の残基の外側に位置する。

例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性割合を判断するために１００残基の問い合わせ配列と整合される。欠失が対象配列のＮ末端において生じるため、ＦＡＳＴＤＢ整合は、Ｎ末端における最初の１０残基の一致／整合を示さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を示すため、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性割合のスコアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性割合は９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であるため、問い合わせ配列と一致／整合しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算される同一性割合は、手動補正されない。前述のように、ＦＡＳＴＤＢ整合において示される、問い合わせ配列と一致／整合しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側の残基位置のみが手動で補正される。他の手動補正は、本発明の目的のために行われない。

変異体は、通常、変異体と同じ長さの正常ＨＡまたは治療用タンパク質の長さと少なくとも７５％（例えば、少なくとも約８０％、９０％、９５％、または９９％）の配列同一性を有する。ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列レベルの相同性または同一性は、配列類似性検索用に調整されたプログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘ（参照することによって全てが組み込まれる、Ｋａｒｌｉｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４〜２２６８（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０〜３００（１９９３））によって採用されるアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）分析により判断される。

ＢＬＡＳＴプログラムによって使用される手法は、最初に問い合わせ配列とデータベース配列との間の類似のセグメントを考慮し、次に、同定される全ての一致の統計学的有意性を評価し、最終的に、有意性のあらかじめ選択した閾値を満たす一致のみを集約することである。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の考察については、参照することによって全体が組み込まれるＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．、（ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ６：１１９−１２９（１９９４））を参照されたい。ヒストグラム、記述、整合、期待値（すなわち、データベース配列に対する一致を報告するための統計的に有意な閾値）、カットオフ、マトリクス、およびフィルターに関する検索パラメータは、デフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘにより使用されるデフォルト評点マトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス（参照することによって全体が組み込まれるＨｅｎｉｋｏｆｆｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２））である。ｂｌａｓｔｎに関し、評点マトリクスは、Ｍ（すなわち、一対の一致残基に関する報酬スコア対Ｎ（すなわち、不一致残基に関するペナルティスコア）の比率により設定され、ここで、ＭおよびＮのデフォルト値は、それぞれ５および−４である。４つのｂｌａｓｔｎパラメータは、Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティ）、Ｒ＝１０（ギャップ延長ペナルティ）、ｗｉｎｋ＝１（問い合わせ配列に沿ってｗｉｎｋ番目の位置毎にワードヒットを生じる）、およびｇａｐｗ＝１６（ギャップアラインメントが生成されるウインドウ幅を設定する）のように調整され得る。同等のＢｌａｓｔｐパラメータ設定は、Ｑ＝９、Ｒ＝２、ｗｉｎｋ＝１、およびｇａｐｗ＝３２であった。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０において利用可能な配列間の最良適合比較は、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティ）およびＬＥＮ＝３（ギャップ延長ペナルティ）を使用し、また、タンパク質比較における同等設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。

本発明のポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における変化を含んでもよい。本発明の実施形態は、サイレント置換、付加、または欠失を産生するが、コードされるポリペプチドの特性または活性を変化させない変化を含むポリヌクレオチド変異体を含む。また、遺伝コードの縮重に起因するサイレント置換によって産生されるヌクレオチド変異体も本発明の実施形態である。さらに、任意の組み合わせにおいて５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１０個未満、または５〜５０個、５〜２５個、５〜１０個、１〜５個、もしくは１〜２個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されるポリペプチド変異体も本発明の実施形態である。ポリヌクレオチド変異体は、多種多様の理由、例えば、特定の宿主についてのコドン発現を至適化するため（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、酵母または大腸菌等の細菌宿主に好ましいコドンに変化させる）のために、産生可能である。

ある実施形態において、アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分をコードする本発明のポリヌクレオチドは、酵母または哺乳動物細胞における発現のために最適化される。さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードする本発明のポリヌクレオチドは、酵母または哺乳動物細胞における発現のために最適化される。またさらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、酵母または哺乳動物細胞における発現のために最適化される。

代替実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、治療用タンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてアルブミンタンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。別の実施形態において、アルブミン融合タンパク質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において治療用タンパク質部分またはアルブミンタンパク質部分をコードする野生型ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。

追加の実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは、その治療用タンパク質の天然に存在する配列を含まないか、あるいはその配列から成らない。さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは、アルブミンタンパク質の天然に存在する配列を含まないか、あるいはその配列から成らない。代替実施形態において、アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、治療用タンパク質部分またはアルブミンタンパク質部分の天然に存在する配列を含まないか、その配列から成らない。

天然に存在する変異体は、「対立遺伝子変異体」と呼ばれ、また、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つを指す（ＧｅｎｅｓＩＩ、Ｌｅｗｉｎ、Ｂ．、Ｅｄ．、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリペプチドレベルのいずれかで変化可能であり、また、本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。

タンパク質工学および組み換えＤＮＡ技術の既知の方法を使用して、変異体は、本発明のポリペプチドの特性を改善または変化させるために生成され得る。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に損失することなく本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失可能である。一例として、Ｒｏｎｅｔａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３））は、３、８、または２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失させた後でもヘパリン結合活性を有する変異体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させた後、最大１０倍のより高い活性を呈した（Ｄｏｂｅｌｉｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：１９９−２１６（１９８８））。

さらに、十分な証拠により、天然に存在するタンパク質の生物学的活性に類似する活性を、変異体が多くの場合保持することが実証される。例えば、Ｇａｙｌｅおよび共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２１０５−２２１１１（１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる突然変異分析を実行した。彼らは、無作為な突然変異を使用して、分子の全長における変異体毎に平均２．５アミノ酸が変化する、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ変異体を生成した。多数の変異が、全ての可能なアミノ酸位置において審査された。研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のいずれに対してもほとんど影響を及ぼさずに変化され得る」ことを発見した。実際は、審査された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、２３個の特異的なアミノ酸配列のみが、野生型と活性が大幅に異なるタンパク質を生成した。

さらに、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失により、１つ以上の生物学的機能の修飾または損失がもたらされるとしても、他の生物学的活性は依然として保持され得る。例えば、分泌形態を認識する抗体を誘発および／または結合する欠失変異体の能力は、分泌形態の過半数未満の残基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合に保持される可能性がある。タンパク質のＮ末端またはＣ末端残基を欠損する特定のポリペプチドが、このような免疫原活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法およびそうでなければ当該分野において既知の方法により容易に判断可能である。

したがって、本発明は、機能的活性（例えば、生物学的活性および／または治療的活性）を有するポリペプチド変異体をさらに含む。一実施形態において、本発明は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質の１つ以上の生物学的活性および／または治療的活性に対応する機能的活性（例えば、生物学的活性および／または治療的活性）を有するアルブミン融合タンパク質の変異体を提供する。別の実施形態において、本発明は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質の１つ以上の生物学的活性および／または治療的活性に対応する機能的活性（例えば、生物学的活性および／または治療的活性）を有するアルブミン融合タンパク質の変異体を提供する。このような変異体は、当該分野で既知の一般規則に従って、活性にほとんど影響を及ぼさないように選択される、欠失、挿入、反転、反復、および置換を含む。また、このような変異体をコードするポリヌクレオチドも本発明に包含される。

いくつかの実施形態において、本発明の変異体は、保存的置換を有する。「保存的置換」は、脂肪族または疎水性のアミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換、芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小型アミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換等の群内の交換を意図する。

表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針は、例えば、Ｂｏｗｉｅｅｔａｌ．、「ＤｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇｔｈｅＭｅｓｓａｇｅｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＴｏｌｅｒａｎｃｅｔｏＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において提供され、ここで、著者は、変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主要な戦略があることを示す。

第１の戦略は、進化の中の自然選択によるアミノ酸置換の寛容性を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することによって、保存されるアミノ酸を同定することが可能である。これらの保存されたアミノ酸は、タンパク質の機能についておそらく重要である。対照的に、置換が自然選択によって寛容されたアミノ酸の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを示す。したがって、アミノ酸置換を寛容する位置は、タンパク質の生物学的活性を依然として維持しながら修飾され得る。

第２の戦略は、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クローン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を使用する。例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発（分子中の各残基毎に単一のアラニン変異の導入）を使用することが可能である。ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）を参照されたい。次に、結果として生じた変異体分子の生物学的活性について試験可能である。

著者らが述べるように、これらの２つの戦略は、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。さらに、著者らは、どのアミノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容状態であるかを示す。例えば、（タンパク質の３次構造内に）大部分が埋められるアミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴のほとんどは、一般的に保存されない。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換、ヒドロキシル残基のＳｅｒおよびＴｈｒの置換、酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換、アミド残基のＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換、芳香族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小型アミノ酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。保存的なアミノ酸置換に加え、本発明の変異体は、（ｉ）１つ以上の非保存的なアミノ酸残基の置換であって、ここで置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基であってもそうでなくてもよい置換、を含むポリペプチド、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むポリペプチド、または（ｉｉｉ）ポリペプチドの安定性および／または可溶性を増加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）等の別の化合物と融合もしくは化学的に結合されたポリペプチド、（ｉｖ）例えば、ＩｇＧＦｃ融合領域ペプチド等の追加のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。このような変異体ポリペプチドは、本明細書における教示から、当業者の範囲内であると見なされる。

例えば、他の荷電アミノ酸または中性アミノ酸との荷電アミノ酸のアミノ酸置換を含むポリペプチド変異体は、凝集軽減等の特性が改善されたタンパク質を生成し得る。医薬処方物の凝集は、凝集体の免疫原活性に起因して、活性を減少させ、またクリアランスを増加させる。Ｐｉｎｃｋａｒｄｅｔａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）、Ｒｏｂｂｉｎｓｅｔａｌ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ３６：８３８−８４５（１９８７）、Ｃｌｅｌａｎｄｅｔａｌ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ１０：３０７−３７７（１９９３）を参照されたい。

具体的な実施形態において、本発明のポリペプチドは、アルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列、治療用タンパク質および／またはヒト血清アルブミンのアミノ酸配列のフラグメントまたは変異体を含むか、あるいはこれらから成り、ここで、このフラグメントまたは変異体は、参照アミノ酸配列と比較した場合に、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０、または５０〜１５０のアミノ酸残基の付加、置換、および／または欠失を有する。他の実施形態において、アミノ酸置換は保存的である。また、これらのポリペプチドをコードする核酸も本発明に包含される。

本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスターによって相互に結合したアミノ酸から構成可能であり、また、遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドは、翻訳後プロセシング等の天然のプロセスによって、または当該分野で既知の化学修飾技術によってのいずれかで修飾され得る。このような修飾は、基本テキスト、およびより詳細な研究論文、ならびに多くの研究文献に十分記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドにおける任意の位置において発生可能である。同じ型の修飾が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同一または可変の程度で存在し得ることが理解されたい。また、所定のポリペプチドは、多くの型の修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝状であってもよく、また、ポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環状であり得る。環状、分枝状、および分枝した環状のポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから生じてもよく、または合成方法によって作製され得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化等のタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が含まれる（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、２ｎｄＥｄ．、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）、ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬＣＯＶＡＬＥＮＴＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｅｄ．、、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１−１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒｅｔａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）、Ｒａｔｔａｎｅｔａｌ．、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照）。

機能的活性

「機能的活性を有するポリペプチド」は、治療用タンパク質の全長、プロタンパク質、および／または成熟形態に関連付けられる１つ以上の既知の機能的活性を示し得るポリペプチドを指す。このような機能的活性には、生物学的活性、抗原性［抗ポリペプチド抗体に結合（または結合についてポリペプチドと競合）する能力］、免疫原性（本発明の特異的プリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のポリペプチドと多量体を形成する能力、およびポリペプチドの受容体またはリガンドに結合する能力が含まれるがこれらに限定されない。

「生物学的活性を有するポリペプチド」は、特定の生物学的アッセイにおいて測定される際に、投薬量依存性の有無にかかわらず、本発明の治療用タンパク質の活性と類似の活性であるが、その活性と必ずしも同一でない活性を呈する、成熟形態を含むポリペプチドを指す。投薬量依存性が存在する場合、投薬量依存性は、ポリペプチドの投薬量依存性と同一である必要はなく、むしろ本発明のポリペプチドと比較した場合の所定の活性における投薬量依存性と実質的に類似する（すなわち、候補ポリペプチドは、本発明のポリペプチドと比較してより高い活性、または約２５倍低い、ある実施形態において１０倍低い、またさらなる実施形態において、約３倍低い活性を示す）。

いくつかの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されない場合の治療用タンパク質部分（またはそのフラグメントもしくは変異体）に関連付けられる少なくとも１つの生物学的活性および／または治療的活性を有する。

追加の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、非融合状態の治療用タンパク質部分（またはそのフラグメントもしくは変異体）と比較して、高いプラズマ安定性を有する。本発明のアルブミン融合タンパク質のプラズマ安定性または非融合治療用タンパク質部分（またはそのフラグメントもしくは変異体）のプラズマ安定性は、当該分野において既知であるアッセイを使用して、またはそのアッセイを慣用的に修正してアッセイ可能である。

本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該分野で既知のアッセイおよび本明細書に記載のアッセイを使用するか、またはこれらを慣用的に修正して、機能的活性（例えば、生物学的活性）についてアッセイ可能である。さらに、当業者は、表１の対応する行（例えば、表１の３列）に参照されるアッセイを使用して、活性についてアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質のフラグメントを慣用的にアッセイすることができる。さらに、当業者は、当該分野で既知のアッセイを使用して、および／または以下の実施例に記載されるアッセイを使用して、活性についてアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質のフラグメントを慣用的にアッセイすることができる。

例えば、アルブミン融合タンパク質が治療用タンパク質に結合するか、または抗治療的ポリペプチド抗体および／または抗アルブミン抗体への結合に関して治療用タンパク質と競合する能力についてアッセイする一実施形態において、当該分野で既知の種々の免疫アッセイが使用可能であり、このようなアッセイには、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、原位置免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵素、または放射性同位体標識を使用する）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Ａアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等の技術を使用する競合アッセイ系および非競合アッセイ系が含まれるがこれらに限定されない。一実施形態において、抗体結合は、１次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態において、１次抗体は、１次抗体に対する２次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態において、２次抗体は標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合の検出に関して当該分野において既知であり、また本発明の範囲内である。

ある実施形態において、治療用タンパク質の結合パートナー（例えば、受容体またはリガンド）が同定される場合、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィ、タンパク質アフィニティークロマトグラフィ、ならびにアフィニティーブロッティング等の当該分野で既知の手段によって、融合物の治療用タンパク質部分として治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質によるその結合パートナーへの結合が、アッセイ可能である。一般的に、Ｐｈｉｚｉｃｋｙｅｔａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）を参照されたい。別の実施形態において、融合物の治療用タンパク質部分に対応する治療的ポリペプチドの基質に結合する、アルブミン融合タンパク質の生理学的相関の能力が、当該分野で既知の技術を使用して慣用的にアッセイ可能である。

代替実施形態において、アルブミン融合タンパク質の多量体化する能力が評価されている場合、多量体の他の成分との関連は、例えば、還元および非還元のゲルクロマトグラフィ、タンパク質アフィニティークロマトグラフィ、ならびにアフィニティーブロッティング等の当該分野で既知の手段によってアッセイ可能である。一般的には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙｅｔａｌ．（上記）を参照されたい。

いくつかの実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の全部または一部を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されていない場合の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体に関連付けられる少なくとも１つの生物学的活性および／または治療的活性（例えば、ポリペプチドまたはエピトープに特異的に結合すること）を有する。他の実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の全部または一部を含むアルブミン融合タンパク質の生物学的活性および／または治療的活性は、治療用タンパク質に結合する抗体により特異的に結合されるポリペプチドに関連付けられる生物学的活性および／または治療的活性のうちの１つ以上の阻害（すなわち、拮抗作用）または活性化（すなわち、アゴニスト作用）である。

治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、多種多様の方法で特徴化され得る。具体的には、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質に結合する抗体により特異的に結合される同一の抗原に特異的に結合する能力に関して、本明細書に記載される技術を使用して、または当該分野で既知の技術を慣用的に修正してアッセイ可能である。

アルブミン融合タンパク質（例えば、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む）の、特定のタンパク質またはエピトープに（特異的に）結合する能力に関するアッセイは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４１２−４２１（１９９２））、ビーズ上で（例えば、Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ上で（例えば、Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ３６４：５５５−５５６（１９９３））、細菌上で（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上で（例えば、米国特許第５，５７１，６９８号、第５，４０３，４８４号、および第５，２２３，４０９号）、プラスミド上で（例えば、Ｃｕｌｌｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１８６５−１８６９（１９９２））、またはファージ上で（例えば、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６〜３９０（１９９０）、Ｄｅｖｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４−４０６（１９９０）、Ｃｗｉｒｌａｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６３７８−６３８２（１９９０）、ならびにＦｅｌｉｃｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０（１９９１））、実行され得る（これらの参考文献の各々は、参照することによってその全体が本明細書中に組み込まれる）。また、治療抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、特異的タンパク質またはエピトープに対するその特異性および親和性に関して、本明細書中に記載の技術または当該分野で既知の他の方法を使用するか、またはこれらを慣用的に修正してアッセイすることができる。

治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、他の抗原（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体により特異的に結合される分子との配列／構造保存性を有する分子）との交差反応性に関して、当該分野で既知の任意の方法によりアッセイすることができる。

免疫特異的結合および交差反応性を分析するために使用可能である免疫アッセイには、いくつか例を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、およびタンパク質Ａ免疫アッセイ等の技術を使用する競合アッセイ系および非競合アッセイ系が含まれるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、また当該分野において既知である（例えば、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．、Ｅｄｓ、１９９４、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋを参照）。例示的な免疫アッセイについて、以下に簡潔に記載される（但し、これらは限定する目的で意図されない）。

免疫沈降プロトコルは、一般的に、タンパク質ホスファターゼ阻害剤および／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７２の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）等の溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解するステップ、本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む）を細胞溶解物に付加するステップ、ある時間（例えば、１〜４時間）４０℃でインキュベートするステップ、例えば、抗アルブミン抗体に結合したセファロースビーズを細胞溶解物に付加するステップ、約１時間以上４０℃でインキュベートするステップ、溶解緩衝液中でビーズを洗浄するステップ、およびＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁するステップを含む。アルブミン融合タンパク質の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析によりアッセイ可能である。当業者は、アルブミン融合タンパク質の抗原への結合を増加するように、かつバックグラウンドを減少させる（例えば、セファロースビーズで細胞溶解物を事前に清浄する）ように修正可能なパラメータに関して精通し得るる。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．、ｅｄｓ、１９９４、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、１０．１６．１を参照されたい。

ウエスタンブロット分析は、一般的に、タンパク質サンプルを調製するステップ、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲルによる電気泳動（例えば、抗原の分子量に依存する８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルから、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、またはナイロン等の膜へ移すステップ、ブロッキング溶液（例えば、３％のＢＳＡまたは無脂肪ミルクを含むＰＢＳ）中で膜をブロックするステップ、膜を洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄するステップ、（ブロッキング緩衝液で希釈された）本発明のアルブミン融合タンパク質を膜に適用するステップ、洗浄緩衝液中で膜を洗浄するステップ、ブロッキング緩衝液で希釈された、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、^３２Ｐまたは^１２５Ｉ））に共役した２次抗体（アルブミン融合タンパク質、例えば、抗ヒト血清アルブミン抗体を認識する）を適用するステップ、洗浄緩衝液中で膜を洗浄するステップ、および抗原の存在を検出するステップ、を含む。当業者は、検出されるシグナルを増加し、かつバックグランドノイズを減少するように修正可能なパラメータに関して精通し得る。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ、ｅｄｓ、１９９４、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、１０．８．１を参照されたい。

ＥＬＩＳＡは、抗原を調製するステップ、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原で被覆するステップ、ウエルに結合しなかった抗原を洗い流すステップ、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスフォターゼ）等の検出可能な化合物に共役される本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む）をウェルに添加して、ある時間インキュベートするステップ、非結合または非特異的結合アルブミン融合タンパク質を洗い流すステップ、およびウェルを被覆する抗原に特異的に結合したアルブミン融合タンパク質の存在を検出するステップを含む。ＥＬＩＳＡでは、アルブミン融合タンパク質は、検出可能な化合物に共役される必要はなく、その代わりに、検出可能な化合物に共役された２次抗体（アルブミン融合タンパク質を認識する）がウェルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原で被覆する代わりに、アルブミン融合タンパク質は、ウェルに被覆され得る。この場合、検出可能な分子は、酵素基質等（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）の検出可能な化合物に共役された抗原であり得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように修正可能なパラメータ、ならびに当該分野において既知のＥＬＩＳＡの他の変形に関して精通し得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．、ｅｄｓ、１９９４年、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、１１．２．１を参照されたい。

タンパク質、抗原、またはエピトープに対するアルブミン融合タンパク質の結合親和性およびアルブミン融合タンパク質−タンパク質／抗原／エピトープ相互作用のオフ速度が、競合結合アッセイにより判断可能である。競合結合アッセイの一例として、ラジオイムノアッセイが挙げられ、このラジオムノアッセイは、標識抗原（例えば、^３Ｈまたは^１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での本発明のアルブミン融合タンパク質との培養、および標識抗原に結合した抗体の検出を含む。アルブミン融合タンパク質の、特定のタンパク質、抗原、またはエピトープに対する親和性、および結合オフ速度は、スキャッチャードプロット分析によるデータから判断可能である。また、アルブミン融合タンパク質と同一のタンパク質、抗原、またはエピトープに結合する第２のタンパク質との競合も、ラジオイムノアッセイを使用して判断可能である。この場合、タンパク質、抗原、またはエピトープは、本発明のアルブミン融合タンパク質と同一のタンパク質、抗原、またはエピトープに結合する漸増量の非標識第２タンパク質の存在下で、標識化合物（例えば、^３Ｈまたは^１２５Ｉ）に共役されたアルブミン融合タンパク質でインキュベートされる。

ある実施形態において、ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析を使用して、タンパク質、抗原、またはエピトープに対する本発明のアルブミン融合タンパク質の結合のオン速度およびオフ速度を判断する。ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析は、その表面上にそれぞれ固定された特異的ポリペプチド、抗原もしくはエピトープ、アルブミン融合タンパク質との、チップからのタンパク質、または特異的ポリペプチド、抗原もしくはエピトープの結合および解離を分析するステップを含む。

アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質に結合する抗体も、所定のタンパク質または抗原、例えば、それらが特異的に結合する抗原に対する結合親和性に関して、記載または特定され得る。結合親和性には、５Ｘ１０^−２Ｍ、１０^−２Ｍ、５Ｘ１０^−３Ｍ、１０^−３Ｍ、５Ｘ１０^−４Ｍ、１０^−４Ｍ未満の解離定数つまりＫｄを有する親和性が含まれる。他の結合親和性には、５Ｘ１０^−５Ｍ、１０^−５Ｍ、５Ｘ１０^−６Ｍ、１０^−６Ｍ、５Ｘ１０^−７Ｍ、１０^７Ｍ、５Ｘ１０^−８Ｍ、または１０^−８Ｍ未満の解離定数つまりＫｄを有する親和性が含まれる。追加の結合親和性には、５Ｘ１０^−９Ｍ、１０^−９Ｍ、５Ｘ１０^−１０Ｍ、１０^−１０Ｍ、５Ｘ１０^−１１Ｍ、１０^−１１Ｍ、５Ｘ１０^−１２Ｍ、^{１０−１２}Ｍ、５Ｘ１０^−１３Ｍ、１０^−１３Ｍ、５Ｘ１０^−１４Ｍ、１０^−１４Ｍ、５Ｘ１０^−１５Ｍ、または１０^−１５未満の解離定数つまりＫｄを有する親和性が含まれる。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質に結合する抗体のうちの少なくともフラグメントもしくは変異体を含む）の価およびその対応する抗体の価を考慮すると、治療用タンパク質に結合する対応する抗体（アルブミンに融合していない）の親和性と類似する所定のタンパク質もしくはエピトープに対する親和性を有する。さらに、本明細書中に記載のアッセイ（実施例および表１参照）または当該分野で既知であるアッセイは、アルブミン融合タンパク質ならびにそのフラグメント、変異体、および誘導体が、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／またはアルブミン部分のいずれかに関連する生物学的活性および／または治療的活性を（体外または体内のいずれかで）引き起こす能力を測定するために、慣用的に適用され得る。他の方法は、当業者に既知であり、また本発明の範囲内である。

アルブミン

上述のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは変異体と、ヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは変異体とを含み、これらは、例えば、遺伝子融合によって相互に関連付けられている。

追加の実施形態は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは変異体と、ヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは変異体とを含み、これらは、化学的結合によって相互に連結されている。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）という用語は、本明細書中において交換可能に使用される。「アルブミン」および「血清アルブミン」という用語は、より広い意味であり、ヒト血清アルブミン（ならびにそのフラグメントおよび変異体）ならびに他の種からのアルブミン（ならびにそのフラグメントおよび変異体）を包含する。

本明細書中で使用する際、「アルブミン」は、アルブミンの１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）を有する、アルブミンのタンパク質もしくはアミノ酸配列、またはアルブミンのフラグメントもしくは変異体を総称して指す。具体的には、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはそのフラグメント（例えば、欧州特許第２０１２３９号、欧州特許第３２２０９４号、国際公開第ＷＯ９７／２４４４５号、国際公開第ＷＯ９５／２３８５７号参照）を指し、特に、図１および配列番号１に示されるヒトアルブミンの成熟形態、あるいは他の脊椎動物からのアルブミン、またはその分子もしくはフラグメントの類似体もしくは変異体を指す。

いくつかの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質において使用されるヒト血清アルブミンは、配列番号１に関する以下の組の点変異のうちの片方または両方を含む。Ｌｅｕ−４０７からＡｌａ、Ｌｅｕ−４０８からＶａｌ、Ｖａｌ−４０９からＡｌａ、およびＡｒｇ−４１０からＡｌａ、またはＡｒｇ−４１０からＡ、Ｌｙｓ−４１３からＧｌｎ、およびＬｙｓ−４１４からＧｌｎ（例えば、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開番号第ＷＯ９５／２３８５７号を参照）。他の実施形態において、上述の点変異の組の片方または両方を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母Ｙａｐ３ｐタンパク質切断に対して改善した安定性／抵抗性を有し、これにより、酵母宿主細胞中で発現される組み換えアルブミン融合タンパク質の生成増加が可能になる。

本明細書中で使用する場合、治療用タンパク質の治療的活性または貯蔵寿命を延長するに十分なアルブミン部分は、タンパク質の治療的活性またはプラズマ安定性を安定化または延長するために十分な長さまたは構造を有し、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分の貯蔵寿命またはプラズマ安定性が、非融合状態における貯蔵寿命またはプラズマ安定性と比較して延長または長期化されるような、アルブミン部分を指す。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、上述のＨＡ配列の全長を含んでもよく、または治療的活性を安定化または延長可能な１つ以上のそのフラグメントを含んでもよい。このようなフラグメントは、１０個以上のアミノ酸の長さであってもよく、またはＨＡ配列からの約１５個、２０個、２５個、３０個、５０個以上の連続するアミノ酸を含んでもよく、またはＨＡの特定のドメインの一部または全部を含み得る。例えば、最初の２つの免疫グロブリン様ドメインに及ぶＨＡの１つ以上のフラグメントを使用することができる。ある実施形態において、このＨＡフラグメントは、ＨＡの成熟形態である。

本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、正常ＨＡの変異体であり得る。また、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク部分は、本明細書に記載される治療用タンパク質の変異体であり得る。「変異体」という用語は、保存的または非保存的のいずれかである挿入、欠失、および置換を含み、この場合、このような変化は、アルブミンの腫脹の有用なリガンド結合特性および非免疫原性特性のうちの１つ以上、または治療用タンパク質の治療的活性を付与する活性部位もしくは活性ドメインを実質的に変化しない。

具体的には、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ヒトアルブミンの天然に存在する多型変異体、およびヒトアルブミンのフラグメント、例えば、欧州特許第３２２０９４号に開示されるフラグメント（つまり、ＨＡ（Ｐｎ）であり、ここで、ｎは、３６９〜４１９である））を含んでもよい。アルブミンは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来し得る。非哺乳動物アルブミンには、雌鳥およびサケが挙げられるがこれらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、治療用タンパク質部分とは異なる動物由来であり得る。

一般的に言うと、ＨＡのフラグメントまたは変異体は、少なくとも１００アミノ酸長、例えば、少なくとも１５０アミノ酸長である。ＨＡ変異体は、ＨＡの少なくとも１つのドメイン全体、例えば、ドメイン１（配列番号１のアミノ酸１〜１９４）、ドメイン２（配列番号１のアミノ酸１９５〜３８７）、ドメイン３（配列番号１のアミノ酸３８８〜５８５）、ドメイン１および２（配列番号１の１〜３８７）、ドメイン２および３（配列番号１の１９５〜５８５）、またはドメイン１および３（配列番号１のアミノ酸１〜１９４および配列番号１のアミノ酸３８８〜５８５）から成るか、あるいはこれらを含んでもよい。各ドメイン自体は、２つの相同なサブドメイン、つまり、１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１、および５１２〜５８５から構成され、可撓性のサブドメイン間リンカー領域が、残基Ｌｙｓ１０６からＧｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２からＶａｌ３１５、およびＧｌｕ４９２からＡｌａ５１１を含む。

一態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメインもしくはドメインまたはその保存的修飾体を含む。融合物がサブドメインに基づく場合、隣接リンカーのうちの一部または全部は、治療用タンパク質部分に連結するために使用され得る。

治療用タンパク質に特異的に結合する抗体も治療用タンパク質

本発明は、表１に開示される治療用タンパク質に特異的に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質も包含する。「治療用タンパク質」という用語が、治療用タンパク質（例えば、表１の列Ｉに記載される）に結合する抗体ならびにそのフラグメントおよび変異体を包含することが、具体的に想定される。したがって、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは変異体、および／または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含み得る。

抗体の構造およびバックグラウンド

基本的な抗体構造単位は、４量体を含むことが既知である。各４量体は、２つの同一の対のポリペプチド鎖から構成され、各対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）および１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０アミノ酸以上の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεに分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥに定義する。一般的には、ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈａｐｔｅｒｓ３−５（Ｐａｕｌ，Ｗ、ｅｄ．、４ｔｈｅｄ．ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９８）（全目的のために、参照することによってその全体が組み込まれる）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。

したがって、無傷ＩｇＧ抗体は、２つの結合部位を有する。２官能性抗体または２重特異性抗体の場合以外において、２つの結合部位は同一である。

鎖は、全て、３つの超可変領域により連結された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を呈し、それは、相補性決定領域つまりＣＤＲとも呼ばれる。ＣＤＲ領域は、一般的に、抗原と接触してその特異性を判断する抗体部分である。各対の重鎖および軽鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域により整合され、それにより、特異的エピトープに結合することが可能になる。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。可変領域は、重鎖定常領域または軽鎖定常領域に連結される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔの定義に従う、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｒｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７ａｎｄ１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆ＬｅｓｋＪ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８〜８８３（１９８９）。

本明細書で使用する際、「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子（例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲ領域を含む分子）を指す。アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体には、単クローン抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖｓ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ´）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に特異的な抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメント（例えば、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、または１つ以上のＣＤＲ領域）を含むが、これらに限定されない。

治療用タンパク質に結合する抗体

本発明は、治療用タンパク質（例えば、表１に開示される）に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を包含する。

治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源由来であり得る。抗体は、ヒト、ネズミ（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリの抗体であり得る。一実施形態において、抗体は、ヒト抗体である。本明細書中で使用する際、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、また、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、およびヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたゼノマウスもしくは他の生物から単離された抗体を含む。

治療用タンパク質に結合し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、または任意のサブクラスであることが可能である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体分子は、ＩｇＧ１である。他の実施形態において、治療用タンパク質に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ２である。他の実施形態において、治療用タンパク質に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ４である。

ある実施形態において、治療用タンパク質に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、本発明のヒト抗原結合フラグメントであり、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、およびＦ（ａｂ´）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ならびにＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが含まれるがこれらに限定されない。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を、単独で、またはヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインの全部もしくは一部と組み合わせて含んでもよい。治療用タンパク質またはアルブミン融合タンパク質に結合し得る追加の抗原結合タンパク質は、例えば、ＳｍａｌｌＭｏｄｕｌａｒＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ＳＭＩＰＳ（登録商標））を含む（例えば、米国公開特許出願第２００５０２０２５３４号参照）。

治療用タンパク質に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、単一特異性、２重特異性、３重特異性、またはより多重の特異性であり得る。多重特異性抗体は、治療用タンパク質の異なるエピトープに対して特異的であり得、または治療用タンパク質と、例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体材料等の異種エピトープの両方に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１７７１５号、第ＷＯ９２／０８８０２号、第ＷＯ９１／００３６０号、第ＷＯ９２／０５７９３号、Ｔｕｔｔｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）、米国特許第４，４７４，８９３号、第４，７１４，６８１号、第４，９２５，６４８号、第５，５７３，９２０号、第５，６０１，８１９号、Ｋｏｓｔｅｌｎｙｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。

治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体は、２重特異性または２官能性であってもよく、これは、抗体が２つの異なる重鎖／軽鎖対と２つの異なる結合部位とを有する人工的ハイブリッド抗体であることを意味する。２重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ´フラグメントの結合を含む、多種多様な方法により産生可能である。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙｅｔａｌ．、ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７１５５３（１９９２）を参照されたい。さらに、２重特異性抗体は、「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｎｅｒｅｔａｌ．、「Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ’：ｓｍａｌｌｂｉｖａｌｅｎｔａｎｄｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙｆｒａｇｍｅｎｔｓ」ＰＮＡＳＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）または「ジャヌシン」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒｅｔａｌ．、「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）ｔａｒｇｅｔｃｙｔｏｔｏｘｉｃｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｏｎＨＩＶｉｎｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓ」ＥＭＢＯＪ１０：３６５５−３６５９（１９９１）、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒｅｔａｌ．、「Ｊａｎｕｓｉｎ：ｎｅｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｓｉｇｎｆｏｒｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅａｇｅｎｔｓ」ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒＳｕｐｐｌ７：５１−５２（１９９２））として形成され得る。

また、本発明は、本明細書中に記載の抗体または当該分野で既知である抗体のフラグメントまたは変異体（誘導体を含む）を含む、アルブミン融合タンパク質も提供する。当業者に既知である標準的技術を使用して、本発明の分子をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することが可能であり、例えば、アミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発を含む。ある実施形態において、変異体（誘導体を含む）は、参照ＶＨドメイン、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬドメイン、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３に対して、５０個未満のアミノ酸置換、４０個未満のアミノ酸置換、３０個未満のアミノ酸置換、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換をコードする。具体的な実施形態において、変異体は、ＶＨＣＤＲ３の置換をコードする。ある実施形態において、変異体は、１つ以上の予測非必須アミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を有する。

治療用タンパク質に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、認識または特異的に結合する治療用タンパク質のエピトープまたは部分に関連して記載または特定され得る。また、治療用タンパク質または治療用タンパク質の特定のエピトープに特異的に結合する抗体は、排除され得る。したがって、本発明は、治療用タンパク質を特異的に結合し、その排除を可能にする抗体を包含する。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、その抗体自体の非融合フラグメントまたは変異体と同一のエピトープに結合する。

また、治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体も、その交差反応性に関連して記載または特定され得る。治療用タンパク質の他の任意の類似体、相同分子種、または同族体に結合しない抗体が含まれる。また、治療用タンパク質に対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の配列同一性（当該分野で既知の方法および本明細書中に記載の方法を使用して計算する場合）を有するポリペプチドを結合する抗体も、本発明に含まれる。具体的な実施形態において、治療用タンパク質に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、ヒトタンパク質の、マウス同族体、ラット同族体および／またはウサギ同族体、ならびに対応するそれらのエピトープと交差反応する。また、治療用タンパク質に対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の配列同一性（当該分野で既知の方法および本明細書中に記載の方法を使用して計算する場合）を有するポリペプチドに結合しない抗体も、本発明に含まれる。具体的な実施形態において、上述の交差反応性は、本明細書中に開示される任意の単一の特異的な抗原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチド、あるいは特異的な抗原性ポリペプチドおよび／または免疫原性ポリペプチドのうちの２個、３個、４個、５個以上の組み合わせに関する。追加の実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、その特定の抗体自体のフラグメントまたは変異体と比較して、類似または実質的に同一な交差反応性を有する。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書中に記載される）において治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合する抗体がさらに含まれる。また、治療用タンパク質に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体も、本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性に関連して記述または特定され得る。結合親和性には、５Ｘ１０^−２Ｍ、１０^−２Ｍ、５Ｘ１０^−３Ｍ、１０^−３Ｍ、５Ｘ１０^−４Ｍ、１０^−４Ｍ未満の解離定数つまりＫｄを有する親和性が含まれる。他の結合親和性には、５Ｘ１０^−５Ｍ、１０^−５Ｍ、５Ｘ１０^−６Ｍ、１０^−６Ｍ、５Ｘ１０^−７Ｍ、１０^７Ｍ、５Ｘ１０^−８Ｍ、または１０^−８Ｍ未満の解離定数つまりＫｄを有する親和性が含まれる。さらに、結合親和性には、５Ｘ１０^−９Ｍ、１０^−９Ｍ、５Ｘ１０^−１０Ｍ、１０^−１０Ｍ、５Ｘ１０^−１１Ｍ、１０^−１１Ｍ、５Ｘ１０^−１２Ｍ、^{１０−１２}Ｍ、５Ｘ１０^−１３Ｍ、１０^−１３Ｍ、５Ｘ１０^−１４Ｍ、１０^−１４Ｍ、５Ｘ１０^−１５Ｍ、または１０^−１５Ｍ未満の解離定数つまりＫｄを有する親和性が含まれる。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含む）の価およびその対応する抗体の価を考慮すると、治療用タンパク質に結合する対応する抗体（アルブミンに融合していない）の親和性と類似する所定のタンパク質もしくはエピトープに対する親和性を有する。

また、本発明は、競合的結合を判断するための当該分野で既知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載の免疫アッセイ）によって判断されるような、治療用タンパク質のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。いくつかの実施形態において、抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの結合を競合的に阻害する。他の実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質のエピトープへの２次抗体の結合を競合的に阻害する。他の追加の実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質のエピトープへの２次抗体の結合を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、競合的に阻害する。

治療用タンパク質に結合し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、その治療用タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとしての役割を果たすことができる。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとの受容体／リガンド相互作用を部分的または完全に妨げるする抗体を含む。本発明は、受容体特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方の特徴を有する。また、本発明は、リガンド結合を妨害しないが受容体活性化を妨害する受容体特異的抗体の特徴を有する。受容体活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書に記載の技術または当該分野で既知の技術により判断することができる。例えば、受容体活性化は、受容体のリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降とその後のウエスタンブロット分析（例えば、上述のような）によってその基質を検出することによって判断することができる。具体的な実施形態において、リガンド活性または受容体活性を、この抗体の非存在下におけるリガンド活性または受容体活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、その治療用タンパク質に結合する抗体の非融合フラグメントまたは変異体と比較して、リガンド結合の防止および／または受容体活性化の防止に関して、類似または実質的に類似の特徴を有する。

また、本発明は、リガンド結合および受容体活性の両方を妨げる受容体特異的抗体、ならびに受容体−リガンド複合体を認識し、かつ非結合受容体または非結合リガンドを特異的に認識しない受容体特異的抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドに結合しかつ受容体へのリガンドの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガントに結合することによって受容体活性化を妨げるが、リガンドが受容体に結合することを妨げない抗体を含む。さらに、本発明は、その受容体を活性化する抗体を含む。これらの抗体は、受容体アゴニストとしての役割を果たし得、つまり、例えば、受容体の２量体化を誘発することによって、リガンド媒介受容体活性化の生物学的活性の全部またはサブセットのいずれかを増強または活性化し得る。抗体は、治療用タンパク質（例えば、表１に開示）の特異的生物学的活性を含む生物学的活性に対するアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして特定され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で既知の方法を使用して作製可能である。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４０２８１号、米国特許第５，８１１，０９７号、Ｄｅｎｇｅｔａｌ．、Ｂｌｏｏｄ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）、Ｈａｒｒｏｐｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）、Ｚｈｕｅｔａｌ．、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）、Ｙｏｏｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）、Ｐｒａｔｅｔａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）、Ｐｉｔａｒｄｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）、Ｌｉａｕｔａｒｄｅｔａｌ．、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ９（４）：２３３−２４１（１９９７）、Ｃａｒｌｓｏｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）、Ｔａｒｙｍａｎｅｔａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ１４（４）：７５５−７６２（１９９５）、Ｍｕｌｌｅｒｅｔａｌ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）、Ｂａｒｔｕｎｅｋｅｔａｌ．、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ８（１）：１４−２０（１９９６）（これらの文献は全て、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質に結合する抗体の非融合フラグメントまたは変異体と比較して、類似または実質的に同一のアゴニスト特性またはアンタゴニスト特性を有する。

治療用タンパク質に結合し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体を使用して、例えば、治療用タンパク質を精製、検出、および標的化してもよく、これらは、体外および体内の両方の診断方法および治療方法を含む。例えば、抗体は、生体サンプルにおける治療用タンパク質のレベルを定性的および定量的に測定するための免疫アッセイにおける有用性を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗｅｔａｌ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、２ｎｄｅｄ．１９８８）（参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。同様に、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質を使用して、例えば、治療用タンパク質を精製、検出、および標的化してもよく、これらは、体外および体内の両方の診断方法および治療方法を含む。

治療用タンパク質に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、すなわち、抗体への任意の型の分子の共有結合によって修飾される誘導体を含む。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結等によって修飾された抗体を含む。多数の化学修飾のうちのいずれかも、既知の技術によって実行されてもよく、この技術には、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等が含まれるがこれらに限定されない。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。また、本発明のアルブミン融合タンパク質も、上記のように修飾され得る。

治療用タンパク質に結合する抗体の生成方法

治療用タンパク質に結合し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、当該分野で既知の任意の適切な方法によって生成され得る。該当する抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で既知の種々の手順によって産生され得る。例えば、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらに限定されない種々の宿主動物に治療用タンパク質を投与して、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘発し得る。種々のアジュバントを使用して、宿主種に応じて免疫反応を増加させることができ、また、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン等の界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウムパルバム等の潜在的に有用なヒトアジュバントを含むがこれらに限定されない。このようなアジュバントも当該分野において既知である。

単クローン抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、およびファージ提示技術、またはこれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で既知の多種多様な技術を使用して調製可能である。例えば、単クローン抗体は、当該分野で既知の技術、および例えば、Ｈａｒｌｏｗｅｔａｌ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、２ｎｄｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇｅｔａｌ．、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＴ−ＣｅｌｌＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記参考文献は、参照することによってその全体が組み込まれる）に教示される技術を含むハイブリドーマ技術を使用して産生可能である。本明細書中で使用する際、「単クローン抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生された抗体に限定されない。「単クローン抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来し、それが産生される方法に由来しない抗体を指す。

ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法は、当該分野において慣用的かつ既知である。非限定的な例において、マウスは、治療用タンパク質またはそのフラグメントもしくは変異体、アルブミン融合タンパク質、あるいはこのような治療用タンパク質またはそのフラグメントもしくは変異体またはアルブミン融合タンパク質を発現する細胞を用いて免疫されることが可能である。免疫応答が検出されると、例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出されると、マウスの脾臓を摘出して脾細胞を単離する。次に、脾細胞を既知の技術によって任意の適切な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限界希釈によって選択およびクローン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合可能な抗体を分泌する細胞について、当該分野で既知の方法によってアッセイする。一般的に、高いレベルの抗体を含有する腹水が、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫することによって、生成可能である。

したがって、本発明は、単クローン抗体と、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞をインキュベートするステップを含む方法によって生成される抗体とを生成する方法を提供し、この場合、例えば、ハイブリドーマは、本発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合させ、次に、本発明のポリペプチドと結合可能な抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される。

多クローン性ヒトＢ細胞株および単クローン性ヒトＢ細胞株の両方を産生するための別の既知の方法は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を使用する形質転換である。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株を生成するためのプロトコルは、当該分野において通常既知であり、例えば、参照することによって本明細書に組み込まれるＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．、Ｅｄｓ．、１９９４、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹの第７．２２章に要約されるプロトコルが挙げられる。形質転換のためのＢ細胞源は、通常、ヒト末梢血であるが、形質転換のためのＢ細胞は、リンパ節、扁桃腺、脾臓、腫瘍組織、および感染組織を含むがこれらに限定されない他の細胞源に由来し得る。組織は、一般的に、ＥＢＶ形質転換前に、単一細胞懸濁物にされる。さらに、抗ＥＢＶ抗体に対して血清陽性である個体由来のＴ細胞が、ＥＢＶによるＢ細胞不死化を抑制可能であるため、Ｂ細胞含有サンプル中のＴ細胞を物理的に除去または不活化する（例えば、シクロスポリンＡによる処理によって）ためのステップを取ることができる。

一般的に、ヒトＢ細胞を含有するサンプルに、ＥＢＶが接種され、３〜４週間培養される。典型的なＥＢＶ供給源は、Ｂ９５−８細胞株（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１４９２）の培養上清である。ＥＢＶ形質転換の物理的徴候は、一般的に、３〜４週間の培養期間の終了時に観察され得る。位相差顕微鏡によって、形質転換細胞は、大きく、明確に、毛様に表示可能であり、高度な細胞クラスターに凝集する傾向があり得る。最初は、ＥＢＶ株は、一般的に、多クローン性である。しかしながら、長期の細胞培養期間において、ＥＢＶ株は、特定のＢ細胞クローンの選択的増殖の結果として、単クローン性または多クローン性になり得る。あるいは、多クローン性ＥＢＶ形質転換株は、サブクローン化されてもよく（例えば、限界希釈培養により）、または適切な融合パートナーと融合されて、単クローンＢ細胞株を得るために限界希釈でプレートされ得る。ＥＢＶ形質転換細胞株のための適切な融合パートナーには、マウス骨髄腫細胞株（例えば、ＳＰ２／０、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）、ヘテロ骨髄腫細胞株（ヒト×マウス、例えば、ＳＰＡＭ−８、ＳＢＣ−Ｈ２０、およびＣＢ−Ｆ７）、およびヒト細胞株（例えば、ＧＭ１５００、ＳＫＯ−００７、ＲＰＭＩ８２２６、およびＫＲ−４）が含まれる。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントに対するヒト多クローン性抗体またはヒト単クローン性抗体の生成方法も提供し、これは、ヒトＢ細胞のＥＢＶ形質転換を含む。

特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の技術によって生成され得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ´）の２フラグメントは、（Ｆａｂフラグメントを産生するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ´）の２フラグメントを産生するために）ペプシン等の酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ´）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。

例えば、治療用タンパク質に結合する抗体も、当該分野で既知の種々のファージ提示法を使用して生成可能である。ファージ提示方法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。特定の実施形態において、このようなファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはネズミ）から発現される抗原結合ドメインを提示することが可能である。該当する抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原で選択または同定可能であり、例えば、標識した抗原あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を使用する。これらの方法において使用するファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組み換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド安定化されたＦｖ抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージである。治療用タンパク質に結合する抗体を作製するために使用可能なファージ提示方法の例として、Ｂｒｉｎｋｍａｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８２：４１−５０（１９９５）、Ａｍｅｓｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８４：１７７−１８６（１９９５）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈｅｔａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）、Ｐｅｒｓｉｃｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ１８７９−１８（１９９７）、Ｂｕｒｔｏｎｅｔａｌ．、ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５７：１９１−２８０（１９９４）、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ第９１／０１１３４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０２８０９号、第ＷＯ９１／１０７３７号、第ＷＯ９２／０１０４７号、第ＷＯ９２／１８６１９号、第ＷＯ９３／１１２３６号、第ＷＯ９５／１５９８２号、第ＷＯ９５／２０４０１号、ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号、および第５，９６９，１０８号において開示されるものが挙げられ、これらの各々は、参照することによって本明細書中において組み込まれる。

上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または他の任意の所望の抗原結合フラグメントを生成するために単離および使用可能であり、また、例えば、以下に詳述するように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現可能である。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、およびＦ（ａｂ´）の２フラグメントを組み換え的に産生するための技術も、当該分野で既知の方法を使用して用いることが可能であり、このような方法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２２３２４号、Ｍｕｌｌｉｎａｘｅｔａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１２（６）：８６４−８６９（１９９２）、およびＳａｗａｉｅｔａｌ．、ＡＪＲＩ３４：２６−３４（１９９５）、およびＢｅｔｔｅｒｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、参照することによってその全体が組み込まれる）に開示される。

単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために使用可能な技術の例として、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号、Ｈｕｓｔｏｎｅｔａｌ．、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２０３：４６〜８８（１９９１）、Ｓｈｕｅｔａｌ．、ＰＮＡＳ９０：７９９５〜７９９９（１９９３）、およびＳｋｅｒｒａｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０３８〜１０４０（１９８８）に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体の体内における使用および体外検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を使用することができる。キメラ抗体は、ネズミ単クローン抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体等の、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を産生する方法は、当該分野において既知である。例えば、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれるＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２（１９８５）、Ｏｉｅｔａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４（１９８６）、Ｇｉｌｌｉｅｓｅｔａｌ．、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１２５：１９１−２０２、米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、および第４，８１６３９７号を参照されたい。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を変化、例えば、改善させるために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で既知の方法によって同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって行われる（例えば、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、Ｑｕｅｅｎｅｔａｌ．、米国特許第５，５８５，０８９号、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３（１９８８）を参照されたい）。抗体は、例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３９，４００号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０９９６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、および第５，５８５，０８９号）、ベニア化または表面置換化（欧州特許第５９２，１０６号、第５１９，５９６号、Ｐａｄｌａｎ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａｅｔａｌ．、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７（６）：８０５−８１４（１９９４）、Ｒｏｇｕｓｋａｅｔａｌ．、ＰＮＡＳ９１：９６９−７３（１９９４）、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当該分野で既知の多種多様な技術を使用してヒト化されることが可能である。

完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に関して特に所望される。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する上述のファージ提示方法を含む当該分野で既知の多種多様な方法により作製可能である。米国特許第４，４４４，８８７号、第４，７１６，１１１号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ９８／４６６４５号、第ＷＯ９８／５０４３３号、第ＷＯ９８／２４８９３号、第ＷＯ９８／１６６５４号、第ＷＯ９６／３４０９６号、第ＷＯ９６／３３７３５号、および第ＷＯ９１／１０７４１号も参照され、これらのうちの各々は、参照することによってその全体が本明細書中に組み込まれる。

また、ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンの発現の能力は無いが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現可能なトランスジェニックマウスを使用して産生可能である。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子の複合体は、無作為にまたは相同的組み換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加え、マウスの胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組み換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別々にまたは同時に非機能的に付与され得る。具体的には、ＪＨ領域のホモ接合性欠失は、内因性抗体の産生を妨げる。修飾された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞中に微量注入してキメラマウスを産生する。次に、キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を産生する。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全体または一部を使用して通常の方式で免疫する。抗原に対する単クローン抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して免疫したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスに保持されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再配置し、その後、クラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。したがって、このような技術を使用して、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇａｎｄＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい。ヒト抗体およびヒト単クローン抗体を産生するためのこの技術のならびにこのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細な考察については、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／２４８９３号、第ＷＯ９２／０１０４７号、第ＷＯ９６／３４０９６号、第ＷＯ９６／３３７３５号、欧州特許第０５９８８７７号、米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、第５，８８５，７９３号、第５，９１６，７７１号、第５，９３９，５９８号、第６，０７５，１８１号、および第６，１１４，５９８号を参照されたく、これらは参照することによってその全体が本明細書中に組み込まれる。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）等の会社は、上述の技術に類似した技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。

選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技術を使用して生成可能である。本手法において、選択された非ヒト単クローン抗体、例えば、マウス抗体を使用して、同一のエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓｅｔａｌ．、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：８９９−９０３（１９８８））。

抗体をコードするポリヌクレオチド

さらに、本発明は、抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件下、例えば、上記に定義されるような条件下において、例えば、治療用タンパク質と特異的に結合する抗体、およびさらなる態様において、表２の「配列番号Ｚ」の列に開示される「治療用タンパク質：Ｘ」のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。

ポリヌクレオチドは、当該分野で既知の任意の方法によって入手されてもよく、また、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を判断することができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブリされてもよく（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒｅｔａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１７：２４２（１９９４）に記載される）、これは、簡潔に言うと、抗体をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、および連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を伴う。

あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な源からの核酸から生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンは、入手不可能であるが、抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成されてもよく、または適切な源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞等の、抗体を発現する任意の組織もしくは細胞）から生成されたｃＤＮＡライブラリー、またはこれから単離された核酸、例えばポリＡ＋ＲＮＡ）から、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーから、例えばｃＤＮＡクローンを同定するために、配列の３´末端および５´末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって入手することができる。次に、ＰＣＲによって生成された増幅核酸は、当該分野で既知の任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る（実施例６５を参照）。

抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が判断されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作に関して当該分野で既知の方法（例えば、組み換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ等（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．、１９９０、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、２ｄＥｄ．、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹａｎｄＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．、ｅｄｓ．、１９９８、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹに記載の技術を参照されたく、この両方は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる）を使用して操作されて、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を生成するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成し得る。

具体的な実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において既知の方法によって、例えば、配列超可変性の領域を判断するために、他の重鎖および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって、調査することができる。慣用的な組み換えＤＮＡ技術を使用して、１つ以上のＣＤＲが、上述のようにフレームワーク領域内に、例えば、非ヒト抗体をヒト化するためにヒトフレームワーク領域中に、挿入され得る。フレームワーク領域は天然に存在してもよく、またはコンセンサスフレームワーク領域であってもよく、また、例えば、ヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストに関しては、Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照されたい）。一態様において、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせによって生成されるポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。別の態様において、上記に考察するように、１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製されてもよく、例えば、アミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法を使用して、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製し得る。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本発明によって包含され、また当該分野の範囲内にある。

さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることによって、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４−６０８（１９８４）、Ｔａｋｅｄａｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２−４５４（１９８５））を使用することが可能である。上述のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、ネズミｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域、例えばヒト化抗体由来の可変領域を有する分子である。

あるいは、単鎖抗体の産生に関して記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３（１９８８）、およびＷａｒｄｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３３４：５４４−５４（１９８９））が、単鎖抗体を産生するように適合可能である。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されることによって形成され、単鎖ポリペプチドをもたらす。また、大腸菌における機能的Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術も使用され得る（Ｓｋｅｒｒａｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。

抗体の組み換え発現

抗体、またはそのフラグメント、誘導体、もしくは類似体（例えば、抗体の重鎖もしくは軽鎖または単鎖抗体）の組み換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部分（例えば、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードする本発明のポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で既知の技術を使用して、組み換えＤＮＡ技術によって産生され得る。したがって、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法が、本明細書に記載される。当業者に既知の方法を使用して、抗体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することが可能である。これらの方法には、例えば、体外組み換えＤＮＡ技術、合成技術、および体内遺伝子組み換えが含まれる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８６／０５８０７号、ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０１０３６号、および米国特許第５，１２２，４６４号を参照）をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく、またこの抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得る。

発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へ移入され、次に、トランスフェクト細胞は、抗体を産生するために、従来技術によって培養される。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。２重鎖抗体の発現に関するいくつかの実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、後述のように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中に同時発現され得る。

多種多様な宿主発現ベクター系を利用して、本発明の抗体分子を発現し得る。このような宿主発現系は、該当するコード配列を産生してその後精製し得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形質転換またはトランスフェクトされる場合に、原位置で本発明の抗体分子を発現し得る細胞を表わす。これらには、抗体をコードする配列を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、大腸菌、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の微生物、抗体をコードする配列を含有する組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス属、ピチア属）、抗体をコードする配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする配列を含有する組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組み換え発現構築物を保持する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）、が含まれるがこれらだけに限定されない。一態様において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ等の細菌細胞、およびさらなる態様において、特に、組み換え抗体分子全体の発現のために、真核細胞を使用して組み換え抗体分子を発現する。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要即時性初期遺伝子プロモーター要素等のベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳動物細胞は、抗体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ４５：１０１（１９８６）、Ｃｏｃｋｅｔｔｅｔａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２（１９９０））。

細菌系において、多くの発現ベクターは、抗体分子の発現を意図する使用に依存して有利に選択され得る。例えば、このようなタンパク質が多量に産生される場合、抗体分子の医薬組成物の生成のために、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベクターには、抗体をコードする配列がｌａｃＺコード領域でベクターにインフレームで個別に連結され、その結果、融合タンパク質が産生され得る大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒｅｔａｌ．、ＥＭＢＯＪ．２：１７９１（１９８３））、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）、ＶａｎＨｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））等が含まれるがこれらに限定されない。また、ｐＧＥＸベクターを使用して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現し得る。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、また、マトリクスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合し、その後遊離グルタチオン存在化で溶出することによって、溶解細胞から容易に精製可能である。ｐＧＥＸは、トロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計され、クローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から放出可能である。

昆虫系では、オートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖する。抗体をコードする配列は、ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされて、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。

哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスに基づく発現系が利用され得る。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、該当する抗体をコードする配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３部分リーダー配列、に連結され得る。次に、このキメラ遺伝子は、体外または体内での組み換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）における挿入によって、生存可能で、かつ感染した宿主において抗体分子を発現する能力のある組み換えウイルスがもたらされる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３５５−３５９（１９８４）参照）。また、特異的開始シグナルが、挿入された抗体をコードする配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、開始コドンは、挿入部分全体の翻訳を確実にするように、所望のコード配列の読み枠と同相でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方を有することが可能である。適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を含むことによって、発現の効率を高め得る（Ｂｉｔｔｎｅｒｅｔａｌ．、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）参照）。

さらに、挿入配列の発現を調節し、または、所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択し得る。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび修飾のための、特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された異種タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするように選択可能である。この目的のために、遺伝子産物の、１次転写、グリコシル化、およびリン酸化の適切なプロセシングのための細胞機構を所有する真核宿主細胞を使用し得る。このような哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および具体的には、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ等の乳癌細胞株、ならびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔ等の正常な乳腺細胞株を含むがこれらに限定されない。

ある実施形態において、組み換えタンパク質の長期間高収率産生のために、タンパク質は安定的に発現され得る。例えば、安定的に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製源を含有する発現ベクターを使用せずに、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換可能である。外来ＤＮＡの導入の後に、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖されて、次に、選択培地に切り替えられ得る。組み換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が、プラスミドをその染色体内に安定的に組み込み、増殖して増殖巣を形成し、次にこれはクローニングおよび増殖して細胞株になることを可能にする。本方法を有利に利用して、抗体分子を発現する細胞株を操作し得る。このような操作された細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。

多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ１１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むがこれらだけに限定されず、これらの遺伝子は、ｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ使用可能である。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用可能である。メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒｅｔａｌ．、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：３５７（１９８０）、Ｏ’Ｈａｒｅｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：１５２７（１９８１））、ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２０７２（１９８１））、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（ＣｌｉｎｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｙ１２：４８８−５０５、ＷｕａｎｄＷｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ３：８７〜９５（１９９１）、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）、Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：９２６−９３２（１９９３）、およびＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）、１９９３年５月、ＴＩＢＴＥＣＨ１１（５）：１５５−２１５）、ならびにハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ３０：１４７（１９８４））。組み換えＤＮＡ技術の分野で一般的に既知の方法は、所望の組み換えクローンを選択するために慣用的に適用されてもよく、また、このような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）、ａｎｄｉｎＣｈａｐｔｅｒｓ１２ａｎｄ１３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（ｅｄｓ）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載され、これらは参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加可能である（再考のために、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎａｎｄＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、ＴｈｅｕｓｅｏｆｖｅｃｔｏｒｓｂａｓｅｄｏｎｇｅｎｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｌｏｎｅｄｇｅｎｅｓｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓｉｎＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３．（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８７）を参照されたい）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤のレベルにおける増加によって、マーカー遺伝子のコピーの数が増加する。増幅領域は抗体遺伝子と関連しているので、抗体の産生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。

グルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを選択マーカーとして使用するベクターは、それぞれ、薬物メチオニンスルホキシミンまたはメトトレキセートの存在下で、増幅可能である。グルタミンシンターゼベースのベクターの利点は、グルタミンシンターゼ陰性の細胞株（例えば、ネズミ骨髄腫細胞株、ＮＳ０）の入手可能性である。また、グルタミンシンターゼ発現系は、内因性遺伝子の機能を妨げるさらなる阻害剤を提供することによって、グルタミンシンターゼ発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）において機能可能である。グルタミンシンターゼ発現系およびその成分は、第ＷＯ８７／０４４６２号、第ＷＯ８６／０５８０７号、第ＷＯ８９／０１０３６号、第ＷＯ８９／１０４０４号、および第ＷＯ９１／０６６５７号のＰＣＴ公開において記載され、これらは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本発明に従って使用され得るグルタミン合成酵素発現ベクターは、例えば、ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ、ＮＨ）を含む業者から市販されている。ネズミ骨髄腫細胞においてＧＣ発現系を使用する単クローン抗体の発現および産生は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎｅｔａｌ．、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６９（１９９２）ならびにＢｉｂｌｉａおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ１１：１（１９９５）に記載され、これらは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクター）で、同時にトランスフェクトされ得る。この２つのベクターは、同一の選択マーカーを含んでもよく、これによって重鎖および軽鎖のポリペプチドの等しい発現が可能になる。あるいは、重鎖および軽鎖両方のポリペプチドをコードし、発現すること可能な単一のベクターを使用し得る。このような状況において、過剰の毒性の遊離重鎖を回避するために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ３２２：５２（１９８６）、Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含んでもよい。

本発明の抗体分子が、動物によって産生され、化学的に合成され、または組み換え発現されると、当該分野で既知の免疫グロブリン分子の精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、具体的には、タンパク質Ａの後の特異的抗原に対する親和性による、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な技術によって精製され得る。さらに、治療用タンパク質に結合し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるまたはそれ以外の当該分野において既知の異種ポリペプチド配列に融合されて、精製を容易にすることが可能である。

抗体の修飾

治療療用タンパク質に結合する抗体またはフラグメントもしくは変異体は、精製を容易にするペプチド等のマーカー配列に融合可能である。他の実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ＥｔｏｎＡｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）において提供されるタグ）であり、このうちの多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球凝集素タグ（「ＨＡ」タグとも呼ばれる）（Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ３７：７６７（１９８４））、および「フラグ」タグが含まれるがこれらに限定されない。

本発明は、診断剤または治療剤に共役される抗体またはそのフラグメントをさらに含む。抗体を診断的に使用して、例えば、例えば所定の治療レジメンの有効性を判断するための臨床上の試験手順一部として、腫瘍の発生または進行を監視することが可能である。検出は、検出可能な物質に抗体を結合させることによって容易にすることが可能である。検出可能な物質の例として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光体、発光体、生物発光体、放射性物質、種々の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメント）に対して、直接的、または当該分野で既知の技術を使用する媒介物（例えば、当該分野で既知のリンカー等）を介して間接的のいずれかで、結合または共役され得る。例えば、本発明に従う診断としての使用のための抗体に共役可能な金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、適切な蛍光体の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられ、発光体の例として、ルミノールが挙げられ、生物発光体の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、ならびに適切な放射性物質の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、または９９Ｔｃが挙げられる。検出可能な物質の他の例は、本明細書中の他の箇所に記載されている。

さらに、本発明の抗体は、細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤等の細胞毒素、治療剤、または２１３Ｂｉ等のαエミッタ等の放射性金属イオン等の、治療用部分に共役され得る。細胞毒素または細胞毒性薬には、細胞に有害な任意の薬剤が含まれる。例として、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または同族体が含まれる。治療剤には、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルマスティン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アンスラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれるがこれらだけに限定されない。

本発明の共役体は、所定の生物学的応答を修飾するために使用可能であり、治療剤または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を所有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素等の毒素、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子、例えばＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭＩ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照）、ＡＩＭＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号参照）等のアポトーシス剤、例えばアンジオスタチンもしくはエンドスタチン等の血栓剤または血管新生阻害剤、例えばリンホカイン、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子等の生物学的応答修飾剤が含まれ得る。

また、抗体は、固体支持体に付着されてもよく、この固体支持体は、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが含まれるがこれらに限定されない。

このような治療用部分を抗体に共役するための技術は既知であり、例えば、Ａｒｎｏｎｅｔａｌ．、「ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＦｏｒＩｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇＯｆＤｒｕｇｓＩｎＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ」ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（ｅｄｓ．）、ｐｐ．２４３−５６（ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍｅｔａｌ．、「ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＦｏｒＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ」ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄｅｄ．）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（ｅｄｓ．）、ｐｐ．６２３〜５３（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ、「ＡｎｔｉｂｏｄｙＣａｒｒｉｅｒｓＯｆＣｙｔｏｔｏｘｉｃＡｇｅｎｔｓＩｎＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ：ＡＲｅｖｉｅｗ」ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（ｅｄｓ．）、ｐｐ．４７５−５０（１９８５）、「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ＡｎｄＦｕｔｕｒｅＰｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅＯｆＴｈｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＵｓｅＯｆＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＡｎｔｉｂｏｄｙＩｎＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ」ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＦｏｒＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎＡｎｄＴｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（ｅｄｓ．）、ｐｐ．３０３−１６（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ１９８５）、ａｎｄＴｈｏｒｐｅｅｔａｌ．、「ＴｈｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＡｎｄＣｙｔｏｔｏｘｉｃＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓＯｆＡｎｔｉｂｏｄｙ−ＴｏｘｉｎＣｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９〜５８（１９８２）を参照されたい。

あるいは、抗体は２次抗体に共役され、米国特許第４，６７６，９８０号（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）におけるＳｅｇａｌによって記載される抗体のヘテロ共役体を形成し得る。

単独で、あるいは細胞傷害性因子および／またはサイトカインと併用して投与される、抗体に共役する治療用部分を含むまたは含まない抗体を治療薬として使用することが可能である。

抗体−アルブミン融合

治療用タンパク質に結合し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体には、表１の「治療用タンパク質Ｘ」の列に開示される治療用タンパク質に結合する抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体が含まれるがこれらに限定されない。

具体的な実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは変異体は、ＶＨドメインを含むかまたはこれから成る。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは変異体は、１つ、２つ、または３つのＶＨＣＤＲを含むかまたはこれらから成る。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは変異体は、ＶＨＣＤＲ１を含むかまたはＶＨＣＤＲ１から成る。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは変異体は、ＶＨＣＤＲ２を含むかまたはこれから成る。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは変異体は、ＶＨＣＤＲ３を含むかまたはこれから成る。

具体的な実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは変異体は、ＶＬドメインを含むかまたはこれから成る。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは変異体は、１つ、２つ、または３つのＶＬＣＤＲを含むかまたはこれらから成る。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは変異体は、ＶＬＣＤＲ１を含むかまたはＶＬＣＤＲ１から成る。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは変異体は、ＶＬＣＤＲ２を含むかまたはこれから成る。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは変異体は、ＶＬＣＤＲ３を含むかまたはこれから成る。

他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは変異体は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＶＬＣＤＲおよび／またはＶＨＣＤＲを含むかまたはこれらから成る。

いくつかの実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合し、かつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは変異体は、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３等のペプチドリンカー（配列番号４）によって治療抗体のＶＬドメインに連結される、治療抗体のＶＨドメインを含むｓｃＦｖを含むかまたはこれから成る。

免疫表現型検査

本発明の抗体、あるいは治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、細胞株および生体サンプルの免疫表現型検査のために利用され得る。本発明の治療用タンパク質は、細胞特異的マーカーとして、またはより具体的には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で区別的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向される単クローン抗体（または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質）は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能にする。マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、単クローン抗体（または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質）を使用して種々の技術を利用することが可能であり、これらの技術には、抗体で被覆された磁気ビーズを使用する磁気分離、固体マトリクス（つまり、プレート）に付着する抗体を使用する「パンニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ、９６：７３７−４９（１９９９）を参照）が含まれる。

これらの技術によって、血液悪性疾患（すなわち、急性白血病患者における微小残留病変（ＭＲＤ）および移植片対宿主（ＧＶＨＤ）を予防するための移植における「非自己」細胞に見られるような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能になる。あるいは、これらの技術によって、ヒト臍帯血に見られるような増殖および／または分化を受けることが可能な、造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングが可能になる。

治療用タンパク質に結合する抗体、および治療用タンパク質に結合する抗体のフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質の特徴化

本発明の抗体、または治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、多種多様の方法で特徴化され得る。具体的には、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、本明細書中に記載の技術を使用して、または当該分野で既知の技術を慣用的に修正して、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に結合する抗体に対応する、治療用タンパク質に結合する抗体によって特異的に結合される同一の抗原に特異的に結合する能力に関してアッセイすることができる。

本発明の抗体、または治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質が、特異的タンパク質またはエピトープに（特異的に）結合する能力に関するアッセイは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４１２−４２１（１９９２））、ビーズ上で（例えば、Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ上で（例えば、Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ３６４：５５５−５５６（１９９３））、細菌上で（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上で（例えば、米国特許第５，５７１，６９８号、第５，４０３，４８４号、および第５，２２３，４０９号）、プラスミド上で（例えば、Ｃｕｌｌｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１８６５−１８６９（１９９２））、またはファージ上で（例えば、ＳｃｏｔｔａｎｄＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６−３９０（１９９０）、Ｄｅｖｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４−４０６（１９９０）、Ｃｗｉｒｌａｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６３７８−６３８２（１９９０）、Ｆｅｌｉｃｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０（１９９１））行なうことができる（これらの参考文献の各々は、参照することによってその全体が本明細書中に組み込まれる）。また、本発明の抗体、または治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、本明細書中に記載される技術または他の当該分野で既知の技術を使用するか、またはこれらを慣用的に修正して、特定のタンパク質またはエピトープに対するその特異性および親和性に関してアッセイすることができる。

治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該分野で既知の任意の方法によって、他の抗原（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体によって特異的に結合される分子と、配列保存／構造保存を有する分子）との交差反応性に関してアッセイすることができる。

（免疫特異的な）結合および交差反応性を分析するために使用可能な免疫アッセイには、いくつか例を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、タンパク質Ａ免疫アッセイ等の技術を使用する競合アッセイ系および非競合アッセイ系が含まれるがこれらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、かつ当該分野において既知である（例えば、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．、ｅｄｓ、１９９４、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋを参照）。例示的な免疫アッセイについて以下に簡潔に記載される（但し、これらは限定する目的で意図されない）。

免疫沈降プロトコルは、一般的に、タンパク質ホスファターゼ阻害剤および／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７２の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）等の溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解するステップ、本発明の抗体または治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を細胞溶解物に付加するステップ、ある時間（例えば、１〜４時間）４０℃でインキュベートするステップ、アルブミン融合タンパク質が治療抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む場合に、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｇセファロースビーズ（または適切な抗イディオタイプ抗体または抗アルブミン抗体で被覆されたビーズ）を細胞溶解物に付加するステップ、約１時間以上４０℃でインキュベートするステップ、溶解緩衝液中でビーズを洗浄するステップ、およびＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁するステップを含む。本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析によりアッセイ可能である。当業者は、抗体またはアルブミン融合タンパク質の抗原への結合を増加するように、かつバックグラウンドを減少させる（例えば、セファロースビーズで細胞溶解物を事前に清浄する）ように修正可能なパラメータについて精通し得る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．、ｅｄｓ．、１９９４、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、１０．１６．１を参照されたい。

ウエスタンブロット分析は、一般的に、タンパク質サンプルを調製するステップ、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲルによる電気泳動（例えば、抗原の分子量に依存する８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルから、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、またはナイロン等の膜へ移すステップ、ブロッキング溶液（例えば、３％のＢＳＡまたは無脂肪ミルクを含むＰＢＳ）中で膜をブロックするステップ、膜を洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄するステップ、（ブロッキング緩衝液で希釈された）本発明のアルブミン融合タンパク質を膜に適用するステップ、洗浄緩衝液中で膜を洗浄するステップ、ブロッキング緩衝液で希釈された、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、^３２Ｐまたは^１２５Ｉ）に共役した２次抗体（アルブミン融合タンパク質、例えば、抗ヒト血清アルブミン抗体を認識する）を適用するステップ、洗浄緩衝液中で膜を洗浄するステップ、および抗原の存在を検出するステップ、を含む。当業者は、検出されるシグナルを増加し、かつバックグランドノイズを減少するように修正可能なパラメータに関して精通し得る。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．、ｅｄｓ．、１９９４、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ．、１０．８．１を参照されたい。

ＥＬＩＳＡは、抗原を調製するステップ、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原で被覆するステップ、ウエルに結合しなかった抗原を洗い流すステップ、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスフォターゼ）等の検出可能な化合物に共役される本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む）をウェルに付加して、ある時間インキュベートするステップ、非結合または非特異的結合アルブミン融合タンパク質を洗い流すステップ、およびウェルを被覆する抗原に特異的に結合した抗体またはアルブミン融合タンパク質の存在を検出するステップを含む。ＥＬＩＳＡでは、抗体またはアルブミン融合タンパク質は、検出可能な化合物に共役される必要はなく、その代わりに、検出可能な化合物に共役された２次抗体（抗体またはアルブミン融合タンパク質をそれぞれ認識する）がウェルに付加され得る。さらに、ウェルを抗原で被覆する代わりに、抗体またはアルブミン融合タンパク質は、ウェルに被覆され得る。この場合、検出可能な分子は、酵素基質等（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）の検出可能な化合物に共役された抗原であり得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように修正可能なパラメータ、ならびに当該分野において既知のＥＬＩＳＡの他の変形に関して精通し得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．、ｅｄｓ．、１９９４、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、１１．２．１を参照されたい。

タンパク質、抗原、またはエピトープに対するアルブミン融合タンパク質の結合親和性およびアルブミン融合タンパク質−タンパク質／抗原／エピトープ相互作用のオフ速度が、競合結合アッセイにより判断可能である。競合結合アッセイの一例として、ラジオイムノアッセイが挙げられ、これは、標識した抗原（例えば、^３Ｈまたは^１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での本発明のアルブミン融合タンパク質とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含む。本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質の、特定のタンパク質、抗原、またはエピトープに対する親和性、および結合オフ速度は、スキャッチャードプロット分析によるデータから判断可能である。また、抗体またはアルブミン融合タンパク質と同一のタンパク質、抗原、またはエピトープに結合する第２のタンパク質との競合も、ラジオイムノアッセイを使用して判断可能である。この場合、このタンパク質、抗原、またはエピトープは、本発明のアルブミン融合タンパク質と同一のタンパク質、抗原、またはエピトープに結合する漸増量の非標識第２タンパク質の存在下で、標識した化合物（例えば、^３Ｈまたは^１２５Ｉ）に共役されたアルブミン融合タンパク質または抗体でインキュベートされる。

ある実施形態において、ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析を使用して、タンパク質、抗原、またはエピトープに対する本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質の結合のオン速度およびオフ速度を判断する。ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析は、その表面上にそれぞれ固定された特異的ポリペプチド、抗原もしくはエピトープ、抗体もしくはアルブミン融合タンパク質との、チップからの抗体、アルブミン融合タンパク質、または特異的ポリペプチド、抗原もしくはエピトープの、結合および解離を分析するステップを含む。

治療的使用

さらに、本発明は、抗体ベースの治療を対象とし、この治療は、１つ以上の開示された疾患、障害、または病状を治療するために、動物、例えば哺乳動物、またはヒトである患者に、本発明の抗体、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与するステップを伴う。本発明の治療化合物には、本発明の抗体（本明細書中に記載されるそのフラグメント、類似体、および誘導体を含む）、本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載されるそのフラグメント、類似体、および誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質、ならびにこのようなアルブミン融合タンパク質をコードする核酸が含まれるがこれらに限定されない。本発明の抗体、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を使用して、本明細書中に記載される任意の１つ以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない、治療用タンパク質の異常な発現および／または活性に関連付けられる疾患、障害、または病状を治療、阻害、または予防することが可能である。治療用タンパク質の異常な発現および／または活性に関連付けられる疾患、障害、または病状の治療および／または予防は、これらの疾患、障害、または病状に関連付けられる症状を緩和するステップを含むがこれに限定されない。本発明の抗体、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該分野において既知の薬学的に許容可能な組成物または本明細書中に記載される薬学的に許容可能な組成物において提供され得る。

具体的な実施形態において、本発明は、抗体ベースの治療を対象とし、この治療は、神経障害、免疫系障害、筋障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎障害、増殖障害、および／または癌性の疾患および病状、および／または本明細書中の他の箇所に記載されるものを含むがこれらだけに限定されない１つ以上の疾患、障害、または病状を治療するために、動物、例えば哺乳動物、またはヒトである患者に、本発明の抗体、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与するステップを伴う。本発明の治療化合物には、本発明の抗体（例えば、哺乳動物細胞の細胞表面上に発現される全長タンパク質に対する抗体、治療用タンパク質のエピトープに対する抗体、および本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載されるそのフラグメント、類似体、および誘導体、ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が含まれるがこれらに限定されない。本発明の抗体を使用して、本明細書中に記載される任意の１つ以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない、治療用タンパク質の異常な発現および／または活性に関連付けられる疾患、障害、または病状を治療、阻害、または予防することが可能である。治療用タンパク質の異常な発現および／または活性に関連付けられる疾患、障害、または病状の治療および／または予防は、これらの疾患、障害、または病状に関連付けられる症状を緩和するステップを含むがこれに限定されない。本発明の抗体、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該分野において既知の薬学的に許容可能な組成物または本明細書中に記載される薬学的に許容可能な組成物において提供され得る。

本発明の抗体、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を治療的に使用し得る方法の要約は、治療用タンパク質を、身体において局所的もしくは全身的に、または補体による媒介（ＣＤＣ）もしくはエフェクター細胞による媒介（ＡＤＣＣ）等の抗体の直接細胞傷害性によって結合するステップを含む。これらの手法のいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書中に提供される教示の助けによって、当業者は、本発明の抗体、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を、不要な実験を行わずに、診断、監視、または治療の目的のために使用する方法を把握するだろう。

本発明の抗体、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、他の単クローン抗体もしくはキメラ抗体と組み合わせて、または例えば抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性が増加する役割を果たす、例えばリンホカインもしくは造血増殖因子（ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７等）と組み合わせて有利に利用され得る。

本発明の抗体、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、単独で、または他の型の治療（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、および抗腫瘍薬）と組み合わせて投与され得る。一般的に、患者と同一の種である本来の種または反応性種（抗体の場合）の産物の投与を投与し得る。したがって、ある実施形態において、ヒト抗体、フラグメント誘導体、類似体、または核酸は、療法または予防のためにヒト患者に投与される。

一実施形態において、治療用タンパク質、そのフラグメントもしくは領域に対する高親和性および／または強力な体内阻害抗体および／または中和抗体（またはこのような抗体に関連するアルブミン融合タンパク質）は、そのフラグメントを含む本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを対象とする免疫アッセイおよびこれに関連する障害療法の両方のために使用される。このような抗体、フラグメント、または領域は、そのフラグメントを含む本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性を有し得る。結合親和性は、５Ｘ１０^−２Ｍ、１０^−２Ｍ、５Ｘ１０^−３Ｍ、１０^−３Ｍ、５Ｘ１０^−４Ｍ、１０^−４Ｍ未満の解離定数つまりＫｄを含む。他の結合親和性は、５Ｘ１０^−５Ｍ、１０^−５Ｍ、５Ｘ１０^−６Ｍ、１０^−６Ｍ、５Ｘ１０^−７Ｍ、１０^７Ｍ、５Ｘ１０^−８Ｍ、または１０^−８Ｍ未満の解離定数つまりＫｄを有する結合親和性を含む。さらに他の結合親和性は、５Ｘ１０^−９Ｍ、１０^−９Ｍ、５Ｘ１０^−１０Ｍ、１０^−１０Ｍ、５Ｘ１０^−１１Ｍ、１０^−１１Ｍ、５Ｘ１０^−１２Ｍ、１０^−１２Ｍ、５Ｘ１０^−１３Ｍ、１０^−１３Ｍ、５Ｘ１０^−１４Ｍ、１０^−１４Ｍ、５Ｘ１０^−１５Ｍ、または１０^−１５Ｍ未満の解離定数つまりＫｄを有する結合親和性を含む。

遺伝子療法

具体的な実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む治療用タンパク質またはアルブミン融合タンパク質に結合する抗体をコードする配列を含む核酸は、遺伝子療法によって、治療用タンパク質の異常な発現および／または活性に関連付けられる疾患または障害を治療、阻害、または予防するために投与される。遺伝子療法は、発現される核酸または発現可能な核酸の被験体への投与によって実行される療法を指す。本発明の本実施形態において、核酸は、治療効果を媒介するこれらのコードされたタンパク質を産生する。

当該分野で利用可能な遺伝子療法に関するいずれの方法も、本発明に従い使用可能である。例示的な方法は、本明細書中の他の箇所においてより詳細に記載される。

治療的活性または予防的活性の実証

本発明の化合物または医薬組成物は、ヒトでの使用の前に、所望の治療的活性または予防的活性について体外で試験され、次に体内で試験することができる。例えば、化合物または医薬組成物の治療的有用性または予防的有用性を実証するための体外アッセイには、細胞株または患者組織サンプルに対する化合物の効果が含まれる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物または組成物の効果は、ロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイが含まれるがこれらに限定されない当業者に既知である技術を利用して判断可能である。本発明によると、特定の化合物の投与が示されるか否かを判断するために使用可能である体外アッセイには、体外細胞培養アッセイが含まれ、この体外細胞培養アッセイにおいて、患者組織サンプルが培養下で増殖し、化合物に曝露されるか、他の手段で化合物が投与され、組織サンプルに対するこのような化合物の効果が観察される。

治療的投与／予防的投与および組成物

本発明は、例えばアルブミン融合タンパク質またはその組成物（例えば、医薬組成物）である、有効量の本発明の化合物または医薬組成物の被験体への投与による治療、阻害、および予防の方法を提供する。ある実施形態において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかまたは不要な副作用を産生する物質を実質的に含まない）。被験体には、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物が含まれるがこれらに限定されない動物であってもよく、また一実施形態において哺乳動物であり、別の実施形態においてヒトである。

化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用可能である処方物および投与方法については上述され、さらなる適切な処方および投与経路については、本明細書中で以下に記載されたものの中から選択可能である。

種々の送達系が既知であり、また、本発明の化合物、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現可能である組み換え細胞中でのカプセル化、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕａｎｄＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照）、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての核酸の構築を投与するために使用可能である。導入方法には、皮内経路、筋内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、および経口経路が含まれるがこれらに限定されない。化合物または組成物は、例えば注入またはボーラス注射により、上皮層または皮膚粘膜層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜等）を介した吸収により、任意の簡便な経路により投与されてもよく、また、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与され得る。さらに、投与は、全身的または局所的であることが可能である。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、脳室内注射および髄腔内注射を含む任意の適切な経路によって中枢神経系に導入することが望ましい場合がある。脳内注射は、例えばオマヤ槽等の容器に取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤を含む処方物により、肺投与を使用することも可能である。

具体的な実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要な領域に局所的に投与することが望ましい場合があり、これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局所注入、例えば手術後の創傷包帯と併用する局所適用、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはシラスティック膜等の膜または繊維を含む、多孔性材料、非多孔性材料、または膠様材料であるインプラントにより達成され得る。一実施形態において、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用することに注意を払われなければならない。

別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、具体的には、リポソームにおいて送達可能である（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）、Ｔｒｅａｔｅｔａｌ．、ＬｉｐｏｌｏｍｅｓｉｎｔｈｅＴｈｅｒａｐｙｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅａｎｄＣａｎｃｅｒ、Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎａｎｄＦｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．）、Ｌｉｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ｐｐ．３５３〜３６５（１９８９）、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、ｉｂｉｄ．、ｐｐ．３１７−３２７を参照、同書を大まかに参照）。

さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、制御放出系において送達可能である。一実施形態において、ポンプを使用することができる（上記のＬａｎｇｅｒ、Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）、Ｂｕｃｈｗａｌｄｅｔａｌ．、Ｓｕｒｇｅｒｙ８８：５０７（１９８０）、Ｓａｕｄｅｋｅｔａｌ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照）。別の実施形態において、高分子材料を使用することが可能である（ＭｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ、ＬａｎｇｅｒａｎｄＷｉｓｅ（ｅｄｓ．）、ＣＲＣＰｒｅｓ．、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）、ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＤｒｕｇＢｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、ＤｒｕｇＰｒｏｄｕｃｔＤｅｓｉｇｎａｎｄＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳｍｏｌｅｎａｎｄＢａｌｌ（ｅｄｓ．）、Ｗｉｌｅｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８４）、ＲａｎｇｅｒａｎｄＰｅｐｐａｓ、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照されたく、また、Ｌｅｖｙｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１９０（１９８５）、Ｄｕｒｉｎｇｅｔａｌ．、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）、Ｈｏｗａｒｄｅｔａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照されたい）。さらに別の実施形態において、制御放出系は、治療標的、例えば、脳に近接して配置可能であるため、全身投薬量の一部だけを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、上記のＭｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ、ｖｏｌ．２、ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照）。

他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ、総説において説明される（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。

本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である具体的な実施形態において、核酸を体内に投与して、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、かつそれを細胞内になるように投与し、例えば、レトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、または直接注射によって、または微粒子銃（例えば、遺伝子銃、バイオリスティック、Ｄｕｐｏｎｔ社）の使用によって、または脂質もしくは細胞表面受容体の被覆または薬剤のトランスフェクトによって、または核に入ることで既知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照）等により、そのコードされたタンパク質の発現を促進することが可能である。あるいは、核酸は、細胞内に導入可能であり、また、相同組み換えによって発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込み可能である。

また、本発明は、アルブミン融合タンパク質を含むか、これから成るか、または本質的にこれから成る医薬組成物等の医薬組成物も提供する。このような組成物は、治療有効な量の化合物（例えば、アルブミン融合タンパク質）、および薬学的に許容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において、「薬学的に許容可能な」という用語は、動物における、より具体的にはヒトにおける使用のために、連邦規制当局もしくは州政府に認可された手段、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識されている薬局方に列挙された手段を指す。「キャリア」という用語は、治療剤と共に投与される、希釈剤、アジュバンド、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような薬学的なキャリアは、水および例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の石油由来、動物由来、植物由来、または合成由来の油を含む油等の、滅菌液であることが可能である。一実施形態において、水は、医薬組成物が静脈内に投与される場合のキャリアである。また、食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセロール水溶液を、特に注射剤のために、液体キャリアとして用いることが可能である。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。また、組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むことも可能である。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物等の形態を取ることが可能である。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリド等のキャリアを含む坐薬として処方可能である。経口処方物は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準キャリアを含むことが可能である。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、治療有効な量の化合物を、例えば精製形態で、適切な量のキャリアと共に含んで、患者への適切な投与のための形態を提供するようにする。処方物は、投与形態に適合するべきである。

ある実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内投与のために採用された医薬組成物として、慣用的な手順に従って処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝液における溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤および注射部位における痛みを軽減するリグノカイン等の局部麻酔薬を含み得る。一般的に、成分は、別々か、または単位投薬形態で一緒に混合するかのいずれかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたはサシェ等の密閉容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。組成物が点滴により投与される場合、組成物は、滅菌した薬学的等級の水または食塩水を含有する点滴ボトルで投薬可能である。組成物が注射により投与される場合、投与の前に成分を混合するように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルが提供可能である。

本発明の化合物は、中性形態または塩形態として処方可能である。薬学的に許容可能な塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するもの等の陰イオンと共に形成される塩と、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するもの等の陽イオンと共に形成される塩とが含まれる。

治療用タンパク質の異常な発現および／または活性と関連付けられる疾患または障害の治療、抑制、および予防において効果的である本発明の化合物の量は、標準的な臨床技術によって決定可能である。さらに、体外アッセイを任意で使用して、最適な投薬量の範囲の特定に役立てることができる。また、処方物に用いられる正確な投薬量は、投与経路、および疾患または障害の重症度に依存し、また、担当医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効量は、体外または動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から推定され得る。

抗体に関して、患者に投与される投薬量は、典型的には、患者の体重１ｋｇあたり、０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇである。ある実施形態において、患者に投与される投薬量は、患者の体重１ｋｇあたり、０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間である。別の実施形態において、投薬量は、患者の体重１ｋｇあたり、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。一般的に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドへの免疫応答に起因して、その他種からの抗体よりもヒト体内において長い半減期を有する。したがって、ヒト抗体の低投薬量および低頻度の投与は、多くの場合可能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、例えば、脂質化等の修飾よる抗体の取り込みおよび組織浸透（例えば、脳への）を増強することにより減少し得る。

診断および画像化

治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）（治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質を含む）に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体および類似体を診断目的のために使用して、治療用タンパク質の異常な発現および／または活性に関連付けられる疾患、障害および／または病状を検出、診断、または監視することが可能である。本発明は、治療用タンパク質の異常な発現の検出を提供し、これは、（ａ）該当するポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の治療用タンパク質の発現をアッセイするステップと、（ｂ）遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現レベルとを比較するステップとを含み、これによって、標準的な発現レベルと比較されるアッセイされた治療用タンパク質発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。

本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（ａ）治療用タンパク質に特異的な抗体の変異体の少なくともフラグメントを含む治療用タンパク質またはアルブミン融合タンパク質に特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の治療用タンパク質の発現をアッセイするステップと、（ｂ）遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現レベルとを比較するステップとを含み、これによって、標準的な発現レベルと比較されるアッセイされた治療用タンパク質の遺伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体からの生検組織における比較的多量の転写物の存在は、疾患の発症のための素因を示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供し得る。この種類のより決定的な診断によって、保健専門家が初期に予防手段または積極的治療を用いることが可能になるため、癌の発症またはさらなる進行を予防することになる。

本発明の抗体または治療用タンパク質に特異的な抗体の変異体の少なくともフラグメントを含むアルブミン融合タンパク質を使用して、当業者に既知の古典的な免疫組織学的方法を用いることにより、生体サンプル中のタンパク質レベルをアッセイすることが可能である（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６〜９８５（１９８５）、Ｊａｌｋａｎｅｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７〜３０９６（１９８７）を参照）。タンパク質の遺伝子発現の検出に有用な他の抗体ベースの方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等の免疫アッセイが含まれる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野において既知であり、また、グルコースオキシダーゼ等の酵素標識、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）等の放射性同位体、ルミノール等の発行標識、ならびにフルオレセインやローダミンおよびビオチン等の蛍光標識を含む。

本発明の１つの局面は、動物、例えば哺乳動物またはヒトにおける、治療用タンパク質の異常な発現と関連付けられる疾患または障害の検出および診断である。一実施形態において、診断は、ａ）該当するポリペプチドに特異的に結合する有効量の標識分子を被験体に（例えば、非経口、皮下、または腹腔内）投与するステップと、ｂ）治療用タンパク質が発現する被験体内の部位で標識分子が選択的に濃縮することを可能にするように（および非結合標識分子がバックグラウンドレベルまで除去されるように）投与後、ある時間間隔で待機するステップと、ｃ）バックグラウンドレベルを判断するステップと、ｄ）被験体中の標識分子を検出するステップとを含み、その結果、バックグラウンドレベルを超える標識分子の検出は、この被験体が治療用タンパク質の異常な発現と関連付けられる特定の疾患または障害を有することを示す。バックグラウンドレベルは、特定の系について過去に判断した標準的な値と、検出された標識分子の量とを比較するステップを含む種々の方法により判断可能である。

被験体のサイズおよび使用する画像化システムが、診断画像を生成するために必要な画像化部分の量を決定することが当該分野において理解される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、約５から２０ミリキュリーまでの^９９ｍＴｃの範囲である。次に、標識抗体、抗体フラグメント、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、特定の治療用タンパク質を含有する細胞の位置に選択的に蓄積される。体内腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌｅｔａｌ．、「ＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＴｈｅｉｒＦｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｃｈａｐｔｅｒ１３ｉｎＴｕｍｏｒＩｍａｇｉｎｇ：ＴｈｅＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌａｎｄＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓｅｄｓ．、ＭａｓｓｏｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＩｎｃ．（１９８２）に記載される。

使用する標識の型および投与形態を含むいくつかの可変要素に依存して、標識分子が被験体の部位に選択的に濃縮し、また非結合標識分子がバックグラウンドレベルまで除去されることを可能にするための投与後の時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態において、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間である。

ある実施形態において、疾患または障害の監視は、疾患または障害を診断するための方法を、例えば、最初の診断後１ヶ月、最初の診断後６ヶ月、最初の診断後１年等の間繰り返すことによって実行される。

標識分子の存在は、体内走査に関する当該分野で既知の方法を使用して、患者から検出可能である。このような方法は、使用する標識の型に依存する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定するこができるだろう。本発明の診断方法において使用され得る方法および機器には、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）等の全身走査、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、および超音波診断法が含まれるがこれらに限定されない。

特定の実施形態において、分子は、放射性同位体で標識され、放射線応答型器具を使用して患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎｅｔａｌ．、米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態において、分子は、蛍光化合物で標識され、蛍光応答型走査器具を使用して患者から検出される。別の実施形態において、分子は、陽電子放出金属で標識され、陽電子放出断層撮影法を使用して患者において検出される。さらに別の実施形態において、分子は、常磁性標識で標識され、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）を使用して患者から検出される。アルブミン融合タンパク質を特異的に検出するが、アルブミンまたは治療用タンパク質を単独で検出しない抗体は、ある実施形態である。これらを使用して、本明細書中に記載されるアルブミン融合タンパク質を検出することが可能である。

キット

本発明は、上記の方法において使用可能なキットを提供する。一実施形態において、キットは、１つ以上の容器中に、抗体、例えば、精製された抗体を含む。具体的な実施形態において、本発明のキットは、キットに含まれる抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチドを含む。別の実施形態において、本発明のキットは、該当するポリペプチドと反応しない対照抗体をさらに含む。別の具体的な実施形態において、本発明のキットは、該当するポリペプチドとの抗体の結合を検出するための手段を備える（例えば、この抗体は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物、または発光化合物等の検出可能な基質と共役することができるか、あるいは１次抗体を認識する２次抗体が、検出可能な基質と共役することができる）。

本発明の別の具体的な実施形態において、キットは、増殖性および／または癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含有する血清をスクリーニングする際に使用する診断キットである。このようなキットは、該当するポリペプチドと反応しない対照抗体を含み得る。このようなキットは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を含み得る。さらに、このようなキットは、この抗体の抗原への結合を検出するための手段を備える（例えば、この抗体は、フローサイトメトリーにより検出可能であるフルオレセインまたはローダミン等の蛍光化合物と共役され得る）。具体的な実施形態において、このキットは、組み換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に合成されたポリペプチド抗原を含んでもよい。また、キットのポリペプチド抗原は、固体支持体に付着し得る。

より具体的な実施形態において、上述のキットの検出手段は、このポリペプチド抗原が付着される固体支持体を含む。また、このようなキットは、非付着レポーター標識抗ヒト抗体を含み得る。本実施形態において、抗体のポリペプチド抗原との結合は、このレポーター標識抗体の結合により検出可能である。

追加の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含有する血清をスクリーニングする際に使用する診断キットを含む。診断用キットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である、実質的に単離された抗体、およびこのポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の抗体との結合を検出する手段を備える。一実施形態において、抗体は、固体支持体に付着される。具体的な実施形態において、抗体は、単クローン抗体であり得る。キットの検出手段は、第二の、標識単クローン抗体を含み得る。代替的にまたは付加的に、検出手段は、標識競合抗原を含んでもよい。

一診断構成において、試験血清は、本発明の方法により得られる表面結合抗原を有する固相試薬と反応する。特異的な抗原抗体を試薬と結合させて、非結合血清成分を洗浄により除去した後に、固体支持体上の結合抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させるために、試薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。非結合標識抗体を除去するために試薬を再洗浄し、試薬と関連付けられるレポーターの量を測定する。典型的には、レポーターは、適切な蛍光基質、発光基質または比色基質（Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で、固相をインキュベートすることによって検出される酵素である。

上記アッセイにおける固体表面試薬は、高分子ビーズ、計深棒、９６ウェルプレート、または濾過材料等の固体支持体材料にタンパク質材料を付着させるための既知の技術により調製される。これらの付着方法には、一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着、または典型的には遊離アミン基を介する、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基等の固体支持体上の化学反応基とのタンパク質の共有結合を含む。あるいは、ストレプトアビジン被覆プレートが、ビオチン化抗原と併用して使用可能である。

したがって、本発明は、この診断方法を実行するためのアッセイ系またはキットを提供する。キットは、一般的に、表面結合された組み換え抗原を有する支持体、および表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識抗ヒト抗体を含む。

アルブミン融合タンパク質

本発明は、概して、アルブミン融合タンパク質および疾患または障害を治療、予防、または改善する方法に関する。本明細書中で使用する際、「アルブミン融合タンパク質」は、少なくとも１つの分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）への融合によって形成されるタンパク質を指す。本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントまたは変異体およびヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントまたは変異体を含み、これらは、例えば遺伝子融合によって相互に関連付けられる（すなわち、アルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の全部または一部をコードするポリヌクレオチドが、アルブミンの全部または一部をコードするポリヌクレオチドとインフレームで結合される核酸の翻訳によって生成される）、または相互に対して関連付けられる。治療用タンパク質およびアルブミンタンパク質は、一旦アルブミン融合タンパク質の一部になると、各々は、アルブミン融合タンパク質の「一部」、「領域」、または「部分」と呼ばれる場合がある。

ある実施形態において、本発明は、表１または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によってコードされるアルブミン融合タンパク質を提供する。また、これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも、本発明によって包含される。

本発明のアルブミン融合タンパク質の実施形態は、治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで結合された、アルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードするポリヌクレオチドを含むかまたはこれから成る核酸分子、表１、表２、または実施例中に記載されるように生成される、治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで結合された、アルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードするポリヌクレオチドを含むかまたはこれから成る核酸分子、あるいは、例えば、次の要素（１）機能的な自己複製ベクター（シャトルベクター、発現ベクター、組み込みベクター、および／または複製系を含むがこれらに限定されない）、（２）転写の開始のための領域（例えば、調節可能プロモーターまたは誘導性プロモーター、構成プロモーターのようなプロモーター領域）、（３）転写の終結のための領域、（４）リーダー配列、および（５）選択マーカー、のうちの１以上をさらに含む、少なくとも１つの分子の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで結合される少なくとも１つの分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから成る核酸分子によってコードされるアルブミン融合タンパク質を含むがこれらに限定されない。

一実施形態において、本発明は、治療用タンパク質（例えば、表１に記載される）および血清アルブミンタンパク質を含むかまたはこれらから成る、アルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の生物学的に活性なフラグメントおよび／または治療的に活性なフラグメントならびに血清アルブミンタンパク質を含むかまたはこれらから成るアルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の生物学的に活性な変異体および／または治療的に活性な変異体ならびに血清アルブミンタンパク質を含むかまたはこれらから成るアルブミン融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、アルブミン融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は、血清アルブミンの成熟部分である。

さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質ならびに血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性なフラグメントおよび／または治療的に活性なフラグメントを含むかまたはこれらから成るアルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質ならびに血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性な変異体および／または治療的に活性な変異体を含むかまたはこれらから成るアルブミン融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、このアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の成熟部分である。

さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の生物学的に活性なフラグメントもしくは変異体および／または治療的に活性なフラグメントもしくは変異体、ならびに血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性なフラグメントもしくは変異体および／または治療的に活性なフラグメントもしくは変異体を含むかまたはこれらから成るアルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の成熟部分および血清アルブミンの成熟部分を含むかまたはこれらから成るアルブミン融合タンパク質を提供する。

一態様において、アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてＨＡを含み、また、Ｃ末端部分として治療用タンパク質を含む。あるいは、Ｃ末端部分としてＨＡを含み、かつＮ末端部分として治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質も使用され得る。

他の実施形態において、アルブミン融合タンパク質は、アルブミンのＮ末端およびＣ末端の両方に融合した治療用タンパク質を有する。ある実施形態において、Ｎ末端で融合した治療用タンパク質とＣ末端で融合した治療用タンパク質は、同一の治療用タンパク質である。別の実施形態において、Ｎ末端で融合した治療用タンパク質とＣ末端で融合した治療用タンパク質は、異なる治療用タンパク質である。別の実施形態において、Ｎ末端で融合した治療用タンパク質とＣ末端で融合した治療用タンパク質とは、同一かまたは関連する疾患、障害、または病状（例えば、表１の「適応症：Ｙ」の列に列挙される）を治療または予防するために使用され得る、異なる治療用タンパク質である。別の実施形態において、Ｎ末端で融合した治療用タンパク質とＣ末端で融合した治療用タンパク質とは、通常、患者において同時に、同時発生的に、または連続的に発生するか、あるいは通常、患者において相互に関連して発生することが当該分野で既知である疾患または障害（例えば、表１の「適応症：Ｙ」の列に列挙される）を治療、改善、または予防するために使用され得る、異なる治療用タンパク質である。

本発明のアルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端、ならびに／あるいはアルブミンまたはその変異体のＮ末端またはＣ末端に融合した、所定の治療用タンパク質Ｘまたはその変異体の、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の分子を含有するタンパク質を包含する。所定の治療用タンパク質Ｘまたはその変異体の分子は、任意の数の配向にあってもよく、この配向には、「頭から頭」配向（例えば、治療用タンパク質Ｘの１つの分子のＮ末端が、治療用タンパク質Ｘの別の分子のＮ末端に融合する場合）または「頭から尾」配向（例えば、治療用タンパク質Ｘの１つの分子のＣ末端が、治療用タンパク質Ｘの別の分子のＮ末端に融合する場合）が含まれるがこれらに限定されない。

一実施形態において、縦列配向した治療用タンパク質Ｘポリペプチド（またはそのフラグメントもしくは変異体）の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上は、本発明のアルブミン融合タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端、ならびに／またはアルブミンもしくはその変異体のＮ末端および／もしくはＣ末端に融合される。

本発明のアルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端、ならびに／あるいはアルブミンまたはその変異体のＮ末端またはＣ末端に融合した、所定の治療用タンパク質Ｘまたはその変異体の、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の分子を含有するタンパク質をさらに包含し、ここで、分子は、ペプチドリンカーを介して結合される。例として、米国特許第５，０７３，６２７号（参照することによって本明細書中に組み込まれる）に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって分離された複数の治療用タンパク質Ｘポリペプチドを含むアルブミン融合タンパク質は、従来の組み換えＤＮＡ技術を使用して産生され得る。リンカーは、大きいＨＳＡ分子に小さいペプチドを融合させる場合に、特に重要である。ペプチド自体は、ペプチドの縦列コピーを融合させることによってリンカーであり得るか、または他の既知のリンカーが使用され得る。リンカーを組み込む構築物は、表２に記載されるか、または配列番号Ｙを調べれば、明らかになる。

さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、分子内および／または分子間のマルチマー形態の形成を可能にするような様式で、アルブミンまたはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端に、治療用タンパク質Ｘまたはその変異体を融合させることによって産生され得る。本発明の一実施形態において、アルブミン融合タンパク質は、モノマー形態またはマルチマー形態（すなわち、２量体、３量体、４量体、およびより高次のマルチマー）であり得る。本発明のさらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、モノマー形態またはマルチマー形態（すなわち、２量体、３量体、４量体、およびより高次のマルチマー）であり得る。具体的な実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、マルチマー形態（すなわち、２量体、３量体、４量体およびより高次のマルチマー）であり、また、アルブミンタンパク質部分は、モノマー形態である。

アルブミン部分が治療用タンパク質部分のＮ末端および／またはＣ末端に融合されたアルブミン融合タンパク質に加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、該当する治療用タンパク質またはペプチド（例えば、表１に開示される治療用タンパク質Ｘ、あるいは治療用タンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントもしくは変異体）を、ＨＡの内部領域に挿入することによって産生され得る。例えば、ＨＡ分子のタンパク質配列において、多数のループまたはターンが、αヘリックスの終点と開始点との間に存在し、これらは、ジスルフィド結合によって安定化される。ＨＡの結晶構造から決定されるようなループ（ＰＤＢ同定子１ＡＯ６、１ＢＪ５、１ＢＫＥ、１ＢＭ０、１Ｅ７Ｅ〜１Ｅ７Ｉおよび１ＵＯＲ）は、大部分、分子本体から離れて延びている。これらのループは、治療的に活性なペプチド、特に、２次構造が機能的であることを要するもの、または治療用タンパク質の挿入または内部融合のために有用であり、特定の生物学的活性を有するアルブミン分子を本質的に生成する。

本発明のアルブミン融合タンパク質を生成するためにペプチドまたはポリペプチドが挿入され得るヒトアルブミン構造中のループは、Ｖａｌ５４〜Ａｓｎ６１、Ｔｈｒ７６〜Ａｓｐ８９、Ａｌａ９２〜Ｇｌｕ１００、Ｇｌｎ１７０〜Ａｌａ１７６、Ｈｉｓ２４７〜Ｇｌｕ２５２、Ｇｌｕ２６６〜Ｇｌｕ２７７、Ｇｌｕ２８０〜Ｈｉｓ２８８、Ａｌａ３６２〜Ｇｌｕ３６８、Ｌｙｓ４３９〜Ｐｒｏ４４７、Ｖａｌ４６２〜Ｌｙｓ４７５、Ｔｈｒ４７８〜Ｐｒｏ４８６およびＬｙｓ５６０〜Ｔｈｒ５６６を含む。追加の実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、成熟ヒトアルブミン（配列番号１）のＶａｌ５４〜Ａｓｎ６１ループ、Ｇｌｎ１７０〜Ａｌａ１７６ループ、および／またはＬｙｓ５６０〜Ｔｈｒ５６６ループ中に挿入される。

挿入されるペプチドは、特定の生物学的活性についてスクリーニングされたファージ提示ライブラリーまたは合成ペプチドライブラリーのいずれか、あるいは所望の機能を有する分子の活性部分に由来し得る。さらに、ランダムペプチドライブラリーは、ＨＡ分子の特定のループ内に生成され得、またはＨＡ分子の特定のループにランダム化ペプチドを挿入することによって生成されてもよく、ここで、アミノ酸の全ての可能な組み合わせが提示される。

このようなライブラリーは、以下の方法のうちの１つによって、ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメントに対して生成され得る。
ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメント内の１つ以上のペプチドループ内のアミノ酸のランダム化変異。ループ内の１つ、より多く、または全ての残基のうちのいずれかがこの様式で変異され得る。
長さＸ_ｎ（ここで、Ｘはアミノ酸であり、ｎは残基の数である）のランダム化ペプチドの、ＨＡもしくはＨＡのドメインフラグメントうちの１つ以上のループの置換またはＨＡもしくはＨＡのドメインフラグメンのうちの１つ以上のループへの挿入（すなわち、内部融合）。
（ａ）および／または（ｂ）に加えて、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端のペプチド／タンパク質融合。

また、ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメントは、同一のＨＡまたはＨＡのドメインフラグメントへの異なる標的に対する、異なるループの異なるスクリーニングに由来するペプチドを移植することによって、多官能性にすることができる。

いくつかの実施形態において、ヒト血清アルブミンのループに挿入されるペプチドは、表１に開示される治療用タンパク質のペプチドフラグメントまたはペプチド変異体である。より具体的には、本発明は、ヒト血清アルブミンのループに挿入された、少なくとも７アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１１アミノ酸長、少なくとも１２アミノ酸長、少なくとも１３アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長、または少なくとも４０アミノ酸長のペプチドフラグメントまたはペプチド変異体を含むアルブミン融合タンパク質を包含する。また、本発明は、ヒト血清アルブミンのＮ末端に融合した、少なくとも７アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１１アミノ酸長、少なくとも１２アミノ酸長、少なくとも１３アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長、または少なくとも４０アミノ酸長のペプチドフラグメントまたはペプチド変異体を含むアルブミン融合タンパク質を包含する。また、本発明は、ヒト血清アルブミンのＣ末端に融合した、少なくとも７アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１１アミノ酸長、少なくとも１２アミノ酸長、少なくとも１３アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長、または少なくとも４０アミノ酸長のペプチドフラグメントまたはペプチド変異体を含むアルブミン融合タンパク質を包含する。例えば、表１および表２に記載される短いペプチド（例えば、治療剤Ｙ）は、アルブミンループ中に挿入され得る。

一般的に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、１つのＨＡ由来領域および１つの治療用タンパク質由来領域を有し得る。しかしながら、各タンパク質の複数の領域を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製し得る。同様に、複数の治療用タンパク質を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製し得る。例えば、治療用タンパク質は、ＨＡのＮ末端およびＣ末端の両方に融合され得る。このような構成において、治療用タンパク質部分は、同一の治療用タンパク質分子または異なる治療用タンパク質分子であり得る。２重機能的アルブミン融合タンパク質の構造は、Ｘ−ＨＡ−ＹまたはＹ−ＨＡ−Ｘとして示され得る。

例えば、抗ＢＬｙＳ（商標）ｓｃＦｖ−ＨＡ−ＩＦＮα−２ｂ融合物を調製して、抗ＢＬｙＳ（商標）ｓｃＦｖによって、ＩＦＮα−２ｂに対する免疫応答を調節することができる。代替法は、ＨＡ−抗ＢＬｙＳ（商標）ｓｃＦｖ融合物または他のＨＡ融合物と、半減期等の機能に依存して種々の比率で混合した、ＨＡ融合物、例えば、ＨＡ−ＩＦＮα−２ｂ融合物の２重（または多重でも）機能的用量を生成することである。

また、２重機能または多重機能アルブミン融合タンパク質を調製して、ＨＡの反対側の末端にて、タンパク質またはペプチドを介して標的器官または細胞型に、融合物の治療用タンパク質部分を標的化することができる。

既知の治療分子の融合物の代替として、ペプチドは、典型的には、６、８、１２、２０、または２５またはＸｎ（ここで、Ｘはアミノ酸（ａａ）であり、ｎは残基の数に等しい）のランダム化アミノ酸の、ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメントのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端への融合物として構築されたライブラリーをスクリーニングすることによって、獲得されてもよく、ここで、アミノ酸の全ての可能な組み合わせが提示された。この手法の特定の利点は、ＨＡ分子上のペプチドが原位置で選択され、従って、他の任意の方法によって誘導され、次いでＨＡに結合されるペプチドについての場合において起こりうるように、修飾されるのではなく、このペプチドの特性が、選択され得ることである。

さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、融合部分間にリンカーペプチドを含んで、部分間のより大きい物理的分離を提供し得るため、治療用タンパク質部分のアクセス可能性、例えば、その同族受容体への結合について最大化することができる。リンカーペプチドは、可撓性またはより剛性であるようにアミノ酸から成り得る。

リンカー配列は、プロテアーゼによってまたは化学的に切断されて、成長ホルモン関連部分を生じ得る。一態様において、プロテアーゼは、宿主によって天然に産生されるプロテアーゼ、例えば、サッカロマイセスセレビシエプロテアーゼｋｅｘ２または等価なプロテアーゼである。

したがって、上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、Ｒ１−Ｌ−Ｒ２、Ｒ２−Ｌ−Ｒ１、またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１の式を有し得、ここで、Ｒ１は、少なくとも１つの治療用タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド配列であるが、必ずしも同じ治療用タンパク質ではなく、Ｌはリンカーであり、また、Ｒ２は血清アルブミン配列である。

いくつかの実施形態において、治療用タンパク質を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合していない場合の同一の治療用タンパク質のプラズマ安定性に比べて高いプラズマ安定性を有する。プラズマ安定性は、典型的には、治療用タンパク質が体内投与されて血流に運搬される時と、治療用タンパク質が退化して、身体から治療用タンパク質を最終的に除去する腎臓または肝臓等の器官に血流から除去される時との間の時間を指す。プラズマ安定性は、血流における治療用タンパク質の半減期の観点から計算される。血流における治療用タンパク質の半減期は、当該分野で既知である一般的なアッセイによって容易に測定可能である。

いくつかの実施形態において、治療用タンパク質を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンと融合していない場合の同一の治療用タンパク質の貯蔵寿命に比べて貯蔵寿命が長期化される。貯蔵寿命は、典型的には、溶液中または他のいくつかの保管処方物中の治療用タンパク質の治療的活性が、治療的活性を過度に損失せずに安定している期間を指す。治療用タンパク質の多くは、その非融合状態では、高度に不安定である。後述のように、これらの治療用タンパク質の典型的な貯蔵寿命は、本発明のアルブミン融合タンパク質に組み込まれると、顕著に延長される。

「延長した」または「長期化した」貯蔵寿命を有する本発明のアルブミン融合タンパク質は、同一の保管条件および取り扱い条件に供された基準と比較して、より高い治療的活性を示す。この基準は、非融合の全長治療用タンパク質であり得る。アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分が類似体、変異体、またはそうでなければ変更されている場合、あるいはそのタンパク質に関する完全配列を含まない場合、治療的活性の延長は、その類似体、変異体、変更されたペプチド、または不完全配列の非融合の等価物と代替的に比較され得る。例として、本発明のアルブミン融合タンパク質は、所定の時点で比較した場合に、基準と同一の保管条件および取り扱い条件に供された場合、基準の治療的活性の約１００％より高い活性、または基準の治療的活性の約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％もしくは２００％より高い活性を保持し得る。

また、貯蔵寿命は、保管開始時の治療的活性に対して正規化した、保管後に残存する治療的活性の観点から評価され得る。延長または長期化された治療的活性によって示されるような、延長または長期化した貯蔵寿命を有する本発明のアルブミン融合タンパク質は、同一条件に供された場合の等価な非融合治療用タンパク質の治療的活性の、約５０％より高い治療的活性、約６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の治療的活性を保持し得る。

融合タンパク質の発現

本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母、細菌等の微生物、またはヒトもしくは動物の細胞株からの分泌によって、組み換え分子として産生され得る。一態様において、ポリペプチドは、宿主細胞から分泌される。

本発明の特定の実施形態は、酵母において分泌を指向するのに有効なシグナル配列、具体的には、酵母由来のシグナル配列（特に、酵母宿主と同種のもの）をコードするＤＮＡ構築物、および本発明の第１の態様の融合分子を含み、シグナルポリペプチドと成熟ポリペプチドとの間には、酵母由来のプロ配列は存在しない。

サッカロマイセスセレビシエインベルターゼシグナルは、酵母由来のシグナル配列の一例である。

Ｐｏｚｎａｎｓｋｙｅｔａｌ．（ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２３９：１８（１９８８））によって調製される種類、すなわち、別々に調製されたポリペプチドが、化学的架橋によって結合されている共役体は意図されない。

また、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するように形質転換された、細胞、例えば酵母細胞も含む。形質転換された宿主細胞自体に加えて、本発明は、栄養培地中の、これらの細胞の培養物、例えば、単クローン（クローン性均質な）培養物または単クローン培養物由来の培養物も意図する。ポリペプチドが分泌される場合、この培地は、細胞を含んで、または細胞が濾過もしくは遠心分離によって除去されている場合には細胞を含まずに、ポリペプチドを含有する。細菌（例えば、大腸菌およびＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えば、サッカロマイセスセレビシエ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、およびＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、糸状菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞を含む多くの発現系細菌が既知であり、また使用され得る。

アルブミン融合タンパク質の産生に使用される酵母株の例として、Ｄ８８、ＤＸＹ１、およびＢＸＰ１０が挙げられる。Ｄ８８［ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４］は、親株ＡＨ２２ｈｉｓ^＋（ＤＢ１としても既知、例えば、Ｓｌｅｅｐｅｔａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：４２−４６（１９９０）を参照）の誘導体である。この株は、ＬＥＵ２遺伝子を含有する２ミクロンベースのプラスミドの栄養要求性選択を可能にする、ｌｅｕ２変異を含む。また、Ｄ８８は、グルコース過剰条件で、ＰＲＢ１の抑制を呈する。ＰＲＢ１プロモーターは、通常、グルコースレベルおよび増殖段階を監視する２つのチェックポイントによって制御される。プロモーターは、グルコース枯渇および静止期へ入る際に、野生型酵母において活性化される。株Ｄ８８は、グルコースによる抑制を呈するが、静止期へ入る際に、誘導を維持する。ＰＲＡ１遺伝子は、酵母空胞プロテアーゼであるＹｓｃＡエンドプロテアーゼＡをコードし、このプロテアーゼは、ＥＲに局在する。ＵＢＣ４遺伝子は、ユビキチン化経路にあり、ユビキチン依存的な分解のための、短命かつ異常なタンパク質の標的化に関与している。このｕｂｃ４変異の単離は、細胞における発現プラスミドのコピー数を増大させ、プラスミドから発現される所望のタンパク質の発現レベルを増大させることが発見されている（例えば、国際公開番号第ＷＯ９９／００５０４号を参照されたく、これは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

Ｄ８８の誘導体であるＤＸＹ１は、［ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３：：ｙａｐ３］の遺伝子型を有する。Ｄ８８において単離された変異に加えて、この株は、ＹＡＰ３プロテアーゼのノックアウトも有する。このプロテアーゼは、主に２塩基性残基（ＲＲ、ＲＫ、ＫＲ、ＫＫ）の切断をもたらすが、タンパク質中の単一の塩基性残基での切断も促進可能である。このｙａｐ３変異の単離によって、高レベルの全長ＨＳＡ産生がもたらされた（例えば、米国特許第５，９６５，３８６号およびＫｅｒｒｙ−Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａｌ．、Ｙｅａｓｔ１４：１６１〜１６９（１９９８）を参照されたく、これは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる）。

ＢＸＰ１０は、［ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐ１５０：：ＬＹＳ２、ｐｍｔ１：：ＵＲＡ３］の遺伝子型を有する。ＤＸＹ１において単離された変異に加えて、この株は、ＰＭＴ１遺伝子およびＨＳＰ１５０遺伝子のノックアウトも有する。ＰＭＴ１遺伝子は、ドリコール−ホスフェート−Ｄ−マンノースタンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｐｍｔ）の、進化的に保存された族のメンバーである。Ｐｍｔ１ｐの膜貫通トポロジーは、これが、Ｏ結合グリコシル化において役割を有する、小胞体の、不可欠な膜タンパク質であることを示唆する。この変異は、ＨＳＡ融合物のＯ結合グリコシル化を、低減／排除する役割を果たす（例えば、国際公開番号第ＷＯ００／４４７７２号を参照されたく、これは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる）。研究により、Ｈｓｐ１５０タンパク質が、イオン交換クロマトグラフィーによっては、ｒＨＡから不十分に分離されることが明らかとなった。ＨＳＰ１５０遺伝子における変異は、標準的な精製技術による除去が困難であると証明されている、潜在的な混入物を除去する。例えば、米国特許第５，７８３，４２３号を参照されたく、これは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

所望のタンパク質は、例えば、宿主染色体に挿入されたコード配列または遊離プラスミド上のコード配列から、従来の方法で産生される。酵母は、例えばエレクトロポレーションのような通常の方法のいずれかにおいて、所望のタンパク質のコード配列で形質転換される。エレクトロポレーションによる酵母の形質転換方法は、Ｂｅｃｋｅｒ＆Ｇｕａｒｅｎｔｅ、（１９９０）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１９４，１８２に開示される。

形質転換を成功した細胞（すなわち、本発明のＤＮＡ構築物を含有する細胞）は、既知の技術によって同定可能である。例えば、発現構築物の導入から生じる細胞は、所望のポリペプチドを産生するように増殖可能である。細胞は採取および溶解され、そのＤＮＡ内容物が、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３またはＢｅｒｅｎｔｅｔａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３、２０８に記載される方法を使用して、ＤＮＡの存在について試験され得る。あるいは、上清中のタンパク質の存在は、抗体を使用して検出可能である。

有用な酵母プラスミドベクターには、ｐＲＳ４０３〜４０６およびｐＲＳ４１３〜４１６が含まれ、また、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ．ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ９２０３７，ＵＳＡから一般的に入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーのＨＩＳ３、７ＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３を組み込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３〜４１６は、酵母染色体プラスミド（Ｙｃｐ）である。

酵母においてアルブミン融合タンパク質を発現させるためのベクターの例として、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、およびｐＣ４：ＨＳＡが挙げられ、これらは、実施例１において詳細に記載される。図２は、ｐＰＰＣ０００５プラスミドのマップを示し、これは、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドがクローニングされてＨＡ融合物を形成し得る、基本ベクターとして使用可能である。これは、ＰＲＢ１サッカロマイセスセレビシエプロモーター（ＰＲＢ１ｐ）、融合リーダー配列（ＦＬ）、ＨＡ（ｒＡＨ）をコードするＤＮＡ、およびＡＤＨ１サッカロマイセスセレビシエターミネーター配列を含む。融合リーダー配列の配列は、ヒト血清アルブミンのシグナルペプチド（配列番号３）の最初の１９アミノ酸および接合因子α１プロモーターの最後の５アミノ酸（ＳＬＤＫＲ、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる欧州特許第Ａ−３８７３１９号を参照）から成る。

プラスミドｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、およびｐＣ４：ＨＳＡは、２００１年４月１１日に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０−２２０９に寄託され、受託番号ＡＴＣＣＰＴＡ−３２７８、ＰＴＡ−３２７６、ＰＴＡ−３２７９、およびＰＴＡ−３２７７がそれぞれ与えられた。酵母でのアルブミン融合タンパク質の発現のために有用な別のベクターである、ｐＳＡＣ３５ベクターは、Ｓｌｅｅｐｅｔａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：４２（１９９０）に記載され、これは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

アルブミン融合タンパク質を発現するために使用可能である酵母プロモーターは、ＭＥＴ２５プロモーターである。例えば、ＤｏｍｉｎｉｋＭｕｍｂｕｒｇ、ＲｏｌｆＭｕｌｌｅｒおよびＭａｒｔｉｎＦｕｎｋ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．２５、ｐｐ．５７６７−５７６８を参照されたい。Ｍｅｔ２５プロモーターは、３８３塩基長（塩基−３８２〜−１）であり、また、このプロモーターによって発現される遺伝子も、Ｍｅｔ１５、Ｍｅｔ１７、およびＹＬＲ３０３Ｗとして既知である。ある実施形態は、以下の配列を使用し、ここで、以下の配列の５´末端において、クローニングに使用されるＮｏｔ１部位に下線を付し、そして３´末端において、ＡＴＧ開始コドンに下線を付している。
ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＡＴＧＣＡＡＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＴＴＡＧＣＴＣＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＡＴＣＧＣＡＡＡＡＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＧＡＴＡＴＴＧＧＧＧＡＡＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＡＣＴＡＡＴＴＡＡＧＴＴＡＧＴＣＡＡＧＧＣＧＣＣＡＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡＡＡＣＴＧＴＧＴＡＡＣＡＴＡＡＴＡＡＣＣＧＡＡＧＴＧＴＣＧＡＡＡＡＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＴＣＣＡＡＴＴＧＡＡＣＡＣＧＣＴＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＧＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＧＧＴＴＡＡＧＴＡＡＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＴＧＣＴＣＴＣＴＴＧＴＣＴＴＴＴＣＡＴＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＡＡＴＡＣＡＧＧＧＴＣＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＴＡＧＡＴＡＣＡＡＴＴＣＴＡＴＴＡＣＣＣＣＣＡＴＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧ（配列番号５）

酵母においてアルブミンタンパク質を発現するために使用可能である追加のプロモーターは以下を含む。
ａ）ｃｂｈ１プロモーター：
ＴＣＴＡＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＴＧＴＡＴＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＧＴＣＧＣＡＴＣＴＡＡＡＴＡＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＣＣＣＧＧＡＧＡＡＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＡＡＴＴＡＧＣＡＴＧＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＡＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＣＴＴＧＴＴＧＡＡＴＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＣＡＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣＧＴＴＣＣＧＴＣＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＧＡＧＡＴＴＣＣＴＡＡＧＴＡＧＣＧＡＴＧＧＡＡＣＣＧＧＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＴＡＧＧＣＡＡＴＡＣＡＴＴＧＡＧＴＴＧＣＣＴＣＧＡＣＧＧＴＴＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＧＧＴＡＣＴＧＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＴＡＡＣＴＧＴＴＣＣＧＴＡＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＴＧＡＴＴＣＡＧＣＧＴＡＣＣＣＧＴＡＣＡＡＧＴＣＧＴＡＡＴＣＡＣＴＡＴＴＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＧＡＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＣＣＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＧＴＣＡＴＴＧＣＧＡＴＧＴＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧＡＣＣＧＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＡＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＣＧＣＣＴＣＧＡＡＧＧＴＴＣＡＣＧＧＣＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＧＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＧＣＡＡＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＣＣＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＧＴＡＣＡＴＡＡＧＴＴＡＡＴＧＣＣＴＡＡＡＧＡＡＧＴＣＡＴＡＴＡＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＣＡＡＴＣＡＡＧＴＧＧＣＴＡＡＡＣＧＴＡＣＣＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＴＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣＣＡＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣＴＴＧＴＴＴＧＴＴＣＣＧＧＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＣＴＧＡＣＴＣＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＡＴＡＣＡＡＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＧＣＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＧＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＴＡＣＧＡＣＧＡＡＴＡＣＴＧＴＡＴＡＧＴＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴＧＴＡＡＧＴＣＧＧＣＡＣＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＡＴＴＧＡＧＴＴＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＡＡＧＡＴＣＴＣＧＧＧＣＣＣＴＣＧＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣＣＴＴＴＧＧＧＴＧＴＡＣＡＴＧＴＴＴＧＴＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＧＴＧＴＧＧＴＡＧＧＡＴＣＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＧＧＧＴＡＴＧＴＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＴＧＴＴＣＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＡＧＣＣＧＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＣＣＴＣＡＴＴＡＡＡＣＧＧＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣＧＡＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＧＧＴＴＣＧＡＧＧＴＣＣＧＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＴＧＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴＣＡＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＧＴＣＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＴＧＧＣＡＴＣ（配列番号１１３）
ｂ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｃｙｓＤプロモーター：
ＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＣＧＡＴＧＣＧＣＣＴＣＧＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＡＧＡＴＴＣＣＴＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣＴＡＴＣＧＴＴＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＴＴＧＧＡＣＣＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＴＴＡＴＴＣＡＣＧＣＡＡＴＴＡＣＧＡＴＡＧＴＡＴＴＴＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＧＴＴＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＴＣＧＧＧＴＡＡＧＡＣＧＣＧＡＴＣＡＣＧＣＣＡＴＴＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＴＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＣＣＣＣＧＣＡＴＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＧＧＣＴＴＴＧＣＧＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＴＣＴＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＴＣＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＡＣＣＣＣＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣ（配列番号１１４）
ｃ）以下の配列を有する修飾ｃｂｈ１プロモーター：
ＴＣＴＡＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＴＧＴＡＴＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＧＴＣＧＣＡＴＣＴＡＡＡＴＡＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＣＣＣＧＧＡＧＡＡＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＡＡＴＴＡＧＣＡＴＧＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＡＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＣＴＴＧＴＴＧＡＡＴＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＣＡＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣＧＴＴＣＣＧＴＣＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＧＡＧＡＴＴＣＣＴＡＡＧＴＡＧＣＧＡＴＧＧＡＡＣＣＧＧＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＴＡＧＧＣＡＡＴＡＣＡＴＴＧＡＧＴＴＧＣＣＴＣＧＡＣＧＧＴＴＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＧＧＴＡＣＴＧＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＴＡＡＣＴＧＴＴＣＣＧＴＡＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＴＧＡＴＴＣＡＧＣＧＴＡＣＣＣＧＴＡＣＡＡＧＴＣＧＴＡＡＴＣＡＣＴＡＴＴＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＧＡＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＣＣＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＧＴＣＡＴＴＧＣＧＡＴＧＴＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧＡＣＣＧＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＡＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＣＧＣＣＴＣＧＡＡＧＧＴＴＣＡＣＧＧＣＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＧＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＧＣＡＡＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＣＣＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＧＴＡＣＡＴＡＡＧＴＴＡＡＴＧＣＣＴＡＡＡＧＡＡＧＴＣＡＴＡＴＡＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＣＡＡＴＣＡＡＧＴＧＧＣＴＡＡＡＣＧＴＡＣＣＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＴＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣＣＡＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣＴＴＧＴＴＴＧＴＴＣＣＧＧＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＣＴＧＡＣＴＣＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＡＴＡＣＡＡＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＧＣＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＧＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＴＡＣＧＡＣＧＡＡＴＡＣＴＧＴＡＴＡＧＴＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴＧＴＡＡＧＴＣＧＧＣＡＣＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＡＴＴＧＡＧＴＴＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＡＡＧＡＴＣＴＣＧＧＧＣＣＣＴＣＧＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣＣＴＴＴＧＧＧＴＧＴＡＣＡＴＧＴＴＴＧＴＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＧＴＧＴＧＧＴＡＧＧＡＴＣＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＧＧＧＴＡＴＧＴＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＴＧＴＴＣＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＴＡＴＣＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＣＣＧＴＣＧＣＴＣＧＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧＣＴＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＣＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＧＧＴＣＣＴＡＧＣＴＴＡＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＡＧＣＣＧＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＣＣＴＣＡＴＴＡＡＡＣＧＧＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣＧＡＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＧＧＴＴＣＧＡＧＧＴＣＣＧＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＴＧＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴＣＡＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＧＴＣＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＴＧＧＣＡＴＣ（配列番号１１５）
ｄ）以下の配列を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｃｙｓＤプロモーター：
ＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＣＧＡＴＧＣＧＣＣＴＣＧＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＡＧＡＴＴＣＣＴＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣＴＡＴＣＧＴＴＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＴＴＧＧＡＣＣＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＴＴＡＴＴＣＡＣＧＣＡＡＴＴＡＣＧＡＴＡＧＴＡＴＴＴＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＧＴＴＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＴＣＧＧＧＴＡＡＧＡＣＧＣＧＡＴＣＡＣＧＣＣＡＴＴＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＴＡＴＣＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＣＣＧＴＣＧＣＴＣＧＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧＣＴＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＣＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＧＧＴＣＣＴＡＣＧＣＣＧＧＣＧＴＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＣＣＣＣＧＣＡＴＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＧＧＣＴＴＴＧＣＧＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＴＣＴＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＴＣＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＡＣＣＣＣＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣ（配列番号１１６）

相補的な粘着末端を介して、ＤＮＡをベクターに作動可能に連結するための多種多様な方法が、開発されている。例えば、相補的なホモポリマー区域が、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡセグメントに付加可能である。次に、ベクターおよびＤＮＡセグメントは、相補的なホモポリマーテイル間での水素結合によって結合されて、組み換えＤＮＡ分子を形成する。

１つ以上の制限部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに結合する代替方法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化によって生成されるＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩで処理され、これらは、その３´５´エキソヌクレアーゼ活性によって、突出γ一本鎖末端を除去し、それらの重合活性によって、陥凹３´末端を満たす酵素である。

したがって、これらの活性の組み合わせは、平滑末端のＤＮＡセグメントを生成する。次に、この平滑末端のセグメントは、バクテリオファージのＴ４ＤＮＡリガーゼ等の平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒可能な酵素の存在下で、大幅にモル濃度過剰のリンカー分子とともにインキュベートされる。したがって、反応産物は、その末端にポリマーリンカー配列を有するＤＮＡセグメントである。次に、これらのＤＮＡセグメントは、適切な制限酵素で切断され、ＤＮＡセグメントの末端と適合する末端を産生する酵素を用いて切断された発現ベクターに連結される。

多種多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ、ＮｅｗＨａｖｅｎ、ＣＴ、ＵＳＡを含む多数の供給源から市販されている。

本発明に従ってＤＮＡを修飾するための望ましい方法は、例えば、ＨＡ変異体が調製される場合、Ｓａｉｋｉｅｔａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９，４８７−４９１によって開示されるようなポリメラーゼ鎖反応を使用することである。この方法において、酵素的に増幅されるＤＮＡは、それ自体増幅されたＤＮＡに組み込まれる２つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーによって隣接される。特異的プライマーは、当該分野で既知の方法を使用して発現ベクター中にクローニングするために使用可能である制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでもよい。

アルブミン融合タンパク質を発現するための宿主として本発明の実施において有用であることが想定される酵母の例示的な属は、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロマイセス）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ等が挙げられる。例示的な属は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、およびＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａから成る群より選択される属である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．の例として、サッカロマイセスセレビシエ、Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓおよびＳ．ｒｏｕｘｉｉが挙げられる。

Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．の例として、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓが挙げられる。適切なＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａ種は、Ｔ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである。Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）ｓｐｐ．の例として、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（以前はＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ（以前はＨ．ａｎｏｍａｌａ）、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。サッカロマイセスセレビシエの形質転換方法は、一般的に、欧州特許第２５１７４４号、欧州特許第２５８０６７号、および国際公開第ＷＯ９０／０１０６３号において教示され、これらは全て、参照することによって本明細書に組み込まれる。

サッカロマイセスの例示的な種として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセスセレビシエ）、Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、およびＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｒｏｕｘｉｉが挙げられる。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの例示的な種として、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓが挙げられる。Ｈａｎｓｅｎｕｌａの例示的な種として、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在Ｐｉｃｈｉａａｎｇｕｓｔａ）、Ｈ．ａｎｏｍａｌａ（現在ではＰｉｃｈｉａａｎｏｍａｌａ）およびＰｉｃｈｉａｃａｐｓｕｌａｔａが挙げられる。Ｐｉｃｈｉａ種の追加の種として、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの例示的な種として、Ａ．ｎｉｇｅｒおよびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓが挙げられる。Ｙａｒｒｏｗｉａの例示的な種として、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。多くの酵母種が、ＡＴＣＣから入手可能である。例えば、以下の酵母種がＡＴＣＣから入手可能であり、またアルブミン融合タンパク質の発現において有用である。サッカロマイセスセレビシエＨａｎｓｅｎ、有性世代株ＢＹ４７４３ｙａｐ３変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２２７３１）、サッカロマイセスセレビシエＨａｎｓｅｎ、有性世代株ＢＹ４７４３ｈｓｐ１５０変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２１２６６）、サッカロマイセスセレビシエＨａｎｓｅｎ、有性世代株ＢＹ４７４３ｐｍｔ１変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２３７９２）、サッカロマイセスセレビシエＨａｎｓｅｎ、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号２０６２６、４４７７３、４４７７４、および６２９９５）、
ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓＡｎｄｒｅｗｓｅｔＧｉｌｌｉｌａｎｄｅｘｖａｎｄｅｒＷａｌｔ、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号６２９８７）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ（Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ）ｖａｎｄｅｒＷａｌｔ、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号７６４９２）、Ｐｉｃｈｉａａｎｇｕｓｔａ（Ｔｅｕｎｉｓｓｏｎｅｔａｌ．）Ｋｕｒｔｚｍａｎ、ＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａｄｅＭｏｒａｉｓｅｔＭａｉａとして寄託される有性世代、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号２６０１２）、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒｖａｎＴｉｅｇｈｅｍ、無性世代（ＡＴＣＣ受託番号９０２９）、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒｖａｎＴｉｅｇｈｅｍ、無性世代（ＡＴＣＣ受託番号１６４０４）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｅｉｄａｍ）Ｗｉｎｔｅｒ、無性世代（ＡＴＣＣ受託番号４８７５６）、およびＹａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍら）ｖａｎｄｅｒＷａｌｔｅｔｖｏｎＡｒｘ、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号２０１８４７）。

サッカロマイセスセレビシエの適切なプロモーターには、ＰＧＫＩ遺伝子、ＧＡＬ１遺伝子もしくはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣＩ、ＰＨＯ５、ＴＲＰＩ、ＡＤＨＩ、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−３−リン酸塩デヒドロゲナーゼについての遺伝子、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸塩デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸塩イソメラーゼ、グルコキナーゼ、α−接合因子フェロモン、［接合因子フェロモン］、ＰＲＢＩプロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤＩプロモーター、および他のプロモーターの５´調節領域の部分または上流活性部位を有する５´調節領域の部分のハイブリッドに関するハイブリッドプロモーター（例えば、欧州特許第Ａ−２５８０６７号のプロモーター）に関連するものが含まれる。

Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅにおける使用のための簡便な調節可能プロモーターは、Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ、（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、１０８５７−１０８６４に記載されるようなｎｍｔ遺伝子由来のチアミン抑制プロモーターおよびＨｏｆｆｍａｎ＆Ｗｉｎｓｔｏｎ、（１９９０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２４、８０７−８１６によって記載されるようなグルコース抑制ｊｂｐｌ遺伝子プロモーターである。

外来遺伝子の発現のためにＰｉｃｈｉａを形質転換する方法は、例えば、Ｃｒｅｇｇｅｔａｌ．、（１９９３）、および種々のＰｈｉｌｌｉｐ社の特許（例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる米国特許第４，８５７，４６７号）において教示され、また、Ｐｉｃｈｉａ発現キットは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＢＶ、Ｌｅｅｋ、ＮｅｔｈｒｔｌａｎｄｓおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている。適切なプロモーターには、ＡＯＸＩおよびＡＯＸ２が挙げられる。Ｇｌｅｅｓｏｎｅｔａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２、３４５９−３４６５は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａベクターおよび形質転換に関する情報を含み、適切なプロモーターは、ＭＯＸ１およびＦＭＤ１であり、一方欧州特許第３６１９９１号、Ｆｌｅｅｒｅｔａｌ．（１９９１）およびＲｈｏｎｅ−ＰｏｕｌｅｎｃＲｏｒｅｒからの他の公報は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．における異種タンパク質を発現する方法を教示し、適切なプロモーターは、ＰＧＫＩである。

例示的な転写終結シグナルは、転写終結およびポリアデニル化のための適切なシグナルを含有する真核細胞遺伝子の３´隣接配列を含む。適切な３´隣接配列は、例えば、使用する発現制御配列に天然に連結される遺伝子の配列であり得、すなわち、プロモーターに相当し得る。あるいは、異なり得、その場合、それらは、終結シグナルがサッカロマイセスセレビシエＡＤＨＩ遺伝子のものであり得る。

所望のアルブミン融合タンパクシ質は、分泌リーダー配列で最初に発現され得, それは、選択された酵母において効果的な任意のリーダーであり得る。酵母において有用なリーダーは、以下のうちのいずれかを含む。

ａ）ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１〜２１）ＭＫＶＳＶＡＡＬＳＣＬＭＬＶＴＡＬＧＳＱＡ（配列番号６）
ｂ）スタンニオカルシンシグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ、配列番号７）
ｃ）ＨＳＡシグナル配列のプレ−プロ領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ、配列番号８）
ｄ）ＨＳＡシグナル配列のプレ領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ、配列番号９）または例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ、（配列番号１０）等のその変異体
ｅ）インベルターゼシグナル配列（例えば、ＭＬＬＱＡＦＬＦＬＬＡＧＦＡＡＫＩＳＡ、配列番号１１）
ｆ）酵母接合因子αシグナル配列（例えば、ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲ、配列番号１２またはＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＤＫＲ、配列番号１２）
ｇ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素リーダー配列
ｈ）ハイブリッドシグナル配列（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＥＫＲ、配列番号１３）
ｉ）ＨＳＡ／ＭＦα−１ハイブリッドシグナル配列（ＨＳＡ／ｋｅｘ２としても既知である）（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＤＫＲ、配列番号１４）
ｊ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー／ＭＦα−１融合リーダー配列（例えば、ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＳＬＤＫＲ、配列番号１５）
ｋ）免疫グロブリンＩｇシグナル配列（例えば、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ、配列番号１６）
ｌ）フィブリンＢ前駆体シグナル配列（例えば、ＭＥＲＡＡＰＳＲＲＶＰＬＰＬＬＬＬＧＧＬＡＬＬＡＡＧＶＤＡ、配列番号１７）
ｍ）クラスター前駆体シグナル配列シグナル配列（例えば、ＭＭＫＴＬＬＬＦＶＧＬＬＬＴＷＥＳＧＱＶＬＧ、配列番号１８）
ｎ）インスリン様増殖因子結合タンパク質４シグナル配列（例えば、ＭＬＰＬＣＬＶＡＡＬＬＬＡＡＧＰＧＰＳＬＧ、配列番号１９）
ｏ）ＨＳＡシグナル配列のプレ−プロ前領域の変異体、例えば、
ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ（配列番号２０）、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＬＧ（配列番号２１）、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＬＧ（配列番号２２）、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧ（配列番号２３）、
修飾ＨＳＡリーダーＨＳＡ＃６４−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号２４）、
修飾ＨＳＡリーダーＨＳＡ＃６６−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号２５）、
修飾ＨＳＡ（Ａ１４）リーダー-ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号２６）、
修飾ＨＳＡ（Ｓ１４）リーダー（修飾ＨＳＡ＃６５としても既知である）-ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＳＧ（配列番号２７）、
修飾ＨＳＡ（Ｇ１４）リーダー-ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号２８）、またはＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧＤＬＨＫＳ（配列番号２９）
ｐ）コンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ、配列番号３０）
ｑ）酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）リーダー（例えば、ＭＦＫＳＶＶＹＳＩＬＡＡＳＬＡＮＡ配列番号３１）
ｒ）ＭＦｏｚ−１のプレ配列
ｓ）０グルカナーゼ（ＢＧＬ２）のプレ配列
ｔ）キラー毒素リーダー
ｕ）キラー毒素のプレ配列
ｖ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素キラー毒素プレプロ（２９アミノ酸、プレの１６アミノ酸、およびプロの１３アミノ酸）ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＬＥＨＴＨＲＲＧＳＬＤＫＲ（配列番号３２）
ｗ）Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓグルコアルニラーゼＩｌ分泌リーダー配列
ｘ）Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓα−ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）分泌リーダー配列
ｙ）Ｃａｎｄｉｄａｇｌｕｃｏａｒｎｙｌａｓｅリーダー配列
ｚ）欧州特許第Ａ−３８７３１９号（参照することによって本明細書に組み込まれる）に開示されるハイブリッドリーダー
ａａ）ｇｐ６７シグナル配列（バキュロウイルス発現系と併用）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１〜１９）または
ｂｂ）治療用タンパク質Ｘの天然リーダー、
ｃｃ）ＪＰ６２−０９６０８６（９１１０３６５１６として認可される、参考することによって本明細書に組み込まれる）において開示されるようなサッカロマイセスセレビシエインベルターゼ（ＳＵＣ２）リーダー、または
ｄｄ）イヌリナーゼ-ＭＫＬＡＹＳＬＬＬＰＬＡＧＶＳＡＳＶＩＮＹＫＲ（配列番号３３）。
ｅｅ）修飾ＴＡ５７プロペプチドリーダー変異体＃１-ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＫＲ（配列番号３４）
ｆｆ）修飾ＴＡ５７プロペプチドリーダー変異体＃２-ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＥＥＧＥＰＫＲ（配列番号３５）
ｇｇ）コンセンサスシグナルペプチド-ＭＷＷＲＬＷＷＬＬＬＬＬＬＬＬＷＰＭＶＷＡ（配列番号１１１）
ｈｈ）修飾ＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列−ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＧＳＬＤＫＲ（配列番号１１２）
ｉｉ）コンセンサスシグナルペプチド＃２-ＭＲＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ（配列番号１０５）

アルブミン融合タンパク質の組み換え産生および合成的産生のさらなる方法

本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および合成技術および組み換え技術によるアルブミン融合タンパク質の産生に関する。例えば、ベクターは、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製可能または複製欠損であり得る。後者の場合、一般的にウイルス増殖は、相補宿主細胞においてのみ生じる。

本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物等の沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベクターがウイルスである場合、このベクターは、適切なパッケージング細胞株を使用して体外でパッケージングされ、次に、宿主細胞に形質導入され得る。

ポリヌクレオチド挿入物は、いくつか挙げると、例えば、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター等の、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは当業者に既知である。発現構築物はさらに、転写開始、転写終結のための部位、および転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。この構築物によって発現される転写物のコード部分は、始めに翻訳開始コドン、および翻訳されるポリペプチドの末端に適切に配置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含み得る。

示されるように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことができる。このようなマーカーは、真核細胞培養のためにはジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、グルタミンシンターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、ならびに大腸菌および他の細菌においてインキュベートするためにはテトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺伝子を含み得る。適切な宿主の典型的な例は、大腸菌、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞等の細菌細胞、酵母細胞（例えば、サッカロマイセスセレビシエまたはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））等の真菌細胞、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞等の動物細胞、ならびに植物細胞を含むが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当該分野において既知である。

細菌における使用のための例示的なベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．から入手可能）、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．から入手可能なｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、およびＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。例示的な真核生物ベクターの中には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ、ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。酵母系における使用のための例示的な発現ベクターとして、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｂａｄ、ＣＡから入手可能）が含まれるがこれらに限定されない。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかであるだろう。

一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質の局在化を原核生物細胞または真核生物細胞の特定の画分を指向し、および／または原核生物細胞または真核生物細胞由来の本発明のタンパク質の分泌を指向するシグナル配列に融合され得る。例えば、大腸菌において、周辺質空間にタンパク質の発現を指向することが望まれ得る。本発明のアルブミン融合タンパク質が、細菌の周辺質空間にポリペプチドの発現を方向づけるために融合され得るシグナル配列またはタンパク質（それらのフラグメント）の例として、ｐｅｌＢシグナル配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）シグナル配列、ＭＢＰ、ｏｍｐＡシグナル配列、周辺質大腸菌熱不安定エンテロトキシンＢサブユニットのシグナル配列、およびアルカリンホスファターゼのシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのベクターは、タンパク質（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから入手可能なベクターのｐＭＡＬ種（特定のｐＭＡＬ−ｐ種）の局在化を指向する融合タンパク質の構築のために市販されている。具体的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドアルブミン融合タンパク質は、ｐｅｌＢペクチン酸塩リアーゼシグナル配列に融合されてもよく、グラム陰性細菌におけるこのようなポリペプチドの発現および精製の効率を高める。米国特許第５，５７６，１９５号および第５，８４６，８１８号を参照されたく、また、本内容は、参照することによって本明細書中に組み込まれる。

哺乳動物細胞におけるその分泌を方向付けるために本発明のアルブミン融合タンパク質に融合され得るシグナルペプチドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。

ａ）ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１〜２１）ＭＫＶＳＶＡＡＬＳＣＬＭＬＶＴＡＬＧＳＱＡ（配列番号６）
ｂ）スタンニオカルシンシグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ、配列番号７）
ｃ）ＨＳＡシグナル配列のプレ−プロ領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ、配列番号８）
ｄ）ＨＳＡシグナル配列のプレ領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ、配列番号９）または例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ等のその変異体（配列番号１０）
ｅ）インベルターゼシグナル配列（例えば、ＭＬＬＱＡＦＬＦＬＬＡＧＦＡＡＫＩＳＡ、配列番号１１）
ｆ）酵母接合因子αシグナル配列（例えば、ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲ、配列番号１２またはＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＤＫＲ、配列番号１２）
ｇ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素リーダー配列
ｈ）ハイブリッドシグナル配列（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＥＫＲ、配列番号１３）
ｉ）ＨＳＡ／ＭＦα−１ハイブリッドシグナル配列（ＨＳＡ／ｋｅｘ２としても既知）（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＤＫＲ、配列番号１４）
ｊ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー／ＭＦα−１融合リーダー配列（例えば、ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＳＬＤＫＲ、配列番号１５）
ｋ）免疫グロブリンＩｇシグナル配列（例えば、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ、配列番号１６）
ｌ）フィブリンＢ前駆体シグナル配列（例えば、ＭＥＲＡＡＰＳＲＲＶＰＬＰＬＬＬＬＧＧＬＡＬＬＡＡＧＶＤＡ、配列番号１７）
ｍ）クラスター前駆体シグナル配列（例えば、ＭＭＫＴＬＬＬＦＶＧＬＬＬＴＷＥＳＧＱＶＬＧ、配列番号１８）
ｎ）インスリン様増殖因子結合タンパク質４シグナル配列（例えば、ＭＬＰＬＣＬＶＡＡＬＬＬＡＡＧＰＧＰＳＬＧ、配列番号１９）
ｏ）ＨＳＡシグナル配列のプレ−プロ前領域の変異体グナル配列、例えば、
ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ（配列番号２０）、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＬＧ（配列番号２１）、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＬＧ（配列番号２２）、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧ（配列番号２３）、
修飾ＨＳＡリーダーＨＳＡ＃６４−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号２４）、
修飾ＨＳＡリーダーＨＳＡ＃６６−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号２５）、
修飾ＨＳＡ（Ａ１４）リーダー-ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号２６）、
修飾ＨＳＡ（Ｓ１４）リーダー（修飾ＨＳＡ＃６５としても既知）-ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＳＧ（配列番号２７）、
修飾ＨＳＡ（Ｇ１４）リーダー−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号２８）、またはＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧＤＬＨＫＳ（配列番号２９）
ｐ）コンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ、配列番号３０）
ｑ）酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）リーダー（例えば、ＭＦＫＳＶＶＹＳＩＬＡＡＳＬＡＮＡ配列番号３１）
ｒ）ＭＦｏｚ−１のプレ配列
ｓ）グルカナーゼ（ＢＧＬ２）のプレ配列
ｔ）キラー毒素リーダー
ｕ）キラー毒素のプレ配列
ｖ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素プレプロ（２９アミノ酸、プレの１６アミノ酸、およびプロの１３アミノ酸）ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＬＥＨＴＨＲＲＧＳＬＤＫＲ（配列番号３２）
ｗ）Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓグルコアルニラーゼＩｌ分泌リーダー配列
ｘ）Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓα−ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）分泌リーダー配列
ｙ）Ｃａｎｄｉｄａｇｌｕｃｏａｒｎｙｌａｓｅリーダー配列
ｚ）欧州特許第Ａ−３８７３１９号（参照することによって本明細書に組み込まれる）に開示されるハイブリッドリーダー
ａａ）ｇｐ６７シグナル配列（バキュロウイルス発現系と併用）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１〜１９）または
ｂｂ）治療用タンパク質Ｘの天然リーダー、
ｃｃ）ＪＰ６２−０９６０８６（９１１０３６５１６として認可される、参考することによって本明細書に組み込まれる）において開示されるサッカロマイセスセレビシエインベルターゼ（ＳＵＣ２）リーダー、または
ｄｄ）イヌリナーゼ−ＭＫＬＡＹＳＬＬＬＰＬＡＧＶＳＡＳＶＩＮＹＫＲ（配列番号３３）。
ｅｅ）修飾ＴＡ５７プロペプチドリーダー変異体＃１−ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＫＲ（配列番号３４）
ｆｆ）修飾ＴＡ５７プロペプチドリーダー変異体＃２−ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＥＥＧＥＰＫＲ（配列番号３５）
ｇｇ）コンセンサスシグナルペプチド−ＭＷＷＲＬＷＷＬＬＬＬＬＬＬＬＷＰＭＶＷＡ（配列番号１１１）
ｊｊ）修飾ＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列−ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＧＳＬＤＫＲ（配列番号１１２）
ｋｋ）コンセンサスシグナルペプチド＃２-ＭＲＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ（配列番号１０５）

ある実施形態において、修飾ＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列（配列番号１１２）は、本明細書に記載のアルブミンおよび治療用タンパク質を含む融合タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質ならびに国際公開第ＷＯ９３／１５１９９号、第ＷＯ９７／２４４４５号、第ＷＯ０３／６００７１号、第ＷＯ０３／５９９３４号、およびＰＣＴ／ＵＳ第０４／０１３６９号に記載されるアルブミン融合タンパク質のアミノ末端に融合され、これらの各々は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。修飾ＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列は、例えば、Ｓｌｅｅｐｅｔａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９９０、ｖｏｌ．８、ｐｐ．４２−４６、および米国特許第５，３０２，６９７号に開示されるＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列（配列番号１４）に基づき、その両方は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される修飾ＨＳＡ／ｋｅｘ２リーダー配列は、親シグナルペプチドの残基１９において非保存アミノ酸置換（ＡｒｇからＧｌｙ）を含有する。修飾ＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナルペプチドは、非修飾ＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列よりも、酵母において発現される場合にアルブミン融合タンパク質の予想外に優れた発現収率および／または切断をもたらすことが発見されている。修飾ＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナルペプチドの変異体も、本発明によって包含される。具体的には、配列番号１１２の位置１９におけるＧｌｙ残基は、プロ残基と置換され得る。修飾ＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列の他の保存的置換変異体も意図される。配列番号１１２の修飾ＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列をコードする核酸ならびにその保存的置換変異体も、本発明によって包含される。

グルタミン合成酵素（ＧＳ）またはＤＨＦＲを、選択マーカーとして使用するベクターは、それぞれメチオニンスルホキシミンまたはメトトレキサートである薬物の存在下で増幅可能である。グルタミン合成酵素ベースのベクターの利点は、グルタミン合成酵素陰性の細胞株例えば、ネズミ骨髄腫細胞株（ＮＳＯ））が利用可能であることである。また、グルタミン合成酵素発現系は、グルタミン合成酵素発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）においても、さらなる阻害剤を提供して内因性遺伝子の機能を妨げることにより、機能可能である。グルタミン合成酵素発現系およびその成分は、ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号、第ＷＯ８６／０５８０７号、第ＷＯ８９／０１０３６号、第ＷＯ８９／１０４０４号、および第ＷＯ９１／０６６５７号（参照することによって、その全体が本明細書に組み込まれる）において記載される。さらに、グルタミン合成酵素発現ベクターは、ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ、ＮＨ）から入手可能である。ＧＳ発現系を使用する、ネズミ骨髄腫細胞における単クローン抗体の発現および産生は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６９（１９９２）ならびにＢｉｂｌｉａａｎｄＲｏｂｉｎｓｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１：１（１９９５）において記載され、これらは、参照することによって本明細書中に組み込まれる。

また、本発明は、本明細書中で記載される上述のベクター構築物を含む宿主細胞にも関し、また、本発明のヌクレオチド配列を含む宿主細胞をさらに包含し、このヌクレオチド配列は、当該分野で既知の技術を使用して、１つ以上の異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と作動可能に連結される。宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞）等の高等な真核生物細胞もしくは酵母細胞等の下等な真核生物細胞であり得るか、または宿主細胞は、細菌細胞のような原核生物細胞であり得る。挿入遺伝子配列の発現を調節する宿主菌株、または遺伝子産物を所望の特別な様式で修飾もしくはプロセシングする宿主株が選択され得る。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導因子の存在下で、増大し得るため、遺伝子操作されたポリペプチドの発現は、制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、翻訳ならびに翻訳後のタンパク質のプロセシングおよび修飾（例えば、リン酸化、切断）について、特徴および特定の機構を有する。適切な細胞株は、発現する異種タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実にするように、選択可能である。

本発明の核酸および核酸構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によって達成可能である。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９８６）等の、多くの標準的研究室マニュアルにおいて記載される。本発明のポリペプチドが、実際に組み換えベクターを欠く宿主細胞によって発現され得ることが、具体的に想定される。

本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに加えて、本発明は、脊椎動物由来（具体的には、哺乳動物由来）の１次宿主細胞、２次宿主細胞、および不死化宿主細胞も包含し、これらの宿主細胞は、内因性遺伝子物質（例えば、治療用タンパク質に相当するコード配列は、治療用タンパク質に相当するアルブミン融合タンパク質と置き換えられ得る）を欠失または置換するように操作されており、および／または遺伝物質（例えば、治療用タンパク質に相当する本発明のアルブミン融合タンパク質等の、例えば異種ポリヌクレオチド配列）を含むように設計される。内因性ポリヌクレオチドと作動可能に連結する遺伝物質は、内因性のポリヌクレオチドを活性化、変更、および／または増幅し得る。

さらに、当該分野で既知の技術は、相同的組み換えを介して、異種ポリヌクレオチド（例えば、アルブミンタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体をコードするポリヌクレオチド）および／または異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を、治療用タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列と、作動可能に連結するために使用され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号、国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８９３２−８９３５（１９８９）、およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照されたく、これらの各々の開示は、参照することによってその全体が組み込まれる）。

本発明のアルブミン融合タンパク質は、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷相互作用クロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法によって組み換え細胞培養から回収および精製可能である。別の態様において、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。

いくつかの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製され、この陰イオン交換クロマトグラフィーには、Ｑ−セファロースカラム、ＤＥＡＥセファロースカラム、ポロスＨＱカラム、ポロスＤＥＡＥカラム、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＱカラム、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＱＡＥカラム、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＤＥＡＥカラム、リソース／ソースＱカラムおよびリソース／ソースＤＥＡＥカラム、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＱカラムならびにＦｒａｃｔｏｇｅｌＤＥＡＥカラムが含まれるがこれらに限定されない。

具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製され、この陽イオン交換クロマトグラフィーには、ＳＰ−セファロースカラム、ＣＭセファロースカラム、ポロスＨＳカラム、ポロスＣＭカラム、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＳＰカラム、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＣＭカラム、リソース／ソースＳカラムおよびリソース／ソースＣＭカラム、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラムおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌＣＭカラムならびにこれらの等価物および類似物が含まれるがこれらに限定されない。

具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して精製され、この疎水性相互作用クロマトグラフィーには、フェニル−セファロースカラム、ブチル−セファロースカラム、メチル−セファロースカラム、オクチル−セファロースカラム、ヘキシル−セファロースカラム、ポロスフェニルカラム、ポロスブチルカラム、ポロスメチルカラム、ポロスオクチルカラム、ポロスヘキシルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌフェニルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌメチルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌオクチルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌヘキシルカラム、リソース／ソースフェニルカラム、リソース／ソースブチルカラム、リソース／ソースメチルカラム、リソース／ソースオクチルカラム、リソース／ソースヘキシルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌフェニルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌブチルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌメチルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌオクチルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌヘキシルカラム、ならびにこれらの等価物および類似物が含まれるが、これらに限定されない。

具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製され、このサイズ排除クロマトグラフィーには、セファロースＳ１００カラム、セファロースＳ２００カラム、セファロースＳ３００カラム、セファデックスレジンカラム、ならびにこれらの等価物および類似物が含まれるがこれらに限定されない。

具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され、このアフィニティークロマトグラフィーには、ＭｉｍｅｔｉｃＤｙｅアフィニティーカラム、ペプチドアフィニティーカラム、および抗体アフィニティーカラムが含まれるがこれらに限定されず、これらのカラムは、ＨＳＡまたは「融合標的」分子のいずれかに関して選択的である。

いくつかの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、上に列挙した１つ以上のクロマトグラフィー方法を使用して精製される。他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＱセファロースＦＦカラム、ＳＰセファロースＦＦカラム、Ｑセファロース高性能カラム、ブルーセファロースＦＦカラム、ブルーカラム、フェニルセファロースＦＦカラム、ＤＥＡＥセファロースＦＦカラム、またはメチルカラムのうちの１つ以上のクロマトグラフィーカラムを使用して精製される。

さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第ＷＯ００／４４７７２号（本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載された過程を使用して精製され得る。当業者は、この中で記載される過程を、本発明のアルブミン融合タンパク質の精製における使用のために容易に修正し得る。

本発明のアルブミン融合タンパク質は、化学合成手順の産物、および組み換え技術により原核細胞宿主または真核細胞宿主から生成される産物であって、例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が含まれる産物から回収され得る。組み換え生成手順において用いられるる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化または非グリコシル化であり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、場合により、宿主媒介過程の結果として、冒頭のメチオニン残基の修飾も含み得る。したがって、全ての真核細胞において、翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンが、任意のタンパク質から、一般的に、翻訳後に効率的に除去されることは、当該分野において既知である。殆どのタンパク質におけるＮ末端メチオニンはまた、殆どの原核生物においても効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質については、Ｎ末端メチオニンが共有結合するアミノ酸の性質に依存して、この原核生物除去過程が非効率的である。

一実施形態において、酵母Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓは、真核細胞系において、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現させるために使用される。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓは、メタノールをその唯一の炭素源として代謝可能なメチロトローフ酵母である。メタノール代謝経路における主要なステップは、Ｏ_２を使用してのホルムアルデヒドへのメタノールの酸化である。この反応は、酵素アルコールオキシダーゼによって触媒される。その唯一の炭素源としてメタノールを代謝するために、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｏ_２に対するアルコールオキシダーゼの比較的低い親和性に部分的に起因して、高レベルのアルコールオキシダーゼを生成しなければならない。結果的に、主要な炭素源としてメタノールに依存する増殖培地において、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）のうちの１つのプロモーター領域は、高度に活性である。メタノールの存在下で、ＡＯＸ１遺伝子から産生されるアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓにおける総可溶性タンパク質のうち、最大およそ３０％を含む。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂ．ｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１−２１（１９８５）、Ｋｏｕｔｚ，Ｐ．Ｊ．ｅｔａｌ．、Ｙｅａｓｔ５：１６７〜７７（１９８９）、Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ．ｅｔａｌ．、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：３８５９〜７６（１９８７）を参照されたい。したがって、例えば、本発明のポリヌクレオチド等の、ＡＯＸ１調節配列の全部または一部の転写調節下の異種コード配列は、メタノールの存在下で増殖したＰｉｃｈｉａ酵母において非常に高レベルで発現される。

一例において、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋは、「ＰｉｃｈｉａＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」、Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＪ．Ｃｒｅｇｇｅｄｓ．ＴｈｅＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８において本質的に記載される、Ｐｉｃｈｉａｅａ酵母系において本明細書中に示される本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現させるために使用される。この発現ベクターによって、多重クローニング部位の上流に位置するＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、リーダー）に連結された強力なＡＯＸ１プロモーターの効力によって、本発明のポリペプチドの発現および分泌が可能になる。

ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５等の、多くの他の酵母ベクターは、当業者が容易に理解するように、提案された発現構築物が、必要に応じてインフレームのＡＵＧを含む転写、翻訳、分泌（所望される場合）等のために適切に配置されたシグナルを提供する限り、ｐＰＩＣ９Ｋの代わりに使用され得る。

別の実施形態において、異種コード配列、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド等の高レベルの発現は、本発明の異種ポリヌクレオチドを、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺα等の発現ベクター中にクローニングし、そしてメタノールの非存在下で酵母培養物を増殖させることによって達成され得る。

さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該分野で既知の技術を使用して化学合成が可能である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．ａｎｄＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３１０：１０５〜１１１（１９８４）を参照）。例えば、ポリペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成可能である。さらに、必要に応じて、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体が、置換または付加としてこのポリペプチド配列に導入可能である。非古典的アミノ酸には、通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、ｂ−メチルアミノ酸等のデザイナーアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および、概してアミノ酸類似体が含まれるがこれらに限定されない。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であることが可能である。

本発明は、翻訳中または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの連結等によって示差的に修飾される本発明のアルブミン融合タンパク質を包含する。任意の多数の化学的修飾が、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ_４による特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成等を含むがこれらだけに限定されない既知の技術によって実行され得る。

本発明によって包含されるさらなる翻訳後修飾には、例えば、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸骨格への化学的部分の付着、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原核宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加もしくは欠失を含む。また、アルブミン融合タンパク質は、酵素標識、蛍光標識、同位体標識、または親和性標識等の検出可能な標識を用いて修飾して、タンパク質の検出および単離を可能にすることができる。

適切な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、適切な蛍光物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例として、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、適切な放射活性物質の例として、ヨウ素（^１２１Ｉ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１１Ｉｎ、^１１２Ｉｎ、^１１３ｍＩｎ、^１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（^９９Ｔｃ，^９９ｍＴｃ）、タリウム（^２０１Ｔｉ）、ガリウム（^６８Ｇａ、^６７Ｇａ）、パラジウム（（^１０３Ｐｄ）、モリブデン（^９９Ｍｏ）、キセノン（^１３３Ｘｅ）、フッ素（^１８Ｆ）、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１５９Ｇｄ、^１４９Ｐｍ、^１４０Ｌａ、^１７５Ｙｂ、^１６６Ｈｏ、^９０Ｙ、^４７Ｓｃ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１４２Ｐｒ、^１０５Ｒｈ、ａｎｄ^９７Ｒｕが挙げられる。

具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質またはそのフラグメントもしくは変異体は、^１７７Ｌｕ、^９０Ｙ、^１６６Ｈｏ、および^１５３Ｓｍを含むがこれらに限定されない放射性金属イオンと結合する、ポリペプチドに対する大環状のキレーターに結合する。別の実施形態において、大環状のキレーターと結合する放射性金属イオンは、^１１１Ｉｎである。別の実施形態において、大環状のキレーターと結合する放射性金属イオンは、^９０Ｙである。具体的な実施形態において、大環状のキレーターは、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´´−４酢酸（ＤＯＴＡ）である。他の具体的な実施形態において、ＤＯＴＡは、リンカー分子を介して本発明の抗体またはそのフラグメントに結合する。ＤＯＴＡがポリペプチドに共役するために有用なリンカー分子の例は、一般的に当該分野において既知である。例えば、ＤｅＮａｒｄｏｅｔａｌ．、ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４（１０）：２４８３−９０（１９９８）；Ｐｅｔｅｒｓｏｎｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５５３−７（１９９９）、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｅｔａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：９４３−５０（１９９９）を参照されたく、これらは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、翻訳後プロセシング等の天然プロセスまたは当該分野で既知の化学修飾技術のいずれかによって、修飾され得る。同じ型の修飾が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じ程度または種々の程度で存在し得ることが、理解される。本発明のポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝状であり得、そしてそのポリペプチドは、分枝を含むまたは含まない環状であり得る。環状ポリペプチド、分枝状ポリペプチド、および分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化等のタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が含まれる（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、２ｎｄＥｄ．、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）、ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬＣＯＶＡＬＥＮＴＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．ＪｏｈｎｓｏｎＥｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．１−１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒｅｔａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ１８２：６２６−６４６（１９９０）、Ｒａｔｔａｎｅｔａｌ．、ＡｎｎＮＹＡｃａｄＳｃｉ６６３：４８−６２（１９９２）を参照）。

本発明のアルブミン融合タンパク質、および治療用タンパク質またはそのフラグメントもしくは変異体に結合する抗体は、精製を容易にするためのペプチド等のマーカー配列に融合可能である。いくつかの実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、例えば、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ＥｔｏｎＡｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）にて提供されるタグであり、その多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製のために有用な他のペプチドタグには、「ＨＡ」タグおよび「ｆｌａｇ」タグが挙げられるがこれらに限定されず、この「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ３７：７６７（１９８４））。

さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、細胞毒素等の治療用部分、例えば細胞増殖抑制因子もしくは細胞殺傷因子、治療剤または放射性金属イオン、例えば２１３Ｂｉ等の例えば、α−放出体等に共役され得る。細胞毒素または細胞毒性薬は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例として、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにその類似体または同族体が挙げられる。治療剤には、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルマスティン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アンスラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれるがこれらに限定されない。

本発明の共役体は、所定の生物学的応答を修飾するために使用可能であり、治療剤または薬物部分は、古典的な化学的治療薬剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物成分は、所望の生物学的活性を所有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素等の毒素、腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えば、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＡＩＭＩ（国際公開番号第ＷＯ９７／３３８９９号参照）、ＡＩＭＩＩ（国際公開番号第ＷＯ９７／３４９１１号を参照）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開番号第ＷＯ９９／２３１０５を参照）、例えばアンジオスタチンもしくはエンドスタチン等の血栓剤または血管新生阻害剤等のタンパク質、例えばリンホカイン、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の成長因子のような生物学的応答修飾剤を含まれ得る。このような治療用部分をタンパク質（例えば、アルブミン融合タンパク質）に共役する技術は、当該分野において既知である。

また、アルブミン融合タンパク質は、固体支持体に付着されてもよく、この固体支持体は、本発明のアルブミン融合タンパク質よって結合されるか、それに結合するか、またはそれと会合するポリペプチドの免疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルド、またはポリプロピレンを含むがこれらに限定されない。

アルブミン融合タンパク質は、それに共役した治療用部分を含むか、または含まずに、単独、または細胞傷害性因子（単数または複数）および／またはサイトカイン（単数または複数）と併用して治療剤として投与される。

本発明のアルブミン融合タンパク質が治療用タンパク質に結合する抗体のＶＨドメインのみを含む実施形態において、治療用タンパク質に結合する同一の抗体のＶＬドメインとの融合タンパク質を同時発現して、ＶＨアルブミン融合タンパク質およびＶＬタンパク質が、翻訳後に（共有結合または非共有結合のいずれかにより）会合することが必要および／または所望され得る。

本発明のアルブミン融合タンパク質が、治療用タンパク質に結合する抗体のＶＬドメインのみを含む実施形態において、治療用タンパク質に結合する同一の抗体のＶＨドメインとの融合タンパク質を同時発現して、ＶＬアルブミン融合タンパク質およびＶＨタンパク質が、翻訳後に（共有結合または非共有結合のいずれかにより）会合することが必要および／または所望され得る。

いくつかの治療抗体は、２重特異性抗体であり、治療用タンパク質に結合する抗体が、２つの異なる重鎖／軽鎖対、および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体であることを意味する。その治療用タンパク質に対応するアルブミン融合タンパク質を生成するために、アルブミンタンパク質部分のＮ末端およびＣ末端の両方に融合されたｓｃＦｖフラグメントを有するアルブミン融合タンパク質を生成することが可能である。より具体的には、アルブミンのＮ末端に融合されたｓｃＦｖは、治療用タンパク質に結合する本来の抗体の重鎖／軽鎖（ＶＨ／ＶＬ）対の一方に対応し得、また、アルブミンのＣ末端に融合されたｓｃＦｖは、治療用タンパク質に結合する本来の抗体の重鎖／軽鎖（ＶＨ／ＶＬ）対の他方に対応し得る。

また、ポリペプチドの溶解度、安定性、および循環時間の増加、または免疫原性の低下等の追加の利点を提供し得る、本発明のアルブミン融合タンパク質の化学的に修飾された誘導体も、本発明によって提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照）。誘導体化のための化学的成分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーから選択され得る。アルブミン融合タンパク質は、分子内の無作為な位置、または分子内の所定の位置で修飾されてもよく、また、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の付着された化学的部分を含んでもよい。

ポリマーは、任意の分子量を有してもよく、また分枝または非分枝であり得る。ポリエチレングリコールに関し、分子量は、取り扱いおよび製造を容易にするために、約１ｋＤａから約１００ｋＤａの間である（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製物中で、いくつかの分子が述べられた分子量よりいくらか大きいか、または小さい重量であることを示す）。他のサイズも、所望の治療プロファイル（例えば、所望の持続放出の持続期間、存在する場合生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如、および治療用タンパク質または類似体に対するポリエチレングリコールの他の既知の効果）に依存して使用され得る。例えば、ポリエチレングリコールは約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。

前述のように、ポリエチレングリコールは、分枝構造を有し得る。分枝ポリエチレンは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号、Ｍｏｒｐｕｒｇｏｅｔａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）、Ｖｏｒｏｂｊｅｖｅｔａｌ．、ＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１８：２７４５−２７５０（１９９９）、およびＣａｌｉｃｅｔｉｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）に記載されており、これらの各々開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。

ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、タンパク質の機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する影響を考慮してタンパク質に付着されるべきである。当業者に利用可能な多くの付着方法があり、例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる欧州特許第０４０１３８４号に開示される方法（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧの結合）、トレシルクロライドを用いるＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する、Ｍａｌｉｋｅｔａｌ．、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５（１９９２）もまた参照されたい。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノ基またはカルボキシル基等の反応基を経由してアミノ酸残基を通じて共有結合され得る。反応基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得るような基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基は、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含んでもよく、遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基を含み得る。また、スルフヒドリル基も、ポリエチレングリコール分子を付着するための反応基として使用され得る。治療目的のために、Ｎ末端またはリジン基における付着等の付着がアミノ基において行われ得る。

上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、任意の数のアミノ酸残基への連結を経由してタンパク質に付着され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基への共有結合を経由してタンパク質に結合され得る。１つ以上の反応化学薬品が、ポリエチレングリコールを、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）、またはタンパク質の１つ以上の型の特異的アミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびこれらの組合せ）に付着するために用いられ得る。

Ｎ末端において化学的に修飾されるタンパク質が、具体的に所望され得る。本発明の組成物の例示として、ポリエチレングリコールを使用して、当業者は、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝等によって）、反応混合物中のポリエチレングリコール分子対タンパク質（ポリペプチド）分子の割合、実行されるペグ化反応の型、および選択されるＮ末端ペグ化タンパク質を得る方法から選択し得る。Ｎ末端ペグ化調製物を得る（すなわち、この部分を、必要に応じて、他のモノペグ化部分から分離する）方法は、Ｎ末端ペグ化物質をペグ化タンパク質分子の集団から精製することによってであり得る。Ｎ末端修飾において化学的に修飾された選択的タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（Ｎ末端に対してリジン）の異なる反応性を利用する還元型アルキル化によって達成され得る。適切な反応条件の下で、カルボキシル基含有ポリマーを用いたＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。

上記に示されるように、本発明のアルブミン融合タンパク質のペグ化は、多様な手段により達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、アルブミン融合タンパク質に、直接的にまたは介在リンカーによってかのいずれかで付着され得る。ポリエチレングリコールをタンパク質に付着するための無リンカー系は、Ｄｅｌｇａｄｏｅｔａｌ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．ＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｔａｌ．、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆＨｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）、米国特許第４，００２，５３１号、米国特許第５，３４９，０５２号、国際公開第ＷＯ９５／０６０５８号、および第ＷＯ９８／３２４６６号に記載され、これらの各々の開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。

ポリエチレングリコールをタンパク質のアミノ酸残基に介入リンカーを使用せずに直接付着するための１つの系は、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）のトレシルクロリド（ＣｌＳＯ_２ＣＨ_２ＣＦ_３）を使用した修飾により産生される、トレシル化ＭＰＥＧを使用する。タンパク質とトレシル化ＭＰＥＧとの反応の際に、ポリエチレングリコールは、そのタンパク質のアミン基に直接付着される。したがって、本発明は、本発明のタンパク質と、２，２，２−トリフルオロエタンスルホニル基を有するポリエチレングリコール分子とを反応させることによって産生される、タンパク質−ポリエチレングリコール共役体を包含する。

また、ポリエチレングリコールは、多くの異なる介入リンカーを使用してタンパク質に結合可能である。例えば、開示全体が本明細書に参照することによって組み込まれる米国特許第５，６１２，４６０号は、ポリエチレングリコールをタンパク質に連結するためのウレタンリンカーを開示する。また、ポリエチレングリコールがリンカーによってタンパク質に結合されるタンパク質−ポリエチレングリコール共役体は、タンパク質と、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、１，１´−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロペニルカーボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカーボネート、および種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体等の化合物との反応によって産生可能である。ポリエチレングリコールをタンパク質に付着するための、多くの追加のポリエチレングリコール誘導体および反応化学は、開示全体が本明細書に参照することによって組み込まれる国際公開番号第ＷＯ９８／３２４６６号に記載される。本明細書中に記載される反応化学を使用して産生されるペグ化タンパク質産物は、本発明の範囲内に含まれる。

本発明の各アルブミン融合タンパク質に付着されるポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換の程度）も変化し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、平均して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、１７個、２０個、またはそれ以上のポリエチレングリコール分子に連結され得る。同様に、平均した置換の程度は、１タンパク質分子あたり、１〜３個、２〜４個、３〜５個、４〜６個、５〜７個、６〜８個、７〜９個、８〜１０個、９〜１１個、１０〜１２個、１１〜１３個、１２〜１４個、１３〜１５個、１４〜１６個、１５〜１７個、１６〜１８個、１７〜１９個、または１８〜２０個等のポリエチレングリコール部分の範囲である。置換の程度を判断するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏｅｔａｌ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．ＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）において議論される。

本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれるがこれらに限定されない標準的な方法によって、化学合成および組み換え細胞培養から回収および精製可能である。本発明の一態様において、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）は、精製のために使用される。タンパク質の再折り畳みのための既知の技術は、ポリペプチドが、単離および／または精製の間に変性される場合、活性な配座を再生するために使用され得る

本発明のアルブミン融合タンパク質の存在または量は、当該分野で既知の免疫アッセイであるＥＬＩＳＡを使用して判断され得る。１つのＥＬＩＳＡにおいて、本発明のアルブミン融合タンパク質を検出／定量化するために有用なプロトコルは、ＥＬＩＳＡプレートを、抗ヒト血清アルブミン抗体で被覆するステップ、プレートをブロッキングして非特異的結合を防止するステップ、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄するステップ、本発明のアルブミン融合タンパク質を含有する溶液を（１以上の異なる濃度で）付加するステップ、検出可能な標識に連結された２次抗治療用タンパク質特異的抗体を付加するステップ（本明細書中に記載されるかまたはそうでなければ当該分野で既知のように）、および２次抗体の存在を検出ステップを含む。このプロトコルの代替的バージョンにおいて、ＥＬＩＳＡプレートは、抗治療用タンパク質特異的抗体で被覆されてもよく、その標識２次試薬は、抗ヒトアルブミン特異的抗体であり得る。

ポリヌクレオチドの使用

本明細書中で特定されるポリヌクレオチドの各々は、多くの様式において試薬として使用可能である。以下の説明は、例示的であると見なされるべきであり、また、既知の技術を利用する。

本発明のポリヌクレオチドは、本発明のアルブミン融合タンパク質を産生するために有用である。以下により詳細に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド（アルブミン融合タンパク質をコードする）は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによってコードされるアルブミン融合タンパク質を発現する細胞、細胞株、または組織を作製するために、遺伝子工学において有用な組み換えＤＮＡ法において使用され得る。

また、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子療法において有用である。遺伝子療法の１つの目標は、遺伝的欠損を矯正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する生物に正常な遺伝子を挿入することである。本発明において開示されるポリヌクレオチドは、高度に正確な様式でこのような遺伝的欠損を標的化する手段を提供する。別の目標は、宿主ゲノムに存在しなかった新たな遺伝子を挿入することにより、宿主細胞において新たな形質を産生することである。本発明によって包含される遺伝子療法のさらなる非限定的例は、本明細書中の他の箇所により十分に記載される（例えば、「遺伝子療法」と表された節ならびに実施例６１および６２を参照されたい）。

ポリペプチドの使用

本明細書中で特定されるポリペプチドの各々は、多くの様式において使用可能である。以下の説明は、例示的であると見なされるべきであり、また、既知の技術を利用する。

本発明のアルブミン融合タンパク質は、組織（例えば、ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼの等の免疫組織化学アッセイ（Ｈｓｕｅｔａｌ．、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２９：５７７−５８０（１９８１））または細胞型（例えば、免疫細胞化学アッセイ）の差次的同定のための免疫学的プローブを提供するために有用である

アルブミン融合タンパク質を使用して、当業者に既知の古典的な免疫組織学的な方法を使用して、生体サンプル中のポリペプチドのレベルをアッセイ可能である（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）、Ｊａｌｋａｎｅｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照）。タンパク質の遺伝子発現を検出するのに有用な他の方法には、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））等の免疫アッセイが含まれる。適切なアッセイの標識は、当該分野で既知であり、また、グルコースオキシダーゼ等の酵素標識、ヨウ素（^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^１２１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１５ｍＩｎ、^１１３ｍＩｎ、^１１２Ｉｎ、^１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（^９９Ｔｃ、^９９ｍＴｃ）、タリウム（^２０１Ｔｉ）、ガリウム（^６８Ｇａ、^６７Ｇａ）、パラジウム（^１０３Ｐｄ）、モリブデン（^９９Ｍｏ）、キセノン（^１３３Ｘｅ）、フッ素（^１８Ｆ）、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１５９Ｇｄ、^１４９Ｐｍ、^１４０Ｌａ、^１７５Ｙｂ、^１６６Ｈｏ、^９０Ｙ、^４７Ｓｃ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１４２Ｐｒ、^１０５Ｒｈ、^９７Ｒｕ等の放射性同位体、ルミノール等の発光標識、ならびにフルオレセインやローダミンおよびビオチン等の蛍光標識が含まれる。

また、本発明のアルブミン融合タンパク質は、画像化により体内検出可能である。タンパク質の体内画像化のための抗体の標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、または電子スピン緩和（ＥＳＲ）により検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法に適切な標識は、バリウムまたはセシウム等の放射性同位体を含み、これは検出可能な放射線を放射するが、被験体に対して明らかで有害あることはない。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーは、重水素等の、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカーを含み、これは、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現する細胞株に生じた栄養分を標識することによりアルブミン融合タンパク質中に取り込まれ得る。

放射性同位体（例えば、^１３１Ｉ、^１１２Ｉｎ、^９９ｍＴｃ、（^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^１２１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１５ｍＩｎ、^１１３ｍＩｎ、^１１２Ｉｎ、^１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（^９９Ｔｃ、^９９ｍＴｃ）、タリウム（^２０１Ｔｉ）、ガリウム（^６８Ｇａ、^６７Ｇａ）、パラジウム（^１０３Ｐｄ）、モリブデン（^９９Ｍｏ）、キセノン（^１３３Ｘｅ）、フッ素（^１８Ｆ、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１５９Ｇｄ、^１４９Ｐｍ、^１４０Ｌａ、^１７５Ｙｂ、^１６６Ｈｏ、^９０Ｙ、^４７Ｓｃ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１４２Ｐｒ、^１０５Ｒｈ、^９７Ｒｕ）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料等の、適切な検出可能な画像化部分で標識された、アルブミン融合タンパク質は、免疫系障害について検査されるべき哺乳動物に（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に）導入される。被験体のサイズおよび使用する画像化システムによって、診断画像を生成するために必要な画像化部分の量が決定されることが当該分野において理解される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、約５から２０ミニキュリーまでの^９９ｍＴｃの範囲である。次に、標識されたアルブミン融合タンパク質は、一つ以上の受容体、リガンド、または基質（本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために使用される治療用タンパク質のものに対応する）が配置される身体における部位（例えば、器官、細胞、細胞外空間、または細胞外マトリックス）に選択的に蓄積する。あるいは、アルブミン融合タンパク質が、治療抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む場合、次に、標識されたアルブミン融合タンパク質は、治療抗体（本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために使用される）によって結合されるものに対応するポリペプチド／エピトープが配置される身体の部位（例えば、器官、細胞、細胞外空間、または細胞外マトリックス）に選択的に蓄積する。体内腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌｅｔａｌ．、「ＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＴｈｅｉｒＦｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｃｈａｐｔｅｒ１３ｉｎＴｕｍｏｒＩｍａｇｉｎｇ：ＴｈｅＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓｅｄｓ．、ＭａｓｓｏｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＩｎｃ．（１９８２））に記載される。本明細書中に記載されるプロトコルは、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて使用するために当業者によって容易に改変され得る。

一実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドおよび／または抗体）を投与することによって、本発明のアルブミン融合タンパク質の細胞への特異的な送達のための方法を提供する。一例において、本発明は、治療用タンパク質を標的化細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、１本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または２本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込み可能であるか、またはエピソームにて複製可能であり、また、転写可能であるＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。

別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグに関連する本発明のアルブミン融合タンパク質を投与することによる細胞の特異的な破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。

「毒素」は、内因性の細胞傷害性エフェクタ系、放射性同位体、ホロ毒素、修飾型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分子もしくは酵素を結合および活性化する１つ以上の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、当該分野で既知の放射性同位体、例えば、抗体（またはその補体固定含有部分）固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性エフェクタ系に結合する化合物、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン、ゲロニン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン、およびコレラ毒素が含まれるがこれらに限定されない。また、「毒素」は、細胞分裂停止剤もしくは細胞破壊剤、治療薬または放射活性金属イオン、例えば、^２１３Ｂｉ等のα放射体、もしくは他の放射性同位体（例えば、^１０３Ｐｄ、^１３３Ｘｅ、^１３１Ｉ、^６８Ｇｅ、^５７Ｃｏ、^６５Ｚｎ、^８５Ｓｒ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^１５３Ｓｍ、^１５３Ｇｄ、^１６９Ｙｂ、^５１Ｃｒ、^５４Ｍｎ、^７５Ｓｅ、^１１３Ｓｎ、^９０イットリウム、^１１７スズ、^１８６レニウム、^１６６ホルミウム、および^１８８レニウム等の他の放射性同位体）、ルミノール等の発光標識、フルオレセインやローダミンおよびビチン等の蛍光標識を含む。具体的な実施形態において、本発明は、放射性同位体^９０Ｙに関連する本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を投与することによって、細胞の特異的な破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。別の具体的な実施形態において、本発明は、放射性同位体^１１１Ｉｎに関連する本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を投与することによって、細胞の特異的な破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。さらなる具体的な実施形態において、本発明は、放射性同位体^１３１Ｉに関連する本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を投与することによって、細胞の特異的な破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。

当該分野において既知の技術は、本発明のポリペプチドを標識化するために適用することができ、このような技術には、２官能性共役剤の使用が含まれるがこれに限定されない（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号、第５，７１４，６３１号、第５，６９６，２３９号、第５，６５２，３６１号、第５，５０５，９３１号、第５，４８９，４２５号、第５，４３５，９９０号、第５，４２８，１３９号、第５，３４２，６０４号、第５、２７４，１１９号、第４，９９４，５６０号、および第５，８０８，００３号を参照されたく、これら各々の内容は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる）。

本発明のアルブミン融合タンパク質は、哺乳動物、例えば、ヒトにおける種々の障害の診断、治療、予防および／または予後のために有用である。このような障害には、以下の節の見出しである「生物学的活性」に基づいて本明細書中に記載されるものが含まれるがこれらに限定されない。

したがって、本発明は、障害の診断方法を提供し、この診断方法は、（ａ）本発明のアルブミン融合タンパク質を使用して個体の細胞または体液における特定のポリペプチドの発現レベルをアッセイするステップ、および（ｂ）アッセイされたポリペプチドの発現レベルを標準的なポリペプチドの発現レベルと比較することによって、標準的な発現レベルと比較してアッセイされたポリペプチドの発現レベルにおける増加または減少が障害を示すステップを伴う。癌に関して、個体からの生検組織における比較的多量の転写物の存在は、疾患の発症のための素因を示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供し得る。この型のより決定的な診断によって、保健専門家が初期に予防手段または積極的治療を用いることが可能になるため、癌の発症またはさらなる進行を予防することになる。

さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質を使用して、例えば、神経障害、免疫系障害、筋障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎障害、増殖性障害および／または癌性疾患および状態等の、疾患または病状を治療または予防することができる。例えば、患者は、ポリペプチドの不在またはレベルの減少を元に戻すこと（例えば、インスリン）、異なるポリペプチドの不在またはレベルの減少を補充すること（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘモグロビンＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、ＤＮＡ修復タンパク質）、ポリペプチドの活性を阻害すること（例えば、癌遺伝子または腫瘍抑制因子）、ポリペプチドの活性を活性化すること（例えば、受容体に結合させることによって）、遊離リガンドについて膜結合受容体と競合させることによって膜結合レセプターの活性を減少させること（例えば、炎症の低減に使用される可溶性ＴＮＦ受容体）、または所望の応答をもたらすこと（例えば、血管の成長の阻害、増殖細胞または組織に対する免疫応答の増強）の試みにおいて、本発明のポリペプチドを投与可能である。

具体的には、治療抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質を使用して、疾患（上記疾患および本明細書中の他の箇所に記載される疾患）を治療することも可能である。例えば、治療抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質の投与は、ポリペプチドを結合可能であり、および／またはアルブミン融合タンパク質の作製に使用される治療抗体が特異的に結合するポリペプチドを中和可能であり、および／またはアルブミン融合タンパク質の作製に使用される治療抗体が特異的に結合するポリペプチドの過剰産生を低減可能である。同様に、治療抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質の投与は、膜（受容体）に結合されるポリペプチドに結合することによって、アルブミン融合タンパク質を作製するために使用される治療抗体が特異的に結合するポリペプチドを活性化可能である。

少なくとも、本発明のアルブミン融合タンパク質は、当業者に既知の方法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用可能である。宿主細胞の形質転換を評価する方法として、本発明のアルブミン融合タンパク質を使用して、抗体を惹起し、次いで、この抗体を使用して組み換え細胞からの治療用タンパク質、アルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のタンパク質発現を測定することも可能である。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質を使用して、本明細書において後述する生物学的活性を試験することが可能である。

診断アッセイ

本発明の化合物は、哺乳動物、例えばヒトにおける種々の障害の診断、治療、予防、および／または予後のために有用である。このような障害には、表１の対応する列、ならびに本明細書中、上記の「免疫アッセイ」、「血液関連障害」、「過剰増殖障害」、「腎障害」、「心血管障害」、「呼吸障害」、「抗新脈管形成活性」、「細胞レベルの疾患」、「創傷治癒および上皮細胞増殖」、「神経活性および神経学的疾患」、「内分泌障害」、「生殖系障害」、「感染性疾患」、「再発症」、および／または「胃腸障害」と見出しをつけた節に対応する、各治療用タンパク質について記載されたものが含まれるがこれらに限定されない。
多数の障害について、遺伝子発現の実質的に変更した（増大または減少した）レベルが、このような障害を有する個体から得た細胞または体液（例えば、血清、血漿、尿、精液、滑液、または髄液）において、「標準的な」遺伝子発現レベル、すなわち、障害の無い個体由来の組織または体液中の発現レベルに比較して、検出可能である。したがって、本発明は、障害の診断中に有用な診断方法を提供し、この方法は、個体由来の組織、細胞、または体液におけるポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを測定するステップと、測定した遺伝子発現レベルを標準的な遺伝子発現レベルと比較するステップとを伴い、これによって、標準と比較される遺伝子発現レベルの増加または減少が障害を示す。これらの診断アッセイは、例えば、血液サンプル、生検組織、または剖検組織などにおいて、体内または体外で実行され得る。
また、本発明は、予想指標として有用であり、これにより遺伝子発現の上昇または低下を示す患者は、良くない臨床結果を受けることになる。

「ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」は、特定のポリペプチドのレベル、または本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡレベルを、第一の生体サンプルで、直接的に（例えば、絶対タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルの判断または評価によって）または相対的に（例えば、第１の生体サンプルのポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対する比較によって）、定性的または定量的に測定または評価することを意図する。一実施形態において、第一の生体サンプル中のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルは、測定または評価されて、標準的なポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルと比較され、この標準は、障害の無い個体から得た第２の生物学的サンプルから得られるか、または障害の無い個体集団からのレベルを平均して判断される。当該分野で理解されるように、標準的なポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが判明すると、比較のための標準として繰り返し使用可能である。
「生体サンプル」は、本発明のポリペプチド（その一部を含む）またはｍＲＮＡを含有する、個体、細胞株、組織培養物、または他の源から得られた、任意の生体サンプルを意図する。示されるように、生体サンプルには、ポリペプチドの全長またはそのフラグメントまたはｍＲＮＡを発現することが見出された体液（血清、血漿、尿、滑液、および髄液等）および組織供給源が含まれる。哺乳動物から組織生検および体液を得る方法は、当該分野で既知である。生体サンプルが、ｍＲＮＡを含む場合、生体サンプルは、組織生検から得ることができる。
全細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７））に記載される一段階グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム方法の等の任意の適切な技術を使用して、生体サンプルから単離可能である。次に、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルが、任意の適切な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を含む。
また、本発明は、ポリペプチドの正常なレベルおよび異常なレベルの測定を含む、生体サンプル（例えば、細胞および組織）中の、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質に会合するポリペプチドのレベルを検出する定量アッセイおよび診断アッセイ等の診断アッセイに関する。したがって、例えば、正常な制御組織サンプルと比較した、アルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質に会合するポリペプチドの異常発現を検出するための本発明に従う診断アッセイは、腫瘍の存在を検出するために使用され得る。宿主由来のサンプルにおいて、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と会合するポリペプチドのレベルを判断するために使用可能なアッセイ技術は、当業者に既知である。このようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。生体サンプルにおけるポリペプチドレベルのアッセイは、任意の当該分野において既知の任意の方法を使用して可能である。

生体サンプル中のポリペプチドレベルをアッセイすることは、技術を使用して可能である。例えば、組織におけるポリペプチド発現は、古典的な免疫組織学的方法（Ｊａｌｋａｎｅｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）、Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７））を用いて研究可能である。ポリペプチド遺伝子発現の検出に有用な他の方法は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等の免疫アッセイを含む。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で既知であり、また、グルコースオキシダーゼ等の酵素標識、ならびにヨウ素（^１２５Ｉ、^１２１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（^９９ｍＴｃ）等の放射性同位元素、ならびにフルオレセインやローダミンおよびビオチン蛍光標識が含まれる。
被分析組織または細胞型には、一般的に、該当する遺伝子を発現することが既知であるか、またはそのことが予測される組織または細胞型（例えば、癌など）が含まれる。本明細書中で使用されるタンパク質単離方法は、例えば、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれるＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄＬａｎｅ，Ｄ．、１９８８「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）に記載される方法であり得る。単離細胞は、細胞培養物または患者から得ることが可能である。培養物から採取された細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子療法技術の一部として、あるいは遺伝子の発現に対する化合物の効果を試験するために使用され得る細胞の評価において必須のステップであり得る。
例えば、アルブミン融合タンパク質を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と会合するポリペプチドの存在を定量的にまたは定性的に検出することができる。これは、例えば、光学顕微鏡検出、フローサイトメトリー検出、または蛍光分析検出と組み合わせた、蛍光標識したアルブミン融合タンパク質を使用する免疫蛍光技術によって達成可能である。

ある実施形態において、少なくとも本明細書中に開示される（例えば、表１に開示される治療用タンパク質）または他に当該分野で既知である治療用タンパク質に特異的に結合する抗体のフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質を使用して、遺伝子産物、またはその保存された変異体もしくはペプチドフラグメントの存在を定量的にまたは定性的に検出することができる。これは、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光分析検出と組み合わせた、蛍光標識した抗体を使用する免疫蛍光技術によって達成可能である。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と会合するポリペプチドの原位置検出のために、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡、または非免疫学的アッセイとしてさらに組織学的に使用され得る。原位置検出は、患者から組織学的標本を取るステップと、それに本発明の標識した抗体またはポリペプチドを適用するステップとによって達成され得る。アルブミン融合タンパク質は、生体サンプル上に標識したアルブミン融合タンパク質を覆うことによって適用され得る。このような手順の使用によって、アルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と会合するポリペプチドの存在だけでなく、試験された組織におけるその分布も決定することが可能である。本発明を使用して、当業者は、広範種々の組織学的方法のいずれか（例えば、染色手順）が、例えば、原位置検出を達成するために変更可能であることを容易に理解するだろう。
アルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と会合するポリペプチドを検出する免疫アッセイおよび非免疫アッセイは、典型的には、遺伝子産物または保存された変異体もしくはそのペプチドフラグメントを結合し得る検出可能に標識された抗体の存在下で、生物学的液体、組織抽出物、採取されたばかりの細胞、または細胞培養においてインキュベートされた細胞の溶解物等のサンプルをインキュベートするステップ、ならびに当該分野で既知の多数の技術のいずれかによって結合した抗体を検出するステップを含む。
生体サンプルは、固相支持体またはニトロセルロース等のキャリアあるいは細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定可能な他の固体支持体と接触させられ得る。次に、支持体を、適切な緩衝液で洗浄し、続いて、本発明の検出可能に標識されたアルブミン融合タンパク質で処理し得る。次に、固相支持体を緩衝液で再び洗浄し、非結合の抗体またはポリペプチドを除去し得る。任意により、抗体は、その後標識される。次に、固体支持体上の結合された標識の量を、従来の方法によって検出し得る。

「固相支持体またはキャリア」は、ポリペプチド（例えば、アルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と会合するポリペプチド）を結合可能な任意の支持体を意図する。既知の支持体またはキャリアには、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が含まれる。キャリアの性質は、本発明の目的のためにある程度可溶性であるかまたは不溶性のいずれかであり得る。支持体材料は、結合した分子が、ポリペプチドに結合可能である限り、実質的に任意の可能な構造配置を有し得る。したがって、支持体の構造は、ビーズの場合のように球状、あるいは試験管の内表面またはロッドの外表面の場合のように円筒形であり得る。あるいは、表面は、シート、試験ストリップ等のように平面であり得る。例示的な支持体は、ポリスチレンビーズを含む。当業者は、抗体または抗原を結合する多くの他の適切なキャリアを把握しているか、または慣用的な実験の使用によって同一か確認することができる。
アルブミン融合タンパク質の所定のロットの結合活性は、周知の方法に従って判断され得る。当業者は、慣用的な実験を使用することによって各々の判断のための有効でかつ最適なアッセイ条件を判断することができる。
個体から得られた生体サンプルにおいてポリペプチドレベルをアッセイすることに加えて、ポリペプチドはまた、画像化によって体内でも検出され得る。例えば、本発明の一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、疾患の細胞または新生物細胞を画像化するために使用される。
本発明のアルブミン融合タンパク質を体内で画像化するための標識またはマーカーは、Ｘ線撮影、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、またはＥＳＲにより検出可能なものが含まれる。Ｘ線撮影に適切な標識には、バリウムまたはセシウム等の放射線同位元素が含まれ、これは、検出可能な放射線を放射するが被験体に対して明らかに有害とはならない。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーは、重水素等の、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカーを含み、これは、操作される細胞株（または細菌株もしくは酵母株）の栄養分を標識することによりアルブミン融合タンパク質中に取り込まれ得る。

さらに、存在が検出可能な本発明のアルブミン融合タンパク質を投与することが可能である。例えば、放射性不透過性化合物または他の適切な化合物で標識された本発明のアルブミン融合タンパク質を投与し、標識抗体に関して上記に記載のように体内で画像化することが可能である。さらにこのようなポリペプチドは、体外診断手順のために使用可能である。
放射性同位元素（例えば^１３１Ｉ、^１１２Ｉｎ、^９９ｍＴｃ）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料等の適切な検出可能な画像化部分で標識されたポリペプチド特異的抗体または抗体フラグメントが、障害について試験される哺乳動物に（例えば、非経口的、皮下、もしくは腹腔内）導入される。被験体および使用される画像化システムのサイズにより、診断画像を生成するのに必要とされる画像化部分の量が決定されることは、当該分野で理解される。放射線同位元素部分の場合、ヒト被験体では、注入される放射能の量は、通常、約５から２０ミリキュリーまでの^９９ｍＴｃの範囲である。次に、標識されたアルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と会合する、ポリペプチドまたは他の基質を含む体内の位置に選択的に蓄積する。体内腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌｅｔａｌ．、「ＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＴｈｅｉｒＦｒａｇｍｅｎｔ」により記載される（Ｃｈａｐｔｅｒｓ１３ｉｎＴｕｍｏｒＩｍａｇｉｎｇ：ＴｈｅＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌａｎｄＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓｅｄｓ．、ＭａｓｓｏｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＩｎｃ．（１９８２））。
本発明のアルブミン融合タンパク質が検出可能に標識され得る１つの方法は、当該タンパク質をレポーター酵素へ連結し、連結された産物を酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）に使用することによる（Ｖｏｌｌｅｒ、Ａ．「ＴｈｅＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」１９７８、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＨｏｒｉｚｏｎｓ２：１−７、ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｅｓＱｕａｒｔｅｒｌｙＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、Ｖｏｌｌｅｒｅｔａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７〜５２０（１９７８）、Ｂｕｔｌｅｒ、Ｊ．Ｅ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）、Ｍａｇｇｉｏ、Ｅ．（ｅｄ．）１９８０、ＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、ＦＬ、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ら（ｅｄｓ．）１９８１、ＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＫａｇａｋｕＳｈｏｉｎ、Ｔｏｋｙｏ）。抗体に結合するレポーター酵素は、適切な基質、例えば、色素基質と、例えば、分光光度法、蛍光法または可視手段によって検出可能な化学的部分を生成するように反応する。抗体を検出可能に標識するために使用可能なレポーター酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。さらに、検出は、レポーター酵素に対する色素基質を用いる比色分析方法によって達成可能である。また、検出は、同様に調製された標準物質と比較して、基質の酵素反応の程度を視覚的に比較することによって達成可能である。

また、アルブミン融合タンパク質は、放射標識されてもよく、また、種々の他の免疫アッセイのいずれかにおいて使用され得る。例えば、アルブミン融合タンパク質を放射性標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）においてアルブミン融合タンパク質を使用することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，ＳｅｖｅｎｔｈＴｒａｉｎｉｎｇＣｏｕｒｓｅｏｎＲａｄｉｏｌｉｇａｎｄＡｓｓａｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＴｈｅＥｎｄｏｃｒｉｎｅＳｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６を参照されたく、これは、本明細書中に参考として援用される）。放射性同位元素は、γカウンター、シンチレーションカウンター、またはオードラジオグラフィーを含むがこれらに限定されない手段によって検出可能である。
さらに、当該分野でキレート剤分子は既知であり、アルブミン融合タンパク質を標識するために使用可能である。キレート剤分子は、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合し、このタンパク質を、放射性核種または蛍光標識を含む金属イオンで標識することを容易にし得る。例えば、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｒ．ａｎｄＭｅａｒｅｓ，Ｃ．Ｆ．、「ＢｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＣｈｅｌａｔｉｎｇＡｇｅｎｔｓｆｏｒＲａｄｉｏｍｅｔａｌ−ｌａｂｅｌｅｄｍｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、（ＣａｎｃｅｒＩｍａｇｉｎｇｗｉｔｈＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｄ．Ｍ．ＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇＥｄ．）ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｏｓｔｏｎ）、Ｓａｊｉ，Ｈ．、「Ｔａｒｇｅｔｅｄｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄｉｍａｇｉｎｇａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｇｅｎｔｓ：ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．」Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．ＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔ．１６：２０９−２４４（１９９９）、ＳｒｉｖａｓｔａｖａＳ．Ｃ．ａｎｄＭｅａｓｅＲ．Ｃ．、「Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｌｉｇａｎｄｓ，ｎｕｃｌｉｄｅｓａｎｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｌａｂｅｌｉｎｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ａｐｐｌ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．Ｂ１８：５８９−６０３（１９９１）、およびＬｉｕ，Ｓ．およびＥｄｗａｒｄｓ，Ｄ．Ｓ．、「Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈｅｌａｔｏｒｓｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｌａｎｔｈａｎｉｄｅｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１２：７−３４（２００１）を参照のこと。このアルブミン融合タンパク質に共有結合可能な任意のキレート剤が、本発明に従って使用され得る。キレート剤は、アルブミン融合タンパク質に対するキレート部分と結合するリンカー部分をさらに含み得る。
一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、非環式キレート剤、例えば、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´−ペンタ酢酸（ＤＰＴＡ）、ＤＰＴＡの類似体、およびＤＰＴＡの誘導体と結合する。非限定的な例として、キレート剤は、２−（ｐ−イソチオシアネートベンジル）−６−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（１Ｂ４Ｍ−ＤＰＴＡ、ＭＸ−ＤＴＰＡとしても既知）、２−メチル−６−（ρ−ニトロベンジル）−１，４，７−トリアザヘプタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´−ペンタ酢酸（ニトロ−１Ｂ４Ｍ−ＤＰＴＡまたはニトロ−ＭＸ−ＤＴＰＡ）、２−（ｐ−イソチオシアネートベンジル）−シクロヘキシルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＣＨＸ−ＤＴＰＡ）、またはＮ−［２−アミノ−３−（ρ−ニトロフェニル）プロピル］−トランス−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´−ペンタ酢酸（ニトロ−ＣＨＸ−Ａ−ＤＴＰＡ）であり得る。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、非環式テルピリジンキレート剤、例えば、６，６´´−ビス［［Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´−テトラ（カルボキシメチル）アミノ］メチル］−４´−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）２，２´：６´，２´´−テルピルジン（ＴＭＴ−アミン）と結合する。

具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する大環状キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´´−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。他の具体的な実施形態において、ＤＯＴＡは、リンカー分子を介して本発明のアルブミン融合タンパク質と結合する。ポリペプチドへのＤＯＴＡ共役に有用なリンカー分子の例として、当該分野で一般的に既知である、例えば、ＤｅＮａｒｄｏｅｔａｌ、Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４（１０）：２４８３−９０，１９９８、Ｐｅｔｅｒｓｏｎｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５５３−７、１９９９、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｅｔａｌ、，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：９４３−５０を参照されたく、これらの全体は、参照することによって本明細書に組み込まれる。さらに、抗体に共役し得るキレート剤およびそれらを製造かつ使用するための方法を開示する米国特許第５，６５２，３６１号および第５，７５６，０６５号は、参照してその全体を本明細書に組み込まれる。米国特許第５，６５２，３６１号および第５，７５６，０６５号は、抗体へのキレート剤の共役に焦点を合わせているが、当業者は、それらに開示される方法を容易に適合させ、他のポリペプチドにキレート剤を共役させ得る。
共役が、活性化アーム、または官能基を介してリガンドの炭素骨格に結合される大環状リガンドに基づく２官能性キレート剤は、Ｍ．Ｍｏｉｅｔａｌ．、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４９：２６３９（１９８９）（２−ｐ−ニトロベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´´−テトラ酢酸）、Ｓ．Ｖ．Ｄｅｓｈｐａｎｄｅｅｔａｌ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：４７３（１９９０）、Ｇ．Ｒｕｓｅｒｅｔａｌ、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１：３４５（１９９０）、Ｃ．Ｊ．Ｂｒｏａｎｅｔａｌ、Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２３：１７３９（１９９０）、およびＣ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ、，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３６：８５０（１９９５）に記載されるように用いられることが可能である。
一実施形態において、任意により１つ以上のカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキサメート基、ホスファネート基、またはリン酸基を含む大環状キレート剤、例えば、ポリアザ大環状キレート剤、は、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合する。別の実施形態において、キレート剤は、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡの類似体、およびＤＯＴＡの誘導体から成る群より選択されるキレート剤である。
一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合し得る適切なキレート剤分子には、ＤＯＸＡ（１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカントリ酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザノナントリ酢酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンテトラ酢酸）、およびＴＨＴ（４´−（３−アミノ−４−メトキシ−フェニル）−６，６´´−ビス（Ｎ´，Ｎ´−ジカルボキシメチル−Ｎ−メチルヒドラジノ）−２，２´：６´，２´´−テルピリジン）、およびそれらの類似体および誘導体が含まれる。例えば、Ｏｈｍｏｎｏｅｔａｌ、，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ３５：１５７−１６２（１９９２）、Ｋｕｎｇｅｔａｌ．、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２５：３２６−３３２（１９８４）、Ｊｕｒｉｓｓｏｎｅｔａｌ、，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９３：１１３７−１１５６（１９９３）、および米国特許第５，３６７，０８０号を参照のこと。他の適切なキレート剤には、米国特許第４，６４７，４４７号、第４，６８７，６５９号、第４，８８５，３６３号、欧州特許第Ａ−７１５６４号、国際公開第ＷＯ８９／００５５７号、および欧州特許第Ａ−２３２７５１号に開示されるキレート剤が含まれる。

別の実施形態において、本発明において使用可能な適切な大環状カルボン酸キレート剤には、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´´−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´´−テトラ酢酸（１５Ｎ４）、１，４，７−テトラアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´−トリ酢酸（９Ｎ３）、１，５，９−トリアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´−トリ酢酸（１２Ｎ３）、および６−ブロモアセトアミド−ベンジル−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´´−テトラ酢酸（ＢＡＴ）が含まれる。
本発明のアルブミン融合タンパク質に結合可能な例示的なキレート剤は、α−（５−イソチオシアナート−２−メトキシフェニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸であり、ＭｅＯ−ＤＯＴＡ−ＮＣＳとしても既知である。また、α−（５−イソチオシアナート−２−メトキシフェニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸の塩またはエステルも使用され得る。
記載されるようなキレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、（キレート剤の配位部位を介して）、治療目的、診断目的、または治療および診断目的に適切な放射性核種を用いて標識され得る。適切な金属の例として、Ａｇ、Ａｔ、Ａｕ、Ｂｉ、Ｃｕ、Ｇａ、Ｈｏ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｐｂ、Ｐｄ、Ｐｍ、Ｐｒ、Ｒｂ、Ｒｅ、Ｒｈ、Ｓｃ、Ｓｒ、Ｔｃ、Ｔｌ、Ｙ、およびＹｂが挙げられる。診断目的のために使用される放射性核種の例として、Ｆｅ、Ｇｄ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、または^６８Ｇａが挙げられる。別の実施形態において、診断目的で使用される放射性核種は、^１１１Ｉｎまたは^６７Ｇａである。治療目的で使用される放射性核種の例として、^１６６Ｈｏ、^１６５Ｄｙ、^９０Ｙ、^１１５ｍＩｎ、^５２Ｆｅ、または^７２Ｇａが挙げられる。一実施形態において、治療目的で使用される放射性核種は、^１６６Ｈｏまたは^９０Ｙである。治療目的および診断目的の両方に使用される放射性核種の例として、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１５９Ｇｄ、^１７５Ｙｂ、または^４７Ｓｃが挙げられる。一実施形態において、放射性核種は、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１７５Ｙｂ、または^１５９Ｇｄである。

例示的な金属放射性核種には、^９０Ｙ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^４７Ｓｃ、^６７Ｇａ、^５１Ｃｒ、^１７７ｍＳｎ、^６７Ｃｕ、^１６７Ｔｍ、^９７Ｒｕ、^１８８Ｒｅ、^１７７Ｌｕ、^１９９Ａｕ、^４７Ｓｃ、^６７Ｇａ、^５１Ｃｒ、^１７７ｍＳｎ、^６７Ｃｕ、^１６７Ｔｍ、^９５Ｒｕ、^１８８Ｒｅ、^１７７Ｌｕ、^１９９Ａｕ、^２０３Ｐｂ、および^１４１Ｃｅが含まれる。
特定の実施形態において、キレート剤が共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、^９０Ｙ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^１６６Ｈｏ、^２１５Ｂｉ、および^２２５Ａｃから成る群より選択される金属イオンを用いて標識され得る。
さらに、γ放射放射性核種、例えば、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、および^１６９Ｙｂは、診断画像化のために認可されているか、または調査中であるが、β放射体、^６７Ｃｕ、^１１１Ａｇ、^１８６Ｒｅ、および^９０Ｙは腫瘍治療における適用に有用である。他の有用な放射性核種には、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、および^１６９Ｙｂ等のγ放射体、および^６７Ｃｕ、^１１１Ａｇ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、および^９０Ｙ等のβ放射体、ならびに^２１１Ａｔ、^２１２Ｂｉ、^１７７Ｌｕ、^８６Ｒｂ、^１０５Ｒｈ、^１５３Ｓｍ、^１９８Ａｕ、^１４９Ｐｍ、^８５Ｓｒ、^１４２Ｐｒ、^２１４Ｐｂ、^１０９Ｐｄ、^１６６Ｈｏ、^２０８Ｔｌ、および^４４Ｓｃ等の該当する他の放射性核種が含まれる。キレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、上記の放射性核種を用いて標識され得る。
別の実施形態において、キレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、遷移金属およびランタニド金属のイオンを含む常磁性金属イオン、例えば、原子番号２１〜２９、４２、４３、４４、または５７〜７１を有する金属、具体的にはＣｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、およびＬｕのイオンを用いて標識され得る。磁気応答画像化のための組成物において使用される常磁性金属には、原子番号２２〜２９、４２、４４、および５８〜７０を有する元素が含まれる。

別の実施形態において、キレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、イオンランタニド、具体的にはＬａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ（例えば、^１５２Ｅｕ）、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、およびＬｕを含む蛍光金属を用いて標識され得る。
別の実施形態において、キレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、Ｍｏ、Ｂｉ、Ｓｉ、およびＷの原子を含み得る重金属含有レポーターを用いて標識され得る。
また、アルブミン融合タンパク質を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識された抗体が適切な波長の光に露光されると、その存在は、蛍光に起因して検出可能である。最も一般的に使用される蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレサミンが含まれる。
また、アルブミン融合タンパク質は、^１５２Ｅｕ，または他のランタニド系列等の蛍光発光金属を用いて検出可能に標識可能である。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＴＤＡ）のような金属キレート群を使用してアルブミン融合タンパク質に結合可能である。
また、アルブミン融合タンパク質は、化学発光化合物に結合させることによって検出可能に標識可能である。次いで、化学発光タグ化アルブミン融合タンパク質の存在は、化学反応の経過中に生じる発光の存在を検出することによって判断される。特に有用な化学発光標識化合物の例として、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびオキサレートエステルが挙げられる。
同様に、生物発光化合物を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質を標識し得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物系において見出される化学発光の型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって判断される。標識目的のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。
トランスジェニック生物

本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック生物も、本発明に含まれる。トランスジェニック生物は、一般的に、組み換え体、外因性または転移されたクローン化遺伝材料に修飾された生物体である。このような遺伝材料は、導入遺伝子と呼ばれることが多い。形質転換体の核酸配列は、コードされたタンパク質の最適な発現および分泌に必要とされ得る、１つ以上の転写制御配列および他の核酸配列、例えば、イントロンを含み得る。導入遺伝子は、生物または生物により産生される産物、例えば、生物体の乳液、血液、尿、卵、髪、または種子からの再生を容易にするように、コードされたタンパク質の発現を支配するように設計され得る。導入遺伝子は、標的動物の種と同種のゲノムまたは異種のゲノムに由来する核酸配列から成り得る。導入遺伝子は、特定の核酸配列が他の方法で通常見出されないゲノムの遺伝子座か、または導入遺伝子の正常の遺伝子座のいずれかで組み込まれ得る。
「生殖細胞株トランスジェニック生物」という用語は、遺伝的変化または遺伝的情報が生殖細胞株に導入されれることによって、子孫に遺伝情報を伝えるためのトランスジェニック生物の能力を与えるトランスジェニック生物を指す。このような子孫が、実際にそのような変化または遺伝情報のいくつかまたは全てを有する場合、それらもまたトランスジェニック生物である。変化または遺伝情報は、受容者が属する生物体の種にとって外来のものであり得、特定の受容個体にとってのみ外来のものであり得、または受容者によりすでに保有される遺伝的情報であり得る。最後の場合、変化または誘導された遺伝子は、天然の遺伝子とは異なって発現され得る。

トランスジェニック生物は、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物であり得る。トランスジェニック動物は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング、ならびに組み換えウイルス感染および組み換えレトロウイルス感染を含む種々の異なる方法で産生可能である（例えば、米国特許第４，７３６，８６６号、第５，６０２，３０７号、Ｍｕｌｌｉｎｓｅｔａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ２２（４）：６３０−６３３、Ｂｒｅｎｉｎｅｔａｌ．（１９９７）Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６（２）９９−１１０、Ｔｕａｎ（ｅｄ．）、ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＮｏ．６２，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（１９９７）を参照のこと）。核酸フラグメントを組み換え可能な哺乳類動物細胞に導入する方法は、複数の核酸分子の共形質転換に有利な任意の方法であり得る。トランスジェニック動物を産生する詳細な手順は、当業者に容易に入手可能であり、米国特許第５，４８９，７４３号および同第５，６０２，３０７号における開示を含む。
多くの組み換えマウスまたはトランスジェニックマウスが産生れ、これらは、活性化したオンコジーン配列を発現するマウス（米国特許第４，７３６，８６６号）、サルＳＶ４０Ｔ抗原配列発現マウス（米国特許第５，７２８，９１５号）、インターフェロン制御因子１（ＩＲＦ−１）の発現欠損マウス（米国特許第５，７３１，４９０号）、ドーパミン作用性機能不全を示すマウス（米国特許第５，７２３，７１９号）、血圧調節に関係する少なくとも１つのヒト遺伝子を発現するマウス（米国特許第５，７３１，４８９号）、天然発生するアルツハイマー病において示される状態により大きな類似点を示すマウス（米国特許第５，７２０，９３６号）、細胞接着を媒介する能力が減少したマウス（米国特許第５，６０２，３０７号）、ウシ成長ホルモン遺伝子を保有するマウス（Ｃｌｕｔｔｅｒｅｔａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１４３（４）：１７５３−１７６０）、または十分なヒト抗体応答を生成する能力のあるマウス（ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９９７）ＴｈｅＬａｎｃｅｔ３４９（９０４９）：４０５）を含む。
マウスおよびラットは、いまだ、多くのトランスジェニック実験のために選択される動物であるが、いくつかの例において、代替の動物種を使用することが好ましいか、または必要でさえある。トランスジェニックの手順は、種々の非マウス動物（ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ウサギ、ウシおよびモルモットを含む）において首尾よく利用される（例えば、Ｋｉｍｅｔａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６（４）：５１５−５２６、Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（１９９５）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｎｕｔｒ．Ｄｅｖ．３５（６）：６０９−６１７、Ｐｅｔｔｅｒｓ（１９９４）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６（５）：６４３−６４５、Ｓｃｈｎｉｅｋｅｅｔａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７８（５３４６）：２１３０−２１３３、およびＡｍｏａｈ（１９９７）Ｊ．ＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ７５（２）：５７８−５８５）を参照のこと）。

トランスジェニック哺乳動物の乳中に、本発明の導入遺伝子がコードされたタンパク質の分泌を指向するため、導入遺伝子は、哺乳動物の上皮細胞において選択的に活性化されるプロモーターの制御下に置かれ得る。乳タンパク質をコードする遺伝子を調節するプロモーターは、例えば、カゼイン、β−ラクトグロブリン、ホエー酸タンパク質、またはラクトアルブミンのプロモーターが使用され得る（例えば、ＤｉＴｕｌｌｉｏ（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７４−７７、Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：４８７−４９２、Ｇｏｒｔｏｎｅｔａｌ．（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：１１８３−１１８７、およびＳｏｕｌｉｅｒｅｔａｌ．（１９９２）ＦＥＢＳＬｅｔｔｓ．２９７：１３を参照のこと）。選択されたトランスジェニック哺乳動物は、大量の乳を生成し、長い授乳期を有する（例えば、ヤギ、ウシ、ラクダまたはヒツジ）。

また、本発明のアルブミン融合タンパク質は、トランスジェニック植物、例えば、ＤＮＡ形質転換体が、核ゲノムまたは色素体ゲノムに挿入された植物において発現可能である。外因性核酸を植物細胞またはプロトプラストに誘導するために使用される植物形質転換手順は、当該分野で既知である。一般的に、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙｅｔａｌ．Ｖｏｌ．１５３（「ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡＰａｒｔＤ」）１９８７、ＷｕａｎｄＧｒｏｓｓｍａｎＥｄｓ．、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓおよび欧州特許出願第６９３５５４号を参照のこと。遺伝子操作された植物を生成するための方法はさらに、米国特許第５，２８３，１８４号、第５，４８２，８５２号、および欧州特許出願第６９３５５４号に開示され、これらの全ては、参照することによって本明細書に組み込まれる。

医薬組成物または治療的組成物

本発明のアルブミン融合タンパク質またはそれらの処方物は、非経口（例えば、皮下または筋肉内注入または静脈内注入を含む任意の従来の方法により投与され得る。治療は、期間にわたって、単一の投薬量または複数の投薬量から成り得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、単独で投与されることが可能であるが、１つ以上の許容可能なキャリアと共に医薬処方物として存在することが好ましい。このキャリアは、アルブミン融合タンパク質に対して適合性があるという意味で「許容可能」であるべきであり、それらの受容者に有害であるべきではない。典型的には、キャリアは、滅菌および無発熱物質である水または生理食塩水である。溶液中のそれらの貯蔵寿命長期化に起因して、本発明のアルブミン融合タンパク質は、水性キャリア、例えば、滅菌無発熱物質水、生理食塩水または溶液中のそれらの貯蔵寿命長期化に起因する別の等張溶液中の処方物に特によく適合する。例えば、本発明の医薬組成物は、あらかじめ水性形態で、例えば、投薬される前、数週間または数ヶ月あるいはそれより長い時間に、十分に処方され得る。
例えば、アルブミン融合タンパク質を含有する処方物は、水性処方物におけるアルブミン融合タンパク質の貯蔵寿命長期化を考慮して調製され得る。上記のように、ＨＡに融合後、これら治療的タンパク質の多くの貯蔵寿命が、著しく増加されるか、または延長される。

エアロゾル投与が適切な例において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、標準手順を使用するエアロゾルとして処方され得る。「エアロゾル」という用語は、細気管支または鼻経路に吸入可能な、本発明のアルブミン融合タンパク質の任意のガス保有懸濁相を含む。具体的には、エアロゾルは、定量吸入用量吸入器または噴霧器、あるいはミスト噴霧器において生成されるような、本発明のアルブミン融合タンパク質の水滴のガス保有懸濁液を含む。エアロゾルはまた、例えば、吸入デバイスから吸入によって送達され得る空気または他のキャリアガスに懸濁された本発明の化合物の乾燥粉末組成物を含む。Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ＆Ｊｏｎｅｓ，ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙｔｏｔｈｅＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＴｒａｃｔ、ＥｌｌｉｓＨｏｒｗｏｏｄ（１９８７）、Ｇｏｎｄａ（１９９０）ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ６：２７３−３１３、およびＲａｅｂｕｒｎｅｔａｌ．，（１９９２）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２７：１４３−１５９を参照のこと。
典型的には、本発明の処方物はまた、１つには適切な種に由来するアルブミン融合タンパク質の成分の使用が理由で、非免疫原性であり得る。例えば、ヒトの使用に対し、治療的タンパク質およびアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分の両方は、典型的には、ヒトである。いずれかの成分が非ヒト由来であるいくつかの場合において、その成分は主要アミノ酸の置換によりヒト化され得、その結果特異的なエピトープが、ヒト免疫系に対し、外因性というよりは、むしろ天然のヒト種のようになる。
処方物は、単位投与形態で都合よく存在し得、そして薬学の当該分野で周知の任意の方法により調製され得る。このような方法は、１つ以上の付属成分を構成するキャリアとアルブミン融合タンパク質を会合させるステップを包む。一般的に、活性成分を液体キャリアまたは微細な誘導固体キャリア、またはそれら両方と均一にかつ親密に会合させることによって、処方物が調製され、次いで、必要に応じて、産物を形成する。

非経口投与に適切な処方物には、抗酸化物、緩衝液、静菌剤および意図される受容者のために処方物を適切にする溶液を含み得る水性滅菌注入溶液または非水性滅菌注入溶液、および懸濁剤および濃化剤を含み得る水性滅菌注入溶液または非水性滅菌注入溶液が含まれる。処方物は、単位用量容器または複数用量容器、例えば、密封されたアンプル、バイアルまたはシリンジ中に存在してもよく、また、使用の直前に滅菌キャリア（例えば、注入用の水）の添加のみを必要とする凍結乾燥（親液性）状態で保存され得る。即席注入溶液および懸濁液は、滅菌散剤から調製され得る。投与処方物は、本発明の多くのアルブミン融合タンパク質により示される長期化された血清半減期のため、治療的タンパク質のための非融合標準処方物と比較して低いモル濃度またはより低い投薬量で治療用タンパク質の一部を含み得る。
例として、本発明のアルブミン融合タンパク質が、１つ以上の治療的タンパク質領域として表１の「治療用タンパク質：Ｘ」列に列挙されたタンパク質の１つを含む場合、天然治療用タンパク質の半減期と比較して、アルブミン融合タンパク質の延長された血清半減期および貯蔵寿命を考慮して、投薬形態は、アルブミンタンパク質の有効性に基づいて計算可能である。例えば、治療用タンパク質が、典型的に０．３〜３０．０ＩＵ／ｋｇ／週または０．９〜１２．０ＩＵ／ｋｇ／週で投与され、１年またはそれ以上の間に、３つまたは７つに分けた投与量で与えられる。治療用タンパク質に融合する全長ＨＡからなるアルブミン融合タンパク質において、同等容量は、単位の観点から見るとより重量の高い薬剤を示すが、投与回数は、例えば、１週間に２回、１週間に１回、またはそれ以下に減少され得る。

本発明の処方物または組成物は、説明書またはアルブミン融合タンパク質成分の長期化された半減期を言及する包装挿入物と共に包装され得るか、または共にキットに含まれ得る。例えば、このような説明書または包装挿入物は、本発明のアルブミン融合タンパク質の長期化または延長された半減期に考慮した、推薦の保管状態、例えば、時間、温度、および光に注意を向け得る。このような説明書または包装挿入物はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質の特定の利点、例えば、野外、調節された病院、診療所またはオフィス状態の外で使用が求められ得る処方物のための保存の容易さに注意を向け得る。上記のように、本発明の処方物は、水性形態であり得、そして理想的ではない環境下で、治療的活性の有意な欠損なしで保管され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、栄養補助として含まれ得る。例えば、本発明の特定のアルブミン融合タンパク質は、アルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック哺乳動物から得られる、乳、または乳製品を含む天然産物中に投与され得る。このような組成物はまた、アルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック植物から得られる、植物体または植物産物を含み得る。アルブミン融合タンパク質はまた、他の既知の添加剤、キャリア、増量剤および希釈剤を含むか、または含まずに、粉末形態または錠剤形態で提供され得る。栄養補助は、ＳｃｏｔｔＨｅｇｅｎｈａｒｔ，ＦｏｏｄＰｒｏｄｕｃｔＤｅｓｉｇｎ，Ｄｅｃ．１９９３に記載される。
また、本発明はまた、薬学的に許容可能なキャリアにおいて、有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（「アルブミン融合ポリヌクレオチド」）を被験体に投与することによって、疾患または障害（例えば、本明細書中に開示される任意の１以上の疾患または障害）を治療および／または予防する方法も提供する。
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、個々の患者の臨床状態（特に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを単独で用いた処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に既知の他の要因を考慮して、適正な医療行為に一致するように処方および投薬する。したがって、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮によって決定される。

一般的提案として、投薬量当り、非経口的に投与されるアルブミン融合タンパク質の総薬学的有効量は、患者体重１ｋｇあたり、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。一実施形態において、この投薬量は、ホルモンに関し、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、別の実施形態において、ヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、典型的には、アルブミン融合タンパク質を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたはミニポンプを用いて連続皮下注入のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化する。
前述のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質部分（またはそのフラグメントもしくは変異体）の単体よりも高いプラズマ安定性を有する。プラズマ安定性のこのような増加は、投薬量毎に投与されるアルブミン融合タンパク質の有効量および投薬量投与スケジュールの決定の際に考慮すべきである。具体的には、より高いプラズマ安定性によって、アルブミン融合タンパク質を同一の投与頻度においてより低い投薬量で投与可能にし、あるいはアルブミン融合タンパク質を回数の少ない投薬量で投与可能にすることができる。より高い安定性によって、本発明のアルブミン融合タンパク質は、低頻度でより回数の少ない投薬量で投与可能にすることができる。一実施形態において、アルブミン融合タンパク質は、２週間毎に１回投与可能である。別の実施形態において、アルブミン融合タンパク質は、アルブミン融合タンパク質の薬物動態に依存して、３週間毎、４週間毎、５週間毎、またはそれ以上の週間毎に１回投与可能である。例えば、上述のように、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質の薬物動態は、２〜４週間以上毎に１回の投薬レジメンに対応し、４週間毎または４週間毎以上の間隔の投薬にさえ対応する。
投薬量毎に投与される治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質は、投薬量毎に付与される処方アルブミン融合タンパク質総濃度として示されることも可能である。一実施形態において、投薬量毎に患者に投与される処方アルブミン融合タンパク質総濃度は、約１０ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量までの範囲である。一実施形態において、総濃度は、約１００ｕｇ／投薬量から約１０００ｕｇ／投薬量の範囲、あるいは約１０００ｕｇ／投薬量から約１２００ｕｇ／投薬量または約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の範囲である。

具体的な実施形態において、本発明のＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９０ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で投薬される。他の実施形態において、本発明のＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６によって産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約２１００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約２０００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約１２００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で投与され、また、さらに他の実施形態において、約１２００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、６００ｕｇ／投薬量、７２０ｕｇ／投薬量、８００ｕｇ／投薬量、９００ｕｇ／投薬量、１０００ｕｇ／投薬量、１２００ｕｇ／投薬量、１５００ｕｇ／投薬量、１８００ｕｇ／投薬量、２０００ｕｇ／投薬量、２１００ｕｇ／投薬量、または２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で投与される。追加の実施形態において、本発明のＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産出される）質の総処方投薬量は、単独で、またはリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生されるにより産生される）の総処方投薬量は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して投与される。
追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）の処方総濃度を投与して、ＨＣＶに感染した患者を治療する。具体的な実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９０ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、ＨＣＶを患う治療未経験患者に単独でまたは有効量のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して投与される。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約２１００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約２０００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約１２００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、またさらなる実施形態において、約１２００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、ＨＣＶを患う治療未経験患者に単独でまたは有効量のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、６００ｕｇ／投薬量、７２０ｕｇ／投薬量、８００ｕｇ／投薬量、９００ｕｇ／投薬量、１０００ｕｇ／投薬量、１２００ｕｇ／投薬量、１５００ｕｇ／投薬量、１８００ｕｇ／投薬量、２０００ｕｇ／投薬量、２１００ｕｇ／投薬量、または２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、ＨＣＶを患う治療未経験患者に単独でまたは有効量のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して投与される。

追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質の処方総濃度は、９０ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、有効量のリバビリン等の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス化合物と併用して、ＨＣＶを患う治療未経験患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約２１００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約２０００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約１２００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度、またさらなる実施形態において、約１２００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、有効量のリバビリン等の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス化合物と併用して、ＨＣＶを患う治療未経験患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、６００ｕｇ／投薬量、７２０ｕｇ／投薬量、８００ｕｇ／投薬量、９００ｕｇ／投薬量、１０００ｕｇ／投薬量、１２００ｕｇ／投薬量、１５００ｕｇ／投薬量、１８００ｕｇ／投薬量、２０００ｕｇ／投薬量、２１００ｕｇ／投薬量、または２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、有効量のリバビリン等の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス化合物と併用して、ＨＣＶを患う治療未経験患者に投与される。

追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９０ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、単独で、または有効量のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、ＨＣＶを患う治療経験済患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約２１００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約２０００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約１２００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、また、他の実施形態において、約１２００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、単独で、または有効量のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、ＨＣＶを患う治療経験済患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、６００ｕｇ／投薬量、７２０ｕｇ／投薬量、８００ｕｇ／投薬量、９００ｕｇ／投薬量、１０００ｕｇ／投薬量、１２００ｕｇ／投薬量、１５００ｕｇ／投薬量、１８００ｕｇ／投薬量、２０００ｕｇ／投薬量、２１００ｕｇ／投薬量、または２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、単独で、または有効量のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、ＨＣＶを患う治療経験済患者に投与される。

追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９０ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、有効量のリバビリン等の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス化合物と併用して、ＨＣＶを患う治療経験済患者に投与される。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量、９００ｕｇ／投薬量から約２１００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約２０００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約１２００ｕｇ／投薬量、約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度、また追加の実施形態において、約１２００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、有効量のリバビリン等の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス化合物と併用して、ＨＣＶを患う治療経験済患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、６００ｕｇ／投薬量、７２０ｕｇ／投薬量、８００ｕｇ／投薬量、９００ｕｇ／投薬量、１０００ｕｇ／投薬量、１２００ｕｇ／投薬量、１５００ｕｇ／投薬量、１８００ｕｇ／投薬量、２０００ｕｇ／投薬量、２１００ｕｇ／投薬量、または２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、有効量のリバビリン等の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス化合物と併用して、ＨＣＶを患う治療経験済患者に投与される。
アルブミン融合タンパク質の処方総濃度およびアルブミン融合タンパク質を投与する投薬間隔は、所望の効果および投与する特定の治療用タンパク質に依存して変動する。一実施形態において、投薬量毎に患者に投与される処方アルブミン融合タンパク質総濃度は、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、またはそれ以上の週間毎に一回、約１０ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の範囲である。別の実施形態において、総濃度は、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、またはそれ以上の週間毎に１回、約１００ｕｇ／投薬量から約１０００ｕｇ／投薬量の範囲であり、あるいは、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、またはそれ以上の週間毎に１回、約１０００ｕｇ／投薬量から約１２００ｕｇ／投薬量または約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の範囲である。

具体的な実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９０ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回投与される。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約２１００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約１２００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、また、別の実施形態において、約１２００ｕｇ／投薬量から１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回投薬される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約６００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１２００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１５００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１６００ｕｇ／投薬量２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、２１００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、または２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回投薬される。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、また、さらなる実施形態において、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、２週間毎に１回、１２００ｕｇ／投薬量総濃度で、４週間毎に１回、または１８００ｕｇ／投薬量総濃度で、４週間毎に１回投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）の総処方投薬量は、単独で、またはリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）の総処方投薬量は、有効量のリバビリン等の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス化合物と併用して投与される。

具体的な実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９０ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、単独で、またはリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約２１００ｕｇ／投薬量２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約１２００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、また、さらに他の実施形態において、約１２００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、単独で、またはリバビリン等を含む抗ウイルス化合物と併用して、治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約６００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、８００ｕｇ／投薬量約の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１２００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１５００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１６００ｕｇ／投薬量２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、２１００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、あるいは２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、単独で、またはリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。

具体的な実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９０ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、有効量のリバビリン等の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス化合物と併用して、治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約２１００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約１２００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、また、またさらなる実施形態において、約１２００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、例えば、リバビリンを含む１つ以上の抗ウイルス化合物と併用して、例えば、リバビリンまたは任意により別の抗ウイルス化合物を含む１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス化合物と併用して、治療未経験ＨＣＶ患者に投与され得る。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約６００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１２００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１５００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１６００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、あるいは２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、２１００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、あるいは２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、有効量のリバビリン等の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス化合物と併用して、治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。

追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、また、さらなる実施形態において、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、２週間毎に１回、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、４週間毎に１回、または１８００ｕｇ／投薬量の総濃度で、４週間毎に１回、単独で、またはリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、また、さらなる実施形態において、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、２週間毎に１回、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、４週間毎に１回、または１８００ｕｇ／投薬量の総濃度で、４週間毎に１回、有効量のリバビリン等の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス化合物と併用して、治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。
別の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、少なくとも２４週間の間、２週間毎に１回、また、他の実施形態において、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、少なくとも２４週間の間、２週間毎に１回、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、少なくとも２４週間の間、４週間毎に１回、または１８００ｕｇ／投薬量の総濃度で、少なくとも２４週間の間、４週間毎に１回、治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のこのような投与は、単独で、またはリバビリン等の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス化合物と併用するものである。ある実施形態において、治療未経験ＨＣＶ患者は、ＨＣＶ遺伝子２型または３型に感染している。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、少なくとも４８週間の間、２週間毎に１回、また、別の実施形態において、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、少なくとも４８週間の間、２週間毎に１回、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、少なくとも４８週間の間、４週間毎に１回、または１８００ｕｇ／投薬量の総濃度で、少なくとも４８週間の間、４週間毎に１回、治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のこのような投与は、単独で、またはリバビリン等の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス化合物と併用するものである。ある実施形態において、治療未経験ＨＣＶ患者は、ＨＣＶ遺伝子１型に感染している。

前述のように、治療の第４週における迅速な抗ウイルス反応（ＲＶＲ）は、持続性抗ウイルス反応（ＳＶＲ）の肯定的な予測因子として特定されている。さらに、治療の第１２週までＨＣＶＲＮＡ陰性の維持は、ＳＶＲのさらなる肯定的な予測因子として確立される。つまり、第４週でＨＣＶＲＮＡ陰性を達成、このような陰性を第１２週まで持続する患者は、治療レジメンの完了後、ＨＣＶＲＮＡ陰性を維持する可能性がある。したがって、単独で、または少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つのリバビリン等の抗ウイルス剤と併用してＩＦＮ−α−ＨＳＡで治療した後に、第４週でＨＣＶＲＮＡ陰性を達成し、かつ第１２週までこのような陰性を持続するＨＣＶ患者の数を最大化する必要がある。したがって、さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、約９０ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。他の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、約９００ｕｇ／投薬量から約２１００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、約９００ｕｇ／投薬量から約２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、約９００ｕｇ／投薬量から約１２００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、また、さらなる実施形態において、約１２００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のこのような投与は、単独で、またはリバビリン等の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の抗ウイルス化合物と併用するものである。
追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約６００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、１０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、１２００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、１５００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、１６００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、２１００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、あるいは２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のこのような投与は、単独で、または１つ、２つ、３つ、または４つのリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用するものである。いくつかの実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質は、少なくとも２４週間の間、また、他の実施形態において、４８週間の間、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、遺伝子１型に感染する治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質は、少なくとも２４週間の間、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して遺伝子２型または３型に感染する治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。

ある実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９０ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、治療レジメンの初期の間、２週間毎に２回、治療未経験ＨＣＶ患者に投与され、その後、残りの治療期間について、４週間毎にＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合で治療される。具体的な実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、治療レジメンの初期の間、２週間毎に２回、治療未経験ＨＣＶ患者に投与され、その後、残りの治療期間中について、４週間毎にＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合で治療される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、治療レジメンの初期の間、２週間毎に２回、治療未経験ＨＣＶ患者に投与され、その後、残りの治療期間中について、４週間毎にＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合で治療される。本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のこのような投与は、単独で、または１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用するものである。いくつかの実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質は、少なくとも２４週間の間、また、ある実施形態において、４８週間の間、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、遺伝子１型に感染する治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、２４週間の間、遺伝子２型または３型に感染する治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。

追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、。約６００ｕｇ／投薬量、８００ｕｇ／投薬量、９００ｕｇ／投薬量、１０００ｕｇ／投薬量、１２００ｕｇ／投薬量、１５００ｕｇ／投薬量、１６００ｕｇ／投薬量、１８００ｕｇ／投薬量、２０００ｕｇ／投薬量、２１００ｕｇ／投薬量、または２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、治療レジメンの初期の間、２週間毎に２回、治療未経験ＨＣＶ患者に投与され、その後、残りの治療期間中について、４週間毎にＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合で治療される。本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のこのような投与は、単独で、または１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用するものである。ある実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質の処方総濃度は、１２００ｕｇ／投薬量または１８００ｕｇ／投薬量である。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、または４つのリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、少なくとも２４週間の間、また別の実施形態において、４８週間の間、遺伝子１型に感染する治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質は１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、２４週間の間、遺伝子２型または３型に感染する治療未経験ＨＣＶ患者に投与される。
追加の具体的な実施形態にいおいて、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９０ｕｇ／投薬量から約２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、単独で、またはリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約２１００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約１２００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、また、他の実施形態において、約１２００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、１週間に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、または別の実施形態において、２週間毎に、単独で、またはリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約６００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１２００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１５００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１６００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、２１００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、単独で、またはリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。

さらに具体的な実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。約９０ｕｇ／投薬量から約２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、有効量の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。いくつかの実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約２１００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約１２００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、また、他の実施形態において、約１２００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、１週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、またはさらに他の実施形態において、２週間毎に、有効量の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約６００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１２００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１５００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１６００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、２１００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、あるいは２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または５週間毎に１回、有効量の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。

いくつかの実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎に１回、また、ある実施形態において、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、２週間毎に１回、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、４週間毎に１回、または１８００ｕｇ／投薬量の総濃度で、４週間毎に１回、単独で、またはリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。他の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、９００ｕｇ／投薬量２週間毎に１回の処方総濃度で、また、別の実施形態において、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で２週間毎に１回、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で４週間毎に１回、または１８００ｕｇ／投薬量の総濃度で４週間毎に１回、有効量の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物ち併用して、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。
別の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、少なくとも２４週間の間、２週間毎に１回、またいくつかの実施形態において、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、少なくとも２４週間、２週間毎に１回、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、少なくとも２４週間の間、４週間毎に１回、または１８００ｕｇ／投薬量の総濃度で、少なくとも２４週間の間で４週間毎に１回、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のこのような投与は、単独で、または１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用するものである。ある実施形態において、治療経験済ＨＣＶ患者は、遺伝子２型または３型に感染している。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、少なくとも４８週間の間、２週間毎に１回、また別の実施形態において、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、少なくとも４８週間の間、２週間毎に１回、１２００ｕｇ／投薬量の総濃度で、少なくとも４８週間の間、４週間毎に１回、または１８００ｕｇ／投薬量の総濃度で、少なくとも４８週間の間、４週間毎に１回、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のこのような投与は、単独で、または１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用するものである。ある実施形態において、治療経験済ＨＣＶ患者は、ＨＣＶ遺伝子１型に感染している。

前述のように、治療の第４週における迅速な抗ウイルス反応（ＲＶＲ）は、持続性抗ウイルス反応（ＳＶＲ）の肯定的な予測因子として特定されている。さらに、治療の第１２週までＨＣＶＲＮＡ陰性の維持は、ＳＶＲのさらなる肯定的な予測因子として確立される。つまり、第４週でＨＣＶＲＮＡ陰性を達成、このような陰性を第１２週まで持続する患者は、治療レジメンの完了後、ＨＣＶＲＮＡ陰性を維持する可能性がある。したがって、単独で、または少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つのリバビリン等の抗ウイルス剤と併用してＩＦＮ−α−ＨＡＳで治療した後に、第４週でＨＣＶＲＮＡ陰性を達成し、かつ第１２週までこのような陰性を持続するＨＣＶ患者の数を最大化する必要がある。したがって、さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９０ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。いくつかの実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、約９００ｕｇ／投薬量から約２１００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、約９００ｕｇ／投薬量から約２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、約９００ｕｇ／投薬量から約１２００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、また、いくつかの他の実施形態において、約１２００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のこのような投与は、単独で、または１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用するものである。

追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約６００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で２週間毎および４週間毎の組み合わせで、９００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、１０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、１２００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、１５００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、１６００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、２０００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、２１００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、あるいは２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、２週間毎および４週間毎の組み合わせで、治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のこのような投与は、単独で、または１つ、２つ、３つ、または４つのリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用するものである。いくつかの実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質は、少なくとも２４週間の間、また、追加の実施形態において、４８週間の間、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、遺伝子１型に感染した治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質は、２４週間の間、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、遺伝子２型または３型に感染した治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。

ある実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９，２３４３，２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９０ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、治療レジメンの初期の間、２週間毎に２回、治療経験済ＨＣＶ患者に投薬され、その後、残りの治療期間中について、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合４週間毎に、治療される。ある実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、治療レジメンの初期の間、２週間毎に２回、治療経験済ＨＣＶ患者に投与され、その後、残りの治療期間中について、４週間毎にＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合で治療される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約９００ｕｇ／投薬量から約１８００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、治療レジメンの初期の間、２週間毎に２回、治療経験済ＨＣＶ患者に投与され、その後、残りの治療期間中について、４週間毎にＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合で治療される。本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のこのような投与は、単独で、または１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物を併用するものである。他の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質は、少なくとも２４週間の間、また、さらなる実施形態において、４８週間の間、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、遺伝子１型に感染した治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質は、２４週間の間、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、遺伝子２型または３型に感染した治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。

追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により産生される）は、約６００ｕｇ／投薬量、８００ｕｇ／投薬量、９００ｕｇ／投薬量、１０００ｕｇ／投薬量、１２００ｕｇ／投薬量、１５００ｕｇ／投薬量、１６００ｕｇ／投薬量、１８００ｕｇ／投薬量、２０００ｕｇ／投薬量、２１００ｕｇ／投薬量、または２４００ｕｇ／投薬量の処方総濃度で、治療レジメンの初期の間、２週間毎に２回、治療経験済ＨＣＶ患者に投与され、その後、４週間毎に、残りの治療期間中について、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合で治療される。本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のこのような投与は、単独で、または、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用するものである。一実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質の処方総濃度は、１２００ｕｇ／投薬量または１８００ｕｇ／投薬量である。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質は、少なくとも２４週間の間、また、別の実施形態において、４８週間の間、１つ、２つ、３つ、または４つのリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、遺伝子１型を感染した治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。追加の実施形態において、本発明のＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質は、２４週間の間、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリバビリン等の抗ウイルス化合物と併用して、遺伝子２型または３型に感染した治療経験済ＨＣＶ患者に投与される。
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、経口的、直腸内、非経口的、槽内、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与可能である。「薬学的に許容可能なキャリア」は、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤を指す。本明細書で使用する際、「非経口的」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与形態を指す。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドはまた、持続放出系により適切に投与される。持続放出型アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドの適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内、膣内、腹腔内、局所的（散剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによる）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与される。「薬学的に許容可能なキャリア」は、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤を指す。本明細書で用いる場合、「非経口的」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与形態をいう。持続放出型アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドのさらなる例として、適切なポリマー材料（例えば、成形品の形態の半透過性ポリマーマトリックス（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル））、適切な疎水性材料（例えば、許容可能な油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂、および低可溶性誘導体（例えば、低可溶性塩）が挙げられる。
持続放出型マトリックスには、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎｅｔａｌ．、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒｅｔａｌ．、Ｉｄ．）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が含まれる。

持続放出型アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドはまた、リポソームに封入された本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む（一般には、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）、Ｔｒｅａｔｅｔａｌ．，ＬｉｐｏｓｏｍｅｓｉｎｔｈｅＴｈｅｒａｐｙｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅａｎｄＣａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎａｎｄＦｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．３１７−３２７ａｎｄ３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを含有するリポソームは、それ自体が既知である方法により調製される。ＤＥ３，２１８，１２１、Ｅｐｓｔｅｉｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）、Ｈｗａｎｇｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１９８０）、欧州特許第５２，３２２号、欧州特許第３６，６７６号、欧州特許第８８，０４６号、欧州特許第１４３，９４９号、欧州特許第１４２，６４１号、日本国特許出願第８３−１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号、ならびに欧州特許第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小型の（約２００〜８００Ａ）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適な治療剤のために調整される。
さらに追加の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ポンプによって送達される（Ｌａｎｇｅｒ，前出、Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）、Ｂｕｃｈｗａｌｄｅｔａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ８８：５０７（１９８０）、Ｓａｕｄｅｋｅｔａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）

他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説において議論される。
非経口投与では、一実施形態において、一般的に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、それを所望の程度の純度で、薬学的に許容可能なキャリア、すなわち、用いる投薬量および濃度で受容者に対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、処方物は、酸化剤、および治療剤に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
一般的に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要に応じて、生成物を所望の処方物に成形する。例示的なキャリアは、非経口的キャリア、または受容者の血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例として、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。

キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度で受容者に対して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤、アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸、セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール、ナトリウムのような対イオン、および／またはポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０を含む）、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
アルブミン融合タンパク質は、典型的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば、１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度において、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方される。前述の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、ポリペプチド塩が形成されることが理解される

治療的投与に用いられる任意の医薬品は無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥したアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。

具体的な実施形態において、アルブミン融合タンパク質処方物は、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５ｍＭ塩化ナトリウム、融合タンパク質１ｍｇあたり０．１６マイクロモルオクタン酸ナトリウム、１５マイクログラム／ミリリットルポリソルベート８０、ｐＨ７．２を含む。別の具体的な実施形態において、アルブミン融合タンパク質処方物は、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５ｍＭ塩化ナトリウム、融合タンパク質１ｍｇあたり０．１６マイクロモルオクタン酸ナトリウム、１５マイクログラム／ミリリットルポリソルベート８０、ｐＨ７．２から成る。ｐＨおよび緩衝液は、生理学的条件に調合するように選択され、そして塩が、等張化剤として加えられる。オクタン酸ナトリウムは、溶液中のタンパク質の熱安定性を増加する、その報告された能力に起因して選択された。最後に、ポリソルベートは、溶液の表面張力を低くし、そして容器密封系に対してアルブミン融合タンパク質の非特異的吸着を低くする遺伝子界面活性剤として加えられた。
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドの１つ以上の成分を満たした１つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。さらに、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独で、またはアジュバントと併用して投与され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得るアジュバントには、ミョウバン、ミョウバン＋デオキシコール酸（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（ＢｉｏｃｉｎｅＣｏｒｐ．）、ＱＳ２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ（例えば、ＴＨＥＲＡＣＹＳ（登録商標））、ＭＰＬおよびコリネバクテリウムパルバムの生育不能調製物が含まれるがこれらに限定されない。具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ミョウバンと併用して投与される。別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＱＳ−２１と併用して投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得るさらなるアジュバントには、モノホスホリル脂質免疫調節剤、ＡｄｊｕＶａｘ１００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩、ＭＦ−５９、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術が含まれるがこれらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得るワクチンには、ＭＭＲ（麻疹、流行性耳下腺炎，風疹）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）、水痘、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ菌、百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇｃｏｕｇｈ）、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイルス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、ポリオ（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、狂犬病、腸チフス、および百日咳（ｐｅｒｔｕｓｉｓ）に対する予防に指向するワクチンが含まれるがこれらに限定されない。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して、または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、化合物または薬剤の一つをまず投与し、続いて第二の化合物または薬剤を投与する、個別投与をさらに含む。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独で、または他の治療的薬剤と併用して投与され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組合せて投与され得るアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド薬剤としては、化学療法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗炎症剤、従来の免疫療法剤、ならびに／または以下に記載される治療処置が含まれるがこれらに限定されない。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して、または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される形態を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、化合物または薬剤の一つをまず投与し、続いて第二の化合物または薬剤を投与する、個別投与をさらに含む。
一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、反凝固薬と併用して投与される。本発明の組成物とともに投与され得る反凝固薬には、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ワルファリンナトリウム（例えば、ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））、ジクマロール、４−ヒドロキシクマリン、アニシンジオン（例えば、ＭＩＲＡＤＯＮ（商標））、アセノクマロール（例えば、ニクマロン、ＳＩＮＴＨＲＯＭＥ（商標））、インダン−１，３−ジオン、フェンプロクーモン（例えば、ＭＡＲＣＵＭＡＲ（商標））、エチルビスクマセテート（ｅｔｈｙｌｂｉｓｃｏｕｍａｃｅｔａｔｅ）（例えば、ＴＲＯＭＥＸＡＮ（商標））、およびアスピリンが含まれるがこれらに限定されない。別の具体的な実施形態において、本発明の組成物は、ヘパリンおよび／またはワルファリンと併用して投与される。別の具体的な実施形態において、本発明の組成物は、ワルファリンと併用して投与される。別の具体的な実施形態において、本発明の組成物は、ワルファリンおよびアスピリンと併用して投与される。別の具体的な実施形態において、本発明の組成物は、ヘパリンと併用して投与される。別の具体的な実施形態において、本発明の組成物は、ヘパリンおよびアスピリンと併用して投与される。

別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、血栓溶解薬物と併用して投与される。本発明の組成物と併用して投与され得る血栓溶解薬物には、プラスミノゲン、ｌｙｓ−プラスミノゲン、α２−抗プラスミン、ストレプトキナーゼ（例えば、ＫＡＢＩＫＩＮＡＳＥ（商標））、アンチリスプラーゼ（ａｎｔｉｒｅｓｐｌａｃｅ）（例えば、ＥＭＩＮＡＳＥ（商標））、組織プラスミノゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ、アルテバーゼ（ａｌｔｅｖａｓｅ）、ＡＣＴＩＶＡＳＥ（商標））、ウロキナーゼ（例えば、ＡＢＢＯＫＩＮＡＳＥ（商標））、サウルプラーゼ（ｓａｕｒｕｐｌａｓｅ）（プロウロキナーゼ、単鎖ウロキナーゼ）、およびアミノカプロ酸（例えば、ＡＭＩＣＡＲ（商標））が含まれるがこれらに限定されない。具体的な実施形態において、本発明の組成物は、組織プラスミノゲン活性化剤およびアスピリンと併用して投与される。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗血小板薬物と併用して投与される。本発明の組成物と併用して投与され得る抗血小板薬物には、アスピリン、ジピリダモール（例えば、ＰＥＲＳＡＮＴＩＮＥ（商標））、およびチクロピジン（例えば、ＴＩＣＬＩＤ（商標））が含まれるがこれらに限定されない。

具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用する抗凝固薬、血栓溶解薬物および／または抗血小板薬物の使用は、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、血栓塞栓症、肺塞栓症、性動脈硬化症、心筋梗塞、一過性脳虚血（乏血）発作、不安定狭心症の予防、診断および／または処置について企図される。具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用する抗凝固薬、血栓溶解薬物および／または抗血小板薬物の使用は、血管形成手順を伴い得る肛門周囲の血栓症の危険性を減少するため、非リウマチ性動脈原線維性を含む動脈原線維性を有する患者内の脳卒中の危険性を減少するため、人工心臓バルブおよび／または僧帽弁のバルブ疾患に関連する塞栓症の危険性を減少するため、伏在の移植片の不顕性出血について想定される。単独で、または抗血小板薬物、抗凝固薬および／または血栓溶解薬物と併用する本発明の治療についての他の用途には、体外の機器（例えば、脈管内カニューレ、血液透析患者内の脈管アクセスシャウト、血液透析機器、および心肺バイパス機器）における不顕性出血の予防が含まれるがこれに限定されない。

特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、および／またはプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）と併用して投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得るＮＲＴＩには、ＲＥＴＲＯＶＩＲ（商標）（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸ（商標）（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤ（商標）（ザルシタビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴ（商標）（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲ（商標）（ラミブジン／３ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲ（商標）（ジドブジン／ラミブジン）が含まれるがこれらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得るＮＮＲＴＩには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＶＩＲＡＭＵＮＥ（商標）（ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ（商標）（デラビルジン）、およびＳＵＳＴＩＶＡ（商標）（エファビレンズ）が含まれるがこれらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得るプロテアーゼ阻害剤には、ＣＲＩＸＩＶＡＮ（商標）（インディナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ））、ＮＯＲＶＩＲ（商標）（リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ））、ＩＮＶＩＲＡＳＥ（商標）（サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ））、およびＶＩＲＡＣＥＰＴ（商標）（ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ））が含まれるがこれらに限定されない。具体的な実施形態において、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、および／またはプロテアーゼ阻害剤は、ＡＩＤＳを処置するため、および／またはＨＩＶ感染を予防もしくは治療するために、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとの任意の組み合わせで使用され得る。

さらなるＮＲＴＩには、ＬＯＤＥＮＯＳＩＮＥ（商標）（Ｆ−ｄｄＡ、酸安定性アデノシンＮＲＴＩ、Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ、ＣＯＶＩＲＡＣＩＬ（商標）（エントリシタビン（ｅｍｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）／ＦＴＣ、構造的にラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）（３ＴＣ）に関連があるが、体外で３〜１０倍大きな活性を有する、Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）、ｄＯＴＣ（ＢＣＨ−１０６５２もまた構造的にラミブジンに関連があるが、ラミブジン耐性単離物の実質的な割合に対して活性を維持したままである、ＢｉｏｃｈｅｍＰｈａｒｍａ）、Ａｄｅｆｏｖｉｒ（ＦＤＡによって抗ＨＩＶ治療に対する認可を拒絶された、ＧｉｌｅａｄＳｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＲＥＶＥＯＮ（登録商標）（ＡｄｅｆｏｖｉｒＤｉｐｉｖｏｘｉｌ、アデホビル（ａｄｅｆｏｖｉｒ）の活性なプロドラック、その活性形態はＰＭＥＡ−ｐｐである）、ＴＥＮＯＦＯＶＩＲ（商標）（ビス−ＰＯＣＰＭＰＡ、ＰＭＰＡプロドラック、Ｇｉｌｅａｄ）、ＤＡＰＤ／ＤＸＧ（ＤＡＰＤの活性な代謝物、Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）、Ｄ−Ｄ４ＦＣ（３ＴＣに関連し、ＡＺＴ／３ＴＣ−耐性ウイルスに対する活性を有する）、ＧＷ４２０８６７Ｘ（ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅ）、ＺＩＡＧＥＮ（商標）（アバカビル（ａｂａｃａｖｉｒ）／１５９Ｕ８９、ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅＩｎｃ．）、ＣＳ−８７（３´アジド−２´，３´−ジデオキシウリジン、国際公開第ＷＯ９９／６６９３６号）、およびＳ−アシル−２−チオエチル（ＳＡＴＥ）を保有するβ−Ｌ−ＦＤ４Ｃおよびβ−Ｌ−ＦｄｄＣのプロドラック形態（国際公開第ＷＯ９８／１７２８１）が含まれる。

さらなるＮＮＲＴＩには、ＣＯＡＣＴＩＮＯＮ（商標）（Ｅｍｉｖｉｒｉｎｅ／ＭＫＣ−４４２、ＨＥＰＴクラスの強力なＮＮＲＴＩ、Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）、ＣＡＰＲＡＶＩＲＩＮＥ（商標）（ＡＧ−１５４９／Ｓ−１１５３、Ｋ１０３Ｎ変異体を含むウイルスに対する活性を有する次世代のＮＮＲＴＩ、Ａｇｏｕｒｏｎ）、ＰＮＵ−１４２７２１（前駆体（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）よりも２０〜５０倍大きな活性を有し、そしてＫ１０３Ｎ変異体に対して活性である、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）、ＤＰＣ−９６１およびＤＰＣ−９６３（エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）の第二世代の誘導体、Ｋ１０３Ｎ変異を有するウイルスに対して活性であるように設計される、ＤｕＰｏｎｔ）、ＧＷ−４２０８６７Ｘ（ＨＢＹ０９７よりも２５倍大きな活性を有し、そしてＫ１０３Ｎ変異体に対して活性である、ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅ）、ＣＡＬＡＮＯＬＩＤＥＡ（ラテックスの木由来の天然に存在する薬剤、Ｙ１８１ＣおよびＫ１０３Ｎ変異のいずれかまたは両方を含むウイルスに対して活性）、ならびにＰｒｏｐｏｌｉｓ（国際公開第ＷＯ９９／４９８３０号）が含まれる。

さらなるプロテアーゼ阻害剤には、ＬＯＰＩＮＡＶＩ（商標）（ＡＢＴ３７８／ｒ、ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＢＭＳ−２３２６３２（アザペプチド、Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｒｅｓＳｑｕｉｂｂ）、ＴＩＰＲＡＮＡＶＩＲ（商標）（ＰＮＵ−１４０６９０、非ペプシンジヒドロピロン、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）、ＰＤ−１７８３９０（非ペプチド性ジヒドロピロン、Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）、ＢＭＳ２３２６３２（アザペプチド、Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）、Ｌ−７５６、４２３（インディナルビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）類似体、Ｍｅｒｃｋ）、ＤＭＰ−４５０（環状ウレア化合物、Ａｖｉｄ＆ＤｕＰｏｎｔ）、ＡＧ−１７７６（プロテアーゼ阻害剤耐性ウイルスに対する体外活性を有するペプチド模倣物、Ａｇｏｕｒｏｎ）、ＶＸ−１７５／ＧＷ−４３３９０８（アンプレナビル（ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）のリン酸プロドラック、Ｖｅｒｔｅｘ＆ＧｌａｘｏＷｅｌｃｏｍｅ）、ＣＧＰ６１７５５（Ｃｉｂａ）、ならびにＡＧＥＮＥＲＡＳＥ（商標）（アンプレナビル、ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅＩｎｃ．）が含まれる。

さらなる抗レトロウイルス剤には、融合阻害剤／ｇｐ４１結合剤が含まれる。融合阻害剤／ｇｐ４１結合剤には、Ｔ−２０（ＨＩＶｇｐ４１膜貫通タンパク質外部ドメインの残基６４３−６７８由来のペプチド（休止期においてｇｐ４１と結合し、そして紡錘細胞状態に対する形質転換を防止する、Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）ならびにＴ−１２４９（第２世代融合阻害剤、Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）が含まれる。

さらなる抗レトロウイルス剤には、融合阻害剤／ケモカイン受容体アンタゴニストが含まれる。融合阻害剤／ケモカイン受容体アンタゴニストには、ＡＭＤ３１００（ビシクラム（ｂｉｃｙｃｌａｍ））等のＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＳＤＦ−１およびその類似体、ならびにＡＬＸ４０−４Ｃ（カチオン性ペプチド）、Ｔ２２（１８個のアミノ酸ペプチド、Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）ならびにＴ２２アナログＴ１３４およびＴ１４０、ＣＣＲ５アンタゴニスト（例えば、ＲＡＮＴＥＳ（９−６８）、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＡＫ−７７９）、ならびにＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えば、ＮＳＣ６５１０１６（ジスタマイシンアナログ））が含まれる。ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ３、およびＣＣＲ６アンタゴニストがまた含まれる。ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β等のケモカイン受容体アゴニストはまた、融合を阻害し得る。
さらなる抗レトロウイルス剤は、インテグラーゼ阻害剤を含む。インテグラーゼ阻害剤には、ジカフェオイルキナ酸（ＤＦＱＡ）、Ｌ−チコリ酸（ジカフェオイル酒石酸（ＤＣＴＡ））、キナリザリン（ＱＬＣ）および関連するアントラキノン、ＺＩＮＴＥＶＩＲ（商標）（ＡＲ１７７、真のインテグラーゼ阻害剤でなく細胞表面でおそらく作用するオリゴヌクレオチド、Ａｒｏｎｄｅｘ）、ならびに国際公開第ＷＯ９８／５０３４７号に記載されるナフトール等のナフトールが含まれる。

さらなる抗レトロウイルス剤には、ヒドロキシウレア様化合物（例えば、ＢＣＸ−３４（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、Ｂｉｏｃｒｙｓｔ）、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤（例えば、ＤＩＤＯＸ（商標）（ＭｏｌｅｃｕｌｅｓｆｏｒＨｅａｌｔｈ））、イノシンモノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）阻害剤（例えば、ＶＸ−４９７（Ｖｅｒｔｅｘ））、ならびにマイコフォリック酸（ｍｙｃｏｐｈｏｌｉｃａｃｉｄ）（例えば、ＣｅｌｌＣｅｐｔ（マイコフェノラートモフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅｍｏｆｅｔｉｌ）、Ｒｏｃｈｅ）が含まれる。

さらなる抗レトロウイルス剤には、ウイルスインテグラーゼの阻害剤、ウイルスゲノム核転座の阻害剤、例えば、アリーレンビス（メチルケトン）化合物、ＨＩＶ侵入の阻害剤、例えば、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ−ＩｇＧ融合タンパク質、ＲＡＮＴＥＳの溶解性複合体およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ならびにＡＭＤ−３１００、ヌクレオカプシドジンクフィンガー阻害剤、例えば、ジチアン化合物、ＨＩＶＴａｔおよびＲｅｖの標的、ならびに薬学的エンハンサー、例えば、ＡＢＴ−３７８が含まれる。

他の抗レトロウイルス治療剤および補助治療剤には、サイトカインおよびリンホカイン（例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＳＤＦ−１α、ＩＬ−２、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）（アデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）／Ｌ２−７００１、Ｃｈｉｒｏｎ）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１３）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−α２ｂ、ＩＦＮ−β、ＴＮＦ、ＮＦｋＢ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１０のアンタゴニスト）、免疫活性を調節する薬剤（例えば、シクロスポリンおよびプレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ））、ワクチン（例えば、Ｒｅｍｕｎｅ（商標）（ＨＩＶＩｍｍｕｎｏｇｅｎ）、ＡＰＬ４００−００３（Ａｐｏｌｌｏｎ）、組み換えｇｐ１２０およびフラグメント、二価（Ｂ／Ｅ）組み換えエンベロープ糖タンパク質、ｒｇｐ１２０ＣＭ２３５、ＭＮｒｇｐ１２０、ＳＦ−２ｒｇｐ１２０、ｇｐ１２０／可溶性ＣＤ４錯体、ＤｅｌｔａＪＲ−ＦＬタンパク質、不連続ｇｐ１２０Ｃ３／Ｃ４ドメイン由来の分枝合成ペプチド、融合成分イムノゲン、ならびにＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、およびＴａｔワクチン）、遺伝子ベース治療剤（例えば、遺伝子抑制エレメント（ＧＳＥ、国際公開第ＷＯ９８／５４３６６号）、およびイントラキン（ｉｎｔｒａｋｉｎｅｓ）（新しく合成されたＣＣＲ５の表面発現を遮断するためにＥＲに対して標的された、一般に改変されたＣＣケモカイン（Ｙａｎｇｅｔａｌ．、ＰＮＡＳ９４：１１５６７−７２（１９９７）、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１１０−１６（１９９７））、抗体（例えば、抗−ＣＸＣＲ４抗体１２Ｇ５、抗−ＣＣＲ５抗体２Ｄ７、５Ｃ７、ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２、およびＰＡ１４、抗−ＣＤ４抗体Ｑ４１２０およびＲＰＡ−Ｔ４、抗−ＣＣＲ３抗体７Ｂ１１、抗−ｇｐ１２０抗体１７ｂ、４８ｄ、４４７−５２Ｄ、２５７−Ｄ、２６８−Ｄおよび５０．１、抗−Ｔａｔ抗体、抗−ＴＮＦ−α抗体、およびモノクローナル抗体３３Ａ）、アリール炭化水素（ＡＨ）レセプターアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、ＴＣＤＤ、３，３´，４，４´，５−ペンタクロロビフェニル、３，３´，４，４´−テトラクロロビフェニル、およびα−ナフトフラボン（国際公開第ＷＯ９８／３０２１３））、ならびに抗酸化剤（例えば、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエチルエステル（γ−ＧＣＥ、国際公開第ＷＯ９９／５６７６４号）が含まれる。

さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗ウイルス剤と併用して投与される。追加の実施形態において本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、２つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される。さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、３つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される。
ある実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る抗ウイルス剤には、ウイルス酵素の小分子阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼの小分子阻害剤、核酸ベースの抗ウイルス剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、チアゾライド、抗ウイルス抗体、新規免疫調節剤、サイクロフィリン阻害剤、肝臓保護剤、およびインターフェロンエンハンサーが含まれるがこれらに限定されない。具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る抗ウイルス剤には、アシクロビル、リバビリン、リバビリン類似体、アマンタジン、レマンチジン、マキサミン、またはチマルファシン含まれるがこれらに限定されない。具体的には、インターフェロンアルブミン融合タンパク質は、これら薬剤のいずれかと併用して投与可能である。さらに、インターフェロンαアルブミン融合タンパク質も、これら薬剤のいずれかと共に投与可能であり、また、ある実施形態において、インターフェロンα２ａまたは２ｂアルブミン融合タンパク質は、これらの薬剤のいずれかと共に投与可能である。さらに、インターフェロンβアルブミン融合タンパク質も、これら薬剤のうちのいずれかと共に投与可能である。さらに、任意のＩＦＮハイブリッドアルブミン融合タンパク質も、これら薬剤のいずれかと共に投与可能である。

ある実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、リバビリンまたはリバビリン類似体と併用して投与される。別の実施形態において、インターフェロンアルブミン融合タンパク質と併用して投与され得るリバビリンまたはリバビリン類似体には、ＣＯＰＥＧＵＳ（登録商標）（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、Ｎ．Ｊ．）、ＲＥＢＥＴＯＬ（登録商標）（ＳｃｈｅｒｉｎｇＣｏｒｐ．、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、Ｎ．Ｊ．）、ＶＩＲＡＺＯＬＥ（登録商標）（Ｖａｌｅａｎｔ、ＣｏｓｔａＭｅｓａ、ＣＡ）、ＲＩＢＡＶＩＮ（商標）（Ｌｕｐｉｎ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）、ＲＩＢＡＺＩＤ（商標）（Ｅｐｌａ、Ｋｉｒａｃｈｉ、Ｐａｋｉｓｔａｎ）、トリバビリン、ＶＩＲＡＭＩＤＩＮＥ（商標）（Ｖａｌｅａｎｔ、ＣｏｓｔａＭｅｓａ、ＣＡ）、およびＲＩＢＡＳＰＨＥＲＥ（商標）（ＴｈｒｅｅＲｉｖｅｒｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＣｒａｎｂｅｒｒｙＴｏｗｎｓｈｉｐ、ＰＡ）が含まれるがこれらに限定されない。さらなる実施形態において、インターフェロンαアルブミン融合タンパク質は、リバビリンまたはリバビリン類似体と併用して投与される。さらなる実施形態において、インターフェロンα２ａアルブミン融合タンパク質は、リバビリンまたはリバビリン類似体と併用して投与される。さらなる実施形態において、インターフェロンα２ｂアルブミン融合タンパク質は、リバビリンまたはリバビリン類似体と併用して投与される。さらなる実施形態において、インターフェロンβアルブミン融合タンパク質は、リバビリンまたはリバビリン類似体と併用して投与される。さらなる実施形態において、ハイブリッドインターフェロンアルブミン融合タンパク質は、リバビリンまたはリバビリン類似体と併用して投与される。追加の実施形態において、本発明のインターフェロンアルブミン融合タンパク質は、リバビリンまたはリバビリン類似体および１つ以上の追加の抗ウイルス剤と併用して投与される。さらなる実施形態において、本発明のインターフェロンアルブミン融合タンパク質およびリバビリンまたはリバビリン類似体と併用して投与される追加の抗ウイルス剤には、ウイルス酵素の小分子阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼの小分子阻害剤、核酸ベースの抗ウイルス剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、チアゾライド、抗ウイルス抗体、新規免疫調節剤、サイクロフィリン阻害剤、肝臓保護剤、およびインターフェロンエンハンサーが含まれるがこれらに限定されない。

さらなる実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独で、またはウイルス感染治療のための１つ以上の抗ウイルス剤と組み合わせて、投与され得る。ある実施形態では、本発明のインターフェロン-アルブミン融合タンパク質は、単独で、または１つ以上の抗ウイルス剤と組み合わせて投与され得る。追加実施形態では、ウイルス感染は、肝炎ウイルスによる感染から生じる。別の実施形態では、肝炎ウイルスは、C型肝炎ウイルス（HCV）である。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと投与され得る抗ウイルス剤は、ウイルス酵素の小分子阻害剤、RNAポリメラーゼの小分子阻害剤、核酸ベースの抗ウイルス剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、チアゾリジン、抗ウイルス抗体、新規免疫変調剤、サイクロフィリン阻害剤、肝臓保護剤、およびインターフェロン促進剤を含むが、これらに限定されない。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得る抗ウイルス酵素阻害剤には、ＶＸ−９５０（プロテアーゼ阻害剤、Ｖｅｒｔｅｘ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ＶＸ−４９７（ｍｅｒｉｍｅｐｏｄｉｂ、経口ＩＭＰＤＨ阻害剤、Ｖｅｒｔｅｘ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ＢＩＬＢ１９４１（プロテアーゼ阻害剤、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＳＣＨ７（プロテアーゼ阻害剤、ＳｃｈｅｒｉｎｇＣｏｒｐ．、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、Ｎ．Ｊ．）、ＭＸ−３２５３（ｃｅｌｇｏｓｉｖｉｒ、α−グルコシダーゼ阻害剤、Ｍｉｇｅｎｉｘ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）、ＩＤＮ−６５５６（カスパーゼ阻害剤、Ｐｆｉｚｅｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ）、ＵＴ２３１Ｂ（グルコシダーゼ阻害剤、ＵｎｉｔｅｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＳｉｌｖｅｒＳｐｒｉｎｇ、ＭＤ）、Ｒ１６２６（ウイルスプロテアーゼ阻害剤、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＩＴＭＮ−Ｂ（ＩＴＭＮ−１９１、プロテアーゼ阻害剤、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ、Ｂｒｉｓｂａｎｅ、ＣＡ）、ＳＣＨ５０３０３４（プロテアーゼ阻害剤、ＳｃｈｅｒｉｎｇＣｏｒｐ．、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＣＨ８０６（ＧＳ９１３２、経口プロテアーゼ阻害剤、Ａｃｈｉｌｌｉｏｎ、ＮｅｗＨａｖｅｎ、ＣＴ／ＧｉｌｅａｄＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡが含まれるがこれらに限定されない。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得る抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤は、ヌクレオシド類似体または非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）であり得る。ある実施形態において、抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤は、ＨＣＶＲＮＡポリメラーゼを阻害する。一実施形態において、抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤は、ヌクレオシド類似体であってもよく、このヌクレオシド類似体には、ＮＭ２８３（２３´−Ｃ−メチル−シチジンの経口プロドラッグ、Ｉｄｅｎｉｘ、Ｃａｍｂｒｉｄｅ、ＭＡ）、Ｒ１６２６（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、および２´−Ｃ−メチルヌクレオシドが含まれるがこれらに限定されない。別の実施形態において、抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤は、非ヌクレオシド阻害剤であってもよく、この非ヌクレオシド阻害剤には、ＪＴＫ−１０３、ＪＴＫ−００３、およびＪＴＫ−１０９（日本たばこ、東京、日本）、Ｒ８０３（Ｒｉｇｅｌ、ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、ＨＣＶ−３７１、ＨＣＶ−０８６、およびＨＣＶ−７９６（ＶｉｒｏＰｈａｒｍ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ／Ｗｙｅｔｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、ＸＴＬ−２１２５（ＢＣ２１２５、ＸＴＬｂｉｏ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ）、Ａ−８３１（ＡｒｒｏｗＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ）が含まれるがこれらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得る追加の抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤には、ＭＫ−０６０８（Ｍｅｒｃｋ、ＷｈｉｔｅｈｏｕｓｅＳｔａｔｉｏｎ、ＮＪ）、ＮＳ５ａ（経口非ヌクレオシドポリメラーゼ阻害剤、Ｇｅｎｅｌａｂｓ、ＲｅｄｗｏｏｄＣｉｔｙ、ＣＡ）、ＮＳ５ｂ（経口ヌクレオシドポリメラーゼ阻害剤、Ｇｅｎｅｌａｂｓ、ＲｅｄｗｏｏｄＣｉｔｙ、ＣＡ）、およびＡＮＡ０２５−１（ポリメラーゼ阻害剤、ＡｎａｄｙｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）が含まれるがこれらに限定されない。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得る抗ウイルス性核酸ベース薬剤には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、およびｓｉＲＮＡｓ、または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が含まれるがこれらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得る抗ウイルス性アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤には、ＮＥＵＧＥＮＥ（登録商標）ＡＶＩ−４０６５（ＡＶＩＢｉｏｐｈａｒｍａ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）が含まれるがこれらに限定されない。
別の実施形態において、チアゾライドが、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得る。ある実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得るチアゾライドには、ＡＬＩＮＩＡ（登録商標）（ニタゾキサニド、ＲｏｍａｒｋＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌ．Ｃ．、Ｔａｍｐａ、ＦＬ）が含まれるがこれに限定されない。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得る抗ウイルス性免疫調節剤には、ＺＡＤＸＩＮ（登録商標）（サイモシンα１、サイマルファシン、ＳｃｉＣｌｏｎｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｔ’ｌ、ＨｏｎｇＫｏｎｇ）と、ＡＮＡ２４５（ＴＬＲ−７アゴニスト、ＡｎａｄｙｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＡＮＡ９７５（ＡＮＡ２４５の経口プロドラッグ、ＡｎａｄｙｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、およびＣＰＧ−１０１０１（ＡＣＴＩＬＯＮ（商標）、ＴＬＲ−９アゴニスト、ＣｏｌｅｙＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＧｒｏｕｐ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）を含むがこれらに限定されないトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストが含まれるがこれらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得るサイクロフィリン阻害剤には、Ｄｅｂｉｏ−０２５（ＤｅｂｉｏｐｈａｒｍＧｒｏｕｐ、Ｌａｕｓａｎｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が含まれるがこれらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得る肝臓保護剤には、ＮＯＶ−２０５（ＮｏｖｅｌｏｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）が含まれるがこれらに限定されない。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得るインターフェロンエンハンサーには、ＥＭＺ７０２（ＴｒａｎｓｉｔｉｏｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ）が含まれるがこれに限定されない。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得る抗ウイルス抗体には、Ｔａｒｖａｃｉｎ（バビツキシマブ、内皮系腫瘍細胞の表面上のホスファチジルセリンを標的化するヒト化単クローン抗体、ＰｅｒｅｇｒｉｎｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｔｕｓｔｉｎ、ＣＡ）が含まれるがこれに限定されない。

ある実施形態において、本発明によって包含される抗ウイルス剤のうちの１つ以上と併用して単体でまたは併用して投与され得るアルブミン融合タンパク質は、インターフェロン−アルブミン融合タンパク質である。追加の実施形態において、インターフェロン−アルブミン融合タンパク質のインターフェロン部分は、インターフェロンαである。本発明によって包含されるインターフェロンαの非限定的な例には、表１の治療用タンパク質の列に開示されるインターフェロンαタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態においてインターフェロンα部分は、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンα２ｃ、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンαｎ１、インターフェロンαｎ３、例えば、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（ＳｃｈｅｒｉｎｇＣｏｒｐ．、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、Ｎ．Ｊ．）、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）Ａ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、Ｎ．Ｊ．）、Ｂｅｒｏｆｏｒαインターフェロン（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｇｅｌｈｅｉｍＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｉｎｃ．、Ｒｉｄｇｅｆｉｅｄ、Ｃｏｎｎ．）、ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（商標）（Ｖｉｒａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＦＬ）、ＭＵＬＴＩＦＥＲＯＮ（商標）（Ｖｉｒａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＦＬ）ＷＥＬＬＦＥＲＯＮ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＧｒｅａｔＢｒｉｔｉａｎ）、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ、Ｉｎｃ．、ＴｈｏｕｓａｎｄｓＯａｋｓ、ＣＡ）、ＳＵＭＩＦＥＲＯＮ（登録商標）（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ、Ｊａｐａｎ）、ＢＥＬＥＲＯＦＯＮ（登録商標）（ＮａｕｔｉｌｕｓＢｉｏｔｅｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＭＡＸＹ−ＡＬＰＨＡ（商標）（Ｍａｘｙｇｅｎ、ＲｅｄｗｏｏｄＣｉｔｙ、ＣＡ／Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、Ｎ．Ｊ．）等の任意の市販形態のインターフェロンα、または任意の精製インターフェロンα産物もしくはそのフラグメントから成るか、あるいはこれらを含む。さらなる実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のインターフェロンα部分は、持続放出または制御放出のために修飾または処方されるインターフェロンから成るか、あるいはこれを含む。例えば、インターフェロンα部分は、市販の持続放出または制御放出インターフェロンαから成るか、あるいはこれを含み、また、インターフェロン−α−ＸＬ（ＦｌａｍｅｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）およびＬＯＣＴＥＲＯＮ（商標）（ＢｉｏＬｅｘＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ＯｃｔｏＰｌｕｓ、Ｐｉｔｔｓｂｏｒｏ、ＮＣ）を含むがこれに限定されない。追加の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のインターフェロンα部分は、化学的部分の付着によって修飾され得る。例えば、インターフェロンα部分は、ペグ化によって修飾され得る。したがって、追加の実施形態において、ＩＦＮ−α−ＨＳＡ融合タンパク質のインターフェロンα部分は、インターフェロンα２ａ、２ｂ、またはコンセンサスインターフェロンのペグ化形態から成るか、あるいはこれを含み、また、例えば、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ＳｃｈｅｒｉｎｇＣｏｒｐ．、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、Ｎ．Ｊ．）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、Ｎ．Ｊ．）、ＰＥＧ−ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（商標）（Ｖｉｒａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＦＬ）またはそのフラグメント等の市販のペグインターフェロンαが含まれるがこれらに限定されない。追加の実施形態において、インターフェロンα２ａまたは２ｂインターフェロン、インターフェロンアルブミン融合タンパク質のインターフェロン部分は、これらの薬剤のいずれとも併用して投与可能である。さらに、別の実施形態において、インターフェロン−アルブミン融合タンパク質のインターフェロン部分は、インターフェロンβまたはインターフェロンハイブリッドである。さらなる実施形態において、インターフェロン−アルブミン融合タンパク質の非融合インターフェロン部分は、単体で、または本発明に包含される抗ウイルス剤のうちの１つ以上併用して使用され得る。

他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗日和見感染症薬剤と組み合わせて投与され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る抗日和見感染症薬剤には、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ（商標）、ＤＡＰＳＯＮＥ（商標）、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥ（商標）、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ（商標）、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ（商標）、ＲＩＦＡＭＰＩＮ（商標）、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ（商標）、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ（商標）、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ（商標）、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ（商標）、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ（商標）、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ（商標）、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ（商標）、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲ（商標）、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ（商標）、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲ（商標）、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥ（商標）、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ（商標）、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（商標）（フィルグラスチム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥ（商標）（サルグラモスチン／ＧＭ−ＣＳＦ）が含まれるがこれらに限定されない。具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的にまたは予防するために、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ（商標）、ＤＡＰＳＯＮＥ（商標）、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥ（商標）、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ（商標）との任意の組み合わせで使用される。別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ複合感染を予防的に処置または予防するために、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ（商標）、ＲＩＦＡＭＰＩＮ（商標）、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ（商標）、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ（商標）との任意の組み合わせで使用される。別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を予防的に処置または予防するために、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ（商標）、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ（商標）、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ（商標）との任意の組み合わせで使用される。別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見サイトメガロウイルス感染を予防的に処置または予防するために、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ（商標）、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ（商標）、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲ（商標）との任意の組み合わせで使用される。別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見真菌感染を予防的に処置または予防するために、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）との任意の組み合わせで使用される。別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見単純ヘルペスウイルスＩ型および／またはＩＩ型感染を予防的に処置または予防するためにＡＣＹＣＬＯＶＩＲ（商標）および／またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲ（商標）との任意の組み合わせで使用される。別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ感染を予防的に処置または予防するために、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥ（商標）および／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ（商標）との任意の組み合わせで使用される。別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見細菌感染を予防的に処置または予防するためにＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ（商標）および／またはＮＥＵＰＯＧＥＮ（商標）との任意の組み合わせで使用される。

さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗生物質と併用して投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る抗生物質には、アモキシシリン、β−ラクタマーゼ、アミノグリコシド、β−ラクタム（糖ペプチド）、β−ラクタマーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン、マクロライド、メトロニダゾール、ペニシリン、キノロン、ラパマイシン、リファンピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｔｈｏｘａｚｏｌｅ）、およびバンコマイシンが含まれるがこれらに限定されない。

他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、免疫刺激剤と併用して投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得る免疫刺激剤には、レバミゾ−ル（例えば、ＥＲＧＡＭＩＳＯＬ（商標）），）、イソピリノサイン（ｉｓｏｐｒｉｎｏｓｉｎｅ）（例えば、ＩＩＮＯＳＩＰＬＥＸ（商標））、インターフェロン（例えば、インターフェロンα）、およびインターロイキン（例えば、ＩＬ−２）が含まれるがこれらに限定されない。

他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、免疫抑制剤と併用して投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得る免疫抑制剤には、ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミドメチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、および応答するＴ細胞の機能を抑制することにより作用する他の免疫抑制剤が含まれる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得る他の免疫抑制剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：プレドニゾロン（ｐｒｅｄｏｎｉｓｏｌｏｎｅ）、メトトレキサート、サリドマイド、メトキサレン、ラパマイシン、レフルノミド、ミゾリビン（ＢＲＥＤＩＮＩＮ（商標））、ブレキナル、デオキシスペルグアリン、およびアザスピラン（ａｚａｓｐｉｒａｎｅ）（ＳＫＦ１０５６８５）、ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥＯＫＴ（登録商標）３（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ（商標）、ＮＥＯＲＡＬ（商標）、ＳＡＮＧＤＹＡ（商標）（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦ（登録商標）（ＦＫ５０６、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ））、ＣＥＬＬＣＥＰＴ（登録商標）（マイコフェノラートモフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅｍｏｔｅｆｉｌ），その活性な代謝産物は、ミコフェノール酸である）、ＩＭＵＲＡＮ（商標）（アザチオプリン）、グルココルチコステロイド、副腎皮質ステロイド（例えば、ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標）（プレドニゾン）およびＨＹＤＥＬＴＲＡＳＯＬ（商標）（プレドニゾロン））、ＦＯＬＥＸ（商標）およびＭＥＸＡＴＥ（商標）（メトトレキサート）、ＯＸＳＯＲＡＬＥＮ−ＵＬＴＲＡ（商標）（メトトレキサレン）ならびにＲＡＰＡＭＵＮＥ（商標）（シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））が含まれるがこれらに限定されない。）具体的な実施形態において、免疫抑制剤を使用して、器官移植または骨髄移植の拒絶を予防し得る。

追加の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独または１以上の静脈内免疫グロブリン調製物と併用して投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物には、ＧＡＭＭＡＲ（商標）、ＩＶＥＥＧＡＭ（商標）、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮ（商標）、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤＳ／Ｄ（商標）、ＡＴＧＡＭ（商標）（抗胸腺細胞グロブリン）およびＧＡＭＩＭＵＮＥ（商標）が含まれるがこれらに限定されない。具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈内免疫グロブリン調製物と併用して投与される。

別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、癌の治療のために、患者に体内、または細胞に体外のいずれかにおいて、単独で、または組み合わせ治療の一部として投与される。具体的な実施形態において、アルブミン融合タンパク質、特にＩＬ−２−アルブミン融合は、癌についての消極的な免疫治療（例えば、Ｄｕｄｌｅｙｅｔａｌ．、ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓ．ｏｒｇでのＳｃｉｅｎｃｅＥｘｐｒｅｓｓ、２００２年９月１９日（ここで、この全体は、参考として本明細書中で援用される）に記載されるような転移性メラノーマについての養子細胞転移治療）の間、繰り返し投与される。

特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独でまたは抗炎症剤と併用して投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得る抗炎症剤には、コルチコステロイド（例えば、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンおよびトリアムシノロン）、非ステロイド系抗炎症薬（例えば、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク（ｅｔｏｄｏｌａｃ）、フェノプロフェン、フロクタフェニン、フルルビフロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメート（ｍｅｃｌｏｆｅｎａｍａｔｅ）、メフェナム酸、メロキシカム（ｍｅｌｏｘｉｃａｍ）、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸，およびトルメチン）、ならびに抗ヒスタミン剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体，アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類，ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン（ｇｕａｉａｚｕｌｅｎｅ）、ナブメトン、ニメスリド（ｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ）、オルゴテイン（ｏｒｇｏｔｅｉｎ）、オキサセプロール（ｏｘａｃｅｐｒｏｌ）、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、ピフオキシム（ｐｉｆｏｘｉｍｅ）、プロカゾン（ｐｒｏｑｕａｚｏｎｅ）、プロキサゾール、およびテニダプ（ｔｅｎｉｄａｐ）が含まれるがこれらに限定されない。
追加の実施形態において、本発明の組成物は、単独でまたは抗脈管形成剤と併用して投与される。本発明の組成物と併用して投与され得る抗脈管形成剤には、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）（Ｅｎｔｒｅｍｅｄ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、トロポニン（Ｔｒｏｐｏｎｉｎ）−１（ＢｏｓｔｏｎＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその誘導体、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織阻害剤、メタロプロテイナーゼ−２の組織阻害剤、ＶＥＧＩ、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−２および種々の形態のより軽い「ｄ群」遷移金属が含まれるがこれらに限定されない。

より軽い「ｄ群」遷移金属には、例えばバナジウム、モリブデン、タングステン、チタン、ニオブおよびタンタル種が含まれる。このような遷移金属種は、遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体には、オキソ遷移金属錯体が含まれる。
バナジウム錯体の代表的な例としては、オキソバナジウム錯体（例えば、バナジン酸錯体およびバナジル錯体）が挙げられる。適切なバナジン酸錯体としては、メタバナジン酸錯体およびオルトバナジン酸錯体（例えば、メタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナジン酸ナトリウム）が挙げられる。適切なバナジル錯体としては、例えば、バナジルアセチルアセトネート、ならびに硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル３水和物のような硫酸バナジル水和物を含む、硫酸バナジルが挙げられる。
タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯体が挙げられる。適切なオキソタングステン錯体としては、タングステン酸およびタングステンオキシド錯体が挙げられる。適切なタングテン酸錯体としては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切なタングステンオキシドとしては、タングステン（ＩＶ）オキシドおよびタングステン（ＶＩ）オキシドが挙げられる。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデン酸錯体、モリブデンオキシド錯体およびモリブデニル錯体が挙げられる。適切なモリブデン酸錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙げられる。適切なモリブデンオキシドとしては、モリブデン（ＶＩ）オキシド、モリブデン（ＶＩ）オキシドおよびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデニル錯体としては、例えば、モリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール、酒石酸および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。

広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る。代表的な例としては、血小板因子４、硫酸プロタミン、硫酸化キチン誘導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎｃｒａｂ）の殻から調製される）（Ｍｕｒａｔａｅｔａｌ．、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５１：２２〜２６、１９９１）、硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ステロイド（例えば、エストロゲン）およびクエン酸タモキシフェンの存在によって、増強され得る）、スタウロスポリン、基質代謝のモジュレーター（例えば、プロリンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、α，α−ジピリジル，アミノプロピオニトリルフマレートを含む）、４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ヘパリン、インターフェロン、２マクログロブリン−血清、ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１〜１７３２６、１９９２）、キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎｅｔａｌ．、ＢｉｏｃｈｅｍＪ．２８６：４７５〜４８０、１９９２）、シクロデキストリンテトラデカサルフェート、エポネマイシン（Ｅｐｏｎｅｍｙｃｉｎ）、カンプトセシン、フマギリン（Ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎ）（Ｉｎｇｂｅｒｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５５−５５７、１９９０）、チオリンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」、ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０−１４４６、１９８７）、アンチコラゲナーゼ−血清、α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（４）：１６５９−１６６４、１９８７）、ビサントレン（Ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）（ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ロベンザリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃａｃｉｄ）二ナトリウム、すなわち「ＣＣＡ」、Ｔａｋｅｕｃｈｉｅｔａｌ．、ＡｇｅｎｔｓＡｃｔｉｏｎｓ３６：３１２−３１６、１９９２）、およびＢＢ９４等のメタロプロテイナーゼ阻害剤が含まれるがこれらに限定されない。

本発明の内容内で利用され得る追加の抗脈管形成因子には、サリドマイド（Ｃｅｌｇｅｎｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ）、血管拡張性ステロイド、ＡＧＭ−１４７０（Ｈ．ＢｒｅｍおよびＪ．ＦｏｌｋｍａｎＪＰｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２８：４４５−５１（１９９３））、インテグリンαｖβ３アンタゴニスト（Ｃ．Ｓｔｏｒｇａｒｄら．，ＪＣｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：４７−５４（１９９９））、カルボキシアミノイミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ）、カルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）（ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、ＣｏｎｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎＡ−４（ＣＡ４Ｐ）（ＯＸｉＧＥＮＥ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、Ｓｑｕａｌａｍｉｎｅ（ＭａｇａｉｎｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＰｌｙｍｏｕｔｈＭｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）、ＴＮＰ−４７０，（ＴａｐＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、ＺＤ−０１０１ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）、ＡＰＲＡ（ＣＴ２５８４）、Ｂｅｎｅｆｉｎ，Ｂｙｒｏｓｔａｔｉｎ−１（ＳＣ３３９５５５）、ＣＧＰ−４１２５１（ＰＫＣ４１２）、ＣＭ１０１、Ｄｅｘｒａｚｏｘａｎｅ（ＩＣＲＦ１８７）、ＤＭＸＡＡ、エンドスタチン、Ｆｌａｖｏｐｒｉｄｉｏｌ、Ｇｅｎｅｓｔｅｉｎ、ＧＴＥ、ＩｍｍＴｈｅｒ、Ｉｒｅｓｓａ（ＺＤ１８３９）、Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ（ソマトスタチン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ、Ｐｅｎａｃｉｌｌａｍｉｎｅ、Ｐｈｏｔｏｐｏｉｎｔ、ＰＩ−８８、Ｐｒｉｎｏｍａｓｔａｔ（ＡＧ−３３４０）Ｐｕｒｌｙｔｉｎ、Ｓｕｒａｄｉｓｔａ（ＦＣＥ２６６４４）、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）、Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ、テトラチオモリブデート、Ｘｅｌｏｄａ（Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、および５−フルオロウラシルが含まれる。

本発明の化合物と組み合わせて投与され得る抗脈管形成薬剤は、種々の機構を通じて作用することができ、これらの機構には、細胞外マトリックスのタンパク質分解の阻害、増殖因子のような脈管形成誘導因子の機能を拮抗することによる内皮細胞−細胞外マトリックス接着分子の機能のブロック、および増殖している内皮細胞において発現されるインテグリン受容体の阻害が含まれるがこれらに限定されない。細胞外マトリックスタンパク質分解を妨害し、かつ本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗脈管形成阻害剤の例として、ＡＧ−３３４０（Ａｇｏｕｒｏｎ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ＢＡＹ−１２−９５６６（Ｂａｙｅｒ，ＷｅｓｔＨａｖｅｎ，ＣＴ）、ＢＭＳ−２７５２９１（ＢｒｉｓｔｏｌＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、ＣＧＳ−２７０３２Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，ＥａｓｔＨａｎｏｖｅｒ，ＮＪ）、Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ（ＢｒｉｔｉｓｈＢｉｏｔｅｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）およびＭｅｔａｓｔａｔ（Ａｅｔｅｒｎａ，Ｓｔ−Ｆｏｙ，Ｑｕｅｂｅｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。内皮細胞−細胞外マトリックス接着分子の機能をブロックすることにより作用し、そして本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗脈管形成阻害剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＥＭＤ−１２１９７４（ＭｅｒｃｋＫｃｇａＡＤａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＶｉｔａｘｉｎ（Ｉｘｓｙｓ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。脈管形成誘導因子と直接拮抗するかまたはこの誘導因子を阻害することにより作用し、かつ本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗脈管形成薬剤の例として、Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）、抗ＶＥＧＦ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓ．ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ＰＴＫ−７８７／ＺＫ−２２５８４６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＳＵ−１０１（Ｓｕｇｅｎ，Ｓ．ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ＳＵ−５４１６（Ｓｕｇｅｎ／ＰｈａｒｍａｃｉａＵｐｊｏｈｎ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）、およびＳＵ−６６６８（Ｓｕｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗脈管形成薬剤は、脈管形成を間接的に阻害するように作用する。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る脈管形成の間接的阻害剤の例として、ＩＭ−８６２（Ｃｙｔｒａｎ，Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ）、インターフェロン−α、ＩＬ−１２（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）、およびペントサンポリスルフェート（ＧｅｏｒｇｅｔｏｗｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣが挙げられるがこれらに限定されない。

特定の実施形態において、抗脈管形成薬剤と併用した本発明の組成物の使用は、自己免疫疾患、例えば、本明細書中に記載の自己免疫疾患の治療、予防、および／または改善のために想定される。
特定の実施形態において、抗脈管形成薬剤と併用した本発明の組成物の使用は、関節炎の治療、予防、および／または改善のために想定される。さらに特定の実施形態において、抗脈管形成薬剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、慢性関節リウマチの治療、予防、および／または回復のために意図される。
別の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、脈管形成タンパク質または脈管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドと併用して投与される。本発明の組成物と共に投与され得る脈管形成タンパク質の例としては、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−３、上皮増殖因子αおよび表皮増殖因子β、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、ならびに一酸化窒素シンターゼが挙げられるがこれらに限定されない。

追加の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と併用して投与される。本発明の治療剤と共に投与され得る化学療法剤には、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、シクロホスファミドイホスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）、およびクロランブシル）、エチレンイミン類およびメチルメラミン類（例えば、ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート類（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア類（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、およびストレプトゾシン（ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ））、トリアゼン類（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド））、葉酸アナログ（例えば、メトトレキサート（アメトプテリン））、ピリミジンアナログ（例えば、フルオロウラシル（５−フルオロウラシル、５−ＦＵ）、フロクスウリジン（Ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）（フルオロデオキシウリジン、ＦｕｄＲ）、およびシタラビン（シトシンアラビノシド））、プリンアナログおよび関連阻害剤（例えば、メルカプトプリン（６−メルカプトプリン、６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン、ＴＧ）、およびペントスタチン（２´−デオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）））、ビンカアルカロイド類（例えば、ビンブラスチン（ＶＬＢ、硫酸ビンブラスチン））およびビンクリスチン（硫酸ビンクリスチン））、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ）、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、生物学的応答改変剤（例えば、インターフェロン−αおよびインターフェロン−α−２ｂ）、白金配位化合物（例えば、シスプラチン（シス−ＤＤＰ）およびカルボプラチン）、アントラセンジオン（ミトキサントロン）、置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、エストラジオール、およびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（テストステロンプロプリオネート（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）、およびフルオキシメステロン）、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド）、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ（例えば、ロイプロリド）、他のホルモンおよびホルモンアナログ（例えば、メチルテストステロン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、クロロトリアニセン、およびテストラクトン）、ならびに他（例えば、ジカルバジン、グルタミン酸、およびミトタン）が含まれるがこれらに限定されない。

一実施形態において、本発明の組成物は、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標）Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｉｎｃ．としても既知）、Ｔｒｏｃａｄｅ（Ｒａｏｃｈｅ，ＲＯ−３２−３５５５）、Ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ（ＨｏｅｃｈｓｔＭａｒｉｏｎＲｏｕｓｓｅｌ製のＡｒａｖａ（商標）としても既知）、Ｋｉｎｅｒｅｔ（商標）（Ａｍｇｅｎ、Ｉｎｃ．製のＡｎａｋｉｎｒａとしても既知である、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト）の薬物のうちの１つ以上と併用して投与され得る。
具体的な実施形態において、本発明の組成物は、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）と併用して投与されるか、ＣＨＯＰの組成物の１つ以上の成分と併用して投与される。一実施形態において、本発明の組成物は、抗ＣＤ−２０抗体（ヒトモノクローナル抗ＣＤ２０抗体）と併用して投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、抗ＣＤ２０抗体およびＣＨＯＰと併用して投与されるか、または抗ＣＤ２０抗体ならびにＣＨＯＰの１つ以上の成分（特定のシクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）の任意の組合せで投与される。具体的な実施形態において、本発明の組成物は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと併用して投与される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰと共に、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの１以上の成分（詳細には、シクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）の任意の組み合わせと共に投与される。具体的な実施形態において、本発明の組成物は、ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂと併用して投与される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂおよびＣＨＯＰと共に、またはｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂおよびＣＨＯＰの組成物の１つ以上の成分（詳細には、シクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）の任意の組合せと共に投与される。抗ＣＤ２０抗体は、必要に応じて、放射性同位体、毒素または細胞毒性薬物に結合し得る。

別の具体的な実施形態において、本発明の組成物は、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）と併用して投与される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）およびＣＨＯＰと共に、またはＺｅｖａｌｉｎ（商標）およびＣＨＯＰの成分、具体的には、シクロホスファミドおよび／またはプレドニゾンのうちの１つ以上の任意の組み合わせと共に投与される。Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）は、１以上の放射性同位体と結合し得る。特に好ましい同位体は、^９０Ｙおよび^１１１Ｉｎである。
追加の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、サイトカインと併用して投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得るサイトカインには、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αが含まれるがこれらに限定されない。別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびＩＬ−２１を含むが、これらに限定されない任意のインターロイキンと共に投与され得る。
一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＴＮＦ族のメンバーと組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得るＴＮＦ分子、ＴＮＦ関連分子またはＴＮＦ様分子には、可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても既知）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−β中に見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号第ＷＯ９６／１４３２８号）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号第ＷＯ９７／３３８９９号）、エンドカイン−α（国際公開番号第ＷＯ９８／０７８８０号）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン−α（国際公開番号第ＷＯ９８／１８９２１号）、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号第ＷＯ９６／３４０９５号）、ＤＲ３（国際公開番号第ＷＯ９７／３３９０４号）、ＤＲ４（国際公開番号第ＷＯ９８／３２８５６号）、ＴＲ５（国際公開番号第ＷＯ９８／３０６９３号）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号第ＷＯ９８／５６８９２号）、ＴＲ１０（国際公開番号第ＷＯ９８／５４２０２号）、３１２Ｃ２（国際公開番号第ＷＯ９８／０６８４２号）、およびＴＲ１２、ならびに可溶性形態のＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３が含まれるがこれらに限定されない。

追加の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、脈管形成タンパク質と併用して投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得る脈管形成タンパク質には、欧州特許第３９９８１６号に開示されるような神経膠腫誘導増殖因子（ＧｉｌｉｏｍａＤｅｒｉｖｅｄＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）（ＧＤＧＦ）、欧州特許第６８２１１０号に開示されるような血小板誘導増殖因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、欧州特許第２８２３１７号に開示されるような血小板誘導増殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）、国際公開番号第ＷＯ９２／０６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、Ｈａｕｓｅｒｅｔａｌ．、ＧｏｒｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるような胎盤増殖因子−２（ＰＩＧＦ−２）、国際公開番号第ＷＯ９０／１３６４９号に開示されるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、欧州特許第５０６４７７号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、国際公開番号第ＷＯ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖因子−２（ＶＥＧＦ−２）、血管内皮増殖因子−Ｂ（ＶＥＧＦ−３）、国際公開番号第ＷＯ９６／２６７３６号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）、国際公開番号第ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、国際公開番号第ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、およびドイツ国特許ＤＥ１９６３９６０１号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が含まれるがこれらに限定されない。上記の参考文献は、本明細書でその全体が参考として援用される
追加の実施形態において本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、線維芽細胞増殖因子と併用して投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得る線維芽細胞増殖因子には、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が含まれるがこれらに限定されない。

追加の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、造血増殖因子と併用して投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る造血増殖因子には、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）、ＬＥＵＫＩＮＥ（商標）、ＰＲＯＫＩＮＥ（商標））、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（フィルグラスチン（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（商標））、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１）エリトロポイエチン（エポエチンα、ＥＰＯＧＥＮ（商標）、ＰＲＯＣＲＩＴ（商標））、幹細胞因子（ＳＣＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド、スチール因子（ｓｔｅｅｌｆａｃｔｏｒ））、巨核球コロニー刺激因子、ＰＩＸＹ３２１（ＧＭＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質）、インターロイキン（特に、ＩＬ−１〜ＩＬ−１２のうちの任意の１つ以上）、インターフェロンγ、またはトロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）が含まれるがこれらに限定されない
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、アドレナリン作動遮断薬（例えば、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、カルテオロール、ラベタロール、メトプロロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、およびチモロールと併用して投与される。
別の実施形態において、別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗不整脈薬（例えば、アデノシン、アミドアロン（ａｍｉｄｏａｒｏｎｅ）、ブレチリウム、ジギタリス、ジゴキシン、ジギトキシン、ジリアゼン（ｄｉｌｉａｚｅｍ）、ジソピラミド、エスモロール、フレカイニド、リドカイン、メキシレチン、モリシジン（ｍｏｒｉｃｉｚｉｎｅ）、フェニトイン、プロカインアミド、Ｎ−アセチルプロカインアミド、プロパフェノン、プロプラノロール、キニジン、ソタロール、トカイニド、およびベラパミル）と併用して投与される。

別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、利尿薬（例えば、カルボニックアンヒドラーゼ−阻害剤（例えば、アセタゾラミド、ジクロルフェナミド、およびメタゾルアミド）、浸透圧性利尿薬（例えば、グリセリン、イソソルビド、マンニトール、および尿素）、Ｎａ^＋−Ｋ^＋−２Ｃｌ−シンポートを阻害する利尿薬（例えば、フロセミド、ブメタニド、アゾセミド、ピレタニド、トリパミド、エタクリン酸、ムゾリミン、およびトルセミド）、チアジドおよびチアジド様利尿薬（例えば、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリコルメチアジド（ｔｒｉｃｈｏｒｍｅｔｈｉａｚｉｄｅ）、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン、およびキネサゾン（ｑｕｉｎｅｔｈａｚｏｎｅ））、カリウム保持性利尿薬（例えば、アミロライドおよびトリアムテレン）、ならびに鉱質コルチコイド受容体アンタゴニスト（例えば、スピロノラクトン、カンレノン、およびカンレノ酸カリウム）と併用して投与される。

一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のための治療と併用して投与される。内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のための治療には、^１２７Ｉ、ヨウ素の放射性同位体（例えば、^１３１Ｉおよび^１２３Ｉ）、組み換え成長ホルモン（例えば、ＨＵＭＡＴＲＯＰＥ（商標）（組み換えソマトロピン）、成長ホルモンアナログ（例えば、ＰＲＯＴＲＯＰＩＮ（商標）（ソマトレム））、ドーパミンアゴニスト（例えば、ＰＡＲＬＯＤＥＬ（商標）（ブロモクリプチン）、ソマトスタチンアナログ（例えば、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（商標）（オクトレオチド）、ゴナドトロピン調製物（例えば、ＰＲＥＧＮＹＬ（商標）、Ａ．Ｐ．Ｌ．（商標）およびＰＲＯＦＡＳＩ（商標）（絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ））、ＰＥＲＧＯＮＡＬ（商標）（メノトロピン）、およびＭＥＴＲＯＤＩＮ（商標）（尿性卵胞性刺激ホルモン（ｕＦＳＨ））、合成ヒトゴナドトロピン放出ホルモン調製物（例えば、ＦＡＣＴＲＥＬ（商標）およびＬＵＴＲＥＰＵＬＳＥ（商標）（塩酸ゴナドレリン）、合成ゴナドトロピンアゴニスト（例えば、ＬＵＰＲＯＮ（商標）（酢酸ロイプロリド）、ＳＵＰＰＲＥＬＩＮ（商標）（酢酸ヒストレリン（ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ））、ＳＹＮＡＲＥＬ（商標）（酢酸ナファレリン）、およびＺＯＬＡＤＥＸ（商標）（酢酸ゴセレリン）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンの合成調製物（例えば，ＲＥＬＥＦＡＣＴＴＲＨ（商標）およびＴＨＹＰＩＮＯＮＥ（商標）（プロチレリン）、組み換えヒトＴＳＨ（例えば、ＴＨＹＲＯＧＥＮ（商標））、甲状腺ホルモンの天然異性体のナトリウム塩の合成調製物（例えば、Ｌ−Ｔ_４（商標）、ＳＹＮＴＨＲＯＩＤ（商標）およびＬＥＶＯＴＨＲＯＩＤ（商標）（レボチロキシンナトリウム）、Ｌ−Ｔ_３（商標）、ＣＹＴＯＭＥＬ（商標）およびＴＲＩＯＳＴＡＴ（商標）（リオチロインナトリウム（ｌｉｏｔｈｙｒｏｉｎｅｓｏｄｉｕｍ））、およびＴＨＹＲＯＬＡＲ（商標）（リオトリックス））、抗甲状腺化合物（例えば、６−ｎ−プロピルチオウラシル（プロピルチオウラシル）、１−メチル−２−メルカプトイミダゾールおよびＴＡＰＡＺＯＬＥ（商標）（メチマゾール）、ＮＥＯ−ＭＥＲＣＡＺＯＬＥ（商標）（カルビマゾール）、β−アドレナリン作動性レセプターアンタゴニスト（例えば、プロプラノロールおよびエスモロール）、Ｃａ^２＋チャネル遮断薬、デキサメタゾンおよびヨウ素化放射線造影剤（例えば、ＴＥＬＥＰＡＱＵＥ（商標）（ヨーパン酸（ｉｏｐａｎｏｉｃａｃｉｄ））およびＯＲＡＧＲＡＦＩＮ（商標）（イポダートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｉｐｏｄａｔｅ））が含まれるがこれらに限定されない。

内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のさらなる治療には、エストロゲンまたは結合型エストロゲン（例えば、ＥＳＴＲＡＣＥ（商標）（エストラジオール）、ＥＳＴＩＮＹＬ（商標）（エチニルエストラジオール）、ＰＲＥＭＡＲＩＮ（商標）、ＥＳＴＲＡＴＡＢ（商標）、ＯＲＴＨＯ−ＥＳＴ（商標）、ＯＧＥＮ（商標）およびエストロピペート（ｅｓｔｒｏｐｉｐａｔｅ）（エストロン）、ＥＳＴＲＯＶＩＳ（商標）（キネストロール）、ＥＳＴＲＡＤＥＲＭ（商標）（エストラジオール）、ＤＥＬＥＳＴＲＯＧＥＮ（商標）およびＶＡＬＥＲＧＥＮ（商標）（吉草酸エストラジオール）、ＤＥＰＯ−ＥＳＴＲＡＤＩＯＬＣＹＰＩＯＮＡＴＥ（商標）およびＥＳＴＲＯＪＥＣＴＬＡ（商標）（サイピオン酸（ｃｙｐｉｏｎａｔｅ）エストラジオール））、抗エストロゲン（例えば、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（商標）（タモキシフェン）、ＳＥＲＯＰＨＥＮＥ（商標）およびＣＬＯＭＩＤ（商標）（クロミフェン）、プロゲスチン（例えば、ＤＵＲＡＬＵＴＩＮ（商標）（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン）、ＭＰＡ（商標）およびＤＥＰＯ−ＰＲＯＶＥＲＡ（商標）（酢酸メドロキシプロゲステロン）、ＰＲＯＶＥＲＡ（商標）およびＣＹＣＲＩＮ（商標）（ＭＰＡ）、ＭＥＧＡＣＥ（商標）（酢酸メゲストロール）、ＮＯＲＬＵＴＩＮ（商標）（ノルエチンドロン）、ならびにＮＯＲＬＵＴＡＴＥ（商標）およびＡＹＧＥＳＴＩＮ（商標）（酢酸ノルエチンドロン））、プロゲステロンインプラント（例えば、ＮＯＲＰＬＡＮＴＳＹＳＴＥＭ（商標）（ノルゲストレルの皮下移植物））、抗黄体ホルモン（例えば、ＲＵ４８６（商標）（ミフェプリストン）、ホルモン性避妊薬（例えば、ＥＮＯＶＩＤ（商標）（ノルエチノドレル＋メストラノール）、ＰＲＯＧＥＳＴＡＳＥＲＴ（商標）（プロゲステロンを放出する子宮内デバイス）、ＬＯＥＳＴＲＩＮ（商標）、ＢＲＥＶＩＣＯＮ（商標）、ＭＯＤＩＣＯＮ（商標）、ＧＥＮＯＲＡ（商標）、ＮＥＬＯＮＡ（商標）、ＮＯＲＩＮＹＬ（商標）、ＯＶＡＣＯＮ−３５（商標）およびＯＶＡＣＯＮ−５０（商標）（エチニルエストラジオール／ノルエチンドロン）、ＬＥＶＬＥＮ（商標）、ＮＯＲＤＥＴＴＥ（商標）、ＴＲＩ−ＬＥＶＬＥＮ（商標）およびＴＲＩＰＨＡＳＩＬ−２１（商標）（エチニルエストラジオール／レボノルゲストレル（ｌｅｖｏｎｏｒｇｅｓｔｒｅｌ）ＬＯ／ＯＶＲＡＬ（商標）およびＯＶＲＡＬ（商標）（エチニルエストラジオール／ノルゲストレル）、ＤＥＭＵＬＥＮ（商標）（エチニルエストラジオール／二酢酸エチノジオール）、ＮＯＲＩＮＹＬ（商標）、ＯＲＴＨＯ−ＮＯＶＵＭ（商標）、ＮＯＲＥＴＨＩＮ（商標）、ＧＥＮＯＲＡ（商標）、およびＮＥＬＯＶＡ（商標）（ノルエチンドロン／メストラノール）、ＤＥＳＯＧＥＮ（商標）およびＯＲＴＨＯ−ＣＥＰＴ（商標）（エチニルエストラジオール／デスゲストレル）、ＯＲＴＨＯ−ＣＹＣＬＥＮ（商標）およびＯＲＴＨＯ−ＴＲＩＣＹＣＬＥＮ（商標）（エチニルエストラジオール／ノルゲスチメート（ｎｏｒｇｅｓｔｉｍａｔｅ））、ＭＩＣＲＯＮＯＲ（商標）およびＮＯＲ−ＱＤ（商標）（ノルエチンドロン）、ならびにＯＶＲＥＴＴＥ（商標）（ノルゲストレル））以下が挙げられるがこれらに限定されない。

内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のためのさらなる治療には、テストステロンエステル類（例えば、酢酸メテノロンおよびウンデカン酸テストステロン、非経口および経口アンドロゲン（例えば、ＴＥＳＴＯＪＥＣＴ−５０（商標）（テストステロン）、ＴＥＳＴＥＸ（商標）（プロピオン酸テストステロン）、ＤＥＬＡＴＥＳＴＲＹＬ（商標）（テストステロンエナンタート）、ＤＥＰＯ−ＴＥＳＴＯＳＴＥＲＯＮＥ（商標）（サイピオン酸テストステロン）、ＤＡＮＯＣＲＩＮＥ（商標）（ダナゾール）、ＨＡＬＯＴＥＳＴＩＮ（商標）（フルオキシメステロン）、ＯＲＥＴＯＮＭＥＴＨＹＬ（商標）、ＴＥＳＴＲＥＤＴＭおよびＶＩＲＩＬＯＮ（商標）（メチルテストステロン）、およびＯＸＡＮＤＲＩＮ（商標）（オキサンドロロン（ｏｘａｎｄｒｏｌｏｎｅ））、テストステロン経皮系（例えば、ＴＥＳＴＯＤＥＲＭ（商標））、アンドロゲンレセプターアンタゴニストおよび５−α−レダクターゼ阻害剤（例えば、ＡＮＤＲＯＣＵＲ（商標））（酢酸シプロテロン）、ＥＵＬＥＸＩＮ（商標）（フルタミド）、およびＰＲＯＳＣＡＲ（商標）（フィナステリド）、副腎皮質刺激ホルモン調製物（例えば、ＣＯＲＴＲＯＳＹＮ（商標）（コシントロピン）、副腎皮質ステロイドおよびその合成アナログ（例えば、ＡＣＬＯＶＡＴＥ（商標））（ジプロピオン酸アルクロメタゾン）、ＣＹＣＬＯＣＯＲＴ（商標）（アムシノニド）、ＢＥＣＬＯＶＥＮＴ（商標）およびＶＡＮＣＥＲＩＬ（商標）（ジプロピオン酸ベクロメタゾン）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥ（商標）（ベタメタゾン）、ＢＥＮＩＳＯＮＥ（商標）およびＵＴＩＣＯＲＴ（商標）（安息香酸ベタメタゾン）、ＤＩＰＲＯＳＯＮＥ（商標）（ジプロピオン酸ベタメタゾン）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥＰＨＯＳＰＨＡＴＥ（商標）（ベタメタゾンリン酸ナトリウム）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥＳＯＬＵＳＰＡＮ（商標）（ベタメタゾンリン酸ナトリウムおよび酢酸塩）、ＢＥＴＡ−ＶＡＬ（商標）およびＶＡＬＩＳＯＮＥ（商標）（吉草酸ベタメタゾン）、ＴＥＭＯＶＡＴＥ（商標）（プロピオン酸クロベタゾール）、ＣＬＯＤＥＲＭ（商標）（ピバル酸クロコルトロン）、ＣＯＲＴＥＦ（商標）およびＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥ（商標）（コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（酢酸コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＬＯＣＯＩＤ（商標）（酪酸コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥＰＨＯＳＰＨＡＴＥ（商標）（コルチゾール（ヒドロコルチゾン）リン酸ナトリウム）、Ａ−ＨＹＤＲＯＣＯＲＴ（商標）およびＳＯＬＵＣＯＲＴＥＦ（商標）（コルチゾール（ヒドロコルチゾン）コハク酸ナトリウム）、ＷＥＳＴＣＯＲＴ（商標）（吉草酸コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＣＯＲＴＩＳＯＮＥＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（酢酸コルチゾン）、ＤＥＳＯＷＥＮ（商標）およびＴＲＩＤＥＳＩＬＯＮ（商標）（デソニド）、ＴＯＰＩＣＯＲＴ（商標）（デスオキシメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮ（商標）（デキサメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮＬＡ（商標）（酢酸デキサメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮＰＨＯＳＰＨＡＴＥ（商標）およびＨＥＸＡＤＲＯＬＰＨＯＳＰＨＡＴＥ（商標）（デキサメタゾンリン酸ナトリウム、ＦＬＯＲＯＮＥ（商標）およびＭＡＸＩＦＬＯＲ（商標）（ジ酢酸ジフロラゾン）、ＦＬＯＲＩＮＥＦＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（酢酸フルドロコルチゾン）、ＡＥＲＯＢＩＤ（商標）およびＮＡＳＡＬＩＤＥ（商標）（フルニソリド）、ＦＬＵＯＮＩＤ（商標）およびＳＹＮＡＬＡＲ（商標）（フルオシノロンアセトニド）、ＬＩＤＥＸ（商標）（フルオシノニド）、ＦＬＵＯＲ−ＯＰ（商標）およびＦＭＬ（商標）（フルオロメトロン）、ＣＯＲＤＲＡＮ（商標）（フルランドレノリド）、ＨＡＬＯＧ（商標）（ハルシノニド）、ＨＭＳＬＩＺＵＩＦＩＬＭ（商標）（メドリゾン）、ＭＥＤＲＯＬ（商標）（メチルプレドニゾロン）、ＤＥＰＯ−ＭＥＤＲＯＬ（商標）およびＭＥＤＲＯＬＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（酢酸メチルプレドニゾン）、Ａ−ＭＥＴＨＡＰＲＥＤ（商標）およびＳＯＬＵＭＥＤＲＯＬ（商標）（メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム）、ＥＬＯＣＯＮ（商標）（モメタゾンフロエート（ｍｅｍｏｔａｓｏｎｅｆｕｒｏａｔｅ））、ＨＡＬＤＲＯＮＥ（商標）（酢酸パラメタゾン）、ＤＥＬＴＡ−ＣＯＲＴＥＦ（商標）（プレドニゾロン）、ＥＣＯＮＯＰＲＥＤ（商標）（酢酸プレドニゾロン）、ＨＹＤＥＬＴＲＡＳＯＬ（商標）（プレドニゾロンリン酸ナトリウム）、ＨＹＤＥＬＴＲＡ−Ｔ．Ｂ．Ａ（商標）（プレドニゾロンテブテート（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅｔｅｂｕｔａｔｅ））、ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標）（プレドニゾン）、ＡＲＩＳＴＯＣＯＲＴ（商標）およびＫＥＮＡＣＯＲＴ（商標）（トリアムシノロン（ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ））、ＫＥＮＡＬＯＧ（商標）（トリアムシノロンアセトニド）、ＡＲＩＳＴＯＣＯＲＴ（商標）およびＫＥＮＡＣＯＲＴＤＩＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（トリアムシノロンジアセテート）、ならびにＡＲＩＳＴＯＳＰＡＮ（商標）（トリアムシノロンヘキサアセトニド）、副腎皮質ステロイドの生合成および作用の阻害剤（例えば、ＣＹＴＡＤＲＥＮ（商標）（アミノグルテチミド）、ＮＩＺＯＲＡＬ（商標）（ケトコナゾール）、ＭＯＤＲＡＳＴＡＮＥ（商標）（トリロスタン）、およびＭＥＴＯＰＩＲＯＮＥ（商標）（メチラポン）、ウシ、ブタまたはヒトのインスリンまたはその混合物、インスリンアナログ、組み換えヒトインスリン（例えば、ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）およびＮＯＶＯＬＩＮ（商標））、経口血糖降下剤（例えば、ＯＲＡＭＩＤＥ（商標）およびＯＲＩＮＡＳＥ（商標）（トルブタミド）、ＤＩＡＢＩＮＥＳＥ（商標）（クロルプロパミド）、ＴＯＬＡＭＩＤＥ（商標）およびＴＯＬＩＮＡＳＥ（商標）（トラザミド）、ＤＹＭＥＬＯＲ（商標）（アセトヘキサミド）、グリベンクラミド、ＭＩＣＲＯＮＡＳＥ（商標）、ＤＩＢＥＴＡ（商標）およびＧＬＹＮＡＳＥ（商標）（グリブリド）、ＧＬＵＣＯＴＲＯＬ（商標）（グリピジド）、およびＤＩＡＭＩＣＲＯＮ（商標）（グリクラジド）、ＧＬＵＣＯＰＨＡＧＥ（商標）（メトホルミン）、シグリタゾン、ピオグリタゾン、およびα−グルコシダーゼ阻害剤、ウシまたはブタのグルカゴン、ソマトスタチン（例えば、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（商標）（オクトレオチド）、ならびにジアゾキシド（例えば、ＰＲＯＧＬＹＣＥＭ（商標）（ジアゾキシド））が含まれるがこれらに限定されない。

一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、子宮運動性障害のための治療と共に投与される。子宮運動性障害のための治療には、エストロゲン薬剤（例えば、結合型エストロゲン（例えば、ＰＲＥＭＡＲＩＮ（登録商標）およびＥＳＴＲＡＴＡＢ（登録商標））、エストラジオール（例えば、ＣＬＩＭＡＲＡ（登録商標）およびＡＬＯＲＡ（登録商標））、エストロピペート（ｅｓｔｒｏｐｉｐａｔｅ）、およびクロロトリアニセン）、プロゲスチン薬剤（例えば、ＡＭＥＮ（登録商標）（メドロキシプロゲステロン）、ＭＩＣＲＯＮＯＲ（登録商標）（酢酸ノルエチンドロン（ｎｏｒｅｔｈｉｄｒｏｎｅａｃｅｔａｔｅ））、ＰＲＯＭＥＴＲＩＵＭ（登録商標）プロゲステロン、および酢酸メゲストロール）、ならびにエストロゲン／プロゲステロンの組合せ治療剤（例えば、結合型エストロゲン／メドロキシプロゲステロン（例えば、ＰＲＥＭＰＲＯ（商標）およびＰＲＥＭＰＨＡＳＥ（登録商標））および酢酸ノルエチンドロン／エチニルエストラジオール（例えば、ＦＥＭＨＲＴ（商標））が含まれるがこれだけに限定されない。
追加の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、鉄欠乏症および低色素性貧血を処置する際に有効な薬物と併用して投与され、これらの薬物には、硫酸第一鉄（硫酸鉄、ＦＥＯＳＯＬ（商標））、フマル酸第一鉄（例えば、ＦＥＯＳＴＡＴ（商標））、グルコン酸第一鉄（例えば、ＦＥＲＧＯＮ（商標））、ポリサッカリド−鉄複合体（例えば、ＮＩＦＥＲＥＸ（商標））、鉄デキストラン注射剤（例えば、ＩＮＦＥＤ（商標））、硫酸第二銅、ピロキシジン、リボフラビン、ビタミンＢ１２、シアノコバラミン注射剤（例えば、ＲＥＤＩＳＯＬ（商標）、ＲＵＢＲＡＭＩＮＰＣ（商標））、ヒドロキソコバラミン、葉酸（例えば、ＦＯＬＶＩＴＥ（商標））、ロイコボリン（ホリニン酸、５−ＣＨＯＨ４ＰｔｅＧｌｕ、シトロボラム因子）またはＷＥＬＬＣＯＶＯＲＩＮ（ロイコボリンのカルシウム塩）、トランスフェリンまたはフェリチンが含まれるがこれだけに限定されない。

特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、精神医学的障害を治療するために使用される薬剤と併用して投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る精神医学的薬物には、抗精神病薬（例えば、クロルプロマジン、クロルプロチキセン、クロザピン、フルフェナジン、ハロペリドール、ロキサピン、メソリダジン、モリンドン、オランザピン、ペルフェナジン、ピモジド、クエチアピン、リスペリドン、チオリダジン、チオチキセン、トリフルオペラジン、およびトリフルプロマジン）、抗躁薬（例えば、カルバマゼピン、ジバルプロックスナトリウム（ｄｉｖａｌｐｒｏｅｘｓｏｄｉｕｍ）、炭酸リチウム、およびクエン酸リチウム）、抗うつ薬（例えば、アミトリプチリン、アモキサピン、ブプロピオン（ｂｕｐｒｏｐｉｏｎ（アムフェブタモン））、シタロプラム、クロミプラミン、デシプラミン、ドキセピン、フルボキサミン、フルオキセチン、イミプラミン、イソカルボキサジド、マプロチリン、ミルタザピン、ネファゾドン、ノルトリプチリン、パロキセチン、フェネルジン、プロトリプチリン、セルトラリン、トラニルシプロミン、トラゾドン、トリミプラミン、およびベンラファキシン）、抗不安薬（例えば、アルプラゾラム、ブスピロン、クロルジアゼポキシド、クロラゼペート、ジアゼパム、ハラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、およびプラゼパム）、ならびに興奮薬（例えば、ｄ−アンフェタミン、メチルフェニデート、およびペモリン）が含まれるがこれらに限定されない。

他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、神経学的障害を治療するために使用される薬剤と併用して投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る神経学的薬剤には、鎮痙薬（例えば、カルバマゼピン、クロナゼパム、エトスクシミド、フェノバルビタール、フェニトイン、プリミドン、バルプロ酸、ジバルプロックスナトリウム、フェルバメート、ガバペンチン、ラモトリジン、レベチラセタム、オクスカルバゼピン、チアガビン（ｔｉａｇａｂｉｎｅ）、トピラマート、ゾニサミド、ジアゼパム、ロラゼパム、およびクロナゼパム）、抗振せん麻痺薬（例えば、レボドパ／カルビドパ、セレジリン、アマンチジン（ａｍａｎｔｉｄｉｎｅ）、ブロモクリプチン、ペルゴリド、ロピニロール、プラミペキソール、ベンズトロピン、ビペリデン、エトプロパジン、プロシクリジン、トリヘキシフェニジル、トルカポン（ｔｏｌｃａｐｏｎｅ））、およびＡＬＳ治療薬（例えば、リルゾール（ｒｉｌｕｚｏｌｅ））が含まれるがこれらに限定されない。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、血管拡張剤および／またはカルシウムチャネル遮断薬と併用して投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る血管拡張剤には、アンギオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、パパベリン、イソクスプリン、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、エナラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、トランドラプリル、およびニリドリン）ならびに硝酸塩（例えば、イソソルビドジニトレート、イソソルビジドモノニトレート、およびニトログリセリン）が含まれるがこれらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと併用して投与され得るカルシウムチャネルブロッキング薬剤の例としては、アムロジピン、ベプリジル、フェロジピン、フルナリジン、イスラジピン、ニカルジピン、ニモジピン、およびベラパミルが含まれるがこれらに限定されない。

特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、胃腸障害に対する治療と併用して投与される。本発明のアルブミン癒合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る胃腸障害の処置剤としては、Ｈ２ヒスタミンレセプターアンタゴニスト（例えば、ＴＡＧＡＭＥＴ（商標）（シメチジン）、ＺＡＮＴＡＣ（商標）（ラニチジン）、ＰＥＰＣＩＤ（商標）（ファモチジン）、およびＡＸＩＤ（商標）（ニザチジン））、Ｈ^＋、Ｋ^＋ＡＴＰａｓｅ（例えば、ＰＲＥＶＡＣＩＤ（商標））およびＰＲＩＬＯＳＥＣ（商標）（オメプラゾール））、ビスマス化合物（例えば、ＰＥＰＴＯ−ＢＩＳＭＯＬ（商標）（ビスマスサブサリシレート）およびＤＥ−ＮＯＬ（商標）（ビスマスサブシトレート））、種々の制酸剤、スクラルフェート、プロスタグランジンアナログ（例えば、ＣＹＴＯＴＥＣ（商標）（ミソプロストール））、ムスカリンコリンアンタゴニスト、緩下剤（例えば、表面緩下剤、刺激緩下剤、生理食塩水および浸透性緩下剤）、抗下痢剤（例えば、ＬＯＭＯＴＩＬ（商標）（ジフェノキシレート）、ＭＯＴＯＦＥＮ（商標）（ジフェノキシン）、およびＩＭＯＤＩＵＭ（商標）（ロペルアミド塩化水素））、ソマトスタチンの合成アナログ（例えば、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（商標）（オクトレオチド）、抗嘔吐剤（例えば、ＺＯＦＲＡＮ（商標）（オンダンセトロン）、ＫＹＴＲＩＬ（商標）（グラニセトロン塩化水素）、トロピセトロン、ドラセトロン、メトクロプラミド、クロロプロマジン、ペルフェナジン、プロクロペラジン、プロメタジン、チエチルペラジン、トリフルプロマジン、ドンペリドン、ハロペリドール、ドロペリドール、トリメトベンザミド、デキサメサゾン、メチルプレドニソロン、ドロナビノール、およびナビロン）、Ｄ２アンタゴニスト（メトクロプラミド、トリメトベンザミドおよびクロロプロマジン）、胆汁塩、ケノデオキシコリン酸、ウルソデオキシコリン酸、および膵臓酵素調製物（例えば、膵臓および膵臓リパーゼ）が含まれるが、これらに限定されない。

追加の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、他の治療レジメンまたは予防レジメン、例えば、放射線治療と併用して投与される。

また、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質を含む医薬組成物の成分のうちの１つ以上で充填される、１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。任意により、薬学的製品および生物学的製品の製造、使用または販売を制御する政府機関に指示された形態の注意書きがこのような容器に付随可能であり、この注意書きは、ヒト投与物の製造、使用または販売の機関による承認を反映する。

遺伝子療法

本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする構築物は、遺伝子療法プロトコルの一部として使用されて、アルブミン融合タンパク質の治療的有効投与量を送達することができる。細胞への核酸の体内導入に対する例示的なアプローチは、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸を含む、ウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターによる細胞の感染には、標的細胞の大部が核酸を受けることができるという利点がある。加えて、例えば、ウイルスベクターに含まれるｃＤＮＡによって、ウイルスベクター内でコードされる分子は、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞中で効率的に発現される。
レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターは、体内でアルブミン融合タンパク質をコードする外因性核酸分子の輸送のための組み換え遺伝子送達系として、使用することができる。これらのベクターは、細胞内への核酸の有効な送達を提供し、輸送された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡに安定して組み込まれる。複製欠損性レトロウイルスのみを産生する特殊細胞株（「パッケージ細胞」と称される）の開発は、遺伝子療法に対するレトロウイルスの有用性を増大しており、欠陥レトロウイルスは、遺伝子療法の目的で遺伝子輸送で使用するために特徴付けられる（論評について、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ７６：２７１を参照）。複製欠損性レトロウイルスは、標準技術によって、ヘルパーウイルスの使用を通して、標的細胞を感染させるために使用することができる、ビリオンの中に詰めることができる。組み換えレトロウイルスを産生するため、および生体内または生体外で、このようなウイルスで細胞を感染させるためのプロトコルは、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．、（ｅｄｓ．）ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ９．１０−９．１４、および他の標準的な実験室マニュアルにある。

本発明で有用な、別のウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来ベクターを使用する。アデノウイルスのゲノムは、目的の遺伝子産物をコードおよび発現するが、正常な溶解性ウイルスのライフサイクルにおいて複製する能力に関しては非活性化されるように、操作することができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒｅｔａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６（１９８８）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１−４３４（１９９１）、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ６８：１４３−１５５（１９９２）を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄ１３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）に由来する適切なアデノウイルスベクターは、当業者に既知である。組み換えアデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができないという点で特定の環境で有利となり得て、上皮細胞を含む、多種多様な細胞型に感染させるために使用することができる（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄｅｔａｌ．、（１９９２）、上記参照）。その上、ウイルス粒子は比較的安定で、かつ精製および濃縮に適しており、上記のように、感染性のスペクトラムに影響するよう修正することができる。加えて、アデノウイルスＤＮＡ（およびそれに含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに組み込まれないが、エピソーム性のままであり、それにより、ＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）に組み込まれる状況において挿入突然変異の結果として発生し得る、潜在的問題を回避する。さらに、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノムの保有能力は、他の遺伝子送達ベクターと比べて大きい（最大８キロベース）（Ｂｅｒｋｎｅｒｅｔａｌ．、上記参照、Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄｅｔａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７（１９８６））。
別の実施形態において、本発明の非ウイルス遺伝子送達系は、標的細胞による、被験ヌクレオチド分子の取り込みのためのエンドサイトーシス経路に依存する。この種類の例示的な遺伝子送達系は、リポソーム由来系、ポリリジン共役、および人工ウイルスエンベロープを含む。代表的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子は、表面上に正電荷を保有し、かつ（任意で）標的組織の細胞表面抗原に対して抗体でタグ付けられる、リポソーム（例えば、リポフェクチン）中にトラップすることができる（Ｍｉｚｕｎｏｅｔａｌ．、（１９９２）ＮｏＳｈｉｎｋｅｉＧｅｋａ２０：５４７−５５１、ＰＣＴ公報Ｗ０９１／０６３０９、日本特許出願１０４７３８１、および欧州特許公報−第Ａ−４３０７５号）。

本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子送達系は、多数の方法のいずれかによって、患者に導入することができる。例えば、遺伝子送達系の薬学的調製物は、例えば、静脈注入によって、全身に導入することができ、標的細胞中のタンパク質の特異的形質導入は、受容体遺伝子の発現を制御する転写制御配列またはそれらの組み合わせにより、遺伝子送達賦形剤、細胞型発現または組織型発現によって提供される、形質導入の特異性から主に発生する。他の実施形態において、組み換え遺伝子の初期送達は、確実に局在する動物に導入することによって、さらに限定される。例えば、遺伝子送達賦形剤は、カテーテル（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）または定位注入（例えば、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．、（１９９４）ＰＮＡＳ９１：３０５４−３０５７）によって導入することができる。遺伝子療法構築物の薬学的調製物は、許容可能な希釈剤中の遺伝子送達系から本質的に成ることができるか、または遺伝子送達賦形剤が埋め込まれた持続放出基質を備えることができる。アルブミン融合タンパク質を、組み換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから、無傷で産生することができる場合、薬学的調製物は、アルブミン融合タンパク質を産生する１つ以上の細胞を備えることができる。
付加的な遺伝子治療法
同様に本発明に包含されるは、障害、疾患、および状態を処置または予防するための遺伝子治療方法である。遺伝子治療法は、本発明のアルブミン融合タンパク質の発現を達成する、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の動物への導入に関する。この方法は、標的組織による融合タンパク質の発現のために必要なプロモータおよび任意の他の遺伝要素に動作可能に連結された、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを必要とする。そのような遺伝子治療および送達技術は当該分野において既知であり、例えば、参照することにより本願に組み込まれる、第ＷＯ９０／１１０９２号を参照されたい。

したがって、例えば、患者由来の細胞は、生体外で本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーターを備えるポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて操作されてもよく、次いで、操作された細胞は、本発明の融合タンパク質で処置される患者に提供される。そのような方法は、当該分野で周知である。例えば、参照することにより本願に組み込まれる、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８５：２０７−２１６（１９９３）、Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，ｅｔａｌ．、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５３：１１０７−１１１２（１９９３）、Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１５３：４６０４−４６１５（１９９４）、Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ｅｔａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６０：２２１−２２９（１９９５）、Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ｅｔａｌ．、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５０：５１０２−５１０６（１９９０）、Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ｅｔａｌ．、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ７：１−１０（１９９６）、Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ、Ｌ．ｅｔａｌ．、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４：１２４６−１２５５（１９９７）、およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ｅｔａｌ．、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：３１−３８（１９９６））を参照されたい。一実施形態において、操作される細胞は、動脈細胞である。動脈細胞は、動脈、動脈の周囲の組織への直接注射を通して、またはカテーテル注入を通して、患者に再導入され得る。
下記でより詳細に論じられるように、ポリヌクレオチド構築物は、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓等）の間質腔への注射等の、動物の細胞に注射可能な物質を送達する任意の方法によって送達することができる。ポリヌクレオチド構築物は、薬学的に許容可能な液体または水性担体中で送達され得る。

一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドとして送達される。「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、またはＲＮＡという用語は、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈殿剤等を含む、細胞への進入を補助、促進、または容易にするように作用する、いずれの送達賦形剤も含まない配列を指す。しかしながら、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、当業者に周知の方法によって調製することができるリポソーム処方物およびリポフェクチン処方物等で送達することができる。そのような方法は、例えば、参照することにより本願に組み込まれる、米国特許第５，５９３，９７２号、第５，５８９，４６６号、および第５，５８０，８５９号に記載されている。
遺伝子治療法で使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、宿主ゲノムに組み込まれない、または複製を可能にする配列を含まない、構築物であり得る。適切なベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ、Ｐｈａｒｍａｃｉａより入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２を含む。他の適切なベクターが、当業者に容易に明白となるであろう。
当業者に既知の任意の強力なプロモーターは、ポリヌクレオチド配列の発現を駆動するために使用することができる。適切なプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーター等のアデノウイルスプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター等の異種プロモーター、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、アルブミンプロモーター、ＡｐｏＡＩプロモーター、ヒトグロビンプロモーター、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター等のウイルスチミジンキナーゼプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、ｂ−アクチンプロモーター、およびヒト成長ホルモンプロモーターを含む。プロモーターはまた、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する遺伝子に対する天然プロモーターであり得る。

他の遺伝子療法技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、細胞中でのポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列を細胞に導入して、最大で６ヶ月までの期間にわたって、所望のポリペプチドの産生を提供できることが示されている。
ポリヌクレオチド構築物は、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を含む、動物の体内の組織の間質腔に送達することができる。組織の間質腔は、器官組織の細網線維間の、細胞間液体ムコ多糖類基質、血管または室の壁中の弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維、または結合組織鞘性筋肉細胞内または骨の裂孔中の同じ基質を備える。これは、同様に、循環の血漿およびリンパ管流路のリンパ液によって占拠される空間である。下記で論じられる理由で、筋肉組織の間質腔への送達が行われ得る。それらは、これらの細胞を備える組織への注射によって、好都合に送達され得る。それらは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、かつその中で発現され得るが、送達および発現は、例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞等の、非分化細胞または不完全分化細胞において達成され得る。体内の筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込んで発現する能力において、特に適格である。
裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲となる。実施形態において、投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、別の実施形態では、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇとなる。もちろん、当業者であれば十分理解するように、この投与量は、注射の組織部位に従って変化する。核酸配列の適切かつ有効な投与量は、当業者によって容易に決定することができ、処置されている状態および投与経路に依存し得る。
実施形態において、投与経路は、組織の間質腔への非経口注射経路による。しかしながら、特に、肺または気管支組織、咽喉、または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入等の、他の非経口経路もまた、使用することができる。また、該手順で使用されるカテーテルによって、血管形成術中に、裸のＤＮＡ構築物を動脈に送達することができる。

裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接針注射、静脈注射、局所投与、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない、当該分野で既知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該分野で既知である。
構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、沈殿剤等の送達賦形剤で送達することができる。そのような送達の方法は、当該分野で既知である。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、リポソーム調製物中で複合体形成される。本発明で使用するためのリポソーム調製物は、カチオン性（正の電荷を持つ）、アニオン性（負の電荷を持つ）、および中性の調製物を含む。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で強固な荷電複合体が形成され得るため、カチオン性リポソームを使用することができる。カチオン性リポソームは、機能的形態で、プラスミドＤＮＡ（参照することにより本願に組み込まれる、Ｆｅｌｇｎｅｒｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６）、ｍＲＮＡ（参照することにより本願に組み込まれる、Ｍａｌｏｎｅｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１）、および精製転写因子（参照することにより本願に組み込まれる、Ｄｅｂｓｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。

カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ］プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、特に有用であり、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎという商標のもとで、ＧＩＢＣＯＢＲＬ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．（例えば、参照することにより本願に組み込まれる、Ｆｅｌｇｎｅｒｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６も参照）より入手可能である。他の市販のリポソームには、トランスフェクテース（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が含まれる。

当該分野で周知の技術を使用して、容易に入手可能な物質から他のカチオン性リポソームを調製することができる。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述については、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ９０／１１０９２号（参照することにより本願に組み込まれる）を参照されたい。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献で説明されており、例えば、参照することにより本願に組み込まれるＰ．Ｆｅｌｇｎｅｒｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３−７４１７を参照されたい。他のカチオン性脂質物質からリポソームを調製するために、同様の方法を使用することができる。
同様に、アニオン性および中性リポソームは、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａ．）等から容易に入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して、容易に調製することができる。そのような物質はとりわけ、ホスファチジル、コリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。これらの物質はまた、適切な割合で、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰ出発物質と混合することもできる。これらの物質を使用してリポソームを作製するための方法は、当該分野で周知である。

例えば、商業的に、コレステロールの添加の有無に関わらず、従来のリポソームを作製するために、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を様々な組み合わせで使用することができる。したがって、例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、各５０ｍｇのＤＯＰＧおよびＤＯＰＣを乾燥させることによって、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製することができる。サンプルを一晩真空ポンプ下に置き、翌日、脱イオン水で水和する。次いで、１５℃で浴を循環させている間に、最大設定にて、逆位カップ（浴槽型）プローブを装備したＨｅａｔＳｙｓｔｅｍｓモデル３５０超音波処理器を使用して、栓をしたバイアル中でサンプルを２時間超音波処理する。あるいは、超音波処理なしで負の電荷を持つ小胞を調製して、多重膜小胞を生成するか、または核孔膜を通した押し出しによって、個別の大きさの単膜小胞を産生することができる。他の方法が、当業者に既知であり、かつ利用可能である。
リポソームは、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小型単膜小胞（ＳＵＶ）、または大型単膜小胞（ＬＵＶ）を備えることができ、ＳＵＶが特定の実施形態である。当該分野で周知の方法を使用して、様々なリポソーム・核酸複合体が調製される。例えば、参照することにより本願に組み込まれる、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒｅｔａｌ．、ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）、１０１：５１２−５２７を参照されたい。例えば、核酸を含むＭＬＶは、ガラスチューブの壁にリン脂質の薄膜を堆積させ、その後、カプセル化される物質の溶液で水和することによって調製することができる。ＳＵＶは、ＭＬＶの長時間超音波処理によって調製され、単膜リポソームの均質集団を産生する。封入される物質を、前もって作られたＭＬＶの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソームを使用する時、乾燥脂質膜を、滅菌水または１０ｍＭのトリス／ＮａＣｌ等の等張性緩衝溶液等の、適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し、次いで、前もって作られたリポソームをＤＮＡと直接混合する。カチオン性ＤＮＡへの正電荷を持つリポソームの結合のため、リポソームおよびＤＮＡは、非常に安定した複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメントによる用途を見出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多数の方法によって調製される。一般的に使用される方法は、Ｃａ^２＋−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３、Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ１７：７７（１９７９））、エーテル注入（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．ａｎｄＢａｎｇｈａｍ、Ａ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ４４３：６２９（１９７６）、Ｏｓｔｒｏｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６（１９７７）、Ｆｒａｌｅｙｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：３３４８（１９７９））、界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ、Ｈ．ａｎｄＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：１４５（１９７９））、および逆相蒸着（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０４３１（１９８０）、Ｓｚｏｋａ、Ｆ．ａｎｄＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：１４５（１９７８）、Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２１５：１６６（１９８２））を含み、これらは参照することにより本願に組み込まれる。

概して、ＤＮＡのリポソームに対する比は約１０：１から約１：１０となる。一実施形態において、比は、約５：１から約１：５となる。別の実施形態において、比は、約３：１から約１：３となる。なおも別の実施形態において、比は、約１：１となる。
米国特許第５，６７６，９５４号（参照することにより本願に組み込まれる）は、カチオン性リポソームキャリアと複合体を形成した遺伝物質のマウスへの注入について報告している。米国特許第４，８９７，３５５号、第４，９４６，７８７号、第５，０４９，３８６号、第５，４５９，１２７号、第５，５８９，４６６号、第５，６９３，６２２号、第５，５８０，８５９号、第５，７０３，０５５号、および国際公報第ＷＯ９４／９４６９号（参照することにより本願に組み込まれる）は、ＤＮＡを細胞および哺乳類にトランスフェクトする際に使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、第５，６９３，６２２号、第５，５８０，８５９号、第５，７０３，０５５号、および国際公報第ＷＯ９４／９４６９号は、哺乳類にＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を送達するための方法を提供する。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする配列を備えるＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用して、体外または体内で、細胞を操作する。レトロウイルスプラスミドベクターが由来し得る、レトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスを含むが、これらに限定されない。

パッケージング細胞株を形質導入して産生細胞株を形成するために、レトロウイルスプラスミドベクターを採用する。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例は、その全体が参照することにより本願に組み込まれる、Ｍｉｌｌｅｒ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１：５−１４（１９９０）に記載のような、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株を含むが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野で既知の任意の手段により、パッケージング細胞を形質導入し得る。そのような手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ_４沈殿を含むが、これらに限定されない。一代替法において、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソームにカプセル化され、または脂質に結合され、次いで宿主に投与することができる。
産生細胞株は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。次いで、体外または体内のどちらかで、真核細胞を形質導入するために、そのようなレトロウイルスベクター粒子を採用することができる。形質導入真核細胞は、本発明の融合タンパク質を発現する。

特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドを用いて、体外または体内で、細胞を操作する。アデノウイルスは、それが本発明の融合タンパク質をコードおよび発現し、同時に通常の溶菌性ウイルスライフサイクルにおいて複製するその能力に関して不活性化されるように、操作され得る。アデノウイルス発現は、ウイルスＤＮＡの宿主細胞染色体への組み込みなしで達成され、それにより、挿入突然変異についての懸念を軽減する。さらに、アデノウイルスは、長年、優れた安全性プロフィールを伴って、腸内生ワクチンとして使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｔａｌ．、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１０９：２３３−２３８（１９７４））。最終的に、アデノウイルス媒介性遺伝子導入は、コトンラットの肺へのα−１−アンチトリプシンおよびＣＦＴＲの導入を含む、多くの事例で実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ｅｔａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１−４３４、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄｅｔａｌ．、（１９９２）Ｃｅｌｌ６８：１４３−１５５）。その上、ヒト癌における病因物質としてアデノウイルスを確立しようとする広範囲な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．、（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：６６０６）。
本発明で有用な、適切なアデノウイルスベクターは、例えば、参照することにより本願に組み込まれる、ＫｏｚａｒｓｋｙａｎｄＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．３：４９９−５０３（１９９３）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ６８：１４３−１５５（１９９２）、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔ．Ｔｈｅｒ．４：７５９−７６９（１９９３）、Ｙａｎｇｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．７：３６２−３６９（１９９４）、Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６５：６９１−６９２（１９９３）、および米国特許第５，６５２，２２４号に記載されている。例えば、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、ヒト２９３細胞中で増殖させることができる。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、構成的にＥｌａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失される遺伝子の産物を提供することによって欠陥アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加えて、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もまた、本発明で有用である。

一実施形態において、本発明で使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である。複製欠損性アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルスおよび／またはパッケージング細胞株の補助を必要とする。得られたウイルスは、細胞に感染することが可能であり、かつプロモーターに動作可能に連結された目的のポリヌクレオチドを発現することができるが、ほとんどの細胞中で複製することができない。複製欠損性アデノウイルスは、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａ、またはＬ１〜Ｌ５の遺伝子の全てまたは一部のうちの１つ以上において欠失し得る。

特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、生体外または生体内で、細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を産生するためにヘルパーウイルスを必要とする、自然発生の欠陥ウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７（１９９２））。それはまた、非分裂細胞の中にそのＤＮＡを組み込んでもよい、数少ないウイルスのうちの１つである。わずか３００塩基対ほどのＡＡＶを含むベクターをまとめることができるが、組み込み得るが、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。そのようなＡＡＶを産生および使用するための方法は、当該分野で既知である。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号、第５，１７３，４１４号、第５，３５４，６７８号、第５，４３６，１４６号、第５，４７４，９３５号、第５，４７８，７４５号、および第５，５８９，３７７号を参照されたい。
例えば、本発明で使用するための適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列全てを含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ（１９８９）にあるもの等の、標準的クローニング方法を使用して、ＡＡＶベクターにポリヌクレオチド構築物を挿入する。次いで、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿等を含む、任意の標準的技術を使用して、ヘルパーウイルスに感染しているパッケージング細胞に、組み換えＡＡＶベクターをトランスフェクトする。適切なヘルパーウイルスは、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、またはヘルペスウイルスを含む。一旦パッケージング細胞がトランスフェクトおよび感染されると、それらはポリヌクレオチド構築物を含む感染性ＡＡＶウイルス粒子を産生する。次いで、体外または体内のいずれかで、真核細胞を形質導入するために、これらのウイルス粒子を使用する。形質導入細胞は、そのゲノムに組み込まれるポリヌクレオチド構築物を含み、かつ本発明の融合タンパク質を発現する。

遺伝子療法の別の方法は、相同的組み換え（例えば、参照することにより本願に組み込まれる、米国特許第５，６４１，６７０号、１９９７年６月２４日発行、国際公報第ＷＯ９６／２９４１１号、１９９６年９月２６日公開、国際公報第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４日公開、、Ｋｏｌｌｅｒｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８９３２−８９３５（１９８９）、およびＺｉｊｌｓｔｒａｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照）を介して、異種制御領域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のポリペプチドをコードする）を動作可能に関連付けるステップを伴う。この方法は、標的細胞中に存在しているが、通常は細胞中で発現されない、または所望よりも低いレベルで発現される、遺伝子の活性化を伴う。
当該分野で既知の標準的技術を使用して、プロモーターに隣接した標的配列とともにプロモーターを含む、ポリヌクレオチド構築物を作製する。適切なプロモーターを本明細書に記載する。標的化配列は、プロモーター−標的化配列と内在性配列との相同的組み換えを可能にするのに十分、内在性配列を補完している。標的化配列は、所望の内在性ポリヌクレオチド配列の５´末端の十分近くにあるため、相同的組み換えに際して、プロモーターは、内在性配列に動作可能に連結される。

プロモーターおよび標的配列は、ＰＣＲを使用して増幅することができる。一実施形態において、増幅プロモーターは、５´および３´末端上に異なる制限酵素部位を含む。別の実施形態において、第１の標的配列の３´末端は、増幅プロモーターの５´末端と同じ制限酵素部位を含み、第２の標的配列の５´末端は、増幅プロモーターの３´末端と同じ制限部位を含む。増幅プロモーターおよび標的配列を消化し、共に連結する。
裸のポリヌクレオチドとして、または上記でさらに詳細に記載されるリポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、沈殿剤等の、トランスフェクション促進剤と併用してのいずれかで、プロモーター−標的配列構築物は、細胞に送達される。直接針注射、静脈注射、局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法によって、Ｐプロモーター−標的配列を送達することができる。方法を、下記でさらに詳細に記載する。
プロモーター−標的配列構築物は、細胞によって取り込まれる。構築物と内在性配列との間に相同的組み換えが起こるため、内在性配列は、プロモーターの制御下に置かれる。次いで、プロモーターは、内在性配列の発現を駆動する。
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、タンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含んでもよい。典型的に、シグナル配列は、コード領域の５´末端に向かって、またはそこで発現される、ポリヌクレオチドのコード領域に位置付けられる。シグナル配列は、目的のポリヌクレオチドと同種または異種であってもよく、かつトランスフェクトされる細胞と同種または異種であり得る。加えて、シグナル配列は、当該分野で既知の方法を使用して化学合成され得る。

投与形態が、治療効果を提供するのに十分な量で、１つ以上の分子の発現をもたらす限り、上記のポリヌクレオチド構築物のうちのいずれかの任意の投与形態を使用することができる。これは、直接針注射、全身注射、カテーテル注入、バイオリスティック注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲルフォームスポンジデポ、他の市販デポ物質、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口または坐薬固形（錠剤または丸剤）医薬処方物、および手術中のデカンティングまたは局所適用を含む。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓への裸のリン酸カルシウム沈降プラスミド、または門脈へのタンパク質被覆プラスミドの直接注射は、ラット肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現をもたらしている（Ｋａｎｅｄａｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：３７５（１９８９））。
実施形態において、局所投与の方法は、直接注射による。別の実施形態において、送達賦形剤と複合体を形成した本発明のアルブミン融合タンパク質は、直接注射によって動脈領域内に、または局所的に投与される。動脈領域内で局所的な組成物の投与とは、動脈内の数センチメートル、ある実施形態では数ミリメートルで、組成物を注射することを指す。
局所投与の別の方法は、本発明のポリヌクレオチド構築物を、外科的創傷の中または周囲に接触させることである。例えば、患者は手術を受けることができ、ポリヌクレオチド構築物を創傷の内側の組織の表面上で被覆することができ、または構築物を創傷の内側の組織の領域に注入することができる。

全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的送達賦形剤と複合体を形成した本発明の融合タンパク質を含む。全身投与で使用するために適切な送達賦形剤は、特定部位に賦形剤を標的化するためのリガンドを備えるリポソームを備える。具体的な実施形態において、全身投与で使用するための適切な送達賦形剤は、特定の部位に賦形剤を標的化するための本発明のアルブミン融合タンパク質を備えるリポソームを備える。
実施形態において、全身投与の方法は、静脈注射、エアロゾル、経口および経皮（局所的）送達を含む。静脈注射は、当該分野で標準的な方法を使用して行うことができる。エアロゾル送達もまた、当該分野で標準的な方法を使用して行うことができる（例えば、参照することにより本願に組み込まれる、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１８９：１１２７７−１１２８１，１９９２を参照）。経口送達は、動物の腸内の消化酵素による分解に耐えることが可能なキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物を複合体形成することによって、行うことができる。そのようなキャリアの例は、当該分野で既知であるもの等の、プラスチックカプセルまたは錠剤を含む。局所的送達は、皮膚内へ通過することが可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌクレオチド構築物を混合することによって、行うことができる。

送達される物質の有効量の決定は、例えば、物質の化学構造および生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびその重症度、および投与経路を含む、多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、１用量あたりの投与されるポリヌクレオチド構築物の量、ならびに被験体の健康および既往歴等の、多数の因子に依存する。正確な量、投薬回数、および投薬のタイミングは、主治医または獣医によって決定される。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、任意の動物、例えば、哺乳動物および鳥類に投与することができる。例示的な哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタを含み、特定の実施形態ではヒトである。
生物学的活性

本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の生物学的活性を試験するアッセイで使用することができる。アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドが、特定のアッセイにおいて活性を示す場合、融合タンパク質に対応する治療用タンパク質は、生物学的活性に関連する疾患に関与する可能性が高い。したがって、関連疾患を処置するために、融合タンパク質が使用され得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、表１の「適応症Ｙ」列に列挙される疾患および障害を処置する方法を包含し、そのような処置、予防、または改善が望まれる患者において、疾患または障害を治療、予防、または改善する有効量で、表１の「治療用タンパク質Ｘ」列（表１の「適応症Ｙ」列に列挙される、処置されるべき疾患または障害と同じ行）で開示される治療用タンパク質に対応する治療用タンパク質部分を備える、本発明のアルブミン融合タンパク質を投与するステップを含む。
さらなる実施形態において、本発明は、表１の「適応症：Ｙ」列に特定の治療用タンパク質について列挙される疾患または障害を処置する方法を包含し、そのような治療、予防、または改善が望ましい患者において、疾患または障害を治療、予防、または改善する有効量で実施例において適応症が関連する、治療用タンパク質に対応する、治療用タンパク質部分を備える、本発明のアルブミン融合タンパク質を投与するステップを含む。

配列番号Ｙをコードするポリヌクレオチドによってコードされると、細胞によってアルブミン融合タンパク質が産生されることが、本発明によって具体的に検討される。細胞由来のコードされたタンパク質を発現するために、これらのポリヌクレオチドが使用される時に、細胞の天然分泌および処理ステップは、表２の列４および／または１１に明示的に列挙されるシグナル配列を欠くタンパク質を産生する。列挙されたシグナル配列の特定のアミノ酸配列は、本明細書に示されるか、または当該分野で周知である。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、細胞によって産生されるアルブミン融合タンパク質（表２の列４および／または１１に示される、リーダー配列を欠く）を含む。また、他の実施形態において、ポリオペプチドは、表２の列４および／または１１に列挙される特定のリーダー配列なしで、配列番号Ｙを備える。医薬組成物を含む、これら２つの実施形態を備える組成物（薬学的組成物を含む）もまた、提供され得る。これらのアルブミン融合タンパク質は、表１の「適応症：Ｙ」列で特定の治療用タンパク質について列挙される疾患または障害を処置、予防、または改善することが、具体的に検討される。
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、内分泌系の疾患および障害（例えば、下記の「内分泌障害」節を参照）、神経系の疾患および障害（例えば、下記の「神経疾患」節を参照）、免疫系の疾患および障害（例えば、下記の「免疫活性」節を参照）、呼吸器系の疾患および障害（例えば、下記の「呼吸器障害」節を参照）、心臓血管系の疾患および障害（例えば、下記の「心臓血管障害」節を参照）、生殖器系の疾患および障害（例えば、下記の「生殖系障害」節を参照）、消化器系の疾患および障害（例えば、下記の「胃腸障害」節を参照）、細胞増殖に関する疾患および／または障害（例えば、下記の「過剰増殖性障害」節を参照）、および／または血液に関する疾患および／または障害（例えば、下記の「血液関連障害」節を参照）に関する、疾患および／または障害の診断、予測、予防、および／または治療で使用することができる。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する遺伝子が発現される組織に関連する、疾患および／または障害を診断および／または予測するために、使用することができる。

したがって、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコード化するポリヌクレオチドは、ホルモン活性化、神経伝達物質活性、細胞シグナル伝達、細胞増殖、細胞分化、および細胞移動を含むが、これらに限定されない、活性に関連する疾患および／または障害の診断、検出、および／または治療に有用である。
さらに一般的には、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、次のような体系に関連する疾患および／または障害の診断、予測、予防、および／または治療に有用であり得る。
免疫活性位

本発明のアルブミン融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、免疫細胞の増殖、分化もしくは動員（走化性）を活性化または阻害することによって、免疫系の疾患、障害および／または状態を治療、予防、診断、および／または予測するのに有用であり得る。免疫細胞は、造血と呼ばれる過程を通して発生し、多能性幹細胞から骨髄性細胞（血小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）およびリンパ系細胞（ＢおよびＴリンパ球）を産生する。これらの免疫疾患、障害、および／または状態の病因は、遺伝的、癌およびいくつかの自己免疫性障害等の身体的、後天的（例えば、化学療法または毒素による）、または感染性であり得る。さらに、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の免疫系疾患または障害のマーカーまたは検出物質として使用することができる。
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫系の疾患および障害を治療するために、および／または、本発明のポリペプチドが発現される組織に関連する細胞によって生成される免疫応答を阻害または増大させるために、使用することができる。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、先天性および後天性免疫不全症の両方を含む、免疫不全症を治療、予防、診断、および／または予測するのに有用であり得る。免疫グロブリンレベル、Ｂ細胞機能、および／またはＢ細胞数が減少される、Ｂ細胞免疫不全症の例は、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ブルートン病）、Ｘ連鎖小児性無ガンマグロブリン血症、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫不全症、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫不全症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、先天性および後天性無ガンマグロブリン血症を含む無ガンマグロブリン血症、成人発症型無ガンマグロブリン血症、遅発型無ガンマグロブリン血症、ガンマグロブリン異常症、低ガンマグロブリン血症、不特定低ガンマグロブリン血症、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型）、選択的ＩｇＭ欠損症、選択的ＩｇＡ欠損症、選択的ＩｇＧサブクラス欠損症、ＩｇＧサブクラス欠損症（ＩｇＡ欠損症を伴う、または伴わない）、ＩｇＭの増加を伴うＩｇ欠損症、ＩｇＭの増加を伴うＩｇＧおよびＩｇＡ欠損症、正常または上昇Ｉｇを伴う抗体欠損症、Ｉｇ重鎖欠乏、κ鎖欠損症、Ｂ細胞リンパ球増殖障害（ＢＬＰＤ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩ）（後天性）、および一過性乳児低ガンマグロブリン血症を含む。
具体的な実施形態において、毛細血管拡張性運動失調症または毛細血管拡張性運動失調に関連する状態は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、治療、予防、診断、および／または予測される。

Ｔ細胞および／またはＢ細胞の機能および／または数が減少される、先天性免疫不全症の例は、ディジョージ異常、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）（Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、常染色体劣性ＳＣＩＤ、アデノシンデアミナーゼ欠損症、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）欠損症、クラスＩＩＭＨＣ欠損症（不全リンパ球症候群）、ウィスコット・アルドリッチ症候群、および毛細血管拡張性運動失調症を含むが、これらに限定されない）、胸腺形成不全症、３次および４次咽頭嚢症候群、２２ｑ１１．２欠損、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ナチュラルキラー細胞欠損症（ＮＫ）、特発性ＣＤ４＋Ｔリンパ球減少症、優性Ｔ細胞欠損（不特定）を伴う免疫不全症、および細胞媒介免疫の不特定免疫不全症を含むが、これらに限定されない。
具体的な実施形態において、ディジョージ異常またはディジョージ異常に関連する状態は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、治療、予防、診断、および／または予測される。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、治療、予防、診断、および／または予測することができる、他の免疫不全症は、慢性肉芽腫症、チェディアック・東症候群、ミエロペルオキシダーゼ欠損症、リンパ球グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、リンパ球接着欠損症、補体成分欠損症（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、および／またはＣ９欠損症を含む）、細網異形成症、胸腺リンパ形成不全症、胸腺腫を伴う免疫不全症、重度先天性白血球減少症、免疫不全症を伴う形成異常、新生児好中球減少症、短肢小人症、およびＩｇによる免疫不全症を共存するネゼロフ症候群を含むが、これらに限定されない。

実施形態において、免疫不全症および／または上記の免疫不全症に関連する状態は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、治療、予防、診断、および／または予測される。
実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫不全個体間で免疫応答性を高める薬剤として使用され得る。具体的な実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞免疫不全個体間で免疫応答性を高める薬剤として使用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、自己免疫障害を治療、予防、診断、および／または予測するのに有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞による、外来物質としての自己の不適切な認識に起因する。この不適切な認識は、宿主組織の破壊につながる免疫応答をもたらす。したがって、免疫応答、特に、Ｔ細胞の増殖、分化または走化性を阻害することができる、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与は、自己免疫障害を予防するのに有効な治療法であり得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療、予防、診断、および／または予測することができる、自己免疫疾患または障害は、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺病、自己免疫溶血性貧血、溶血性貧血、血小板減少症、自己免疫血小板減少症紫斑病、自己免疫新生児血小板減少症、特発性血小板減少症紫斑病、紫斑病（例えばヘノッホ・シェーンライン紫斑病）、自己免疫性血球減少症、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、グレイヴズ病（甲状腺機能亢進症）、およびインスリン耐性糖尿病のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで治療、予防、および／または診断することができる、自己免疫成分を有する可能性がある、さらなる障害は、ＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、神経炎、ブドウ膜炎眼炎、多発性内分泌腺症、ライター病、全身硬直症候群、自己免疫肺炎症、自閉症、ギラン・バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症性眼障害を含むが、これらに限定されない。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで治療、予防、診断、および／または予測することができる、自己免疫成分を有する可能性がある、さらなる障害は、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（例えば、核小体および他の核抗体によってしばしば特徴付けられる）、混合結合組織病（例えば、可溶性核抗原（例えば、リボ核タンパク質）に対する抗体によってしばしば特徴付けられる）、多発性筋炎（例えば、非ヒストンＡＮＡによってしばしば特徴付けられる）、悪性貧血（例えば、抗壁細胞、ミクロソーム、および内因子抗体によってしばしば特徴付けられる）、特発性アジソン病（例えば、体液性および細胞媒介性の副腎細胞傷害性によってしばしば特徴付けられる）、不妊症（例えば、抗精子抗体によってしばしば特徴付けられる）、糸球体腎炎（例えば、糸球体基底膜抗体または免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、水疱性類天疱瘡（例えば、基底膜中のＩｇＧおよび補体によってしばしば特徴付けられる）、シューグレン症候群（例えば、多組織抗体および／または特異的非ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）によってしばしば特徴付けられる）、糖尿病（例えば、細胞媒介性および体液性島細胞抗体によってしばしば特徴付けられる）、およびアドレナリン作動薬耐性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作動薬耐性を含む）（例えば、β−アドレナリン作動性受容体抗体によってしばしば特徴付けられる）を含むが、これらに限定されない。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで治療、予防、診断、および／または予測することができる、自己免疫成分を有し得る、さらなる障害は、慢性活動性肝炎（例えば、平滑筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、原発性胆汁性肝硬変（例えば、ミトコンドリア抗体によってしばしば特徴付けられる）、他の内分泌腺不全（例えば、場合によっては特異的組織抗体によってしばしば特徴付けられる）、白斑（例えば、メラノサイト抗体によってしばしば特徴付けられる）、脈管炎（例えば、血管壁中のＩｇおよび補体、および／または低血清補体によってしばしば特徴付けられる）、ＭＩ後（例えば、心筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、心臓切開症候群（例えば、心筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、じんましん（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、アトピー性皮膚炎（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、喘息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、ならびに多くの他の炎症性、肉芽腫性、変性、および萎縮性障害を含むが、これらに限定されない。

実施形態において、自己免疫疾患および障害、および／または上記疾患および障害に関連する状態は、例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、治療、予防、診断、および／または予測される。具体的な実施形態において、リウマチ性関節炎は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、治療、予防、および／または診断される。
別の具体的な実施形態において、全身性エリテマトーデスは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、治療、予防、および／または診断される。別の具体的な実施形態において、特発性血小板減少性紫斑病は、発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、治療、予防、および／または診断される。
別の具体的な実施形態において、ＩｇＡ腎症は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、治療、予防、および／または診断される。
実施形態において、自己免疫疾患および障害、および／または上記の疾患および障害と関連する状態は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、治療、予防、診断、および／または予測される。
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫抑制剤として使用される。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、造血細胞の疾患、障害、および／または状態を治療、予防、予測、および／または診断するのに有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球減少症、好中球減少症、貧血、および血小板減少症を含むがこれらに限定されない、特定の（または多くの）種類の造血細胞の減少に関連する疾患、障害、および／または状態を治療または予防する目的で、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させるために使用され得る。あるいは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、組織球増殖症を含むがそれに限定されない、特定の（または多くの）種類の造血細胞の減少に関連する疾患、障害、および／または状態を治療または予防する目的で、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させるために使用され得る。
喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸障害等のアレルギー反応および状態はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、治療、予防、診断、および／または予測することができる。さらに、これらの分子は、アナフィラキシー、抗原性分子に対する過敏性、または血液型不適合を治療、予防、予測、および／または診断するために使用することができる。

加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＩｇＥ媒介アレルギー反応を治療、予防、診断、および／または予測するために使用することができる。そのようなアレルギー反応は、喘息、鼻炎および湿疹を含むが、これらに限定されない。具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、体外または体内でＩｇＥ濃度を調節するために使用することができる。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症状態の診断、予測、予防、および／または治療に使用される。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症応答に関与する細胞の活性化、増殖、および／または分化を阻害することができるため、慢性および急性炎症状態を予防および／または治療するためにこれらの分子を使用することができる。そのような炎症状態は、例えば、感染に関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症反応症候群）、虚血再かん流傷害、内毒素致死、補体媒介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘発性肺傷害、炎症性腸疾患、クローン病、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰産生、呼吸器障害（例えば、喘息およびアレルギー）、胃腸障害（例えば、炎症性腸疾患）、癌（例えば、胃癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、肝臓癌、および乳癌）、ＣＮＳ障害（例えば、多発性硬化症、虚血性脳損傷、および／または脳卒中、外傷性脳損傷、神経変性性障害（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）、ＡＩＤＳ関連認知症、およびプリオン病、心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、心筋炎、心血管疾患、および心肺バイパス合併症）、ならびに炎症によって特徴付けられる多くのさらなる疾患、状態、および障害（例えば、肝炎、リウマチ性関節炎、痛風、外傷、膵炎、サルコイドーシス、皮膚炎、腎虚血再かん流傷害、グレイヴズ病、全身性エリテマトーデス、糖尿病、および同種移植片拒絶反応）を含むが、これらに限定されない。

炎症は基礎的な防御機構であるため、炎症性疾患は、本質的に体の任意の組織に影響を及ぼし得る。したがって、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、副腎炎、肺胞炎、胆管胆嚢炎、虫垂炎、亀頭炎、眼瞼炎、気管支炎、滑液胞炎、心臓炎、蜂巣炎、子宮管炎、胆嚢炎、声帯炎、蝸牛炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、皮膚炎、憩室炎、脳炎、心内膜炎、食道炎、耳管炎、結合組織炎、毛嚢炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、内耳炎、喉頭炎、リンパ管炎、乳腺炎、中耳炎、髄膜炎、子宮炎、粘膜炎、心筋炎、筋炎、鼓膜炎、腎炎、神経炎、精巣炎、骨軟骨炎、耳炎、心膜炎、腱周囲炎、腹膜炎、咽頭炎、静脈炎、灰白髄炎、前立腺炎、歯髄炎、網膜炎、鼻炎、卵管炎、強膜炎、強膜脈絡膜炎、陰嚢炎、副鼻腔炎、脊椎炎、脂肪組織炎、口内炎、滑膜炎、耳管炎、腱炎、扁桃炎、尿道炎、および膣炎を含むがこれらに限定されない、組織特異的炎症性疾患の治療で使用される。
具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、臓器移植拒絶反応および移植片対宿主病を診断、予測、予防、および／または治療することに有用である。臓器拒絶反応は、免疫応答を通した移植組織の宿主免疫細胞破壊によって起こる。同様に、免疫反応はまた、ＧＶＨＤにも関与するが、この場合、外来の移植免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫応答、特にＴ細胞の活性化、増殖、分化、または走化性を阻害する、本発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレオチド、および／またはそれらのアゴニストあるいはアンタゴニストは、臓器拒絶反応またはＧＶＨＤを予防するのに有効な治療法であり得る。具体的な実施形態において、免疫応答、特にＴ細胞の活性化、増殖、分化、または走化性を阻害する、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、実験的アレルギーおよび超急性異種移植拒絶反応を予防するのに有効な治療法であり得る。

他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血清病、後連鎖球菌性糸球体腎炎、結節性多発動脈炎、および免疫複合誘導性脈管炎を含むが、これらに限定されない、免疫複合疾患を診断、予測、予防、および／または治療することに有用である。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、感染性因子を処置する、検出する、および／または予防するために使用することができる。例えば、免疫応答を増大する、特にＢおよび／またはＴ細胞の増殖、活性化、および／または分化を増大することによって、感染性疾患を、治療、検出、および／または予防することができる。免疫応答は、既存の免疫応答を増大するか、または新しい免疫応答を惹起するかのいずれかによって、増大することができる。あるいは、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、必ずしも免疫応答を誘出することなく、感染性因子（感染性因子を列挙する用途の節を参照）を直接阻害することができる。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗原に対する免疫応答性を増大するワクチンアジュバントとして使用される。具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍特異的な免疫応答を増大するアジュバントとして使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗ウイルス免疫応答を増大するアジュバントとして使用される。アジュバントとして本発明の組成物を使用して増大され得る、抗ウイルス免疫応答は、ウイルスおよび本明細書に記載される、あるいは当該分野で既知のウイルス関連疾患または症状を含む。具体的な実施形態において、本発明の組成物は、ＡＩＤＳ、髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）から成る群より選択される、ウイルス、疾患、または症状に対する免疫応答を増大するアジュバントとして使用される。別の具体的な実施形態において、本発明の組成物は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、呼吸器合胞体ウイルス、デング熱、ロタウイルス、日本脳炎、インフルエンザＡおよびＢ、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス、狂犬病、フニン、チクングンヤ熱、リフトバレー熱、単純疱疹、および黄熱病から成る群より選択される、ウイルス、疾患、または症状に対する免疫応答を増大するアジュバントとして使用される。

別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗細菌または抗真菌免疫応答を増大するアジュバントとして使用される。アジュバントとして本発明の組成物を使用して増大され得る、抗細菌または抗真菌免疫応答は、細菌または真菌、および本明細書に記載される、あるいは当該分野で既知の疾患または症状に関連する細菌または真菌を含む。具体的な実施形態において、本発明の組成物は、破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒症、およびＢ型髄膜炎からなる群より選択される、細菌または真菌、疾患、または症状に対する免疫応答を増大するアジュバントとして使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明の組成物は、ハンセン箘、チフス箘、パラチフス菌、髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、赤痢菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管出血性大腸菌、およびライム病菌から成る群より選択される、群細菌または真菌、疾患、または症状に対する免疫応答を増大するアジュバントとして使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗寄生生物免疫応答を増大するアジュバントとして使用される。アジュバントとして本発明の組成物を使用して増大され得る、抗寄生生物免疫応答は、寄生生物、および本明細書に記載される、あるいは当該分野で既知の疾患または症状に関連する寄生生物を含む。具体的な実施形態において、寄生生物に対する免疫応答を増大するアジュバントとして使用される。別の具体的な実施形態において、本発明の組成物は、熱マラリア（マラリア）またはリーシュマニア属に対する免疫応答を増大するアジュバントとして使用される。

別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、単核性食細胞の動員および活性化を防ぐことによって、珪胚症、サイコイドーシス、および特発性肺線維症を含む感染疾患を治療するために採用することができる。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに対する免疫介在応答を阻害または増大する抗体の生成に対する抗原として使用される。

一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒト、具体的な実施形態においてはヒト）に投与されて、免疫系を高め、１つ以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）の量の増大を生じ、高い親和性の抗体産生および免疫グロブリンクラス転換（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）を誘導し、および／または免疫応答を増大する。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、病原体に対するＢ細胞応答性の刺激物質として使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞の活性剤として使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫抑制療法を受ける前の、個体の免疫状態を高める薬剤として使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、より高い親和性抗体を誘導する薬剤として使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血清免疫グロブリン濃度を増加する薬剤として使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫不全の個体の回復を加速する薬剤として使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、高齢の集団および新生児の間で免疫応答性を高める薬剤として使用される。

別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、骨髄移植および／または他の移植（例えば、同種異系または異種臓器移植）の前、間、または後の免疫系エンハンサーとして使用される。移植に関して、本発明の組成物は、移植の前、同時、および／または後に投与することができる。具体的な実施形態において、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回復の開始前に投与される。別の具体的な実施形態において、本発明の組成物は、まず、移植の後、Ｔ細胞集団の回復の開始後であるが、Ｂ細胞集団の完全な回復の前に投与される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ細胞機能の後天的欠損を有する個体間で免疫応答性を高めるための薬剤として使用される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することによって寛解または処置することができる、Ｂ細胞機能の後天的欠損を生じる状態は、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄移植、およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含むが、これらに限定されない。

別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、一時的な免疫不全を有する個体間で免疫応答性を高める薬剤として使用される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することによって寛解または処置することができる、一時的な免疫不全を生じる状態は、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）からの回復、栄養失調に関連する状態、感染性単核細胞症からの回復、またはストレスに関連する状態、麻疹からの回復、輸血からの回復、および手術からの回復を含むが、これらに限定されない。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単球、樹状細胞、および／またはＢ細胞による抗原提示の調節因子として使用される。一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、体外または体内で抗原提示を増強するか、または抗原提示に拮抗する。さらに、関連する実施形態において、この抗原提示の増強または拮抗作用は、抗腫瘍治療として、または免疫系を調節するために有用であり得る。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、個体の免疫系を、ＴＨ１細胞性応答とは反対に、体液性応答（すなわち、ＴＨ２）の発生に向かって指向する薬剤として使用される。

別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍増殖を誘導し、したがって、腫瘍を抗腫瘍性薬剤に対してより感受性にするための手段として使用される。例えば、多発性骨髄腫は、緩慢な細胞分裂の疾患であり、したがって、本質的に全ての抗腫瘍性レジメンに対して不応性である。これらの細胞をより急速に強制的に増殖させた場合、感受性プロフィールがおそらく変化するであろう。
別の具体的実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＡＩＤＳ、慢性リンパ球障害および／または分類不能型免疫不全症等の病状におけるＢ細胞産生の刺激因子として使用される。

別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、手術、外傷、または遺伝的欠陥後のリンパ組織の生成および／または再生のための療法として使用される。別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、移植前の骨髄サンプルの前処理で使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＳＣＩＤ患者の間で観察されるような免疫不全症／免疫欠損を生じる遺伝性障害のための遺伝子ベースの療法として使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、リーシュマニア属等の、単球に影響を及ぼす寄生生物疾患に対して防御するために単球／マクロファージを活性化する手段として使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドによって誘出される分泌サイトカインを制御する手段として使用される。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、獣医学的医療に適用され得るような、本明細書に記載の用途のうちの１つ以上で使用される。

別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外来因子または自己に対する様々な態様の免疫応答を遮断する手段として使用される。具体的な態様の免疫応答の遮断が望ましい場合がある、疾患または状態の例は、狼瘡および関節炎等の自己免疫障害、ならびに皮膚アレルギー、炎症、腸疾患、損傷、および病原体に関する疾患／障害に対する免疫応答性を含む。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、および多発性硬化症等の、自己免疫疾患に関連するＢ細胞増殖およびＩｇ分泌を防ぐための療法として使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニスト、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内皮細胞におけるＢおよび／またはＴ細胞の遊走の阻害剤として使用される。この活性は、組織構造または同属の応答を阻害し、そして例えば、免疫応答の阻害および敗血症の遮断において有用である。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ヴァルデンストレーム疾患、関連する特発性単クローン性高ガンマグロブリン血症、および形質細胞腫のような疾患において顕著な慢性高ガンマグロブリン血症のための療法として使用される。

別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、具体的な自己免疫疾患および慢性炎症疾患および感染性疾患における、マクロファージおよびそれらの前駆体、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリンパ球およびいくつかのＴ細胞サブセット、例えば、活性化Ｔ細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞ならびにナチュラルキラー細胞の、ポリペプチド走化性および活性化を阻害するために採用され得る。自己免疫疾患の例は、本明細書中に記載され、その自己免疫疾患の例としては、多発性硬化症およびインスリン依存性糖尿病を含む。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、好酸球の産生および遊走を防ぐことによって、特発性好酸球増多症候群を治療するために採用され得る。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、相補的介在細胞溶解を増大する、または阻害するために使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗体依存性細胞性細胞毒性を増大する、または阻害するために使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、動脈壁における単球浸潤を防ぐことによって、アテローム性動脈硬化症を治療するために採用され得る。

別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）を治療するために採用され得る。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、創傷および組織の修復の刺激、新脈管形成の刺激、および／または血管またはリンパの疾患または障害の修復の刺激において有用であり得る。加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、粘膜表面の再生を刺激するために使用することができる。

具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、原発性または後天性の免疫不全、欠損性の血清免疫グロブリン産生、再発性の感染および／または免疫系機能不全によって特徴付けられる障害を診断、予測、治療および／または予防するために使用される。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、関節、骨、皮膚および／または耳下腺の感染、血液由来の感染（例えば、敗血症、髄膜炎、敗血症性関節炎および／または骨髄炎）、自己免疫疾患（例えば、本明細書中に開示されるような自己免疫疾患）、炎症性障害、および悪性疾患、ならびに／あるいはこれらの感染、疾患および／または悪性疾患に関連する任意の疾患または障害または状態（ＣＶＩＤ、他の原発性免疫不全、ＨＩＶ疾患、ＣＬＬ、再発性気管支炎、静脈洞炎、中耳炎、結膜炎、肺炎、肝炎、髄膜炎、帯状ヘルペス（例えば、重篤な帯状ヘルペス）および／またはニューモシスティスを含むが、これらに限定されない）を治療または予防するために使用され得る。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって予防、診断、予測、および／または治療され得る他の疾患および傷害として、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、リンパ球減少、食細胞殺細菌機能不全、血小板減少、およびヘモグロビン尿症が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、分類不能型免疫不全疾患（ＣｏｍｍｏｎＶａｒｉａｂｌｅＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＤｉｓｅａｓｅ）（「ＣＶＩＤ」、「後天性無ガンマグロブリン血症」および「後天性低ガンマグロブリン血症」としても既知である）またはこの疾患のサブセットを有する個体を、治療および／または診断するために使用される。

具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫細胞あるいは、免疫組織関連癌または新生物を含む癌または新生物の診断、予測、予防および／または治療に使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、予防、診断または治療され得る癌または新生物の例として、以下に挙げられるが、これらに限定されない。急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、プラスマ細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ変換性（ＥＢＶ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）疾患、および／または本明細書中の他の箇所で「過剰増殖障害」と題される節に記載される疾患および障害。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ラージＢ細胞リンパ腫の細胞増殖を減少するための療法として使用される。
別の具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、慢性骨髄性白血病に関連するＢ細胞およびＩｇの関与を減少する手段として使用される。
具体的な実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞免疫不全個体（例えば、部分的または完全な脾臓摘出術を受けた個体など）の間で免疫応答性を促進させるための因子として使用される。
血液関連障害

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、止血性活性（出血を止めること）または血栓崩壊活性（血餅形成）を調節し得る。例えば、止血活性または血栓崩壊活性を増大させることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用し、血液凝固の疾患、障害および／または状態（例えば、無線維素原血症、因子欠損症、血友病）、血液血小板の疾患、障害および／または状態（例えば、血小板減少症）、あるいは外傷、手術または他の原因から生じる創傷を治療または予防し得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得る本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用し、凝血を阻害または溶解し得る。心臓発作（梗塞）、発作（ｓｔｒｏｋｅ）または瘢痕の治療または予防において、これらの分子は重要であり得る。
具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、血栓塞栓症、肺塞栓症、アテローム硬化症、心筋梗塞、一過性脳虚血発作、不安定狭心症の予防、診断、予測および／または治療に使用され得る。具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、伏在静脈移植片の閉塞の予防のため血管形成術の手順に伴い得るような処置をした周囲で起きる血栓症（ｐｅｒｉｐｒｏｃｅｄｕｒａｌｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）の危険性を減らすために、非リウマチ性心房細動を含む心房細動を有する患者における発作の危険性を減らすために、人工心臓弁および／または増帽弁疾患に関連した塞栓症の危険性を減らすために、使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのための他の使用としては、体外装置（例えば、脈管内カニューレ、血液透析の患者における脈管アクセスシャント、血液透析機、および心肺バイパス機）における閉塞の予防が挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドが発現している組織に関連する血液および／または血液形成器官の疾患および障害の予防、診断、予測および／または治療に使用され得る。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、造血活性（血球の形成）を調節に使用され得る。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、全ての、またはサブセットの血球（例えば、赤血球、リンパ球（Ｂ細胞またはＴ細胞）、脊髄細胞（例えば、好塩基球、好酸球、好中球、肥満細胞、マクロファージ）および血小板など）の量を増大するのに使用される。血球の量、または血球のサブセットの量を減少する能力は、以下に記載される貧血および白血球減少症の予防、検出、診断および／または治療に有用であり得る。あるいは、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、全ての、またはサブセットの血球（例えば、赤血球、リンパ球（Ｂ細胞またはＴ細胞）、脊髄細胞（例えば好塩基球、好酸球、好中球、肥満細胞、マクロファージ）および血小板）の量を減らすのに使用され得る。血球の量、または血球のサブセットの量を減少する能力は、白血球増加症（例えば、好酸球増加症など）の予防、検出、診断および／または治療に有用であり得る。

本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血液悪液質を予防、治療、または診断するために使用され得る。
貧血は、赤血球の数またはその中のヘモグロビン（酸素を運ぶタンパク質）の量が正常を下回る、状態である。貧血は、過度の出血、減少した赤血球生成、または増加した赤血球細胞破壊（溶血）によって引き起こされ得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、貧血を治療、予防、および／または診断する際に有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより治療、予防または診断され得る貧血としては、鉄欠乏性貧血、血色素減少症、小球性貧血、萎黄病、遺伝性鉄芽球性貧血、特発性後天性鉄芽球性貧血、赤血球形成不全症、巨赤芽球性貧血（例えば、悪性貧血、（ビタミンＢ１２欠乏）および葉酸欠乏性貧血）、再生不良性貧血、溶血性貧血（例えば、自己免疫溶血性貧血、細血管異常性溶血性貧血、および発作性夜間血色素尿症）が、挙げられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、疾患に関連する貧血を治療、予防、および／または診断する際に有用であり得、この疾患に関連する貧血としては、全身性エリテマトーデスに関連する貧血、ガンに関連する貧血、リンパ腫に関連する貧血、慢性腎疾患に関連する貧血、および腫脹した脾臓に関連する貧血が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、薬物治療から生じる貧血を治療、予防および／または診断する際に有用であり得、そのような貧血は、例えば、メチルドパに関連する貧血、ダプソンに関連する貧血、および／またはサルファ剤に関連する貧血である。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、異常な赤血球構造に関連する貧血を治療、予防、および／または診断する際に有用であり得、このような貧血としては、遺伝性球状赤血球、遺伝性楕円赤血球症、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損、および鎌状赤血球貧血が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヘモグロビン異常（例えば、鎌状赤血球貧血、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＳ−Ｃ症、およびヘモグロビンＥ症に関連した異常）を治療、予防、および／または診断するにおいて有用であり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、サラセミア（α−サラセミアおよびβ−サラセミアのメジャー形態およびマイナー形態を含むが、これらに限定されない）を診断、予後診断、予防および／または治療において有用であり得る。
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血小板減少症（例えば、特発性血小板減少性紫斑病、および血栓性血小板減少性紫斑病）、ヴォン・ヴィレブランド病、遺伝性血小板障害（例えば、蓄積プール症（ｓｔｏｒａｇｅｐｏｏｌｄｉｓｅａｓｅ）（例えば、チェディアック−東病およびヘルマンスキー−パドラック症候群）、トロンボキサンＡ２機能不全、血小板無力症、およびベルナール−スーリエ症候群）、溶血性尿毒症症候群、血友病（ｈｅｍｏｐｈｅｌｉａ）（例えば、血友病Ａまたは第ＶＩＩ因子欠損、およびクリスマス病または第ＩＸ因子欠損）、遺伝性出血性毛細管拡張症（ランデュ−オースラー−ウェーバー症候群としてもまた既知）、アレルギー性紫斑病（ヘーノホ−シェーンライン紫斑病）および汎発性血管内凝固症候群が挙げられるが、これらに限定されない出血障害を診断、予後診断、予防および／または治療する際に有用であり得る。

血液の凝固時間に対する、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの効果は、全血部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、活性凝固時間（ＡＣＴ）、再石灰化活性凝固時間またはリー−ホワイト凝固時間が挙げられるが、これらに限定されない、当該分野で既知の任意の凝固試験を使用してモニターされ得る。
いくつかの疾患および種々の薬物は、血小板機能不全を引き起こし得る。したがって、具体的な実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、後天性血小板機能不全（例えば、腎不全、白血病、多発性骨髄腫、肝臓の肝硬変、および全身性エリテマトーデスに関連する血小板機能不全、ならびに薬物治療（高用量でのアスピリン、チクロピジン、非ステロイド性抗炎症薬（関節炎、疼痛、および捻挫に使用される）、およびペニシリンによる治療を含む）に関連する血小板機能不全）を診断、予後診断、予防および／または治療する際に有用であり得る。

別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球数の増加もしくは減少によって特徴付けられるか、または白血球数の増加もしくは減少に関連する疾患および障害を診断、予後診断、予防および／または治療する際に有用であり得る。白血球減少症は、白血球数が、正常未満に減少する場合に生じる。白血球減少症としては、好中球減少症およびリンパ球減少症が挙げられるが、これらに限定されない。正常と比較した白血球数の増加は、白血球増加症として既知である。身体は、感染の間に、増加した数の白血球を産生する。したがって、白血球増加症は、単純に、感染を反映する通常の生理的パラメータであり得る。あるいは、白血球増加症は、損傷または癌のような他の疾患の指標であり得る。白血球増加症（Ｌｅｏｋｏｃｙｔｏｓｅｓ）としては、好酸球増加症およびマクロファージの蓄積が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球減少症を診断、予後診断、予防および／または治療する際に有用であり得る。他の具体的な実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球増加症を診断、予後診断、予防および／または治療する際に有用であり得る。
白血球減少症は、全ての型の白血球が概して減少した状態であり得るか、または特定の型の白血球の特異的枯渇であり得る。したがって、具体的な実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好中球数の減少（好中球減少症として既知）を診断、予後診断、予防および／または治療する際に有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって診断、予後診断、予防および／または治療され得る好中球減少症としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：乳児遺伝性顆粒球減少症（ｉｎｆａｎｔｉｌｅｇｅｎｅｔｉｃａｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｏｓｉｓ）、家族性好中球減少症、周期性好中球減少症、食事性欠損（例えば、ビタミンＢ１２欠損または葉酸欠損）から生じるかまたはこれに関連する好中球減少症、薬物治療（例えば、抗生物質レジメン（例えば、ペニシリン治療）、スルホンアミド治療、抗凝固薬治療、鎮痙薬物、抗甲状腺性薬物、および癌化学療法）から生じるかまたは薬物治療に関連した好中球減少症、およびいくつかの細菌感染またはウイルス感染、アレルギー性障害、自己免疫疾患、個体が膨張した脾臓を有し（例えば、フェルティ症候群、マラリア、およびサルコイドーシス）、そしていくつかの薬物治療レジメンを有する状態に関連して生じ得る好中球破壊の増加から生じる好中球減少症。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ストレス、薬物治療（例えば、コルチコステロイドを用いる薬物治療、癌化学療法、および／または放射線治療）、ＡＩＤ感染、および／または他の疾患（例えば、癌、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、慢性感染、いくつかのウイルス感染、および／または遺伝性障害（例えば、ディ・ジョージ症候群、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、重症複合型免疫不全、毛細血管拡張性運動失調）など）から生じるかまたはそれらに関連するリンパ球減少症を含むが、これに限定されないリンパ球減少症（Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球の数の減少）を診断、予後診断、予防および／または治療する際に有用であり得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ゴシェ病、ニーマン−ピック病、レテラー−ジーヴェ病、およびハンド−シュラー−クリスチャン病を含むが、これらに限定されない、マクロファージ数および／またはマクロファージ機能に関連した疾患および障害を診断、予後診断、予防および／または治療する際に有用であり得る。
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特発性好酸球増多症候群、好酸球増多−筋痛症候群、およびハンド−シュラー−クリスチャン病を含むが、これらに限定されない、好酸球数および／または好酸球機能に関連した疾患および障害を診断、予後診断、予防および／または治療する際に有用であり得る。

さらに別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、急性リンパ性（リンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（骨髄性（ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）、骨髄芽球性または骨髄単球性）白血病、慢性リンパ性白血病（例えば、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞白血病、セザリー症候群、およびヘアリーセル白血病）、慢性骨髄性（骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）、骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）または顆粒球性）白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および菌状息肉腫を含むが、これらに限定されない白血病およびリンパ腫を診断、予後診断、予防および／または治療するにおいて有用であり得る。
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、形質細胞異形成、単一クローン性高ガンマグロブリン血症、意義不明の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｇａｍｍｏｐａｔｈｉｅｓｏｆｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、クリオグロブリン血症、およびレーノー現象を含むが、これらに限定されないプラスマ細胞の疾患および障害を診断、予後診断、予防および／または治療する際に有用であり得る。

他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、真性赤血球増加症、相対的赤血球増加症、２次的赤血球増加症（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ）、骨髄線維症、急性骨髄線維症、原因不明骨髄様化生、血小板血症（１次的および２次的血小板血症の両方を含む）、および慢性骨髄性白血病を含むが、これらに限定されない、骨髄増殖性障害を治療、予防および／または診断する際に有用であり得る。
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外科手術の前に、血球産生を増加させるための治療として有用であり得る。
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好中球、食作用、スーパーオキシド産生、抗体依存性細胞傷害性、好酸球およびマクロファージの移動を増強するための薬剤として有用であり得る。

他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、幹細胞フェレーシスの前に、循環系の幹細胞数を増加させるための薬剤として有用であり得る。別の具体的な実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血小板フェレーシスの前に、循環系の幹細胞数を増加させるための薬剤として有用であり得る。
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、サイトカイン産生を増加させるための薬剤として有用であり得る。
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１次造血障害を予防、診断および／または治療する際に有用であり得る。
過剰増殖性障害

具体的な実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、過剰増殖性障害（新生物を含む）を治療または検出するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、直接的相互作用または間接的相互作用を通して、障害の増殖を阻害し得る。あるいは、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、過剰増殖性障害を阻害し得る他の細胞を増殖し得る。
例えば、免疫応答を増加させることによって、特に、過剰増殖性障害の抗原性の質を増加させることかまたはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員することによって、過剰増殖性障害は治療され得る。この免疫応答は、既存の免疫応答を増強することか、または新たな免疫応答を開始することのいずれかによって増加され得る。あるいは、免疫応答を減少させることはまた、過剰増殖性障害を治療する方法であり得る（例えば、化学療法剤）。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療または検出され得る過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（腎上体、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸郭、および泌尿性器管に位置づけられる新生物。

同様に、他の過剰増殖性障害もまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療または検出され得る。このような過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性小児性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、成体（原発性（ｐｒｉｍａｒｙ））肝細胞癌、成体（原発性（ｐｒｉｍａｒｙ））肝臓癌、成体急性リンパ性白血病、成体急性骨髄性白血病、成体ホジキン病、成体ホジキンリンパ腫、成体リンパ性白血病、成体非ホジキンリンパ腫、成体原発性肝臓癌、成体軟組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性疾患、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨の癌、脳幹グリオーム、脳腫瘍、乳癌、腎盤および尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児性（原発性）肝細胞癌、小児性（原発性）肝臓癌、小児性急性リンパ芽球性白血病、小児性急性骨髄性白血病、小児性脳幹グリオーム、小児性小脳星状細胞腫、小児性大脳星状細胞腫、小児性頭蓋外胚細胞腫瘍（ＣｈｉｌｄｈｏｏｄＥｘｔｒａｃｒａｎｉａｌＧｅｒｍＣｅｌｌＴｕｍｏｒ）、小児性ホジキン病、小児性ホジキンリンパ腫、小児性視床下部および視路グリオーム（ＣｈｉｌｄｈｏｏｄＨｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃａｎｄＶｉｓｕａｌＰａｔｈｗａｙＧｌｉｏｍａ）、小児性リンパ芽急性白血病、小児性髄芽腫、小児性非ホジキンリンパ腫、小児性松果体およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、小児性原発性肝臓癌、小児性横紋筋肉腫、小児性軟組織肉腫、小児性視路および視床下部グリオーム、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌腫、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連の腫瘍、膵外分泌癌（ＥｘｏｃｒｉｎｅＰａｎｃｒｅａｔｉｃＣａｎｃｅｒ）、頭蓋外胚細胞腫瘍（ＥｘｔｒａｃｒａｎｉａｌＧｅｒｍＣｅｌｌＴｕｍｏｒ）、性腺外胚細胞腫瘍（ＥｘｔｒａｇｏｎａｄａｌＧｅｒｍＣｅｌｌＴｕｍｏｒ）、肝外胆管癌、眼の癌、雌性乳癌、ゴシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸類癌腫、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍（ＧｅｒｍＣｅｌｌＴｕｍｏｒ）、妊娠期栄養膜腫瘍（ＧｅｓｔａｔｉｏｎａｌＴｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃＴｕｍｏｒ）、ヘアリーセル白血病、頭頸部の癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸の癌、眼内黒色腫、島細胞癌腫、島細胞膵臓癌、カポージ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇および口腔の癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害、マクログロブリン血症、雄性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平上皮頸癌（ＭｅｔａｓｔａｔｉｃＯｃｃｕｌｔＰｒｉｍａｒｙＳｑｕａｍｏｕｓＮｅｃｋＣａｎｃｅｒ）、転移性原発性扁平上皮頸癌（ＭｅｔａｓｔａｔｉｃＰｒｉｍａｒｙＳｑｕａｍｏｕｓＮｅｃｋＣａｎｃｅｒ）、転移性扁平上皮頸癌（ＭｅｔａｓｔａｔｉｃＳｑｕａｍｏｕｓＮｅｃｋＣａｎｃｅｒ）、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／プラスマ細胞新生物、脊髄形成異常症候群、骨髄性白血病（ＭｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓＬｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病（ＭｙｅｌｏｉｄＬｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、妊娠期の非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌（ＮｏｎｍｅｌａｎｏｍａＳｋｉｎＣａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頸癌（ＯｃｃｕｌｔＰｒｉｍａｒｙＭｅｔａｓｔａｔｉｃＳｑｕａｍｏｕｓＮｅｃｋＣａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣境界型腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、紫斑、上皮小体癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、プラスマ細胞新生物／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盤および尿管の癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮頸癌、胃癌、テント上未分化神経外胚葉性および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盤および尿管の移行上皮癌、移行性の腎盤および尿管の癌、栄養膜腫瘍、尿管および腎盤細胞の癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣の癌、視路および視床下部グリオーム、外陰部の癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫、ならびに任意の他の過剰増殖性疾患、および新形成であって、上記に列挙された器官系に位置付けられるもの。

別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、前悪性状態の診断、予後判断、予防および／または治療、ならびに上に記載されるような障害を含むがこれらに限定されない腫瘍性状態または悪性状態への進行の予防を行う。このような使用が示されるのは、腫瘍性または癌（特に、ここで、過形成、化生、または最も特には形成異常からなる非腫瘍性の細胞増殖が起こっている（このような異常な増殖状態の総説について、ＲｏｂｂｉｎｓａｎｄＡｎｇｅｌｌ，１９７６，ＢａｓｉｃＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄＥｄ．，Ｗ．Ｂ．ＳａｕｎｄｅｒｓＣｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．６８−７９）を参照）への前述の進行が知られるか、または疑われる状況においてである。
過形成は、制御された細胞増殖形態であり、これは、構造または機能において有意な変化を伴わない、組織または器官における細胞数の増大を含む。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、診断、予後判断、予防および／または治療し得る過形成障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：脈管濾胞性縦隔リンパ節増殖、好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、非定型メラニン細胞過形成、基底細胞過形成、良性巨大リンパ節増殖、セメント質過形成、先天性副腎過形成、先天性脂腺増生症、嚢胞性増殖、乳房嚢胞性過形成、義歯性線維症、導管過形成、子宮内膜過形成、線維筋過形成、局所性上皮肥厚、歯肉増殖、炎症性線維性過形成、炎症性乳頭状過形成、血管内乳頭状内皮過形成、結節性前立腺過形成、結節性再生過形成、偽上皮腫性増殖、老年性脂腺増生症、ならびに疣贅性肥厚。
過形成は、成体の細胞または完全に分化した細胞の１つの型が、別の型の成体の細胞に代わる制御された細胞増殖形態である。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、診断、予後判断、予防および／または治療し得る化生障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：原因不明骨髄様化生、アポクリン化生、非定型化性（ａｔｙｐｉｃａｌｍｅｔａｐｌａｓｉａ）、自己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸上皮化生、化生性貧血、変形骨化、異形成性ポリープ、骨髄化生、原発性骨髄様化生、２次性骨髄様化生、扁平化生、羊膜の扁平化生、および症候性骨髄化生。

形成異常は、頻繁に癌の前兆であり、そして主に上皮において見出される。形成異常は、非腫瘍性細胞増殖の最も乱れた形態であり、これは、個々の細胞の一様性の損失および細胞の構築的配向の喪失を含む。形成異常細胞は、しばしば異常に大きく、深く染色される核を有し、そして多態性を呈する。形成異常は、特徴的に慢性的な過敏または炎症の存在するところに生じる。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、診断、予後判断、予防および／または治療し得る形成異常障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：無汗性外胚葉性形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭形成異常、心房指（ａｔｒｉｏｄｉｇｉｔａｌ）形成異常、気管支肺異形成症、終脳形成異常、子宮頸部形成異常、軟骨外胚葉性形成異常、鎖骨頭蓋骨形成不全、先天性外胚葉性形成異常、頭蓋骨幹形成異常、頭蓋骨手根骨足根骨形成不全、頭蓋骨幹端形成異常、ぞうげ質異形成症、骨幹形成異常、外胚葉性形成異常、エナメル質形成異常、脳−眼球異形成（ｅｎｃｅｐｈａｌｏ−ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｄｙｓｐｌａｓｉａ）、足根骨肥大、多発性骨端形成異常、点状骨端形成異常、上皮形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、家族性顎骨の線維性形成障害、家族性白色襞性形成異常、線維筋性形成異常、線維性骨形成異常、開花性骨異形成症、遺伝性腎性−網膜性形成異常（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｒｅｎａｌ−ｒｅｔｉｎａｌｄｙｓｐｌａｓｉａ）、発汗性外胚葉性形成異常、無汗性外胚葉形成異常症、リンパ球減少性胸腺形成異常、乳房形成異常、顎顔面形成異常、骨幹端形成異常、モンディーニ型内耳形成異常、単発性線維性形成異常、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎形成異常、歯牙形成不全、眼下顎四肢形成不全、根尖性セメント質異形成症、多発性線維性骨形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔−視覚異形成症、脊椎骨端形成異常、および心室橈骨形成異常。

さらに本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、診断、予後判断、予防および／または治療し得る前腫瘍性障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性の異常増殖障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞状態、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、および食道形成異常）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、および日光性角化症。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、ポリペプチドが発現される組織に関する障害の診断および／または予後判断し得る。
別の実施形態において、本明細書において記載されるように毒素または放射性同位元素に結合した、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、本明細書中に記載されるものを含むが、これらに限定されない癌および新生物を治療し得る。さらなる実施形態において、本明細書において記載されるように毒素または放射性同位元素に結合した、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、急性骨髄性白血病を治療し得る。

さらに本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アポトーシスに影響し得、したがって細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関する多くの疾患を治療する際に有用である。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて診断、予後判断、予防、および／または治療し得る細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関する疾患としては、以下が挙げられる。癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌、およびホルモン依存性腫瘍（以下を含むが、これらに限定されない：結腸癌、心臓性腫瘍（ｃａｒｄｉａｃｔｕｍｏｒｓ）、膵臓癌、黒色腫、網膜芽腫、神経膠芽腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫、および卵巣癌））、自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、ならびに免疫性糸球体腎炎（ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）および慢性関節リウマチ）ならびにウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶。
他の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、癌（特に上に列挙したもの）の増殖、進行、および／または転移を阻害する。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、診断、予後判断、予防および／または治療され得る、細胞の生存を増大させることに関するさらなる疾患または状態としては、以下の進行および／または転移が挙げられるが、これらに限定されない：悪性腫瘍および関連する障害（例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄性白血病（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病を含む））、ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（顆粒球性白血病）および慢性リンパ性白血病）を含む）、真性赤血球増加、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、および固形腫瘍（これらは、以下が挙げられるが、これらに限定されない：肉腫および癌（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮性肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫、頚部癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫（ｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、聴神経鞘腫（ａｃｏｕｓｔｉｃｎｅｕｒｏｍａ）、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽腫、ならびに網膜芽腫））。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、診断、予後判断、予防および／または治療され得る、アポトーシスを増大させることに関する疾患は、以下を含む：ＡＩＤＳ、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、および脳腫瘍または原発性関連疾患（ｐｒｉｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｉｓｅａｓｅ））、自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、および免疫関連糸球体腎炎（ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）および慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性障害（例えば、心筋梗塞、発作、および再灌流障害に起因するもの）、肝障害（例えば、肝炎に関連する肝障害、虚血／再灌流障害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管障害）、および肝癌）、毒素誘導性肝疾患（例えば、アルコールに起因するもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、診断、予後判断、予防および／または治療され得る、過剰増殖性の疾患および／または障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：肝、腹部、骨、胸、消化器系、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭、および首、神経系（中枢神経および末梢神経）、リンパ系、骨盤、皮膚、柔組織、脾臓、胸郭および泌尿性器路に位置する新生物。

同様に、他の過剰増殖障害もまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、診断、予後判断、予防および／または治療され得る。このような過剰増殖障害の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖障害、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および新形成に加えて、上に列挙した器官系に位置する他の任意の過剰増殖疾患。
別の実施形態は、本発明および／またはそのタンパク質融合物またはそのフラグメントを使用する遺伝子治療によって、異常な細胞分裂を阻害するために本発明のポリヌクレオチドを利用する。
したがって、本発明は、異常に増殖する細胞中に、本発明のポリヌクレオチドを挿入することによって細胞増殖性障害を治療するための方法を提供し、ここでこのポリヌクレオチドは、その発現を抑制する。

本発明の別の実施形態は、個体において細胞増殖性障害を治療する方法を提供し、この方法は、異常に増殖する細胞（単数または複数）に本発明の１つ以上の活性遺伝子コピーを投与するステップを包含する。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を発現する際に有効な、組み換え発現ベクターを含むＤＮＡ構築物である。本発明の別の実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、レトロウイルス（またはより好ましくは、アデノウイルスベクター）を利用して治療されるべき細胞中に、挿入される（Ｇ．Ｊ．Ｎａｂｅｌｅｔａｌ．、ＰＮＡＳ１９９９９６：３２４〜３２６（本明細書により参考として援用される）を参照のこと）。他の実施形態において、このウイルスベクターは欠損性であり、そして、非増殖細胞を形質転換せず、増殖する細胞のみ形質転換する。さらに、いくつかの実施形態において、単独でか、他のポリヌクレオチドと組み合わせてか、または他のポリヌクレオチドと融合されてのいずれかで、増殖する細胞中に挿入される本発明のポリヌクレオチドは、その後、外部刺激（すなわち、磁気、特定の低分子、化学物質または薬物の投与など）を介して調節され得、この外部刺激は、コードされるタンパク質産物の発現を誘導するように、このポリヌクレオチドの上流のプロモーターに対して作用する。このように、本発明の有益な治療効果は、この外部刺激に基づいて明らかに調節され（すなわち、本発明の発現を増加、減少または阻害し）得る。
本発明のポリヌクレオチドは、腫瘍性遺伝子または抗原の発現を抑制する際に有用であり得る。「腫瘍性遺伝子の発現を抑制する」とは、この遺伝子の転写の抑制、この遺伝子転写物（プレメッセージＲＮＡ）の破壊、スプライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻訳後改変の妨害、タンパク質の崩壊、またはタンパク質の正常な機能の阻害を意図する。

異常に増殖している細胞への局所投与のために、本発明のポリヌクレオチドは、当業者に既知の任意の方法によって投与され得る。この方法には、トランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞の微量注入、もしくはリポソームのようなビヒクル、リポフェクション、または裸のポリヌクレオチドとして、あるいは、本明細書全体を通して記載される任意の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、当業者に既知のレトロウイルスベクター（Ｇｉｌｂｏａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４４：８４５（１９８２）、Ｈｏｃｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ３２０：２７５（１９８６）、Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：３０１４）、ワクシニアウイルス系（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．５：３４０３（１９８５）、または他の効率的なＤＮＡ送達系（Ｙａｔｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１２（１９８５））のような既知の遺伝子送達系（しかし、これらの限定されない）によって送達され得る。これらの参考文献は例示のみであり、そして本明細書中で参考として援用される。異常に増殖している細胞を特異的に送達またはトランスフェクトし、そして非分裂の細胞を残すために、当業者に既知のレトロウイルス、またはアデノウイルス（当該分野において記載され、そして本明細書中の他の箇所において記載されるような）送達系を利用することが好ましい。宿主ＤＮＡ複製は、レトロウイルスＤＮＡを組み込むために必要とされ、そしてレトロウイルスは、その生活環に必要とされるレトロウイルス遺伝子を欠損するので、自律複製し得ない。本発明のポリヌクレオチドのためにこのようなレトロウイルス送達系を利用することは、この遺伝子および構築物を異常に増殖している細胞へと標的化し、そして分裂していない正常細胞を残す。

本発明のポリヌクレオチドは、疾患部位に直接的に注射針をガイドするために使用される画像化デバイスを使用することによって、内部の器官、体腔などにおける細胞増殖性障害／疾患の部位に直接的に送達され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、外科的介入の時点で、疾患部位に投与され得る。
「細胞増殖性疾患」とは、良性であろうと悪性であろうと、細胞、細胞群、または組織の単一または複数の局所的異常増殖によって特徴付けられる、器官、腔、または身体部分のいずれか１つまたはいずれかの組み合わせに罹患する、ヒトまたは動物の任意の疾患または障害を意味する。
本発明のポリヌクレオチドの任意の量が、それらが処理された細胞の増殖に対して生物学的に阻害する効果を有する限り、投与され得る。さらに、同一部位に同時に、本発明の１つより多くのポリヌクレオチドを投与することが可能である。「生物学的に阻害する」とは、部分的または全体的な増殖阻害、ならびに細胞の増殖または成長の速度減少を意味する。生物学的に阻害性の用量は、組織培養物中の標的の悪性細胞増殖または異常増殖の細胞増殖、動物および細胞培養物中の腫瘍増殖に対する本発明のポリヌクレオチドの効果を評価することによって、または当業者に既知の任意の他の方法によって、決定され得る。

さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単独でか、タンパク質融合物としてか、または本明細書中の他の箇所に記載されるように直接的または間接的に他のポリペプチドと組み合わせるかのいずれかで、増殖性の細胞または組織の新脈管形成を阻害する際に有用である。他の実施形態では、この抗新脈管形成作用は、例えば、造血性腫瘍特異的細胞（例えば、腫瘍関連マクロファージ）の阻害を通して、間接的に達成され得る（ＪｏｓｅｐｈＩＢｅｔａｌ．，ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ，９０（２１）：１６４８−５３（１９９８）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アポトーシスの誘導を通して増殖性の細胞または組織を阻害する際に有用であり得る。これらの融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、例えば、死ドメイン（ｄｅａｔｈ−ｄｏｍａｉｎ）受容体（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体−１、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）、ＴＮＦ受容体関連アポトーシス媒介性タンパク質（ＴＲＡＭＰ）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体−１および−２（Ｓｃｈｕｌｚｅ−ＯｓｔｈｏｆｆＫｅｔａｌ．，ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ２５４（３）：４３９−５９（１９９８）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと））の活性化において、増殖性の細胞および組織のアポトーシスを誘導するように、直接的または間接的のいずれかで作用し得る。さらに、本発明の別の実施形態では、これらの融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、アポトーシスを活性化する他のタンパク質の活性化におけるような他の機構を通してか、あるいは単独または低分子薬物もしくはアジュバント（例えば、アポプトニン（ａｐｏｐｔｏｎｉｎ）、ガレクチン（ｇａｌｅｃｔｉｎ）、チオレドキシン、抗炎症性タンパク質（例えば、ＭｕｔａｔＲｅｓ４００（１−２）：４４７−５５（１９９８），ＭｅｄＨｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３（１９９８），ＣｈｅｍＢｉｏｌＩｎｔｅｒａｃｔ．Ａｐｒ２４、１１１−１１２：２３−３４（１９９８），ＪＭｏｌＭｅｄ．７６（６）：４０２−１２（１９９８），ＩｎｔＪＴｉｓｓｕｅＲｅａｃｔ、２０（１）：３−１５（１９９８）（これらは全て、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと））と組み合わせてかのいずれかで、このタンパク質の発現を刺激することを通して、アポトーシスを誘導し得る。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、増殖性細胞または組織の転移を阻害する際に有用である。阻害は、本明細書中他の箇所に記載されるように、これらのアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを投与するステップの直接的結果として、または間接的に（例えば、転移を阻害することが既知のタンパク質（例えば、α４インテグリン）の発現を活性化する）生じ得る（例えば、本明細書中に参考として援用される、ＣｕｒｒＴｏｐＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ１９９８、２３１：１２５−４１を参照のこと）。本発明のこのような治療的影響は、単独で、または低分子薬物もしくはアジュバントと組み合わせてかのいずれかで達成され得る。
別の実施形態において、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を、本発明のアルブミン融合タンパク質によって結合された、このタンパク質に結合する、またはこのタンパク質に関連するポリペプチドを発現する標的とされた細胞に送達する方法を提供する。本発明のアルブミン融合タンパク質は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合的な相互作用を通じて結合され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、増殖性抗原および免疫原に対して、直接的（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質が「ワクチン接種」された場合、上記の抗原および免疫原に対して応答するように免疫応答を生じる）または間接的（例えば、免疫応答を増強することが既知のタンパク質（例えば、ケモカイン）の発現を活性化することにおいて）のいずれかで、増殖している細胞または組織の免疫原性および／または抗原性を増強する際に有用である。
腎臓障害

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、腎臓系の障害を、治療、予防、診断、および／または予後診断し得る。本発明の組成物を用いて診断、予後診断、予防、および／または治療され得る腎臓障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：腎不全、腎炎、腎臓の血管障害、代謝性腎臓障害および先天性腎臓障害、腎臓の尿障害、自己免疫障害、硬化症および壊死、電解質不均等、および腎臓癌。
本発明の組成物を用いて診断、予後診断、予防、および／または治療され得る腎疾患としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性腎不全、慢性腎不全、アテローム塞栓症、末期腎臓疾患、腎臓の炎症性疾患（例えば、急性糸球体腎炎、感染後糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、膜性糸球体腎炎、家族性ネフローゼ症候群、膜性増殖性糸球体腎炎ＩおよびＩＩ、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、急性尿細管間質性腎炎、慢性尿細管間質性腎炎、急性溶連菌感染後性糸球体腎炎（ＰＳＧＮ）、腎盂腎炎、ループス腎炎、慢性腎炎、間質性腎炎、および溶連菌感染後性糸球体腎炎）、腎臓の血管障害（例えば、腎感染、アテローム塞栓症性腎臓疾患、皮質壊死、悪性腎硬化症、腎静脈血栓症、腎貫流低下（ｒｅｎａｌｕｎｄｅｒｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、腎性網膜症（ｒｅｎａｌｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、腎虚血再灌流（ｒｅｎａｌｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、腎動脈塞栓症、および腎動脈狭窄）、そして尿管疾患に起因する腎障害（例えば、腎盂腎炎、水腎症、尿石症（腎結石症、腎石症）、逆流性腎症、尿管感染、尿閉（ｕｒｉｎａｒｙｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）、および急性または慢性片側閉塞性尿路疾患）。

さらに、本発明の組成物を用いて、腎臓の代謝障害および先天性障害（例えば、尿毒症、腎アミロイドーシス、腎性骨形成異常症、尿細管性アシドーシス、腎性糖尿、腎原性尿崩症、シスチン尿症、ファンコーニ症候群、腎性くる病（ｒｅｎａｌｆｉｂｒｏｃｙｓｔｉｃｏｓｔｅｏｓｉｓ（ｒｅｎａｌｒｉｃｋｅｔｓ））、ハートナップ病、バーター症候群、リドル症候群、多発性嚢胞腎疾患、髄質嚢胞病、髄質海綿腎、アルポート症候群、爪−膝蓋骨症候群、先天性ネフローゼ症候群、クラッシュ症候群、馬蹄腎、糖尿病性ニューロパシー、腎原性尿崩症、鎮痛薬性腎症、腎結石、および膜性腎症）、ならびに腎臓の自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー症候群、ＩｇＡ腎症、およびＩｇＭメサンギウム増殖性糸球体腎炎））を診断、予後診断、予防、および／または治療し得る。
本発明の組成物を用いて、以下も診断、予後診断、予防、および／または治療し得る。腎臓の硬化性障害または壊死性障害（例えば、糸球体硬化症、糖尿病性腎症、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、壊死性糸球体腎炎、および腎乳頭壊死）、腎臓の癌（例えば、腎腫、副腎腫、腎芽細胞腫、腎細胞癌、移行上皮癌、腎腺癌、扁平上皮癌、およびウィルムス腫）、ならびに電解質不均等（例えば、腎石灰、膿尿、水腫、水腎、蛋白尿、低ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血症、低カルシウム血症、高カルシウム血症、低リン酸血症、および高リン酸血症）。

本発明の組成物は、当該分野で既知である任意の方法を使用して投与され得、これらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口または坐剤の固形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で既知である。本発明の組成物は、下記でより詳細に記載される、治療剤の一部として投与され得る。ポリヌクレオチドを送達する方法は本明細書中でより詳細に記載される。
心臓血管障害

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、四肢虚血のような末梢動脈疾患を含むが、これらに限定されない心臓血管障害を治療、予防、診断、および／または予後診断し得る。
心臓血管障害としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌｆｉｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候群のような心臓血管異常が挙げられるが、これらに限定されない。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄（ａｏｒｔｉｃｏａｒｃｔａｔｉｏｎ）、三房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙｖｅｓｓｅｌａｎｏｍａｌｉｅｓ）、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔｄｕｃｔｕｓａｒｔｅｒｉｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合症、左心室発育不全症候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔｓｅｐｔａｌｄｅｆｅｃｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙｓｅｐｔａｌｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｈｅａｒｔｓｅｐｔａｌｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられるが、これらに限定されない。

心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉｇｈｃａｒｄｉａｃｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗｃａｒｄｉａｃｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｈｅａｒｔｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｐｒｅｇｎａｎｃｙｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心臓病が挙げられるが、これらに限定されない。
不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群（ｌｏｎｇＱＴｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群、マヘーム型早期興奮症候群（Ｍａｈａｉｍ−ｔｙｐｅｐｒｅ−ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げられるが、これらに限定されない。頻拍としては、発作性頻拍、上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性再入頻拍（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｎｏｄａｌｒｅｅｎｔｒｙｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、異所心房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節性再入頻拍（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌｎｏｄａｌｒｅｅｎｔｒｙｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、洞性頻拍、トルサード・ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。

心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａｒｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。
心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、および心筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。
心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｓｔｕｎｎｉｎｇ）のような冠動脈疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫症状、ヒッペル−リンダウ疾患（Ｈｉｐｐｅｌ−ＬｉｎｄａｕＤｉｓｅａｓｅ）、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｃｉａｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管疾患が挙げられる。
動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が挙げられるが、これらに限定されない。

動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉塞性血栓性血管炎が挙げられるが、これらに限定されない。
脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、大脳の塞栓症および血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症候群、室周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ）機能不全が挙げられるが、これらに限定されない。
塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チアノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられるが、これらに限定されない。血栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられるが、これらに限定されない。

虚血性障害としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前仕切り症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血が挙げられるが、これらに限定されない。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で既知である任意の方法を使用して投与され得、これらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口または坐剤の固形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で既知である。ポリヌクレオチドを送達する方法は本明細書中でより詳細に記載される。
呼吸性障害

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、呼吸系の疾患および／または障害の治療、予防、診断、および／または予後診断するために用いられ得る。
呼吸系の疾患および障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：鼻前庭炎、非アレルギー性鼻炎（例えば、急性鼻炎、慢性鼻炎、アトロピン様鼻炎、血管運動神経性鼻炎）、鼻ポリープ、および副鼻腔炎、若年性血管線維腫、鼻の癌および若年性乳頭腫、声帯ポリープ、声帯結節（歌手結節）、接触潰瘍、声帯麻痺、喉頭気腫、咽頭炎（例えば、ウイルス性および細菌性）、扁桃炎、扁桃蜂巣炎、副咽頭間隙膿瘍、喉頭炎、喉頭気腫、ならびに咽頭癌（例えば、鼻咽頭の癌、扁桃癌、咽頭癌）、肺癌（例えば、扁平上皮細胞腫、小細胞腫（燕麦細胞腫）、大細胞腫、および腺癌）、アレルギー性障害（好酸球性肺炎、過敏性肺炎（例えば、外因性アレルギー性肺胞炎、アレルギー性間質肺炎、有機塵埃塵肺症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、喘息、ヴェーゲナー肉芽腫症（肉芽腫性脈管炎）、グッドパスチャー症候群））、肺炎（例えば、細菌肺炎（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（連鎖球菌肺炎）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ブドウ球菌肺炎）、グラム陰性細菌肺炎（例えば、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌおよびＰｓｅｕｄｏｍａｓｓｐｐ．により引き起こされる）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ肺炎、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ肺炎、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（レジオネラ性疾患）、ならびにＣｈｌａｍｙｄｉａｐｓｉｔｔａｃｉ（オウム病））、そしてウイルス肺炎（例えば、インフルエンザ、水痘（Ｃｈｉｃｋｅｎｐｏｘ）（水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ））。

呼吸系のさらなる疾患および障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細気管支炎、ポリオ、クループ、ＲＳウイルス感染、おたふくかぜ、伝染性紅斑（第五病）、小児バラ疹、進行性風疹汎脳炎、風疹、および亜急性硬化性汎脳炎）、真菌肺炎（例えば、ヒストプラスマ症、コクシジオイデス真菌症、ブラストミセス症、重篤に抑制される免疫系を有する人々における真菌感染（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓにより引き起こされるクリプトコックス症、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐｐ．により引き起こされるアスペルギルス症、Ｃａｎｄｉｄａにより引き起こされるカンジダ症、およびムコール菌症）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓｃａｒｉｎｉｉ（ニューモシスティス肺炎）、異型肺炎（例えば、ＭｙｃｏｐｌａｓｍａおよびＣｈｌａｍｙｄｉａｓｐｐ．）、日和見感染性肺炎、院内感染肺炎、化学性肺炎、ならびに吸引性肺炎、胸膜疾患（例えば、胸膜炎、胸水、および気胸症（例えば、単純自発性気胸症、複雑自発性気胸症、緊張気胸症））、気道閉塞疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、急性気管支炎または慢性気管支炎）、職業性肺疾患（例えば、珪肺症、黒色肺（炭坑夫塵肺症）、石綿肺症、ベリリウム症、職業性喘息、綿肺症、ならびに良性塵肺症）、浸潤性肺疾患（例えば、肺線維症（例えば、線維化肺胞炎、通常型間質性肺炎）、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、リンパ球性間質性肺炎、原因不明性組織球増殖症（例えば、レテラー−ジーヴェ病、ハンド−シュラー−クリスチャン病、好酸球性肉芽腫）、特発性肺ヘモジデリン沈着、サルコイドーシスおよび肺胞蛋白症）、急性呼吸窮迫症候群（例えば、成人呼吸促進症候群とも呼ばれる）、水腫、肺動脈塞栓症、気管支炎（例えば、ウイルス性、細菌性）、気管支拡張症、無気肺、肺膿瘍（例えば、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓまたはＬｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａによって引き起こされる）、そして嚢胞性線維症。
抗新脈管形成活性

新脈管形成の内因性の、刺激因子と阻害剤との間の天然に存在する平衡は、阻害影響が優勢である平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ５６：３４５−３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下において生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プロセス）において、新脈管形成は、ストリンジェントに調節され、そして空間的および時間的に定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）の下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼の障害および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏｓｅｓｅｔａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０−６３４（１９９１）、Ｆｏｌｋｍａｎｅｔａｌ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７−１７６３（１９９５）、Ａｕｅｒｂａｃｈｅｔａｌ．、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１−４１１（１９８５）、Ｆｏｌｋｍａｎ、ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎａｎｄＷｅｉｎｈｏｕｓｅｅｄｓ．、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ｐｐ．１７５−２０３（１９８５）、Ｐａｔｚ、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５−７４３（１９８２）、およびＦｏｌｋｍａｎｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎａｎｄＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。

本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与による新生血管形成に関連する疾患または障害の治療を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて治療し得る悪性状態および転移性状態には、本明細書に記載の悪性疾患、固形腫瘍、および癌、ならびに当該分野で既知の他のもの（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎｅｔａｌ．、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２ｄＥｄ．、Ｊ．Ｂ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明は、新脈管形成関連疾患および／または障害の治療の方法を提供し、この方法は、治療有効量の、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、その治療の必要な個体に投与するステップを包含する。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌または腫瘍を治療的に治療するために、種々のさらなる方法で利用され得る。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで治療され得る癌としては、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、頸部癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌を含む固形腫瘍、原発性腫瘍および転移、黒色腫、膠芽腫、カポージ肉腫、平滑筋肉腫、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、進行性（ａｄｖａｎｃｅｄ）悪性疾患、および血液から生じる腫瘍（例えば、白血病）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍およびカポージ肉腫のような癌を治療するために、局所送達され得る。

なお他の態様において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば膀胱内投与によって膀胱癌の表面形態を治療するために利用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、注射またはカテーテルを介して、腫瘍に直接的に、または腫瘍部位付近に送達され得る。当然のことながら、当業者が理解するように、適切な投与形態は、治療されるべき癌によって多様である。他の送達形態は本明細書中において議論される。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌に加えて、他の障害（新脈管形成を含む）を治療する際に有用であり得る。これらの障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、動脈硬化プラーク、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および眼の翼状片（Ｐｔｅｒｙｇｉａ）（異常な血管増殖））、慢性関節リウマチ、乾癬、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、脈管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、およびアテローム性動脈硬化症。

例えば、本発明の一態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを過形成性瘢痕またはケロイドに投与するステップを包含する、過形成性瘢痕およびケロイドを治療するための方法が提供される。
本発明の一実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、過形成性瘢痕またはケロイドに、これらの病変の進行を妨げるために直接注射される。この療法は、過形成性瘢痕およびケロイド（例えば、やけど）の発生を生じることが知られている状態の予防治療において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷害の約１４日後）を有した後であるが、過形成性瘢痕またはケロイドの発生の前に開始される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、角膜新生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖および黄斑変性を含む）を治療するための方法を提供する。

さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療され得る新生血管形成に関連する眼の障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血管新生緑内障、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例えば、Ｗａｌｔｍａｎｅｔａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４−７１０（１９７８）およびＧａｒｔｎｅｒｅｔａｌ．、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１−３１２（１９７８）による総説を参照のこと。
したがって、本発明の一態様において、治療有効量の化合物（本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を患者に対して、血管の形成が阻害されるように角膜に投与するステップを包含する、角膜新生血管形成（角膜移植新生血管形成を含む）のような眼の新生血管形成疾患を治療するための方法が、提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を欠く組織である。しかし、特定の病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲脈管叢から角膜に伸長し得る。角膜が血管化されるようになる場合、角膜はまた混濁されるようになり、患者の視力の衰えを生じる。角膜が完全に不透明になる（ｏｐａｃｉｔａｔｅ）場合に、視力喪失が完全になり得る。広範な種々の障害は、例えば、以下を含む角膜新生血管形成を生じ得る。すなわち、角膜感染（例えば、トラコーマ、単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫学的プロセス（例えば、移植片拒絶およびスティーヴンズ−ジョンソン症候群）、アルカリやけど、外傷、炎症（任意の原因による）、毒性および栄養欠乏状態、ならびにコンタクトレンズを装着することの合併症としてである。

本発明のいくつかの実施形態において、本発明は、生理食塩水（眼に用いる調製物において一般に使用される任意の保存剤および抗菌剤と組合せて）中で局所投与のために調製され得、そして点眼剤形態で投与され得る。溶液または懸濁液は、その純粋な形態で調製され得、そして１日に数回投与され得る。あるいは、上記のように調製される抗脈管形成組成物はまた、角膜に直接投与され得る。いくつかの実施形態において、抗脈管形成組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーとともに調製される。さらなる実施形態において、抗脈管形成因子または抗脈管形成組成物は、従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治療はまた、脈管形成応答（例えば、化学的やけど）を誘導する高い可能性を有することが既知である角膜病変において予防的に有用であり得る。これらの場合において、治療（おそらくステロイドと組み合わせられる）は、その後の合併症を予防するのを補助するために直ちに開始され得る。
他の実施形態において、上記の化合物は、角膜支質に直接、顕微鏡の案内の下で眼科医によって注入され得る。好ましい注射部位は、個々の病巣の形態によって多様であり得るが、投与の目標は、脈管構造の前進している面に組成物を置くこと（すなわち、血管と正常な角膜との間に分散される）である。ほとんどの場合において、これは、前進している血管から角膜を「防御」するための縁周囲（ｐｅｒｉｌｉｍｂｉｃ）角膜注射を含む。この方法はまた、角膜新生血管形成を予防的に防ぐために、角膜傷害の直後に利用され得る。この状況において、この物質は、角膜病巣とその所望されない潜在的な血液供給の縁との間に分散して縁周囲角膜に注射され得る。このような方法はまた、同様に、移植された角膜の毛細血管浸潤を予防するために利用され得る。徐放形態において、注入は、１年に２〜３回のみ必要とされ得る。ステロイドもまた、注入溶液に添加され、その注射自体から生じる炎症を低減し得る。

本発明の別の態様において、患者に、血管の形成を阻害するように、治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを眼に投与するステップを包含する、血管新生緑内障を治療するための方法が提供される。一実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形態を治療するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物は、前方角（ａｎｔｅｒｉｏｒｃｈａｍｂｅｒａｎｇｌｅ）の領域に注入によって移植され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が眼房水に連続的に放出されるように、任意の位置に置かれ得る。本発明の別の態様において、患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを眼に投与するステップを包含する、増殖性糖尿病性網膜症を治療するための方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態において、増殖性糖尿病性網膜症は、網膜における本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストの局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体への注入によって治療され得る。好ましくは、この治療は、光凝固を必要とする重篤な疾患の獲得の前に開始されるべきである。

本発明の別の態様において、血管の形成が阻害されるように、患者に、治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを眼に投与するステップを包含する、水晶体後線維増殖症を治療するための方法が、提供される。化合物は、硝子体内注射を介して、および／または眼内移植を介して局所投与され得る。
さらに、この本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで治療され得る障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム性プラーク、遅延型創傷治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管接着。

さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで治療、予防、診断、および／または予後診断され得る障害および／または状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：固形腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄｂｏｒｎ）腫瘍（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、およびブドウ膜炎）、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、脈管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー−ウェーバー症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動脈硬化症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防することによる）、病原性の結果（例えば、ネコ引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅｍｉｎａｌｉａｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有する疾患。
産児制限方法の一態様において、胎芽着床をブロックするのに十分な化合物の量は、性交および受精が起こる前またはその後に投与され、従って産児制限の有効な方法、おそらく「事後用（ｍｏｒｎｉｎｇａｆｔｅｒ）」方法を提供する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、月経を制御することにおいて使用され得るか、または子宮内膜症の治療における腹膜洗浄液として、もしくは腹膜移植のためのいずれかで投与され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、縫合（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ得る。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、広範な種々の外科手順において利用され得る。例えば、本発明の一態様において、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態において）は、悪性組織から正常な周囲の組織を分離するため、そして／または周囲の組織への疾患の広がりを予防するために、腫瘍の除去の前に、領域をコートまたはスプレーするために利用され得る。本発明の他の態様において、組成物（例えば、スプレーの形態において）は、腫瘍をコートするため、または所望の場所において新脈管形成を阻害するために、内視鏡手順を介して送達され得る。本発明のなお他の態様において、本発明の抗脈管形成組成物でコートされている外科メッシュが、外科メッシュが利用され得る任意の手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの実施形態において、抗脈管形成組成物を有した外科メッシュレーデン（ｌａｄｅｎ）は、構造に対する支持を提供するため、そして一定の量の抗脈管形成因子を放出するために、腹部癌切除手術の間（例えば、結腸切除の後）に利用され得る。

本発明のさらなる態様において、癌の局所的再発およびその部位での新しい血管の形成が阻害されるように、切除後に本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを腫瘍の切除縁に投与するステップを包含する、腫瘍切除部位を治療するための方法が提供される。本発明の一実施形態において、抗脈管形成化合物は、腫瘍切除部位に直接投与される（例えば、塗布、ブラッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、または他の方法によって抗脈管形成化合物で腫瘍の切除縁をコートすることによって適用される）。あるいは、抗脈管形成化合物は、投与前に既知の外科ペーストに組み込まれ得る。本発明のいくつかの実施形態において、抗脈管形成化合物は、悪性疾患についての肝切除後および神経外科手術後に適用される。
本発明の一態様において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、広範な種々の腫瘍（例えば、乳房腫瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍および肝腫瘍を含む）の切除縁に投与され得る。例えば、本発明の一実施形態において、抗脈管形成化合物は、切除後に、神経学的腫瘍の部位に、その部位での新しい血管の形成が阻害されるように投与され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、他の抗脈管形成因子とともに投与され得る。他の抗脈管形成因子の代表的な例としては以下が挙げられる。抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織阻害剤、メタロプロテイナーゼ−２の組織阻害剤、プラスミノーゲン活性化阻害剤−１、プラスミノーゲン活性化阻害剤−２および種々の形態のより軽い「ｄ群」遷移金属。

より軽い「ｄ群」遷移金属には、例えばバナジウム、モリブデン、タングステン、チタン、ニオブおよびタンタル種が挙げられる。そのような遷移金属種は、遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体としては、オキソ遷移金属錯体が挙げられる。
バナジウム錯体の代表的な例としては、バナデート錯体およびバナジル錯体のようなオキソバナジウム錯体が挙げられる。適切なバナデート錯体としては、例えばメタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナジン酸ナトリウムのようなメタバナデート錯体およびオルトバナデート錯体が挙げられる。適切なバナジル錯体としては、例えばバナジルアセチルアセトネートおよび硫酸バナジル（硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三水和物のような硫酸バナジル水和物を含む）が挙げられる。
タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯体が挙げられる。適切なオキソタングステン錯体としては、タングステート錯体およびタングステンオキシド錯体が挙げられる。適切なタングステート錯体としては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切なタングステンオキシドとしては、タングステン（ＩＶ）オキシドおよびタングステン（ＶＩ）オキシドが挙げられる。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデート、モリブデンオキシドおよびモリブデニル錯体が挙げられる。適切なモリブデート錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙げられる。適切なモリブデンオキシドとしては、モリブデン（ＶＩ）オキシド、モリブデン（ＶＩ）オキシドおよびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデニル錯体としては、例えばモリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール、酒石酸および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。

広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る。代表的な例としては、以下が挙げられる。血小板因子４、硫酸プロタミン、硫酸化キチン誘導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎｃｒａｂ）の殻から調製される）（Ｍｕｒａｔａｅｔａｌ．、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５１：２２−２６、１９９１）、硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ステロイド（例えば、エストロゲン）およびクエン酸タモキシフェンの存在によって、増強され得る）、スタウロスポリン、基質代謝の調節因子（例えば、プロリンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、α，α−ジピリジル，アミノプロピオニトリルフマレートを含む）、４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン、メトトレキサート、ミトザントロン、ヘパリン、インターフェロン、２マクログロブリン−血清、ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１−１７３２６、（１９９２）、キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎｅｔａｌ．、ＢｉｏｃｈｅｍＪ．２８６：４７５−４８０、１９９２）、シクロデキストリンテトラデカサルフェート、エポネマイシン、カンプトテシン、フマギリン（Ｉｎｇｂｅｒｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５５−５５７、１９９０）、チオリンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」、ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０−１４４６、１９８７）、アンチコラゲナーゼ−血清、α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（４）：１６５９〜１６６４、１９８７）、ビサントレン（ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ロベンザリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃａｃｉｄ）二ナトリウム、すなわち「ＣＣＡ」、Ｔａｋｅｕｃｈｉｅｔａｌ．、ＡｇｅｎｔｓＡｃｔｉｏｎｓ３６：３１２−３１６、１９９２）、サリドマイド、Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃステロイド、ＡＧＭ−１４７０、カルボキシアミノイミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ）、およびメタロプロテイナーゼ阻害剤（例えば、ＢＢ９４）。
細胞レベルでの疾患

本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療、予防、診断、および／または予後診断され得る細胞生存の増大あるいはアポトーシスの阻害に関連する疾患には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌腫、およびホルモン依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を含むが、これらに限定されない）、自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶、が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特に上記に列挙される、癌の増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害するために使用される。

本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療あるいは検出され得る細胞生存の増大に関連するさらなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または転移ならびに以下のような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定されない）。

本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療、予防、診断、および／または予後診断され得るアポトーシスの増大に関連する疾患には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＩＤＳ、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍または以前に関連した疾患）、自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害（例えば、肝炎関連肝臓傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）および肝臓癌）、毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって引き起こされるようなもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
創傷治癒および上皮細胞増殖

本発明のなおさらなる態様に従って、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、治療目的のため、例えば、創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激するため、ならびに毛包生成および皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用するプロセスが提供される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を含む創傷治癒を刺激する際に臨床的に有用であり得る。外科的創傷、切除の創傷、深い創傷（真皮および表皮の損傷を含む）、眼組織の創傷、歯組織の創傷、口腔創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈の潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、熱への曝露または化学物質から生ずる熱傷、および他の異常な創傷治癒状態（例えば、尿毒症、栄養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロイド、放射線療法および抗腫瘍性薬物および代謝拮抗物質を用いる全身性治療に関連する合併症。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚損失後の皮膚の回復を促進するために使用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、創傷床（ｗｏｕｎｄｂｅｄ）への皮膚移植片の接着を増大するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激するために使用され得る。以下は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが創傷床への接着を増大するために使用され得る、移植片の型である。自家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己表皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕｌａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｇｒａｆｔ）、異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｇｒａｆｔ）、増殖性移植片、層板状移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリエ−ティールシュ移植片、大網移植片、パッチの移植片（ｐａｔｃｈｇｒａｆｔ）、茎状移植片、全層移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇｇｒａｆｔ）、分層植皮片（ｓｐｌｉｔｓｋｉｎｇｒａｆｔ）、分層植皮片（ｔｈｉｃｋｓｐｌｉｔｇｒａｆｔ）。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚の強度を助長するため、および加齢した皮膚の外見を改善するために使用され得る。

本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵臓、胃、小腸、および大腸における上皮細胞増殖における変化を生じると考えられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上皮細胞（例えば、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝細胞、ＩＩ型肺胞上皮細胞（ｔｙｐｅＩＩｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細胞、および他の上皮細胞、ならびに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれらの前駆体）の増殖を促進し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内皮細胞、ケラチノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、放射線、化学療法治療またはウイルス感染から生じる腸の毒性の副作用を低減するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、小腸粘膜に対して細胞保護的な（ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）効果を有し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、化学療法およびウイルス感染から生じる粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）（口潰瘍）の治癒を刺激し得る。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、やけどを含む、完全な厚さおよび部分的な厚さの皮膚欠損における皮膚の完全な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の再増殖）、乾癬のような他の皮膚欠損の治療においてさらに使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、表皮水疱症（これらの損傷の再上皮形成を促進することによる頻繁な開放性かつ疼痛性の水疱を生じる、下層の真皮への表皮の接着の欠損）を治療するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、胃潰瘍および十二指腸（ｄｏｕｄｅｎａｌ）潰瘍を治療し、そして粘膜の内層の瘢痕形成ならびに腺の粘膜および十二指腸の粘膜の内層の再生による治癒を、より迅速に補助するために使用され得る。炎症性腸疾患、例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎は、それぞれ、小腸または大腸の粘膜表面の破壊を生じる疾患である。したがって、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、粘膜表面の再表面形成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅速な炎症性腸疾患の治癒を補助し、そして炎症性腸疾患の進行を予防するために、使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いる治療は、胃腸管全体の粘液の産生に対して有意な効果を有すると予期され、そして摂取された有害な物質からかまたは外科手術後に、腸粘膜を有害な物質から保護するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、その発現不足に関連する疾患を治療するために使用され得る。

さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、種々の病的状態に起因する肺への損傷を予防および治癒するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、急性または慢性の肺損傷を予防または治療するために、肺胞および細気管支（ｂｒｏｃｈｉｏｌａｒ）上皮の増殖および分化を刺激し得、そしてその修復を促進し得る。例えば、肺胞（ａｖｅｏｌｉ）の進行性の損失を生じる気腫、および細気管支上皮および肺胞の壊死を生じる吸入傷害（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎｉｎｊｕｒｙ）（すなわち、煙の吸入およびやけどから生じる）は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストを使用して、効果的に治療され得る。また、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＩＩ型肺胞上皮細胞の増殖および分化を刺激するために使用され得、これは、未熟な乳児における肺硝子膜症（例えば、乳児呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾患を治療または予防するのを助け得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、肝細胞の増殖および分化を刺激し得、したがって、肝臓の疾患および病状（例えば、肝硬変により生じる劇症肝不全、ウイルス性肝炎および毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素（ｃａｒｂｏｎｔｅｔｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、および当該分野で既知の他の肝臓毒素）により生じる肝臓損傷）を緩和または治療するために用いられ得る。

さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、真性糖尿病の発症を治療または予防するために使用され得る。新たにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病と診断された患者において、いくらかの島細胞機能が残っている場合、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、その疾患の永続的な発現を、緩和、遅延または予防するように、その島機能を維持するために使用され得る。また、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、島細胞機能を改善または促進するための島細胞移植における補助として使用され得る。
ニューロンの活性および神経学的疾患

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、脳および／または神経系の疾患、障害、損傷、または傷害の診断および／または治療のために使用され得る。本発明の組成物（例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を用いて治療され得る神経系の疾患には、軸索の切断、ニューロンの減少もしくは変性、または脱髄のいずれかを引き起こす、神経系損傷および疾患、障害および／または状態が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って、患者（ヒト患者および非ヒト哺乳動物患者を含む）において治療され得る神経系病変には、以下の中枢神経系（脊髄、脳を含む）または末梢神経系のいずれかの病変が挙げられるが、これらに限定されない：（１）虚血病変（ここで、神経系の一部における酸素不足により、ニューロンの損傷または死が生じ、これには大脳梗塞もしくは虚血、または脊髄梗塞もしくは虚血が挙げられる）、（２）外傷病変（身体的損傷により生じるかまたは手術に関連する病変、例えば、神経系の一部分を切断する病変、または圧縮損傷を含む）、（３）悪性病変（ここで、神経系の一部分は、神経系関連悪性疾患もしくは非神経系組織由来の悪性疾患のいずれかである悪性組織により破壊または損傷される）、（４）感染性病変（ここで、神経系の一部分は、例えば、膿瘍による感染の結果として、破壊または損傷されるか、あるいはヒト免疫不全ウイルス、帯状ヘルペスもしくは単純ヘルペスウイルスによる感染と関連するか、ライム病、結核、梅毒に関連する）、（５）変性病変（ここで、神経系の一部分は、変性プロセスの結果として破壊または損傷され、これには、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン病または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する変性が挙げられるが、これらに限定されない）、（６）栄養性の疾患、障害および／または状態に関連する病変（ここで、神経系の一部分は、栄養障害または代謝障害によって破壊または損傷され、これには、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ヴェルニッケ病、タバコ−アルコール弱視、マルキアファーヴァ−ビニャーミ病（脳梁の１次変性）およびアルコール小脳変性が挙げられるが、これらに限定されない）、（７）全身性疾患に関連する神経性病変（糖尿病（糖尿病性ニューロパシー、ベル麻痺）、全身性エリテマトーデス、癌または類肉腫症が挙げられるが、これらに限定されない）、（８）毒性物質（アルコール、鉛または特定の神経毒を含む）により生じる病変、ならびに（９）脱髄性病変（ここで、神経系の一部分は、脱髄性執権によって破壊または損傷され、これには、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄障害、横断脊髄障害または種々の病因、進行性多病巣性白質脳障害、および橋中央ミエリン溶解が挙げられるが、これらに限定されない）。

一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、低酸素症の損傷効果から神経細胞を保護するために用いられる。さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大脳低酸素症の損傷作用から神経細胞を保護するために用いられる。この実施形態によると、本発明の組成物は、大脳低酸素症に関連する神経細胞損傷を治療または予防するために用いられる。この実施形態の１つの非限定な態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大脳虚血に伴う神経細胞損傷を治療または予防するために用いられる。この実施形態の別の非限定な態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大脳梗塞に伴う神経細胞損傷を治療または予防するために用いられる。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、脳卒中に伴う神経細胞損傷を治療または予防するために用いられる。具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、脳卒中に伴う大脳神経細胞損傷を治療または予防するために用いられる。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、心臓発作に伴う神経細胞損傷を治療または予防するために用いられる。具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、心臓発作に伴う大脳神経細胞損傷を治療または予防するために用いられる。

神経系障害を治療または予防するのに有用な本発明の組成物は、ニューロンの生存または分化の促進における生物学的活性について試験することによって、選択され得る。例えば、制限する目的ではないが、以下の効果のいずれかを誘発する本発明の組成物は、本発明によると有用であり得る。（１）低酸素または低酸素状態の存在または非存在下のいずれかの媒地におけるニューロンの増加した生存時間、（２）培地または体内におけるニューロンの増加した出芽、（３）培地または体内におけるニューロン関連分子（例えば、運動ニューロンに関して、コリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンステラーゼ）の増加した産生、あるいは（４）体内におけるニューロン機能障害の軽減した症状。このような効果は、当該分野で既知の任意の方法によって測定され得る。好ましくは、非制限的な実施形態において、ニューロンの増加した生存時間は、本明細書中に記載される方法、またはそうでなければ当該分野で既知の方法（例えば、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９７：３６３７−４２（２０００）、または、Ａｒａｋａｗａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：３５０７−３５１５（１９９０）など）を使用して慣用的に測定され得、ニューロンの増加した出芽は、当該分野で既知の方法（例えば、Ｐｅｓｔｒｏｎｋｅｔａｌ．、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０：６５−８２（１９８０）またはＢｒｏｗｎｅｔａｌ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：１７−４２（１９８１）に記載される方法）によって検出され得、ニューロン関連分子の増加した産生は、当該分野で既知の技術を使用し、測定されるべき分子に基づいて、バイオアッセイ、酵素アッセイ、抗体結合、ノーザンブロットアッセイなどによって、測定され得、そして運動ニューロンの機能障害は、運動ニューロン障害の物理的発現（例えば、弱さ、運動ニューロンの伝導速度、または機能障害）を評価することによって、測定され得る。

具体的な実施形態において、本発明に従って治療され得る運動ニューロンの障害には、運動ニューロンおよび神経系の他の成分に影響を与え得る障害（例えば、梗塞、感染、毒素への曝露、外傷、外科的損傷、変性疾患、または悪性疾患）、ならびにニューロンに選択的に影響する障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症）が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこれには、進行性脊髄性筋萎縮症、進行性球延髄麻痺、原発性側索硬化症、小児筋萎縮および若年性筋萎縮、小児期の進行性球麻痺（ファチオ−ロンデ病）、ポリオおよびポリオ後症状、ならびに遺伝性運動感覚性神経障害（シャルコー−マリー−トゥース病）が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ニューロン生存、シナプス形成、伝達、神経分化などにおいて役割を果たし得る。したがって、本発明の組成物（本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む）は、学習および／または認識の障害を含むがこれに限定されない、これらの役割に関連する疾患または障害を、診断、および／または治療または予防するのに用いられ得る。本発明の組成物は、神経変性性疾患状態および／または行動障害の治療または予防において有用であり得る。このような神経変性性疾患状態および／または行動障害としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ツレット症候群、精神分裂病、躁病、痴呆、偏執症、強迫性障害、鬱病、恐慌性障害、学習障害、ＡＬＳ、精神病、自閉、および行動変化（栄養補給、睡眠パターン、平衡、および知覚の障害を含む）。さらに、本発明の組成物は、発生中の胚、または伴性障害に関連する発生の障害の治療、予防および／または検出において役割を果たし得る。

さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を含むが挙げられるがこれらに限定されない脳血管障害に伴う、疾患、傷害、障害または、損傷から、神経細胞を防御するのに有用であり得る。脳血管障害（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄またはモヤモヤ病）、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、脳低酸素症、大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、脳塞栓症および血栓（例えば、頸動脈血栓症、洞血栓症およびヴァレンベルク症候群）、硬膜上血腫（例えば、硬膜外血腫または硬膜下血腫およびクモ膜下出血）、脳亀裂骨折、脳虚血（例えば、一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群、または椎骨脳底不全（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ））、血管性痴呆（たとえば、多発脳梗塞性痴呆）、脳室周囲白質軟化症、ならびに血管性頭痛（例えば、群発性頭痛）。
本発明のなお、さらなる態様によれば、治療目的で、例えば神経学的細胞増殖および／または分化を刺激するために、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロセスが提供される。したがって、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、神経学的疾患を治療、および／または検出するために用いられ得る。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の神経系疾患または傷害のマーカーまたは検出因子として用いられ得る。

本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出され得る神経学的疾患の例としては、以下が挙げられる。脳疾患（例えば、母系フェニルケトン尿症のようなフェニルケトン尿症を含む代謝性脳疾患）、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠乏症、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠乏症、ヴェルニッケ脳障害、脳水腫、テント下（ｉｎｆｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ）新生物を含む小脳性新生物のような脳新生物、脈絡叢新生物のような脳室新生物、視床下部性新生物、テント上新生物、キャナヴァン病、毛細血管拡張性運動失調のような脊髄小脳性退化を含む小脳性運動失調のような小脳疾患、小脳性共同運動障害、フリードライヒ失調症、マチャド−ジョセフ病、オリーブ橋小脳萎縮、テント下新生物のような小脳性新生物、びまん性軸周囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症および亜急性硬化性汎脳炎のようなびまん性脳硬化。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる。脳血管障害（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄およびモヤモヤ病を含む頸動脈疾患）、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、頸動脈血栓症、洞血栓症およびヴァレンベルク症候群のような脳塞栓症および血栓症、硬膜上血腫、硬膜下血腫およびクモ膜下出血のような脳出血、脳亀裂骨折、一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群および椎骨脳底不全（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような脳虚血、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴呆、脳室周囲白質軟化症、群発性頭痛のような血管性頭痛。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出され得るさらなる神経学的疾患としては以下が挙げられる。ＡＩＤＳ痴呆複合症のような痴呆症、アルツハイマー病およびクロイツフェルト−ヤーコプ病のような初老期痴呆、アルツハイマー病および進行性核上性麻痺のような老年痴呆、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴呆、びまん性軸周囲性脳炎のような脳炎、流行性脳炎、日本脳炎、セントルイス脳炎、マダニ媒介性脳炎および西ナイル熱のようなウイルス性脳炎、急性播種性脳脊髄炎、ブドウ膜髄膜炎症候群、脳炎後パーキンソン病および亜球性硬化性汎脳炎のような髄膜脳脊髄炎、室周白斑症のような脳軟化症、点頭痙攣を含む全身てんかんのようなてんかん、アプサンスてんかん（ａｂｓｅｎｃｅｅｐｉｌｅｐｓｙ）、ＭＥＲＲＦ症候群を含むミオクローヌスてんかん、強直・間代てんかん、複雑部分てんかん、前頭葉てんかんおよび側頭葉てんかんのような部分てんかん、外傷後てんかん、持続性部分てんかんのようなてんかん重積持続状態、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる。ダンディ−ウォーカー症候群および正常圧水頭症のような水頭症、視床下部性新生物のような視床下部性疾患、大脳マラリア、脱力発作を含むナルコレプシー、延髄ポリオ（ｂｕｌｂａｒｐｏｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、大脳偽腫瘍、レット症候群、ライ症候群、視床疾患、大脳トキソプラスマ症、頭蓋内結核腫およびツェルヴェーガー症候群、ＡＩＤＳ痴呆複合症のような中枢神経系感染、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、ウマの脳脊髄炎のような脳脊髄炎、ベネズエラウマ脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、ビスナ、ならびに大脳マラリア。

本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる。クモ膜炎のような髄膜炎、リンパ球性脈絡髄膜炎を含むウイルス性髄膜炎のような無菌性髄膜炎、ヘモフィルス髄膜炎を含む細菌性髄膜炎、リステリア髄膜炎、ウォーターハウス−フリーデリックセン症候群のような髄膜炎菌性脳脊髄膜炎、肺炎球菌髄膜炎および髄膜結核症、クリプトコックス髄膜炎のような真菌性髄膜炎、硬膜下滲出、ブドウ膜髄膜脳炎症候群のような髄膜脳炎、横行脊髄炎（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅｍｙｅｌｉｔｉｓ）のような脊髄炎、脊髄ろうのような神経梅毒、延髄ポリオおよびポリオ後症候群を含むポリオ、プリオン病（例えば、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ウシの海綿状脳症、ゲルストコン−シュトロイスラー症候群、クールー、スクラピー）、ならびに大脳トキソプラスマ症。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる。テント下新生物のような小脳性新生物を含む脳新生物のような中枢神経系新生物、脈絡叢新生物、視床下部性新生物およびテント上新生物のような脳室新生物、髄膜新生物、硬膜外新生物を含む脊髄新生物、キャナヴァン病のような脱髄疾患、副腎脳白質ジストロフィーを含むびまん性大脳硬化症（ｄｉｆｆｕｓｅｃｅｒｅｂｒａｌｓｃｅｌｏｒｉｓ）、びまん性軸周囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症のようびまん性大脳硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、多発性硬化症、橋中央ミエリン溶解、横行脊髄炎、視神経脊髄炎、スクラピー、脊柱前弯症、慢性疲労症候群、ビスナ、高圧神経質症候群（ＨｉｇｈＰｒｅｓｓｕｒｅＮｅｒｖｏｕｓＳｙｎｄｒｏｍｅ）、髄膜症、先天性筋無緊張症のような脊髄疾患、筋萎縮性側索硬化症、ヴェルドニッヒ−ホフマン病のような棘筋萎縮、脊髄圧搾、硬膜外新生物のような脊髄新生物、脊髄空洞症、脊髄ろう、スティッフマン症候群、母親由来１５ｑ‐１３微少欠損のような精神遅滞、ネコ鳴き症候群、ド・ランゲ症候群、ダウン症候群、ガングリオシドーシスＧ（Ｍ１）のようなガングリオシドーシス、ザントホフ病、テイ−サックス病、ハートナップ病、ホモシスチン尿症、ローレンス−ムーン−ビードル症候群、レッシュ−ナイハン症候群、カエデシロップ尿病、フコース蓄積症のようなムコリピドーシス、ニューロンセロイド脂褐素沈着症、眼脳腎症候群、母系フェニルケトン尿のようなフェニルケトン尿症、プラーダー−ヴィリ症候群、レット症候群、ルービンスタイン−テービ症候群、結節硬化症、ＷＡＧＲ症候群、全前脳症のような神経系異常、水無能症（ｈｙｄｒａｎｇｅｎｃｅｐｈａｌｙ）を含む無能症のような神経管不全、アルノルト−キアーリ奇形、脳ヘルニア、髄膜瘤、髄膜脊髄瘤、嚢胞性二分脊椎および潜在性二分脊椎のような脊髄癒合不全。

本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる。シャルコー−マリー疾患を含む遺伝性の運動および感覚ニューロン障害、遺伝性視覚萎縮症、レフスム病、遺伝性痙性対麻痺、ヴェルドニッヒ−ホフマン病、先天性痛覚脱失症および家族性自律神経障害のような遺伝性感覚および自律性ニューロパシー、神経学的症状発現（例えば、ゲルストマン症候群を含む失認）、逆向性健忘症のような健忘症、失行症、神経因性膀胱、脱力発作、難聴、部分聴覚欠失、大声（ｌｕｄｎｅｓｓ）レクルートメントおよび耳鳴を含む聴覚障害のような情報伝達障害、失書症、名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症のような言語障害、急性失読症のような失読症、言語発育障害、名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症のような発語障害、蓄積障害、構語障害、反響言語、無言症およびどもりを含む発語障害のような情報伝達障害、失声症および嗄声のような発声障害、除脳硬直状態、せん妄、線維束性攣縮、幻覚、髄膜症、母親由来１５ｑ‐１３微少欠損、運動失調、アテトーシス、舞踏病、失調症、運動低下症、筋肉緊張低下、ミオクローヌス、チック、斜頸および振せんのような運動障害、スティッフマン症候群のような筋肉硬直のような筋肉緊張亢進、筋肉痙性、耳帯状疱疹を含む顔面神経麻痺のような神経麻痺、胃不全麻痺、片麻痺、複視のような眼筋麻痺、デュエーン症候群、ホルナー症候群、キーンズ症候群のような慢性進行性外眼筋麻痺症、球麻痺、熱帯性痙攣不全対麻痺、ブラウン−セカール症候群、四肢麻痺、呼吸麻痺および声帯麻痺のような対麻痺、不全麻痺、幻肢、無味覚症および味覚不全のような味覚障害、弱視、失明、色覚異常、複視、半盲、視野暗点および準正常視覚（ｓｕｂｎｏｒｍａｌｖｉｓｉｏｎ）のような視覚障害、クライネ−レヴィン症候群、不眠症および夢遊症を含む過眠症のような睡眠障害、開口障害のような痙縮、昏睡、持続性植物状態および失神およびめまいのような意識消失、先天性筋無緊張症のような神経筋疾患、筋萎縮性側索硬化症、ランバート−イートン筋無力症症候群、運動神経疾患、棘筋萎縮、シャルコー−マリー疾患およびヴェルドニッヒ−ホフマン病のような筋萎縮、後ポリオ症候群、筋ジストロフィー、重症筋無力症、萎縮性筋緊張症、先天性筋緊張症、ネマリンミオパシー、家族性期性四肢麻痺、多発性パラミロクローヌス（ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰａｒａｍｙｌｏｃｌｏｎｕｓ）、熱帯性痙攣不全対麻痺およびスティッフマン症候群、先端肢端疼痛症のような末梢神経系疾患、腎アミロイドーシス、アーディー症候群、Ｂａｒｒｅ−Ｌｉｅｏｕ症候群、家族性自律神経障害、ホルナー症候群、反射性交感神経性ジストロフィーおよびシャイ−ドレーガー症候群のような自律神経系疾患、神経線維腫症２を含む聴神経腫のような内耳神経疾患のような脳神経疾患、顔面神経痛のような顔面神経疾患、メルカーソン−ローゼンタール症候群、弱視を含む眼球運動性障害、眼振、眼球運動麻痺、デュエーン症候群のような眼筋麻痺、ホルナー症候群、キーンズ症候群を含む慢性進行性外眼筋麻痺症、内斜視および外斜視のような斜視、動眼神経麻痺、遺伝性眼萎縮症を含む眼萎縮症のような眼神経疾患、視神経円板結晶腔、視神経脊髄炎のような視神経炎、乳頭水腫、三叉神経痛、声帯麻痺、視神経脊髄炎および脊柱前弯症のような脱髄疾患、糖尿病性足のような糖尿病性ニューロパシー。

本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる。手根管症候群のような神経圧搾症候群、足根管症候群、頸肋症候群のような胸郭出口症候群、尺骨神経圧搾症候群、カウザルギー、頸腕神経痛、顔面神経痛および三叉神経痛のような神経痛、実験的アレルギー性神経炎、眼神経炎、多発性神経炎、多発性神経根神経炎および神経根炎（例えば、多発性神経根炎、遺伝性運動および感覚ニューロパシー（例えば、シャルコー−マリエ疾患、遺伝性眼萎縮症、レフサム病、遺伝性痙性対麻痺およびヴェルドニッヒ−ホフマン病、遺伝性感覚および自律神経ニューロパシー（先天性痛覚脱失および家族性自律神経障害を含む）、ＰＯＥＭＳ症候群、坐骨神経痛、味覚性発汗症候群およびテタニー））のような神経炎。
内分泌障害

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、ホルモンアンバランスに関連する障害および／または疾患、ならびに／あるいは内分泌系の障害または疾患を治療、予防、診断、および／または予後し得る。
内分泌系の腺により分泌されるホルモンは、身体発育、性的機能、代謝、および他の機能を制御する。障害は、ホルモンの産生における障害、およびホルモンに応答する組織の不全の、２つに分類される。これらのホルモンアンバランスおよび内分泌系疾患、障害または状態の病因は、遺伝的、体細胞性（例えば、癌およびいくつかの自己免疫疾患）、後天性（例えば、化学治療、損傷または毒素によって）、または感染性であり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内分泌系および／またはホルモンアンバランスに関連する特定の疾患または障害のマーカーまたは検出因子として使用され得る。

分泌系および／またはホルモンアンバランスおよび／または疾患は、子宮運動の障害を含み、これには以下が挙げられるが、これらに限定されない：妊娠および分娩時の合併症（例えば、早期分娩、過期妊娠、自然流産、ならびに遅延分娩および停止した分娩）、ならびに月経周期の障害および／または疾患（例えば、月経困難症および子宮内膜症）。
内分泌系および／またはホルモンアンバランス障害および／または疾患としては、膵臓の障害および／または疾患（例えば、真性糖尿病、尿崩症、先天性白内障欠損、褐色細胞腫−島細胞腫瘍症候群）、副腎の障害および／または疾患（例えば、アディソン病、コルチコステロイド欠損、男性化作用疾患、多毛症、クッシング症候群、高アルドステロン症、褐色細胞腫）、下垂体の障害および／または疾患（例えば、下垂体機能亢進症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、下垂体腺腫、汎下垂体機能低下症、先端巨大症、巨人症）、甲状腺の障害および／または疾患（甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、プラマー病、グレーヴズ病（毒性散在甲状腺腫）、毒性小結節甲状腺種、甲状腺炎（橋本甲状腺炎、亜急性肉芽腫性甲状腺炎、およびサイレントリンパ球性甲状腺炎）、ペンドレッド症候群、粘液水腫、クレチン病、甲状腺中毒症、甲状腺ホルモン縮合障害、チミン形成不全症、甲状腺のヒュルトレ細胞腫瘍、甲状腺癌、甲状腺悪性腫瘍、髄様甲状腺癌が挙げられるが、これらに限定されない）、副甲状腺の障害および／または疾患（例えば、上皮小体機能亢進症、上皮小体機能低下症）、視床下部の障害および／または疾患。

さらに、内分泌系および／またはホルモンアンバランス障害および／または疾患はまた、癌を含む精巣または卵巣の障害および／または疾患を含み得る。他の精巣または卵巣の障害および／または疾患としては、例えば、卵巣癌、多嚢胞性卵巣症候群、クラインフェルター症候群、バニシング精巣症候群（両側性無精巣）、ライディヒ細胞先天性欠損、潜伏精巣症、ヌーナン症候群、筋緊張性ジストロフィー、精巣の毛細血管種（良性）、精巣の新形成および新精巣がさらに挙げられる。
さらに、内分泌系および／またはホルモンアンバランス障害および／または疾患はまた、例えば、多内分泌腺機能低下症候群、褐色細胞腫、神経芽細胞腫、多発性内分泌腺腫症、ならびに内分泌組織の障害および／または癌を含み得る。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質が発現される組織に関連する内分泌疾患および／または障害を診断、予後、予防および／または治療するために使用され得る。
生殖器系障害

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、生殖器系の疾患および／または障害を診断、治療または予防するために使用され得る。本発明の組成物によって治療され得る生殖器系の障害としては、生殖器損傷、感染、腫瘍性障害、先天性欠損、および不妊症を生じる疾患または障害、妊娠、分娩または出産の合併症、および出産後の困難が挙げられるが、これらに限定されない。
生殖器系障害および／または疾患としては、以下を含む精巣の疾患および／または障害が挙げられる。精巣萎縮症、精巣性女性化症候群、潜在精巣症（片側および両側）、無精巣症、異所性精巣、精巣上体および／または耳下腺性精巣（典型的に、感染（例えば、淋疾、おたふくかぜ、結核、および梅毒）から生じる）、精巣捻転症、結節性精管炎、生殖細胞腫瘍（例えば、精上皮腫、胎児性細胞癌、奇形癌、絨毛癌、卵黄嚢腫瘍、奇形腫）、支質腫瘍（例えば、ライディヒ細胞腺腫）、水瘤、血種、精索静脈瘤、精液瘤、鼡径ヘルニア、および精液産生の障害（例えば、線毛不動症候群、無精液症、精子無力症、無精子症、精子過少症、奇形精子症）。

生殖器系障害としてはまた、例えば以下のような前立腺の障害が挙げられ得る。急性非細菌性前立腺炎、慢性非細菌性前立腺炎、急性細菌性前立腺炎、慢性細菌性前立腺炎、前立腺膀胱炎、前立腺症、肉芽腫性前立腺炎、マラコプラキア、良性前立腺肥大または肥厚、および前立腺腫瘍性障害（腺癌をふくむ）、移行上皮癌、腺管癌、および扁平上皮癌。
さらに、本発明の組成物は、以下を含む陰茎または尿道の障害または疾患の診断、治療および／または予防において有用である。炎症性障害（例えば、亀頭包皮炎、閉塞性乾燥性亀頭炎、包茎、嵌頓包茎、梅毒、単純疱疹ウイルス、淋疾、非淋菌性尿道炎、クラミジア、マイコプラスマ、トリコモナス、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、ライター症候群、尖圭コンジローム、扁平コンジローム、および真珠陰茎丘疹）、尿道障害（例えば、尿道下裂、尿道上裂、および包茎）、前悪性病巣（ケーラー紅色肥厚症、ボーエン病、ボーエノイド・バピュローシス、ブシュケ−レーヴェンシュタインの巨大コンジローム、およびいぼ状癌を含む）、陰茎癌（扁平上皮癌、インサイチュにおける癌、いぼ状癌、および播種性陰茎癌を含む）、尿道新形成障害（尿道海綿体癌、球海綿体筋尿道癌、および尿道前立腺部癌を含む）、ならびに勃起障害（例えば、プリアピスム、ペーロニー病、勃起不全、およびインポテンス）。

さらに、精管の疾患および／または障害としては、脈管炎およびＣＢＡＶＤ（精管の先天性両側性欠損）が挙げられ、さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、精嚢の疾患および／または障害（包虫症、先天性塩化物下痢、および多発性嚢胞腎疾患を含む）を診断、治療および／または予防するために使用され得る。
他の男性生殖器系の障害および／または疾患としては、例えば、クラインフェルター症候群、ヤング症候群、早漏、真性糖尿病、嚢胞性線維症、カルタゲナー症候群、高熱、多発性硬化症、および女性型乳房が挙げられる。
さらに、ポリヌクレオチド、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を含む膣および外陰の疾患および／または障害の診断、治療および／または予防において使用され得る。細菌性腟炎、カンジダ膣炎、単純疱疹ウイルス、軟性下疳、鼡径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、疥癬、ヒト乳頭腫、膣外傷、外陰外傷、腺疾患、クラミジア膣炎、淋疾、腟トリコモナス、尖圭コンジローム、梅毒、伝染性軟属腫、萎縮性腟炎、パジェット病、硬化性萎縮、扁平苔癬、外陰病変、トキシックショック症候群、腟痙、外陰腟炎、外陰腟前庭炎、および新形成障害（例えば、扁平上皮過形成、腎臓明細胞癌、基底細胞癌、黒色腫、バルトリン腺の癌、および外陰上皮新形成）。

子宮の障害および／または疾患としては、以下が挙げられる。月経困難症、後傾子宮、子宮内膜症、フィブロイド、腺筋症、無排卵性出血、無月経、クッシング症候群、胞状奇胎、アッシェルマン症候群、早期閉経、性的早熟、子宮ポリープ、機能不全性不正子宮出血（例えば、迷走ホルモンシグナルに起因する）、および新形成障害（例えば、腺癌、平滑筋肉腫、および肉腫）。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下のような子宮異常のマーカーまたはディテクターとして、ならびに子宮異常の診断、治療および／または予防において有用であり得る。双角子宮、中隔子宮、単角子宮、非空腔性不全角を有する単角子宮、非交通空腔不全角を有する単角子宮、交通空腔角を有する単角子宮、弓状子宮、子宮二空洞およびＴ型子宮。
卵巣疾患および／または障害としては、以下が挙げられる。無排卵、多嚢胞性卵巣（スタイン−リーヴェンサール症候群）、卵巣嚢胞、卵巣機能不全、ゴナドトロピンに対して非感受性の卵巣、アンドロゲンの卵巣過剰産生、右卵巣静脈症候群、無月経、多毛症、および卵巣癌（１次および２次癌増殖、セルトリ−ライディヒ腫瘍、卵巣の類内膜癌、卵巣乳頭漿液性腺癌、卵巣粘液性腺癌、および卵巣クルーケンベルク腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない）。

頸部疾患および／または障害としては、以下が挙げられる。子宮頸管炎、慢性子宮頸管炎、粘液膿性子宮頸管炎、子宮頸部形成異常、頸部ポリープ、ナーボト嚢胞、頸部びらん、頸部機能不全、および頸部新形成（例えば、頸部癌、扁平化生、扁平上皮癌、腺扁平上皮細胞新形成および円柱細胞新形成を含む）。
さらに、生殖器系の疾患および／または障害としては、以下を含む妊娠の障害および／または疾患が挙げられる。流産および死産（例えば、早期流産、晩期流産、自然流産、人工流産、治療的流産、切迫流産、稽留流産、不全流産、完全流産、習慣性流産、稽留流産、および敗血性流産）、異所性妊娠、貧血、Ｒｈ不適合、妊娠中の膣出血、妊娠糖尿病、子宮内発育遅延、羊水過多症、ＨＥＬＬＰ症候群、常位胎盤早期剥離、前置胎盤、悪阻、子かん前症、子かん、妊娠性ヘルペス、および妊娠時のじんま疹。さらに、本発明のポリヌクレオチド、ポリオペプチド、およびアゴニストまたはアンタゴニストは、以下を含む妊娠を複雑にし得る疾患を診断、治療および／または予防するために使用され得る。心臓疾患、心不全、リウマチ性心疾患、先天性心疾患、僧帽弁逸脱症、高血圧、貧血、腎臓疾患、感染症（例えば、風疹、サイトメガロウイルス、トキソプラスマ症、感染性肝炎、クラミジア、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、および陰部ヘルペス）、真性糖尿病、グレーヴズ病、甲状腺炎、甲状腺機能低下症、橋本甲状腺炎、慢性活動性肝炎、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、ぜん息、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、虫垂炎、卵巣嚢胞、胆嚢障害、および腸の閉塞症。

分娩および出産に伴う合併症としては、膜の早期破裂（ｐｒｅｍａｔｕｒｅｒｕｐｔｕｒｅｏｆｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅｓ）、早産、後期妊娠（ｐｏｓｔ−ｔｅｒｍｐｒｅｇｎａｎｃｙ）、過熟妊娠、非常に遅く進行する分娩（ｌａｂｏｒｔｈａｔｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｔｏｏｓｌｏｗｌｙ）、胎児仮死（例えば、異常な心拍数（胎児性または母性）、呼吸の問題、および異常な胎児位置）、肩甲難産、臍帯脱出症、羊水塞栓症、および異常な子宮の出血が、挙げられる。
さらに、分娩期後の疾患および／または障害としては、子宮内膜炎、子宮筋層炎、子宮傍結合組織炎、腹膜炎、骨盤血栓性静脈炎、肺動脈塞栓症、内毒素血症、腎盂腎炎、伏在性血栓性静脈炎、乳腺炎、膀胱炎、分娩後出血、および反転性子宮（ｉｎｖｅｒｔｅｄｕｔｅｒｕｓ）が挙げられる。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより診断、治療、および／または予防され得る雌性生殖器系の他の障害ならびに／または疾患としては、例えば、ターナー症候群、偽半陰陽、月経前緊張症候群、骨盤炎症性疾患、骨盤うっ血（ｐｅｌｖｉｃｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ）（血管充血（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｇｏｒｇｅｍｅｎｔ））、不感症、無オルガスム症、性交疼痛症、破裂性（ｒｕｐｔｕｒｅｄ）ファローピウス管、および中間痛が挙げられる。
感染性疾患

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、感染因子を治療または検出するするために使用され得る。例えば、免疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させることによって、感染性疾患が治療され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇され得る。あるいは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、必ずしも免疫応答を誘発することなく、感染因子を直接阻害し得る。

ウイルスは、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより治療または検出され得る疾患または症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるがこれらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング熱、ＥＢＶ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイルス、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイルスは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る。関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸性シンシチウムウイルス、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎Ｂ型、アルゼンチン出血熱、チングニア、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、任意のこれらの症状または疾患が治療または検出され得る。具体的な実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下の治療に使用される。髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および／または肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。さらなる具体的な実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１以上の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を治療するために使用される。さらに具体的な実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＡＩＤＳまたはＨＩＶ、または肝炎の感染（例えば、慢性Ｃ型肝炎感染）を治療するために使用される。

同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療または検出され得る細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグラム陰性およびグラム陽性細菌および細菌科ならびに真菌を含むがこれらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｓｉｓ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｎｄｉｄｉａ、Ｃａｍｐｙｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ）Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｄｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、大腸菌（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ大腸菌およびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ大腸菌）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、ＨｅａｍｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザＢ型）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｅｐｒａｅおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ（例えば、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｐｐ．、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａｓｐｐ．）、Ｓｈｉｇｅｌｌａｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ、ＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＡ群、Ｂ群およびＣ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびＵｒｅａｐｌａｓｍａｓ。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き起こし得る。抗生物質耐性の感染、菌血症、心内膜炎、敗血症、眼感染症（例えば、結膜炎）、ブドウ膜炎、結核、歯肉炎、細菌性の下痢、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、虫歯、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、セプシス、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、レジオネラ症、慢性炎および急性炎、紅斑、酵母感染、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病、ブルセラ病、消化性潰瘍、炭疽、自然流産、出生時欠損、肺炎、肺の感染、難聴、失明、傾眠、倦怠、嘔吐、慢性下痢、クローン病、大腸炎、腟の病気、不妊症、骨盤炎症性疾患、カンジタ症、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症、ｎｏｓｃｏｍｉａｌ感染。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、任意のこれらの症状もしくは疾患を治療または検出し得る。具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を治療するために使用される。破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および／またはＢ型髄膜炎。

さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより治療、予防および／または診断され得る、寄生生物性因子が引き起こす疾患または症状としては以下のファミリーまたはクラスが挙げられるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物性、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマニア症、住血吸虫症（Ｓｃｈｉｓｔｉｓｏｍａ）、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）症、ならびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏａｎ）（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ、ＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｏｖａｌｅ）。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る。疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、任意のこれらの症状または疾患を治療、予防および／または診断し得る。具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、マラリアを治療、予防および／または診断するために使用される。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、患者に有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質を投与するか、または患者から細胞を取り出して、本発明のポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして操作した細胞を患者に戻す（体外治療）かのいずれかによるものであり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはワクチン中の抗原として使用されて、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
再生

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、細胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して、組織の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：５９−８７（１９９７）を参照のこと）。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害、もしくは全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を修復、置換、または保護し得る。
本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる。器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、血管系（血管およびリンパ管を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱、および靭帯）の組織。ある実施形態では、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減されて生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。

さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、治癒するのが困難な組織の再生を増加させ得る。例えば、腱／靭帯の再生を増大させることによって、損傷後の回復時間が早まる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、損傷を回避する試みにおいて予防的に使用され得る。治療され得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。非治癒創傷の組織再生のさらなる例としては、褥瘡性潰瘍、脈管不全、外科的創傷、および外傷性創傷に関連する潰瘍が挙げられる。
同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるために本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用することによって再生され得る。本方法を用いて治療され得る疾患としては、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患、神経障害、または機械的および外傷性の障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（ｓｔｏｋｅ））が挙げられる。詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神経障害（例えば、化学療法または他の医学的療法から生じる）、局在神経障害、および中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）は全て、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療、予防および／または診断され得る。
胃腸障害

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、炎症性疾患および／または状態、感染、癌（例えば、腸の新生物（小腸のカルチノイド類癌腫、小腸の非ホジキンリンパ腫、小腸のリンパ腫））、および潰瘍（例えば、消化性潰瘍）を含む胃腸傷害を治療、予防、診断、および／または予後を判定し得る。
胃腸障害として、えん下困難、えん下痛、食道の炎症、消化性食道炎、胃逆流（ｇａｓｔｒｉｃｒｅｆｌｕｘ）、粘膜下線維症および狭窄、マロリー−ヴァイス病変、平滑筋腫、脂肪腫、表皮癌、腺癌、胃の遺残障害、胃腸炎、胃の萎縮症、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）／胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、胃のポリープ、悪性貧血のような自己免疫疾患、幽門狭窄症、胃炎（細菌性、ウイルス性、好酸性、ストレス誘導性、慢性びらん性、萎縮性、プラスマ細胞、およびメネトリエ病）、および腹膜疾患（例えば、乳び腹水、腹腔内出血、腸管膜嚢、腸間膜リンパ節炎、腸管膜血管閉塞、皮下脂肪組織炎、新生物、腹膜炎、気腹、乳児横隔膜膿瘍（ｂｕｂｐｈｒｅｎｉｃａｂｓｃｅｓｓ））が挙げられる。

胃腸障害としてはまた、小腸に関連する障害（例えば、吸収不良症候群、膨満、過敏性腸症候群（ｉｒｒｉｔａｂｌｅｂｏｗｅｌｓｙｎｄｒｏｍｅ）、糖不耐性、腹腔疾患、十二指腸潰瘍、十二指腸炎、熱帯性スプルー、ホウィップル病、腸リンパ管拡張症、クローン病、虫垂炎、回腸の便秘、メッケル憩室、複数の憩室（ｍｕｌｔｉｐｌｅｄｉｖｅｒｔｉｃｕｌａ）、小腸および大腸の完全な回旋不全、リンパ腫）、ならびに細菌性および寄生虫性疾患（例えば、旅行者下痢、チフスおよびパラチフス、コレラ、回虫（Ａｓｃａｒｉａｓｉｓｌｕｍｂｒｉｃｉｄｅｓ）、鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、線虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、条虫類（Ｔａｅｎｉａｓａｇｉｎａｔａ）、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍｓｐｐ．、およびＴ．ｓｏｌｉｕｍによる感染）が挙げられる。

肝臓疾患および／または障害として、肝臓内胆汁うっ滞（アラギール（ａｌａｇｉｌｌｅ）症候群、胆汁性肝硬変）、脂肪肝（アルコール性脂肪肝、ライ症候群）、肝静脈血栓症、ヘパトレントリキュラー（ｈｅｐａｔｏｌｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）変性、肝腫、肝肺症候群、肝腎症候群、門脈圧亢進症（食道静脈瘤および胃静脈瘤）、肝膿瘍（アメーバ性肝膿瘍）、肝硬変（アルコール性、胆汁および実験的）、アルコール性肝疾患（脂肪肝、肝炎、肝硬変）、寄生虫性（肝性エキノコックス症、肝蛭症、アメーバ性肝膿瘍）、黄疸（溶血性、肝細胞性、および胆汁うっ滞性）、胆汁うっ滞、門脈圧亢進症、肝肥大、腹水、肝炎（アルコール性肝炎、動物性肝炎、慢性肝炎（自己免疫性、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、薬物誘導性）、毒性肝炎、ウイルス性ヒト肝炎（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎）、ウィルソン病、肉芽腫性肝炎、２次性胆汁性肝硬変（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｂｉｌｉａｒｙｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝性脳障害、門脈圧亢進症、静脈瘤、肝性脳障害、１次性胆汁性肝硬変（ｐｒｉｍａｒｙｂｉｌｉａｒｙｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、原発性硬化性胆管炎、肝細胞腺腫、血管腫、胆汁石、肝不全（肝性脳障害、急性肝不全）、および肝性新生物（ｌｉｖｅｒｎｅｏｐｌａｓｍｓ）（血管筋脂肪腫、石灰化肝転移（ｃａｌｃｉｆｉｅｄｌｉｖｅｒｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）、嚢胞性肝転移、上皮腫瘍、線維層板肝細胞癌（ｆｉｂｒｏｌａｍｅｌｌａｒｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、病巣結節過形成（ｆｏｃａｌｎｏｄｕｌａｒｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、肝細胞腺腫、血性胆汁嚢胞腺腫（ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙｃｙｓｔａｄｅｎｏｍａ）、胚芽腫、肝細胞癌、肝癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、肝癌（ｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ）、肝臓血管内皮腫、間葉過誤腫（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｈａｍａｒｔｏｍａ）、肝臓の間葉腫瘍、結節再生過形成（ｎｏｄｕｌａｒｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、良性肝癌（肝嚢胞（単純嚢胞（Ｓｉｍｐｌｅｃｙｓｔ）、多嚢胞性肝疾患、血性胆汁嚢胞腺腫（Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙｃｙｓｔａｄｅｎｏｍａ）、総胆管嚢胞）、間葉腫瘍（間葉過誤腫、乳児先天性血管内皮腫、血管腫、肝臓紫斑病、脂肪腫、炎症性偽腫瘍、ミスセラネウス（Ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ））、上皮腫瘍（胆管上皮（胆管過誤腫、胆管腺腫）、肝細胞（腺腫、病巣結節過形成、結節再生過形成））、転移性肝臓腫瘍（肝細胞、胚芽腫、肝細胞癌、胆管細胞（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｅｌｌｕｌａｒ）、胆管癌、嚢胞腺癌、血管の癌、血管肉腫、カポージ肉腫、血管内皮腫、他の腫瘍、胎生期肉腫（ｅｍｂｒｙｏｎａｌｓａｒｃｏｍａ）、線維肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、癌肉腫、奇形腫、カルチノイド、扁平上皮癌、原発性リンパ腫））、肝臓紫斑病、赤芽肝性ポルフィリン症（ｅｒｙｔｈｒｏｈｅｐａｔｉｃｐｏｒｐｈｙｒｉａ）、肝性ポルフィリン症（急性間欠性ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症）、ツェルヴェーガー症候群）が挙げられる。

膵臓疾患および／または障害として、急性膵炎、慢性膵炎（急性壊死膵炎（ａｃｕｔｅｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）、アルコール性膵炎）、新生物（膵臓の腺癌、嚢胞腺癌、インスリノーマ、ガストリノーマ、およびグルカゴノーマ、嚢胞性新生物、島細胞腫瘍、膵臓芽腫（ｐａｎｃｒｅｏｂｌａｓｔｏｍａ）、および他の膵臓疾患（例えば、嚢胞性線維症、嚢胞（膵臓偽嚢胞、膵臓フィステル、不全））が挙げられる。
胆嚢疾患として、胆石（胆石症および総胆管結石症）、胆嚢摘出後症候群、胆嚢の憩室症、急性胆嚢炎、慢性胆嚢炎、胆管腫瘍および涙嚢腫が挙げられる。

大腸の疾患および／または障害として、抗生物質関連大腸炎、憩室炎、潰瘍性大腸炎、後天性巨大結腸、膿瘍、真菌性感染および細菌性感染、肛門直腸疾患（例えば、裂溝、痔）、結腸疾患（大腸炎、結腸新生物（結腸癌（ｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒ）、腺腫様結腸ポリープ（例えば、絨毛腺腫）、結腸癌（ｃｏｌｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）、結腸直腸癌）、結腸憩室炎、大腸憩室、巨大結腸（ヒルシュスプルング病、有害な巨大結腸）、Ｓ状疾患（ｓｉｇｍｏｉｄｄｉｓｅａｓｅｓ）（直腸結腸炎、シグモイン（ｓｉｇｍｏｉｎ）新生物））、便秘症、クローン病、下痢（乳児期下痢、赤痢）、十二指腸疾患（十二指腸新生物、十二指腸閉塞症、十二指腸潰瘍、十二指腸炎）、腸炎（ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）（腸炎（ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｓ））、ＨＩＶ腸症、回腸疾患（回腸新生物、回腸炎）、免疫増殖性小腸疾患、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、腸閉鎖、寄生虫病（アニサキス症、バランチジウム症、ブラストシスティス属感染症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、アメーバ赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、腸フィステル（直腸フィステル）、腸新生物（盲端新生物、結腸新生物、十二指腸新生物、回腸新生物、腸ポリープ、空腸新生物、直腸新生物）、腸閉塞（輸入脚症候群、十二指腸閉塞、楔合便（ｉｍｐａｃｔｅｄｆｅｃｅｓ）、腸偽閉塞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｓｅｕｄｏ−ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）（盲腸捻転）、重積症）、腸閉鎖（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ）、腸ポリープ（結腸ポリープ、ガードナー症候群、ポイツ−ジェガーズ症候群）、空腸疾患（空腸新生物）、吸収不良症候群（盲係蹄症候群、セリアック病（ｃｅｌｉａｃｄｉｓｅａｓｅ）、乳糖不耐症、短腸症候群、熱帯性スプルー、ホウィップル病）、腸間膜血管閉塞（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｖａｓｃｕｌａｒｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、腸壁嚢胞状気腫、蛋白喪失性腸症（腸リンパギエクタシス（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｌｙｍｐｈａｇｉｅｃｔａｓｉｓ））、腸疾患（肛門疾患、便失禁、痔、直腸炎、腸フィステル、脱腸、直腸瘤）、消化性潰瘍（十二指腸潰瘍、消化性食道炎、出血、穿孔、胃潰瘍、ゾリンジャー−エリソン症候群）、胃切除後症候群（ダンピング症候群）、胃障害（例えば、塩酸欠乏症、胃十二指腸の逆流（胆汁逆流）、胃洞血管膨張（ｇａｓｔｒｉｃａｎｔｒａｌｖａｓｃｕｌａｒｅｃｔａｓｉａ）、胃フィステル、胃排出口閉塞（ｇａｓｔｒｉｃｏｕｔｌｅｔｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、胃炎（萎縮性または肥大性）、胃不全麻痺、胃拡張、胃憩室、胃新生物（胃癌、胃ポリープ、胃腺癌、増殖性胃ポリープ）、胃破裂、胃潰瘍、胃閉塞）、結核、内臓下垂症、嘔吐（例えば、吐血、妊娠悪阻、手術後悪心（ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅｎａｕｓｅａ）および手術後嘔吐）および出血性大腸炎が挙げられる。

さらなる胃腸系の疾患および／または障害として、胆汁管障害（例えば、胃壁破裂症）、フィステル（例えば、胆道フィステル、食道フィステル、胃フィステル、腸フィステル、膵臓フィステル）、新生物（例えば、胆汁管新生物、食道新生物（例えば、食道の腺癌）、食道扁平上皮癌、胃腸新生物、膵臓新生物（例えば、膵臓の腺癌）、膵臓のムチン嚢胞性新生物、膵臓嚢胞性新生物、膵臓芽腫および腹膜新生物）、食道疾患（例えば、水疱性疾患、カンジダ症、グリコゲンアカントシス、潰瘍形成、バレット食道静脈瘤、閉鎖症、嚢胞、憩室（例えば、ツェンカー憩室）、フィステル（例えば、気管食道フィステル）、運動性疾患（例えば、ＣＲＥＳＴ症候群、嚥下疾患、アカラシア、痙縮、食道逆流）、新生物、穿孔（例えば、ブールハーフェ症候群、マロリー−ヴァイス症候群）、狭窄症、食道炎、横隔膜ヘルニア（例えば、裂孔ヘルニア）、胃腸疾患（例えば、胃腸炎（例えば、コレラ病、ノーウォークウイルス感染））、出血（例えば、吐血、メレナ、消化性潰瘍出血）、胃新生物（胃癌、胃ポリープ、胃腺癌、胃癌））、ヘルニア（例えば、先天性横隔膜ヘルニア、大腿ヘルニア、鼡径ヘルニア、閉鎖孔ヘルニア、臍ヘルニア、腹壁ヘルニア）、および腸疾患（例えば、盲端疾患（虫垂炎、盲端新生物））が挙げられる。
走化性

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／または内皮細胞）を、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖の部位）に誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特定の外傷または異常性を撃退および／または治癒し得る。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。次いで、これらの走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標的化した細胞の数を増加させることによって、炎症、感染、過剰増殖性の疾患、障害および／もしくは状態、または任意の免疫系障害を治療し得る。例えば、走化性分子を使用して、傷害を受けた位置に免疫細胞を誘引することによって、組織に対する創傷および他の外傷を治療し得る。本発明の走化性分子はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を治療するために使用され得る。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが走化性活性を阻害し得ることもまた意図される。これらの分子はまた障害を治療するために使用され得る。したがって、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、走化性の阻害剤として使用され得る。
結合活性

本発明のアルブミン融合タンパク質は、この融合タンパク質の治療用タンパク質部分に結合する分子、またはこの融合タンパク質の治療用タンパク質部分が結合する分子についてスクリーニングするために使用され得る。この融合タンパク質とこの分子との結合は、結合した融合タンパク質または分子の活性を活性化（（例えば、アゴニスト）、部分的アゴニスト等）、増大、阻害（（例えば、アンタゴニスト）、部分的アンタゴニスト等）、または減少させ得る。そのような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、受容体）、または低分子が挙げられる。
ある実施形態では、この分子は、本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質部分の天然のリガンド（例えば、リガンドのフラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは機能的模倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ５（１９９１）を参照のこと）。同様に、この分子は、本発明のアルブミン融合タンパク質が結合する天然の受容体、または少なくとも、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分によって結合され得る受容体のフラグメント（例えば、活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合においても、この分子は、既知の技術を用いて合理的に設計され得る。

ある実施形態では、これらの分子についてのスクリーニングは、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現する適切な細胞を産生するステップを包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、または大腸菌由来の細胞が挙げられる。
アッセイは、本発明のアルブミン融合タンパク質への候補化合物の結合を単純に試験し得、ここで結合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイにおいて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がこの融合タンパク質への結合によって生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。

あるいは、アッセイは、無細胞調製物、固体支持体に接着された融合タンパク質／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され得る。アッセイはまた、候補化合物を、アルブミン融合タンパク質を含む溶液と混合するステップ、融合タンパク質／分子の活性または結合を測定するステップ、および融合タンパク質／分子の活性または結合を、標準と比較するステップを単純に包含し得る。
ある実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイが、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して、試料（例えば、生物学的試料）における融合タンパク質のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、アルブミン融合タンパク質への直接的もしくは間接的のいずれかの結合、または基質についてのアルブミン融合タンパク質との競合によって、融合タンパク質のレベルまたは活性を測定し得る。

さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分が結合する受容体は、当業者に既知の多くの方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎ．，１（２）、Ｃｈａｐｔｅｒ５（１９９１））によって同定され得る。例えば、発現クローニングは、ポリアデニル化ＲＮＡがこのアルブミン融合タンパク質に応答する細胞から調製される場合に用いられ、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（これは、ＦＧＦファミリータンパク質に対する複数の受容体を含むことが既知である）、およびＳＣ−３細胞、およびこのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーは、プールに分けられ、そしてこのアルブミン融合タンパク質に応答性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクトするために使用される。ガラススライド上で増殖しているトランスフェクトされた細胞は、それらを標識化した後に、本発明のアルブミン融合タンパク質に曝露される。このアルブミン融合タンパク質は、種々の手段（部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位のヨウ素化または封入を含む）によって標識化され得る。

固定化およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラフィー分析に供される。陽性プールを同定し、そしてサブプールを、反復性のサププール化および再スクリーニングプロセスを使用して調製および再びトランスフェクトして、最終的に推定受容体をコードする単一のクローンを生じる。
受容体同定のための代替のアプローチとして、標識アルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質成分について受容体分子を発現する調製物を、細胞膜と光親和性に連結し得るか、または抽出し得る。架橋された材料は、ＰＡＧＥ分析によって分解され、そしてＸ線フィルムに曝露される。融合タンパク質の受容体を含む標識複合体が切り出され得、ペプチドフラグメントへと分離され得、そしてタンパク質微量配列決定に供され得る。微量配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、１組の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定受容体をコードする遺伝子を同定する。

さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリングの技術（集合的に「ＤＮＡシャッフリング」という）を利用して、融合タンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分もしくはアルブミン成分の活性を調節し得、それによって本発明のアルブミン融合タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に生成する。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ｅｔａｌ．、Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）、Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）、Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）、ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．ａｎｄＢｌａｓｃｏ，Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２４（２）：３０８−１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの変更は、ＤＮＡシャッフリングによって達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同組み換えまたは部位特異的な組み換えによる、２つ以上のＤＮＡセグメントの、所望の分子への構築を含む。別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびコードされたアルブミン融合タンパク質は、組み換えの前に、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム変異誘発に供することによって、変更され得る。別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。いくつかの実施形態において、この異種分子は、ファミリーの成員である。さらなる実施形態において、この異種分子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、アクチビンＡおよびアクチビンＢ、デカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドーサリン（ｄｏｒｓａｌｉｎ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄａｌ）、ＭＩＳ、インヒビン−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５、および神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子である。

他の例示的なフラグメントは、治療用タンパク質部分および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン成分の生物学的に活性なフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、治療用タンパク質部分および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン成分の活性に類似の活性を示すが、必ずしも治療用タンパク質部分および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン成分の活性に同一ではないフラグメントである。このフラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または減少した所望されない活性を含み得る。
さらに、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質の作用を調節する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は、哺乳動物線維芽細胞、本発明のアルブミン融合タンパク質、スクリーニングされるべき化合物および^３［Ｈ］チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で合わせるステップを包含する。対照アッセイは、スクリーニングされるべき化合物の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖の量と比較して、各々の場合における^３［Ｈ］チミジンの取り込みの決定によって、この化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、^３［Ｈ］チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによって測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が、この手順により同定され得る。

別の方法において、本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質成分に対する受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明の融合タンパク質とともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングされるべき化合物の相互作用に従う既知のセカンドメッセンジャー系の応答および受容体が測定され、そしてこの化合物がこの受容体に結合し、そしてセカンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化合物が潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。このようなセカンドメッセンジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホスホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。

これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、融合タンパク質／分子を活性化または阻害することによって、疾患を治療するか、あるいは患者に特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、アッセイは、適切に操作された細胞または組織からの本発明のアルブミン融合タンパク質の産生を阻害または増強し得る因子を発見し得る。
したがって、本発明は、以下のステップを含む本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する化合物を同定する方法を包含する。（ａ）候補結合化合物を本発明のアルブミン融合タンパク質とともにインキュベートするステップ、および（ｂ）結合が生じたか否かを判定するステップ。さらに、本発明は、以下のステップを含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する方法を包含する。（ａ）候補化合物を本発明のアルブミン融合タンパク質とともにインキュベートするステップ、（ｂ）生物学的活性をアッセイするステップ、および（ｂ）融合タンパク質の生物学的活性が改変されているか否かを判定するステップ。
標的化された送達

別の実施形態において、本発明は、組成物を、本発明のアルブミン融合タンパク質の成分についての受容体を発現する標的化細胞に送達する方法を提供する。
本明細書中で議論される場合、本発明の融合タンパク質（例えば、アルブミン融合タンパク質）は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合性の相互作用を介して会合し得る。一実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した本発明の融合タンパク質（抗体を含む）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特定の送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療用タンパク質を標的細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）あるいは二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され得る、ＤＮＡ）を、標的細胞に送達するための方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合した本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体）を投与することによる細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。

「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分子もしくは酵素を、結合および活性化する化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：当該分野で既知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性エフェクター系を結合する化合物（例えば、抗体（またはその一部を含む補体固定）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞傷害性化合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
薬物スクリーニング

本発明のアルブミン融合タンパク質またはアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当するタンパク質の活性を改変する分子についてスクリーニングするための、本発明のアルブミン融合タンパク質、またはこれらの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用が、さらに意図される。このような方法は、融合タンパク質を、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を有することが疑われる選択された化合物と接触させるステップ、および結合に続いてこの融合タンパク質の活性をアッセイするステップを包含する。
本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて、本発明のアルブミン融合タンパク質、またはそれらの結合フラグメントを使用することによって治療用化合物をスクリーニングするために特に有用である。このような試験に用いられるアルブミン融合タンパク質は、固体支持体に固定化され得、細胞表面上に発現され得、溶液中で遊離であり得、または細胞内に局在化され得る。薬物スクリーニングの１つの方法は、アルブミン融合タンパク質を発現する組み換え核酸を用いて安定に形質転換される真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利用する。薬物は、競合結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞に対してスクリーニングされる。例えば、試験されている薬剤と本発明のアルブミン融合タンパク質との間の複合体の形成（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｎ）を測定し得る。

したがって、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質によって媒介される活性に影響を及ぼす薬物または任意の他の薬剤についてのスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、当該分野で周知の方法によって、このような薬剤を本発明のアルブミン融合タンパク質もしくはそのフラグメントと接触させるステップ、およびこの薬剤とこのアルブミン融合タンパク質もしくはそのフラグメントとの間の複合体の存在についてアッセイするステップを包含する。このような競合結合アッセイにおいて、スクリーニングされる薬剤は、代表的に、標識化される。インキュベーション後に、遊離の薬剤は、結合形態中に存在する薬剤から分離され、そして遊離または複合体化されていない標識の量は、特定の薬剤が本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する能力の尺度である。

薬物スクリーニングについての別の技術は、本発明のアルブミン融合タンパク質に対する適切な結合親和性を有する化合物に対するハイスループットスクリーニングを提供し、それは、欧州特許出願第８４／０３５６４号（１９８４年９月１３日公開）（これは、本明細書中で参考として援用される）に非常に詳細に記載される。簡潔にいうと、大量の異なる小さなペプチド試験化合物は、固体基材（例えば、プラスチックピンまたはいくつかの他の表面）上で合成される。ペプチド試験化合物を、本発明のアルブミン融合タンパク質と反応させ、そして洗浄する。次いで、結合したペプチドは、当該分野で周知の方法によって検出される。精製されたアルブミン融合タンパク質は、前述の薬物スクリーニング技術での使用のためにプレート上に直接コーディングされる。さらに、非中和抗体を使用して、このペプチドを捕捉し得、そして固体支持体上にそれを固定し得る。
本発明はまた、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図し、ここで、本発明のアルブミン融合タンパク質を結合し得る中和抗体は、アルブミン融合タンパク質またはそのフラグメントに対する結合について試験化合物と特異的に競合する。この様式において、抗体を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質と１つ以上の抗原性エピトープを共有する任意のペプチドの存在を検出する。
結合ペプチドおよび他の分子

本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合するポリペプチドおよび非ポリペプチドを同定するためのスクリーニング方法、ならびにそれによって同定された結合分子を含む。これらの結合分子は、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。そのようなアゴニストおよびアンタゴニストは、本発明に従って、以下に詳細に記載される治療実施形態において使用され得る。
この方法は、本発明のアルブミン融合タンパク質を多数の分子と接触させるステップ、およびアルブミン融合タンパク質に結合する分子を同定するステップを包含する。

本発明のアルブミン融合タンパク質を多数の分子と接触させるステップは、多数の方法によってもたらされ得る。例えば、アルブミン融合タンパク質を固体支持体上に固定化させ、そして多数の分子の溶液を固定したポリペプチドと接触させることを意図し得る。このような手順は、固定した本発明のアルブミン融合タンパク質から構成される親和性マトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィープロセスに類似している。次いで、アルブミン融合タンパク質に対して選択的な親和性を有する分子が、親和性選択によって精製され得る。固体支持体の性質、アルブミン融合タンパク質のこの固体支持体への付着に関するプロセス、溶媒、および親和性単離または親和性選択の条件は、大部分が従来のものであり、そして当業者に周知である。

あるいは、多数のポリペプチドはまた、ポリペプチドのサブセットまたは個々のポリペプチドを含む実質的に別々の画分へ分離され得る。例えば、多数のポリペプチドは、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィーなどポリペプチドの分離に関して当業者に既知の方法によって、分離され得る。個々のポリペプチドはまた、宿主細胞の外部表面上またはほぼ外部表面に発現されるような様式で、形質転換された宿主細胞（例えば、組み換えファージ）によって産生され得る。次いで、個々の単離物は、アルブミン融合タンパク質によって「プローブ化」され得、必要に応じて発現に必要とされるであろうインデューサーの存在下で、アルブミン融合タンパク質と個々のクローンとの間で任意の選択的親和性相互作用が起こったか否かが決定される。アルブミン融合タンパク質を個々のポリペプチドを含む各画分と接触させる前に、これらのポリペプチドはまず、さらなる簡便性のために固体支持体に移され得る。そのような固体支持体は、単に、例えばニトロセルロースまたはナイロンでできたフィルター膜の断片であり得る。この様式において、陽性クローンは、形質転換宿主細胞の発現ライブラリーの集団（これらは、本発明のアルブミン融合タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を持つ）から同定され得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列が、従来の手段によって直接決定され得るか、またはこのポリペプチドをコードするＤＮＡのコード配列が、頻繁により簡便に決定され得る。次いで、１次配列が、対応するＤＮＡ配列から推定され得る。アミノ酸配列がポリペプチド自身から決定されるものである場合、微小配列決定技術を使用し得る。この配列決定技術は、質量分析法を含み得る。
特定の状況において、選択的親和性相互作用の存在を決定または検出しようと試みる前に、未結合のポリペプチドを、本発明のアルブミン融合タンパク質および多数のポリペプチドの混合物から洗浄除去することが望ましい場合がある。このような洗浄ステップは、本発明のアルブミン融合タンパク質または多数のポリペプチドが固体支持体に結合している場合に、特に望ましくあり得る。

本方法に従って提供される多数の分子は、多様性ライブラリー（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質へ特異的に結合する分子をスクリーニングし得るランダムまたはコンビナトリアルの、ペプチドライブラリーまたは非ペプチドライブラリー）として提供され得る。使用され得る多くのライブラリー（例えば、化学合成ライブラリー、組み換えライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）、および体外翻訳ベースのライブラリー）が、当該分野で既知である。化学合成ライブラリーの例は、以下に記載される。Ｆｏｄｏｒｅｔａｌ．、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：７６７−７７３、Ｈｏｕｇｈｔｅｎｅｔａｌ．、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ３５４：８４−８６、Ｌａｍｅｔａｌ．、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ、１９９４、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：７０９−７１０、Ｇａｌｌｏｐｅｔａｌ．、１９９４、Ｊ．ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ３７（９）：１２３３−１２５１、Ｏｈｌｍｅｙｅｒｅｔａｌ．、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０９２２−１０９２６、Ｅｒｂｅｔａｌ．、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１４２２−１１４２６、Ｈｏｕｇｈｔｅｎｅｔａｌ．、１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４１２、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅｅｔａｌ．、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１６１４−１６１８、Ｓａｌｍｏｎｅｔａｌ．、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１７０８−１１７１２、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９３／２０２４２号、ならびにＢｒｅｎｎｅｒａｎｄＬｅｒｎｅｒ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５３８１−５３８３。

ファージディスプレイライブラリーの例は、以下に記載される。Ｓｃｏｔｔｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６−３９０（１９９０）、Ｄｅｖｌｉｎｅｔａｌ．、、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４０４−４０６（１９９０）、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｅｔａｌ．、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−７１８１９９２）、Ｌｅｎｓｔｒａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：１４９−１５７（１９９２）、Ｋａｙｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ１２８：５９−６５（１９９３）、ならびにＰＣＴ公開番号第ＷＯ９４／１８３１８号（１９９４年８月１８日）。
体外翻訳ベースのライブラリーとしては、以下：ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９１／０５０５８号（１９９１年４月１８日）、およびＭａｔｔｈｅａｋｉｓｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：９０２２−９０２６（１９９４）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：４７０８−４７１２（１９９４）を参照のこと）が、使用のために適応され得る。ペプトイドライブラリー（Ｓｉｍｏｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９３６７−９３７１（１９９２））がまた使用され得る。使用され得るライブラリーの別の例は、Ｏｓｔｒｅｓｈｅｔａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１１３８−１１１４２（１９９４））によって記載され、ここでは、ペプチド中のアミド官能基が、過剰にメチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅ）されて、化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリーを生成する。

本発明において有用である種々の非ペプチドライブラリーは、大きい。例えば、ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：３５１−３６０（１９９５））は、種々のライブラリーの基礎を形成する化学種の間として、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ピペラジンジオン、ビフェニル、糖アナログ、β−メルカプトケトン、アリール酢酸、アシルピペラジン、ベンゾピラン、キューバン（ｃｕｂａｎｅ）、キサンチン、アミンイミドおよびオキサゾロンを列挙している。
非ペプチドライブラリーは、修飾されたモノマーおよびオリゴマーの、２つの型に大きく分類され得る。修飾モノマーライブラリーは、比較的単純な骨格構造を使用し、この上に種々の官能基が付加される。しばしば、骨格は、既知の有用な薬理学的活性を有する分子である。例えば、骨格は、ベンゾジアゼピン構造であり得る。
非ペプチドオリゴマーライブラリーは、モノマーの順序に依存して新規な形状を作製する様式で共にアセンブルされる、多数のモノマーを使用する。使用されるモノマー単位の間には、カルバメート、ピロリノン（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏｎｅ）およびモルホリノがある。ペプトイド（側鎖がα炭素よりもαアミノ基に結合するペプチド様オリゴマー）は、非ペプチドオリゴマーライブラリーの別のバージョンの基礎を形成する。最初の非ペプチドオリゴマーライブラリーは、単一型のモノマーを使用し、したがって、反復骨格を含む。近年のライブラリーは、１つより多くのモノマーを使用し、ライブラリーに、追加の自由度が与えられる。

ライブラリーをスクリーニングすることは、多様な一般的に既知の方法のいずれかによって達成され得る。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する以下の参考文献を参照のこと。Ｐａｒｍｌｅｙｅｔａｌ．、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８（１９８９）、Ｓｃｏｔｔｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６−３９０（１９９０）、Ｆｏｗｌｋｅｓｅｔａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４２２−４２７（１９９２）、Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５３９３−５３９７（１９９２）、Ｙｕｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ７６：９３３−９４５（１９９４）、Ｓｔａｕｄｔｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：５７７−５８０（１９９８）、Ｂｏｃｋｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３５５：５６４−５６６（１９９２）、Ｔｕｅｒｋｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６９８８−６９９２（１９９２）、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３５５：８５０−８５２（１９９２）、米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、および米国特許第５，１９８，３４６号（全てＬａｄｎｅｒｅｔａｌ．に対して）、Ｒｅｂａｒｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３：６７１−６７３（１９９３）、ならびにＰＣＴ公開番号第ＷＯ９４／１８３１８号。
具体的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質を結合する分子を同定するためのスクリーニングは、ライブラリーのメンバーを固相に固定化された本発明のアルブミン融合タンパク質と接触させ、そしてアルブミン融合タンパク質に結合するこれらのライブラリーメンバーを収集することによって実行され得る。そのようなスクリーニング方法の例の、「パニング」と呼ばれる技術は、例として、Ｐａｒｍｌｅｙｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ７３：３０５−３１８（１９９８）、Ｆｏｗｌｋｅｓｅｔａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４２２−４２７（１９９２）、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９４／１８３１８号、ならびにその中に引用される参考文献に記載される。

別の実施形態において、酵母中の相互作用タンパク質を選択するためのツーハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓｅｔａｌ．、，Ｎａｔｕｒｅ３４０：２４５−２４６（１９８９）、Ｃｈｉｅｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：９５７８−９５８２（１９９１））が、本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子を同定するために使用され得る。
結合分子がポリペプチドである場合、このポリペプチドは、任意のペプチドライブラリー（ランダムペプチドライブラリー、コンビナトリアルペプチドライブラリー、またはバイアスペプチドライブラリーを含む）から簡便に選択され得る。「バイアス（ｂｉａｓｅｄ）」という用語は、この場合のペプチドにおいて、ライブラリーを作製する方法が、生じる分子収集の多様性を支配する１つ以上のパラメータを制限するように操作されることを意味するために本明細書中に使用される。

したがって、真にランダムなペプチドライブラリーは、ペプチドの所定の位置に特定のアミノ酸を見出す可能性が全て２０のアミノ酸に関して同じである、ペプチドの収集物を作製する。しかし、例えば、リジンがアミノ酸５つ毎に生じることを特定するかまたはデカペプチドライブラリーの４位、８位および９位がアルギニンのみを含むように固定して特定することによって、バイアスがライブラリーに導入され得る。明らかに、バイアスの多くの型は、意図され得、そして本発明は、任意の特定のバイアスに制限されない。さらに、本発明は、特定の型のペプチドライブラリー（例えば、ファージディスプレイペプチドライブラリーおよびＤＮＡ挿入物と共にλファージベクターを含むＤＮＡ構築物を使用するライブラリー）を意図する。
上記のように、結合分子（ポリペプチドである）の場合、このポリペプチドは、約６から約６０未満のアミノ酸残基を有し、好ましくは約６〜約１０アミノ酸残基、そしてより好ましくは約６〜約２２アミノ酸であり得る。別の実施形態において、結合ポリペプチドは、１５〜１００の範囲のアミノ酸、または２０〜５０の範囲のアミノ酸を有する。
選択された結合ポリペプチドは、化学合成または組み換え発現によって得られ得る。
他の活性

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、種々の疾患状態（例えば、血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因する虚血組織の血管再生を刺激するための治療において利用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをまた利用して、上述のように新脈管形成および肢の再形成を刺激し得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、傷害、熱傷、手術後組織修復、および潰瘍に起因する創傷の治療にもまた利用し得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞（例えば、線維芽細胞および骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それゆえ損傷した組織または疾患組織の修復または置換を促進するからである。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、ニューロンの成長を刺激し、そして特定のニューロンの障害または神経変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびＡＩＤＳ関連複合体）において生じるニューロンの損傷を処置および予防するために利用し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得、それゆえ、これらは、骨および歯周の再形成を増強し、そして組織移植片または骨の移植片における補助のために利用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをまた利用して、ケラチノサイト増殖を刺激することにより、日焼けに起因する皮膚の老化を予防し得る。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをまた、抜け毛を予防するために利用し得る。同じ系列にそって、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを利用して、他のサイトカインと組み合わせて使用した場合、造血細胞および骨髄細胞の増殖および分化を刺激し得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをまた利用して、移植前の器官を維持し得るか、または１次組織の細胞培養を支持するために使用し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、初期胚における分化のための中胚葉起源の組織を誘導するために利用され得る。

本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、上で述べられるように造血系統に加えて、胚性幹細胞の分化もしくは増殖を増加または減少し得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色素沈着、大きさ、および形（例えば、美容外科））を調節するために使用され得る。同様に、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、およびエネルギーの貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、バイオリズム、カリカディック（ｃａｒｉｃａｄｉｃ）リズム、うつ病（抑うつ性の障害を含む）、暴力の傾向、痛に対する耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビンまたはインヒビン様活性によって）、ホルモンレベルもしくは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、ストレス、または他の認知の質に影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精神状態または身体状態を変更するために使用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加または減少させるような食品添加物または保存剤として使用され得る。

上記で引用される適用は、広範な種々の宿主における用途を有する。そのような宿主としては、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまたはネコである。いくつかの実施形態において、宿主は、哺乳動物である。他の実施形態において、宿主は、ヒトである。
本発明を一般的に記載したが、それは、以下の実施例を参照することにより容易に理解される。それらの実施例は、そして説明のために提供され、そして制限することを意図しない。
さらなる説明を有することなく、当業者は、前記説明および以下の指示例を使用して、本発明において見出される変更を成し、そして利用し得、そして請求の範囲に記載される方法を実施し得る。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指示し、いかようにも本開示の残りの部を制限すると解釈されない。

ｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＳｃＣＨＳＡの生成
ベクターｐＳｃＮＨＳＡ（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３２７９）およびｐＳｃＣＨＳＡ（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３２７６）は、ｐＰＰＣ０００５（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３２７８）の誘導体であり、治療用タンパク質またはそれらのフラグメントまたはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドが、ヒト血清アルブミン「ＨＳＡ」をコードするポリヌクレオチドを有する翻訳フレームに隣接して、または翻訳フレーム中に挿入されるクローニングベクターとして使用される。ｐＳｃＣＨＳＡは、治療用タンパク質ＨＳＡ融合を生成するために使用し得る一方で、ｐＳｃＮＨＳＡは、ＨＳＡ治療用タンパク質融合を生成するために使用し得る。

ｐＳｃＣＨＳＡの生成：治療的部分に対するアルブミン部分Ｃ端とのアルブミン融合
成熟アルブミンタンパク質をコードするＤＮＡに対する治療的タンパク質Ｎ末端をコードするＤＮＡのクローニングを促進させるためのベクターを、ｐＰＰＣ０００５におけるキメラＨＳＡシグナルペプチドをコードする核酸配列がＸｈｏＩ部位およびＣｌａＩ部位を含むように変更することによって作製した。
まず、ｐＰＰＣ０００５に固有のＸｈｏＩ部位およびＣｌａＩ部位（ＡＤＨ１終結配列の３´に位置する）を、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩでｐＰＰＣ０００５を消化することによって排除し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで突出末端を削り、平滑末端を再ライゲーションしてｐＰＰＣ０００６を作製した。

次に、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位およびＣｌａＩ制限酵素認識部位を、２ラウンドＰＣＲを用いて、ｐＰＰＣ０００６中のＨＳＡ（ＨＳＡリーダーのキメラおよび接合因子α「ＭＡＦ」由来のｋｅｘ２部位）のシグナルペプチドをコードする核酸配列中に操作した。ＰＣＲの第１ラウンドにおいて、配列番号３６および配列番号３７として示されるプライマーによる増幅を行った。配列が配列番号３６として示されるプライマーは、ＨＳＡのシグナルペプチド配列の部分、接合因子αリーダー配列由来のｋｅｘ２部位、およびＨＳＡの成熟形態のアミノ末端の部分をコードする核酸配列を含む。この配列に４つの点変異を導入し、キメラシグナルペプチドおよびＨＳＡの成熟形態の接合部に見出されるＸｈｏＩ部位およびＣｌａＩ部位を作製した。下記に示す配列でこれらの４つの変異に下線を引く。ｐＰＰＣ０００５では、５´から３´のこれら４つの位置におけるヌクレオチドは、Ｔ、Ｇ、Ｔ、およびＧである。
５´−ＧＣＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧ−３´（配列番号３６）、および５´−ＡＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＣＡＴＣＴＣＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＴＡＡＧＣ−３´（配列番号３７）。次いで、ＰＣＲの第２ラウンドは、上流隣接プライマー５´−ＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＧＡＧＴＣＣＡＡＴＴＡＧＣ−３´（配列番号３８）および下流隣接プライマー５´−ＣＡＣＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴ−３´（配列番号３９）を用いて実施された。次いで、得られたＰＣＲ産物を精製し、そしてＡｆｌＩＩおよびＸｂａＩで消化し、そしてｐＰＰＣ０００６中の同じ部位に連結して、ｐＳｃＣＨＳＡを作製した。得られたプラスミドは、シグナル配列へと操作された、ＸｈｏＩ部位およびＣｌａＩ部位を有する。ＸｈｏＩ部位の存在は、ＬＤＫＲからＬＥＫＲへの、シグナル配列の末端に単一アミノ酸変化を生じる。このＤからＥへの変化は、５´ＳａｌＩ部位（これは、ＸｈｏＩ部位と適合性である）および３´ＣｌａＩ部位を有する、アルブミン融合タンパク質の治療用部分をコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列が、ｐＳｃＣＨＳＡのＸｈｏＩ部位およびＣｌａＩ部位に連結される場合、最終的なアルブミン融合タンパク質発現プラスミド中に存在しない。ＸｈｏＩへのＳａｌＩの連結は、シグナルペプチド配列の元のアミノ酸配列を回復させる。アルブミン融合タンパク質の治療用部分をコードするＤＮＡは、Ｋｅｘ２部位（Ｋｅｘ２は、シグナルペプチドの最後の二塩基性アミノ酸配列ＫＲの後ろで切断する）の後、およびＣｌａＩ部位の前に挿入され得る。

ｐＳｃＮＨＳＡの生成：治療用部分に対するアルブミン部分Ｎ末端とのアルブミン融合
成熟アルブミンタンパク質をコードするＤＮＡのＣ末端へと、治療用タンパク質部分をコードするＤＮＡをクローニングするのを容易にするベクターを、３つの８塩基対制限部位をｐＳｃＣＨＳＡに付加することにより作製した。成熟ＨＳＡタンパク質をコードする核酸配列の末端にて、Ｂｓｕ３６Ｉ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に、ＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、およびＰｍｅＩ制限部位を添加した。これを、下線を付したＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、およびＰｍｅＩ制限部位を含む２つの相補的合成プライマー（配列番号４０および配列番号４１）の使用によって達成した。
５’−ＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＣＴ−３’（配列番号４０）、
および５’−ＡＧＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴ−３’（配列番号４１）。これらのプライマーを、Ｂｓｕ３６ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてアニールし、そして消化し、ｐＳｃＮＨＳＡを作製するｐＳｃＣＨＳＡにおける同じ部位に結合した。

酵母形質転換のための一般的な構築物生成
ベクターｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＳｃＣＨＳＡは、治療用タンパク質またはそれらのフラグメントまたはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドが、ヒト血清アルブミン「ＨＳＡ」をコードするポリヌクレオチドを有する翻訳フレームに隣接して挿入される、クローニングベクターとして使用され得る。ｐＳｃＣＨＳＡは、治療用タンパク質ＨＳＡ融合を生成するために使用される一方で、ｐＳｃＮＨＳＡは、ＨＳＡ治療用タンパク質融合を生成するために使用され得る。

ＨＳＡ−治療用タンパク質融合産物を備えるアルブミン融合構築物の生成
治療用タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号Ｘで示される、または当該分野で公知の配列）は、融合構築物の生成を容易にするプライマー（例えば、制限部位を加えることにより、継ぎ目のない融合をコードすることにより、リンカー配列をコードすることにより、等）を用いてＰＣＲ増幅され得る。例えば、当業者は、治療タンパク質をコードする（かつＢｓｕ３６Ｉ部位を含む）ＤＮＡの５´末端上にＨＳＡの成熟形態の最後の４つのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを加える５´プライマー、そして停止コドンおよび配列をコードする治療タンパク質の３´末端上の適切なクローニング部位を加える３´プライマーを設計し得る。例えば、治療用タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するために使用される順方向プライマーは、配列５´−ａａｇｃｔＧＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡ（Ｎ）_１５−３´（配列番号４２）を有する場合があり、下線が引かれた配列は、Ｂｓｕ３６Ｉ部位であり、大文字のヌクレオチドは、成熟ＨＳＡタンパク質の最後の４つのアミノ酸（ＡＬＧＬ）をコードし、（Ｎ）_１５は、目的の治療用タンパク質をコードする最初の１５のヌクレオチドと同一である。同様に、治療用タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するために使用される逆方向プライマーは、

を有する場合があり、斜体の配列はＰｍｅＩ部位であり、二重に下線が引かれた配列はＦｓｅＩ部位であり、単一の下線が引かれた配列はＡｓｃＩ部位であり、枠で囲んだヌクレオチドは、２つの直列の停止コドンの逆方向相補鎖であり、（Ｎ）_１５は、目的の治療用タンパク質をコードする最後の１５のヌクレオチドの逆方向相補鎖と同一である。一旦ＰＣＲ産物が増幅されると、それはＢｓｕ３６Ｉおよび（ＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、またはＰｍｅＩ）のうちの１つで切断されて、ｐＳｃＮＨＳＡに連結され得る。

ＨＳＡキメラリーダー配列中のＸｈｏＩ部位の存在は、ＬＤＫＲ（配列番号４４）からＬＥＫＲ（配列番号４５）への、キメラシグナル配列、すなわちＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナル配列の末端における単一アミノ酸変化を作成する。

遺伝子−ＨＳＡ融合産物を備えるアルブミン融合構築物の生成
上記の方法と同様に、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅され得る：ＳａｌＩ部位を含み、治療タンパク質をコードするＤＮＡの５´末端上のＨＳＡリーダー配列、ＤＫＲの最後の３つのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを加える５´プライマー、および治療タンパク質をコードするＤＮＡの３´末端上にＣｌａＩ部位を含む成熟ＨＳＡの最初のいくつかのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを加える３´プライマー。例えば、治療用タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するために使用される順方向プライマーは、配列５’−ａｇｇａｇｃｇｔｃＧＡＣＡＡＡＡＧＡ（Ｎ）_１５−３’（配列番号４６）を有する場合があり、下線が引かれた列はＳａｌＩ部位であり、大文字のヌクレオチドは、ＨＳＡリーダー配列の最後の３つのアミノ酸（ＤＫＲ）をコードし、（Ｎ）_１５は、目的の治療用タンパク質をコードする最初の１５のヌクレオチドと同一である。同様に、治療用タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するために使用される逆方向プライマーは、

を有する場合があり、斜体の配列はＣｌａＩ部位であり、下線が引かれたヌクレオチドは、ＨＳＡの成熟形態の最初の９つのアミノ酸（ＤＡＨＫＳＥＶＡＨ、配列番号４８）をコードするＤＮＡの逆方向相補鎖であり、（Ｎ）_１５は、目的の治療用タンパク質をコードする最後の１５のヌクレオチドの逆方向相補鎖と同一である。一旦ＰＣＲ産物が増幅されると、それはＳａｌＩおよびＣｌａＩで切断され、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩで消化されたｐＳｃＣＨＳＡに連結され得る。異なるシグナルまたはリーダー配列が望ましくてもよく、例えば、インベルターゼ「ＩＮＶ」（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託Ｐ００７２４）、交配因子α「ＭＡＦ」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＡＡ１８４０５）、ＭＰＩＦ（ＧｅｎｅｓｅｑＡＡＦ８２９３６）、フィブリンＢ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託Ｐ２３１４２）、クラステリン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託Ｐ１０９０９）、インスリン様成長因子結合タンパク質４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託Ｐ２２６９２）、およびＨＳＡリーダー配列の順列は、当該分野で公知の標準的な方法によって適切なベクターにサブクローニングすることができる。

酵母サッカロマイセス・セレビシエにおける発現に適合性のアルブミン融合構築物の生成
次いで、ｐＳｃＮＨＳＡまたはｐＳｃＣＨＳＡから生成されるＮ末端またはＣ末端アルブミン融合タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡを含むＮｏｔＩフラグメントが、ＬＥＵ２選択マーカーを有するｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位にクローニングされ得る。次いで、生じるベクターは、酵母サッカロマイセス・セレビシエ発現系の形質転換で使用される。

酵母サッカロマイセス・セレビシエにおける一般発現
酢酸リチウム転換、エレクトロポレーション、または当該分野で公知の、またはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ．１９８９．“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２^ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ”，ｖｏｌｕｍｅｓ１−３、およびＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．２０００．ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌａｎｄＨａｒｖａｒｄＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ “ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ｖｏｌｕｍｅｓ１−４に記載されるような他の方法により、酵母発現に適合性の発現ベクターを酵母サッカロマイセス・セレビシエに形質転換することができる。発現ベクターは、形質転換によりサッカロマイセス・セレビシエ株ＤＸＹ１、Ｄ８８、またはＢＸＰ１０に導入され、例えば、個々の形質転換細胞を１０ｍＬのＹＥＰＤ（１％ｗ／ｖ酵母抽出物、２％ｗ／ｖペプトン、２％ｗ／ｖデキストロース）中で３０℃にて３日間増殖させることができ、細胞を成長の６０時間後に固定相で収集することができる。上清は、１０分間３０００ｇで細胞を浄化することによって収集される。
ｐＳＡＣ３５（Ｓｌｅｅｐｅｔａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：４２、および図３を参照）は、ＬＥＵ２選択マーカーに加えて、全酵母２μｍプラスミドを備え、複製機能、ＰＲＢ１プロモーター、およびＡＤＨ１終始シグナルを提供する。

酵母サッカロマイセス・セレビシエにおけるアルブミン融合から発現されるアルブミン融合タンパク質の一般的精製
いくつかの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質またはその部分の成熟形態（例えば、表１に列挙される治療用タンパク質の成熟形態、または表２に配列番号Ｚとして示される治療用タンパク質の成熟形態）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合されるＨＳＡの成熟形態を備える。本発明の一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、発現に使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列をさらに備える。実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、成熟アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン、インスリン様成長因子結合タンパク質４、キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列を含むがそれに限定されない変異体ＨＳＡリーダー配列、または当該分野で公知の他の異種シグナル配列を含むがこれらに限定されない、異種シグナル配列（例えば、特定の治療用タンパク質の非天然シグナル配列）を備え得る。例は、表２に列挙されるシグナル配列、および／または、上記の明細書の「融合タンパク質の発現」および／または「アルブミン融合タンパク質の組換えおよび合成産生の追加方法」節に列挙されるシグナル配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに備える。フラグメントおよび／または変異体を含む、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に包含される。
上記のような酵母において発現されるアルブミン融合タンパク質は、以下のようなＤｙａｘペプチド親和カラム上で小規模に精製することができる。アルブミン融合タンパク質を発現する酵母からの上清は、ｐＨ６．２で３ｍＭのリン酸緩衝液、２０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０に対して透析濾過し、体積を減少し、色素を除去する。次いで、溶液を０．２２μｍデバイスを通して濾過する。ろ液をＤｙａｘペプチド親和カラム上に装填する。カラムをｐＨ８．２で１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ緩衝液で溶出する。タンパク質を含むピーク留分を、５倍に濃縮した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で収集し、分析する。

大規模精製には、以下の方法を利用することができる。２Ｌを超える上清を透析濾過し、ｐＨ８．０で２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ中で５００ｍＬに濃縮する。濃縮タンパク質溶液を、あらかじめ平衡化した５０ｍＬのＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラム上に装填し、カラムを洗浄し、タンパク質をｐＨ８．０で２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ中で０〜０．４ＭのＮａＣｌのＮａＣｌの直線勾配で溶出する。タンパク質を含むこれらの留分をプールし、０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）でｐＨ６．８に調整する。最終濃度の０．９Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４をタンパク質溶液に添加し、全溶液を、あらかじめ平衡化した５０ｍＬのＢｕｔｙｌ６５０Ｓカラム上に装填する。タンパク質を硫酸アンモニウムの直線勾配（０．９〜０Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）で溶出する。アルブミン融合を含むこれらの留分を再びプールし、ｐＨ５．７５で１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４／クエン酸緩衝液に対して透析濾過し、５０ｍＬのあらかじめ平衡化したＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラム上に装填する。タンパク質を０〜０．５ＭのＮａＣｌ直線勾配で溶出する。目的のタンパク質を含む留分を混合し、緩衝液をＡｍｉｃｏｎ濃縮器によりｐＨ６．２５で１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４／クエン酸に変え、伝導率は２．５ｍＳ／ｃｍより低い。このタンパク質溶液を、１５ｍＬのあらかじめ平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能カラム上に装填し、カラムを洗浄し、タンパク質を０〜０．１５ＭのＮａＣｌのＮａＣｌ直線勾配で溶出する。次いで、精製タンパク質を、緩衝液交換により特定の緩衝液に処方することができる。

哺乳類細胞トランスフェクションについての一般的な構築物の生成
哺乳類細胞株における発現に適合性のアルブミン融合構築物の生成
哺乳類細胞培養系で使用するために、発現ベクターにおいてアルブミン融合構築物を生成することができる。当該分野で公知の標準的方法（例えば、ＰＣＲ増幅、制限消化、および結合）によって、治療用タンパク質をコードするＤＮＡを、哺乳類発現ベクターにおいてＨＳＡへのＮ末端またはＣ末端にクローニングすることができる。一旦発現ベクターが構築されると、哺乳類発現系へのトランスフェクションを進めることができる。適切なベクターは、当該分野で公知であり、例えば、ｐＣ４ベクター、および／またはＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）より入手可能なベクターを含むが、これらに限定されない。
ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡは、哺乳類培養系に適した、プラスミドｐＣ４：ＨＳＡ（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３２７７）を形成するｐＣ４ベクターにクローニングされている。このベクターは、メトトレキサートの存在下で選択を可能にする遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素「ＤＨＦＲ」を有する。
ｐＣ４：ＨＳＡベクターは、ＣＨＯ細胞におけるアルブミン融合タンパク質の発現に適している。発現のために、他の哺乳類細胞培養系では、アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを備える、または代案としてそれから成るフラグメントを、代替的発現ベクターにサブクローニングすることが望ましい場合がある。例えば、成熟アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを備える、あるいはそれから成るフラグメントは、本明細書に記載の哺乳類発現ベクターのいずれかを含むがそれに限定されない、別の発現ベクターにサブクローニングされ得る。

実施形態において、アルブミン融合構築物をコードするＤＮＡは、ＮＳ０細胞における発現について当該分野で公知の手段により、ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）により提供されるベクターにサブクローニングされる。

ＨＳＡ治療用タンパク質融合産物を備えるアルブミン融合構築物の生成
ｐＣ４：ＨＳＡ（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３２７７）を使用して、治療用タンパク質部分が成熟アルブミン配列へのＣ末端である、アルブミン融合構築物を生成することができる。例えば、ベクターのＢｓｕ３６ＩおよびＡｓｃＩ制限部位間の治療用タンパク質のフラグメントまたはその変異体をコードするＤＮＡをクローニングすることができる。Ｂｓｕ３６ＩおよびＡｓｃＩにクローニングする場合、酵母ベクター系（配列番号４２および４３）にクローニングするために使用される同じプライマーを採用し得る（実施例２を参照）。

遺伝子ＨＳＡ融合産物を備えるアルブミン融合構築物の生成
ｐＣ４：ＨＳＡ（ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−３２７７）を使用して、治療用タンパク質部分が成熟アルブミン配列のＮ末端にクローニングされる、アルブミン融合構築物を生成することができる。例えば、ｐＣ４：ＨＳＡのＢａｍＨＩ（またはＨｉｎｄＩＩＩ）およびＣｌａＩ部位間で独自のシグナル配列を有する治療用タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングすることができる。ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ部位のいずれかにクローニングする時、治療用タンパク質をコードするＤＮＡの翻訳開始コドンの前にＫｏｚａｋ配列（ＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧ、配列番号４９）が添加され得る。治療用タンパク質にシグナル配列がない場合、治療用タンパク質をコードするＤＮＡは、ｐＣ４：ＨＳＡのＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位間でクローニングされ得る。ＸｈｏＩ部位を使用する場合、以下の５’（配列番号５０）および３’（配列番号５１）例示的なＰＣＲプライマーを使用し得る。
５’−ＣＣＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＣＧＴＣＧＡ（Ｎ）_１８−３’（配列番号５０）
５’−ＡＧＴＣＣＣＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＣＡＴＣ（Ｎ）_１８−３’（配列番号５１）

５’プライマー（配列番号５０）では、下線が引かれた配列は、ＸｈｏＩ部位であり、ＸｈｏＩ部位およびＸｈｏＩ部位に続くＤＮＡは、天然ヒト血清アルブミンのリーダー配列の最後の７つのアミノ酸をコードする。配列番号５０では、「（Ｎ）_１８」は、目的の治療用タンパク質をコードする最初の１８のヌクレオチドと同一のＤＮＡである。３’プライマー（配列番号５１）では、下線が引かれた配列は、ＣｌａＩ部位であり、ＣｌａＩ部位およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質の最初の１０のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆方向相補鎖である（配列番号１）。配列番号５１では、「（Ｎ）_１８」は、目的の治療用タンパク質をコードする最後の１８のヌクレオチドをコードするＤＮＡの逆方向相補鎖である。これらの２つのプライマーを使用して、目的の治療用タンパク質をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を精製し、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩ制限酵素でそれを消化し、ｐＣ４：ＨＳＡベクター中のＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位にそれをクローニングし得る。
代替的リーダー配列が望ましい場合、天然アルブミンリーダー配列は、キメラアルブミンリーダー、すなわちＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド、または当該分野で公知の標準的方法による代替的リーダーと置換することができる（例えば、当業者であれば、代替リーダーを所定の順序でＰＣＲ増幅し、読み枠を維持する一方で、アルブミンリーダーの代わりにＰＣＲ産物をアルブミン融合構築物にサブクローニングし得る）。

哺乳類細胞株における一般的発現
哺乳類細胞株における発現と適合性の発現ベクターにおいて生成されるアルブミン融合構築物は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクタミン、エレクトロポレーション、または当該分野で公知の、および／またはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ．１９８９．“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２^ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ”、およびＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．２０００．ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌａｎｄＨａｒｖａｒｄＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ｖｏｌｕｍｅｓ１−４に記載されるような、他のトランスフェクション方法により、適切な細胞株にトランスフェクトすることができる。次いで、発現ベクターにおける選択可能なマーカーにより決定される選択剤の存在下で、トランスフェクト細胞を選択する。
ｐＣ４発現ベクター（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）は、プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である。ｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーターである長い末端反復「ＬＴＲ」（Ｃｕｌｌｅｎｅｔａｌ．，Ｍａｒｃｈ１９８５，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７）、およびサイトメガロウイルス「ＣＭＶ」エンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔｅｔａｌ．，１９８５，Ｃｅｌｌ４１：５２１−５３０）を含む。ベクターはまた、３´イントロン、ポリアデニル化およびラットプレプロインスリン遺伝子の終止シグナル、ならびにＳＶ４０早期プロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子も含む。チャイニーズハムスター卵巣「ＣＨＯ」細胞、または活性ＤＨＦＲ遺伝子が欠けている他の細胞株が、トランスフェクションに使用される。当該分野で公知の方法による、ｐＣ４におけるアルブミン融合構築物のＣＨＯ細胞へのトランスフェクションは、ＣＨＯ細胞中のアルブミン融合タンパク質の発現を可能にし、これにリーダー配列開裂および上清への分泌が続く。次いで、アルブミン融合タンパク質を上清からさらに精製する。

ｐＥＥ１２．１発現ベクターは、ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）により提供され、ｐＥＥ６の誘導体である（ＳｔｅｐｈｅｎｓａｎｄＣｏｃｋｅｔｔ，１９８９，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：７１１０）。このベクターは、プロモーター、エンハンサー、および目的の配列の上流である、ヒトサイトメガロウイルスの主な前初期遺伝子「ｈＣＭＶ−ＭＩＥ」（国際公報第ＷＯ８９／０１０３６号）の完全５´非翻訳領域、ならびに選択的メチオニンスルホキシミン含有培地におけるトランスフェクト細胞の選択の目的に対する、グルタミン合成酵素遺伝子（Ｍｕｒｐｈｙｅｔａｌ．，１９９１，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．２２７：２７７−２７９、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎｅｔａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６９−１７５、米国特許第５，１２２，４６４号）を備える。当該分野で公知の方法によりｐＥＥ１２．１において行われるアルブミン融合構築物のＮＳ０細胞（国際公報第ＷＯ８６／０５８０７号）へのトランスフェクションは、ＮＳ０細胞におけるアルブミン融合タンパク質の発現を可能にし、これにリーダー配列開裂および上清への分泌が続く。次いで、本明細書に記載の、または当該分野で公知の技術を使用して、アルブミン融合タンパク質を上清からさらに精製する。
アルブミン融合タンパク質の発現は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法、逆相ＨＰＬＣ分析、または当該分野で公知の他の方法によって、分析され得る。

アルブミン融合構築物でトランスフェクトされる安定したＣＨＯおよびＮＳ０細胞株は、当該分野で公知の方法（例えば、リポフェクタミントランスフェクション）によって生成され、例えば、選択可能なマーカーとして、またはまたはグルタミンを欠く場合の成長を通して、ジヒドロ葉酸還元酵素「ＤＨＦＲ」遺伝子を有するベクターについて１００ｎＭのメトトレキサートで選択される。発現レベルは、例えば、一次的に、抗ＨＳＡ血清を一次抗体とする、または二次的に、所与のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に指向される血清含有抗体を一次抗体とする、免疫ブロット法によって検査することができる。
発現レベルは、抗ＨＳＡ血清を一次抗体とする免疫ブロット検出によって検査される。捕捉抗体がアルブミン融合の治療用タンパク質部分に対するモノクローナル抗体となり得て、検出抗体がモノクローナル抗ＨＳＡビオチン化抗体となり得る（または逆もまた同じ）ＥＬＩＳＡを介して、具体的な産生速度が決定され、これに西洋ワサビペルオキシダーゼ／ストレプトアビジン結合および製造業者のプロトコルに従った分析が続く。

哺乳類細胞におけるアルブミン融合タンパク質の発現
本発明のアルブミン融合タンパク質は、哺乳類細胞において発現させることができる。典型的な哺乳類発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーター要素、タンパク質コード配列、および転写の終結ならびに転写物のポリアデニル化に必要とされる信号を含む。追加要素は、エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、およびＲＮＡスプライシングに対するドナーおよび受容体部位が両側に並ぶ介在配列を含む。高効率転写は、ＳＶ４０からの初期および後期プロモーター、レトロウイルスからの長い末端反復（ＬＴＲ）、例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターにより達成される。しかしながら、細胞要素も使用することができる（例えば、ヒトアクチンプロモーター）。
本発明を実践する際に使用するための適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、およびｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０．等のベクターを含む。使用され得る哺乳類宿主細胞は、ヒトＨｅｌａ、２９３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含むが、これらに限定されない。

あるいは、アルブミン融合タンパク質は、染色体に組み込まれたアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む安定した細胞系において発現させることができる。ＤＨＦＲ、ｇｐｔ、ネオマイシン、またはハイグロマイシン等の選択マーカーによる共トランスフェクションは、トランスフェクト細胞の識別および分離を可能にする。
融合タンパク質をコードするトランスフェクトポリヌクレオチドもまた、大量のコードした融合タンパク質を発現するように増幅することができる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）マーカーは、目的の遺伝子の数百または数千ものコピーを携行する細胞株を開発するのに有用である（例えば、Ａｌｔｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８）、Ｈａｍｌｉｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔＢｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０９７：１０７−１４３（１９９０）、Ｐａｇｅｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：６４−６８（１９９１）を参照）。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミン合成酵素（ＧＳ）（Ｍｕｒｐｈｙｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．２２７：２７７−２７９（１９９１）、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６９−１７５（１９９２））である。これらのマーカーを使用して、哺乳類を選択的培地で増殖させ、最高抵抗がある細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞はしばしば、タンパク質の産生に使用される。

プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４７）の誘導体は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（Ｍａｒｃｈ，１９８５））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）およびＣＭＶエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ４１：５２１−５３０（１９８５））のフラグメントを含む。例えば、制限酵素開裂部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８を伴う多重クローニング部位は、目的の遺伝子のクローニングを促進する。ベクターはまた、３´イントロン、ポリアデニル化およびラットプレプロインスリン遺伝子の終止シグナル、ならびにＳＶ４０早期プロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子も含む。
具体的には、例えば、プラスミドｐＣ６を適切な制限酵素で消化し、次いで、当該分野で公知の手技によって子牛腸内リン酸を使用して脱リン酸化する。次いで、ベクターを１％アガロースゲルから分離する。

本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、当該分野で公知の技術を使用して生成し、このポリヌクレオチドを、当該分野で公知のＰＣＲ技術を使用して増幅する。本発明の融合タンパク質を産生するために自然発生のシグナル配列が使用される場合、ベクターは、第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、自然発生のシグナル配列が使用されない場合、異種シグナル配列を含むようにベクターを修正することができる。（例えば、国際公報第ＷＯ９６／３４８９１号を参照。）
市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ１０１Ｉｎｃ．，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、本発明の融合タンパク質をコードする増幅フラグメントを１％アガロースゲルから分離する。次いで、フラグメントを適切な制限酵素で消化し、１％アガロースゲル上で再び精製する。
次いで、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする増幅フラグメントを同じ制限酵素で消化し、１％アガロースゲル上で精製する。次いで、分離フラグメントおよび脱リン酸化ベクターをＴ４ＤＮＡリガーゼと連結する。次いで、大腸菌ＨＢ１０１またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、例えば、制限酵素を使用して、プラスミドｐＣ６に挿入されたフラグメントを含む細菌を識別する。

活性ＤＨＦＲ遺伝子が欠けているチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６またはｐＣ４に、リポフェクタミンを使用して、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏを同時遺伝子導入する（Ｆｅｌｇｎｅｒｅｔａｌ．、上記参照）。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性選択マーカーである、Ｇ４１８を含む一群の構成物質への耐性を与える酵素をコードするＴｎ５からのｎｅｏ遺伝子を含む。１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したアルファマイナスＭＥＭに細胞を播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートに加えて１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したアルファマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４日後、単一クローンをトリプシン処理し、次いで、異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、６ウェルペトリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで成長しているクローンを、より高い濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新しい６ウェルプレートに移す。１００〜２００μＭの濃度で成長するクローンが得られるまで、同じ手順を繰り返す。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法によって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって、所望の融合タンパク質の発現を分析する。

哺乳類細胞株におけるアルブミン融合構築物から発現されるアルブミン融合タンパク質の一般的精製
いくつかの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質またはその部分（例えば、表１に列挙される治療用タンパク質の成熟形態、または表２に配列番号Ｚとして示される治療用タンパク質の成熟形態）の成熟形態のＮまたはＣ末端のいずれかに融合されるＨＳＡの成熟形態を備える。本発明の一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、発現に使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列をさらに備える。実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、成熟アルブミン融合タンパク質が培養培地中に直接分泌される。本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン、インスリン様成長因子結合タンパク質４、キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列を含むがそれに限定されない変異体ＨＳＡリーダー配列、または当該分野で公知の他の異種シグナル配列を含むがこれらに限定されない、異種シグナル配列（例えば、特定の治療用タンパク質の非天然シグナル配列）を備え得る。模範的シグナル配列は、表２に列挙されるもの、および／または、上記の明細書の「融合タンパク質の発現」および／または「アルブミン融合タンパク質の組換えおよび合成産生の追加方法」節に列挙されるシグナル配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに備える。フラグメントおよび／または変異体を含む、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に包含される。
哺乳類細胞株の上清由来のアルブミン融合タンパク質は、使用される発現系に応じて異なるプロトコルに従って精製される。

ＣＨＯおよび２９３Ｔ細胞株からの精製
ＣＨＯ細胞上清由来または一時的トランスフェクト２９３Ｔ細胞上清由来のアルブミン融合タンパク質の精製は、リン酸ナトリウム緩衝液およびリン酸勾配溶出を使用するアニオン性ＨＱ樹脂による初期捕捉を伴ってもよく、これに塩勾配溶出を使用するＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラム上の親和性クロマトグラフィーが続く。ＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦは、主なＢＳＡ／フェチュイン汚染物質を除去する。リン酸勾配によるＰｏｒｏｓＰＩ５０樹脂上でのさらなる精製は、内毒素汚染を除去および低減し、ならびにアルブミン融合タンパク質を濃縮し得る。

ＮＳ０細胞株からの精製
ＮＳ０細胞上清由来のアルブミン融合タンパク質の精製は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアニオン交換クロマトグラフィーを伴ってもよく、これに段階溶出によるＳＰ−セファロース精製が続き、これに段階溶出によるＰｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ精製、最終的には透析濾過が続く。
次いで、精製タンパク質が緩衝液交換によって処方され得る。

アルブミン融合タンパク質の細菌発現
ＤＮＡ配列の５’および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、細菌シグナル配列を備える、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを増幅し、挿入フラグメントを合成する。挿入物をコードするポリヌクレオチドを増幅するために使用されるプライマーは、増幅産物を発現ベクターにクローン化するために、プライマーの５’末端におけるＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ等の制限部位を含んでもよい。例えば、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩは、細菌発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）上の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは、構成物質に対する抵抗（Ａｍｐｒ）、細菌複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ調節可能プロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−ヒスチジン標識（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位をコードする。
ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩでｐＱＥ−９ベクターを消化し、増幅フラグメントをｐＱＥ−９ベクターへ結紮して、細菌ＲＢＳにおいて開始される読み枠を維持する。次いで、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を与えるプラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含む、大腸菌株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を転換するために、結紮混合物を使用する。ＬＢプレート上で成長する能力によって形質転換細胞を識別し、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを分離し、限定分析によって確認する。

所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００ｕｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５ｕｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させる。１：１００から１：２５０の比率で大量培養を植箘するために、Ｏ／Ｎ培養を使用する。細胞を、０．４から０．６の間の光学密度６００（Ｏ．Ｄ．^６００）に増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を１ｍＭの最終濃度に添加する。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することによって誘発し、増加した遺伝子発現につながるＰ／Ｏを消去する。
細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、遠心分離（６０００Ｘｇで２０分）によって細胞を収穫する。４℃で３〜４時間撹拌することによって、カオトロピック剤である６ＭｏｌａｒＧｕａｎｉｄｉｎｅＨＣｌ中、または例えば、８Ｍの尿素および０．１４Ｍを上回る濃度の２−メルカプトエタノール中で細胞ペレットを可溶化する（例えば、Ｂｕｒｔｏｎｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７９：３７９−３８７（１９８９）を参照）。遠心分離によって細胞残屑を除去し、ポリペプチドを含む上清をニッケルニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）親和性樹脂カラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．より入手可能、上記参照）に装填する。６ｘＨｉｓ標識を伴うタンパク質は、高親和性を伴うＮｉ−ＮＴＡ樹脂に結合し、単純な１段階手順で精製することができる（詳細については、ＴｈｅＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（１９９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．を参照、上記参照）。

簡潔に言えば、上清をｐＨ８で６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ中のカラムに装填する。まずカラムをｐＨ８で６Ｍのグアニジン−ＨＣｌの１０量で洗浄し、次いで、ｐＨ６で６Ｍのグアニジン−ＨＣｌの１０量で洗浄し、最終的に、ポリペプチドをｐＨ５で６Ｍのグアニジン−ＨＣｌで溶出する。
次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはｐＨ６で５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液および２００ｍＭのＮａＣｌに対して透析することによって、精製タンパク質を復元する。あるいは、Ｎｉ−ＮＴＡカラム上に固定されている間に、タンパク質をうまくリフォールディングすることができる。模範的な条件は、プロテアーゼ阻害剤を含む、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０％グリセロール、ｐＨ７．４で２０ｍＭのトリス／ＨＣｌにおける直線６Ｍ−１Ｍ尿素勾配を使用する復元である。復元は、１．５時間以上の期間にわたって行われるべきである。復元後、２５０ｍＭのイミダゾールの添加によってタンパク質を溶出する。ＰＢＳまたはｐＨ６で５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液および２００ｍＭのＮａＣｌに対する最終透析ステップによって、イミダゾールを除去する。精製タンパク質を４℃で保存するか、または−８０℃で凍結する。

上記の発現ベクターに加えて、本発明は、ｐＨＥ４ａ（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４５，１９９８年２月２５日に寄託）と呼ばれる、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結される、ファージオペレーターおよびプロモーター要素を含む、ｐＨＥ４ａ（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４５、１９９８年２月２５日に寄託）と呼ばれる発現ベクターをさらに含む。このベクターは、１）選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）大腸菌の複製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配列、５）Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列、および６）乳糖オペロン抑制遺伝子（ｌａｃＩｑ）を含む。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プロモーターおよびオペレーター配列は、合成される。

ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８でベクターを制限し、ゲル上で制限した産物を流し、かつより大きいフラグメント（スタッファフラグメントは、約３１０の塩基対となるべきである）を分離することによって、ＤＮＡをｐＨＥ４ａに挿入することができる。ＤＮＡ挿入物は、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する制限部位を有するＰＣＲプライマーを使用して、本明細書に記載の、あるいは当該分野で公知のＰＣＲプロトコルに従って生成する。ＰＣＲ挿入物をゲル精製し、適合酵素で制限する。挿入物およびベクターは、標準的プロトコルに従って結紮する。
加工ベクターは、細菌系においてタンパク質を発現するように、上記のプロトコルで置換され得る。

寄託サンプルからの選択ｃＤＮＡクローンの単離
本発明のアルブミン融合構築物の多くは、表３に示されるようにＡＴＣＣに寄託されている。アルブミン融合構築物は、酵母サッカロマイセス・セレビシエ発現ベクターｐＳＡＣ３５、哺乳類発現ベクターｐＣ４、または哺乳類発現ベクターｐＥＥ１２．１といった発現ベクターのうちのいずれか１つを備え得る。
ｐＳＡＣ３５（Ｓｌｅｅｐｅｔａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：４２）、ｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６、Ｃｕｌｌｅｎｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（１９８５）、Ｂｏｓｈａｒｔｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ４１：５２１−５３０（１９８５））、およびｐＥＥ１２．１（ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．、ＳｔｅｐｈｅｎｓａｎｄＣｏｃｋｅｔｔ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：７１１０（１９８９）、国際公報第ＷＯ８９／０１０３６号、Ｍｕｒｐｈｙｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．２２７：２７７−２７９（１９９１）、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６９−１７５（１９９２）、米国特許第５，１２２，４６４号、国際公報第ＷＯ８６／０５８０７号）ベクターは、細菌細胞の成長のためのアンピシリン耐性遺伝子を備える。これらのベクター、および／またはそれらを備えるアルブミン融合構築物は、Ｈａｎａｈａｎ等の当該分野に記載の技術を使用して、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＸＬ−１Ｂｌｕｅ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，１１０１１Ｎ．ＴｏｒｒｅｙＰｉｎｅｓＲｏａｄ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７）等の大腸菌株に形質転換し、１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ寒天プレート上に広げ、３７℃で一晩増殖させることができる。

任意の所与のアルブミン融合構築物について表３に引用されるＡＴＣＣ寄託番号を割り当てられたサンプルにおける寄託物質はまた、１つ以上の追加アルブミン融合構築物を含んでもよく、それぞれが異なるアルブミン融合タンパク質をコードする。したがって、同じＡＴＣＣ寄託番号を共有する寄託物は、少なくとも表３の対応する列で識別されるアルブミン融合構築物を含む。
表３のアルブミン融合構築物について引用されるプラスミドＤＮＡの寄託サンプル由来の特定のアルブミン融合構築物を単離するために、２つの方法を使用することができる。

方法１：スクリーニング
第１に、当該分野で公知の方法を使用し、表１の個々の構築物ＩＤ番号についての配列番号Ｘに対応するポリヌクレオチドプローブを使用して、寄託プラスミドＤＮＡのサンプルをスクリーニングすることによって、アルブミン融合構築物を直接単離し得る。例えば、報告される配列に従ってＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤＮＡ合成機を使用して、３０〜４０のヌクレオチドを有する特定のポリヌクレオチドを合成し得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して^３２Ｐ−γ−ＡＴＰで標識化し、慣用的方法に従って精製することができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ，ＮＹ（１９８２））。ベクター供給業者によって提供されるか、または上記の関連公報または特許において提供されるもの等の、当業者に公知の技術を使用して、所与のＡＴＣＣ寄託物由来のアルブミン融合構築物を、上記に示されるように、適切な宿主（ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等）に形質転換する。１プレートあたり約１５０の形質転換体（コロニー）の密度まで、形質転換体を１．５％寒天プレート（適切な選択剤、例えば、アンピシリンを含む）上にプレートする。細菌コロニースクリーニングのための慣用的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄｉｔ．，（１９８９），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ１．９３ｔｏ１．１０４）、または当該分野で公知の他の技術に従って、これらのプレートをナイロン膜を使用してスクリーニングする。

方法２：ＰＣＲ
あるいは、所定のアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、所定のアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡに対して５´側および３´側の寄託されたアルブミン融合構築物に対してハイブリダイズする１７〜２０ヌクレオチドの２つのプライマーを使用することによって、配列番号Ｘを有する寄託されたアルブミン融合構築物のサンプルから増幅され得る。例えば、０．５ｕｇの上記ｃＤＮＡテンプレートとの２５μｌの反応混合物中で、所定条件下にてポリメラーゼ連鎖反応を行う。従来の反応混合物は、１．５〜５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞれ２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマー、および０．２５単位のＴａｑポリメラーゼである。Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ自動サーマルサイクラーにより、３５サイクルのＰＣＲ（９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間の℃アニーリング、７２℃で１分間の伸長）を行う。増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、予測分子量を有するＤＮＡバンドを切り出し、精製する。ＰＣＲ産物は、サブクローニングによって選択された配列であることが検証され、ＤＮＡ産物を配列決定する。
寄託クローン中に存在しないかもしれない遺伝子の５´または３´非コード部分の識別のために、いくつかの方法が利用可能である。これらの方法は、フィルタプロービング、特異的プローブを使用するクローン強化、および当該分野で公知の５´および３´「ＲＡＣＥ」プロトコルと同様または同一のプロトコルを含むが、これらに限定されない。例えば、５´ＲＡＣＥと同様の方法は、所望の全長転写物の欠落した５´末端を生成するために利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））。

簡潔に言えば、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、おそらく全長遺伝子ＲＮＡ転写物を含むＲＮＡ集団の５´末端に連結する。所望の全長遺伝子の５´部分をＰＣＲを増幅するために、連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライマーを含むプライマーのセットを使用する。次いで、この増幅産物を、配列決定し、全長遺伝子を生成するために使用し得る。

この上記方法は、所望の供給源から単離された全ＲＮＡで開始するが、ポリ−Ａ＋ＲＮＡを使用し得る。次いで、必要であれば、ＲＮＡ調製物をホスファターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程に干渉するかもしれない、分解または損傷ＲＮＡ上の５´リン酸基を排除することができる。次いで、ホスファターゼを活性化するべきであり、メッセンジャーＲＮＡの５´末端に存在するキャップ構造を除去するために、ＲＮＡをタバコ酸ピロホスファターゼで処理するべきである。この反応は、キャップ切断ＲＮＡの５´末端にリン酸基を残し、次いでこれは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを使用してＲＮＡオリゴヌクレオチドに連結することができる。
この修飾ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用する、第１鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用する。第１鎖合成反応を、連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマー、および目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライマーを使用する、所望の５´末端のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用する。次いで、得られた産物を、配列決定し、分析して、５´末端配列が所望の遺伝子に属することを確認する。

多重融合の融合
アルブミン融合タンパク質（例えば、アルブミン（またはそのフラグメントあるいは変異体）に融合される治療用タンパク質（またはそのフラグメントあるいは変異体）を含む）は、加えて、他のタンパク質に融合されて、「多重融合タンパク質」を生成し得る。これらの多重融合タンパク質は、種々の用途に使用することができる。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質とＨｉｓ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、タンパク質Ａ、ＩｇＧ領域、およびマルトース結合タンパク質へとを融合させることで、精製が容易になる（例えば、ＥＰＡ３９４，８２７、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３１：８４−８６（１９８８）を参照）。本発明のポリペプチドに融合された核局在化シグナルは、細胞内局在性に特有のタンパク質を標的にすることができる一方で、共有結合ヘテロ二量体またはホモ二量体は、アルブミン融合タンパク質の活性を増加または減少させることができる。その上、本発明のアルブミン融合タンパク質と追加タンパク質配列との融合は、融合タンパク質の可溶性および／または安定性をさらに増加させ得る。前述の融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を使用するか、または慣用的な修正によって、および／または、ＩｇＧ分子へのポリペプチドの融合を概説する次のプロトコルを修正することによって、製作することができる。
簡潔に言えば、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、下記の配列の５´および３´末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅することができる。これらのプライマーはまた、発現ベクター、例えば、哺乳類または酵母発現ベクターへのクローニングを容易にする便利な制限酵素部位を有するべきである。

例えば、ｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）が使用される場合、ヒトＦｃ部分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結することができる。３´ＢａｍＨＩ部位が破壊されるはずであることに注目されたい。次に、ヒトＦｃ部分含むベクターは、ＢａｍＨＩに再制限し、ベクターに線形化し、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（当該分野で公知の技術を使用して生成および単離される）がこのＢａｍＨＩ部位に連結する。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、終止コドンなしでクローニングされ、そうでなければ、融合タンパク質を含むＦｃが産生されないことに注目されたい。
本発明のアルブミン融合タンパク質を産生するために自然発生のシグナル配列が使用される場合、ｐＣ４は第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、自然発生のシグナル配列が使用されない場合、ベクターは異種シグナル配列を含むように修正することができる。（例えば、国際公報第ＷＯ９６／３４８９１号を参照。）

ヒトＩｇＧＦｃ領域：
ＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＧＧＴＧＣＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣ
ＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＡＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣ
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ＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡ
ＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴ
ＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡＧＴＧＣＧＡＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴ（配列番号５２）

アルブミン融合タンパク質由来の抗体の産生
ハイブリドーマ技術
発明のアルブミン融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質の部分（例えば、融合タンパク質の治療用タンパク質部分またはアルブミン部分）に結合する抗体は、種々の方法によって調製することができる。（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ２を参照。）そのような方法の一例として、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部の調製物を調製し、実質的に天然汚染物質を含まないように精製する。次いで、より大きい比活性度を有するポリクローナル抗血清を産生するために、そのような調製物を動物に導入する。
ハイブリドーマ技術を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部に特異的なモノクローナル抗体を調製する（Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５）、Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）、Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇｅｔａｌ．，ｉｎ：ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡＮｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＴ−ＣｅｌｌＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．５６３−６８１（１９８１））。一般に、動物（例えば、マウス）は、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部によって免疫される。そのようなマウスの脾細胞を抽出し、適切な骨髄腫細胞株と融合する。本発明に従って、任意の適切な骨髄腫細胞株を採用し得る。しかしながら、ＡＴＣＣより入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を採用し得る。融合後、結果として生じたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地中で選択的に維持し、次いで、Ｗａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ８０：２２５−２３２（１９８１））による記載のように限界希釈によってクローニングする。次いで、そのような選択を通して得られたハイブリドーマ細胞は、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部を結合することが可能な抗体を分泌するクローンを識別するために、アッセイされる。

あるいは、抗イディオタイプ抗体を使用する２段階手順において、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部に結合することが可能な追加抗体を産生することができる。そのような方法は、抗体自体が抗原であり、２次抗体に結合する抗体を得ることが可能であるという事実を利用している。本方法に従って、動物、例えばマウスを免疫するために、抗体に特異的なタンパク質を使用する。次いで、ハイブリドーマ細胞を産生するために、そのような動物の脾細胞を使用し、ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、本発明のアルブミン融合タンパク質（または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部）に特異的な抗体に結合する能力が、本発明の融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部によって遮断され得る抗体を産生する、クローンを識別する。そのような抗体は、本発明の融合タンパク質（または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部）に特異的な抗体に対する抗イディオタイプ抗体を備え、さらなる本発明の融合タンパク質（または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部）に特異的な抗体の形成を誘導する目的で動物に免疫するために使用される。

ヒトにおける抗体の生体内使用のために、抗体を「ヒト化」する。そのような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞由来の遺伝子構築物を使用して産生することができる。キメラおよびヒト化抗体を産生するための方法は、当該分野において公知であり、本明細書で論じられる（論評として、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２（１９８５）、Ｏｉｅｔａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４（１９８６）、Ｃａｂｉｌｌｙｅｔａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，欧州特許第１７１４９６号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．，欧州特許第１７３４９４号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ．，第ＷＯ８６０１５３３号、Ｒｏｂｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，国際公報第ＷＯ８７０２６７１号、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１２：６４３（１９８４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１４：２６８（１９８５）を参照）。
ｓｃＦｖｓのライブラリー由来の、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部に対する抗体フラグメントの分離。ヒトＰＢＬから単離された自然発生のＶ遺伝子は、ドナーが曝露され得る、され得ない、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部に対する反応性を含む、抗体フラグメントのライブラリーに構築される（例えば、参照することによってその全体が本明細書中に組み込まれる、米国特許第５，８８５，７９３号を参照）。

ライブラリーのレスキュー。ｓｃＦｖｓのライブラリーは、国際公報第ＷＯ９２／０１０４７号に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡから構築される。抗体フラグメントを提示するファージをレスキューするために、ファージミドを内部に持つ約１０^９個の大腸菌を使用し、１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５０ｍｌの２ｘＴＹ（２ｘＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を播種して、Ｏ．Ｄ．が０．８になるまで振盪しながら増殖させる。５０ｍｌの２ｘＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに播種するために、この培養液のうちの５ｍｌを使用し、２ｘ１０８ＴＵのデルタ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩ、国際公報第ＷＯ９２／０１０４７号を参照）を添加して、培養液を振盪せずに３７℃で４５分間、次いで振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートする。培養液を４０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離し、ペレットを１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０ｕｇ／ｍｌカナマイシンを含む２リットルの２ｘＴＹ中で再懸濁して一晩増殖させる。ファージは、国際公報第ＷＯ９２／０１０４７号に記載のように調製する。

Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩは、次のように調製する。Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩヘルパーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしないため、抗体フラグメントを提示するファージ（ミド）が抗原への大きな結合親和力を持っている。感染性のＭ１３デルタ遺伝子ＩＩＩ粒子は、ファージの形態形成の間に、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を提供するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞中で、ヘルパーファージが増えることによって、作られる。培養液は、振盪せずに３７℃で１時間、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時間インキュベートする。細胞は、沈降し（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ８，４００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間）、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含む３００ｍｌの２ｘＴＹ培養液（２ｘＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）中で再懸濁し、３７℃で振盪して一晩増殖させる。ファージ粒子は、２回のＰＥＧ沈降（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９９０）によって培養培地から生成および濃縮し、２ｍｌのＰＢＳ中で再懸濁し、０．４５μｍフィルタ（ＭｉｎｉｓａｒｔＮＭＬ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に通過させて、約１０^１３形質導入単位／ｍｌの最終濃度を生じる（アンピシリン耐性クローン）。
ライブラリーのパンニング。１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌいずれかの本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部の４ｍｌを伴うＰＢＳ中で、Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ（Ｎｕｎｃ）を一晩被覆する。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳで３７℃にて２時間遮断し、次いで、ＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０^１３ＴＵのファージをチューブに塗布し、ターンテーブルの上および下で横に倒したまま、室温で３０分間インキュベートし、次いでさらに１．５時間静置したままにしておく。チューブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回洗浄し、ＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、ターンテーブル上および下で１５分間回転することによってファージを溶出し、その後に、ｐＨ７．４で０．５ｍｌの１．０Ｍトリス−ＨＣｌにより溶液を直ちに中和する。次いで、細菌を伴う溶出ファージを３７℃で３０分間インキュベートすることによって、１０ｍｌの中間対数大腸菌ＴＧ１を感染させるためにファージを使用する。次いで、１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＹＥプレートに大腸菌をプレートする。次いで、結果として生じる細菌ライブラリーを、ファージを調製するために上で記載したように、この後の選択の段階でデルタ遺伝子３ヘルパーファージによってレスキューする。次いで、合計４回の親和性精製に対してこの過程を反復し、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２０回、３回目と４回目においてはＰＢＳで２０回、チューブを洗浄する。

結合体の特徴付け。大腸菌ＨＢ２１５１を感染させるために第３回目および第４回目の選択からの溶出ファージを使用し、アッセイによる単一コロニーから可溶性ｓｃＦｖを産生する（Ｍａｒｋｓ，ｅｔａｌ．，１９９１）。ｐＨ９．６で５０ｍＭの重炭酸塩中で、１０ｐｇ／ｍｌの本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部のいずれかで被覆されたマイクロタイタープレートにより、ＥＬＩＳＡを行う。ＥＬＩＳＡで陽性のクローンは、ＰＣＲ指紋法（例えば、国際公報第ＷＯ９２／０１０４７号を参照）によって、次いで配列決定によって、さらに特徴付けられる。これらのＥＬＩＳＡ陽性クローンはまた、例えば、エピトープマッピング、結合親和性、受容体シグナル伝達、抗体／抗原結合を遮断する、または競合的に阻害する能力、および競合的アゴニストおよび拮抗活性等の、当該分野で公知の技術によってさらに特徴付けられ得る。

［ ^３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込みアッセイ
脂肪、骨格筋、および肝臓は、インスリン感受性組織である。インスリンは、これらの組織へのグルコース取り込み／輸送を刺激することができる。脂肪および骨格筋の場合、インスリンは、特殊細胞内区画から細胞表面まで、グルコース輸送担体４分子ＧＬＵＴ４の転移を最終的に導く、シグナル伝達を開始する。一旦細胞表面上にくると、ＧＬＵＴ４は、グルコース取り込み／輸送を可能にする。

［ ^３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込み
糖尿病の処置について列挙される治療薬のうちのいずれか１つ以上の組み合わせの非存在下または存在下で、グルコース取り込み／輸送能力について試験するために、多数の脂肪および筋肉関連細胞株を使用することができる。特に、３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞およびＬ６マウス骨格筋細胞は、それぞれ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞および筋管に分化され、［^３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込みアッセイについての適切な生体外モデルとして働くことができる（Ｕｒｓｏｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２７４（４３）：３０８６４−７３（１９９９）、Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１９（３）：２４１−８（１９９７）、Ｈａｓｐｅｌｅｔａｌ．，ＪＭｅｍｂｒＢｉｏｌ，１６９（１）：４５−５３（１９９９）、Ｔｓａｋｉｒｉｄｉｓｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６（１０）：４３１５−２２（１９９５））。簡潔に言えば、２×１０^５細胞／１００μＬの脂肪細胞または分化Ｌ６細胞を、分化後培地中の、５０μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リジンで処理された、すなわち被覆された９６ウェル細胞培養「ＴＣ」に移し、５％ＣＯ_２中で３７℃にて一晩インキュベートする。細胞はまず、無血清低グルコースＤＭＥＭ培地で１回洗浄し、次いで、１ｎＭのインシュリンの非存在下または存在下で、１００μＬ／ウェルの同じ培地および１００μＬ／ウェルの緩衝液または糖尿病の処置について列挙された１つ以上の治療薬物（例えば、漸増濃度の１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの本発明の治療剤（例えば、配列番号Ｙとして開示された特定の融合物ならびにそのフラグメントおよび改変体））の組み合わせのいずれかで、３７℃で１６時間枯渇する。プレートは１００μＬ／ウェルのＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で３回洗浄する。１０μＭ標識［^３Ｈ］−２−デオキシグルコース（Ａｍｅｒｓｈａｍ，＃ＴＲＫ６７２）および１０μＭ非標識２−デオキシグルコース（ＳＩＧＭＡ，Ｄ−３１７９）の存在下で、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中で、３７℃で３０分間、１ｎＭでインスリンを添加する。対照として、インスリンの欠如を除いて同じ条件を実施する。最終濃度の１０μＭのサイトカラシンＢ（ＳＩＧＭＡ，Ｃ６７６２）を、非特異的取り込みを測定するために別個のウェル中に１００μＬ／ウェルで添加する。細胞をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で３回洗浄する。標識された、すなわち１０μＭの［^３Ｈ］−２−デオキシグルコース、および標識されていない、すなわち１０μＭの２−デオキシグルコースを、室温で１０分間添加する。細胞を冷リン酸緩衝食塩水「ＰＢＳ」で３回洗浄する。０．２ＮＮａＯＨの１５０μＬ／ウェルの添加、および続いての室温で２０分間の振盪を伴うインキュベーション時に、細胞を溶解させる。次いで、サンプルをシンチレーションバイアルに移し、それに５ｍＬのシンチレーション液を添加する。ベータシンチレーションカウンタにおいてバイアルを計数する。二重条件での取り込み（差異はインスリンの有無である）は、［（１分あたりのインスリン計数「ｃｐｍ」-非特異的ｃｐｍ）／（無インスリンｃｐｍ-非特異的ｃｐｍ）］という方程式で決定される。平均応答は、脂肪細胞および筋管に対する対照のそれぞれ約５倍および３倍の限度内に含まれる。

細胞の分化
細胞をＴ−７５ｃｍ^２フラスコ中で完全にコンフルエントにさせる。培地を除去し、２５ｍＬの分化前培地で４８時間置換させる。５％ＣＯ_２、８５％湿度で３７℃にて、細胞をインキュベートする。４８時間後、分化前培地を除去し、２５ｍＬの分化培地で４８時間置換させる。５％ＣＯ_２、８５％湿度で３７℃にて、細胞を再びインキュベートする。４８時間後、培地を除去し、３０ｍＬの分化後培地で置換する。１４〜２０日間または完全分化が達成されるまで、分化後培地を維持する。２〜３日毎に培地を交換する。ヒト脂肪細胞は、Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，ＩＮＣ（＃ＳＡ−１０９６）より購入することができる。

［ ^３Ｈ］−チミジンの膵臓細胞株への取り込みの生体外アッセイ
時間および用量依存的に、ＧＬＰ−１がラット膵管上皮細胞株ＡＲＩＰの分化を誘導することが近年示されており、これは、膵島十二指腸ホメオボックス−１（ＩＤＸ−１）およびインスリンｍＲＮＡレベルの増加に関連する（Ｈｕｉｅｔａｌ．，２００１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５０（４）：７８５−９６）。順に、ＩＤＸ−１は、ＧＬＰ−１受容体のｍＲＮＡレベルを増加させる。

試験された細胞型
ＲＩＮ−Ｍ細胞：これらの細胞は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ細胞株番号ＣＲＬ−２０５７）より入手可能である。ＲＩＮ−Ｍ細胞株は、放射線誘導性の移植可能なラット島細胞腫に由来した。細胞株は、腫瘍のヌードマウス異種移植片から確立した。細胞は、島ポリペプチドホルモンを産生および分泌し、Ｌ−ドーパデカルボキシラーゼ（アミン前駆物質取り込みおよび脱炭酸またはＡＰＵＤ活性を有する細胞に対するマーカー）を産生する。

ＡＲＩＰ細胞：これらは、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ細胞株番号ＣＲＬ−１６７４）より入手可能な、上皮形態の膵臓外分泌細胞である。参考文献の、Ｊｅｓｓｏｐ，Ｎ．Ｗ．ａｎｄＨａｙ，Ｒ．Ｊ．，”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｗｏｒａｔｐａｎｃｒｅａｔｉｃｅｘｏｃｒｉｎｅｃｅｌｌｌｉｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅｔｕｍｏｒｓ，”ＩｎＶｉｔｒｏ１６：２１２，（１９８０）、Ｃｏｃｋｅｌｌ，Ｍ．ｅｔａｌ．，”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｔｈａｔｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈａｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆｇｅｎｅｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅａｃｉｎａｒｐａｎｃｒｅａｓ，”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２４６４−２４７６，（１９８９）、Ｒｏｕｘ，Ｅ．，ｅｔａｌ．”Ｔｈｅｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＰＴＦ１ｃｏｎｔａｉｎｓｔｗｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｕｂｕｎｉｔｓｔｈａｔｉｎｔｅｒａｃｔｗｉｔｈｔｈｅＤＮＡ” ＧｅｎｅｓＤｅｖ．３：１６１３−１６２４，（１９８９）、および、Ｈｕｉ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，”Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ１ｉｎｄｕｃｅｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｉｓｌｅｔｄｕｏｄｅｎａｌｈｏｍｅｏｂｏｘ−１−ｐｏｓｉｔｉｖｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃｄｕｃｔａｌｃｅｌｌｓｉｎｔｏｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇｃｅｌｌｓ，” Ｄｉａｂｅｔｅｓ５０：７８５−７９６（２００１）も参照されたい。

細胞の調製
１０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ，＃ＳＨ３００８８．０３）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，＃ＳＨ３０００２７．０１）中でＲＩＮ−Ｍ細胞株を増殖させ、１：３〜１：６の比で６〜８日毎に二次培養する。３〜４日毎に培地を交換する。
１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムおよび１０％ウシ胎仔血清を含むように調製された２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＨａｍ’ｓＦ１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ、＃３０−２００４）中で、ＡＲＩＰ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６７４）細胞株を増殖させる。週に２回、１：３〜１：６の比でＡＲＩＰ細胞株を二次培養する。３日から４日毎に培地を交換する。

アッセイプロトコル
９６ウェルプレート中で４０００細胞／ウェルで細胞を播種し、５０％集合まで４８〜７２時間培養する。細胞を１００μＬ／ウェルで無血清培地に切り替える。４８〜７２時間のインキュベーション後、本発明の血清および／または治療薬（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質、およびそのフラグメントならびに変異体）をウェルに添加する。インキュベーションは、さらに３６時間持続する。［^３Ｈ］−チミジン（５〜２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ，＃ＴＲＫ１２０）を１マイクロキュリー／５マイクロリットルに希釈する。３６時間のインキュベーション後、さらに２４時間にわたって１ウェルあたり５マイクロリットルを添加する。細胞を冷リン酸緩衝食塩水「ＰＢＳ」で１回そっと洗浄することによって、反応を終結する。次いで、細胞を、４℃にて１５分間、１００マイクロリットルの氷冷１０％ＴＣＡで固定する。ＰＢＳを除去し、２００マクロリットルの０．２ＮＮａＯＨを添加する。プレートを、振盪しながら室温で１時間インキュベートする。溶液をシンチレーションバイアルに移し、水溶液と適合する５ｍＬのシンチレーション液を添加して激しく混合する。ベータシンチレーションカウンタでバイアルを計数する。陰性対照として、緩衝液のみを使用する。陽性対照として、ウシ胎仔血清を使用する。

糖尿についてのアッセイ
糖尿（すなわち、尿中の過剰な糖分）は、糖尿病の病状の指標を提供するために、容易にアッセイすることができる。健常患者サンプルと比較すると、患者サンプルにおける過剰な尿は、ＩＤＤＭおよびＮＩＤＤＭの症状を示す。そのようなＥＩＤＤＭおよびＮＩＤＤＭ患者の処置の有効性は、尿中の過剰なグルコースの量の得られた減少によって示される。ＩＤＤＭおよびＮＩＤＤＭをモニタリングする実施形態では、当該分野で公知の技術を使用して、グルコースの存在について患者からの尿サンプルをアッセイする。ヒトの糖尿は、１００ｍｌあたり１００ｍｇを超える尿中グルコース濃度によって定義される。糖尿を示す患者における過剰な糖値は、血液サンプルを採取し、かつ血清グルコースをアッセイすることによって、さらに正確に測定することができる。

細胞増殖および分化の刺激および阻害を検出するアッセイ
機能的体液性免疫応答の生成は、Ｂ系細胞とそれらの微小環境との間に可溶性かつ同種のシグナル伝達を必要とする。シグナルは、Ｂ系細胞がそのプログラムされた発達を続けることを可能にする正の刺激、または細胞にその現在の発達経路を停止するように指示する負の刺激を与え得る。現在まで、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、およびＩＬ−１５を含む、数々の刺激および阻害シグナルがＢ細胞反応性に影響を及ぼすことが見出されている。興味深いことに、これらのシグナルは、それら単独では弱いエフェクターであるが、様々な共刺激タンパク質と組み合わせると、Ｂ細胞集団間で、活性化、増殖、分化、ホーミング、耐性、および死を誘導することができる。
Ｂ細胞共刺激タンパク質の最もよく研究されているクラスの１つは、ＴＮＦスーパーファミリーである。このファミリーにおいて、ＣＤ４０、ＣＤ２７、およびＣＤ３０が、それぞれのリガンドであるＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３と共に、種々の免疫応答を調節することが見出されている。これらのＢ細胞集団およびそれらの前駆体の増殖および分化の検出および／または観察を可能にするアッセイは、増殖および分化に関して、これらのＢ細胞集団に対する様々なタンパク質の効果を決定する有益な手段である。以下に列挙される２つのアッセイは、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体の分化、増殖、または阻害の検出を可能にするように設計される。

生体外アッセイ−本発明のアルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質のフラグメントまたは変異体、および／またはアルブミン、あるいはアルブミンのフラグメントまたは変異体を含む、融合タンパク質を含む）は、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体の活性化、増殖、分化、または阻害および／または死を誘導する能力について評価することができる。プライム剤としてホルマリン固定黄色ブドウ球菌ＣｏｗａｎＩ（ＳＡＣ）または固定抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存在下で、精製へんとうＢ細胞が培養される、標準Ｂリンパ球共刺激アッセイにおいて、０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の投薬量に対して定量的に測定される、精製ヒトへんとうＢ細胞に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を評価する。ＩＬ−２およびＩＬ−１５等の第２のシグナルは、ＳＡＣおよびＩｇＭ架橋結合と共同作用して、トリチウム化チミジン取り込みによって測定されるように、Ｂ細胞増殖を誘出する。このアッセイを使用して、新規の相乗効果剤を容易に識別することができる。このアッセイは、ＣＤ３陽性細胞の電磁ビーズ（ＭＡＣＳ）欠損によってヒトへんとうＢ細胞を単離するステップを伴う。得られる細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現によって評価されるように、Ｂ細胞が９５％より多い。

各サンプルの様々な希釈物を、９６ウェルプレートの個々のウェルの中に入れ、これに、１５０ｕｌの全容量の培養培地（１０％ＦＢＳ、５×１０^−５Ｍの２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１０ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、およびＳＡＣの１０^−５希釈を含むＲＰＭＩ１６４０）に懸濁された１０^５個のＢ細胞を添加する。因子添加の７２時間後に、３Ｈ−チミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）による２０時間のパルス（１ｕＣｉ／ウェル）を開始することによって、増殖または阻害を定量する。陽性および陰性対照は、それぞれＩＬ２および培地である。
生体内アッセイ―ＢＡＬＢ／ｃマウスに、緩衝液のみ、または２ｍｇ／Ｋｇの本発明のアルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質のフラグメントまたは変異体、および／またはアルブミン、あるいはアルブミンのフラグメントまたは変異体を含む、融合タンパク質を含む）を、１日２回注射（腹腔内）する。マウスはこの処置を連続４日間受け、その時点で殺処分して、様々な組織および血清を分析のために収集する。正常脾臓および本発明のアルブミン融合タンパク質で処置した膵臓からのＨ＆Ｅ断面の比較は、末梢動脈周囲リンパ鞘の拡散および／または赤脾髄領域の有核細胞性の有意な増加等の、脾臓細胞に対する融合タンパク質の活性の結果を識別し、それはＢ細胞集団の分化および増殖の活性化を示す場合がある。脾臓分離等の脾細胞に対する生理学的変化が、確立されたＴ細胞領域に浸潤する、境界が明確でないＢ細胞帯内の増加したＢ細胞発現量によるものであるかどうかを決定するために、Ｂ細胞マーカーである抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を使用する免疫組織化学的研究を使用する。

アルブミン融合タンパク質が、対照マウスで観察される以上に、ＴｈＢ＋，ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｄｕｌｌＢ細胞の比率を特に増加させるかどうかを示すために、アルブミン融合タンパク質で処置したマウス由来の脾臓のフローサイトメトリー分析を使用する。
同様に、生体内の増加した成熟Ｂ細胞発現量の予想結果は、比較的増加した血清Ｉｇ価である。したがって、緩衝液および融合タンパク質処置マウス間で、血清ＩｇＭおよびＩｇＡレベルを比較する。

Ｔ細胞増殖アッセイ
ＣＤ３誘発増殖アッセイをＰＢＭＣについて行い、^３Ｈ−チミジンの取り込みによって測定する。アッセイを以下のように行う。９６ウェルプレートを、４℃で一晩、ＣＤ３に対して１００μｌ／ウェルのｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、またはイソ型適合対照ｍＡｂ（Ｂ３３．１）で被覆し（ｐＨ９．５の０．０５Ｍ重炭酸緩衝液中で１μｇ／ｍｌ）、次いで、ＰＢＳで３回洗浄する。ヒト末梢血からＦ／Ｈ勾配遠心分離によってＰＢＭＣを単離し、１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含むＲＰＭＩ中、様々な濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質のフラグメントまたは変異体、および／またはアルブミン、あるいはアルブミンのフラグメントまたは変異体を含む、融合タンパク質を含む）（全容量２００ｕｌ）の存在下で、ｍＡｂ被覆プレートの四重ウェル（５×１０^４／ウェル）に添加する。関連タンパク質緩衝液および培地単独は、対照である。３７℃での４８時間培養の後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間回転し、１００μｌの上清を除去し、増殖への影響が観察されれば、ＩＬ−２（または他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で保存する。０．５ｕＣｉの^３Ｈ−チミジンを含む１００ｕｌの培地をウェルに補充し、３７℃で１８〜２４時間培養する。ウェルを収穫し、増殖の尺度として^３Ｈ−チミジンの取り込みを使用する。抗ＣＤ３単独は、増殖に対する陽性対照である。ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）もまた、増殖を強化する対照として使用される。Ｔ細胞の増殖を誘導しない対照抗体は、本発明の融合タンパク質の影響に対する陰性対照として使用される。

ＭＨＣクラスＩＩ、共刺激、および接着分子の発現、ならびに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化に対する本発明の融合タンパク質の影響
樹状細胞は、末梢血中に見出される増殖前駆体の拡張によって生成される。接着ＰＢＭＣまたは浄化単球分画を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）により７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞は、未熟細胞の特徴的な表現型を有する（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現）。ＴＮＦ−α等の活性化因子による処置は、表面表現型の急速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、共刺激および接着分子の増加した発現、ＦＣγＲＩＩの下方調節、ＣＤ８３の上方調節）を引き起こす。これらの変化は、抗原提示能の増強および樹状細胞の機能的成熟に相関する。
表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下のように行う。細胞を、増加する濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質またはＬＰＳ（陽性対照）で１〜３日間処置し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄し、次いで、適切なＦＩＴＣまたはＰＥ標識モノクローナル抗体の１：２０希釈物により、４℃で３０分間インキュベートする。追加洗浄後、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）上のフローサイトメトリーによって標識細胞を分析する。

サイトカインの産生に対する影響。樹状細胞によって生成されるサイトカイン、特にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始において重要である。ＩＬ−１２はＴｈｌヘルパーＴ細胞免疫応答の発達に強く影響し、細胞障害性ＴおよびＮＫ細胞機能を誘導する。次のようにＩＬ−１２放出を測定するためにＥＬＩＳＡを使用する。樹状細胞（１０^６／ｍｌ）を、増加する濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質で２４時間処置する。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照として細胞培養に添加する。次いで、細胞培養からの上清を収集し、市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を使用して、ＩＬ−１２含有量について分析する。キットに添付された標準プロトコルを使用する。
ＭＨＣクラスＩＩ、共刺激、および接着分子の発現に対する影響。接着分子、抗原提示に関与する分子、およびＦｃ受容体といった、細胞表面抗原の３つの主要ファミリーを単球上で識別することができる。ＭＨＣクラスＩＩ抗原、ならびにＢ７およびＩＣＡＭ−１等の他の共刺激分子の発現の調節は、単球の抗原提示能、およびＴ細胞活性化を誘導する能力の変化をもたらし得る。Ｆｃ受容体の発現増加は、単球細胞毒性、サイトカイン放出、および食作用の改善に相関し得る。

表面抗原を検査するために、ＦＡＣＳ分析を以下のように行う。単球を、増加する濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質またはＬＰＳ（陽性対照）で１〜５日間処置し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄し、次いで、適切なＦＩＴＣまたはＰＥ標識モノクローナル抗体の１：２０希釈物により、４℃で３０分間インキュベートする。追加洗浄後、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）上のフローサイトメトリーによって標識細胞を分析する。
単球活性化および／または増加した生存。単球を活性化する（または、その代わりに、不活性化する）、および／または単球生存を増強させる（または、その代わりに、単球生存を減少させる）分子についてのアッセイは、当該分野で公知であり、本発明の分子が単球の阻害剤または活性剤として機能するかどうかを決定するために慣用的に適用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質は、下記の３つのアッセイを使用してスクリーニングすることができる。３つのアッセイのそれぞれについて、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）による遠心分離によって、単一ドナーｌｅｕｋｏｐａｃｋ（ＡｍｅｒｉｃａｎＲｅｄＣｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製する。向流遠心分離水簸によって、ＰＢＭＣから単球を分離する。

単球生存アッセイ。ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在下で培養されると、生存能力を漸進的に失う。それらの死は、内部調節過程（アポトーシス）に起因する。ＴＮＦ−アルファ等の活性化因子の培養への添加は、細胞生存を劇的に改善し、ＤＮＡ断片化を防ぐ。アポトーシスを測定するために、以下のようにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用する。１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファ（陰性対照）の存在下、および様々な濃度の試験される融合タンパク質の存在下で、単球を、無血清培地（陽性対照）においてポリプロピレン管中で４８時間培養する。最終濃度５μｇ／ｍｌのＰＩ含有ＰＢＳ中で、２×１０^６／ｍｌの濃度で、細胞を懸濁し、次いで、ＦＡＣＳｃａｎ分析の前に室温で５分間インキュベートする。ＰＩの取り込みは、この実験的パラダイムにおいてＤＮＡ断片化と相関することが実証されている。

サイトカイン放出に対する影響。単球／マクロファージの重要な機能は、刺激後のサイトカインの放出を通した、免疫系の他の細胞集団への調節活性である。サイトカイン放出を測定するＥＬＩＳＡを以下のように行う。増加する濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質により、同じ条件下であるが、融合タンパク質の非存在下で、ヒト単球を５×１０^５細胞／ｍｌの密度でインキュベートする。ＩＬ−１２産生のために、融合タンパク質の存在下で、細胞をＩＦＮ（１００Ｕ／ｍｌ）で一晩プライミングする。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。２４時間後に馴化培地を収集し、使用するまで凍結保存する。次いで、市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を使用し、キットに添付された標準プロトコルを適用して、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−８の測定を行う。

酸化的バースト。精製単球を、２〜１×１０^５細胞／ウェルで９６ウェルプレートにプレートする。増加する濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質を、総体積０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）においてウェルに添加する。３日のインキュベーション後、プレートを遠心分離し、培地をウェルから除去する。マクロファージ単層に、刺激剤（２００ｎＭのＰＭＡ）と共に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、５．５ｍＭのデキストロース、０．５６ｍＭのフェノールレッド、および１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）を添加する。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、１ウェルあたり２０μｌの１ＮＮａＯＨを添加することによって、反応を停止する。６１０ｎｍで吸光度を読み取る。マクロファージによって産生されるＨ_２Ｏ_２の量を計算するために、既知のモル濃度のＨ_２Ｏ_２溶液の標準曲線を各実験について行う。

血管内皮細胞の増殖に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の影響
第１日に、４％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１６単位／ｍｌのヘパリン、および５０単位／ｍｌの内皮細胞増殖補完物（ＥＣＧＳ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含むＭ１９９培地中に、２〜５×１０^４細胞／３５ｍｍの皿密度でヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を播種する。第２日に、培地を、１０％ＦＢＳ、８単位／ｍｌのヘパリンを含むＭ１９９培地に取り換える。様々な濃度で、本発明のアルブミン融合タンパク質、ならびにＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）等の陽性対照を添加する。第４日および第６日に、培地を取り換える。第８日に、ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔｅｒで細胞の数を決定する。
ＨＵＶＥＣ細胞の数の増加は、融合タンパク質が血管内皮細胞を増殖させ得ることを示す一方で、ＨＵＶＥＣ細胞の数の減少は、融合タンパク質が血管内皮細胞を阻害することを示す。

ラット角膜創治癒モデル
この動物モデルは、新血管形成に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の影響を示す。実験プロトコルは以下を含む。
角膜の中心から間質細胞層の中へ１〜１．５ｍｍの長さの切開を行う。
目尻に面する切開の縁の下にへらを挿入する。
ポケット（その基部は、目の縁から１〜１．５ｍｍである）を作成する。
５０ｎｇ〜５ｕｇの本発明のアルブミン融合タンパク質を含むペレットをポケット内に位置付ける。
本発明のアルブミン融合タンパク質による処置はまた、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬量範囲内で（毎日の処置を５日間）、角膜創に局所的に適用することもできる。

糖尿病マウスおよびグルココルチコイド損傷創傷治癒モデル
糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル
本発明のアルブミン融合タンパク質が治癒過程を加速することを実証するために、創傷治癒の遺伝的糖尿病マウスモデルを使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける全層創傷治癒モデルは、損傷創傷治癒障害の十分に特徴付けられ、臨床的に関連性があり、再現可能なモデルである。糖尿病創傷の治癒は、収縮よりもむしろ、肉芽組織の形成および再上皮形成に依存している（Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９（１９９２）、Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。

糖尿病動物は、２型糖尿病で観察される特性の多くを有する。同型（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、通常の異型（ｄｂ＋／＋ｍ）同腹子と比較して肥満である。変異糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、第４染色体上の単一常染色体劣性変異（ｄｂ＋）をを有する（Ｃｏｌｅｍａｎｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：２８３−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。変異糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血糖、増加したまたは正常なインスリン濃度、および抑制された細胞性免疫を有する（Ｍａｎｄｅｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）、Ｄｅｂｒａｙ−Ｓａｃｈｓ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１−７（１９８３）、Ｌｅｉｔｅｒｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．ｏｆＰａｔｈｏｌ．１１４：４６−５５（１９８５））。末梢神経障害、心筋合併症、および微小血管病変、基底膜肥厚、および糸球体濾過異常が、これらの動物において説明されている（Ｎｏｒｉｄｏ，Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２１−２３２（１９８４）、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎｅｔａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ２９（１）：６０−６７（１９８０）、Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉｅｔａｌ．，ＬａｂＩｎｖｅｓｔ．４０（４）：４６０−４７３（１９７９）、Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ３１（Ｓｕｐｐｌ）：１−６（１９８２））。これらの同型糖尿病マウスは、高血糖症を発症し、これはヒト２型糖尿病と類似してインスリンに耐性がある（Ｍａｎｄｅｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３７７（１９７８））。

これらの動物で観察される特性は、このモデルにおける治癒が、ヒト糖尿病で観察される治癒に同様となる場合があることを示唆する（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．ｏｆＰａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０））。
遺伝的糖尿病の雌Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウス、およびそれらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）異型同腹子を、この研究で使用する（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。動物は、生後６週間で購入し、研究の開始時に生後８週間である。動物を個別に収容し、食物および水を随意に与える。無菌法を使用して、全ての操作を行う。ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅａｎｄｔｈｅＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒｔｈｅＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って、実験を行う。

以前に報告された方法（Ｔｓｕｂｏｉ，Ｒ．ａｎｄＲｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０））に従って、創傷プロトコルを行う。簡潔に言えば、創傷の日に、脱イオン水に溶解されたＡｖｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロムエタノールおよび２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射で動物に麻酔をかける。動物の背部を剃毛し、７０％エタノール溶液およびヨウ素で皮膚を洗浄する。創傷の前に、滅菌ガーゼで手術領域を乾燥させる。次いで、Ｋｅｙｅｓ組織パンチを使用して、８ｍｍの全層創傷を作成する。創傷の直後に、周囲の皮膚をそっと伸張して創傷拡張を排除する。創傷は、実験の期間中に開いておく。治療の適用は、創傷の日から開始して連続５日間、局所的に与える。治療の前に、無菌食塩水およびガーゼスポンジで創傷をそっと浄化する。
手術の日および以降２日間隔で、創傷を視診して固定距離で写真撮影する。第１〜５日および第８日目の毎日の測定によって創縫合を決定する。目盛り付きＪａｍｅｓｏｎキャリパーを使用して、創傷を縦横に測定する。肉芽組織がもはや見えなくなり、創傷が連続上皮によって覆われている場合、創傷は治癒したと考えられる。

賦形剤中で、８日間、１日に創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇの異なる用量の範囲で使用し、本発明のアルブミン融合タンパク質を投与する。賦形剤対照群は、５０ｍＬの賦形剤溶液を受けた。
第８日目に、ペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で動物を安楽死させる。次いで、組織学および免疫組織化学のために創傷および周囲皮膚を収穫する。さらなる処理のために、生検スポンジ間の組織カセット中の１０％中性緩衝ホルマリンに組織標本を入れる。
１）賦形剤プラセボ対照、２）未治療群、および３）治療群という、それぞれ１０匹の動物（５匹の糖尿病、および５匹の非糖尿病対照）から成る３群を評価する。
縦横軸に面積を測定して創傷の総平方面積を得ることによって、創縫合を分析する。次いで、最初の創傷面積（第０日）と治療後の創傷面積（第８日）との間の差異を確立することによって、収縮を推定する。第１日目の創傷面積は６４ｍｍ^２であり、皮膚パンチのサイズに対応する。次の方程式を使用して、計算を行う。

ａ．［第８日目の開口面積］−［第１日目の開口面積］／［第１日目の開口面積］
１０％緩衝ホルマリン中に標本を固定し、創面と垂直にパラフィン包埋を切断し（５ｍｍ）、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミクロトームを使用して切り取る。両断創傷の断面上で所定のヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行う。治癒過程および修復皮膚の形態的外観が本発明のアルブミン融合タンパク質による治療によって変化されるかどうかを評価するために、創傷の組織学的検査を使用する。この評価は、細胞蓄積、炎症細胞、毛細血管、線維芽細胞、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検証を含んだ（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。盲検の観察者によって目盛り付きレンズマイクロメータが使用される。

ＡＢＣＥｌｉｔｅ検出システムを使用して、組織切片も、ポリクローナルウサギ抗ヒトケラチン抗体で免疫組織化学的に染色する。陽性組織対照としてヒト皮膚を使用する一方で、陰性対照として非免疫ＩｇＧを使用する。目盛り付きレンズマイクロメータを使用して創傷の再上皮形成の程度を評価することによって、ケラチン生成細胞増殖を決定する。

ＡＢＣＥｌｉｔｅ検出システムと共に抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を使用することによって、皮膚標本中の増殖する細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を実証する。ヒト結腸癌が陽性組織対照としての機能を果たし、陰性組織対照としてヒト脳組織を使用する。各標本は、一次抗体の省略および非免疫マウスＩｇＧとの置換を伴う切片を含んだ。これらの切片の順位付けは、０〜８のスケールでの増殖の程度に基づき、スケールの低い方はわずかな増殖を反映し、高い方は極めて強力な増殖を反映している。
対応のないｔ−検定を使用して、実験データを分析する。０．０５より低いｐ値が有意と考えられる。

ステロイド障害ラットモデル
ステロイドによる創傷治癒の阻害は、様々な生体外および生体内システムにおいて十分に文書で立証されている（Ｗａｈｌ，ＧｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓａｎｄＷｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ．Ｉｎ：Ａｎｔｉ−ＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＳｔｅｒｏｉｄＡｃｔｉｏｎ：ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）、Ｗａｈｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：４７６−４８１（１９７５）、Ｗｅｒｂｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：１６８４−１６９４（１９７８））。グルココルチコイドは、血管形成を阻害し、血管透過性を減少させ（Ｅｂｅｒｔｅｔａｌ．，Ａｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７０１−７０５（１９５２）），線維芽細胞の増殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃｋｅｔａｌ．，ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）、Ｈａｙｎｅｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８））、循環単球の一時的低減を生じる（Ｈａｙｎｅｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）、Ｗａｈｌ，”ＧｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓａｎｄＷｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ”，Ｉｎ：ＡｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＳｔｅｒｏｉｄＡｃｔｉｏｎ：ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．２８０−３０２（１９８９））ことによって、創傷治癒を遅らせる。創傷治癒障害へのステロイドの全身投与は、ラットにおいて十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋｅｔａｌ．，ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）、Ｈａｙｎｅｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）、Ｗａｈｌ，”ＧｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓａｎｄＷｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ”，Ｉｎ：ＡｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＳｔｅｒｏｉｄＡｃｔｉｏｎ：ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．２８０−３０２（１９８９）、Ｐｉｅｒｃｅｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２２２９−２２３３（１９８９））。

本発明のアルブミン融合タンパク質が治癒過程を加速することができることを実証するために、メチルプレドニゾロンの全身投与によって治癒が損なわれているラットの全層切除皮膚創傷に対する、融合タンパク質の複数局所適用の効果を評価する。
この例では、体重２５０〜３００ｇの幼若成体ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラット（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用する。動物は、生後８週間で購入し、研究の開始時に生後９週間である。創傷時にメチルプレドニゾロンの全身投与（１７ｍｇ／ｋｇ／ラット、筋肉注射で）によって、ラットの治癒反応を損なう。動物を個別に収容し、食物および水を随意に与える。無菌法を使用して、全ての操作を行う。ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅａｎｄｔｈｅＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒｔｈｅＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って、研究を行う。
上記に従って、創傷プロトコルに従う。創傷の日に、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉注射で動物に麻酔をかける。動物の背部を剃毛し、７０％エタノールおよびヨウ素溶液で皮膚を洗浄する。創傷の前に、滅菌ガーゼで手術領域を乾燥させる。Ｋｅｙｅｓ組織パンチを使用して、８ｍｍの全層創傷を作成する。創傷の直後に、周囲の皮膚をそっと伸張して創傷拡張を排除する。創傷は、実験の期間中に開いておく。試験物質の適用は、創傷の日から開始して、かつメチルプレドニゾロン投与の後に、連続７日間にわたって１日１回、局所的に与える。治療の前に、無菌食塩水およびガーゼスポンジで創傷をそっと浄化する。

創傷の日および治療の終了時に、創傷を視診して固定距離で写真撮影する。第１〜５日および第８日目の毎日の測定によって創縫合を決定する。目盛り付きＪａｍｅｓｏｎキャリパーを使用して、創傷を縦横に測定する。肉芽組織がもはや見えなくなり、創傷が連続上皮によって覆われている場合、創傷は治癒したと考えられる。
賦形剤中で、８日間、１日に創傷あたり４ｍｇから５００ｍｇの異なる用量の範囲で使用し、本発明のアルブミン融合タンパク質を投与する。賦形剤対照群は、５０ｍＬの賦形剤溶液を受けた。
第８日目に、ペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で動物を安楽死させる。次いで、組織学のために創傷および周囲皮膚を収穫する。さらなる処理のために、生検スポンジ間の組織カセット中の１０％中性緩衝ホルマリンに組織標本を入れる。

１）未治療群、２）賦形剤プラセボ対照、および３）治療群という、それぞれ１０匹の動物（メチルプレドニゾロンを伴う５匹、およびグルココルチコイドを伴わない５匹）から成る３群を評価する。
縦横軸に面積を測定して創縫合の総面積を得ることによって、創縫合を分析し、次いで、最初の創傷面積（第０日）と治療後の創傷面積（第８日）との間の差異を確立することによって、縫合を推定する。第１日目の創傷面積は６４ｍｍ^２であり、皮膚パンチのサイズに対応する。次の方程式を使用して、計算を行う。
ｂ．［第８日目の開口面積］−［第１日目の開口面積］／［第１日目の開口面積］

１０％緩衝ホルマリン中に標本を固定し、創面と垂直にパラフィン包埋を切断し（５ｍｍ）、Ｏｌｙｍｐｕｓミクロトームを使用して切り取る。両断創傷の断面上で所定のヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行う。創傷の組織学的検査は、治癒過程および修復皮膚の形態的外観が本発明のアルブミン融合タンパク質による治療によって改善されるかどうかという評価を可能にする。創傷間隙の距離を決定するために、盲検の観察者によって目盛り付きレンズマイクロメータが使用される。
対応のないｔ−検定を使用して、実験データを分析する。０．０５より低いｐ値が有意と考えられる。

リンパ浮腫動物モデル
この実験法の目的は、ラット後肢のリンパ循環系のリンパ管形成および回復における、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療効果を試験するための、適切で一貫したリンパ浮腫モデルを作成することである。罹患肢の腫脹量、リンパ管系の量の定量化、総血漿タンパク質、および組織病理学によって、有効性を測定する。７〜１０日間、急性リンパ浮腫を観察する。おそらくより重要なことには、浮腫の慢性進行は、最大で３〜４週間続く。
手術を始める前に、タンパク質濃度分析のために血液サンプルを採取する。体重約３５０ｇの雄ラットにペントバルビタールを投与する。その後、右脚を膝から腰まで剃毛する。７０％ＥｔＯＨに浸したガーゼで剃毛領域を拭く。血清総タンパク質試験のために血液サンプルを採取する。２つの測定レベル（かかとの０．５ｃｍ上、背側足の中心点）に印を付けた後、足に染料を注射する前に、周囲および体積測定を行う。左右両方の足の皮内背部に０．０５ｍｌの１％エバンスブルーを注射する。次いで、足への染料の注射後に、周囲および体積測定を行う。

目印として膝関節を使用して、円周方向に中肢鼠径切開を行い、大腿血管の場所を特定することを可能にする。皮膚弁を解離および分離するために、鉗子および止血鉗子を使用する。大腿血管の場所を特定した後、血管と平行し、かつその下に走るリンパ管の場所を特定する。次いで、この領域の主要なリンパ管を電気的に凝固させるか、または縫合結紮する。
顕微鏡を使用して、足の後部の筋肉（半腱様筋および内転筋の付近）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の場所を特定する。次いで、２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管、ならびに膝窩リンパ節の遠位血液供給を、縫合によって結紮する。次いで、結合組織を切り取ることによって、膝窩リンパ節、およびあらゆる付随脂肪組織を除去する。
この手技に起因する、あらゆる軽度出血に注意する。リンパ管が閉塞された後、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪＢｕｃｋ）を使用することによって、皮膚弁を密閉する。脚の周囲に約０．５ｃｍの間隙を残したまま、分離した皮膚縁を下層筋組織に密閉する。また、必要な場合には、下層筋組織に縫合することによって皮膚を固着し得る。

感染を回避するために、網で動物を個別に収容する（床敷きなし）。典型的には第５〜７日に発生した浮腫ピークを通して、回復期にある動物を毎日確認する。次いで、プラトー浮腫ピークを観察する。リンパ浮腫の強度を評価するために、手術前および毎日７日間、各足の２つの指定箇所の周囲および体積を測定する。リンパ浮腫に対するプラズマタンパク質の効果を決定し、タンパク質分析が有用な試験視野計であるかどうかも調査する。対照および浮腫肢の両方の重量を２箇所で評価する。盲検方式で分析を行う。
周囲測定：肢の動きを防ぐ短時間のガス麻酔薬下で、肢の周囲を測定するために布テープを使用する。２名の異なる人物によって距骨および背側足で測定を行い、これら２つの測定値を平均する。対照および浮腫肢の両方から測定値を採取する。
体積測定：手術の日に、ペントバルビタールで動物に麻酔をかけ、手術前に試験する。毎日の体積測定のために、動物は短時間のハロセン麻酔薬（急速固定化および迅速回復）をかけられ、両脚を剃毛して、防水マーカーを使用して平等に印を付ける。まず脚を水に浸し、次いで、それぞれ印を付けたレベルまで計器の中へ浸して、次いで、Ｂｕｘｃｏ浮腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔｏｒ）によって測定する。１個人によってデータが記録される一方で、他の個人が印を付けた領域まで肢を浸している。

血漿タンパク質測定：手術前、次いで総タンパク質およびＣａ２^＋比較の終わりに、血液を採取し、回転し、血清分離する。
肢重量比較：採血後、組織採取に動物を準備する。キリチンを使用して肢を切断し、次いで、実験および対照両方の脚を連結線において切り取り、重さを量る。脛踵関節を外して足の重さを量る際に、第２の計量を行う。
組織学的動物標本：膝の後ろに位置する横筋（膝窩）領域を解離して金型に配設し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷メタルブチンの中へ浸し、切断するまで−８０℃で標識サンプルバッグの中へ入れる。切断時に、リンパ管について蛍光顕微鏡検査下で筋肉を観察する。

本発明のアルブミン融合タンパク質によるＴＮＦアルファ誘発接着分子発現の抑制
炎症および血管形成の領域へのリンパ球の動員は、リンパ球上の細胞表面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的受容体−配位子相互作用を伴う。正常および病理学的両方の設定において、接着過程は、内皮細胞（ＥＣ）上の、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、および内皮性白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチン）発現を伴う、多重段階カスケードに従う。血管内皮上の、これらの分子および他の分子の発現は、炎症反応の発現中に、白血球が局所血管系に付着して局所組織の中へ浸出することができる効率を判定する。サイトカインおよび成長因子の局所濃度は、これらのＣＡＭの発現の変調に関与する。
強力な炎症性サイトカインである、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）は、内皮細胞上の３つのＣＡＭ全ての刺激剤であり、多種多様の炎症反応に関与してもよく、しばしば病理学的結果をもたらす。

ＴＮＦ−α誘発ＣＡＭ発現の抑制を媒介する、本発明のアルブミン融合タンパク質の能力を検査する。タンパク質のＦＧＦファミリーの一構成要素で共刺激される時の、ＴＮＦ−α処置ＥＣ上のＣＡＭ発現の量を測定するために、固相吸収剤としてＥＣを使用する修正ＥＬＩＳＡアッセイを採用する。
実験を行うために、プール臍帯採取物からヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物を得て、５％ＣＯ_２を含む３７℃の加湿インキュベーターにおいて１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した成長培地（ＥＧＭ−２、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）中で維持する。１８〜２４時間、または密集するまで、３７℃にてＥＧＭ培地中で１×１０^４細胞／ウェルの濃度で、ＨＵＶＥＣを９６ウェルプレートに播種する。その後、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０の無血清溶液で単層を３回洗浄し、３７℃で２４時間、所与のサイトカインおよび／または成長因子で処置する。次いで、インキュベート後、ＣＡＭ発現について細胞を評価する。
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を標準９６ウェルプレート中で密集まで成長させる。成長培地を細胞から除去し、９０μｌの１９９培地（１０％ＦＢＳ）に取り換える。陽性または陰性対照を試験するためのサンプルを、３通りのプレートに添加する（１０μｌの量で）。３７℃で５時間（セレクチンおよびインテグリン発現）または２４時間（インテグリン発現のみ）のいずれかにわたって、プレートをインキュベートする。プレートを吸引して培地を除去し、１００μｌの０．１％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を伴う）を各ウェルに添加する。プレートを４℃で３０分間保持する。

次いで、固定剤をウェルから除去し、ＰＢＳ（＋Ｃａ，Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡでウェルを１回洗浄して排水を行う。ウェルを乾燥させないこと。１０μｌの希釈一次抗体を試験および対照ウェルに添加する。１０μｇ／ｍｌ（０．１ｍｇ／ｍｌの原料抗体の１：１０希釈）の濃度で、抗ＩＣＡＭ−１−ビオチン、抗ＶＣＡＭ−１−ビオチン、および抗Ｅ−セレクチン−ビオチンを使用する。加湿環境において、細胞を３７℃で３０分間インキュベートする。ＰＢＳ（＋Ｃａ，Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡでウェルを３回洗浄する。
次いで、２０μｌの希釈ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎアルカリホスファターゼ（１：５，０００希釈）を各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。ＰＢＳ（＋Ｃａ，Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡでウェルを３回洗浄する。ｐ−リン酸ニトロフェノールｐＮＰＰの１錠剤を５ｍｌのグリシン緩衝剤（ｐＨ１０．４）に溶解させる。グリシン緩衝剤中の１００μｌのｐＮＰＰ物質を各試験ウェルに添加する。グリシン緩衝剤中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−アルカリホスファターゼの作業希釈液から、３通りの標準ウェルを調整し、１：５，０００（１０^０）＞１０^−０．５＞１０^−１＞１０^−１．５である。５μｌの各希釈液を３つのウェルに添加し、各ウェル内の結果として生じたＡＰ含有量は、５．５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次いで、１００μｌのｐＮＮＰ試薬を標準ウェルのそれぞれに添加しなければならない。プレートを３７℃で４時間インキュベートしなければならない。５０μｌの量の３ＭＮａＯＨを全てのウェルに添加する。４０５ｎｍにてプレートリーダー上で結果を定量化する。グリシン緩衝剤のみで満たされた空のウェルに、バックグラウンド減算オプションを使用する。テンプレートを設定し、各標準ウェル中のＡＰ共役の濃度を示す［５．５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇ］。結果は、各サンプル中の結合ＡＰ共役の量として示される。

ＧＡＳレポーター構築物の構築
細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル変換経路は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴｓ経路と呼ばれる。Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴｓ経路中の活性化タンパク質は、多くの遺伝子のプロモーターに位置する、ガンマ活性化部位「ＧＡＳ」要素またはインターフェロン感受性応答要素（「ＩＳＲＥ」）に結合する。これらの要素へのタンパク質の結合は、関連遺伝子の発現を変える。
ＧＡＳおよびＩＳＲＥ要素は、シグナル伝達物質および転写活性化剤、または「ＳＴＡＴｓ」と呼ばれる転写因子の類によって認識される。ＳＴＡＴｓファミリーの６つの構成要素がある。Ｓｔａｔ１およびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２のように、多くの細胞型に存在する（ＩＦＮ−アルファへの反応が広範囲に及ぶため）。Ｓｔａｔ４はより制限されており、多くの細胞型の中にはないが、ＩＬ−１２による処置後の細胞である、ＴヘルパークラスＩの中で認められている。Ｓｔａｔ５は当初、乳房成長因子と呼ばれたが、骨髄性細胞を含む他の細胞中で、より高い濃度において認められている。これは、多くのサイトカインによって組織培養細胞中で活性化することができる。
ＳＴＡＴｓは、ヤヌスキナーゼ（「Ｊａｋｓ」）ファミリーとして知られる一式のキナーゼによるチロシンリン酸化時に、細胞質から核へと転座するように活性化される。Ｊａｋｓは、可溶性チロシンキナーゼの個別ファミリーを表し、Ｔｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。これらのキナーゼは、有意な配列類似性を示し、概して、静止細胞において触媒能がない。

Ｊａｋｓは、下記の表で要約される多種多様な受容体によって活性化される（ＳｃｈｉｄｌｅｒａｎｄＤａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による論評からの出典）。Ｊａｋｓを活性化することが可能なサイトカイン受容体ファミリーは、２つの群に分けられ、（ａ）クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンに対する受容体を含み、（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ−１０を含む。クラス１受容体は、保存システインモチーフ（４つの保存システインおよび１つのトリプトファンから成る一式）およびＷＳＸＷＳモチーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号５３）をコードする膜金位領域）を共有する。

したがって、受容体への配位子の結合時に、Ｊａｋｓが活性化され、それが順にＳＴＡＴｓを活性化し、次いでそれが転座してＧＡＳ要素に結合する。この全過程は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴｓシグナル変換経路に包含される。したがって、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示すために、ＧＡＳまたはＩＳＲＥ要素の結合によって反映される、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴｓ経路の活性化を使用することができる。例えば、成長因子およびサイトカインは、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴｓ経路を活性化することが知られている（例えば、下記の表４を参照）。したがって、レポーター分子に結び付けられるＧＡＳ要素を使用することによって、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴｓ経路の活性剤を識別することができる。

実施例２７〜２９に記載の生物学的アッセイで使用される、プロモーター要素を含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲを用いた策略を採用してＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を生成する。５´プライマーは、ＩＲＦ１プロモーターの中にあり、かつ一連のサイトカインによる誘導時にＳＴＡＴｓに結合することが以前に実証されている（Ｒｏｔｈｍａｎｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１：４５７−４６８（１９９４））、ＧＡＳ結合部位の４つのタンデムコピーを含むが、他のＧＡＳまたはＩＳＲＥ要素を代わりに使用することができる。５´プライマーはまた、ＳＶ４０早期プロモーター配列を補完する１８ｂｐの配列も含み、ＸｈｏＩ部位を横に伴う。５´プライマーの配列は下記である。
５´：ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧ：３´（配列番号５４）
下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターを補完し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を横に伴う。５´：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３´（配列番号５５）
Ｃｌｏｎｔｅｃｈより入手されるＢ−ｇａｌ：プロモータープラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターテンプレートを使用して、ＰＣＲ増幅を行う。結果として生じるＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化する。順方向および逆プライマーによる配列決定は、挿入物が下記の配列を含むことを確定する。
５´：ＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴ：３´（配列番号５６）

ＳＶ４０プロモーターに結び付けられる、このＧＡＳプロモーター要素により、次にＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を設計する。ここで、レポーター分子は、分泌アルカリホスファターゼ、または「ＳＥＡＰ」である。しかしながら、明らかに、この実施例または他の実施例のいずれかで、任意のレポーター分子がＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用することができる周知のレポーター分子は、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｂ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体によって検出可能な任意のタンパク質を含む。
上記の配列は、合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター要素が、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈより入手されたｐＳＥＡＰ−プロモーターベクターにサブクローン化され、ＳＶ４０プロモーターを増幅ＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーター要素と効果的に取り換えて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作成することを確定した。しかしながら、このベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を含まないため、哺乳類発現系には好ましくない。

したがって、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳類の安定した細胞株を生成するために、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用してＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターからＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを除去し、多重クローニング部位中のこれらの制限部位を使用して、ｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）等のネオマイシン耐性遺伝子を含むバックボーンベクターに挿入して、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作成する。このベクターが哺乳類細胞に導入されると、このベクターは、実施例２７〜２９に記載のようなＧＡＳ結合のためのレポーター分子として使用することができる。
上記の説明を使用し、かつＧＡＳを異なるプロモーター配列と取り換えて、他の構築物を作ることができる。例えば、ＥＧＲおよびＮＦ−ＫＢプロモーター配列を含むレポーター分子の構築を実施例２７〜３１で説明する。しかしながら、これらの実施例に記載のプロトコルを使用して、多くの他のプロモーターを置換することができる。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンプロモーターを、単独または組み合わせて置換することができる（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、またはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）。同様に、レポーター構築物活性を試験するために、ＨＥＬＡ（上皮）、ＨＵＶＥＣ（内皮）、Ｒｅｈ（Ｂ−細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈）、または心筋細胞等の、他の細胞株も使用することができる。

ＳＥＡＰ活性に対するアッセイ
本明細書で開示される実施例に記載のアッセイに対するレポーター分子として、次の一般手順に従ってＴｒｏｐｉｘＰｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔＫｉｔ（Ｃａｔ．ＢＰ−４００）を使用して、ＳＥＡＰ活性を分析する。ＴｒｏｐｉｘＰｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔＫｉｔは、下記で使用される、希釈、アッセイ、および反応緩衝液を提供する。
ディスペンサーに２．５倍希釈緩衝液を入れ、１５ｕｌの２．５倍希釈緩衝液を、本発明のアルブミン融合タンパク質を含む３５ｕｌの溶液を含むＯｐｔｉｐｌａｔｅに分注する。プラスチックシーラーでプレートを密封し、６５℃で３０分間インキュベートするＯｐｔｉｐｌａｔｅを離して不均一な加熱を回避する。

サンプルを１５分間にわたって室温に冷却する。ディスペンサーを空にし、アッセイ緩衝液を入れる。５０ｍｌのアッセイ緩衝液を添加し、室温で５分間インキュベートする。ディスペンサーを空にし、反応緩衝液を入れる（下記の表を参照）。５０ｕｌの反応緩衝液を添加し、室温で２０分間インキュベートする。化学発光信号の強度は時間依存性であるため、照度計上で５枚のプレートを読み取るのに約１０分かかり、したがって、毎回５枚のプレートを処置して、１０分後に第２セットを開始するべきである。

照度計の相対的な光の単位を読み取る。Ｈ１２を空白に設定し、結果を印刷する。化学発光の増加は、レポーター活性を示す。

ニューロンの活性を識別するアッセイ
細胞が分化および増殖を行う時、多くの異なるシグナル伝達経路を通して、一群の遺伝子が活性化される。これらの遺伝子のうちの１つである、ＥＧＲ１（初期成長応答遺伝子１）は、活性化されると、様々な組織および細胞型において誘導される。ＥＧＲ１のプロモーターは、そのような誘導に関与する。レポーター分子に結び付けられるＥＧＲ１プロモーターを使用して、細胞を活性化する本発明の融合タンパク質の能力を評価することができる。
特に、ＰＣ１２細胞株におけるニューロンの活性を評価するために、次のようなプロトコルを使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫細胞）は、ＴＰＡ（テトラデカノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経成長因子）、およびＥＧＦ（上皮成長因子）等の、多数のマイトジェンによる活性化によって、増殖および／または分化することが知られている。この処置中に、ＥＧＲ１遺伝子発現が活性化される。したがって、ＰＣ１２細胞に、ＳＥＡＰレポーターに結び付けられるＥＧＲプロモーターを含有する構築物を安定的に導入することによって、本発明のアルブミン融合タンパク質によるＰＣ１２細胞の活性化を評価することができる。

ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物は、次のようなプロトコルによって組み立てることができる。ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３から＋１）（ＳａｋａｍｏｔｏＫｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６：８６７−８７１（１９９１））は、次のようなプライマーを使用して、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅することができる。
第１のプライマー：５´ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＡＴＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧ−３´（配列番号５７）
第２のプライマー：５´ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣ−３´（配列番号５８）

実施例２４で産生されるＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入することができる。制限酵素ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを線形化し、ＧＡＳ／ＳＶ４０スタッファを除去する。これらの同じ酵素で、ＥＧＲ１増幅産物を制限する。ベクターおよびＥＧＲ１プロモーターを結紮する。
細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、１つの１０ｃｍプレートあたり２ｍｌの塗料溶液（３０％エタノール（濾過滅菌済み）中のＩ型コラーゲン（ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．Ｃａｔ＃０８−１１５）の１：３０希釈）、または９６ウェルプレートのウェルあたり５０ｍｌを添加し、２時間空気乾燥させる。

前被覆した１０ｃｍの組織培養皿の上で、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した、１０％ウマ血清（ＪＲＨＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｃａｔ．＃１２４４９−７８Ｐ）、５％加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中で、ＰＣ１２細胞を定期的に増殖させる。３日から４日毎に、１から４の分割を行う。プレートから細胞を削り取り、１５回よりも多くピペット操作を上下に行って再懸濁する。
当該分野で公知の技術を使用して、ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物をＰＣ１２に導入する。３００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を増殖させることによって、ＥＧＲ−ＳＥＡＰ／ＰＣ１２安定細胞を得る。定期的な増殖にＧ４１８を含まない培地を使用するが、１または２ヶ月毎に、数継代にわたって細胞を３００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８中で再増殖させるべきである。

ニューロンの活性について分析するために、古い培地を除去することによって、約７０から８０％密集の細胞を伴う１０ｃｍプレートをクリーニングする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で１回洗浄する。次いで、低血清培地（抗生物質と共に１％ウマ血清および０．５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）中で、細胞を一晩欠乏状態にする。
翌朝、培地を除去して細胞をＰＢＳで洗浄する。プレートから細胞を削り取り、２ｍｌの低血清培地中で細胞をよく懸濁する。細胞の数を数え、さらに低血清培地を添加して、５×１０^５細胞／ｍｌとして最終細胞密度に到達する。
２００ｕｌの細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１０^５細胞／ウェルに同等）。３７℃で４８から７２時間、一連の異なる濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質を添加する。陽性対照として、５０ｎｇ／ｕｌの神経細胞成長因子（ＮＧＦ）等の、ＥＧＲを通してＰＣ１２細胞を活性化することが知られている成長因子を使用することができる。ＳＥＡＰの５０倍以上の誘導が、典型的に陽性対照ウェルにおいて見られる。当該分野で公知の技術を使用して、および／または実施例２５に記載のように、ＳＥＡＰアッセイを定期的に行うことができる。

Ｔ細胞活性に対するアッセイ
因子を識別し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質がＴ細胞を増殖および／または分化するかどうかを決定することによって、Ｔ細胞活性を評価するために、次のようなプロトコルを使用する。実施例２４で産生されるＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を使用して、Ｔ細胞活性を評価する。したがって、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。このアッセイで使用されるＴ細胞は、ＪｕｒｋａｔＴ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ−１５２）であるが、Ｍｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５５２）およびＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞も使用することができる。
ＪｕｒｋａｔＴ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋Ｔｈ１ヘルパー細胞である。安定した細胞株を生成するために、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、約２００万個のＪｕｒｋａｔ細胞にＧＡＳ−ＳＥＡＰ／ｎｅｏベクターを導入する（下記のトランスフェクション手順）。トランスフェクト細胞をウェルあたり約２０，０００個の細胞の密度まで播種し、１ｍｇ／ｍｌのゲンチシンに耐性があるトランスフェクタントを選択する。耐性コロニーを拡張し、次いで、増加する濃度のインターフェロンγへの反応について試験する。選択したクローンの用量反応が実証される。

具体的には、次のようなプロトコルが、２００ｕｌの細胞を含む７５個のウェルに十分な細胞を生じる。したがって、それは、複数の９６ウェルプレートに十分な細胞を生成するように拡大される、または複数回行われるかのいずれかである。１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐを伴うＲＰＭＩ＋１０％血清中でＪｕｒｋａｔ細胞を維持する。Ｔ２５フラスコ中で、２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１０ｕｇのプラスミドＤＮＡと組み合わせる。５０ｕｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを添加し、室温で１５〜４５分間インキュベートする。
インキュベーション期間中、細胞濃度を数え、必要数の細胞（トランスフェクションあたり１０^７個）を沈降させ、１０^７細胞／ｍｌの最終濃度に、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、Ｔ２５フラスコにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で１ｍｌの１×１０^７個の細胞を添加し、３７℃で６時間インキュベートする。インキュベート後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％血清を添加する。
ＲＰＭＩ＋１０％血清、１ｍｇ／ｍｌゲンチシン、および１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中でＪｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株を維持する。これらの細胞を様々な濃度の本発明の１つ以上の融合タンパク質で処置する。

融合タンパク質による処置の日に、細胞は、洗浄して、１ｍｌあたり５００，０００個の細胞の密度に、新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中で再懸濁するべきである。必要とされる細胞の正確な数は、融合タンパク質の数およびスクリーニングされている異なる濃度の融合タンパク質の数に依存する。１つの９６ウェルプレートに対して、約１，０００個の細胞（１０個のプレートに対して、１億個の細胞）が必要とされる。
融合タンパク質で処置されたＪｕｒｋａｔ細胞を含むウェル皿を、インキュベーターの中に４８時間置く（注：この時間は、４８〜７２時間の間で可変である）。次いで、１２チャネルピペットを使用して、各ウェルからの３５ｕｌのサンプルを不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートは、（セロファンカバーを使用して）覆い、実施例２５に従ってＳＥＡＰアッセイが行われるまで、−２５℃で保存するべきである。残りの処置済み細胞を含むプレートは、４℃で置かれ、所望であれば特定のウェルについてアッセイを反復するための材料源として働く。

陽性対照として、ＪｕｒｋａｔＴ細胞を活性化することが知られている、１００単位／ｍｌのインターフェロンγを使用することができる。陽性対照ウェルでは、典型的に３０倍以上の誘導が観察される。
上記のプロトコルは、一過性ならびに安定トランスフェクト細胞の両方の生成で使用してもよく、それは当業者にとって明白となるであろう。

Ｔ細胞活性に対するアッセイ
ＮＦ−ＫＢ（核因子ＫＢ）は、炎症性サイトカインＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−アルファおよびリンホトキシン−ベータを含む多種多様な作用物質によって、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露によって、特定のウイルス遺伝子産物の発現によって、活性化される転写因子である。転写因子として、ＮＦ−ＫＢは、免疫細胞活性化に関与する遺伝子の発現、アポトーシスの制御（ＮＦ−ＫＢは、アポトーシスから細胞を守ると思われる）、ＢおよびＴ細胞発生、抗ウイルスおよび抗菌反応、および多重ストレス反応を調節する。
非刺激条件において、ＮＦ−ＫＢは、Ｉ−ＫＢ（阻害因子ＫＢ）を伴う細胞質中に保持される。しかしながら、刺激時に、Ｉ−ＫＢは、リン酸化されて分解され、ＮＦ−ＫＢを核へと行き来させることにより、標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−ＫＢによって活性化される標的遺伝子は、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１、およびクラス１ＭＨＣを含む。

その中心的役割および一連の刺激に反応する能力により、融合タンパク質をスクリーニングするためにＮＦ−ＫＢプロモーター要素を利用するレポーター構築物が使用される。疾患を治療、予防、および／または診断する際に、ＮＦ−ＫＢの活性剤または阻害剤が有用となるであろう。例えば、リウマチ性関節炎等の、ＮＦ−ＫＢの急性または慢性活性化に関する疾患を治療するために、ＮＦ−ＫＢの阻害剤を使用することが可能である。
ＮＦ−ＫＢプロモーター要素を含むベクターを構築するために、ＰＣＲを用いた策略を採用する。上流プライマーは、ＳＶ４０早期プロモーター配列の５´末端を補完する１８ｂｐの配列、ＮＦ−ＫＢ結合部位（ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号５９）の４つのタンデムコピーを含み、ＸｈｏＩ部位を横に伴う。
５´：ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧ：３´（配列番号６０）

下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３´末端を補完し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を横に伴う。
５´：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３´（配列番号５５）
Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手されるｐＢ−ｇａｌ：プロモータープラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターテンプレートを使用して、ＰＣＲ増幅を行う。結果として生じたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化する。Ｔ７およびＴ３プライマーによる配列決定は、挿入物が次の配列を含むことを確定する。
５´：ＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴ：３´（配列番号６１）

次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーター要素を、このＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０フラグメントと取り換える。しかしながら、このベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を含まないため、哺乳類発現系には好ましくない。
安定した哺乳類細胞株を生成するために、制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して、上記のＮＦ−ＫＢ／ＳＥＡＰベクターからＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットを除去し、ネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。特に、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１を制限した後、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入し、ＧＦＰ遺伝子を取り換えた。

ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターが作成されると、実施例２５に記載のプロトコルに従って安定したＪｕｒｋａｔＴ細胞を作成し、維持する。同様に、これらの安定したＪｕｒｋａｔＴ細胞を伴う融合タンパク質を分析する方法も、実施例２５に記載される。陽性対照として、外因性ＴＮＦアルファ（０．１、１、１０ｎｇ）を、ウェルＨ９、Ｈ１０、およびＨ１１に添加し、５〜１０倍の活性が典型的に観察される。

骨髄性活性を識別するアッセイ
融合タンパク質が骨髄性細胞を増殖および／または分化するかどうかを決定することによって、本発明のアルブミン融合タンパク質骨髄性活性を評価するために、次のようなプロトコルを使用する。実施例２４で産生されるＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を使用して、骨髄性細胞活性を評価する。したがって、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化させる能力を示す。このアッセイで使用される骨髄性細胞は、前単球細胞株であるＵ９３７であるが、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１を使用することができる。

Ｕ９３７細胞に実施例２４で産生されるＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を一時的に導入するために、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｋｈａｒｂａｎｄａｅｔ．ａｌ．，１９９４，ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５：２５９−２６５）を使用する。まず、２×１０^７個のＵ９３７細胞を収穫し、ＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞は通常、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させる。
次に、０．５ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン、８ｕｇのＧＡＳ−ＳＥＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、３７５ｕＭのＮａ_２ＨＰＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、および６７５ｕＭのＣａＣｌ_２を含む、１ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液中で細胞を懸濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。
１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を洗浄し、１０ｍｌの完全培地中で再懸濁して３７℃で３６時間インキュベートする。

４００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を増殖させることによって、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を得る。定期的な増殖にＧ４１８を含まない培地を使用するが、１ヶ月または２ヶ月毎に、数継代にわたって細胞を４００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８中で再増殖させるべきである。
１×１０^８個の細胞（これは、１０個の９６ウェルプレートのアッセイに十分である）を収穫することによって、これらの細胞を試験し、ＰＢＳで洗浄する。５×１０^５細胞／ｍｌの最終密度で、２００ｍｌの上記成長培地中で細胞を懸濁する。９６ウェルプレートの１ウェルあたり２００ｕｌの細胞を塗布する（または１×１０^５細胞／ウェル）。

異なる濃度の融合タンパク質を添加する。３７℃で４８から７２時間インキュベートする。陽性対照として、Ｕ９３７細胞を活性化することが知られている、１００単位／ｍｌのインターフェロンγを使用することができる。陽性対照ウェルでは、典型的に３０倍以上の誘導が観察される。ＳＥＡＰは、当該分野で公知の方法および／または実施例２５に記載のプロトコルに従って、上清を分析する。

小分子濃度および膜透過性の変化を識別するアッセイ
受容体への配位子の結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウム、およびｐＨ等の、小分子の細胞内濃度を変え、ならびに膜電位を変えることが知られている。これらの変化は、特定の細胞の受容体に結合する融合タンパク質を識別するアッセイにおいて測定することができる。次のようなプロトコルはカルシウムに対するアッセイを説明するものの、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、または蛍光プローブによって検出可能な任意の他の小分子の変化を検出するように容易に修正することができる。
以下のアッセイは、小分子に結合する蛍光分子（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）の変化を測定するために、蛍光イメージングプレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を使用する。明らかに、ここで使用されるカルシウム蛍光分子、ｆｌｕｏ−４（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｆ−１４２０２）の代わりに、小分子を検出する任意の蛍光分子を使用することができる。

付着細胞については、透明な底を伴うＣｏ−ｓｔａｒ黒９６ウェルプレート中で１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルにて、細胞を播種する。プレートをＣＯ_２インキュベーター中で２０時間インキュベートする。付着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗浄機中にて２００ｕｌのＨＢＳＳ（ハンクス平衝食塩水）で２回洗浄し、最終洗浄後に１００ｕｌの緩衝液を残す。
１ｍｇ／ｍｌのｆｌｕｏ−４の原液を１０％プルロニック酸ＤＭＳＯ中で作製する。細胞にｆｌｕｏ−４を装填するために、５０ｕｌの１２ｕｇ／ｍｌｆｌｕｏ−４を各ウェルに添加する。プレートを３７℃にてＣＯ_２インキュベーター中で６０分間インキュベートする。プレートをＣＯ_２インキュベーター中で２０時間インキュベートする。プレートををＢｉｏｔｅｋ洗浄機中にてＨＢＳＳで４回洗浄し、１００ｕｌの緩衝液を残す。

非付着細胞については、培地から細胞を沈降させる。５０ｍｌ円錐管の中で、ＨＢＳＳにより細胞を２〜５×１０^６細胞／ｍｌに再懸濁する。１０％プルロニック酸ＤＭＳＯ中の４ｕｌの１ｍｇ／ｍｌｆｌｕｏ−４溶液を、各ｍｌの細胞懸濁液に添加する。次いで、管を３７℃の水浴に３０〜６０分間入れる。細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、１×１０^６細胞／ｍｌに再懸濁し、マイクロプレートに１００ｕｌ／ウェルで分注する。プレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。次いで、ＤｅｎｌｅｙＣｅｌｌＷａｓｈ中にて２００ｕｌでプレートを洗浄し、それに続いて１００ｕｌの最終量への吸引ステップを行う。
細胞を用いないアッセイに対しては、各ウェルは、ｆｌｕｏ−４等の蛍光分子を含む。本発明の融合タンパク質をウェルに添加し、蛍光の変化を検出する。

細胞内カルシウムの蛍光を測定するために、次のようなパラメータに対してＦＬＩＰＲを設定する。（１）システム利得は３００〜８００ｍＷであり、（２）曝露時間は０．４秒であり、（３）カメラＦ／停止はＦ／２であり、（４）励起は４８８ｎｍであり、（５）発光は５３０ｎｍであり、（６）サンプル添加は５０ｕｌである。５３０ｎｍにおける増加した発光は、細胞内Ｃａ＋＋濃度の増加をもたらしている、本発明の融合タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質によって誘導される分子によって引き起こされる。

チロシンキナーゼ活性を識別するアッセイ
タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、膜貫通および細胞質キナーゼの多様な一群を表す。受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群内には、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦ、およびインスリン受容体サブファミリーを含む、一連の細胞分裂および代謝成長因子に対する受容体がある。加えて、対応する配位子が不明であるＲＰＴＫの大きな一群がある。ＲＰＴＫに対する配位子は、分泌低分子タンパク質を主に含むが、膜結合および細胞外基質タンパク質も含む。
配位子によるＲＰＴＫの活性化は、配位子媒介性受容体二量化を伴い、受容体サブユニットのリン酸転移および細胞質チロシンキナーゼの活性化をもたらす。細胞質チロシンキナーゼは、ｓｒｃファミリー（例えば、ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）の受容体関連チロシンキナーゼ、および、その構成要素が受容体のサイトカインスーパーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、およびレプチン）によって誘発されるシグナル伝達を媒介する、Ｊａｋファミリー等の非受容体連結およびサイトゾルタンパク質チロシンキナーゼを含む。
チロシンキナーゼ活性を刺激することが可能な、広範囲の既知の因子のため、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明の融合タンパク質によって誘導される分子が、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化することが可能であるかどうかを識別することが関心となる。したがって、次のようなプロトコルは、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化することが可能な、そのような分子を識別するように設計されている。

ＮａｌｇｅＮｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入される９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅＳｉｌｅｎｔＳｃｒｅｅｎＰｌａｔｅｓにおいて１ウェルあたり約２５，０００個の細胞の密度で、標的細胞（例えば、一次ケラチン生成細胞）を播種する。プレートを１００％エタノールによる２回の３０分間のすすぎ洗いで滅菌し、水ですすぎ、一晩乾燥させる。その全てはＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入することができる、１００ｍｌの細胞培養グレードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）、またはポリリシン（５０ｍｇ／ｍｌ）、またはＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入される１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ、または子ウシ血清で、いくつかのプレートを２時間被覆し、ＰＢＳですすいで４℃で保存する。成長培地に５，０００細胞／ウェルを播種し、かつ４８時間後に製造業者ＡｌａｍａｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）による記載のようにａｌａｍａｒＢｌｕｅの使用を通した細胞数を間接的に定量することよって、これらのプレート上の細胞増殖を分析する。ＬｏｐｒｏｄｙｎｅＳｉｌｅｎｔＳｃｒｅｅｎＰｌａｔｅｓを覆うために、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）からのＦａｌｃｏｎプレートカバー＃３０７１を使用する。ＦａｌｃｏｎＭｉｃｒｏｔｅｓｔＩＩＩ細胞培養プレートも、一部の増殖実験で使用することができる。

抽出物を調製するために、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、完全培地中で一晩培養する。２４時間の血清を含まない基礎培地中でのインキュベーションによって、細胞を休止させる。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または異なる濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質による５〜２０分間の処置後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（（ｐＨ７．５で２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％ＳＤＳ、２ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４、２ｍＭのＮａ_４Ｐ_２Ｏ_７、およびＢｏｅｈｅｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手されるプロテアーゼ阻害剤（＃１８３６１７０）の混合物）を各ウェルに添加し、プレートを回転振盪機上で４℃にて５分間振盪する。次いで、プレートを真空移送多岐管に入れ、収容真空を使用して、各ウェルの０．４５ｍｍ膜底を通して抽出物を濾過する。真空多岐管の底で９６ウェルキャッチ／アッセイプレート中に抽出物を収集し、即時に氷上に置く。遠心分離によって浄化された抽出物を得るために、５分間の界面活性剤可溶化の後、各ウェルの内容物を除去し、１６，０００×ｇで４℃にて１５分間遠心分離する。
チロシンキナーゼ活性のレベルについて濾過した抽出物を試験する。チロシンキナーゼ活性を検出する多くの方法が知られているものの、１つの方法をここで説明する。

概して、本発明のアルブミン融合タンパク質のチロシンキナーゼ活性は、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化する、その能力を決定することによって評価される。この目的で使用することができるビオチン化ペプチドは、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃｄｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に対応する）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミノ酸１〜１７に対応する）を含む。両方のペプチドは、一連のチロシンキナーゼに対する基質であり、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍより入手可能である。
チロシンキナーゼ反応は、次のような成分を順番に添加することによって設定される。まず、１０ｕｌの５ｕＭビオチン化ペプチド、次いで１０ｕｌのＡＴＰ／Ｍｇ_２＋（５ｍＭのＡＴＰ／５０ｍＭのＭｇＣｌ_２）、次いで１０ｕｌの５×アッセイ緩衝液（ｐＨ７．３で４０ｍＭのイミダゾール塩酸塩、４０ｍＭのベータ・グリセロリン酸塩、１ｍＭのＥＧＴＡ、１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭのＭｎＣｌ_２、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）、次いで５ｕｌのバナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）、次いで５ｕｌの水を添加する。成分をそっと混合し、反応混合物を３０℃で２時間で前保温する。１０ｕｌの調節酵素または濾過上清を添加することによって、反応を開始する。

次いで、１０ｕｌの１２０ｍｍＥＤＴＡを添加することによってチロシンキナーゼアッセイ反応を終結させ、反応物を氷上に置く。
５０ｕｌアリコートの反応混合物をマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることによって、チロシンキナーゼ活性を決定する。このことは、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートがビオチン化ペプチドと会合することを可能にする。ＭＴＰモジュールを３００ｕｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））に抱合した７５μｌの抗ホスホチロシン抗体を、各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように洗浄する。
次に、１００ｕｌのペルオキシダーゼ基質溶液（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を添加し、室温で少なくとも５分間（最大で３０分まで）インキュベートする。ＥＬＩＳＡリーダーを使用することによって、４０５ｎｍにおいてサナンプルの吸収度を測定する。結合ペルオキシダーゼ活性のレベルは、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して定量され、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。

リン酸化反応活性を識別するアッセイ
潜在的な、実施例３１に記載のタンパク質チロシンキナーゼ活性のアッセイに代わるものおよび／または補完するものとして、主要な細胞内シグナル伝達媒介物の活性化（リン酸化反応）を検出するアッセイを使用することができる。例えば、下記のように、１つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２キナーゼのチロシンリン酸化反応を検出することができる。しかしながら、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、Ｔｅｃ、およびＪａｎｕｓ等の他の分子、ならびに任意の他のホスホセリン、ホスホチロシン、またはホスホトレオニン分子のリン酸化反応は、次のようなアッセイにおいてこれらの分子をＥｒｋ−１またはＥｒｋ−２の代わりにすることによって検出することができる。
具体的には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルを０．１ｍｌのタンパク質Ｇ（１ｕｇ／ｍｌ）で室温（ＲＴ）にて２時間被覆することによって、アッセイプレートを作る。次いで、プレートをＰＢＳで洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳでＲＴにて１時間遮断する。次いで、タンパク質Ｇプレートを、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２に対する２つの市販モノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル）（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処置する（ＲＴで１時間）。（他の分子を検出するために、上記分子のいずれかを検出するモノクローナル抗体を置換することによって、このステップを容易に修正することができる。）ＰＢＳで３〜５回すすいだ後、使用するまでプレートを４℃で保存する。

Ａ４３１細胞を９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィルタプレートにおいて２０，０００／ウェルで播種し、成長培地中で一晩培養する。次いで、細胞を基質培地（ＤＭＥＭ）中で４８時間飢餓状態にし、次いでＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）または様々な濃度の本発明の融合タンパク質で５〜２０分処置する。次いで、細胞を可溶化し、抽出物をアッセイプレートの中へ直接濾過する。
ＲＴで１時間の抽出物によるインキュベーション後、ウェルを再びすすぐ。陽性対照として、Ａ４３１抽出物の代わりに、ＭＡＰキナーゼの市販調製物（１０ｎｇ／ウェル）を使用する。次いで、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する、市販のポリクローナル（ウサギ）抗体（１ｕｇ／ｍｌ）でプレートを処置する（ＲＴで１時間）。この抗体は、標準的手順によってビオチン化される。次いで、ＷａｌｌａｃＤＥＬＦＩＡ計器におけるユーロピウム−ストレプトアビジンおよびユーロピウム蛍光強化試薬（時間分解蛍光）による連続インキュベーションによって、結合ポリクローナル抗体を定量する。背景にわたる増加した蛍光信号は、本発明の融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質によって誘導される分子のリン酸化反応を示す。

リン酸化反応アッセイ
本発明のアルブミン融合タンパク質のリン酸化反応活性について分析するために、米国特許第５，９５８，４０５号（参照することにより本願に組み込まれる）に記載のようなリン酸化反応を利用する。簡潔に言えば、リン酸化反応活性は、ガンマ標識化^３２Ｐ−ＡＴＰを使用するタンパク性基質のリン酸化反応、およびガンマ放射性同位体カウンタを使用する組み込まれた放射能の定量によって測定され得る。本発明の融合タンパク質は、タンパク性基質、^３２Ｐ−ＡＴＰ、およびキナーゼ緩衝液でインキュベートされる。次いで、基質に組み込まれた^３２Ｐを電気泳動によって遊離^３２Ｐ−ＡＴＰから分離し、組み込まれた^３２Ｐを数えて陰性対照と比較する。陰性対照以上の放射能計数は、融合タンパク質のリン酸化反応計数を表す。

ポリペプチド配位子の存在下での本発明のアルブミン融合タンパク質のリン酸化反応活性（活性化）の検出
本発明のアルブミン融合タンパク質のリン酸化反応活性を決定するために、当該分野で公知の方法または本明細書に記載の方法を使用し得る。実施形態では、リン酸化反応活性を決定する方法は、米国特許第５，８１７，４７１号（参照することにより本願に組み込まれる）に記載のようなチロシンリン酸化反応アッセイの使用によるものである。

骨髄ＣＤ３４＋細胞増殖の刺激に対するアッセイ
このアッセイは、造血成長因子の存在下で増殖するヒトＣＤ３４＋の能力に基づき、ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する本発明の融合タンパク質を評価する。
ほとんどの成熟前駆細胞が単一信号のみに反応することが以前に示されている。より未熟な前駆細胞は、反応するために少なくとも２つの信号を必要とする。したがって、多種多様な前駆細胞の造血活性に対する本発明の融合タンパク質の影響を試験するために、アッセイは、造血成長因子の有無を問わずに、本発明の所与の融合タンパク質を含む。分離した細胞は、試験したサンプルと組み合わせて幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で５日間培養する。ＳＣＦ単独は、骨髄（ＢＭ）細胞の増殖に対して非常に限定された影響を及ぼし、そのような条件において「生存」因子としての役割のみを果たす。しかしながら、これらの細胞に対する刺激効果を示す任意の因子と組み合わされて（例えば、ＩＬ−３）、ＳＣＦは、相乗効果を引き起こす。したがって、試験した融合タンパク質が造血前駆細胞に対する刺激効果を有する場合、そのような活性は容易に検出することができる。正常なＢＭ細胞には低レベルの循環細胞があるため、所与の融合タンパク質の阻害効果が検出されないかもしれない可能性がある。したがって、前駆細胞に対する阻害効果のアッセイは、まずＳＣＦ＋ＩＬ＋３による生体外刺激を受け、次いでそのような誘導増殖の阻害について評価されている化合物と接触される、細胞において試験され得る。

簡潔に述べると、ＣＤ３４＋細胞は、当該分野で公知の方法を使用して単離される。これらの細胞は、解凍され、そして、培地（１％Ｌ−グルタミンを有するＱＢＳＦ６０無血清培地（５００ｍｌ）（ＱｕａｌｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤＣａｔ＃１６０−２０４−１０１））に再懸濁される。２００×ｇでのいくらか穏やかな遠心分離の後、細胞は、１時間静置される。細胞数を２．５×１０^５細胞／ｍｌに調節する。この時間の間、１００μｌの滅菌水を９６ウェルプレートの周辺ウェルに添加する。このアッセイにおいて、本発明のアルブミン融合タンパク質で試験され得るサイトカインは、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＣＦ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ＃２５５−ＳＣ）のみであり、そして３０ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＣＦとｒｈＩＬ−３（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ＃２０３−ＭＬ）との組み合わせである。１時間後、１０μｌの調製されたサイトカイン、種々の濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質および２０μｌの希釈された細胞を、培地に添加し、この培地は、１００μｌの最終全体積にするためにすでにウェル中に存在する。次いで、このプレートを３７℃／５％ＣＯ_２インキュベーターに５日間置く。

アッセイを収集する１８時間前に、０．５μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンを、各ウェルに１０μｌの体積で添加し、増殖率を判定する。この実験は、ＴｏｍｔｅｃＨａｒｖｅｓｔｅｒ９６を使用して、細胞を、各９６ウェルプレートからフィルタマットに収集することによって終結される。収集後、フィルタマットを乾燥し、トリムし、そして１つのＯｍｎｉｆｉｌｔｅｒプレートおよび１つのＯｍｎｉＦｉｌｔｅｒトレイからなるＯｍｎｉｆｉｌｔｅｒアセンブリに置く。６０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔを各ウェルに添加し、そしてプレートをＴｏｐＳｅａｌ−Ａプレスオンフィーリングフィルムで密閉する。バーコード１５ステッカーを計数のために、第１のプレートに固定する。次いで、密閉されたプレートを充填し、そして放射能のレベルを、ＰａｒｃｋａｒｄＴｏｐＣｏｕｎｔを介して判定し、プリントされたデータを分析のために収集する。放射能レベルは、細胞増殖の量を反映する。
本実施例に記載される研究は、骨髄ＣＤ３４＋細胞増殖を刺激する、所定の融合タンパク質の活性を試験する。当業者は、本発明のアルブミン融合タンパク質およびポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）ならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストの活性を試験するために、例示された実施例を容易に改変し得る。骨髄ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する本発明のアルブミン融合タンパク質の能力は、この融合タンパク質に対応するアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドが、免疫系および造血に影響する障害の診断および処置に有用であることを示す。代表的な用途は、上記の「免疫活性」および「感染疾患」の節、ならびに本明細書中の他の箇所に記載される。

細胞外マトリックス増強細胞応答（ＥＭＥＣＲ）についてのアッセイ
細胞外マトリックス増強細胞応答（ＥＭＥＣＲ）アッセイの目的は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）誘導シグナルに関連して、造血幹細胞に作用する本発明の融合タンパク質の能力を評価することである。
周囲のミクロ環境から受けるシグナルに関連して、細胞は、調節因子に応答する。例えば、線維芽細胞、ならびに内皮幹細胞および上皮幹細胞は、ＥＣＭからのシグナルの非存在下で、複製することができない。造血幹細胞は、骨髄中で自己再生を起こし得るが、体外懸濁液培養では自己再生を起こさない。体外で自己再生を起こす幹細胞の能力は、間質（ｓｔｒｏｍａｌ）細胞およびＥＣＭタンパク質フィブロネクチン（ｆｎ）とのそれらの相互作用に依存する。細胞のｆｎへの吸着は、α５．β１およびα４．β１インテグリン受容体によって媒介され、これらの受容体は、ヒトおよびマウス造血幹細胞によって発現される。ＥＣＭ環境で組み込み、そして幹細胞の自己再生の刺激の原因である因子は未だ同定されていない。このような因子の発見は、遺伝子治療および脊髄移植適用における重要な目的である。

簡潔に述べると、ポリスチレンの組織培養処理されていない９６ウェルプレートは、０．２μｇ／ｃｍ^２のコーティング濃度でｆｎフラグメントでコートされる。マウス骨髄細胞を、０．２ｍｌの無血清培地（１，０００細胞／ウェル）にプレートする。ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）＋ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養された細胞は、幹細胞の自己再生が期待されず、明確な分化が期待される条件で、陽性対照として作用する。本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＳＣＦ（５．０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、または非存在下で適切な陰性対照と共に試験され、ここで、本発明のアルブミン融合タンパク質を含む投与される組成物の容量は、全アッセイ体積の１０％を示す。次いで、プレートされた細胞を、低酸素環境（５％のＣＯ_２、７％のＯ_２および８８％のＮ_２）の組織培養インキュベーターで７日間インキュベートすることによって増殖させる。次いで、ウェル内の増殖細胞の数を、細胞ＤＮＡへのチミジン組み込みを測定することによって定量する。アッセイにおける陽性ヒットの確認は、細胞の表現型の特徴付けを必要とし、この特徴付けは、培養系をスケールアップし、そして細胞表面抗原およびＦＡＣＳｃａｎに対する適切な抗体試薬を使用することによって達成される。

本発明の特定の融合タンパク質が、造血祖先の刺激薬であることが見出される場合、この融合タンパク質に対応する融合タンパク質およびポリヌクレオチドは、免疫系および造血に影響する障害の診断および処置に有用であり得る。代表的な用途は、上記の「免疫活性」および「感染疾患」の節、ならびに本明細書の他の箇所に記載される。融合タンパク質はまた、種々の血液連鎖の幹細胞および先駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｅｄｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の拡張において、そして種々の細胞の型の分化および／または増殖において有用であり得る。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、造血細胞の増殖および分化を阻害するために使用され、そしてそれによって、化学療法の間に、化学療法薬剤から骨髄幹細胞を保護するために使用され得る。この抗増殖効果は、より高い用量の化学療法薬剤の投与、従って、より有効な化学治療処置を可能にし得る。
さらに、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、例えば、貧血、汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、または白血病などの造血関連障害の処置および診断に有用であり得る。なぜなら、間質細胞は、造血系列の細胞の生成において重要であるからである。これらの用途としては、骨髄細胞体外培養、骨髄移植、骨髄再形成、新形成の放射線療法または化学療法が、挙げられる。

ヒト皮膚線維芽細胞および大動脈平滑筋細胞の増殖
本発明の融合タンパク質を、正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびヒト大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）の培養物に添加し、そして２つの同時アッセイを各試料を用いて実施する。第１のアッセイは、正常なヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ）または大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）の増殖に対する、融合タンパク質の効果を試験する。線維芽細胞または平滑筋細胞の異常な増殖は、いくつかの病理学的プロセス（繊維症および再狭窄を含む）の一部である。第２のアッセイは、ＮＨＤＦおよびＳＭＣの両方によるＩＬ６産生を試験する。ＩＬ６産生は、機能的活性化の指標である、活性化細胞は、多数のサイトカインおよび他の因子の産生の増加を有し、これは、炎症誘発性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）または免疫調節性の結果を生じ得る。アッセイは、同時刺激活性または阻害活性をチェックするために、同時ＴＮＦα刺激と共に行い、そして同時ＴＮＦα刺激なしで行う。
簡単に述べると、１日目に、９６ウェルの黒いプレートに、１００μｌ培養培地中に１０００細胞／ウェル（ＮＨＤＦ）または２０００細胞／ウェル（ＡｏＳＭＣ）を配置する。ＮＨＤＦ培養培地は、以下：ＣｌｏｎｅｔｉｃｓＦＢ基礎培地、１ｍｇ／ｍｌｈＦＧＦ、５ｍｇ／ｍｌインスリン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、２％ＦＢＳを含み、一方ＡｏＳＭＣ培養培地は、以下：ＣｌｏｎｅｔｉｃｓＳＭ基礎培地、０．５μｇ／ｍｌｈＦＧＦ、５ｍｇ／ｍｌインスリン、１μｇ／ｍｌｈＦＧＦ、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢ、５％ＦＢＳを含む。３７℃で少なくとも４〜５時間のインキュベーション後、培養培地を吸引し、増殖停止培地で置換する。ＮＨＤＦ用の増殖停止培地は、線維芽細胞基礎培地、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、２％ＦＢＳを含み、一方ＡｏＳＭＣ用の増殖停止培地は、ＳＭ基礎培地、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢ、０．４％ＦＢＳを含む。３７℃で２日目までインキュベートする。

２日目、本発明のアルブミン融合タンパク質の系列希釈物およびテンプレートを、それらが常に、培地対照および既知のタンパク質対照を含むように、設計する。刺激実験および阻害実験の両方について、タンパク質を増殖停止培地で希釈する。阻害実験について、ＴＮＦαを、最終濃度２ｎｇ／ｍｌ（ＮＨＤＦ）または５ｎｇ／ｍｌ（ＡｏＳＭＣ）まで添加する。対照または本発明のアルブミン融合タンパク質を含む１／３容量の培地を添加し、そして５日目まで、３７℃／５％ＣＯ_２にてインキュベートする。
各ウェルから６０μｌを別の標識９６ウェルプレートに移し、プレートシーラーで覆い、そして６日目まで４℃で（ＩＬ６ＥＬＩＳＡのために）保存する。細胞培養プレート中の残りの１００μｌに、その培養物容量の１０％に等しい量（１０μｌ）のＡｌａｍａｒＢｌｕｅを無菌的に添加する。プレートを３〜４時間の間インキュベーターに戻す。次いで、５３０ｎｍでの励起および５９０ｎｍでの放射を伴う蛍光を、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒを使用して測定する。これにより、増殖刺激／阻害のデータを得る。
５日目、ＩＬ−６ＥＬＩＳＡを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈した５０〜１００μｌ／ウェルの抗ヒトＩＬ−６モノクローナル抗体で９６ウェルプレートをコーティングすることによって実施し、室温でＯＮをインキュベートする。

６日目、プレートの中身を流しに空け、そしてペーパータオル上で吸い取る。４％のＢＳＡを含むＰＢＳを含むアッセイ緩衝液を調製する。プレートを、ＰＢＳ中の２００μ／ウェルのＰｉｅｒｃｅＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液で１〜２時間ブロックし、次いで、洗浄緩衝液（ＰＢＳ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを洗浄する。プレートをペーパータオル上で吸い取る。次いで、０．５０ｍｇ／ｍｌに希釈した抗ヒトＩＬ−６モノクローナルビオチン標識抗体５０μｌ／ウェルを添加する。ＩＬ−６ストックの培地中の希釈物を作製する（３０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．３ｎｇ／ｍｌ、０ｎｇ／ｍｌ）。二連の試料をプレートの最上列に添加する。プレートを覆い、そして振盪機上で室温で２時間インキュベートする。
プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、ペーパータオル上で吸い取る。ＥＵ標識ストレプトアビジンをアッセイ緩衝液中に１：１０００希釈し、そして１００μｌ／ウェルを添加する。プレートを覆い、そして室温で１時間インキュベートする。プレートを再び洗浄緩衝液で洗浄し、そしてペーパータオル上で吸い取る。
１００μｌ／ウェルの増強溶液を添加する。５分間振盪する。ＷａｌｌａｃＤＥＬＦＩＡ蛍光測定器でプレートを読み取る。各アッセイでの三連の試料からの読み取りを、表にして平均をとる。

このアッセイにおける陽性の結果は、ＡｏＳＭＣ細胞増殖を示唆し、そしてアルブミン融合タンパク質が皮膚線維芽細胞増殖および／または平滑筋細胞増殖に関与し得ることを示唆する。陽性の結果はまた、融合タンパク質および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの多くの潜在的な使用を示唆する。例えば、本明細書の全体にわたって記載されるように、炎症および免疫応答、創傷の治癒、ならびに新脈管形成。特に、融合タンパク質は、創傷の治癒および皮膚の再生、ならびに脈管形成（血管およびリンパ管の両方）の促進に使用され得る。脈管の成長は、例えば、心臓血管疾患の処置において使用され得る。さらに、このアッセイにおいて拮抗活性を示す融合タンパク質は、抗脈管（例えば、抗新脈管形成）として作用することによって、新脈管形成を含む、疾患、障害、および／または状態を処置する際に有用であり得る。これらの疾患、障害、および／または状態、例えば以下：悪性腫瘍、固形腫瘍、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、関節硬化性斑（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｉｃｐｌａｑｕｅ）、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜障害、未熟児の網膜障害、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、皮膚潮紅、網膜芽細胞腫、ぶどう膜炎、および眼の翼状片（異常な血管の成長））、慢性関節リウマチ、乾癬、遅延性の創傷の治癒、子宮内膜症、脈管形成、顆粒形成、過形成性瘢痕（ケロイド）、非結合性骨折（ｎｏｎｕｎｉｏｎｆｒａｃｔｕｒｅ）、強皮症、トラコーマ、脈管接着、心筋新脈管形成、冠状側副枝、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性の肢の新脈管形成、Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群、斑の新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、線維性筋性形成異常症、創傷肉芽化、クローン病、およびアテローム性硬化症などは、当該分野において公知でありそして／または本明細書中で記載される。さらに、このアッセイにおいてアンタゴニストとして作用するアルブミン融合タンパク質は、当該分野において公知でありそして／または本明細書中で記載される、抗過増殖性疾患および／または抗炎症性疾患を処置する際に有用であり得る。

内皮細胞上での細胞接着分子（ＣＡＭ）の発現
リンパ球の、炎症および新脈管形成の領域に対する動員は、リンパ球上の細胞表面接着分子（ＣＡＭ）と脈管内皮との間の特異的な受容体リガンド相互作用を含む。接着プロセスは、正常の環境および病的な環境の両方において、多段階のカスケードに従い、このカスケードは、内皮細胞（ＥＣ）上での細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、脈管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、および内皮性白血球接着分子１（Ｅ−セレクチン）の発現を含む。脈管内皮上でのこれらの分子などの発現は、白血球が局所的な脈環構造と接着し、そして炎症性応答の進行の間に局所的な組織へと溢出し得る効率を判定する。サイトカインおよび増殖因子の局所的濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。

簡潔に述べると、内皮細胞（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））を、標準９６ウェルプレート中でコンフルエンスまで増殖する。増殖培地を、細胞から除去し、そして１００μｌの１９９Ｍｅｄｉｕｍ（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））で置き換える。試験のための試料（本発明のアルブミン融合タンパク質を含む）および陽性対照または陰性対照を、３連（１０μｌの容量ずつ）のプレートに添加する。次いで、プレートを、３７℃で、５時間（セレクチンおよびインテグリンの発現）かまたは２４時間（インテグリンの発現のみ）のいずれかの間インキュベートする。プレートを、培地を除去するために吸引し、そして１００μｌの０．１％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋含有）を各ウェルに添加する。プレートを４℃で３０分間保持する。固定剤をウェルから除去し、そしてウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで１回洗浄し、そして水気を切る。１０μｌの希釈した一次抗体を、試験ウェルおよび対照ウェルに添加する。抗ＩＣＡＭ−１−ビオチン、抗ＶＣＡＭ−１−ビオチン、および抗Ｅ−セレクチン−ビオチンを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ／ｍｌのストック抗体の１：１０希釈）で使用する。細胞を３７℃で３０分間、加湿された環境においてインキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄する。２０μｌの希釈されたＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（１：５，０００希釈、本明細書中で作業用希釈液といわれる）を各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄し、排出する。５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）につき１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐＮＰＰ）を溶解する。グリシン緩衝液中の１００μｌのｐＮＰＰ基質を各試験ウェルに添加する。３連の標準ウェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；１：５，０００（１０^０）＞１０^−０．５＞１０^−１＞１０^−１．５の作業用希釈液から調製する。各希釈液の５μｌを３連のウェルに添加すると、各ウェル中の得られるＡＰ含有量は、５．５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次いで、１００μｌのｐＮＮＰ試薬を標準ウェルの各々に添加する。このプレートを、３７℃で４時間インキュベートする。５０μｌの容量の３ＭＮａＯＨを、全てのウェルに添加する。このプレートを、グリシン緩衝液のみを充填したブランクウェルでのバックグラウンド除去オプションを使用して、４０５ｎｍのプレートリーダーで読む。さらに、テンプレートを、各標準ウェル［５．５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇ］中のＡＰ結合体の濃度を示すように調整する。結果を、各試料中の結合したＡＰ共重合体の量として示す。

ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ内皮細胞増殖アッセイ
このアッセイを使用して、ウシリンパ内皮細胞（ＬＥＣ）、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）、またはヒト微小血管子宮筋細胞（ＵＴＭＥＣ）のｂＦＧＦ誘導増殖のタンパク質媒介性阻害を定量的に判定し得る。このアッセイは、代謝活性の検出に基づく、蛍光定量的な増殖インジケーターを組み込む。標準ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ増殖アッセイを、内皮細胞刺激の供給源として添加した１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＥＧＭ−２ＭＶ中で調製する。このアッセイは、増殖培地および細胞濃度がわずかに変化した様々な内皮細胞と共に使用され得る。試験されるべきタンパク質バッチの希釈物を、適切に希釈する。ｂＦＧＦなしの無血清培地（ＧＩＢＣＯＳＦＭ）を、非刺激対照として使用し、そしてＡｎｇｉｏｓｔａｔｉｎまたはＴＳＰ−１を、既知の阻害対照として含める。
簡潔に述べると、ＬＥＣ、ＢＡＥＣまたはＵＴＭＥＣを、９６ウェルプレートに、５０００〜２０００細胞／ウェルの密度で、増殖培地に播種し、そして３７℃で一晩放置する。この細胞を一晩のインキュベートした後、増殖培地を除去し、そしてＧＩＢＣＯＥＣ−ＳＦＭで置き換える。この細胞を、追加のｂＦＧＦを含む３連のウェル中で、本発明のアルブミン融合タンパク質または対照タンパク質試料の適切な希釈物（ＳＦＭ中で調製）で、１０ｎｇ／ｍｌの濃度まで処理する。一旦、細胞を試料で処理すると、プレート（単数または複数）を、３７℃のインキュベーターに３日間戻す。３日後、１０ｍｌのストックａｌａｍａｒｂｌｕｅ（ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＣａｔ＃ＤＡＬ１１００）を、各ウェルに添加し、そしてプレート（単数または複数）を、３７℃のインキュベーターに４時間戻す。次いで、このプレート（単数または複数）を、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーを使用して、５３０ｎｍ励起および５９０ｎｍ発光で読み取る。直接出力を、相対蛍光単位で記録する。

Ａｌａｍａｒｂｌｕｅは、細胞増殖から生じる増殖培地の化学的還元に応答して、蛍光を発しかつ色を変化する、酸化−還元指示薬である。培養中で細胞が増殖するにつれて、生得代謝活性によりすぐ周辺の環境の化学的還元が生じる。増殖に関する還元により、この指示薬は、酸化（非蛍光性の青色）形態から還元（蛍光性赤色）形態に変化し得る。（すなわち、刺激された増殖は、より強いシグナルを生成し、そして阻害された増殖は、より弱いシグナルを生成し、そして全シグナルは細胞の総数ならびにそれらの代謝活性に比例する。）活性のバックグラウンドレベルは、飢餓培地のみを用いて観察される。これを陽性対照試料（増殖培地中のｂＦＧＦ）およびタンパク質希釈物から観察される出力と比較する。

混合リンパ球反応の阻害の検出
このアッセイを使用して、本発明の融合タンパク質による混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の阻害を検出および評価し得る。ＭＬＲの阻害は、細胞増殖および生存度、相互作用する細胞における同時刺激分子の調節、リンパ球と補助細胞との間の接着の調節、または補助細胞によるサイトカイン産生の調節に対する直接効果に起因し得る。複数の細胞は、ＭＬＲを阻害する本発明のアルブミン融合タンパク質によって標的化され得る。なぜなら、このアッセイで使用される末梢血液単核画分は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球およびナチュラルキラーリンパ球、ならびに単球および樹状細胞を含むためである。
ＭＬＲを阻害することが見出された本発明のアルブミン融合タンパク質は、リンパ球および単球の活性化または増殖に関する疾患における用途を見出し得る。これには、喘息、関節炎、糖尿病、炎症性の皮膚状態、乾癬、湿疹、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、動脈硬化症、肝硬変、対宿主性移植片病、対移植片性宿主病、肝炎、白血病およびリンパ腫のような疾患を含むが、これらに限定されない。

簡潔に述べると、ヒトドナー由来のＰＢＭＣを、ＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（ＬＳＭ（登録商標）、密度１．０７７０ｇ／ｍｌ、ＯｒｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷｅｓｔＣｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）を使用する密度勾配遠心分離によって精製する。２人のドナー由来のＰＢＭＣを、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを補ったＲＰＭＩ−１６４０（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）中、２×１０^６細胞／ｍｌに調整する。第３のドナー由来のＰＢＭＣを、２×１０^５細胞／ｍｌに調整する。各ドナー由来の５０μｌのＰＢＭＣを、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェルに添加する。本融合タンパク質試験材料の希釈物（５０μｌ）を、三連でマイクロタイターウェルに添加する。（着目タンパク質の）試験試料と１：４の最終希釈になるまで添加し、ｒｈｕＩＬ−２（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、カタログ番号２０２−ＩＬ）を、１μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで添加し、抗−ＣＤ４ｍＡｂ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、クローン３４９３０．１１、カタログ番号ＭＡＢ３７９）を１０μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで添加する。細胞を、５％ＣＯ_２中、３７℃で７〜８日間培養し、そして１μＣの［^３Ｈ］チミジンを、培養の最後の１６時間でウェルに添加する。細胞を収集し、そしてチミジンの取り込みを、ＰａｃｋａｒｄＴｏｐＣｏｕｎｔを使用して判定する。データを、３連の測定値の平均および標準偏差として表す。

着目の融合タンパク質の試料を、別個の実験でスクリーンし、そして陰性対照処理、抗−ＣＤ４ｍＡＢ（これはリンパ球の増殖を阻害する）、および陽性対照処理、ＩＬ−２（組換え物質または上清として）（これは、リンパ球の増殖を促進する）と比較する。

プロテアーゼ活性のアッセイ
以下のアッセイは、本発明のアルブミン融合タンパク質のプロテアーゼ活性を評価するために使用され得る。
ゼラチンおよびカゼイン酵素電気泳動法を、本質的に記載のように実施する（Ｈｅｕｓｅｎｅｔａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２：１９６−２０２（１９８０）、Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＵｒｏｌｏｇｙ、１４９：６５３−６５８（１９９３））。試料を、１％ゼラチンまたはカゼインを含む１０％ポリアクリルアミド／０．１％ＳＤＳゲルで泳動し、２．５％トリトン中に室温で１時間浸漬し、そして０．１Ｍグリシン（ｐＨ８．３）中に３７℃で５〜１６時間浸漬する。アミド中での染色後、タンパク質分解の黒色領域が、濃紺のバックグラウンドに対する明瞭な領域として出現する。トリプシン（ＳｉｇｍａＴ８６４２）を、陽性対照として使用する。

プロテアーゼ活性はまた、ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）（ＳｉｇｍａＢ−４５００）の開裂をモニタリングすることによって判定される。反応を、（２５ｍＭＮａＰＯ_４、１ｍＭＥＤＴＡ、および１ｍＭＢＡＥＥ）、ｐＨ７．５で調整する。試料を添加し、２６０ｎｍでの吸光度の変化を、ＢｅｃｋｍａｎＤＵ−６分光光度計を用いて時間駆動的（ｔｉｍｅ− ｄｒｉｖｅｍｏｄｅ）にモニターする。トリプシンを、陽性対照として使用する。
さらなるアッセイを、２８０ｎｍでの吸光度として測定するかまたはＦｏｌｉｎ法を用いた比色分析で測定したカゼインまたはヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの遊離に基づいて、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒら、ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ、５（１９８４）に記載されるように実施する。他のアッセイは、色素形成基質の可溶化を含む（Ｗａｒｄ，ＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ，２５１−３１７（１９８３））。

セリンプロテアーゼ基質特異性の同定
当該分野で公知の方法または本明細書中に記載された方法を用いて、セリンプロテアーゼ活性を有する本発明のアルブミン融合タンパク質の基質特異性を判定し得る。実施形態で、基質特異性判定の好ましい方法は、ＧＢ２３２４５２９（本明細書中にその全体が援用される）に記載されるように、合成コンビナトリアルライブラリーの位置的スキャニングの使用による方法である。

リガンド結合アッセイ
以下のアッセイは、本発明のアルブミン融合タンパク質のリガンド結合活性を評価するために用いられ得る。

リガンド結合アッセイは、受容体薬理学を確認するための直接法を提供し、高速形式に適応可能である。本発明のアルブミン融合タンパク質に対する精製リガンドを放射性同位体標識して、結合研究のために高い比放射能（５０〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）にする。次いで、放射性同位体標識のプロセスが融合タンパク質に対するリガンドの活性を低下させないように、判定を行う。緩衝液、イオン、ｐＨおよび他の調節因子（例えば、ヌクレオチド）に関するアッセイ条件を最適化して、膜のポリペプチド源および細胞全体のポリペプチド源の両方についての有効なシグナル対ノイズ比を構築する。これらのアッセイについて、特異的ポリペプチド結合を、総関連放射活性から、過剰の非標識競合リガンドの存在下で測定した放射活性を引いた差として規定する。可能な場合、残留非特異的結合を規定するために、１つより多くの競合リガンドを使用する。

アフリカツメガエル卵母細胞における機能的アッセイ
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする線状化プラスミドテンプレート由来のキャップＲＮＡ転写物を、標準手順に従ってＲＮＡポリメラーゼを用いて体外で合成する。体外転写物を、０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で水中に懸濁する。卵巣葉を成体雌性カエルから取り出し、第Ｖ段階の濾胞除去した卵母細胞を得、そしてＲＮＡ転写物（１０ｎｇ／卵母細胞）を、微量注入装置を用いて５０ｎｌボーラスで注射する。２電極電圧クランプを用いて、融合タンパク質およびポリペプチドアゴニスト曝露に対する個々のアフリカツメガエル卵母細胞由来の電流を測定する。室温でＣａ２＋を含まないバース培地（Ｂａｒｔｈ’ｓｍｅｄｉｕｍ）において記録を行う。このアフリカツメガエル系を、リガンドの活性化のための公知のリガンドおよび組織／細胞抽出物のスクリーニングに使用し得る。

微量生理機能測定（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｒｉｃ）アッセイ
多種多様の２次メッセンジャー系（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｓｓｅｎｇｅｒｓｙｓｔｅｍ）の活性化により、細胞から少量の酸が噴出する。形成された酸は、主に、細胞内シグナル伝達プロセスを刺激するのに必要な代謝活性の増大の結果である。細胞周囲の培地のｐＨ変化は非常に小さいが、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲ微量生理機能測定器（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＬｔｄ．，ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．）によって検出可能である。したがって、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲは、エネルギーを利用した細胞内シグナル伝達系と共役する２次メッセンジャーを活性化する本発明のアルブミン融合タンパク質の能力を、検出可能である。

抽出物／細胞上清スクリーニング
今のところ同系の活性化リガンド（アゴニスト）が存在しない多数の哺乳類受容体が存在する。したがって、これらの受容体に対する活性リガンドは、現在まで同定されたとしてリガンドバンク内に含まれていないかもしれない。したがって、本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／またはアルブミンタンパク質部分についての天然のリガンドを同定するために、組織抽出物に対して、（カルシウム、ｃＡＭＰ、微量生理機能測定器、卵母細胞電気生理学など機能的スクリーニングを使用して）機能的にスクリーニングされ得る。陽性の機能的応答を生じる抽出物は、活性化リガンドが単離および同定されるまで、連続して細分画され得る。

ＡＴＰ結合アッセイ
以下のアッセイが、本発明の融合タンパク質のＡＴＰ結合アッセイを評価するために使用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質のＡＴＰ結合活性は、米国特許第５，８５８，７１９号（その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載されるＡＴＰ結合アッセイを用いて検出され得る。簡単には、本発明のアルブミン融合タンパク質へのＡＴＰ結合を、競合アッセイにおける８−アジド−ＡＴＰでの光親和性標識を介して測定する。１ｍｇ／ｍｌのＡＢＣ輸送タンパク質を含む反応混合物を、種々の濃度のＡＴＰまたは非加水分解性のＡＴＰアナログであるアデニル−５´−イミドニリン酸と、４℃で１０分間インキュベートする。８−アジド−ＡＴＰ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）に８−アジド−ＡＴＰ（^３２Ｐ−ＡＴＰ）（５ｍＣｉ／Ｌｍｏｌ，ＩＣＮ，ＩｒｖｉｎｅＣＡ．）を加えた混合物を、１００μＭの最終濃度までに添加し、０．５ｍｌアリコートを、氷上の磁器製スポットプレートのウェル中に配置する。このプレートを、短波２５４ｎｍのＵＶランプを用いて、プレートから２．５ｃｍの距離で、１分間隔で２回（その間に１分の冷却間隔を置いて）照射する。反応を、２ｍＭの最終濃度までジチオスレイトールを添加することによって、停止する。このインキュベーションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、乾燥、およびオートラジオグラフィーに供す。本発明のアルブミン融合タンパク質に対応するタンパク質バンドを切り取り、放射活性を定量化する。ＡＴＰまたはアデニル−５´−イミドニリン酸を増大することによる放射活性の低下は、融合タンパク質に対するＡＴＰ親和性の尺度を提供する。

本発明のアルブミン融合タンパク質と相互作用するシグナル伝達タンパク質の同定
本発明のアルブミン融合タンパク質を、シグナル伝達経路タンパク質または受容体タンパク質の同定、特徴付けおよび精製のための研究手段として供し得る。簡単には、本発明の標識融合タンパク質は、それが相互作用する分子の精製のための試薬として有益である。親和性精製の一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、クロマトグラフィーカラムに共有結合される。推定の標的細胞（例えば、癌組織）に由来する無細胞抽出液をカラムに通し、適切な親和性を有する分子をアルブミン融合タンパク質に結合する。このタンパク質複合体をカラムから回収し、分離し、そして回収された分子をＮ末端タンパク質配列決定に供する。次いで、このアミノ酸配列を使用して、捕捉分子を同定するか、または適切なｃＤＮＡライブラリーから関連遺伝子をクローニングするための縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計する。

ＩＬ−６バイオアッセイ
本発明のアルブミン融合タンパク質の増殖性効果を試験するための種々のアッセイが、当該分野で公知である。例えば、そのような１つのアッセイは、Ｍａｒｚら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５：３２５１−５６（１９９８）、本明細書中に参考として援用される）によって記載されるような、ＩＬ−６バイオアッセイである。３７℃で６８時間後、生細胞の数を、テトラゾリウム塩チアゾリルブルー（ｔｈｉａｚｏｌｙｌｂｌｕｅ）（ＭＴＴ）を添加してさらに３７℃で４時間インキュベートすることによって、測定する。Ｂ９細胞をＳＤＳによって溶解し、光学密度を５７０ｎｍで測定する。ＩＬ−６を含む対照（陽性）およびサイトカインを含まない対照（陰性）、簡単には、ＩＬ−６依存性マウスＢ９細胞を、ＩＬ−６を含まない培地中で３回洗浄し、５０μｌ中に５，０００細胞／ウェルの濃度でプレートし、そして５０μｌの本発明の融合タンパク質を添加し、利用する。陰性対照と比較して増強された試験試料（本発明のアルブミン融合タンパク質を含む）における増殖は、融合タンパク質によって媒介された増殖性効果を示す。

ニワトリ胚ニューロン生存の支持
交感神経細胞生存度が、本発明のアルブミン融合タンパク質によって支持されるか否かを試験するために、Ｓｅｎａｌｄｉらのニワトリ胚ニューロン生存アッセイが利用され得る（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：１１４５８−６３（１９９８）、これは、本明細書中に参考として援用される）。簡単には、運動ニューロンおよび交感神経を、ニワトリ胚から単離し、Ｌ１５培地（１０％ＦＣＳ、グルコース、亜セレン酸ナトリウム、プロゲステロン、コナルブミン、プトレシン、およびインスリンを含む、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．）ならびにダルベッコ改変イーグル培地［１０％ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン、および２５ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２）を含む、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．］中に、それぞれ再懸濁し、異なる濃度の本発明の精製融合タンパク質の存在下で、ならびに陰性対照はサイトカインを全く含まずに、５％ＣＯ_２中で３７℃でインキュベートする。３日後、ニューロン生存を、細胞形態学の評価によって、Ｍｏｓｍａｎｎの比色分析アッセイ（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３（１９８３））を使用して判定する。サイトカインを含まない対照と比較して増強されたニューロン細胞生存度は、アルブミン融合タンパク質がニューロン細胞の生存を高める能力を示す。

ホスファターゼ活性のアッセイ
以下のアッセイは、本発明のアルブミン融合タンパク質のセリン／トレオニンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）活性を評価するのに使用され得る。
セリン／トレオニンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）活性についてアッセイするために、当業者に広く公知のアッセイが利用され得る。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質のセリン／トレオニンホスファターゼ（ＰＳＰａｓｅ）活性は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．製のＰＳＰａｓｅアッセイキットを用いて測定され得る。ミエリン塩基性タンパク質（ＭｙＢＰ）（ＰＳＰａｓｅのための基質）を、［^３２Ｐ］ＡＴＰの存在下でｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼを用いて、セリン残基およびトレオニン残基にてリン酸化する。次いで、タンパク質セリン／トレオニンホスファターゼ活性を、^３２Ｐ標識ＭｙＢＰからの無機リン酸の遊離を測定することによって判定する。

他のタンパク質とのセリン／トレオニンホスファターゼの相互作用
（例えば、実施例５１において判断されるような）セリン／トレオニンホスファターゼ活性を有する本発明の融合タンパク質は、例えば、さらなる相互作用タンパク質または受容体タンパク質あるいは他のシグナル伝達経路タンパク質の同定、特徴付けおよび精製のための研究手段として有用である。簡単には、本発明の標識融合タンパク質は、この融合タンパク質とが相互作用する分子の精製のための試薬として有用である。アフィニティー精製の一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、クロマトグラフィーカラムに共有結合的に結合する。推定標的細胞由来の無細胞抽出液（例えば、神経細胞または肝細胞）は、カラムを通過し、適切な親和性を有する分子が、この融合タンパク質に結合する。融合タンパク質−複合体をカラムから回収し、分離し、そして回収した分子をＮ末端タンパク質配列決定に供す。次いで、このアミノ酸配列を用いて、捕捉分子を同定するか、または適切なｃＤＮＡライブラリー由来の関連遺伝子をクローニングするための縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計する。

ヘパラナーゼ活性のアッセイ
本発明のアルブミン融合タンパク質のヘパラナーゼ活性についてのアッセイに使用され得る当該分野で公知の多数のアッセイがある。一実施例において、本発明のアルブミン融合タンパク質のヘパラナーゼ活性を、Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，５：７９３−８０２（１９９９））に記載されるようにアッセイする。簡単には、細胞溶解産物、馴化培地、インタクトな細胞（１×１０^６細胞／３５ｍｍディッシュ）、細胞培養上清、または精製融合タンパク質を、３７℃で１８時間、ｐＨ６．２〜６．６で、^３５Ｓ標識ＥＣＭまたは可溶性ＥＣＭ誘導性のピークＩプロテオグリカンと共にインキュベートする。このインキュベーション培地を遠心し、そして上清をＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂカラム（０．９×３０ｃｍ）を用いたゲル濾過によって分析する。画分をＰＢＳで溶出し、それらの放射活性を測定する。ヘパラン硫酸側鎖の分解フラグメントを、０．５＜Ｋ_ａｖ＜０．８（ピークＩＩ）で、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂから溶出する。各実験を、少なくとも３回行う。「ピークＩＩ」に相当するフラグメントは、Ｖｌｏｄａｖｓｋｙによって記載されるように、ヘパラン硫酸の開裂における本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を示す。

生体分子の固定化
この実施例は、非宿主細胞脂質二重層構築物中の本発明のアルブミン融合タンパク質の安定化のための方法（例えば、Ｂｉｅｒｉら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ１７：１１０５−１１０８（１９９９）（これによって、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）を提供し、この方法は、上記の種々の機能的アッセイにおける本発明の融合タンパク質の研究のために適合され得る。簡単には、ビオチン化についての糖質特異的化学を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質にビオチンタグを拘束し、固定化の際の均一な方向を可能にする。洗浄された膜中の本発明のアルブミン融合タンパク質の５０μＭ溶液を、２０ｍＭＮａＩＯ４、１．５ｍｇ／ｍｌ（４ｍＭ）ＢＡＣＨまたは２ｍｇ／ｍｌ（７．５ｍＭ）ビオチン−ヒドラジド（反応容量、１５０μｌ）と共に、室温で１時間インキュベートする。次いで、この試料を、まず４℃で５時間、１時間後毎に緩衝液を交換して透析（ＰｉｅｒｃｅＳｌｉｄｅａｌｉｚｅｒＣａｓｓｅｔｔ，１０ｋＤａカットオフ、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ＲｏｃｋｆｏｒｄＩＬ）を行い、最終的に５００ｍｌ緩衝液Ｒ（０．１５ＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣ１２、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７）で１２時間、透析する。キュベットに添加する直前に、この試料を緩衝液ＲＯＧ５０（５０ｍＭオクチルグルコシドを追加した緩衝液Ｒ）で１：５に希釈する。

メタロプロテイナーゼ活性のアッセイ
メタロプロテイナーゼは、金属イオン（例えば、Ｚｎ^２＋）を触媒機構として用いるペプチド加水分解酵素である。本発明のアルブミン融合タンパク質のメタロプロテイナーゼ活性を、当該分野で公知の方法に従ってアッセイし得る。以下の例示的な方法が提供される。

α−２−マクログロブリンのタンパク質分解
プロテアーゼ活性を確認するために、本発明の精製融合タンパク質を、１×アッセイ緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．２ＭのＮａＣＩ、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、２５μＭのＺｎＣｌ_２および０．０５％Ｂｒｉｊ−３５）中で、基質α−２−マクログロブリン（０．２単位／ｍｌ、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合し、３７℃で１〜５日間インキュベートする。トリプシンを、陽性対照として使用する。陰性対照は、アッセイ緩衝液中にα−２−マクログロブリンのみを含む。試料を収集し、５％の２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で５分間煮沸し、次いで８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードする。電気泳動後、これらのタンパク質を銀染色によって可視化する。タンパク質分解は、陰性対照と比較した低分子量バンドの出現によって明らかである。

メタロプロテイナーゼ阻害剤によるα−２−マクログロブリンタンパク分解の阻害
公知のメタロプロテイナーゼ阻害剤（金属キレート剤（ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＨｇＣｌ_２）、ペプチドメタロプロテイナーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２）、および市販用低分子ＭＭＰ阻害剤）もまた、本発明のアルブミン融合タンパク質タンパク分解活性を特徴付けるために使用し得る。使用し得る３つの合成ＭＭＰ阻害剤は：ＭＭＰ阻害剤Ｉ、［ＭＰ−１に対しておよびＭＭＰ−８に対してＩＣ_５０＝１．０μＭ、ＭＭＰ−９に対してＩＣ_５０＝３０μＭ、ＭＭＰ−３に対してＩＣ_５０＝１５０μＭ］、ＭＭＰ−３（ストロメリシン−１）阻害剤Ｉ「ＭＭＰ−３に対してＩＣ_５０＝５μＭ」、およびＭＭＰ−３阻害剤ＩＩ「ＭＭＰ−３に対してＫ_ｉ＝１３０ｎＭ」、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍを通じて入手可能な阻害剤（各々、カタログ番号４４４２５０、４４４２１８および４４４２２５）である。簡潔には、異なる濃度の低分子ＭＭＰ阻害剤を、本発明の精製融合タンパク質（５０μｇ／ｍｌ）と２２．９μｌ１ｘＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．２ＭＮａｃｌ、１０ｍＭＣａＣｌ_２、２５μＭＺｎＣｌ_２および０．０５％Ｂｒｉｊ−３５）中で混合し、室温（２４℃）にて２時間インキュベートし、次いで、７．１μＬの基質α−２−マクログロブリン（０．２単位／ｍｌ）を添加し、３７℃で２０時間インキュベートする。４ｘ試料緩衝液の添加によってこの反応を止め、直ちに５分間煮沸する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、このタンパク質のバンドを銀染色によって可視化する。

合成蛍光発生ペプチド基質切断アッセイ
例示されたメタロプロテイナーゼ活性を有する本発明の融合タンパク質についての基質特異性を、当該分野で公知の技術（例えば、合成蛍光発生ペプチド基質（ＢＡＣＨＥＭＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＩｎｃから購入した））を用いて判定し得る。試験基質としては、Ｍ−１９８５、Ｍ−２２２５、Ｍ−２１０５、Ｍ−２１１０およびＭ−２２５５が挙げられる。最初の４つの基質は、ＭＭＰ基質であり、そして最後の一つの基質は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）転換酵素（ＴＡＣＥ）の基質である。これらの基質を、好ましくは、１：１のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および水中で調製する。ストック溶液は、５０〜５００μＭである。蛍光アッセイを、一定温度の水浴槽が装備されたＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬＳ５０Ｂルミネセンス分光計を用いて実施する。励起λは３２８ｎｍであり、放出λは３９３ｎｍである。簡潔には、このアッセイを、１７６μｌ１ｘＨＥＰＥＳ緩衝液（０．２ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ_２、０．０５％Ｂｒｉｊ−３５および５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）を４μｌの基質溶液（５０μＭ）と共に２５℃にて１５分間インキュベートすることにより実施し、次いで、アッセイキュベットへ２０μｌの本発明の精製融合タンパク質を添加する。基質の最終濃度は１μＭである。初期の加水分解速度を３０分間モニターする。

ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発症
雌性ＮＯＤ（非肥満性糖尿病）マウスを、ヒトにおいて見出されるコースと同様のコースを用いてＩＤＤＭを表すことによって特徴付けられるが、この疾患は雄性ＮＯＤマウスより雌性ＮＯＤマウスにおいては、より深刻である。以後、他に規定される場合を除き、「ＮＯＤマウス」という用語は、雌性ＮＯＤマウスをいう。ＮＯＤマウスは、慢性自己免疫疾患によって引き起こされる、ベータ細胞の進行性の崩壊を有する。したがって、ＮＯＤマウスは、正常血糖値（ｅｕｇｌｙｃｅｍｉａ）または正常血中グルコースレベルを有して生を始める。しかし、約１５〜１６週齢までに、ＮＯＤマウスは高血糖値になり始める。このことは、そのマウスの大部分の膵臓β細胞の崩壊、およびそれに対応して膵臓が十分なインスリンを産生不能であることを示す。したがって、疾患の原因および進行の両方は、ヒトＩＤＤＭ患者と同様である。
免疫処置レジメンの有効性についての体内アッセイを、雌性ＮＯＤ／ＬｔＪマウス（ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＢａｒＨａｒｂｏｒ，Ｍｅより市販される）において評価し得る。文献において、８０％の雌性マウスが２４週齢までに糖尿病を進行させ、そして膵島炎（ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ）の発症が６週齢と８週例との間に進行させることが、報告されている。ＮＯＤマウスは、同系交配され、そして種々の免疫制御性ストラテジーに対して高度に応答性である。成体のＮＯＤマウス（６〜８週齢）は、平均重量２０〜２５ｇを有する。
これらのマウスは、未処置であるか（対照）、または単独でかもしくは上記の他の治療剤組成物と併用して、本発明の治療法（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび変異体）で処置される。糖尿病の進行に対するこれらの種々の処置の有効性を、以下のように測定し得る。

１４週齢で、雌性ＮＯＤマウスを、グルコース寛容性に従って表現型決定（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）し得る。グルコース寛容性を、腹膜内グルコース寛容性テスト（ＩＰＧＴＴ）で測定し得る。簡潔に述べると、０分およびグルコース腹膜内注射（体重１ｋｇあたり１ｇ）の６０分後、血液を眼窩近傍叢（ｐａｒａｏｒｂｉｔａｌｐｌｅｘｕｓ）より引き出す。正常な寛容性は、０分で１４４ｍｇ％未満の血漿グルコース、または６０分で１６０ｍｇ未満の血漿グルコースとして定義される。血中グルコースレベルを、ＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒＥｌｉｔｅ装置を用いて測定し得る。
この表現型分析に基づき、動物を異なる実験グループに配分し得る。具体的には、より血中グルコースレベルを上昇させた動物を、不能性のグルコース寛容性グループに割り当て得る。これらのマウスに、任意に給餌し得、そして酸性化した水（ｐＨ２．３）を供給し得る。
グルコース寛容性マウスおよびグルコース不寛容性マウスを、さらに、対照グループ、本発明のアルブミン融合タンパク質グループ、およびアルブミン融合タンパク質／治療剤組成物併用グループに分け得る。対照グループのマウスは、毎日（週あたり６回）ビヒクルの腹膜内注射を受け得る。アルブミン融合タンパク質グループのマウスは、毎日（週あたり６回）、ビヒクル中での本発明の治療剤（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質ならびにそのフラグメントおよび変異体）の腹膜内注射を受け得る。アルブミン融合タンパク質／治療剤組成物併用グループのマウスは、アルブミン融合タンパク質および上記の治療剤組成物の併用の両方を受け得る。

ＮＯＤマウスにおける尿中グルコースレベルを、Ｌａｂｓｔｉｘ（ＢａｙｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して、１週おきベースで判定し得る。体重および液体摂取量もまた、１週おきベースで判定し得る。糖尿病の発症を、２つの連続的な判定に対する糖尿の発生後に規定する。処置の１０週後、さらなるＩＰＧＴＴを実施し、そして動物を翌日に殺処分し得る。
１０週のコースの処置にわたって、グルコース寛容性グループおよびグルコース不寛容性グループ両方の対照動物は、それぞれ６０％および８６％の割合で糖尿病を進行させる（Ｇｒｏｓｓらの米国特許第５，８６６，５４６号を参照のこと）。したがって、処置介入がなされない場合に最初にはグルコース寛容性であるＮＯＤマウスにおいてさえ、高い割合で糖尿病が起こる。
処置前および処置後に、ＮＯＤマウスにおける血中グルコースレベルを測定することによって、結果を確認し得る。記載される全てのグループにおいて、グルコース寛容性マウスおよびグルコース不寛容性マウスの両方における血中グルコースレベルを、上記のように測定する。

代替の実施形態において、本発明の治療剤（例えば、配列番号Ｙに開示される特定の融合タンパク質ならびにそれらのフラグメントおよび変異体）を分光学的分析を用いて定量し得、そして注射前に、適切なタンパク質量を、投与量あたり５０μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し得る。各々のマウスの背側の皮膚の下に、１週おきの２回の注射を皮下投与し得る。免疫処置の前に、２つの別々の機会でモニタリングを実施し得、そして処置全体を通して週毎にモニタリングを実施し得、そしてそれ以降も継続し得る。グルコースレベルについて、尿を毎週試験し得る（Ｋｅｔｏ−Ｄｉａｓｔｉｘ．ＲＴＭ．、ＭｉｌｅｓＩｎｃ．，Ｋａｎｋａｋｅｅ，Ｉｌｌ．）そして糖尿のマウスを、血清グルコースについて確認し得る（ＭｅｄｉＳｅｎｓｅ，Ｉｎｃ．Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）。空腹時血糖が２．５ｇ／Ｌを上回る場合、糖尿病と診断される。

ＮＯＤマウスの組織学的試験
ＮＯＤマウスからの組織試料の組織学的試験は、本発明の組成物および／または本発明の組成物および糖尿病のための他の治療剤との併用が、膵臓中のβ細胞の相対濃度を増加させる能力を、実証し得る。実験方法は、以下の通りである。
実施例５６からのマウスを、処置期間の最後に殺処分し、そしてその膵臓からの組織試料を取り出し得る。これらの試料を、０．９％の生理食塩水中の１０％ホルマリン中で固定し、そしてワックス中に包埋し得る。免疫標識化のために、５系列の５μｍの切片の２つの組を、１５０μｍの切断間隔で切断し得る。切片をインスリン（モルモット抗インスリン抗血清、１：１０００希釈、ＩＣＮＴｈａｍｅｓＵ．Ｋ．）およびグルカゴン（ウサギ抗グルカゴン抗血清、１：２０００希釈）について、免疫標識化し得、そしてペルオキシダーゼ結合体化抗ハムスター抗血清（Ｄａｋｏ，ＨｉｇｈＷｙｃｏｍｂｅ，Ｕ．Ｋ．）またはペルオキシダーゼ結合体化抗ウサギ抗血清（１：５０希釈、Ｄａｋｏ）を用いて検出し得る。
本発明の組成物は、グルコース寛容性動物またはグルコース不寛容性動物において糖尿病の臨床的症状に対して行う場合と同程度に強力な、β細胞の目視重量に対する効果を有し得る、または有し得ない。

ＮＩＤＤＭの体内マウスモデル
ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ）から３週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを入手し得、そして慣用的な食餌、または高脂肪食（重量あたり３５．５重量％、Ｂｉｏｓｅｒｖ．Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ，ＮＪ）もしくは高フルクトース食（重量あたり６０重量％、ＨａｒｌａｎＴｅｋｌａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のいずれかを、給餌し得る。規則的な食餌は、重量あたり４．５重量％の脂肪、重量あたり２３重量％のタンパク質、重量あたり３１．９重量％の炭水化物、重量あたり３．７重量％のフルクトースおよび重量あたり５．３重量％の繊維からなる。高脂肪（ラード）食は、重量あたり３５．５重量％の脂肪、重量あたり２０重量％のタンパク質、重量あたり３６．４重量％の炭水化物、重量あたり０．０重量％のフルクトースおよび重量あたり０．１重量％の繊維からなる。高フルクトース食は、重量あたり５重量％の脂肪、重量あたり２０重量％のタンパク質、重量あたり０．０重量％の炭水化物、重量あたり６０重量％のフルクトースおよび重量あたり９．４重量％の繊維からなる。ケージあたり５匹以下、２２℃＋／−３℃に温度制御し、かつ５０％＋／−２０％湿潤制御した部屋で、１２時間の日照（午前６時〜午後６時）／暗サイクルで、これらのマウスを飼育し得る（Ｌｕｏｅｔａｌ．，１９９８，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ４７（６）：６６３−８，「Ｎｏｎｇｅｎｅｔｉｃｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｓｏｆｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄｉａｂａｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ」、Ｌａｒｓｅｎｅｔａｌ．，Ｄｉａｂａｔｅｓ５０（１１）：２５３０−９（２００１），「Ｓｙｓｔｅｍｉｃａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇＧＬＰ−１ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅＮＮ２２１１ｉｎｄｕｃｅｓｌａｓｔｉｎｇａｎｄｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｗｅｉｇｈｔｌｏｓｓｉｎｂｏｔｈｎｏｒｍａｌａｎｄｏｂｅｓｅｒａｔｓ」）。３週間それぞれの食餌にさらした後、体重ｋｇあたり１００ｍｇでのストレプトゾシン「ＳＴＺ」（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはビヒクル（０．０５モル／Ｌのクエン酸、ｐＨ４．５）のいずれかを、マウスに腹膜内注射し得、そして続く４週間、同じ食餌で維持し得る。非飢餓条件の下で、ＳＴＺの１週後、２週後および４週後に、尾の遠位部分を切断することによって血液を得る。試料を使用して、非飢餓の血漿グルコース濃度およびインスリン濃度を測定する。体重および食餌摂取を、週毎に記録する。

インスリンがグルコース処理を刺激する能力に対する高脂肪食の影響を直接判定するために、３つのグループのマウス（脂肪食給餌マウス、ビヒクルを注射した通常食給餌マウス、および上記の７週間の期間の最後にＳＴＺを注射した脂肪食給餌マウス）に、これらの実験を開始し得る。実験前に、マウスを４時間飢餓させ得る。第１系列の実験において、マウスをメチルフルラン（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒ，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）吸引で麻酔し得る。正規のインスリン（Ｓｉｇｍａ）を、尾部静脈を介して静脈注射（［ＩＶ］、ｋｇ体重あたり０．１Ｕ）し、そして注射の３分後、６分後、９分後、１２分後および１５分後に異なる尾部静脈から血液を収集し得る。これらの試料について血漿グルコース濃度を判定し、そして薬理動態学／薬理動力学ソフトウェアプログラムのＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｎｓｕｌｔｉｎｇ，Ａｐｅｘ，ＮＣ）を使用して、血漿からのグルコース消失の半減期（ｔ１／２）を判定し得る。

第２の一連の実験において、腹膜内のペントバルビタールナトリウム（Ｓｉｇｍａ）でマウスを麻酔し得る。腹腔を開腹し、そして腹静脈を露出させ、そして２４ゲージＩＶカテーテル（Ｊｏｈｎｓｏｎ−ＪｏｈｎｓｏｎＭｅｄｉｃａｌ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＴＸ）でカテーテル挿管した。このカテーテルを、腹静脈に隣接した筋肉組織に固定し、シリンジ接続部の下側で切断し、そしてあらかじめ充填したＰＥ５０プラスチックチューブにフック固定し、これを次いで注入溶液を有するシリンジに接続する。次いで、腹腔を縫合して閉じる。このアプローチでは、胴体の下側部分からの血液の逆流の妨害が全くない。マウスに、継続してグルコース（２４．１ｍｇ／ｋｇ／分）およびインスリン（１０ｍＵ／ｋｇ／分）を、注入容量１０μＬ／分で注入した。血漿グルコース濃度および血漿インスリン濃度の測定のために、注入開始の９０分後、１０５分後、１２０分後および１３５分後に、後方眼窩（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）血液試料（各々７０μＬ）を取り出し得る。これら４つの試料の平均を使用して、各々の動物についての安定状態血漿グルコース濃度（ＳＳＰＧ）および安定状態血漿インスリン濃度（ＳＳＰＩ）を評価し得る。

最後に、本適用の治療剤組成物であるアルブミン融合タンパク質が、単独でかまたは糖尿病の処置のために列挙された治療的薬物のいずれか１つ以上との併用のいずれかで、血漿グルコースを減少させる能力を評価するための実験を、ＳＴＺ注射した以下の２つのグループの「ＮＩＤＤＭ」マウスモデルにおいて実施する。（１）脂肪食給餌したＣ５７ＢＬ／６Ｊ、および（２）フルクトース給餌したＣ５７ＢＬ／６Ｊ。これらの研究についてのマウスの血漿グルコース濃度は、２５５〜５５５ｍｇ／ｄＬにわたり得る。マウスを、ビヒクルを用いた処置、または単独でかもしくは糖尿病の処置のために列挙された治療的薬物のいずれか１つ以上との併用のいずれかでの本発明のアルブミン融合タンパク質を用いた処置のいずれかに、ランダムに割り当てる。全部で３つの投与量を投与し得る。最初の投薬前および最後の投薬の３時間後に、血漿グルコース濃度の測定のために、尾部静脈血液試料を取り出し得る。

酵素比色アッセイである、ＳｉｇｍａからのＧｌｕｃｏｓｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＫｉｔ（Ｓｉｇｍａ番号３１５）を使用して、血漿グルコース濃度を測定し得る。ＬｉｎｃｏＲｅｓｅａｒｃｈからのＲａｔＩｎｓｕｌｉｎＲＩＡＫｉｔ（＃ＲＩ−１３Ｋ、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）を使用して、血漿インスリンレベルを測定し得る。

インスリン作用の関与を確立する体外Ｈ４ＩＩｅ−ＳＥＡＰレポーターアッセイ
種々のＨ４ＩＩｅレポーター
Ｈ４ＩＩｅ／ｒＭＥＰ−ＳＥＡＰ：ラットから単離されたリンゴ酸酵素プロモーター（ｒＭＥＰ）は、インスリン経路において存在するＰＰＡＲ−γエレメントを含む。このレポーター構築物を、肝臓Ｈ４ＩＩｅ細胞株に安定にトランスフェクトする。
Ｈ４ＩＩｅ／ＳＲＥＢＰ−ＳＥＡＰ：ステロール制御エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ−１ｃ）は、多くのインスリン応答性遺伝子（例えば、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ））のプロモーターに対して作用し、そして線維芽細胞、褐色脂肪細胞および肝細胞における脂肪酸代謝において重要な遺伝子の発現を制御する、転写因子である。ＳＲＥＢＰ−１ｃはまた、褐色脂肪細胞決定分化因子１（ＡＤＤ−１）としても公知であり、褐色脂肪細胞における遺伝子発現に対してインスリンの効果の主用なメディエーターとみなされる。その活性は、インスリンレベル、ステロールレベルおよびグルコースレベルによって調節される。このレポーター構築物を、肝臓Ｈ４ＩＩｅ細胞株に安定にトランスフェクトする。
Ｈ４ＩＩｅ／ＦＡＳ−ＳＥＡＰ：脂肪酸合成酵素の構築物は、最小限のＳＲＥＢＰ応答性ＦＡＳプロモーターを含む。このレポーター構築物を、肝臓Ｈ４ＩＩｅ細胞株に安定にトランスフェクトする。

Ｈ４ＩＩｅ／ＰＥＰＣＫ−ＳＥＡＰ：ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターは、ＰＥＰＣＫ活性を調節するＰＥＰＣＫ遺伝子転写のホルモン性制御の主要な部位である。ＰＥＰＣＫは、肝臓の糖新生における、統合されかつ速度制御する段階を触媒し、そして従って、正常な限定内で血中グルコースレベルを維持するために、注意深く制御されなければならない。このレポーター構築物を、肝臓Ｈ４ＩＩｅ細胞株に安定にトランスフェクトする。
これのレポーター構築物をまた、３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞およびＬ６筋芽細胞に安定にトランスフェクトし得る。次いで、これらの安定細胞株を、実施例１３に先に記載したように、３Ｔ３−Ｌ１褐色脂肪細胞およびＬ６筋管へと分化させる。次いで、これらの分化した細胞株を、以下に記載するＳＥＡＰアッセイにおいて使用し得る。

増殖培地およびアッセイ培地
増殖培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１０％ウシ血清、１％ＮＥＡＡ、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、および０．７５ｍｇ／ｍＬＧ４１８（Ｈ４ＩＩｅ／ｒＦＡＳ−ＳＥＡＰおよびＨ４ＩＩｅ／ＳＲＥＢＰ−ＳＥＡＰに対して）または０．５０ｍｇ／ｍＬＧ４１８（Ｈ４ＩＩｅ／ｒＭＥＰ−ＳＥＡＰに対して）を含む。Ｈ４ＩＩｅ／ＰＥＰＣＫ−ＳＥＡＰに対して、増殖培地は、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水および０．５０ｍｇ／ｍＬＧ４１８からなる。
Ｈ４ＩＩｅ／ｒＦＡＳ−ＳＥＡＰレポーター、Ｈ４ＩＩｅ／ＳＲＥＢＰ−ＳＥＡＰレポーターおよびＨ４ＩＩｅ／ｒＭＥＰ−ＳＥＡＰレポーターに対するアッセイ培地は、低グルコースＤＭＥＭ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ＮＥＡＡ、１ｘペニシリン／ストレプトマイシンからなる。Ｈ４ＩＩｅ／ＰＥＰＣＫ−ＳＥＡＰレポーターに対するアッセイ媒体は、０．１％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水からなる。
方法

９６ウェルプレートを、対数増殖期の細胞が接着するまで、ウェルあたり１００μＬの増殖培地中に、ウェルあたり７５，０００個の細胞播種する。増殖培地をアッセイ培地（ウェルあたり２００μＬ）に交換することによって、細胞を４８時間飢餓させる。（例えば、Ｈ４ＩＩｅ／ＰＥＰＣＫ−ＳＥＡＰに対して、０．５μＭのデキサメタゾンを含むアッセイ培地をウェルあたり１００μＬで添加し、そして約２０時間インキュベートする）。このアッセイ培地を、その後ウェルあたり１００μＬの新鮮なアッセイ培地に交換し、そして本発明の治療剤（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質ならびにそのフラグメントおよび変異体）を発現するトランスフェクト細胞株から得られた細胞上清の５０μＬのアリコートを、ウェルに添加する。空のベクターをトランスフェクトされた細胞株を、陰性対照として使用する。ウェルへの１０ｎＭおよび／または１００ｎＭのインスリンの添加を、陽性対照として使用する。４８時間のインキュベーション後、馴化培地を収集し、そしてＳＥＡＰ活性を測定する（Ｐｈｏｓｐｈａ−ＬｉｇｈｔＳｙｓｔｅｍプロトコル，Ｔｒｏｐｉｘ＃ＢＰ２５００）。簡潔に述べると、試料を希釈緩衝液で１：４に希釈し、そして６５℃で３０分間インキュベートして、内因性の非胎盤形態のＳＥＡＰを不活性化させる。希釈した試料の５０μＬアリコートを、非胎盤性ＳＥＡＰアイソザイムに対して活性な阻害剤混合物を含む、５０μＬのＳＥＡＰＡｓｓａｙＢｕｆｆｅｒと共に混合し、そしてさらに５分間インキュベートする。ＣＳＰＤ化学発光基質の５０μＬアリコート（これは、Ｅｍｅｒａｌｄ発光増強剤中に１：２０に希釈される）をこの混合物に添加し、そして１５〜２０分間インキュベートする。プレートを、Ｄｙｎｅｘプレートルミノメータで解読する。

トランスジェニック動物
本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、トランスジェニック動物において発現され得る。任意の種の動物（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、小ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシならびに非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して、トランスジェニック動物を生成し得る。特定の実施形態において、本明細書で記載される技術またはそうでなければ当該分野で公知の技術を使用して、ヒトにおいて遺伝子治療プロトコルの一部として本発明の融合タンパク質を発現する。
当該分野で公知の任意の技術を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを動物に導入し、トランスジェニック動物の初代系統を生成し得る。このような技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：前核マイクロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）、Ｃａｒｖｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）、Ｗｒｉｇｈｔｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）、およびＨｏｐｐｅｅｔａｌ．，米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））、生殖系統へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入（ＶａｎｄｅｒＰｕｔｔｅｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、芽細胞または胚細胞、胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｃｅｌｌ５６：３１３−３２１（１９８９））、細胞または胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，１９８３，ＭｏｌＣｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））、遺伝子銃を使用する本発明のポリヌクレオチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５（１９９３）を参照のこと）、核酸構築物の胚性胸膜能幹細胞への導入および幹細胞の芽細胞への移入、ならびに精液媒介性遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら，Ｃｅｌｌ５７：７１７−７２３（１９８９））等。このような技術の総説としては、Ｇｏｒｄｏｎ，”ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｎｉｍａｌｓ，”Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）（これは、その全体が本明細書で参考として援用される）を参照のこと。

当該分野で公知の任意の技術（例えば、休止へと誘導された、培養された胚性胎児、または成体細胞由来の核の除核された卵母細胞への核移入（Ｃａｍｐｅｌｌｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３８０：６４−６６（１９９６）、Ｗｉｌｍｕｔｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３８５：８１０−８１３（１９９７）））を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニッククローンを生成し得る。
本発明は、細胞全体に本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有するトランスジェニック動物、ならびに細胞全体ではないが、いくらかこれらのポリヌクレオチドを保有する動物、すなわち、モザイク動物またはキメラ動物、を提供する。トランスジーンは、単一のトランスジーンとしてか、またはコンカタマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）における複数のコピー、例えば、頭頭連結または頭尾連結として一体化され得る。このトランスジーンはまた、例えば、Ｌａｓｋｏら（Ｌａｓｋｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６２３２−６２３６（１９９２））の教示に従うことによって、特定の細胞型へと選択的に導入され得、そして活性化され得る。細胞型特異的活性化に必要な調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、当業者に対して明らかである。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、治療タンパク質部分または本発明のアルブミン融合タンパク質に対応する内因性遺伝子の染色体部位に一体化されることが望まれる場合、遺伝子標的化が好ましい。簡単に言うと、このような技術が、利用される場合、内因性遺伝子に相同性の幾つかのヌクレオチド配列を含むベクターは、染色体配列による相同性組換えを介する、内因性遺伝子のヌクレオチド配列への一体化およびその機能の破壊の目的のために設計される。トランスジーンはまた、特定の細胞型に選択的に導入され得、したがって、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従うことによって、その細胞型のみにおいて内因性遺伝子を不活性化し得る。このような細胞特異的不活性化に必要な調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、当業者に対して明らかである。

一旦、トランスジェニック動物が生成されると、組換え遺伝子の発現を、標準的技術を利用してアッセイし得る。初期スクリーニングは、動物組織を分析するためのサザンブロット分析またはＰＣＲ技術によって達成され、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一体化が生じたことを検証し得る。トランスジェニック動物の組織における、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのｍＲＮＡ発現のレベルはまた、以下を含むが、これらに限定されない技術を使用して評価され得る。動物から得られる組織試料のノーザンブロット分析、インサイツハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）。融合タンパク質発現組織の試料はまた、融合タンパク質に特異的な抗体を使用して、免疫細胞化学的に、または免疫組織化学的に評価され得る。

一旦、創始動物が生成されると、それらを繁殖し、同系交配し、異種交配し、または交雑育種して、特定の動物のコロニーを生成し得る。このような繁殖ストラテジーの例としては、以下を含むが、これらに限定されない：創始動物と１つより多い一体化部位とを異種交配して、別々の系統を確立する、別々の系統を同系交配して、各トランスジーンのさらなる発現の効果に起因して、より高いレベルでトランスジーンを発現する化合物トランスジェニック体を生成する、所定の一体化部位にヘテロ接合性の動物を生成するように、ヘテロ接合トランスジェニック動物を交配させて、発現を補強し、かつ、ＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性を排除する、別個のヘテロ接合体系統を交配させて、化合物ヘテロ接合体系統またはホモ接合体系統を生成する、ならびに着目実験モデルに適切な別個のバックグランドに対してトランスジーン（すなわち、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を配置するように繁殖する。
本発明のトランスジェニック動物は、以下を含むが、これらに限定されない用途を有する。本発明の融合タンパク質の生物学的機能を推定するのに有用な動物モデル系ならびに本発明の融合タンパク質の治療タンパク質および／またはアルブミン成分、異常な発現に関連する状態および／または障害の研究、ならびにこのような状態および／または障害を改善するのに有効な化合物のスクリーニング。

生体外での遺伝子治療を使用する処置の方法
遺伝子治療の１つの方法は、線維芽細胞を移植し、これは、本発明のアルブミン融合タンパク質を患者へと発現し得る。一般的に、線維芽細胞は、皮膚生検によって被験体から得られる。得られた組織を、組織培養培地に配置し、小片に分離する。この組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面に配置し、約１０片を各フラスコに配置する。フラスコを上下に振り、硬く閉めて、室温で一晩置く。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、組織塊を、フラスコの底部に固定されたままにし、新鮮な培地（例えば、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地（１０％ＦＲＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む））を加える。次いで、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。
このときに、新鮮な培地を加え、続いて、数日毎に入れ替える。培養のさらに２週間後、線維芽細胞の単層が、現れる。この単層をトリプシン処理し、より大きいフラスコにスケールを合わせる。
ｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら，ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））（Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復に隣接する）を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、続いて、子ウシ腸ホスファターゼにより処理する。線形ベクターをアガロースゲル上で分画し、ガラスビーズを使用して精製する。

本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知の技術を使用して生成され得、ＰＣＲプライマーを用いて増幅され得、これは、５´末端配列および３´末端配列に対応し、必要に応じて、適切な制限部位を有し、必要であれば、開始コドン／終止コドンを有する。ある実施形態では、５´プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含み、３´プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、当量のＭｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線形背骨ならびに増幅されたＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを一緒に加える。得られる混合物を２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。次いで、連結混合物を使用して、細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次いで、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する目的で、これを寒天（カナマイシンを含む）上にプレーティングする。
両性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージ細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１０％子ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む）中で、コンフルエント密度まで組織培養で増殖する。次いで、この遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え、パッケージ細胞をベクターにより変換する。ここで、パッケージ細胞は、感染性ウイルス粒子（遺伝子（ここで、パッケージ細胞はプロデューサー細胞と称される）を含む）を生成する。

新鮮な培地を変換されたプロデューサー細胞に加え、続いて、この培地をコンフルエントプロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから回収する。消費培地（感染性ウイルス粒子を含む）を、ミルポアフィルタを通じて濾過し、解離したプロデューサー細胞を除去し、次いで、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させる。培地を線維芽細胞の半コンフルエントプレートから除去し、プロデューサー細胞からの培地により迅速に置換する。この培地を除去し、新鮮な培地で置換する。ウイルスの力価が高い場合、実質的に全ての線維芽細胞が感染され、選択の必要はない。力価が非常に低い場合、選択可能なマーカー（例えば、ｎｅｏまたはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染されると、線維芽細胞を分析して、アルブミン融合タンパク質が産生されたか否かを判定する。
次いで、単独またはｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエンスまで増殖した後に、操作された線維芽細胞を宿主に移植する。

体内での遺伝子療法を使用する治療の方法
本発明の別の態様は、体内遺伝子療法を使用して、障害、疾患および状態を治療することである。遺伝子療法は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の動物への導入に関する。本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標的組織によってポリペプチドの発現に必要なプロモーターまたは任意の他の遺伝子エレメントに作動可能に連結（すなわち、会合）され得る。このような遺伝子治療および送達技術および方法は、当該分野で公知である。例えば、国際公開第Ｗ０９０／１１０９２号，国際公開第Ｗ０９８／１１７７９号、米国特許第５６９３６２２号，同第５７０５１５１号，同第５５８０８５９号、Ｔａｂａｔａら，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９（１９９７）、Ｃｈａｏｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２（１９９７）、Ｗｏｌｆｆ，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８（１９９７）、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．３（５）：４０５−４１１（１９９６）、Ｔｓｕｒｕｍｉｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９４（１２）：３２８１−３２９０（１９９６）（本明細書で参考として援用される）。
ポリヌクレオチド構築物は、注射可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織の間質空間（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）への注射）によって送達され得る。ポリヌクレオチド構築物は、薬学的に許容可能な液体または水性キャリアで送達され得る。

「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡという用語は、細胞への進入を補助、増進、または促進するように作用する任意の送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチンまたは沈殿剤等）を含まない配列を示す。しかしながら、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、リポソーム処方物で送達され得（例えば、ＦｅｌｇｎｅｒＰ．Ｌら．（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈＢ．ら．（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ８５（１）：１−７に教示されているもの）、これらは、当業者に周知の方法によって調製され得る。
遺伝子治療法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、宿主ゲノムへ一体化も、複製を可能にする配列も含みもしない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ＤＮＡの発現を駆動させるために使用され得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入することの１つの主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチド合成の一時的な性質である。非複製ＤＮＡ配列が、細胞に導入されて、６ヶ月までの期間で所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが、研究により示されている。

ポリヌクレオチド構築物は、動物内の以下の組織の間質空間に送達され得る。筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織。これらの組織の間質空間は、細胞間流体、器官組織の細網線維間にあるムコ多糖マトリクス、脈管または室の壁の弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維、または筋肉細胞を覆う結合組織内もしくは骨の空隙内の同じマトリクスを含む。それは、同様に、循環血漿およびリンパチャネルのリンパ流体により占められた空間である。筋組織の間質空間への送達が、以下に考察される理由から好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織に注射によって簡便に送達され得る。それらは、分化された非分裂細胞へと、持続的に送達および発現されるが、送達および発現は、非分化の細胞またはより完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。体内で、筋細胞は、ポリヌクレオチドの取り込みおよび発現の能力において特に有能である。
裸のポリヌクレオチド注射について、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。ある実施形態では、投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであって、別の実施形態では、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。当然ながら、当業者が理解するように、この投薬量は、注射する組織によって変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に判定され得、処置される状態および投与経路に依存し得る。例示的な投与経路は、組織の間質空間への注射という非経口経路によるものである。しかしながら、他の非経口経路（例えば、肺または気管支組織、喉または鼻の粘膜への送達については、特に、エアロゾル処方物の吸入）もまた、使用され得る。加えて、裸のポリヌクレオチド構築物は、手技において使用されるカテーテルによる血管形成の間に、動脈へと送達され得る。

筋肉内に注射されたポリヌクレオチドの体内での投薬量応答効果は、以下のように判定される。本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの産生に好適なテンプレートＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。テンプレートＤＮＡ（これは、環状または線形のいずれでもよい）を、裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化させる。次いで、マウスの四頭筋に、種々の量のテンプレートＤＮＡを注射する。
５〜６週齢の雌および雄のＢａｌｂ／Ｃマウスを、０．３ｍｌの２．５％Ａｂｅｒｔｉｎによる腹腔内注射によって麻酔する。１．５ｃｍの切開を前部大腿に作製し、四頭筋を直接視覚化する。１ｃｃ注射器の２７ゲージ針を通して１分間にわたり、膝への筋肉の遠位注射部位から約０．５ｃｍおよび深さ約０．２ｃｍで、０．１ｍｌのキャリアにより、テンプレートＤＮＡを注射した。将来の局在化のために、縫合糸を注入部位に配置し、そして皮膚をステンレス鋼クリップで閉じる。

適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭筋全体を切開することによって調製する。個々の四頭筋の各５番目の１５ｕｍの断面をタンパク質発現について組織化学的に染色する。融合たんぱく質についての時間経過は、異なるマウス由来の四頭筋を異なる時間において回収することを除いて、同様に実施し得る。注射後の筋肉内のＤＮＡの持続性は、注射したマウスおよび対照マウスからの全細胞ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製後の、サザンブロット分析により判定され得る。マウスにおける上述の実験の結果を使用して、ヒトおよび他の動物における、裸のＤＮＡを使用する適切なパラメータおよび他の処置パラメータを補間し得る。

本発明の融合タンパク質の生物学的影響
星状細胞および神経アッセイ
本発明のアルブミン融合タンパク質は、皮質神経細胞の生存、神経突起成長、または表現型の分化を促進する活性について、およびグリア繊維性酸性タンパク質免疫保護細胞、星状細胞の増殖誘導について試験し得る。バイオアッセイについての皮質細胞の選択は、皮質構造におけるＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の遍在的発現、ならびに以前に報告されているＦＧＦ−２処理による皮質神経細胞生存の促進に基づく。例えば、チミジン取り込みアッセイは、これらの細胞における本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を解明するために使用され得る。
さらに、体外での皮質神経細胞または海馬神経細胞におけるＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）の生物学的影響を記載する以前の報告は、これらの両方において、神経細胞の生存および神経突起成長の増加を実証している（Ｗａｌｉｃｋｅら、“Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｐｒｏｍｏｔｅｓｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓｎｅｕｒｉｔｅｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：３０１２−３０１６．（１９８６）、（この全体が、参考として本明細書中に援用される）。しかし、ＰＣ−１２細胞に関して行われた実験による報告は、これらの２つの反応は、必ずしも同じ意味ではなく、試験されたＦＧＦだけでなく標的細胞上に発現される受容体にも依存し得ることを示唆する。初代皮質神経細胞培養パラダイムを使用して、神経突起成長を誘導する本発明のアルブミン融合タンパク質の能力を、例えば、チミジン取り込みアッセイを用いて、ＦＧＦ−２で達成された反応と比較し得る。

線維芽細胞アッセイおよび内皮細胞アッセイ
ヒト肺線維芽細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓからの増殖培地で維持する。真皮性微小血管内皮細胞をＣｅｌｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から得る。増殖アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞および真皮性微小血管内皮細胞を、９６ウェルプレートの増殖培地中で１日間、５，０００細胞／ウェルで培養し得る。次いでこの細胞を０．１％ＢＳＡ基礎培地中で１日間インキュベートする。新鮮な０．１％ＢＳＡ培地で培地を置換した後、細胞を本発明の試験融合タンパク質と３日間インキュベートする。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（ＡｌｍａｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を１０％の最終濃度になるように各ウェルに添加する。この細胞を４時間インキュベートする。細胞生存度をＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーでの読み取りにより測定する。ＰＧＥ_２アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５，０００細胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を交換した後、細胞をＩＬ−１αと共に、またはそれを伴わずに、ＦＧＦ−２または本発明の融合タンパク質と２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ）によりＰＧＥ_２についてアッセイする。ＩＬ−６アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５，０００細胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を交換した後、細胞を本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはＩＬ−１αと共に、またはそれを伴わずに、ＦＧＦ−２と２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によりＩＬ−６についてアッセイする。
ヒト肺線維芽細胞をＦＧＦ−２または本発明のアルブミン融合タンパク質と共に基礎培地中で３日間培養し、その後、線維芽細胞の増殖に対する効果を評価するためＡｌａｍａｒＢｌｕｅを添加する。ＦＧＦ−２は、本発明のアルブミン融合タンパク質での刺激と匹敵して用いられ得る１０〜２５００ｎｇ／ｍｌの刺激を示すはずである。

［３Ｈ］チミジン取り込みに基づく細胞増殖
以下の［３Ｈ］チミジン組み込みアッセイは、細胞（例えば、線維芽細胞、上皮細胞または未成熟筋細胞）の増殖に対する治療タンパク質（例えば、増殖因子タンパク質）の効果を測定するために使用され得る。
サブコンフルエント培養物は、無血清培地における、１８時間のインキュベーションによってＧ１相で停止される。次いで、治療タンパク質は、２４時間添加され、最後の４時間、培養物は、０．３３μＭの最終濃度（２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で［３Ｈ］チミジンで標識される。取り込まれた［３Ｈ］チミジンは、２４時間、氷冷１０％トリクロロ酢酸で沈殿される。次いで、細胞は、氷冷１０％トリクロロ酢酸で、次いで、氷冷水で連続的に洗浄される。０．５ＭのＮａＯＨでの溶解に続いて、溶解物およびＰＢＳリンス（５００ｍｌ）をプールし、そして放射能の量が測定される。

パーキンソンモデル
パーキンソン病における運動機能の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性投射ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。広範に特徴付けされたパーキンソン病の動物モデルは、１−メチル−４フェニル１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の全身投与を含む。ＣＮＳにおいて、ＭＰＴＰは、星状細胞により取り込まれ、そしてモノアミンオキシダーゼＢにより１−メチル−４−フェニルピリジン（ＭＰＰ^＋）に異化され、そして放出される。引き続き、ＭＰＰ^＋は、ドーパミンの高親和性再取り込みトランスポーターによりドーパミン作動性ニューロンに能動的に蓄積する。次いで、ＭＰＰ^＋は、電気化学勾配によりミトコンドリア中で濃縮され、そしてニコチン酸アミドアデニン二リン酸：ユビキノン酸化還元酵素（複合体Ｉ）を選択的に阻害し、これにより電子伝達を妨害し、そして最終的に活性酸素を生成する。
ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）が黒質のドーパミン作動性ニューロンへの栄養活性を有することが組織培養パラダイムにおいて実証されている（Ｆｅｒｒａｒｉら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８９）。近年、Ｕｎｓｉｃｋｅｒ博士のグループは、線条体のゲル型インプラントでのＦＧＦ−２投与がＭＰＴＰ曝露と関連する毒性から黒質のドーパミン作動性ニューロンのほぼ完全な防御を生じることを実証している（ＯｔｔｏおよびＵｎｓｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０）。

ＦＧＦ−２を用いたデータに基づいて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、体外におけるドーパミン作動性ニューロン生存を増強する際において、ＦＧＦ−２の作用と類似の作用を有するか否かを判定するために評価され、また、線条体におけるドーパミン作動性ニューロンを、ＭＰＴＰ処理と関連する損傷からの防御について体内で試験され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質の潜在的効果を、まずドーパミン性ニューロン細胞培養パラダイムにおいて体外で試験する。妊娠１４日のＷｉｓｔａｒラット胚由来の中脳底板を解剖することにより、培養物を調製する。組織をトリプシンで分離し、そしてポリオルチニン−ラミニンでコートしたカバーガラスに２００，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播く。この細胞をダルベッコ改変イーグル培地およびホルモン補充物（ＮＩ）を含有するＦ１２培地中で維持する。体外で８日後培養物をパラホルムアミドで固定し、そしてチロシンヒドロキシラーゼ（ドーパミン作動性ニューロンについての特異的マーカー）での免疫組織化学染色のために処理する。分離した細胞培養物を胚性ラットから調製する。培養培地を３日毎に変化させ、そしてこの因子をまたその時点毎に添加する。

ドーパミン作動性ニューロンを妊娠１４日（ドーパミン作動性前駆細胞が増殖する段階を過ぎる発生時間）で動物から単離するので、チロシンヒドロキシラーゼ免疫陽性ニューロンの数の増加は、体外で生存しているドーパミン作動性ニューロンの数の増加を示す。したがって、本発明の治療タンパク質がドーパミン作動性ニューロンの生存を延長するように作用するならば、この融合タンパク質がパーキンソン病に関与し得ることを示唆する。

膵臓β細胞移植併用治療
特に標的自己組織が重篤に損傷を受けている場合、移植は自己免疫疾患の処置の一般の形態である。例えば、膵臓移植および膵島細胞移植は、ＩＤＤＭに対する通常の処置選択肢であるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｔｅｗａｔｔｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ８６（３）９８４−９８８（２００１）、Ｂｒｕｎｉｃａｒｄｉ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２８：２１３８−４０（１９９６）、Ｋｅｎｄａｌｌ＆Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ＤｉａｂａｔｅｓＭｅｔａｂ．２２：１５７−１６３（１９９６）、Ｈａｍａｎｏｅｔａｌ．，ＫｏｂｅＪ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．４２：９３−１０４（１９９６）、Ｌａｒｓｅｎ＆Ｓｔｒａｔｔａ，ＤｉａｂａｔｅｓＭｅｔａｂ．２２：１３９−１４６（１９９６）、およびＫｉｋｈａｂｗａｌａｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１７１：５１６−５２０（１９９６）を参照のこと）。任意の移植方法に関して、自己免疫疾患患者に対する移植治療は、移植組織の宿主からの拒絶の危険性を最低にするための処置を包含する。しかしながら、自己免疫疾患は、元の自己組織に損傷を与えた、あらかじめ存在する宿主の自己免疫応答が、移植組織に対して同じ損傷効果をもたらすという、さらなる別個の危険性を含む。故に、本発明は、自己免疫疾患の移植治療を受ける個体において、免疫調節剤および／または免疫抑制剤と併用して本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、自己免疫膵臓疾患の処置のための方法および組成物を包含する。
本発明に従って、上記のアルブミン融合ベースの組成物および処方物を、最初に元の自己組織に対して指向される宿主個体の自己免疫応答から生じた、移植器官、移植組織または移植細胞に対する損傷を防止または処置するために、投与する。移植前および移植後の両方に、２〜４投与量で各１週おきに、投与を実施し得る。

膵島細胞移植または膵臓移植において、以下の免疫調節剤および／または免疫抑制剤を、本発明のアルブミン融合治療剤と一緒に使用し得る。ＡＩ−４０１、ＣＤＰ−５７１（抗ＴＮＦモノクローナル抗体）、ＣＧ−１０８８、Ｄｉａｍｙｄ（糖尿病ワクチン）、ＩＣＭ３（抗ＩＣＡＭ−３モノクローナル抗体）、リノミド（ｌｉｎｏｍｉｄ）（Ｒｏｑｕｉｎｉｍｅｘ）、ＮＢＩ−６０２４（改変ペプチドリガンド）、ＴＭ−２７、ＶＸ−７４０（ＨＭＲ−３４８０）、カスパーゼ８プロテアーゼ阻害剤、サリドマイド、ｈＯＫＴ３γ１（Ａｌａ−ａｌａ）（抗ＣＤ３モノクローナル抗体）、経口インターフェロンα、経口乳酸菌、およびＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−Ｂ（商標）を含むが、これらに限定されない。

ＶＨドメインおよびＶＬドメインの同定およびクローニング
特定の抗体を発現する細胞株から、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを同定およびクローン化するための一つの方法は、抗体を発現する細胞株から作製されたｃＤＮＡに対してＶＨ特異的プライマーおよびＶＬ特異的プライマーを用いて、ＰＣＲを実施することである。簡潔には、ＲＮＡを、細胞株から単離し、そして、ＥＢＶ細胞株により発現される抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを増幅するために設計されたＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとして使用する。細胞を、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ．ＭＤ）で溶解し得、１／５量のクロロホルムで抽出する。クロロホルム添加後、溶液を室温で１０分間インキュベートし、そして、卓上遠心分離機にて、４℃で１５分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離する。上清を収集し、そしてＲＮＡを等量のイソプロパノールを用いて沈殿化する。沈殿化ＲＮＡを、卓上遠心分離機にて、４℃で１５分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離することによって、ペレットにする。遠心分離後、上清を捨て、７５％エタノールを用いて洗浄する。洗浄後、ＲＮＡを再度、４℃で５分間８００ｒｐｍにて遠心分離する。この上清を捨て、そしてこのペレットを風乾する。ＲＮＡをＤＥＰＣ水で溶解し、６０℃で１０分間加熱する。ＲＮＡ量は、光学密度測定を用いて判定し得る。
当該分野で周知の方法によれば、逆転写酵素およびランダムヘキサマープライマーを用いて、ｃＤＮＡを１．５μｇ〜２．５μｇのＲＮＡから合成し得る。次いで、ｃＤＮＡをＶＨドメインおよびＶＬドメインのＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用する。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を増幅するために使用されるプライマーを、表６に示す。典型的には、ＰＣＲ反応は、単一５´プライマーおよび単一３´プライマーを使用する。時には、利用できるＲＮＡテンプレート量が限定される場合、またはより高い効率のために、５´プライマー群および／または３´プライマー群を使用し得る。例えば、時として、５つ全てのＶＨ−５´プライマーおよび全ＪＨ３´プライマーを、単一ＰＣＲ反応で使用する。このＰＣＲ反応を、１ＸＰＣＲ緩衝液、２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．７単位のＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＴａｑポリメラーゼ、５´プライマー混合物、３´プライマー混合物および７．５μｌのｃＤＮＡを含む５０μｌ量で実施する。ＶＨおよびＶＬの両方の５´プライマーおよび３´プライマー混合物を、各々２２ｐｍｏｌｅの個々のプライマーおよび２８ｐｍｏｌｅの個々のプライマーを共にプールすることによって、作製し得る。ＰＣＲ条件は、９６℃で５分間、その後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、および７２℃で１分間の２５サイクル、その後、７２℃で１０分間伸長サイクルが続く。この反応が完了した後、試料チューブを４℃で保管する。

次いで、ＰＣＲ試料を１．３％のアガロースゲルで電気泳動する。予測するサイズのＤＮＡバンド（ＶＨドメインに対し約５０６塩基対、およびＶＬドメインに対し３４４塩基対）を、ゲルから切り出し、当該分野で周知の方法を用いて精製し得る。精製ＰＣＲ産物を、ＰＣＲクローニングベクター（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡからのＴＡベクター）へ連結し得る。大腸菌のトランスフェクションおよび青色／白色の選別後、別個のクローン化ＰＣＲ産物を単離し得る。次いで、クローン化されたＰＣＲ産物を、当該分野で一般に公知の方法を用いて配列決定し得る。

ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むＰＣＲバンドもまた、全長Ｉｇ発現ベクターを生成するために使用し得る。ＶＨドメインおよびＶＬドメインを、重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４）または軽鎖（ヒトκもしくはヒトλ）定常領域のヌクレオチド配列を含有するベクターへクローン化することによって、適切な宿主細胞へトランスフェクトした場合、完全重鎖分子または完全軽鎖分子を、これらのベクターから発現し得る。さらに、クローン化した重鎖および軽鎖が、１つの細胞株内にて（１つのベクターまたは２つのベクターのいずれかから）双方発現する場合、それらは、細胞培養培地へ分泌される完全機能性抗体分子へと、組み立てられ得る。完全抗体分子をコードする発現ベクターを生成するために、ＶＨおよびＶＬ抗体ドメインをコードするポリヌクレオチドを用いる方法は、当該分野内で周知である。

ＨＡサイトカインまたはＨＡ増殖因子融合タンパク質（例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦａ、ＢＤＮＦｂおよびＢＤＮＦｃ）の調製
着目したサイトカインまたは増殖因子、例えば、ＮＧＦのｃＤＮＡを、ｃＤＮＡライブラリーから、ＲＴ−ＰＣＲによって、および一連の重複合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲによって（標準的方法を使用する全て）を含む種々の手段によって、単離し得る。これら全てのタンパク質についてのヌクレオチド配列は、公知であり、かつ利用可能である。ｃＤＮＡを、５´末端および３´末端において改変して、制限部位を生成することによって、オリゴヌクレオチドリンカーを使用して、ｃＤＮＡを、ＨＡのｃＤＮＡをクローニングするためのベクター中にクローニングすることができる。このことは、ＨＡ配列のＮ末端またはＣ末端において、スペーサー配列を用いて、または用いることなく、なし得る。ＩＦＮα（または他のインタ。このことは、ＨＡ配列のＮ末端またはＣ末端において、スペーサー配列を用いて、または用いることなく、なし得る。ＮＧＦ（または他のサイトカイン）ｃＤＮＡを、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローニングする。次に、このようなベクターから、完全な発現カセットを切りだし、そして、プラスミドｐＳＡＣ３５中に挿入して、酵母中でのアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から収集して、精製し、その生物学的活性について、試験し得る。哺乳動物細胞株における発現のために、使用する発現カセットが哺乳動物プロモーター、リーダー配列およびターミネーターを使用する以外は、同様の手順を適用する（実施例１を参照）。次に、この発現カセットを切りだし、そして、哺乳動物細胞株のトランスフェクションに適切なプラスミド中に挿入する。

ＨＡ−ＩＦＮ融合タンパク質（例えば、ＩＦＮα）の調製
ＩＦＮα等の着目インターフェロンのｃＤＮＡを、全て標準的な方法を用いる、ｃＤＮＡライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲによるものを含むが、これらに限定されない、種々の手段によって、単離し得る。インターフェロン、例えば、ＩＦＮαのヌクレオチド配列は、例えば、米国特許第５，３２６，８５９号および第４，５８８，５８５号において、および欧州特許第３２，１３４号において、ならびにＧｅｎＢａｎｋのような公のデータべースにおいて、公知であり、かつ利用可能である。ｃＤＮＡを、５´末端および３´末端において改変して、制限部位を生成することによって、オリゴヌクレオチドリンカーを使用して、ｃＤＮＡを、ＨＡのｃＤＮＡをクローニングするためのベクター中にクローニングすることができる。このことは、ＨＡ配列のＮ末端またはＣ末端において、スペーサー配列を用いて、または用いることなく、なし得る。ＩＦＮα（または他のインターフェロン）ｃＤＮＡを、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローニングし、次いで、完全な発現カセットを切りだし、そして、プラスミドｐＳＡＣ３５中に挿入して、酵母中でのアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から収集して、精製し、その生物学的活性について、試験し得る。哺乳動物細胞株における発現のために、使用する発現カセットが哺乳動物プロモーター、リーダー配列およびターミネーターを使用する以外は、同様の手順を適用する（実施例１を参照）。次に、この発現カセットを切りだし、そして、哺乳動物細胞株のトランスフェクションに適切なプラスミド中に挿入する。

バイアルからの最大のタンパク質回収
本発明のアルブミン融合タンパク質は、低濃度で包装された場合であっても、高度に安定である。加えて、低タンパク質濃度にも関わらず、水溶液がバイアルの壁に対する結合を最小限にするための他のタンパク質を含まない場合であっても、良好な融合タンパク質の回収が、観察される。バイアルに収容されたＨＡ−ＩＦＮ溶液の回収をストックしておいた溶液と比較した。６または３０μｇ／ｍｌのＨＡ−ＩＦＮ溶液を、バイアル中に入れて、４℃で保存した。４８から７２時間後、最初の１０ｎｇの試料に相当する容量を、取り出し、そしてＩＦＮサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。推定された値を、高濃度ストック溶液の容量と比較した。示されるように、これらバイアルにおいて、試料は、実質的に損失せず、バイアルの壁に対する試料の損失を防ぐために、外来の物質、例えば、アルブミンを添加する必要がないことが示された。

体内における、ＨＡ−α−ＩＦＮ融合物の安定性およびバイオアベイラビリティ
体内における、ＨＡ−α−ＩＦＮ融合分子の安定性およびバイオアベイラビリティを判定するために、（酵母より）精製された融合分子を、サルに投与した。ＨＡ−α−ＩＦＮ融合物から処方された薬学的組成物は、延長された血清半減期およびバイオアベイラビリティを、説明し得る。故に、薬学的組成物を、天然のα−インターフェロン分子と比較して、より低い投薬量のα−インターフェロン活性を含むように、処方し得る。
ＨＡ−α−ＩＦＮ融合物を含む薬学的組成物を使用して、α−ＩＦＮの投与によって変調され得る任意の疾患または疾患状態を有する患者における疾患を、処置または予防し得る。そのような疾患としては、毛様細胞白血病、カポジ肉腫、生殖器および肛門のいぼ、慢性Ｂ型肝炎、慢性非Ａ非Ｂ型肝炎、特にＣ型肝炎、Ｄ型肝炎、慢性骨髄性白血病、腎臓細胞癌腫、膀胱癌腫、卵巣癌腫および頚部癌腫、皮膚癌、再発性の呼吸器乳頭腫症、非ホジキンＴ細胞リンパ腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ、多発性硬化症、グリア芽細胞腫、等を含むが、これらに限定されない（ＡＨＦＳＤｒｕｇＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、１９９７のインターフェロンαを参照）。

故に、本発明は、ヒトへの投与のための適切な投薬量を含む、ＨＡ−α−ＩＦＮ融合タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド処方物を含む。本発明はまた、そのような処置を必要とする患者を処置する方法を含む。そのような方法は、少なくとも１つのＨＡ−α−ＩＦＮ融合タンパク質、ポリペプチド、ペプチドを含む薬学的組成物を投与する工程を、少なくとも包含する。

二機能性ＨＡ−α−ＩＦＮ融合物
ＨＡ−α−ＩＦＮ発現ベクターを改変して、二機能性ＨＡ−α−ＩＦＮ融合タンパク質の発現のための挿入物を含むことができる。例えば、着目の第２のタンパク質のｃＤＮＡを、二重の終止コドンを除去するか、またはコード配列の下流に移動させた後に、「ｒＨＡ−ＩＦＮ」配列の下流にフレームを合わせて、挿入し得る。
二機能性ＨＡ−α−ＩＦＮ融合タンパク質の１つのバリエーションにおいて、Ｂリンパ球刺激タンパク質に対する抗体またはフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号４４５５１３９）、またはポリペプチドを、融合分子のＨＡ成分の１つの末端に融合し得る。この二機能性タンパク質は、融合物のα−ＩＦＮ成分によって生じる任意の免疫応答を調整するために、有用である。

ＨＡ−単鎖抗体融合タンパク質の調製
ファージライブラリーからの選択、抗体のｃＤＮＡをクローニングし、隣接する定常領域をプライマーとして使用して可変領域をクローニングすることによる特異的抗体の可変領域のクローニング、または任意の特異的抗体の可変領域に対応するオリゴヌクレオチドの合成を含むが、これらに限定されない、いくつかの方法によって、単鎖抗体を産出する。ｃＤＮＡを、５´末端および３´末端において改変して、制限部位を生成することによって、オリゴヌクレオチドリンカーを使用して、ＨＡのｃＤＮＡをクローニングするためのベクター中にｃＤＮＡをクローニングすることができる。このことは、Ｎ末端またはＣ末端において、スペーサー配列を用いて、または用いることなく、なし得る。細胞のｃＤＮＡを、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローニングし、次いで、完全な発現カセットを切りだし、そして、プラスミドｐＳＡＣ３５中に挿入して、酵母中でのアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。
本発明の融合タンパク質において、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌを、以下の手段の１つ、またはその組み合わせによって、連結し得る。ＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端との間のペプチドリンカー、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌが分泌の際に切断され、次に自己会合する、Ｖ_ＨとＶ_Ｌとの間のＫｅｘ２ｐプロテアーゼ切断部位、ならびに、ＶＨとＶＬとの間でジスルフィド結合を形成し、お互いに連結し得る位置にある、システイン残基。代替的なオプションは、Ｖ_ＨをＨＡまたはＨＡドメインフラグメントのＮ末端に配置し、そしてＶ_ＬをＨＡまたはＨＡドメインフラグメントのＣ末端に配置することである。

次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から収集して、精製し、その活性について、試験し得る。哺乳動物細胞株における発現のために、使用する発現カセットが哺乳動物プロモーター、リーダー配列およびターミネーターを使用する以外は、同様の手順を適用する（実施例１を参照）。次に、この発現カセットを切りだし、そして、哺乳動物細胞株のトランスフェクションに適切なプラスミド中に挿入する。この様式において産生された抗体を、培地から精製して、標準的な免疫化学的方法を用いて、抗原との結合について試験し得る。

ＨＡ融合タンパク質（例えば、ＨＡ抗ウイルス阻害剤、ＨＡ抗菌性阻害剤、ＨＡ酵素阻害剤およびＨＡ抗アレルギータンパク質）としての阻害因子およびペプチドの調製
着目したペプチド、例えば、抗菌性ペプチドのｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーから、種々の手段（一連の重複合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ（これら全ては標準的方法を使用する）を含むが、排他的ではない）によって単離され得る。ｃＤＮＡは、５´末端および３´末端で変更されて、制限部位を生成することによって、オリゴヌクレオチドリンカーを使用して、ｃＤＮＡを、ＨＡのｃＤＮＡをクローニングするためのベクター中にクローニングすることができる。このことは、Ｎ末端またはＣ末端において、スペーサー配列を用いて、または用いることなく、なし得る。ペプチドｃＤＮＡは、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡまたはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクターにクローニングされ、次いで、このベクターから、完全発現カセットが切り出され、そしてプラスミドｐＳＡＣ３５に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質は、次いで、収集され、そして培地から精製され、そしてその生物学的活性について試験され得る。哺乳動物細胞株における発現について、使用される発現カセットが哺乳動物プロモーター、リーダー配列およびターミネーターを使用する以外は、類似の手順が採用される（実施例１を参照）。次いで、この発現カセットが、切り出され、そして哺乳動物細胞株のトランスフェクションに適したプラスミドに挿入される。

標的化されたＨＡ融合タンパク質の調製
着目タンパク質のｃＤＮＡを、標準的な分子生物学的方法を用いて、ｃＤＮＡライブラリーから単離し得るか、または、いくつかの重複するオリゴヌクレオチドを用いて合成し得る。適切なヌクレオチドを、ｃＤＮＡ中で操作して、便宜的制限部位形成し、そしてタンパク質ｃＤＮＡの、アルブミンｃＤＮＡへの付着を可能にし得る。また、標的化タンパク質またはペプチドのｃＤＮＡ（例えば、単鎖抗体、あるいはタンパク質を細胞内に向け得る核局在化シグナルのようなペプチド）を、アルブミンの他の末端に融合し得る。着目タンパク質および標的化ペプチドを、アルブミンｃＤＮＡとの融合を可能にするベクター（例えば、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡ）中にクローニングする。この様式において、アルブミンのＮ末端およびＣ末端の両方を、他のタンパク質と融合する。次に、融合したｃＤＮＡを、ｐＰＰＣ０００５から切り出し、そしてｐＳＡＣ３５のようなプラスミド中に挿入して、酵母中でのアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。上記の手順の全ては、分子生物学の標準的方法を用いて行うことができる。酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を、培地から回収および精製して、適切な生化学的試験および生物学的試験を用いて、その生物学的活性および標的化活性について試験する。

構築物ＩＤ２２４９（ＩＦＮａ２−ＨＳＡ）の生成
構築物ＩＤ２２４９（ｐＳＡＣ３５：ＩＦＮａ２．ＨＳＡ）は、ＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、ＨＳＡキメラリーダー配列、続いて、酵母Ｓ．セレビシエ発現ベクターｐＳＡＣ３５におけるＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合された、ＩＦＮａ２タンパク質の成熟形態、すなわち、Ｃ１−Ｅ１６５を有する。

ＩＦＮａ２ｃＤＮＡのクローニング
ＩＦＮａ２をコードするポリヌクレオチドを、後述のプライマーＩＦＮａ２−１およびＩＦＮａ２−２を使用して、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅体を、ＳａｌＩ／ＣｌａＩで切断し、ＸｈｏＩ／ＣｌａＩで切断したｐＳｃＣＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ番号２２４９は、ＨＳＡのキメラリーダー配列、ＩＦＮａ２の成熟形態、続いて、成熟ＨＳＡタンパク質を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
ＩＦＮａ２、ＩＦＮａ２−１、およびＩＦＮａ２−２の成熟形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために好適な２つのオリゴヌクレオチドを合成した。
ＩＦＮａ２−１：５’−ＣＧＣＧＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＡＡＣＣＣＡＣＡ−３’（配列番号３４８）
ＩＦＮａ２−２：５’−ＧＣＧＣＧＣＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号３４９）

ＩＦＮａ２−１プライマーは、ＳａｌＩクローニング部位（下線で図示）、キメラＨＳＡリーダー配列の最後の３個のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド、ならびにＩＦＮａ２の成熟形態の最初の７個のアミノ酸残基をコードする２２個のヌクレオチド（太字で図示）を組み込む。ＩＦＮａ２−２において、ＣｌａＩ部位（下線で図示）およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体であり、そして最後の２２個のヌクレオチド（太字で図示）は、ＩＦＮａ２の最後の７個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である（実施例２を参照）。ＩＦＮａ２−ＨＳＡのＰＣＲ増幅体を、これらのプライマーを使用して生成し、精製し、ＳａｌＩおよびＣｌａＩ制限酵素で消化し、そしてｐＳｃＣＨＳＡベクターのＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位にクローニングした。配列を確認後、このＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質をコードする発現カセットを、ＮｏｔＩ消化ｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
さらに、アミノ酸配列決定による、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の分析は、予測されたＩＦＮａ２配列の存在を確認し得る（以下参照）。

異なるリーダー配列を使用する他のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を、当該分野において公知の方法によって構築してきた（実施例２を参照）。種々のリーダー配列の例としては、インベルターゼ「ＩＮＶ」（構築物２３４３および２４１０）および交配接合α因子「ＭＡＦ」（構築物２３６６）を含むが、これらに限定されない。これらのＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を以前に記載したようなｐＣ４（構築物２３８２）およびｐＥＥ１２．１のような哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし得る（実施例５を参照）。ＨＳＡにＣ末端を融合させた治療部分を有するＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質をまた構築し得る（構築物２３８１）。
本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、ＩＦＮａ２の成熟形態、すなわち、Ｃｙｓ−１からＧｌｕ−１６５のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態、すなわち、Ａｓｐ−２５からＬｅｕ−６０９を含み得る。本発明の一実施形態では、本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路に初期の融合ポリペプチドを指示するシグナル配列をさらに含む。さらなる実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを除去し、そして成熟ＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質が培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、当該分野で公知の異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン、インスリン様成長因子結合タンパク質４、ＨＳＡリーダー配列変異体（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）を含むが、これらに限定されない）または他の異種シグナル配列を含み得る。ある実施形態では、本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、天然のＩＦＮａ２を含む。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。フラグメントおよび／または変異体を含む、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがまた、本発明によって含まれる。

構築物ＩＤ２２４９の発現および精製
酵母Ｓ．セレビシエにおける発現
構築物２２４９の酵母Ｓ．セレビシエ株ＢＸＰ１０への形質転換を、当該分野で公知の方法によって実行した（実施例３を参照）。細胞を７２時間の増殖後、定常期に回収し得る。上清を、細胞を３０００ｇで１０分間不純物除去することで回収する。発現レベルを、抗ＨＳＡ血清（ＫｅｎｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、またはこの１次抗体として免疫ブロット検出によって試験し得る。およそ８８．５ｋＤａの分子量のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を回収し得る。

酵母Ｓ．セレビシエ細胞上清からの精製
酵母Ｓ．セレビシエ細胞において構築物ＩＤ番号２２４９から発現したＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、Ｄｙａｘペプチドアフィニティーカラム上で小スケールで（実施例４を参照）、または以下の５ステップ：ダイアフィルトレーション、ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂｕｔｙｌ６５０Ｓカラムを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラムまたはＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーを使用する陽イオン交換クロマトグラフィー、およびＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｍａｎｃｅカラムクロマトグラフィーを使用する高性能クロマトグラフィーによる大スケール（実施例４を参照）のいずれかで精製し得る。ＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を、１００〜２５０ｍＭのＮａＣｌでＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラムから、１５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌでＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラムから、および５〜７．５ｍＳ／ｃｍでＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムから溶出し得る。Ｎ末端の配列決定は、ＩＦＮａ２の成熟形態に対応する配列ＣＤＬＰＱ（配列番号９８）を生じるはずである。

ＩＦＮａ２の活性は、体外ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイを使用してアッセイし得る
方法
構築物ＩＤ番号２２４９によってコードされるＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を、実施例７６において上述したようなＩＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイにおいて、活性について試験し得る。簡単に言えば、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞株に対してＩＳＲＥシグナル伝達を指向する能力について、馴化酵母上清を１：１０００の希釈で試験した。ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞を、処理１日前に、３×１０^４細胞／ウェルで９６ウェルのポリ−Ｄ−リジンでコートされたプレート中にプレーティングした。次いで、ＳＥＡＰＲｅｐｏｒｔｅｒＧｅｎｅＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＡｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１７７９８４２）における使用のために４０μＬを除去する前に、レポーター細胞を１８時間または２４時間インキュベートした。組換えヒトインターフェロンβ「ｒｈＩＦＮｂ」（Ｂｉｏｇｅｎ）を、陽性対照として使用した。

結果
ＩＦＮａ２−ＨＳＡの精製された調製物は、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイにおいて、１０^−１〜１０^１ｎｇ／ｍＬ（図４参照）または１０^−１０〜１０^−８ｎｇ／ｍＬ（図５参照）の範囲にある濃度にわたって比較的直線的な増加を証明した。

構築物ＩＤ２２４９によってコードされるインターフェロンα融合物によるＯＡＳの体内誘導
方法
ＯＡＳ酵素（２´−５´−オリゴアデニレートシンテターゼ）を、抗ウイルス感染に応じてインターフェロンによって、転写レベルで活性化する。インターフェロン構築物の効果を、治療サルから血液試料を回収すること、およびこれらの試料を２つのＯＡＳｍＲＮＡ（ｐ４１およびｐ６９）の転写活性について分析することによって測定し得る。０．５ｍＬ容量の全血を、１群あたり４頭の動物から７つの異なる時間点（１匹の動物あたり、０日目、１日目、２日目、４日目、８日目、１０日目、および１４日目）で回収した。種々の群は、溶媒対照（１日目に３０μｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＩＦＮの静脈注射、１日目に３０μｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＩＦＮの皮下注射、１日目に３００μｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＩＦＮの皮下注射）、ならびに陽性対照として、１日目、３日目、および５日目に４０μｇ／ｋｇのインターフェロンα（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）の皮下注射を含む。ｐ４１およびｐ６９のｍＲＮＡ転写物のレベルを、ｐ４１−ＯＡＳおよびｐ６９−ＯＡＳに特異的なプローブを使用するリアルタイム定量ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）によって判定した。ＯＡＳのｍＲＮＡレベルを、１８ＳリボソームＲＮＡ内因性制御と比較して定量した。構築物２２４９によってコードされるアルブミン融合タンパク質を類似の実験に供し得る。
結果
ＩＦＮａ治療サルと対照的に、ｐ４１およびｐ６９ＯＡＳ両方に対するｍＲＮＡ転写レベルの著しい上昇が、ＨＳＡ−インターフェロン治療サルにおいて観察された（ｐ４１データは、図６参照）。その効果は、ほぼ１０日間続いた。

ＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質の適応症
ＩＦＮαアルブミン融合タンパク質（構築物２２４９、２３４３、２４１０、２３６６、２３８２、および２３８１によってコードされるものを含むが、これらに限定されない）を使用して、多発性硬化症を治療、防止、改善、および／または検出することが可能である。他の適応症として、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）および他のコロナウイルス感染症を含む、ウイルス感染症；エボラウイルスおよびマールブルグウイルスを含むが、これらに限定されない、フィロウイルス；ピチンデウイルス、ラッサウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルスを含むが、これらに限定されない、アレナウイルス；リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）；プンタトロウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、砂バエ熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラクロスウイルス、およびハンタウイルスを含むが、これらに限定されない、ブンヤウイルス；黄熱病、バンジウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎、オムスク出血熱、およびキャサヌール森林病ウイルスを含むが、これらに限定されない、フラビウイルス；ベネズエラ、東部、および西部ウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、ならびに風疹ウイルスを含むが、これらに限定されない、トガウイルス；ワクシニア、牛痘、痘瘡、およびサル痘を含むが、これらに限定されない、オルソポックスウイルス；ヘルペスウイルスウイルス；インフルエンザＡ型・Ｂ型；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）；パラインフルエンザ；麻疹；ライノウイルス；アデノウイルス；セムリキ森林熱ウイルス；ウイルス性出血熱；ラブドウイルス；ニパウイルスおよびヘンドラウイルスを含むが、これらに限定されない、パラミクソウイルス；ならびに最優先病原体として、米国ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（疾病対策予防センター）によって特定された他のウイルス性病原体（つまり、ＣａｔｅｇｏｒｙＡ、Ｂ、およびＣ病原体；例えば、Ｍｏｒａｎ，Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．２００２；２０（２）：３１１−３０ａｎｄＤａｒｌｉｎｇｅｔａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．ＮｏｒｔｈＡｍ．２００２；２０（２）：２７３−３０９を参照）を含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、ＩＦＮα−アルブミン融合タンパク質またはＩＦＮ混合融合タンパク質は、ＣＣＲ５アンタゴニストと併用して、さらに、例えば、治療未投与ならびに治療経験成人および小児患者におけるＨＩＶ−１感染、ＨＣＶ、またはＨＩＶ−１およびＨＣＶ重感染の治療のための薬剤の調製用ＨＡＡＲＴ等、単独または抗ＨＩＶ薬物療法と併用して、リバビリン、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ペンタフシドのうちの少なくとも１つと組み合わせて投与される。

遺伝子１型インターフェロン未投与慢性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）患者における、リバビリンとの併用によるＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの抗ウイルス活性
背景：
遺伝子１型インターフェロン未投与（ＩＦＮ未投与）ＨＣＶ患者のための従来の治療は、４８週間、リバビリン（ＲＢＶ）と併用してインターフェロンαを利用する。しかしながら、この治療は、重大な実際的制限を有する。現在のインターフェロン療法の周知の副作用によって、患者の生活の質は、インターフェロンの各投与後、実質的に低下する。現在のプロトコルは、少なくとも毎週の投与を必要として、長期に及ぶ生活の質の低下をもたらす。その結果、多数の患者が治療を中断し、いくつかの研究では、５０％を超える中断率が報告されている。さらに、現在のインターフェロン療法は、大幅な率の著しい血液学的減少も有し、ＲＢＶ用量の減量を必要し、またはより著しい場合、血液学的値が正常化するまで、インターフェロン治療レジメンの一時的中止を必要とし得る。したがって、ＩＦＮ未投与患者における、遺伝子１型ＨＣＶの治療のための改良された治療プロトコルの明確な必要性が存在する。

論理的根拠：
ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂは、遺伝子的に、そのＣ末端の成熟アルブミンを成熟インターフェロンα−２ｂのＮ末端に融合することによって生成された。ＲＢＶと併用してＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる治療の安全性および有効性は、遺伝子１型ＩＦＮ未投与ＨＣＶヒト患者において、実薬対照研究で評価され、実薬対照として、ＲＢＶと併用してＰＥＧ−ＩＦＮα−２ａ（ＰＥＧ−ＩＦＮ）による従来の治療と比較される。

遺伝子１型ＩＦＮ未投与であったヒトＨＣＶ患者が、リバビリン（ＲＢＶ）と併用して、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂまたは実薬対照であるＰＥＧ−ＩＦＮのいずれかによって治療された。より具体的には、４５８名のヒト対象が、（ａ）ＰＥＧ−ＩＦＮを１８０μｇ１週間に１回（Ｑ１ｗ）投与、（ｂ）ＨＳＡ−ＩＦＮα２Ｂを９００μｇ２週間毎に１回（Ｑ２ｗ）投与、（ｃ）ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂを１２００μｇＱ２ｗ投与、または（ｄ）ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂを１２００μｇ４週間毎に１回（Ｑ４ｗ）投与）の４つの皮下（ｓｃ）治療群に無作為化された。
また、各治療群における各対象は、体重に基づいて、１０００−１２００ｍｇ／日ＲＢＶを受けた。階層化の基準として、肥満度指数（ＢＭＩ）（＜２５ｋｇ／ｍ^２または≧２５ｋｇ／ｍ^２）およびＨＣＶＲＮＡ滴定量（＜８００，０００ＩＵ／ｍｌまたは≧８００，０００ＩＵ／ｍｌ）を含んだ。
本治験の治療期間は、４８週間であって、２４週間の追跡を伴う。本治験の主要評価項目は、治療終了後の２４週間目に、検出不能ウイルス量（ＨＣＶＲＮＡ＜１０ＩＵ／ｍｌ）として定義される持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ）である。

ＨＣＶＲＮＡ滴定量は、４３ＩＵから６，９００万ＩＵ／ｍＬの感度範囲（定量化レベル（ＬＯＱ））と、１０ＩＵ／ｍＬの検出レベル（ＬＯＤ）を有するリアルタイムＰＣＲアッセイであるＱｕａｎｔａｓｕｒｅ（商標）（Ｌａｂｃｏｒｐ）を使用して測定された。アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）と、絶対好中球数（ＡＮＣ）、ヘモグロビン、および血小板数を含む血液学的影響は、当技術分野において既知の標準手技を使用して測定した。
包括解析（ＩＴＴ）患者は、患者が紛失データ点を有しているか、または本治験から脱落したかに関わらず、各治療群の全無作為化および治療された対象として定義される。改変包括解析（ＭＩＴＴ）患者は、本治験への登録日に基づいて、２４週目の訪問が考えられ得る患者として定義される。

結果および考察：
対象人口統計、抗ウイルス反応、および血液学的減少は、表７（予備的中間分析）および表１１（最終中間分析）に要約される。全体として、全４つの治療プロトコルは、優れた耐性を示し、有害事象によるグレード３−４の検査値または中断に関して、治療群間に有意差はなかった。

ＳＶＲの抗ウイルス応答予測因子
ＳＶＲの抗ウイルス応答予測因子は、第２段階勾配＞０．６ｌｏｇ／ｗｋ（第２の勾配）を伴う、治療１２週目の陰性ＨＣＶＲＮＡ滴定量（つまり、ＨＣＶＲＮＡ滴定量＜ＬＯＱを有する）として定義された。抗ウイルス応答曲線勾配の段階は、２つの活性を示す。第１段階は、反応の直接抗ウイルス活性を示す。第２段階は、治療された化合物によるＨＣＶ感染細胞の破壊を予測する。したがって、＞０．６ｌｏｇ／ｗｋ時の第２段階勾配の値は、ＳＶＲの優れた予測因子である（陽性予測値（ＰＰＶ）＞９０％）。
１２週目ＩＴＴにおけるＳＶＲの抗ウイルス応答予測因子は、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ２ｗ治療群において最大であって、７５／１１４名の対象または６５．８％（（最終中間分析）（７０／１１２または６２．５％（予備的中間分析）））と、ＰＥＧ−ＩＦＮ対照治療の４９％と比較して、８２／１１０名の対象または７４．５％（（最終中間分析）（７７／１０４または７４．０％（予備分析）））が、ＨＣＶＲＮＡ陰性レベル（つまり、ＬＯＱを下回るレベル（＜４３ＩＵ／ｍＬ））を有し、５８％が第２段階勾配＞０．６ｌｏｇ／ｗｋを示した。これらのデータは、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ２ｗ治療プロトコルが、１２週目に、少なくとも、ＰＥＧ−ＩＦＮによる従来の治療と同程度である抗ウイルス活性を有することを示す。ＰＥＧ−ＩＦＮ対照治療と比較して、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ２ｗ治療プロトコルにおける１２週目に、ＲＮＡ陰性（すなわち、ＬＯＱを下回るＨＣＶＲＮＡ滴定量レベルを有する患者数）は、約９％（最終中間分析）および１２％（予備的中間分析）上回り、第２段階勾配は、約９％（最終および予備的中間分析の両方に対し）上回るため、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ２ｗ治療プロトコルは、従来のＰＥＧ−ＩＦＮ治療よりも優れた有効性をもたらし得る可能性がある。ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ９００μｇＱ２ｗおよびＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ４ｗ治療群において、ＨＣＶＲＮＡ陰性を有する患者数は、ＰＥＧ−ＩＦＮによる従来の治療と同様であった。

２０および２４週目におけるＳＶＲの抗ウイルス応答予測因子は、検出レベル（ＬＯＤ）を下回るＨＣＶＲＮＡ滴定量を有する対象として示される（すなわち、＜１０ＩＵ／ｍＬ）。ＰＥＧ−ＩＦＮ対照治療における７７／１１４または６７．５％（最終中間分析）と比較して、２０週目におけるＳＶＲの抗ウイルス応答予測因子は、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ２ｗ治療群において最大であって、８２／１１０名の対象または７４．５％（最終中間分析）が、検出不能ＨＣＶＲＮＡレベルを有していた（すなわち、＜１０ＩＵ／ｍＬ）。同様に、２４週目におけるＳＶＲの抗ウイルス応答予測因子は、ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ２ｗ治療群において最大であって、６４／９１または７０．３％（最終中間分析）は、検出不能ＨＣＶＲＮＡレベルを有している一方、ＰＥＧ−ＩＦＮ対照治療は、検出不能ＨＣＶＲＮＡレベルと共に、５７／９０または６３．３％を有していた。２０および２４週目の両方のデータは、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ２ｗ治療プロトコルが、改良された投薬スケジュールと共に、少なくとも、ＰＥＧ−ＩＦＮによる従来の治療と同程度の抗ウイルス活性および安全性を有することを示す。

ＡＬＴレベルの正常化
患者の肝機能の一般的測定は、アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルである。ＨＣＶ感染患者の特徴の１つは、肝障害を示す高血清ＡＬＴレベルである。したがって、ＡＬＴレベルの正常化は、肝機能の改善に対応し、治療に応答するための有利な予後を有する。全治療プロトコルが、ＡＬＴレベルを正常化するいくつかの能力を示したが、最も劇的影響は、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ４ｗ治療プロトコルにおいて観察され、ＰＥＧ−ＩＦＮによる従来の治療と比較して、２倍を上回る患者（最終および予備的中間分析）が正常化されたＡＬＴレベルを達成した。したがって、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂを１２００μｇＱ４ｗで投与することは、遺伝子１型ＩＦＮ未投与ＨＣＶ患者における肝機能を正常化する際に、従来のＰＥＧ−ＩＦＮ治療よりも、意外にも、より有効である。

血液学的影響
併用治療プロトコルにおいて、コンプライアンスと、ＩＦＮおよびＲＢＶの総量を保証することは、ＳＶＲ率を最大化するために重要である。
血液学的減少は、ＩＦＮおよびＲＢＶによる併用治療の間に一般的である。ＲＢＶ誘発性溶血によるヘモグロビン（Ｈｂ）の減少は、ＲＢＶにおける用量の減量を必要とする。特に、Ｈｂ＜１２ｇ／ｄＬは、１０００−１２００ｍｇ／日から８００ｍｇ／日のＲＢＶの減量を必要とする。ＲＢＶ用量は、ＨＣＶ再発を防止するための重要である。ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ４Ｗ治療プロトコルは、意外にも、Ｈｂ＜１２ｇ／ｄＬの有意に少ない減量を有する（ＰＥＧ−ＩＦＮに対し５２％対６５％（最終中間分析）、ＰＥＧ−ＩＦＮに対し４９．１対６４％（予備的中間分析））。これは、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ４Ｗ治療プロトコルによるより低い再発率によって、改善されたＳＶＲを可能にすると解釈され得る。

ＡＮＣ＜７５０／ｍｍ^３の減少は、併用治療のＩＦＮ成分を減量することを必要とする。意外にも、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ４Ｗ治療プロトコルは、ＰＥＧ−ＩＦＮと比較して、有意に少ないＡＮＣ＜７５０／ｍｍ^３を有した（それぞれ、６％対２０．２％（最終中間分析）、４．３％対１７．５％（予備的中間分析））。これは、再び、ＳＶＥ率が高い程、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ４Ｗ治療プロトコルによって必要とされる用量の減量が少なくなると解釈され得る。
１２週目に、同様の血液学的減少が、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂＱ２ｗおよびＰＥＧ−ＩＦＮ治療群にわたって発生した。しかしながら、意外にも、１２週目に、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ４ｗ治療群において観察された血液学的減少は、ＰＥＧ−ＩＦＮ治療群において観察されたものよりも約７５％少なかった。これらの結果は、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂＱ４ｗが、従来のＰＥＧ−ＩＦＮ治療と比較して、優れた安全性プロフィールと、改善された再発率を提供し得ることを示す。

治療終了後１２週目の抗ウイルス応答
ＩＴＴ分析による、治療完了後の１２週目における持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ１２）率は、ＰＥＧ−ＩＦＮの５４．４％と比較して、９００Ｑ２ｗに対し５９．３％、１２００Ｑ２ｗに対し５５．５％、および１２００Ｑ４ｗに対し５２．６％であった。ＩＦＮおよびＲＢＶ療法に対し≧８０％追随患者では、１２００Ｑ４ｗの６７．５％およびＰＥＧ−ＩＦＮの６３．０％と比較して、ＳＶＲ１２率は、９００Ｑ２ｗおよび１２００Ｑ２ｗに対し最大であった（それぞれ、７３．８％および７２．０％）。注目すべきとして、より重い患者（≧７５ｋｇ）では、ａｌｂ−ＩＦＮのＳＶＲ１２率は維持された一方、ＰＥＧ−ＩＦＮに対しては減少した。また、療法に対し≧８０％追随対象では、ＰＥＧ−ＩＦＮ（２９．７％）ｐ＝０．０２６１と比較して、再発率は、全ａｌｂ−ＩＦＮ選択肢に対し低下し、９００Ｑ２ｗ（１３．０％）に対しもっとも著しく低下した。全体として、療法の最初の１２週間にかけての抗ウイルス応答プロフィールは、ＳＶＲ１２に対しての予測であって、１２００Ｑ４ｗ選択肢に対する反応プロフィールは、最大陽性予測値を有していた。有害事象による中断は、９００Ｑ２ｗにおける９．３％、１２００Ｑ４ｗにおける１２．１％、および１２００Ｑ２ｗ選択肢における１９．１％と比較して、ＰＥＧ−ＩＦＮ選択肢では６．１％であった。血液学的減少は、ａｌｂ−ＩＦＮ１２００Ｑ４ｗ選択肢において最低であって、他の選択肢にわたって同程度であった。ＳＦ−３６によって測定された生活の質は、９００Ｑ２ｗ選択肢に対し最も有利であった。

治療終了後２４週目の抗ウイルス応答
表９に示されるように、ＩＴＴ分析に基づいて、治療後２４週目に、持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ）（ＨＣＶＲＮＡ＜１０ＩＵ／ｍｌ）を達成した患者の割合は、ＰＥＧ−ＩＦＮに対する５７．９％と比較して、９００Ｑ２ｗに対し５８．５％、１２００Ｑ２ｗに対し５５．５％、および１２００Ｑ４ｗに対し５０．９％であった。全体として、治療後２４週目に全治療追随患者間では、ＳＶＲ率は、ＰＥＧ−ＩＦＮに対する６６．７％と比較して、９００Ｑ２ｗに対し７２．３％、１２００Ｑ２ｗに対し７０．６％、および１２００Ｑ４ｗに対し６２％であった。意外にも、少なくとも７５ｋｇの体重の治療追随患者間では、ＳＶＲ率は、ａｌｂ−ＩＦＮ選択肢に対し維持され、ＰＥＧ−ＩＦＮに対し低下した。このサブグループでは、ＳＶＲ率は、ＰＥＧ−ＩＦＮに対する５３．３％と比較して、９００Ｑ２ｗでは７４．２％、１２００Ｑ２ｗでは６７．９％、および１２００Ｑ４ｗでは６１．０％であった。したがって、少なくとも７５ｋｇの体重の患者において、９００Ｑ２ｗ、１２００Ｑ２ｗ、および１２００Ｑ４ｗでのＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの投与は、ＰＥＧ−ＩＦＮ従来の治療を受けた患者が、投薬スケジュールによって、毎月平均２から３の追加用量を与えられたにも関わらず、従来のＰＥＧ−ＩＦＮ治療と比較して、より高い有効性をもたらす。

生活の質の分析
ＳＦ３６ＨｅｌａｔｈＳｕｒｖｅｙ（ＳＦ−３６健康調査）に基づくと、アルブフェロン９００Ｑ２ｗ治療群の患者は、ＰＥＧ−ＩＦＮ治療群の患者と比較して、４８週治療群全体の全時点において、身体的健康の構成要素および精神的健康の構成要素の両方のＳＰ−３６集約尺度によって測定される、健康関連の生活の質の低下が少ないことが報告された。加えて、アルブフェロン９００Ｑ２ｗ治療群では、それぞれ１２および２４週目のＰＥＧ−ＩＦＮに対する１９．２％および２２．４％と比較して、わずか３．０％および５．８％の勤労患者が、１２および２４週目の訪問の前月に７日以上欠勤したことが報告された。週間治療１２および２４週目には、９００Ｑ２ｗ治療群が、ＰＥＧ−ＩＦＮと比較して、全１０のＳＦ−３６領域において優れていた。

結論
１２週目には、遺伝子１型ＩＦＮ未投与ＨＣＶにおける最大抗ウイルス活性が、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ２ｗ治療群において観察された。また、血液学的減少に対する同様の影響が、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ２ｗおよびＰＥＧ−ＩＦＮ治療群において観察された。さらに、２０および２４週目には、最大抗ウイルス活性も、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ２ｗ治療群において観察された。同程度の抗ウイルス活性が、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ９００μｇＱ２ｗ治療群において、２０および２４週目に継続されていた。治療終了後２４週目には、遺伝子１型ＩＦＮ未投与ＨＣＶにおける最大有効性が、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ９００μｇＱ２ｗ治療群において観察された。故に、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ９００μｇＱ２ｗは、少なくとも、改良された投薬スケジュールを伴って、現在の標準治療であるＰＥＧ−ＩＦＮと同程度の有効性および安全性プロフィール、すなわち、患者にさらなる便宜性を提供し得ると解釈される。９００μｇＱ２ｗ投薬スケジュールは、より有益な生活の質の効果と、ＰＥＧ−ＩＦＮと同程度のＳＶＲ率を伴って、ＰＥＧ−ＩＦＮの注射回数を半分とする。加えて、１２００μｇＱ２ｗは、同程度の有効性および改良された投薬スケジュールと共に、少なくとも、現在の標準治療であるＰＥＧ−ＩＦＮと同程度の安全性プロフィール、すなわち、患者にさらなる便宜性を提供し得ると解釈される。

ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ４ｗプロトコルによる治療は、意外にも、ＰＥＧ−ＩＦＮ従来の治療を受ける対象が、投薬スケジュールによる３つの追加用量を受けたにも関わらず、１２週目に、従来のＰＥＧ−ＩＦＮ治療と比較して、同程度の有効性を示した。従来のＰＥＧ−ＩＦＮ治療と比較して、同程度の有効性のＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ４ｗは、２０および２４週目を通して継続した。また、肝機能を安定させ、血液学的要因の低下を劇的に減少させるための改良された能力が、１２週目に、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ４ｗ治療群において観察され、肝臓損傷と、用量の減量または一時的中止の発生率の低下と、おそらくは、これらの患者における治療後の再発の改善が示唆された。１２００μｇＱ４ｗでのＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる治療後２４週目には、半分を超える患者が持続性ウイルス学的著効を達成した。したがって、これらの結果は、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ４ｗによる治療が、改良された投薬スケジュール、肝機能を正常化するさらに優れた能力、および血液学的減少の低下の利点と共に、ＰＥＧ−ＩＦＮとの併用治療と同程度の有効性を提供し、患者に対するさらなるコンプライアンスと便宜性、およびより好適な治療後転帰をもたらし得ることを示唆する。要するに、ＨＣＶ治療の分野における最近の進歩を考慮すると、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂＱ４Ｗ治療プロトコルは、理想的な特質を有し（例えば、同等の有効性、より優れた忍容性、さらなるコンプライアンスをもたらすより優れた便宜性）、インターフェロン−抗ウイルス併用療法のための最適なインターフェロンの重要要素となるであろう。

有利には、９００Ｑ２ｗおよび１２００Ｑ２ｗＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ治療群では、少なくとも８０％治療に追随し、少なくとも７５ｋｇの体重の患者は、治療終了後２４週目に、ＰＥＧ−ＩＦＮと比較して、より優れたＳＶＲ率を達成した。優れたＳＶＲ率を達成する能力、ならびに体重の重い患者において治療を通して有効性を維持する能力は、体重７５ｋｇを超える患者が大部分を占める特定の国々（例えば、米国）では特に重要である。
まとめると、これらの結果は、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂおよびＲＢＶによる遺伝子１型ＩＦＮ未投与ＨＣＶ患者の併用治療が、改良された投薬スケジュールの利点と共に、少なくとも、従来のＰＥＧ−ＩＦＮおよびＲＢＶ併用治療による治療と同程度の有効性であることを示唆する。特に、これらの結果は、ＲＢＶと併用してＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる治療が、改良され、非常に有利な投薬スケジュールと共に、従来のＲＢＶとのＰＥＧ−ＩＦＮ併用治療と比較して、同様の安全性プロフィールと共により優れた有効性を有するか、より優れた安全性プロフィールと共に同様の有効性を有するか、またはより優れた有効性および安全性プロフィールを有するかのいずれかであり得ることを示唆する。

遺伝子１型インターフェロン未投与慢性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）患者における、２週間毎に１回または４週間毎に１回のリバビリンとの併用によるＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの投与は、治療の１２週間目の抗ウイルス応答と同程度であることを実証
背景
前述のように、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）の治療のための現在のインターフェロン療法は、インフルエンザ様症状、倦怠感、および鬱病を含むが、これらに限定されない重大な副作用を伴う。したがって、患者の生活の質は、インターフェロン療法の間、著しく低下する。現在の標準治療は、少なくとも毎週の投与を必要とするため、生活の質の低下期間は、相当な期間に及ぶ。さらに、毎週の投与要件は、患者に対する不便性として考えられている。頻繁な投薬スケジュールと、患者の生活の質の著しい低下によって、治療中断患者の著しい数につながっている。したがって、患者の便宜性および耐性を増大させることになる、ＩＦＮ未投与患者における遺伝子１型ＨＣＶの治療のための改良された治療プロトコルの明確な必要性が存在する。投薬レジメンの主要目的は、持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ）または治癒を達成するために、インターフェロン療法の期間、定量レベルを下回るＨＣＶＲＮＡレベルを達成し、それを維持することである。しかしながら、毎週の投与は、２週間おきの投与と比較して、患者に投与される薬物量が２倍となり、４週間おきの投与と比較して、患者に投与される薬物量は４倍となるため、そのような投薬スケジュールが、この目的を達成し得るかは疑わしい。

論理的根拠
治療４週目の早期ウイルス反応（ＲＶＲ）は、ペグインターフェロン（ＰＥＧ−ＩＦＮ）による治療を受けるＨＣＶ患者において、持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ）の強固な陽性予測因子である。ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂは、遺伝子的に、そのＣ末端の成熟アルブミンを成熟インターフェロンα−２ｂのＮ末端に融合することによって生成された。リバビリン（ＲＢＶ）と併用してＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる治療の安全性および有効性は、遺伝子１型ＩＦＮ未投与ＨＣＶヒト患者における実薬対照研究で評価され、実薬対照として、ＲＢＶと併用してＰＥＧ−ＩＦＮα−２ａ（ＰＥＧ−ＩＦＮ）による従来の治療と比較した。２週間（Ｑ２ｗ）おきまたは４週間（Ｑ４ｗ）おきに投与されたＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる早期抗ウイルス応答は、ＰＥＧ−ＩＦＮと比較し、低頻度の投薬スケジュールでのＲＢＶと併用してＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる治療が、ＲＮＡ陰性、例えば、ＨＣＶＲＮＡ＜ＬＯＱを維持可能であるかを判定した。

方法
遺伝子１型ＩＦＮ未投与であったヒトＨＣＶ患者が、実施例７３に説明されるように治療された。ＲＶＲ（治療４週目時点で、ＨＣＶＲＮＡ＜ＬＯＱ）を達成した患者における、治療１２週目の早期ウイルス反応の分析が（ａ≧２ｌｏｇＨＣＶＲＮＡ減少として定義されるＥＶＲ、またはＨＣＶＲＮＡ＜ＬＯＱとして定義されるＲＮＡ陰性）、表１０に示される。

結果および考察
２週目治験訪問は、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの２回目の投与またはＰＥＧ−ＩＦＮの３回目の投与を受ける前に行われる。９００μｇＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂＱ２ｗを受け、２週目にａ≧２ｌｏｇＨＣＶＲＮＡを達成した患者の割合は、ＰＥＧ−ＩＦＮを受けた患者の割合と同様であった。２週目にａ≧２ｌｏｇＨＣＶＲＮＡ減少を達成した患者の割合は、患者が２週間おきまたは４週間おきに投与されたかに関わらず、両方の１２００μｇ治療群において、ＰＥＧ−ＩＦＮよりも高かった（Ｐ＝０．０３）。ＨＣＶＲＮＡのａ≧２ｌｏｇ減少を有していた患者の大部分は、１２週目に、ＲＮＡ陰性を達成した。加えて、１２週目にＲＮＡ陰性を達成した患者の割合は、全治療群にわたって同様であった（９２％ＰＥＧ−ＩＦＮ、９５％ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ９００Ｑ２ｗ、９２％ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００Ｑ２ｗ、および９１％ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００Ｑ４ｗ）。したがって、２週目の抗ウイルス応答は、Ｑ２ｗおよびＱ４ｗＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ治療群の両方における１２週目反応転帰に対し非常に予測的となる。４および１２週目にＲＮＡ陰性である患者は、９０％を上回るＳＶＲ達成の可能性を有する。さらに、これらのデータは、治療２週目（ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの単回投与後）までには、１２００μｇＱ２ｗまたはＱ４ｗでのＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる治療が、少なくとも、ＰＥＧ−ＩＦＮによる治療と同程度に有効であって、より有効でさえあり得ることを示唆する。加えて、治療が難しい遺伝子１型母集団において、１２００μｇ用量のＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂが、９００μｇ用量のＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂまたはＰＥＧ−ＩＦＮよりも抗ウイルス活性を提供したことから、用量の増量（例えば、１８００μｇまで）によってより有効となる可能性がある。

２週目にａ≧２ｌｏｇＨＣＶＲＮＡ減少を達成した患者の割合は、１２００μｇＱ４ｗ治療群においてより多かったが、ＲＶＲを達成する患者の割合は、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ２ｗ治療群またはＰＥＧ−ＩＦＮ治療群よりも、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ４ｗ治療群において少なかった。ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ２ｗ治療群において、ＲＶＲを達成した患者の割合は、ＰＥＧ−ＩＦＮ治療群よりも多かった。さらに、ＲＶＲは、１２週目に、ＥＶＲおよびＲＮＡ陰性と正の関係を示した（Ｐ＜０．００１）。１２週目には、ＲＶＲを有する患者は、全治療選択肢において、９７−１００％の同様のＥＶＲまたはＨＣＶ陰性率を有していた。したがって、ＲＶＲを達成する患者の割合は、ＰＥＧ−ＩＦＮ治療群よりも、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇＱ４ｗ治療群において少なかったが、これらの患者の１００％が、１２週目に、ＲＮＡ陰性を維持しており、この治療プロトコルが、実行可能治療プロトコルであることが示唆された。さらに、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１２００μｇ治療群においてＲＶＲを達成した患者の割合が、ＰＥＧ−ＩＦＮ治療群を上回ったことは、Ｑ４ｗ治療群における２週目の第２の投与の追加によって、ＲＶＲを増加させた可能性が示唆される。

まとめると、データは、ＲＢＶと併用してＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの低頻度の投薬スケジュールが、遺伝子１型治療未投与患者を治療する際に、ＰＥＧ−ＩＦＮと同程度に有効またはより有効であり得ることを示唆する。加えて、累積データは、治療プロトコルの最初の４週間は２週間おきに、その後２４−４８週間は４週間おきに、総濃度１２００μｇ以上（１８００μｇ等）でＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂを投与するステップを含む治療レジメンが、現在の標準治療と同程度に優れている、またはそれ以上に優れている可能性を示唆する。さらに、これらのデータは、そのように併用される治療レジメンが、Ｑ４ｗレジメンの便宜性および耐性を患者に提供し、Ｑ２ｗレジメンと同程度の有効性またはより優れた有効性を有することを示唆する。

リバビリンとの併用による、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂへの慢性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）非反応者患者の反応
背景
米国では、４百万人を超える人々が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染しており、このウイルスは、米国における肝疾患の最も一般的原因となっている。抗ウイルス分子であるリバビリン（ＲＢＶ）の併用治療を伴うまたは伴わないインターフェロンα（ＩＦＮα）は、歴史的に、患者への最も有効な治療として認識されている。より最近では、インターフェロンαのペグ化形態は、ＲＢＶと併用してＨＣＶの治療として認められている。これらのペグインターフェロンは、標準インターフェロンまたはリバビリン療法との併用によるインターフェロンよりも、ＨＣＶの治療に有効であることが示されており、ＨＣＶの伝統的治療となっている。

しかしながら、この治療は、重大な実用上の制限を有する。治療の間の患者の生活の質を著しく低下させる周知の副作用と、従来の療法に伴う大幅な割合の著しい血液学的減少に加え、従来の療法は、ＨＣＶの現在の治療を受ける患者の大きな割合に対し非有効である。以前にＩＦＮα−ＲＢＶ療法を受けていないＨＣＶ患者の治療に関する臨床研究によると、従来の治療を開始した約４５％の患者が、ＨＣＶの除去に失敗し、慢性的に感染したままであることが示されている（例えば、非反応者）。その集団においては、療法に反応する患者の割合は、非常に少ない。

治験責任医師は、ペグＩＦＮαおよびＲＢＶの従来の療法によってこれらの患者を再治療することによって、ＩＦＮαによる、またはＲＢＶとの併用による、以前の治療への反応に失敗したＨＣＶ患者の非反応者母集団の必要性に対応している。Ｓｈｉｆｆｍａｎらの「Ｐｅｇｆｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎａｌｆａ−２ａａｎｄｒｅｂａｖｉｌｉｎｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｈｒｏｎｉｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｗｈｏｈａｖｅｆａｉｌｅｄｐｒｉｏｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ」Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１２６（４）：１０１５−２３（２００４）を参照。この治験に登録した３５％の患者が、従来の療法による２０週間の再治療後、ＨＣＶＲＮＡの兆候がなかったが、これらの患者の多くは、治療中断後、再発した。したがって、わずか１８％の患者が、実際に、持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ）を達成し、ＨＣＶを治癒した。同様に、従来のペグＩＦＮα療法による以前の治療を失敗した非反応者患者が、別のペグＩＦＮαによって再治療された際、これらの患者のうちのわずか約５−１０％が、事例証拠に基づいて、ＳＶＲを達成することができた。したがって、１つのインターフェロン療法を失敗しただけでなく、あらゆる現在のインターフェロン療法を失敗した患者の母集団は、有意に成長しつつある。故に、全般的ＨＣＶの治療だけでなく、インターフェロン療法によって以前に治療された（例えば、ＩＦＮα治療経験）患者および非反応者である患者、特に、最も治療が困難な非反応者患者（例えば、現在の伝統的治療による以前の治療または再治療を失敗した患者）の治療の代替療法のための改良された治療プロトコルの明確な必要性が存在する。

論理的根拠
ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂは、遺伝子的に、そのＣ末端の成熟アルブミンを成熟インターフェロンα−２ｂのＮ末端を融合することによって生成される。ＲＢＶと併用するＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる治療の安全性、忍容性、および有効性は、ＩＦＮα治療経験非反応者ＨＣＶヒト患者における無作為化非盲検治験で評価された。本治験の目的のため、非反応者は、ＨＣＶＲＮＡレベル（例えば、早期ウイルス反応、１２週目またはＥＶＲ１２）の２−ｌｏｇ減少の達成の失敗によって、１２週目に前治療を停止したＨＣＶ患者、あるいは治療プロトコル完了後、ＳＶＲを達成しなかった患者のいずれかとして定義された。治療の中断後に再発した患者は、本治験から除外された。加えて、少なくとも５０％の本治験の患者は、ペグＩＦＮα治療プロトコルに以前に失敗していた。

方法
少なくとも１つのＩＦＮα治療プロトコルを以前に失敗したヒトＩＦＮα治療経験非反応者ＨＣＶ患者が、（ａ）９００μｇ２週間毎に１回（Ｑ２ｗ）、（ｂ）１２００μｇＱ２ｗ、および（ｃ）１２００μｇ４週間毎に１回（Ｑ４ｗ）の３つの皮下（ｓｃ）ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ治療群に無作為化された。また、各治療群における各対象は、１０００−１２００ｍｇ／日ＲＢＶを受けた。これら初期の３つのコホートからの安全性データの評価後、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂは、１０００−１２００ｍｇ／日ＲＢＶと併用して、１５００μｇＱ２ｗまたは１８００μｇＱ２ｗのいずれかでＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂを受けた２つの追加コホートの逐次追加によって、用量が増量された。

本治験の治療期間は、４８週間であって、２４週間の追跡を伴う。本治験の主要評価項目は、持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ）である。
ＨＣＶＲＮＡ滴定量は、１０ＩＵから１億ＩＵ／ｍＬ）の感度範囲を有する、リアルタイムＰＣＲアッセイであるＱｕａｎｔａｓｕｒｅ（商標）（Ｌａｂｃｏｒｐ）を使用して測定した。アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）と、絶対好中球数（ＡＮＣ）、ヘモグロビン、および血小板数を含む血液学的影響は、当技術分野において既知の標準手技を使用して測定した。

結果および考察
人口統計
多くの人口統計特性が特定されており、治療への非反応に対し優勢を有する患者の独立指標として役立つ。これらの非反応性の重要な治療前予測因子として、（１）遺伝子１型、（２）ＨＣＶＲＮＡレベルの高ベースライン中央値、（３）ＰＥＧ＋ＲＢＶ療法に対する以前の非反応、（４）アフリカ系アメリカ人、（５）Ｆ３−Ｆ４の進行性線維症レベル（ＭＥＴＡＶＩＲ（登録商標）分類を使用）、および（６）高ＢＭＩ（例えば、≧２５ｍｇ／ｋｇ）を含む。おそらく、非応答性に対する最良の全体指標は、ＰＥＧ−ＲＢＶ治療の以前の失敗であって、以前のＩＦＮベースのレジメン失敗数を背景とする。

対象人口統計は、表１１に要約される。全体として、全対象人口統計は、全治療群において類似であった。対象の大部分は、２つ以上のＩＦＮα含有レジメンに曝露されており、ＰＥＧ＋ＲＢＶによる前治療に失敗していた。加えて、ベースライン疾患特性が、５治療群にわたって同程度であったのに対し、１８００ μｇＱ２ｗ治療群は、有意に高い治療前ＨＣＶＲＮＡと、最大割合の前ＰＥＧ＋ＲＢＶ失敗を有していた。したがって、１８００μｇＱ２ｗ治療群における対象は、最も治療難治性患者母集団を示した。

有効性および生物学的活性
遺伝子１型ＰＥＧ＋ＲＢＶ非反応者、すなわち、最も難治性ＨＣＶ患者母集団に対する、治療期間にわたる治療前レベルからのＨＣＶＲＮＡの減少が表１２に示される。２−１２週目には、ＨＣＶＲＮＡ減少の規模は、９００−１５００μｇ治療群にわたって同程度であった。しかしながら、最大ウイルス量減少は、１８００μｇ治療群において観察された。これは、この治療群における治療前ＨＣＶＲＮＡの高レベルと、最大のＰＥＧ＋ＲＢＶ失敗率とを考えると、驚くべきことであった。最初の１２週間の治療にわたる抗ウイルス応答の規模は、ウイルス動態の第２段階勾配を反映しており、ＳＶＲの陽性予測因子である。
図７に示されるように、ＨＣＶＲＮＡ減少の勾配は、遺伝子１型ＰＥＧ＋ＲＢＶ非反応者における９００−１５００μｇ治療群に対し、１２週目時点で、同程度であった。意外にも、ＨＣＶＲＮＡ減少の規模は、１８００μｇ治療群において最大であった。１５００および１８００μｇ治療群のＨＣＶＲＮＡ減少は、このサブグループ患者においては、２４週目時点で同程度である。

２４週目には、ＨＣＶＲＮＡ陰性の対象の割合は、９００−１５００μｇ治療群にわたって同程度であった。１２週目同様に、２４週目における遺伝子１型ＰＥＧ＋ＲＢＶ非反応者のサブグループ分析は、１８００μｇ治療群において最大反応率を示した（データ示さず）。
対象は、治験責任医師の判断によって、有効性の欠如のため、２４週目に中断が認められ、インターフェロンベースのレジメンの累積データを考えると、ＥＶＲ１２の欠如およびＳＶＲに対する２４週目ＲＮＡ陰性の高陰性予測値が実証された。

２４週目にＲＮＡ陰性であったほとんどの患者は、４８週目でも陰性のままであった。全体の治療終了時反応（ＥＴＲ、４８週目にＨＣＶ陰性）は、９００−１２００μｇ治療群に対し３１％であった（図８Ａ）。したがって、１２週目（例えば、ＥＶＲ１２）または２４週目にＨＣＶＲＮＡ陰性となった対象の高比率が、ＥＴＲを達成した。遺伝子１型ＰＥＧ＋ＲＢＶ非反応者内では、ＥＴＲ率は、約１５％から２７％の範囲であって、１５００μｇおよび１８００μｇ治療群においてＥＴＲの最大率を有していた（図８Ｂ）。
加えて、４８週間の治療（例えば、ＳＶＲを達成）後の１２週目の追跡時点で、有意な数の対象がＨＣＶＲＮＡ陰性のままであった。９００−１２００μｇ治療群全体のＳＶＲ率は、２１％であった（図８Ｃ）。遺伝子１型ＰＥＧ＋ＲＢＶ非反応者内では、ＳＶＲ率は、１０％から１５．４％の範囲であった（図８Ｄ）。

要するに、これらのデータは、高率のＰＥＧ＋ＲＢＶ失敗を有するＩＦＮα治療経験非反応者ＨＣＶ患者の、ＲＢＶと併用して９００−１２００μｇのＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる治療が、強固かつ同程度の抗ウイルス活性をもたらすことを示す。また、低ウイルス再燃（例えば、ＨＣＶＲＮＡ検出不能であるが、その後、２つ以上の時点で陽性である）および再発率が、この治療難治性非反応者母集団において観察された。加えて、有意に著しい減少が、治療の最初の１２週間にわたって、１８００μｇ治療群において観察され、リバビリンと併用して、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂのこの用量で治療を受ける患者が、ＳＶＲ率の有意な増大を有し得ることが示唆された。

血液学的影響
併用治療プロトコルにおけるコンプライアンスと、ＩＦＮおよびＲＢＶの総量への曝露を保証することは、ＳＶＲ率を最大限にするために重要である。
血液学的減少は、ＩＦＮおよびＲＢＶによる併用治療の際には一般的である。ＲＢＶ投与は、ＨＣＶ再発を防止するために重要である。しかしながら、ＲＢＶ誘発性溶血によるヘモグロビン（Ｈｂ）および血小板（ＰＬＴ）数の減少は、ＲＢＶ用量の減量を必要とする。絶対好中球数（ＡＮＣ）＜７５０／ｍｍ^３の減少は、併用治療のＩＦＮ成分を減量した用量を必要とする。
いくらかのＡＮＣおよびＰＬＴ減少が観察されたが、これらの減少は、Ｑ２ｗ治療群全体にわたって同程度であって、約４から８週目に停滞期に達した。同様に、ベースラインからのＨｂ減少は、１２週目以降まで、Ｑ２ｗ治療群（１８００μｇ治療群を含む）全体にわたって同程度であった。血液学的値の減少は、Ｑ４ｗ治療群ではあまり見られなかった。全体として、有害事象の管理のために用量を減量された対象は、１２／１１５名であった。治療プロトコルに概説されるように、ほとんどのＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ用量の減量は、ＡＮＣの減少によるものであった。Ｑ２ｗ治療群間に、用量反応は、観察されなかった。したがって、高用量治療群で観察される用量の減量のさらなる必要性はない。

要するに、ＲＢＶと併用してＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる治療で観察される血液学的値にいくらかの減少が見られるが、これらの減少は、治療群にわたって同程度であって、ＲＢＶと併用して９００−１８００μｇのＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによるＩＦＮα治療経験非反応者ＨＣＶ患者の治療間の安全性に有意差はないことが示唆された。

結論
まとめると、これらの結果は、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂおよびＲＢＶによる治療が、ＰＥＧ＋ＲＢＶ治療プロトコルを以前失敗した患者を含む、ＩＦＮα治療経験の非反応者ＨＣＶ患者の大部分において、ＳＶＲを達成し、したがって、ＨＣＶの根絶に有効であり得ることを示唆する。特に、これらの結果は、ＲＢＶと併用してＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ９００−１２００μｇによる治療が、本治験の全患者の２１％のＳＶＲ達成をもたらしたことを示す。ＳＶＲは、ＰＥＧ＋ＲＢＶレジメンを以前に失敗した患者においてさえも達成可能であって、これらの非常に難治性患者のうちの１０％から１５．４％がＳＶＲを達成した。さらに、１８００μｇ治療群は、最も難治性患者母集団において、最大２４週のＨＣＶＲＮＡ陰性率を示し、この治療が、これらの患者に対しさらに高いＳＶＲ率をもたらし得ることを示唆した。加えて、安全性プロフィールは、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの全治療群にわたって同様であった。さらに、これらの結果は、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂが、２週間から４週間おきに有効に投与され、改良された投薬スケジュールを提供し得ることを示す。したがって、これらの結果は、ＲＢＶと併用してＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの治療が、インターフェロンベースの治療を失敗した患者、特に、現在、当技術分野において欠落している、従来のペグインターフェロンＲＢＶ療法を失敗した者に対し、非常に有利かつ改良された投薬スケジュールと共に、有効かつ安全な治療の代替法を提供することを示す。

遺伝子２型または３型インターフェロン未投与慢性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）患者におけるリバビリンとの併用によるＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの抗ウイルス活性
背景
世界中の１億７千百万人を超える人々が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染しており、このウイルスは、重要な公衆衛生上の懸念として浮上し、世界中において、急速に肝疾患の最も一般的原因となった。急性ＨＣＶ感染は、通常、無症状であって、早期診断を難しいものとしている。実際、ＨＣＶ感染は、慢性的症状となる傾向があり、約７０％の急性感染症は、持続性となる。したがって、新しい感染症の発症は減少傾向にあるが、ＨＣＶ感染の蔓延は、近い将来においても一定のままであることが予測される。

抗ウイルス分子であるリバビリン（ＲＢＶ）の併用治療を伴うまたは伴わないインターフェロンα（ＩＦＮα）は、歴史的に、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）患者のための最も有効な治療として認識されている。より最近では、ペグ化形態のインターフェロンαが、ＲＢＶとの併用によるＨＣＶの治療として認められている。これらのペグインターフェロンは、標準インターフェロンまたはリバビリン療法との併用によるインターフェロンよりも、ＨＣＶの治療に有効であることが示されており、ＨＣＶの伝統的治療となっている。
全体として、現在推奨される治療に対する持続性抗ウイルス応答（ＳＶＲ）は、ウイルスおよび宿主特性、特にウイルス遺伝子型によって、ＣＨＣ患者において大きく異なる。例えば、ＳＶＲ率は、より一般的遺伝子１型の患者では、約４２−４６％の範囲である。一方、あまり一般的ではない遺伝子２型または３型の患者は、７６−８０％のＳＶＲ率を経験する。加えて、遺伝子１型患者よりも比較的治療困難度の低い遺伝子２型または３型患者は、より低用量のリバビリンによって、より短期間の治療期間で治療を受けることが可能である。

ＲＢＶと併用してペグインターフェロンの遺伝子２型または３型の現在推奨される２４週間の治療と、その後の２４週間の追跡期間によって、かなりの割合の患者にＳＶＲを達成することをもたらされるが、この治療プロトコルは、依然として、ＩＦＮベースの治療に一般的な重要となる実用上の制限を残す。特に、現在推奨される治療は、各投与後に患者の生活の質を著しく低下させる悪影響に悩まされたままである。したがって、有効かつ遺伝子２型または３型ＨＣＶ感染患者による耐性がより優れた新しい治療レジメンの継続的必要性が存在する。

論理的根拠
ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂは、遺伝子的に、Ｃ末端の成熟アルブミンを成熟インターフェロンα−２ｂのＮ末端に融合することによって生成される。ＲＢＶと併用してＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる治療の安全性および有効性は、遺伝子２型または３型ＩＦＮ未投与ＣＨＣヒト患者の無作為化多施設非盲検治験において評価された。

方法
遺伝子２型または３型のいずれかであるＩＦＮ未投与の４３名のヒトＨＣＶ患者が、（ａ）２週間おきに１５００μｇの投与（Ｑ２ｗ）または（２）４週間（Ｑ４ｗ）おきに１５００μｇの投与を受ける２つの皮下（ｓｃ）ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ治療群に無作為化された。また、各治療群の各対象は、８００ｍｇ／日のＲＢＶを受けた。階層化の主要基準として、遺伝子型（２または３）およびＨＣＶＲＮＡ（＜８００，０００ＩＵ／ｍＬまたは≧８００，０００ＩＵ／ｍＬ）を含めた。
本治験の治療期間は、２４週間であって、２４週間の追跡を伴う。主要評価項目は、持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ）である。

ＨＣＶＲＮＡ滴定量は、４３ＩＵから６，９００万ＩＵ／ｍＬの感度範囲（定量限界（ＬＯＱ））を有するリアルタイムＰＣＲであるＱｕａｎｔａｓｕｒｅ（商標）（Ｌａｂｃｏｒｐ）を使用して測定した。インスリン抵抗性は、ホメオスターシス評価モデル（ＨｏｍｅｏｓｔａｓｉｓＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔＭｏｄｅｌ、ＨＯＭＡ）を使用して評価された。
包括解析（ＩＴＴ）患者は、患者が紛失データ点を有しているか、または本治験から脱落したかに関わらず、各治療群の全無作為化および治療された対象として定義される。改変包括解析（ＭＩＴＴ）患者は、本治験への登録日に基づいて、１２週目の訪問が考えられ得る患者として定義される。

結果および考察
４および１２週目の対象人口統計および抗ウイルス応答を表１３に要約する。全体として、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂは、両治療群において優れた耐性を示した。

ＨＣＶＲＮＡ減少の規模およびＨＣＶＲＮＡ＜ＬＯＱを有する遺伝子２型または３型患者の割合は、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂＱ２ｗおよびＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂＱ４ｗ治療群の両方にわたって同程度であった。４週目には、ＨＣＶＲＮＡ＜ＬＯＱを有する遺伝子２型または３型患者の割合は、１５００μｇＱ２ｗ治療群では７６．２％であって、１５００μｇＱ４ｗ治療群では６８．２％であった。１２週目には、両治療群における遺伝子２型または３型患者の高割合は、ＨＣＶＲＮＡ＜ＬＯＱ（１５００Ｑ２ｗでは８２．４％、１５００Ｑ４ｗでは８８．９％）を有していた。

したがって、これらの結果は、Ｑ２ｗまたはＱ４ｗ週目のいずれかにおいて、１５００μｇＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる遺伝子２型または３型ＣＨＣ患者の治療が、強固な抗ウイルス応答率をもたらすことを示す。さらに、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１５００μｇＱ４ｗプロトコルによる治療は、遺伝子２型または３型患者におけるＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１５００μｇＱ２ｗプロトコルによる治療と同等の有効性を示した。したがって、これらの結果は、Ｑ２ｗまたはＱ４ｗのいずれかにおいて、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ１５００μｇによる治療が、少なくとも、ＨＣＶ遺伝子２型または３型感染患者のための現在推奨される治療と同様に有効であって、大幅に改良された投薬スケジュールと共に、潜在的に、患者に優れた忍容性および便宜性をもたらすことを示唆する。

リバビリンと併用して、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによって治療される遺伝子１型インターフェロン未投与慢性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）患者の生活の質（ＱＯＬ）
背景
前述のように、リバビリン（ＲＢＶ）と併用してペグインターフェロンαによる遺伝子１型インターフェロン未投与（ＩＦＮ未投与）ＨＣＶ患者の４８週間の従来の治療は、重要となる実際的制限を有する。現在推奨されるインターフェロン療法の周知の副作用によって、患者の生活の質は、インターフェロンの各投与後、著しく低下する。現在のプロトコルは、少なくとも毎週投与することを必要とし、長期間の治療による生活の質の低下および障害日数の増加をもたらす。その結果、多数の患者が治療を中断し、一部の研究では、５０％を超える中断率が報告されている。したがって、ＩＦＮ未投与患者における遺伝子１型ＨＣＶの治療のための治療プロトコルを改良し、現在の標準治療と比較して、生活の質に及ぼす影響を改善する必要性が明確である。

論理的根拠
ＲＢＶと併用してＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる治療の安全性および有効性は、遺伝子１型ＩＦＮ未投与ＨＣＶヒト患者における実薬対照臨床試験において評価され、実施例７３に記載されるように、実薬対照として、ＲＢＶと併用してＰＥＧ−ＩＦＮα−２ａ（ＰＥＧ−ＩＦＮ）による従来の治療と比較した。治療の最初の１２週間の間、ＲＢＶと併用してＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる治療のＱＯＬおよび治療の障害日数（例えば、欠勤日数）が、ＲＢＶとの併用によるＰＥＧ−ＩＦＮと比較された。

方法
４５８名のヒト遺伝子１型ＨＣＶ患者が、無作為化され、実施例７３に記載されるように処理された。ＳＦ−３６ｖ２（登録商標）測定モデル（ＱｕａｌｉｔｙＭｅｔｒｉｃ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＲＩ）によって判定されるＱＯＬおよび障害日数が、治療前、ならびに治療４週目および１２週目に評価された。特に、身体機能（ＰＦ）、日常役割機能（身体）（ＲＰ）、身体の痛み（ＢＰ）、全体的健康感（ＧＨ）、活力（ＶＴ）、社会生活機能（ＳＦ）、日常役割機能（精神）（ＲＥ）、および精神的健康（ＭＨ）の８つのＳＦ−３６ｖ２領域が評価された。最初の４つの領域（ＰＦ、ＲＰ、ＢＰ、およびＧＨ）は、ＱＯＬモデルのＰｈｙｓｉｃａｌＨｅａｌｔｈＣｏｍｐｏｎｅｎｔ（身体的健康の構成要素）に対応し、残りの４つの領域（ＶＴ、ＳＦ、ＲＥ、およびＭＨ）は、ＭｅｎｔａｌＨｅａｌｔｈＣｏｍｐｏｎｅｎｔ（精神的健康の構成要素）に対応する。

８つのＳＦ−３６ｖ２領域の変換（素点）スコア、ならびに標準値に基づいた身体的健康度（ＰＣＳ）スコアおよび精神的健康度（ＭＣＳ）スコアは、１２週間の治療を通して評価された。
結果および考察

１２週目には、９００μｇＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂＱ２ｗを受けた患者のＱＯＬは、全測定値において、ＰＥＧ−ＩＦＮと比較して改善し、ＭＣＳおよびＰＣＳ、ならびに８つのうちの５つの個別領域において統計的有意性を達成した。１２００μｇＱ２ｗおよび１２００μｇＱ４ｗＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ治療群では、ＱＯＬの悪化は、実質的に全測定値において、ＰＥＧ−ＩＦＮと比較して軽減され、臨床的有意差が、身体の痛みおよび精神的健康の療法において観察された。
全体として、いずれのＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂ治療群における遺伝子１型ＨＣＶ患者も、そのＨＣＶ感染およびその後の治療によって、ＰＥＧ−ＩＦＮ治療群の遺伝子１型ＨＣＶ患者よりも欠勤日数（ＭＤＷ）が少なかった。特に、９００μｇＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂＱ２ｗを受けた患者は、ＰＥＧ−ＩＦＮを受けた患者よりも、ＭＤＷが７５％少なく、１２００μｇＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂＱ２ｗまたは１２００μｇＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂＱ４ｗ受けた患者は、ＭＤＷが２５％少なかった。

実施例７３に示されるＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの抗ウイルス活性とあわせて検討すると、これらの結果は、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂおよびＲＢＶによる遺伝子１型ＩＦＮ未投与ＨＣＶ患者の併用治療は、少なくとも、改良された投薬スケジュールおよび改善されたＱＯＬの利点を有して、従来のＰＥＧ−ＩＦＮおよびＲＢＶ併用治療による治療と同様に有効であることを示唆する。特に、これらの結果は、ＲＢＶと併用してＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂによる治療が、ＲＢＶとのＰＥＧ−ＩＦＮ併用治療によって得られるものよりもＱＯＬ指標の悪化の軽減および欠勤日数の減少を患者に提供することによって、ＲＢＶとの従来のＰＥＧ−ＩＦＮ併用治療よりも改良され、非常に有利な治療プロトコルを提供可能であることを示唆する。

遺伝子１型インターフェロン未投与慢性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）患者における、リバビリンの毎日の用量と併用して、２週目の追加用量と共に、４週間おきに投与されるＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの非盲検無作為化多施設予備研究
背景
ａｌｂ−ＩＦＮのウイルス動態モデルは、ＨＣＶＲＮＡにおける非線形二相性減少を実証した。治療開始後、ウイルス量の急激な用量依存性減少（「第１段階」）後、続く治療週間において、比較的緩徐ではあるが、継続的な指数関数的減衰の「第２段階」が続いた。第１段階のＨＣＶＲＮＡ減少は、用量依存性を示した。同様に、ＨＣＶＲＮＡにおいて、用量依存性第２段階減少がみられた。これらは、標準およびＰＥＧ−ＩＦＮα治療の療法で観察されるように、持続性ウイルス減少（ＳＶＲ）の強力な予測因子であると考えられる。Ｎｅｕｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３６（４Ｐｔ２）：３５７ａ（２００２）、Ｐｅｒｅｌｓｏｎｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４２：７４９−７５４（２００５）参照。

論理的根拠
リバビリンの毎日の用量と併用して、２週目の追加用量と共に、４週間おきに投与されるＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの２種療法の安全性および有効性は、非盲検無作為化多施設予備研究において評価される。２種療法は、遺伝子１型慢性Ｃ型肝炎のＩＦＮ未投与患者において、リバビリンの毎日の用量と併用して４週間おきのＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの投与と、リバビリンの毎日の用量と併用して２週間おきの半分の用量のＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂの投与と比較される。

方法
適格患者は、表１５に示されるように、１：１：１の比率で３つの治療群のうちの１つに無作為化される。９００Ｑ２ｗ治療群は、許容可能な安全性プロフィールおよびＰＥＧ−ＩＦＮα−２ａと類似のＨＣＶＲＮＡ減少を有することが示されているため、本治験の内部基準として役立つ。１８００Ｑ２／４治療群は、４週目にＨＣＶＲＮＡ減少の規模を増大させ、それによって、４週目（ＲＶＲ４）の即効ウイルス学的著効率と、潜在的にＳＶＲ率を増加させるために、２週目にａｌｂ−ＩＦＮ１８００μｇの追加用量を受ける。用量の減量もまた、本治験計画内に含まれる。９００Ｑ２ｗ群に対して、最低用量レベル６００μｇまでのａｌｂ−ＩＦＮの用量の減量は、ＩＦＮα未投与遺伝子１型慢性Ｃ型肝炎患者における別の第２相研究の類似用量で観察された有意な抗ウイルス活性に基づいて選択された。１８００Ｑ４ｗおよび１８００Ｑ２／４ｗ群に対して、４週間おきの１２００μｇまでの用量の減量は、２週間おきの６００μｇのａｌｂ−ＩＦＮ用量への類似曝露に基づいて選択された。

約２２５名の患者が、無作為化される（すなわち、治療群につき７５名の患者）。無作為化は、スクリーニング時のＨＣＶＲＮＡ（≧４００，０００ＩＵ／ｍＬまたは＜４００，０００ＩＵ／ｍＬ）および人種別に階層化される。全治療期間は、４８週間である。４８週間の治療を終了した全患者は、５２週目および６０週目の訪問に戻る。６０週目にＨＣＶＲＮＡ＜１００ＩＵ／ｍＬを有する患者は、７２週目にＳＶＲ評価に戻る。
１２週目にウイルス学的著効を達成しない患者（≧２−ｌｏｇ１０減少またはＨＣＶＲＮＡ＜ＬＯＱ［４３ＩＵ／ｍＬ］として定義されるＥＶＲ１２）、あるいは２４週目以降にＨＣＶＲＮＡ≧１００ＩＵ／ＭＬを有する患者は、治験治療を中断する。これらの患者は、ＳＶＲ障害とみなされ、さらなるＨＤＶＲＮＡ評価を行う必要はない。

早期に治療を中断する全患者は、４週間および１２週間の治療後安全性追跡訪問を完了しなければならない。加えて、１２週間の治療後安全性追跡訪問時に、ＨＣＶＲＮＡ＜１００ＩＵ／ｍＬを有する患者は、治療２４週間後、ＳＶＲ評価に戻る。
治験中の任意の時点において、陽性ａｌｂ−ＩＦＮまたはＨＳＡ抗体反応を有する患者は、ＨＣＶＲＮＡ反応に関わらず、（４週間および１２週間の治療後安全性追跡訪問に加え）２４週間の治療後安全性追跡訪問を完了しなければならない。

ＨＣＶＲＮＡは、４３ＩＵ／ｍＬ（ＬＯＱ）−６，９００万ＩＵ／ｍｌのダイナミックレンジを有する有効なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイと、１５ＩＵ／ｍＬの検出下限（ＬＯＤ）とによって、評価される。

有効性評価
ＨＣＶＲＮＡ試料は、１日目、４日目、１週目、２週目、４週目、３２日目、ならびに６、８、１２、１６、２０、２４、３２、４０、４８、５２、６０、および７２週目訪問時に収集されるが、ＥＶＲ１２を達成しない患者または２４週目以降にＨＣＶＲＮＡ≧１００ＩＵ／ｍＬを有している患者を除く。

安全性評価
患者は、治験の間中、有害事象（ＡＥ）、重篤有害事象（ＳＡＥ）、臨床検査値異常、および免疫原性状態について監視される。有害事象重症度は、改訂版ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ（ＤＭＩＤ）ＴｏｘｉｃｉｔｙＴａｂｌｅｓに従って、格付けされる。

他の評価
薬物動態（ＰＫ）試料は、１日目、４日目、８日目（１週目）、１５日目（２週目）、２９日目（４週目）、３２日目、５７日目（８週目）、および８５日目（１２週目）に収集される。患者報告転帰調査、ＳＦ３６ＨｅｌａｔｈＳｕｒｖｅｙ（ＳＦ−３６健康調査）のアキュート版、およびＷｏｒｋＰｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＡｃｔｉｖｉｔｙＩｍｐａｉｒｍｅｎｔＱｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（仕事の生産性及び活動障害に関する質問票）（ＷＰＡＩ−ＳＨＰ）は、４８週間の治療段階を通して週２回と、追跡段階の５２、６０、および７２週目訪問時に収集される。

データ分析
包括解析（ＩＴＴ）母集団は、少なくとも１回量の治験薬を受ける無作為化された全患者から構成される。ＩＴＴの原則に従って、患者は、無作為化の際に割り当てられた治療別に分析される。安全性母集団（安全性解析対象集団）は、少なくとも１回量の治験薬を受け、受ける治療別に分析される全患者から構成される。
ａｌｂ−ＩＦＮの安全性および忍容性は、ＡＥ／ＳＡＥ、中断につながるＡＥ、用量の減量または不作為につながるＡＥ、および臨床検査値異常を含む、各治療群の安全性プロフィール全体を検査することによって評価される。死亡、他の重篤有害事象、ａｌｂ−ＩＦＮの中断を生じさせる有害事象、および用量の減量または不作為につながるＡＥは、治療群別に表される。これら事象の比率は、全３治療群における９５％信頼区間（ＣＩ）と共に推定される。さらに、対群比較は、Ｐｅａｒｓｏｎのカイ２乗検定を使用して、または予測細胞数が５未満である場合、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定を使用して、評価される。

分類別効果指標の奏功率は、その対応する９５％ＣＩと共に報告される。同様に、対群比較は、Ｐｅａｒｓｏｎのカイ２乗検定を使用して、または予測細胞数が５未満である場合、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定を使用して、評価される。検出限界未満のＨＣＶＲＮＡまでの時間は、各対群比較のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法およびログランク検定を使用して、評価される。
引用されるそれぞれの文献（特許、特許出願、特許公報、学術論文、抄録、実験手引書、書籍、または他の刊行物が挙げられ）、ならびに本願に参照されるＧｅｎＢａｎｋ、ＧｅｎｅＳｅｑ、またはＣＡＳＲｅｇｉｓｔｒｙ等のデータベースに特有の識別子を通して利用可能な情報の全開示は、参照されることによって、全体として本明細書に組み込まれる。

さらに、以下の国際出願および米国出願のそれぞれの明細書および配列表は、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／４０８９１号（２００２年１２月２３日出願）、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００１３６９号（２００４年１月２０日出願）、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００４０４１号（２００５年２月９日出願）、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／２９３９１号（２００６年７月３１日出願）、米国出願第１０／７７５，２０４号（２００４年２月１１日出願）、米国出願第１１／１７５，６９０号（２００５年７月７日出願）、米国出願第１１／４２９，３７３号（２００６年５月８日出願）、米国出願第１１／４２９，２７６号（２００６年５月８日出願）、米国出願第１１／４２９，３７４号（２００６年５月８日出願）、米国出願第１１／４９５，６２４号（２００６年７月３１日出願）、ならびに米国暫定出願第６０／７０７，５２１号（２００５年８月１２日出願）、第６０／７１２，３８６号（２００５年８月３１日出願）、第６０／７３２，７２４号（２００５年１１月３日出願）、第６０／７７６，９１４号（２００６年２月２８日出願）、第６０／７８１，３６１号（２００６年３月１３日出願）、第６０／８１０，１８２号（２００６年６月２日出願）、第６０／８１３，６８２号（２００６年６月１５日出願）、第６０／８４４，３４９号（２００６年９月１４日出願）、第６０／８５８，４１０号（２００６年１１月１３日出願）、第６０／９０２，０３９号（２００７年２月２０日出願）、および６０／９４２，６４７号（２００７年６月７日出願）。

カナダ

出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（ＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒｏｆＰａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の試料の供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
ノルウェー

出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか、あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、試料の供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者による試料の供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔｏｆｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
オーストラリア

出願人はここにおいて、微生物の試料の供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有しない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
フィンランド

出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（ＮａｔｉｏｎａｌＢｏａｒｄｏｆＰａｔｅｎｔｓａｎｄＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるか、あるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、試料の供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
英国

出願人はここにおいて、微生物の試料の供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
デンマーク
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか、あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、試料の供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者による試料の供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔｏｆｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
スウェーデン

出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるか、あるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、試料の供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴＡｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅＩのａｎｎｅｘＺに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者による試料の供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔｏｆｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
オランダ

出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家への試料供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。

Claims

アルブミン融合タンパク質であって、
（ａ）治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体、
（ｂ）治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体であって、前記アルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体であって、治療用Ｘの前記フラグメントまたは変異体は、前記治療用タンパク質Ｘの生物学的活性を有し、前記アルブミンのフラグメントまたはその変異体は、アルブミン活性を有する、（ａ）または（ｂ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体、
（ｄ）（ｃ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体であって、前記アルブミン活性は、非融合状態の前記治療用タンパク質Ｘの貯蔵寿命と比べ、前記治療用タンパク質Ｘの貯蔵寿命を延長する能力である、（ｃ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体、
（ｅ）（ｃ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはそのフラグメントもしくはその変異体であって、前記アルブミン活性は、非融合状態の前記治療用タンパク質Ｘの血清半減期と比べ、前記治療用タンパク質Ｘの血清半減期を延長する能力である、（ｃ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはそのフラグメントもしくはその変異体、
（ｆ）（ａ）から（ｅ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体であって、前記アルブミンのフラグメントまたは変異体は、配列番号１のアミノ酸１〜３８７のアミノ酸配列を含む、（ａ）から（ｅ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体、
（ｇ）（ａ）から（ｆ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体であって、前記治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体は、アルブミンのＮ末端または前記アルブミンのフラグメントまたはその変異体のＮ末端に融合される、（ａ）から（ｆ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体、
（ｈ）（ａ）から（ｆ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体であって、前記治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体は、アルブミンのＣ末端または前記アルブミンのフラグメントまたはその変異体のＣ末端に融合される、（ａ）から（ｆ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体、
（ｉ）（ａ）から（ｆ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体であって、前記治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体、アルブミンのＮ末端およびＣ末端または前記アルブミンのフラグメントまたはその変異体のＮ末端およびＣ末端に融合される、（ａ）から（ｆ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体、
（ｊ）（ａ）から（ｆ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体であって、第１の治療用タンパク質Ｘまたはそのフラグメントもしくは変異体と、第２の治療用タンパク質Ｘまたはそのフラグメントもしくは変異体とを含み、前記第１の治療用タンパク質Ｘまたはそのフラグメントもしくは変異体は、前記第２の治療用タンパク質Ｘまたはそのフラグメントもしくは変異体とは異なる、（ａ）から（ｆ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体、
（ｋ）（ａ）から（ｊ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体であって、前記治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体は、前記アルブミンまたは前記アルブミンのフラグメントもしくはその変異体から、リンカーによって分離される、（ａ）から（ｊ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体、
（ｌ）（ａ）から（ｋ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体であって、前記アルブミン融合タンパク質は、
Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１、またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１
の化学式を有し、
さらに、式中、Ｒ１は、治療用タンパク質Ｘまたはそのフラグメントもしくは変異体であり、Ｌはペプチドリンカーであり、Ｒ２は、配列番号１の前記アミノ酸配列を含むアルブミンまたはアルブミンのフラグメントまたは変異体である、（ａ）から（ｋ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体、
（ｍ）（ａ）から（ｌ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体であって、前記アルブミン融合タンパク質の貯蔵寿命は、非融合状態の前記治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体の貯蔵寿命より長い、（ａ）から（ｌ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体、
（ｎ）（ａ）から（ｌ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体であって、前記アルブミン融合タンパク質の血清半減期は、非融合状態の前記治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体の血清半減期より長い、（ａ）から（ｌ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体、
（ｏ）（ａ）から（ｌ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体であって、前記アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体の体外生物学的活性は、非融合状態の前記治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体の体外生物学的活性よりも大きい、（ａ）から（ｌ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体、ならびに
（ｐ）（ａ）から（ｌ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体であって、前記アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体の体内生物学的活性は、非融合状態の前記治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体の体内生物学的活性よりも大きい、（ａ）から（ｌ）の、治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体およびアルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくはその変異体
から選択されるメンバーを含む、アルブミン融合タンパク質。
宿主細胞において発現され、前記宿主細胞は、酵母、哺乳動物、または細菌細胞である、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
前記アルブミン融合タンパク質は、分泌リーダー配列をさらに含む、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
請求項１に記載の前記アルブミン融合タンパク質および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物。
請求項４に記載の組成物を含む、キット。
治療的に有効な量の請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質を投与するステップを含む、患者の疾患、障害、または感染を治療する方法。
前記疾患、障害、または感染は、適応症Ｙを含む、請求項６に記載の方法。
前記疾患、障害、または感染は、慢性肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、慢性Ｂ型肝炎感染、Ｃ型肝炎感染、慢性Ｃ型肝炎感染、Ｄ型肝炎感染、慢性Ｄ型肝炎感染、ヒトパピローマ感染、単純ヘルペスウイルス感染、外部尖圭コンジローマ、ＨＩＶ感染、腫瘍、癌、固形腫瘍、黒色腫、悪性黒色腫、腎臓癌、肺癌、結腸癌、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、膀胱癌、胃癌、肉腫、エイズ関連カポジ肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脳癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、子宮頸部形成異常、白血病、前白血病、骨髄障害、骨障害、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、血液悪性疾患、血液学的疾患、多発性骨髄腫、細菌感染、化学防御、血小板減少症、多発性硬化症、肺線維症、加齢性黄斑変性症、黄斑変性症、クローン病、神経疾患、関節炎、リウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、骨粗鬆症、骨減少症、破骨細胞形成、線維筋痛、シェーグレン症候群、慢性疲労症候群、熱、出血熱、ウイルス性出血熱、高血糖症、糖尿病、尿崩症、糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ）、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン欠乏、脂質異常症、高ケトン血症、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、または米国疾病対策センターにより特定されるカテゴリＡ、Ｂ、もしくはＣ病原体による感染、あるいはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項７に記載の方法。
前記疾患または障害は、Ｃ型肝炎感染またはＢ型肝炎感染である、請求項７または８に記載の方法。
前記疾患または障害は、Ｃ型肝炎感染またはＨＩＶ感染である、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、宿主細胞によって発現され、
（ａ）構築物ＩＤ２２４９、
（ｂ）構築物ＩＤ２３４３、
（ｃ）構築物ＩＤ２３６６、
（ｄ）構築物ＩＤ２３８１、
（ｅ）構築物ＩＤ２３８２、
（ｆ）構築物ＩＤ２４１０、
（ｇ）構築物ＩＤ３１６５、
（ｈ）構築物ＩＤ３４２２、
（ｉ）構築物ＩＤ３４２３、
（ｊ）構築物ＩＤ３４２４、
（ｋ）構築物ＩＤ３４７６、
（ｌ）構築物ＩＤ３９６０、
（ｍ）構築物ＩＤ４２９０、
（ｎ）構築物ＩＤ４２９１、
（ｏ）構築物ＩＤ４２９２、
（ｐ）構築物ＩＤ４２９５、および
（ｑ）構築物ＩＤ４２９６
から選択されるアルブミン融合構築物を含む、請求項９または１０に記載の方法。
前記アルブミン融合構築物は（ｄ）である、請求項１１に記載の方法。
前記アルブミン融合構築物は（ｇ）である、請求項１１に記載の方法。
前記アルブミン融合構築物は（ｌ）である、請求項１１に記載の方法。
前記患者は、Ｃ型肝炎感染を患い、前記患者は、治療未経験または治療経験済みである、請求項１３に記載の方法。
前記患者は、治療経験済みであり、かつ非反応者である、請求項１５に記載の方法。
前記非反応者は、ペグインターフェロンαおよびリバビリンを含む少なくとも１つの併用治療プロトコルに過去に失敗している、請求項１６に記載の方法。
前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子１型または遺伝子２／３型である、請求項１５に記載の方法。
前記治療的に有効な量の前記アルブミン融合タンパク質は、
（ａ）約６００μｇ／投薬量、
（ｂ）約９００μｇ／投薬量、
（ｃ）約１０００μｇ／投薬量、
（ｄ）約１２００μｇ／投薬量、
（ｅ）約１８００μｇ／投薬量、
（ｆ）約２０００μｇ／投薬量、および
（ｇ）約２４００μｇ／投薬量
から選択される、請求項１８に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、
（ａ）週に１回、
（ｂ）２週間毎に１回、
（ｂ）３週間毎に１回、
（ｃ）４週間毎に１回、および
（ｄ）５週間毎に１回
から選択される投薬スケジュールに従って投薬される、請求項１９に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２週間毎および４週間毎の組み合わせを含む投薬スケジュールに従って投薬される、請求項１９に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質の投薬スケジュールは、前記最初の４週間は２週間毎、その後、４週間毎に、前記アルブミン融合タンパク質を投薬するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
前記投薬スケジュールは、２４から４８週間である、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１５から２３のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項２４に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項２４に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項２４に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項２７に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンα２ｂを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンα２ｂは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療未経験であり、（２）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子１型であり、（３）前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約１８００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、２週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、および
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量
から選択される、請求項２９に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項２９または３０に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項３１に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項３１に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項３１に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項３４に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンα２ｂを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンα２ｂは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療未経験であり、（２）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子１型であり、（３）前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約１８００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、４週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、および
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量
から選択される、請求項３６に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項３６または３７に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項３８に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項３８に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項３８に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項３８に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンα２ｂを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンα２ｂは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療未経験であり、（２）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子１型であり、（３）前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約１８００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、治療の最初の４週間は２週間毎に１回、その後、４週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、全部で２４から４８週間、前記患者に投与される、請求項４３に記載の方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、および
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量
から選択される、請求項４３または４４に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー、
から選択される、請求項４６に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、
請求項４６に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項４６に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項４９に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンα２ｂを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンα２ｂは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療経験済みであり、（２）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子１型であり、（３）前記治療的に有効な量は、約１２００μｇ／投薬量から約１８００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、２週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項５１に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項５２に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項５２に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項５２に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項５５に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンα２ｂを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンα２ｂは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療経験済みであり、（２）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子１型であり、（３）前記治療的に有効な量は、約１２００μｇ／投薬量から約１８００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、４週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項に５７記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項５８に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項５８に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項５８に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項６１に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンα２ｂを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンα２ｂは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療経験済みであり、（２）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子１型であり、（３）前記治療的に有効な量は、約１２００μｇ／投薬量から約１８００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、治療の最初の４週間は２週間毎に１回、その後、２４から４８週間は４週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法
前記アルブミン融合タンパク質は、全部で２４から４８週間、前記患者に投与される、請求項６３に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項６３または６４に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項６５に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項６５に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項６５に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項６９に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンα２ｂを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンα２ｂは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療未経験であり、（２）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子２型または３型であり、（３）前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約１８００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、２週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、および
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量
から選択される、請求項７０に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項７０または７１に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項７２に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項７２に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項７２に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項７５に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンα２ｂを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンα２ｂは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療未経験であり、（２）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子２型または３型であり、（３）前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約１８００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、４週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、および
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量
から選択される、請求項７７に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項７７または７８に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項７９に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項７９に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項７９に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項８２に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンα２ｂを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンα２ｂは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療未経験であり、（２）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子２型または３型であり、（３）前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約１８００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、治療の最初の４週間は２週間毎に１回、その後、４週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、全部で２４から４８週間、前記患者に投与される、請求項８４に記載の方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、および
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量
から選択される、請求項８４または８５に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項８４から８６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項８７に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項８７に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項８７に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項９０に記載の方法。
疾患、障害、または感染を患う患者を治療する方法であって、
（ａ）短期間において、許容可能な安全性プロフィールを有する最大投薬量のインターフェロンを前記患者に投与するステップと、
（ｂ）より長い期間において、維持投薬量の前記インターフェロンを前記患者に投与するステップと、
を含む、方法。
前記最大投薬量は、
（ａ）前記インターフェロンの標準投薬量と同じ投薬量、
（ｂ）少なくとも前記インターフェロンの標準投薬量である投薬量、
（ｃ）前記インターフェロンの標準投薬量の１倍高い投薬量、
（ｄ）前記インターフェロンの標準投薬量の２倍高い投薬量、
（ｅ）前記インターフェロンの標準投薬量の３倍高い投薬量、
（ｆ）前記インターフェロンの標準投薬量の４倍高い投薬量、
（ｇ）前記インターフェロンの標準投薬量の５倍高い投薬量、
（ｄ）前記インターフェロンの標準投薬量の６倍高い投薬量、
（ｅ）前記インターフェロンの標準投薬量の７倍高い投薬量、
（ｆ）前記インターフェロンの標準投薬量の８倍高い投薬量、
（ｇ）前記インターフェロンの標準投薬量の９倍高い投薬量、および
（ｈ）前記インターフェロンの標準投薬量の１０倍高い投薬量
から選択される、請求項９２に記載の方法。
前記維持投薬量は、
（ａ）標準投薬量の前記インターフェロンと同じ投薬量
（ｂ）少なくとも標準投薬量の前記インターフェロンである投薬量、
（ｃ）前記最大投薬量の１／４である投薬量、
（ｄ）前記最大投薬量の１／２である投薬量、
（ｅ）前記最大投薬量の１／３である投薬量、
（ｆ）前記最大投薬量の１／８である投薬量、
（ｇ）前記最大投薬量より１倍低い投薬量、
（ｈ）前記最大投薬量より２倍低い投薬量、
（ｉ）前記最大投薬量より３倍低い投薬量、
（ｊ）前記最大投薬量より４倍低い投薬量、
（ｋ）前記最大投薬量より５倍低い投薬量、および
（ｌ）前記最大投薬量より６倍低い投薬量
から選択される、請求項９２または９３に記載の方法。
前記最大投薬量および前記維持投薬量は、
（ａ）１日に１回、
（ｂ）１日に２回、
（ｃ）１週間に１回、
（ｄ）１週間に２回、
（ｅ）１週間に３回、
（ｆ）１週間に１回、
（ｇ）２週間毎に１回、
（ｈ）３週間毎に１回、および
（ｉ）４週間毎に１回
から選択される投薬スケジュールに従って投与される、請求項９２から９４のいずれか一項に記載の方法。
前記短期間は、
（ａ）１週間、
（ｂ）２週間、
（ｃ）３週間、
（ｄ）４週間、
（ｅ）５週間、
（ｆ）６週間、
（ｇ）７週間、および
（ｈ）８週間
から選択される、請求項９２から９５のいずれか一項に記載の方法。
前記の、より長い期間は、
（ａ）少なくとも１６週間、
（ｂ）少なくとも２０週間、
（ｃ）少なくとも２４週間、
（ｄ）少なくとも３０週間、
（ｅ）少なくとも３６週間、
（ｆ）少なくとも４０週間、
（ｇ）少なくとも４６週間、
（ｈ）少なくとも４８週間、
（ｉ）少なくとも５０週間、および
（ｊ）少なくとも６０週間
から選択される、請求項９２から９６のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）短期間において、より高頻度の投薬スケジュールで有効量のインターフェロンを前記患者に投与するステップと、
（ｂ）より長い期間において、より低頻度の投薬スケジュールで前記インターフェロンを前記患者に投与するステップと、
を含む、方法。
前記の、より高頻度の投薬スケジュールは、
（ａ）１日に１回、
（ｂ）１日に２回、
（ｃ）１週間に１回、
（ｄ）１週間に２回、
（ｅ）１週間に３回、および
（ｈ）２週間毎に１回
から選択される、請求項９８に記載の方法。
前記の、より低頻度の投薬スケジュールは、前記の、より高頻度の投薬スケジュールよりも低頻度であり、
（ａ）１週間に１回、
（ｂ）１週間に２回、
（ｃ）２週間毎に１回、
（ｄ）３週間毎に１回、および
（ｅ）４週間毎に１回
から選択される、請求項９８または９９に記載の方法。
前記短期間は、
（ａ）１週間、
（ｂ）２週間、
（ｃ）３週間、
（ｄ）４週間、
（ｅ）５週間、
（ｆ）６週間、
（ｇ）７週間、および
（ｈ）８週間
から選択される、請求項９８から１００のいずれか一項に記載の方法。
前記の、より長い期間は、
（ａ）少なくとも１６週間、
（ｂ）少なくとも２０週間、
（ｃ）少なくとも２４週間、
（ｄ）少なくとも３０週間、
（ｅ）少なくとも３６週間、
（ｆ）少なくとも４０週間、
（ｇ）少なくとも４６週間、
（ｈ）少なくとも４８週間、
（ｉ）少なくとも５０週間、および
（ｊ）少なくとも６０週間
から選択される、請求項９８から１０１のいずれか一項に記載の方法。
疾患、障害、または感染を患う患者を治療する方法であって、
（ａ）短期間において、より高頻度の投薬スケジュールで、許容可能な安全性プロフィールを有する最大投薬量のインターフェロンを前記患者に投与するステップと、
（ｂ）より長い期間において、より低頻度の投薬スケジュールで維持投薬量の前記インターフェロンを前記患者に投与するステップと、
を含む、方法。
前記最大投薬量は、
（ａ）前記インターフェロンの標準投薬量と同じ投薬量、
（ｂ）少なくとも前記インターフェロンの標準投薬量である投薬量、
（ｃ）前記インターフェロンの標準投薬量の１倍高い投薬量、
（ｄ）前記インターフェロンの標準投薬量の２倍高い投薬量、
（ｅ）前記インターフェロンの標準投薬量の３倍高い投薬量、
（ｆ）前記インターフェロンの標準投薬量の４倍高い投薬量、
（ｇ）前記インターフェロンの標準投薬量の５倍高い投薬量、
（ｄ）前記インターフェロンの標準投薬量の６倍高い投薬量、
（ｅ）前記インターフェロンの標準投薬量の７倍高い投薬量、
（ｆ）前記インターフェロンの標準投薬量の８倍高い投薬量、
（ｇ）前記インターフェロンの標準投薬量の９倍高い投薬量、および
（ｈ）前記インターフェロンの標準投薬量の１０倍高い投薬量
から選択される、請求項１０３に記載の方法。
前記維持投薬量は、
（ａ）標準投薬量の前記インターフェロンと同じ投薬量
（ｂ）少なくとも標準投薬量の前記インターフェロンである投薬量、
（ｃ）前記最大投薬量の１／４である投薬量、
（ｄ）前記最大投薬量の１／２である投薬量、
（ｅ）前記最大投薬量の１／３である投薬量、
（ｆ）前記最大投薬量の１／８である投薬量、
（ｇ）前記最大投薬量より１倍低い投薬量、
（ｈ）前記最大投薬量より２倍低い投薬量、
（ｉ）前記最大投薬量より３倍低い投薬量、
（ｊ）前記最大投薬量より４倍低い投薬量、
（ｋ）前記最大投薬量より５倍低い投薬量、および
（ｌ）前記最大投薬量より６倍低い投薬量
から選択される、請求項１０３または１０４に記載の方法。
前記の、より高頻度の投薬スケジュールは、
（ａ）１日に１回、
（ｂ）１日に２回、
（ｃ）１週間に１回、
（ｄ）１週間に２回、
（ｅ）１週間に３回、および
（ｆ）２週間毎に１回
から選択される、請求項１０３から１０５のいずれか一項に記載の方法。
前記の、より低頻度の投薬スケジュールは、前記の、より高頻度の投薬スケジュールよりも頻度が低く、
（ａ）１週間に１回、
（ｂ）１週間に２回、
（ｃ）２週間毎に１回、
（ｄ）３週間毎に１回、および
（ｅ）４週間に１回
から選択される、請求項１０３から１０６のいずれか一項に記載の方法。
前記短期間は、
（ａ）１週間、
（ｂ）２週間、
（ｃ）３週間、
（ｄ）４週間、
（ｅ）５週間、
（ｆ）６週間、
（ｇ）７週間、および
（ｈ）８週間
から選択される、請求項１０３から１０７のいずれか一項に記載の方法。
前記の、より長い期間は、
（ａ）少なくとも１６週間、
（ｂ）少なくとも２０週間、
（ｃ）少なくとも２４週間、
（ｄ）少なくとも３０週間、
（ｅ）少なくとも３６週間、
（ｆ）少なくとも４０週間、
（ｇ）少なくとも４６週間、
（ｈ）少なくとも４８週間、
（ｉ）少なくとも５０週間、および
（ｊ）少なくとも６０週間
から選択される、請求項１０３から１０８のいずれか一項に記載の方法。
前記疾患、障害、または感染は、慢性肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、慢性Ｂ型肝炎感染、Ｃ型肝炎感染、慢性Ｃ型肝炎感染、Ｄ型肝炎感染、慢性Ｄ型肝炎感染、ヒトパピローマ感染、単純ヘルペスウイルス感染、外部尖圭コンジローマ、ＨＩＶ、ＨＩＶ感染、腫瘍、癌、固形腫瘍、黒色腫、悪性黒色腫、腎臓癌、肺癌、結腸癌、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、膀胱癌、胃癌、肉腫、エイズ関連カポジ肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脳癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、子宮頸部形成異常、白血病、前白血病、骨髄障害、骨障害、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、血液悪性疾患、血液学的疾患、多発性骨髄腫、細菌感染、化学防御、血小板減少症、多発性硬化症、肺線維症、加齢性黄斑変性症、黄斑変性症、クローン病、神経疾患、関節炎、リウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、骨粗鬆症、骨減少症、破骨細胞形成、線維筋痛、シェーグレン症候群、慢性疲労症候群、熱、出血熱、ウイルス性出血熱、高血糖症、糖尿病、尿崩症、糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ）、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン欠乏、脂質異常症、高ケトン血症、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、または米国疾病対策センターにより特定されるカテゴリＡ、Ｂ、もしくはＣ病原体による感染、あるいはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項９２から１０９のいずれか一項に記載の方法。
前記疾患、障害、または感染は、Ｃ型肝炎またはＢ型肝炎感染である、請求項１１０に記載の方法。
前記疾患または障害は、Ｃ型肝炎またはＨＩＶ感染である、請求項１１１に記載の方法。
前記Ｃ型肝炎は、
（ａ）遺伝子１型、
（ｂ）遺伝子２型、および
（ｃ）遺伝子３型
から選択される遺伝子型である、請求項に１１０または１１１記載の方法。
前記インターフェロンは、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、もしくはインターフェロンω、またはそれらのフラグメントである、請求項９２から１１３に記載の方法。
前記インターフェロンαは、
（ａ）インターフェロンα２ａ、
（ｂ）インターフェロンα２ｂ、
（ｃ）インターフェロンα２ｃ、
（ｄ）コンセンサスインターフェロン、
（ｃ）インターフェロンアルファコン−１、
（ｄ）インターフェロンαｎ１、
（ｅ）インターフェロンαｎ３、および
（ｆ）任意の市販形態のインターフェロンα
から選択される、請求項１１４に記載の方法。
前記市販のインターフェロンαは、
（ａ）ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ、
（ｂ）ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）Ａ、
（ｃ）ベロフォーαインターフェロン、
（ｄ）ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（登録商標）、
（ｅ）ＭＵＬＴＩＦＥＲＯＮ（登録商標）、
（ｆ）ＷＥＬＬＦＥＲＯＮ（登録商標）、
（ｇ）ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）、
（ｈ）ＳＵＭＩＦＥＲＯＮ（登録商標）、および
（ｉ）ＭＡＸＹ−ＡＬＰＨＡ（登録商標）
から選択される、請求項１１５に記載の方法。
前記インターフェロンは、長時間作用型である、請求項１１４に記載の方法。
前記長時間作用型インターフェロンは、
（ａ）アルブミンまたはそのフラグメントもしくは変異体に融合される、インターフェロンまたはそのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質
（ｂ）ＢＥＬＥＲＯＦＯＮ（登録商標）、
（ｃ）インターフェロン−α−ＸＬ、
（ｄ）ＬＯＣＴＥＲＯＮ（登録商標）、
（ｅ）ペグインターフェロンα２ａ、
（ｆ）ペグインターフェロンα２ｂ、および
（ｇ）ペグコンセンサスインターフェロン
から選択される、請求項１１７に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、宿主細胞によって発現され、
（ａ）構築物ＩＤ２２４９、
（ｂ）構築物ＩＤ２３４３、
（ｃ）構築物ＩＤ２３６６、
（ｄ）構築物ＩＤ２３８１、
（ｅ）構築物ＩＤ２３８２、
（ｆ）構築物ＩＤ２４１０、
（ｇ）構築物ＩＤ３１６５、
（ｈ）構築物ＩＤ３４２２、
（ｉ）構築物ＩＤ３４２３、
（ｊ）構築物ＩＤ３４２４、
（ｋ）構築物ＩＤ３４７６、
（ｌ）構築物ＩＤ３９６０、
（ｍ）構築物ＩＤ４２９０、
（ｎ）構築物ＩＤ４２９１、
（ｏ）構築物ＩＤ４２９２、
（ｐ）構築物ＩＤ４２９５、および
（ｑ）構築物ＩＤ４２９６
から選択されるアルブミン融合構築物を含む、請求項１１８に記載の方法。
前記インターフェロンは、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項９２から１１９のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）リバビリンまたはリバビリン類似体、
（ｂ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｃ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｅ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｆ）チアゾライド、
（ｇ）抗ウイルス抗体、
（ｈ）新規免疫調節剤、
（ｉ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｊ）肝臓保護剤、および
（ｋ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項１２０に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、毎日前記患者に投与される、請求項１２０または１２１に記載の方法。
治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体の貯蔵寿命または血清半減期を長期化する方法であって、非融合状態の前記治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体の貯蔵寿命または血清半減期と比べて、前記治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体の貯蔵寿命または血清半減期を長期化するのに十分な、前記治療用タンパク質Ｘまたは治療用Ｘのフラグメントもしくは変異体を、アルブミンまたはアルブミンのフラグメントまたはその変異体に融合するステップを含む、方法。
請求項１２３に記載の前記アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
請求項１２４に記載の核酸分子を含むベクター。
請求項１２４に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンαを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンαは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療未経験であり、（２）前記患者の体重は、少なくとも７５ｋｇであり、（３）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子１型であり、前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約２４００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、２週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量、
（ｄ）約２１００μｇ／投薬量、および
（ｅ）約２４００μｇ／投薬量
から選択される、請求項１２７に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１２７または１２８に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項１２９に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１２９に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１２９に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１３２に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンαを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンαは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療未経験であり、（２）前記患者の体重は、少なくとも７５ｋｇであり、（３）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子１型であり、前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約２４００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、４週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量、
（ｄ）約２１００μｇ／投薬量、および
（ｅ）約２４００μｇ／投薬量
から選択される、請求項１３４に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１３４または１３５に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項１３６に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１３６に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１３６に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１３９に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンαを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンαは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療未経験であり、（２）前記患者の体重は、少なくとも７５ｋｇであり、（３）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子１型であり、前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約２４００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、治療の最初の４週間は２週間毎に１回、その後、４週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、全部で２４から４８週間、前記患者に投与される、請求項１４１に記載の方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量、
（ｄ）約２１００μｇ／投薬量、および
（ｅ）約２４００μｇ／投薬量
から選択される、請求項１４１または１４２に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１４１から１４３のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項１４４に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１４４に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１４４に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１４７に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンαを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンαは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療経験済みであり、（２）前記患者の体重は、少なくとも７５ｋｇであり、（３）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子１型であり、前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約２４００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、２週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量、
（ｄ）約２１００μｇ／投薬量、および
（ｅ）約２４００μｇ／投薬量
から選択される、請求項１４９に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１４９または１５０に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項１５１に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１５１に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１５１に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１５４に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンαを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンαは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療経験済みであり、（２）前記患者の体重は、少なくとも７５ｋｇであり、（３）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子１型であり、前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約２４００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、４週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量、
（ｄ）約２１００μｇ／投薬量、および
（ｅ）約２４００μｇ／投薬量
から選択される、請求項１５６に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１５６または１５７に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項１５８に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１５８に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１５８に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１６１に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンαを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンαは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療経験済みであり、（２）前記患者の体重は、少なくとも７５ｋｇであり、（３）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子１型であり、前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約２４００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、治療の最初の４週間は２週間毎に１回、その後、４週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、全部で２４から４８週間、前記患者に投与される、請求項１６３に記載の方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量、
（ｄ）約２１００μｇ／投薬量、および
（ｅ）約２４００μｇ／投薬量
から選択される、請求項１６３または１６４に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１６３から１６５のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項１６９に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１６６に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１６６に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１６９に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンαを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンαは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療未経験であり、（３）前記患者の体重は、少なくとも７５ｋｇであり、（４）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子２型または３型であり、（５）前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約２４００μｇ／投薬量であり、（６）前記患者は、２週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量、
（ｄ）約２１００μｇ／投薬量、および
（ｅ）約２４００μｇ／投薬量
から選択される、請求項１７１に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１７１または１７２に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項１７３に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１７３に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１７３に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１７６に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンαを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンαは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療未経験であり、（３）前記患者の体重は、少なくとも７５ｋｇであり、（４）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子２型または３型であり、（５）前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約２４００μｇ／投薬量であり、（６）前記患者は、４週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量、
（ｄ）約２１００μｇ／投薬量、および
（ｅ）約２４００μｇ／投薬量
から選択される、請求項１７８に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１７８または１７９に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項１８０に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１８０に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１８０に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１８３に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンαを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンαは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療未経験であり、（３）前記患者の体重は、少なくとも７５ｋｇであり、（４）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子２型または３型であり、（５）前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約２４００μｇ／投薬量であり、（６）前記患者は、治療の最初の４週間は２週間毎に１回、その後、４週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、全部で２４から４８週間、前記患者に投与される、請求項１８５に記載の方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量、
（ｄ）約２１００μｇ／投薬量、および
（ｅ）約２４００μｇ／投薬量
から選択される、請求項１８５または１８６に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１８５から１８７のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項１８８に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１８８に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１８８に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１９１に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンαを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンαは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療経験済みであり、（３）前記患者の体重は、少なくとも７５ｋｇであり、（４）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子２型または３型であり、（５）前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約２４００μｇ／投薬量であり、（６）前記患者は、２週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量、
（ｄ）約２１００μｇ／投薬量、および
（ｅ）約２４００μｇ／投薬量
から選択される、請求項１９３に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１９３または１９４に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項１９５に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１９５に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項１９５に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項１９８に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンαを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンαは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療経験済みであり、（３）前記患者の体重は、少なくとも７５ｋｇであり、（４）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子２型または３型であり、（５）前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約２４００μｇ／投薬量であり、（６）前記患者は、４週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量、
（ｄ）約２１００μｇ／投薬量、および
（ｅ）約２４００μｇ／投薬量
から選択される、請求項２００に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項２００または２０１に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項２０２に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項２０２に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項２０２に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項２０５に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンαを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンαは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療経験済みであり、（３）前記患者の体重は、少なくとも７５ｋｇであり、（４）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子２型または３型であり、（５）前記治療的に有効な量は、約９００μｇ／投薬量から約２４００μｇ／投薬量であり、（６）前記患者は、治療の最初の４週間は２週間毎に１回、その後、４週間毎に１回、前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、全部で２４から４８週間、前記患者に投与される、請求項２０７に記載の方法。
前記治療的に有効な量は、
（ａ）約９００μｇ／投薬量、
（ｂ）約１２００μｇ／投薬量、
（ｃ）約１８００μｇ／投薬量、
（ｄ）約２１００μｇ／投薬量、および
（ｅ）約２４００μｇ／投薬量
から選択される、請求項２０７または２０８に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項２０７から２０９のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項２１０に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項２１０に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項２１０に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項２１３に記載の方法。
成熟アルブミンに融合される成熟インターフェロンα２ｂを含む、治療的に有効な量のアルブミン融合タンパク質でＣ型肝炎感染を患う患者を治療する方法であって、前記成熟インターフェロンα２ｂは、成熟アルブミンのＣ末端において融合され、さらに、（１）前記患者は、治療未経験であり、（２）前記Ｃ型肝炎感染は、遺伝子１型であり、（３）前記治療的に有効な量は、約１２００μｇ／投薬量から約１８００μｇ／投薬量であり、（４）前記患者は、４週間毎に１回投与され、投与後第２週目に追加の投薬量の前記アルブミン融合タンパク質を投薬される、方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、全部で２４から４８週間、前記患者に投与される、請求項２１５に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項２１５または２１６に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、
（ａ）抗ウイルス酵素阻害剤、
（ｂ）ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）非ヌクレオシド類似体抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤、
（ｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、
（ｅ）チアゾライド、
（ｆ）抗ウイルス抗体、
（ｇ）新規免疫調節剤、
（ｈ）サイクロフィリン阻害剤、
（ｉ）肝臓保護剤、および
（ｊ）インターフェロンエンハンサー
から選択される、請求項２１７に記載の方法。
前記抗ウイルス剤は、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項２１７に記載の方法。
前記アルブミン融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つの抗ウイルス剤と併用して投与される、請求項２１７に記載の方法。
前記抗ウイルス剤のうちの１つは、リバビリンまたはリバビリン類似体である、請求項２２０に記載の方法。
前記患者の体重は、少なくとも７５ｋｇである、請求項２１５から２２１のいずれか一項に記載の方法。