JP2008525491A - ポリマー−フォンビルブラント因子結合体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血漿のおよび/または組換えフォンビルブラント因子(VWF)を含むタンパク質性構築物に関し、上記VWFが少なくとも1つの生理学的に許容し得るポリマー分子に結合するとともに、上記タンパク質性構築物と少なくとも1つの第VIII因子(FVIII)タンパク質との複合体と結合する。さらに、本発明は、FVIIIまたはVWFの少なくとも1つの機能的な欠陥または不足を伴う出血障害がある哺乳動物の血液でVWFまたはFVIIIの生体内半減期を延長する方法に関する。
VWFは、哺乳動物の血漿で存在する多量体付着性糖タンパク質であり、複数の生理機能を持つ。一次止血の間、VWFは血小板表面上の特異的な受容体とコラーゲン等の細胞外マトリックス成分と間にメディエーターとして働く。さらに、VWFはプロコアギュラントFVIII用担体を安定させるタンパク質として働く。VWFは、2813個のアミノ酸からなる前駆体分子として血管内皮細胞および巨核球で合成される。前駆体ポリペチド(プレプロVWF)は、成熟血漿VWFで見つかる22残基シグナルペプチド、741残基プロペプチド、および2050残基ポリペチドからなる(非特許文献1)。血漿へ分泌されると、VWFは異なる分子の大きさで多用な種類の形態で循環する。これらのVWF分子は、2050のアミノ酸残基の成熟サブユニットのオリゴマーおよびマルチマーからなる。VWFは、通常、1つのダイマーから最大で50〜100のダイマーからなるマルチマーまでのダイマーとして、血漿で見いだされる(非特許文献2)。ヒト血行内のヒトVWFの生体内半減期は、約12〜20時間である。
凝固FVIII欠乏(別名血友病A)および/またはVWFの質的および定量的欠乏(別名VWD)に対する処置の範囲を広げるための新規の物質が強く求められている。機能性VWFが欠如していることから、VWDを有する患者は、正常値によりも低いFVIII血漿レベルによって示されるFVIIIの二次欠乏を呈する。VWDの型と疾患の重症度とに応じて、これらのFVIIIレベルが変化し得るが、通常、健常なヒトで見出されるFVIII血漿レベルよりも多少低い。
本発明は、血漿および/または組換えフォンビルブラント因子(VWF)またはその生物学的活性誘導体を含むタンパク質性構築物に関し、上記VWFまたは上記その生物活性誘導体が一つ以上の生理学的に許容し得るポリマー分子に結合しており、タンパク質性構築物の生体内半減期が哺乳動物(特にヒト)の血液で長くなる。さらに、本発明は上記タンパク質性構築物と少なくとも1つのFVIII因子(FVIII)タンパク質またはその生物学的活性誘導体との複合体に関し、上記FVIIIタンパク質または上記その上記生物学的活性誘導体の半減期が哺乳動物の血液でも長くなる。また、本発明により、上記タンパク質性構築物または上記複合体を用いたFVIIIおよびVWFの少なくとも1つの機能的な欠陥または欠乏を伴う出血障害がある哺乳動物の血液でVWFまたはFVIIIの生体内半減期を延長する方法と同様に、上記タンパク質性構築物または上記複合体を含む医薬品組成物を提供する。蛋白質様構築物を作る方法も、提供する。
本発明の一態様は、血漿および/または組換えVWFあるいはその生物活性誘導体を含むタンパク質性構築物(また、以下で「ポリマーVWF結合体」と称される)に関し、上記VWFまたは上記その生物活性誘導体が一種類以上の生理学的に許容可能なポリマー分子に結合しており、上記VWFまたは上記その生物活性誘導体の生体内半減期が哺乳動物血液で長くなる。
(a)上記に定義された少なくとも1種類のタンパク質性構築物を提供するステップと、
(b)上記に定義した少なくとも1種類のFVIIIを提供するステップと、
(c)上記タンパク質性構築物と上記FVIIIとの間の複合体を形成するステップと、を有する。
糖質残基(図1B)を介してポリマーVWF結合体を調製するために、rVWF(最終濃度:500μg/ml)の溶液を20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で調製し、NaIO4を糖質残基の酸化のために添加した(5mM最終濃度)。酸化を4℃で20分間行い、亜硫酸水素ナトリウム(5mM最終濃度)を添加して反応を停止させた。その後、mPEGヒドラジド(鎖長:3kD)を添加し(10mM最終濃度)、さらにVWFのPEG付加を室温で1時間行った。次に、PEG付加VWFをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。反応混合物をセファクリルS−300HR(Amersham)充填クロマトグラフィーカラム(寸法26mm×840mm)に加え、PEG付加VWFを20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.4、5%トレハロース含有)を用いて、試薬から分離した。280ナノメートルVWF抗原量およびODの計測によって示されるように、修飾VWFをボイド容量で溶出させた。VWF含有分画を、さらに精製するために、EMD TMAE 650M(Merck)充填陰イオン交換カラムに直接載せた(寸法:10mm×108mm)。次に、PEG付加VWFを20mM HEPES緩衝液(5%トレハロースおよび1000mM NaCl含有)で溶出させた。
リジン残基(図1A)を介したVWFのPEG付加のために、rVWF(最終濃度:500μg/ml)溶液を20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.4、5%ショ糖含有)で調製し、mPEGスクシンイミジルスクシネート(鎖長:5kD)を添加した(10mM最終濃度)。VWFを室温で1時間、PEG付加した。その後、PEG付加VWFをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。反応混合物をセファクリルS−300HR(Amersham)充填クロマトグラフィーカラムに載せ、PEG付加VWFを、PEG付加反応に使用されるのと同じ緩衝系によって分離した。VWF抗原量およびOD280nmの計測によって示されるように、修飾VWFをボイド容量で溶出させた。VWF含有分画を、さらに精製するために、EMD TMAE650M(Merck)充填陰イオン交換カラムに直接載せた(寸法:26mm×840mm)。次に、PEG付加VWFを20mM HEPES緩衝液(5%ショ糖および1000mM NaCl含有)で溶出させた。
mPEG p−ニトロフェニルカーボネートによるVWFのPEG付加のために、血漿由来VWF(最終濃度:500μg/ml)を20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.6、5%ショ糖含有)で調製し、mPEG p−ニトロフェニルカーボネート(鎖長:2kD)を添加した(最終濃度:10mM)。VWFを室温で2時間、PEG付加した。その後、PEG付加VWFをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。反応混合物をセファクリルS−300HR(Amersham)充填クロマトグラフィーカラムに載せ、PEG付加VWFを、PEG付加反応に使用されるのと同じ緩衝系によって分離した。VWF抗原量およびOD280nmの計測によって示されるように、VWFをボイド容量で溶出させた。
mPEGマレイミドによる遊離SH残基を介したVWFのPEG付加のために、rVWF溶液(最終濃度:500μg/m)を20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.6、4%マンノースおよび1%トレハロース含有)で調製し、mPEG マレイミド(鎖長:10kD)を添加した(最終濃度:10mM)。VWFを室温で2時間、PEG付加した。その後、PEG付加VWFをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。反応混合物をセファクリルS−300HR(Amersham)充填クロマトグラフィーカラムに載せ、PEG付加VWFを、PEG付加反応に使用されるのと同じ緩衝系によって分離した。VWF抗原量およびOD280nmの計測によって示されるように、修飾VWFをボイド容量で溶出させた。
6mg/mlのデキストラン(MW40kD)溶液を20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で調製し、NaIO4を添加した(最終濃度10mM)を添加して遊離アルデヒド基を生成した。酸化を暗所で4℃、1時間実施し、亜硫酸水素ナトリウム(最終濃度5mM)を添加して反応を停止させた。活性化デキストランを0.15MNaCl(PBS緩衝液)含有0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)で透析した。次に、この活性化デキストラン溶液2.4mlを10mlのrVWF溶液(濃度:PBS緩衝液中0.6mg/ml)に添加した。この混合物に、5mlのシクラミン酸ナトリウム溶液(PBS緩衝液中64mg/ml)を添加し、暗所で室温、一晩にわたってインキュベートした。次に、3mlの1.0MTRIS−HCl溶液(pH7.2)を添加して残留アルデヒド基をブロックし、室温で1時間インキュベートし、さらに20mM HEPES緩衝液(pH7.4、5%ショ糖含有)でインキュベートした。次に、rVWF誘導体に結合したデキストランをさらに、セファクリルS−300HR(緩衝液:20mM HEPES、5%ショ糖、pH7.4)を充填したクロマトグラフィーカラム(寸法:50mm×860mm)に混合物を載せることで、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。rVWF誘導体を、VWF抗原量およびOD280nmの計測によって示されるように、VWFをボイド容量で溶出させた。これらの分画を回収し、100kDの再生セルロース膜(Millipore)を用いて、限界濾過法によって濃縮した。
Denis et al.(PNAS 95:9524−9529,1998)に詳述されているVWF欠乏マウスを、重度III型VWD類似ヒトVWDモデルとして使用した。マウス5匹からなる群に対して、PEG−rVWF(鎖長3kD、実施例1によるrVWFのPEG付加)または対照としてのネイティブrVWFを、PEG付加後、検出可能なVWF(ELISA)に基づいて、40単位(U)VWF:Ag/kg体重の用量で、経尾静脈ボーラス注入法により投与した。PEG−rVWF群を、注射後5分、30分、1時間、2時間、6時間、10時間、および24時間(対照群の場合、5分、15分、30分、1時間、2時間、4時間、6時間、10時間、および24時間)麻酔し、クエン酸血漿を心臓穿刺から調製した。血漿でVWF抗原量を追跡した。この実験の結果を図2にまとめる。ネイティブrVWFを、文献(Lenting et al.,J.Biol.Chem.279:12102−12109,2004)に記載されているように、典型的な二相法で血行から除去することで、600分と1440分(10時間および24時間に等しい)との間の検出限界以下に落とす。対照的に、注射時の0から注射後10時間の約0.6U/ml血漿までの初期増加後のPEG付加rVWFは、依然として注射後24時間であっても約0.4U/mlの実質的に高いレベルに存在し、10時間ないし24時間の範囲では平坦な勾配となったことから、PEG付加rVWFがより長期にわたって持続することが示される。経時的な計測可能VWFの漸増は、VWFによって結合体を形成したポリマーPEGの結合の可逆性を示すもので、ポリマーからの放出後、計測のためにアクセス可能になる。このモデルでのPEG−VWFの長い循環時間は、この調製物がVWDの予防療法に使用し得ることを示す。
Bi et al.(Nat.Genet.10:119−121,1995)に詳しく記載されているFVIII欠乏マウスを、重度ヒト血友病Aのモデルとして使用した。マウス5匹からなる群に対して、各々をrFVIIIと事前に混合して3UFVIII/mlおよび3UVWF:Ag/mlを達成するためにPEG−rVWF(鎖長3kD、実施例1によるrVWFのPEG付加)またはネイティブrVWFのいずれかによる経尾静脈ボーラス注入法による投与(13ml/kg)を行った。麻酔後、生成物を注射してから5分および6時間後に、心臓穿刺によってクエン酸血漿を各々の群から調製した。対照群に対しては緩衝液を注射し、注射5分後に出血させた。VWF抗原量を血漿サンプルで計測した。この実験の結果を図3にまとめた。曲線は、VWFのベースレベルの近くまで落ち込んだ、FVIII欠乏マウスに存在するrVWFの典型的除去を示し、その一方でPEG付加rVWFの使用後、レベルが6時間の観察期間中に増加したことを示す。このことは再び、ポリマーPEGの結合の可逆性がVWFと結合体を形成したことを示し、ポリマーからの放出の後、計測のためにアクセス可能になり、適用後360分(6時間)経過しても増加を持続することを示している。
Denis et al.(PNAS 95:9524−9529,1998)によって詳述されるフォンビルブラント欠乏マウスを、重度III型VWD類似ヒトVWDモデルとして使用した。4〜5匹のマウスからなる群に対して、PEG−rVWF(鎖長5kD、実施例2によるrVWFのPEG付加)含有20mM HEPES(150mM NaCl、5%ショ糖、pH7.4)またはネイティブrVWFを、尾静脈を経る静脈内注射した。対照群を緩衝液で処置した。(ELISA換算PEG−rVWF−用量18UVWF:Ag/kg、2700μg/kg、rVWFネイティブ用量:2400μg/kg)。
Bi et al.(Nat Genet.10:119−121,1995)に詳しく記載されているFVIII欠乏マウスを、重度ヒト血友病Aのモデルとして使用した。マウス5匹からなる群に対して、各々をrFVIIIと事前に混合して3UFVIII/mlを達成するためにPEG−rVWF(HZ−PEG、3K、糖質を介して結合)またはネイティブrVWFのいずれかによる経尾静脈ボーラス注入法による投与(13ml/kg)を行った。麻酔後、注射してから5分および6時間後に、心臓穿刺によってクエン酸血漿を各々の群から調製した。FVIII活性およびVWF抗原回収量を血漿サンプルで計測した。この実験の結果を図5および図6にまとめた。
FVIII×VWFダブルノックアウトマウスは、FVIII欠乏およびVWF欠乏マウスの交雑育種によって得られた。それらのマウスはVWF欠乏と同様にFVIII欠乏を患う。このように、動物モデルにおけるFVIII−VWF相互作用を研究するための理想的なモデルを提供する。
PEG付加の可逆性を、VWF欠乏血漿による試験管内実験によって示した。クエン酸血漿を、4℃、15分間、1100xgの遠心によって、VWF欠乏マウスから得た(Denis et al.PNAS 95:9524−9529,1998)。4容量のマウス血漿を、実施例1(糖質を経たPEGカップリング)または実施例2(リジン残基を経たPEGカップリング)によって調製し、48時間にわたり37℃に保ち、1容量のPEG付加rVWFと混ぜ合わせた。非PEG付加rVWFが、両方の実験における対照として用いた。副試料を混合直後、ならびに1時間、5.5時間、24時間、および48時間後に回収し、VWF抗原量を、サンドイッチELISAシステムを用いて凍結試料からアッセイした。ポリクローナル抗VWF抗体(DAKO)を用いて、96穴ELISAプレートを被覆し、ヤギ−抗ウサギ−lgG−HRP−結合体(AXELL)を結合VWF因子検出のためにアッセイした。経時的にVWF抗原の増加性量を計測し、生体外血漿サンプルにおける場合も含めVWFに対するポリエチレングリコールの結合の可逆性が示された(図9)。
異なるPEG付加rVWF調製試料のFVIII結合能を、BIACORE(登録商標)3000装置(BIACORE、Uppsala、Sweden)を使用して表面プラズモン共鳴実験によって比較した(Karlsson et Falt,J.Immunol.Methods 200:121−33,1997)。通常、リガンドをセンサチップに固定し、該リガンドに対する他の構成要素の結合を表面プラズモン共鳴によって測定する。この技術の使用によって、チップ表面の近くの溶液の屈折率の変化が計測される。チップの表面の結合した構成要素の濃度変化を信号として検出し、それを任意の共鳴音単位(RU)で表す。固定リガンドに結合したタンパク質量と観察されるRUとのあいだに、比例関係が存在する。PEG付加VWF調製試料を、7000〜9000RUおよび25℃で、NHS/EDC化学を用いて、BIACORE(商標)センサチップのデキストラン表面に25℃で固定した。150mM NaCl、3mM EDTA、および0.005%界面活性剤P20(HBS緩衝液、BIACORE)を含む10mM HEPES緩衝液(pH7.4)を流速15μl/分で使用した。図10に例示されるように、市販のFVIII産物(ADVATE、Baxter AG、Vienna、Austria)の異なる量の結合が計測された。この図は、mPEGマレイミド5000で修飾され、かつ実施例4によって調製されるPEG付加rVWF調製試料のFVIII結合能を示す。異なるPEG付加rVWF調製試料のBIACORE実験の結果を表1にまとめている。この表では、PEG付加rVWF調製試料の異なるFVIII結合能は、10〜20IUFVIII/ml(色素アッセイ)の範囲にある参照の最大レベルでの非PEG付加参照調製試料のRU値の割合として与えられる。
rVWFを、種々の濃度(1mM、2.5mM、5mM、7.5mM、および10mM)でmPEGスクシンイミジルスクシネート(鎖長:5kD)を使用して、実施例2により、PEG付加した。PEG付加VWF種を2つの異なる方法で分析した。すなわち、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびVWFマルチマー分析である。SDSゲル電気泳動を、3〜8%勾配ゲルを使用して還元条件下で行った(Tris Acetat Gel/Bio−Rad)。VWFマルチマー分析を、1.6%のアガロースゲルを使用してRuggeri et Zimmerman(Blood 57:1140−43,1981)により行った。VWFマルチマーの明視化を、Aihara et al.(Thromb.Haemost.55:263−67,1986)によって実施した。
リジン残基(図1A)を介したVWFのPEG付加のために、rVWF(最終濃度:500μg/ml)を、20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.4、5%スクロース含有)で調製し、mPEGスクシンイミジルグルタレート(鎖長:5kD)を添加した(最終濃度:200mgPEGスクシンイミジルグルタレート/mgタンパク質)。つぎに、pH値を0.1MNaOHで7.4に合わせた。VWFを室温で1時間、PEG付加し、実施例2の記載に従って精製した。
Bi et al.(Nat.Genet.10:119−121,1995)に詳しく記載されているFVIII欠乏マウスを、重度ヒト血友病Aのモデルとして使用した。マウス5匹からなる群に対して、各々を組換え型FVIIIと事前に混合して10UFVIII/mlおよび10UVWF/mlを達成するために、実施例2により調製したPEG−rVWF(SS−PEG、5K)またはネイティブrVWFのいずれかによる経尾静脈ボーラス注入法による投与(10ml/kg)を行った。麻酔後、生成物を注射してから5分、3時間、9時間、および24時間後に、心臓穿刺によるクエン酸血漿を調製した。FVIII活性およびVWF抗原回収量を血漿サンプルで計測した。この実験の結果を図13および図14にまとめた。
異なるPEG付加rVWF調製試料のFVIII結合能を、ELISAと色素アッセイシステム(ECA)とを組み合わせ、Bendetowicz et al.(Blood 92:529−538,1998)の方法の変法によって計測した。マイクロタイタープレートを、200μlの2.6μg/mL抗vWFポリクローナル抗体含有50mmol/lNa2CO3/NaHCO3(pH9.6)で覆った。プレートを、PBS−Tween緩衝液(100mM Na2HPO4/KH2PO4、150mM NaCl、pH7.6と0.05%Tween20)で、各ステップの後に洗った。プレートを、0.1%粉ミルク/2mMベンズアミジン含有PBS−Tweenで37℃、1時間にわたりブロックした。VWFの増加量を37℃、25分間にわたり、0.2U/mlrFVIII(ADVATE,Baxter AG,Vienna,Austria)とともにプレインキュベートし、これらの混合物の100μlをプレートに添加した。インキュベーション後、捕獲されたVWFに結合したFVIIIの量を、FVIII色素アッセイ(Technoclone,Vienna,Austria)で計測した。FVIII結合能を、1分内で405nm(dA405)で計測される吸光度の変化として表した。図15は、2つのPEG付加VWF調製試料(両方ともmPEG−スクシンイミジルスクシネート(SS)で修飾)のVWF用量依存性FVIII結合を示す。修飾VWF調製試料のFVIII結合能は、非修飾開始VWF調製試料の%として算出され、PEG−SS−rVWF−1では20%およびPEG−SS−rVWF−2では50%であると算出された。
分枝PEGマレイミドによる遊離SH残基を経たVWFのPEG付加のために組換え型VWF(最終濃度:500μg/ml)の溶液を、20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.6、3%トレハロース含有)によって調製する。次に、NOF社(NOF Europe,Grobbendonk,Belgium)によって供給される分岐mPEGマレイミド(鎖長:20kD)を添加した(最終濃度10mM)。VWFを静かに撹拌しながら室温で2時間にわたり、PEG付加した。その後、PEG付加rVWFを、再生セルロース(Millipore)からなる100kD膜を使用して、限界濾過法/ダイアフィルトレーション(UF/DF)によって、試薬から分離する。
実施例23により、フリン成熟rVWFを調製および精製した。調製試料を50mMリン酸緩衝液(pH6.2)に対して透析し、400μg/mlの濃度まで希釈した。次に、鎖長5kDのmPEGヒドラジド(mPEG Hz)を添加した(濃度:60mg mPEG Hz/mgVWF)。500mM 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)の新しく調製された溶液30μlを、1mlのVWF含有混合物の1mlに添加し、5時間にわたって静かに振とうさせながら室温でインキュベートした。100kD膜(再生セルロース/Millipore)を用いて、20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.4)に対して、UF/DFによりPEG付加rVWFから試薬を分離する。
ポリシアル酸(コロミン酸、CA)によるリジン残基の修飾を、Fernandes et Gregoriadis(Biochim.Biophys.Acta 1341:26−34,1997)およびJennings et Lugowski(J.Immunol.127:1011−1018,1981)に記載のようにして、実施した。0.1MNaIO4含有コロミン酸(濃度:20mg/ml)溶液を暗所、室温で15分間撹拌させて、CAを酸化した。活性化CA溶液1mlあたり2mlのエチレングリコールを添加し、暗所、室温でさらに30分間撹拌した。溶液を一晩にわたって暗所で0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)に対して透析した。その後、この溶液のアリコートをrVWF溶液(400μg/ml)含有0.05Mリン酸ナトリウムに添加し、1mgVWFあたり50mg活性化CAの最終濃度を得た。この混合物を暗所、室温で30分間撹拌した。NaCNBH3を添加し(1mg/mgrVWF)、混合物を暗所、室温で18時間、静かに撹拌しながらインキュベートした。1MTRIS水溶液(pH7.2)を添加し(50μl/mgNaCNBH3)、1時間にわたって撹拌することで反応を停止させた。遊離試薬を、100kD膜(再生セルロース/Millipore)を使用して、UF/DFによりrVWF−ポリシアル酸結合体から分離した。
Sakariassen et al.(J.Lab.Clin.Med.102:522−535,1983)に記載のように、灌流チェンバーを作製し、剪断応力条件下でのrVWFのPEG付加に使用した。rVWF(500μg/ml)含有20mM HEPES(pH7.4、3%トレハロース含有)の溶液を調製した。次に、mPEGスクシンイミジルスクシネート(最終濃度:5mM)を添加し、0.1MNaOHを添加してpHを7.4に調製し、直ちに灌流システムに充填した。次に、PEG付加はSakariassen et al.(J.Lab.Clin.Med.102:522−535,1983に記載のように、灌流条件下で、蠕動ポンプを使用することで、2500秒−1の剪断速度で、室温で行った。
dVWFの調製を、改良を加えたThorell et Blomback(Thromb.Res.35:431−450,1984)により実施した。pdVWFの調製のために、1.5kgのクリオプレシピテートを20ないし30℃で6リットルの水に溶解した。1時間撹拌させた後に、フィブロネクチン沈殿物を遠心によって除去した。上清1リットルあたり8gNaClを添加し、溶液を室温まで温め、ウイルスを失活させるためにSDストック試薬(1%Tween80+0.18%アセチルトリエチルシトレート最終濃度)を添加した。
PdVWFを実施例21により調製し、20mM HEPES緩衝液(pH7.4)(150mM NaClおよび3%ショ糖を含む)で希釈し、最終濃度を400μg/mlとする。次に、mPEGスクシイミジルスクシネート(鎖長:5kD)を添加し(濃度:10mgPEGSS5000/mg VWF)、pdVWFを室温で、1時間にわたりPEG付加した。次に、再生セルロース(Millipore)からなる100kD膜を使用して、UF/DFによって、PEG付加rVWFから試薬を分離した。
rFVIII発酵および精製プロセス由来の抗FVIII抗体カラムのフロースルー分画の143kgを、Schlokat et al.(Biotechnol.Appl.Biochem.24:257−267,1996)に記載のように、プロペプチド除去のためにフリンで処理し、滅菌濾過した。このプロセスは、初期の研究に基づいた(Fischer et al.,FEBS Lett.375:259−262,1995;Fischer et al.PCT/AT98/00034[WO98/38219],1−33,1998,18−2−1998 and Kaersgaard et Barington,J.Chromatogr.B 715:357−367,1998)。
フリン成熟VWFを実施例23により調製し、20mM HEPES緩衝液(pH7.4)(150mM NaClおよび3%ショ糖を含有)に対して透析した。次に、溶液を20mM HEPES緩衝液(pH7.4)(150mM NaClおよび3%ショ糖を含有)により最終濃度を300μg/mlに希釈した。続いて、mPEGスクシミジルスクシネート(鎖長:5kD)を添加し(濃度:25mgPEGSS5000/mgVWF)、フリン成熟VWFを室温で1時間にわたってPEG付加した。次に、再生セルロース(Millipore)からなる100kD膜を使用して、UF/DFによって、PEG付加VWFから試薬を分離した。
実施例12および図15に記載のように、フリン成熟rVWFのFVIII結合能を表面プラズモン共鳴技術およびECAによって測定した。結果を、実施例21によって調製されるアルブミンを含まない血漿由来VWF調製試料と比較した。
グルタルアルデヒドを架橋試薬(Migneault et al.,Biotechniques 37:790−796,2004)として用いたrVWFとポリシアル酸(コロミン酸)との結合のために、コロミン酸(濃度:20mg/ml)含有20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.4)の溶液4mlを調製し、0.1MNaOHを添加してpHを7.4に合わせた。グルタルアルデヒドを添加して最終濃度を0.01%にした。続いて、rVWF(400μg/ml)含有20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.4)の溶液1mlを100μlのアリコートに添加し、混合物を静かに振とうさせながら1時間インキュベートした。次に、混合物を透析し、トレハロースを添加し(最終濃度:3%)、rVWFポリシアル酸結合体を限界濾過法によって濃縮した。
Denis et al.(PNAS 95:9524−9529,1998)により記載されたVWF欠乏マウスを、ヒトVWDの動物モデルとして使用した。マウス5匹からなる群に対して、100UVWF:Ag/kgを達成するために、実施例19により調製したrVWFポリシアル酸結合体またはネイティブrVWFのいずれかをボーラス注入法(10ml/kg)によって経尾静脈により投与した。麻酔後の心臓穿刺によるクエン酸血漿は、注射後5分、1、3、6、9、および21時間で、それぞれの群から調製した。VWF抗原回収および内因性マウスFVIII活性レベルを血漿サンプルで計測した。この実験の結果は、図21および図22にまとめられている。
rVWF溶液(400μg/ml)を0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)に調製し、mPEGプロピオンアルデヒド(5kDa鎖長)を添加して最終濃度を1mgVWFあたり10mgのmPEGプロピオンアルデヒドとする。この混合物を30分間撹拌する。つぎに、NaCNBH3を添加し(1mg/mgのrVWF)、混合物を静かに撹拌させながら室温で15時間にわたりインキュベートする。1MのTRIS水溶液(pH7.2)を添加し(1mgのNaCNBH3あたり50μl)、1時間にわたって撹拌することで反応を停止させる。その後、PEG付加rVWFは、100kD膜(再生セルロース/Millipore)を使用している限界濾過法/ダイアフィルトレーションによって、試薬から分離される。
rVWFのN末端PEG付加をLee et al.(Pharm.Res.20:818−825,2003)の記載のように行う。rVWF溶液(最終濃度:500のμg/ml)を50mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)に調製し、mPEGプロピオンアルデヒド(鎖長:5kD)を添加した(濃度:10mg mPEGプロピオンアルデヒド/mgVWF)。PEG付加を、還元剤として2mMのNaCNBH3の存在下、室温で24時間にわたって行う。その後、PEG付加rVWFを、100kD膜(再生セルロース/Millipore)を使用して限界濾過法/ダイアフィルトレーションにより試薬から分離される。
RVWFを、実施例2によりmPEGスクシンイミジルスクシネート(鎖長:5kD)で、リジン残基を経てPEG付加する。PEG付加を1時間にわたって室温で行い、遊離試薬を、100kD膜(再生セルロース/Millipore)を使用して20mM HEPES緩衝液(pH7.4、5%サッカロース)に対してUF/DFによりrVWFPEG結合体から分離する。次に、溶液のpH値を、0.1MNaOHで7.6に合わせ、mPEGマレイミド(10mM鎖長5kD/最終濃度)を加えて、遊離SH基のPEG付加を行う。静かに振とうしながら、室温で2時間にわたってPEG付加を行う。次に、試薬を再び、100kD膜(再生セルロース/Millipore)を使用して反応混合物から分離する。
Avigad et al.(J.Biol.Chem.237:2736−43,1962)に記載のように、アルデヒド基を生じさせるrVWFの糖質残基(Wilchek et Bayer,Meth.Enzymol.138;429−442,1987)の酵素酸化を、Dactylium dendroides(Sigma)由来のガラクトースオキシダーゼを使用して行う。得られた溶液を、50mMリン酸緩衝液(pH7.2)に対して透析し、希釈してVWF濃度を400μg/mlにする。次に、鎖長5kDのmPEGヒドラジド(mPEG Hz)(最終濃度:40mg mPEG−Hz/mg VWF)を添加する。混合物を静かに振とうさせながら室温で3時間インキュベートする。試薬を、100kD膜(再生セルロース/Millipore)を使用して、5%のサッカロース含有20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.4)に対して、UF/DFによりPEG付加rVWFから分離する。
非修飾FVIII結合部位を持つPEG付加rVWFを調製するために、rFVIII(200U/ml)およびrVWF(40U VWF:Ag/ml)を含む50mM HEPES緩衝液(50mM HEPES、150mM NaCl、2%トレハロース、pH7.4)の溶液3mlを調製して、37℃で1時間インキュベートする。混合物を、室温まで冷やし、PEGスクシンイミジルスクシネート(PEG−SS/鎖長:5kD)を添加し(最終濃度:1mgPEG−SS/UVWF:Ag)、静かに振とうさせながら1時間インキュベートする。次に、CaCl2を静かに振とうさせながら添加することで、最終濃度で400mMを得る。この溶液を、セファクリルS−400HR(Amersham)充填クロマトグラフィーカラム(2.6×80cm)に載せ、FVIIIの遊離結合部位を持つPEG付加rVWFを、サイズ排除クロマトグラフィー(溶離緩衝液:50mM HEPES緩衝液、400mM CaCI2、pH7.4)によって、rFVIIIから分離する。
rVWF(300μg/ml)含有50mM HEPES緩衝液(pH7.4)の溶液5mlを調製し、同一緩衝液のヘパリンセファロースCL−6B懸濁液(Amersham Bioscience)2mlに添加する。この混合物を静かに振とうさせながら2時間にわたってインキュベートし、VWFをゲルに結合させる(de Romeuf et Mazurier,Thromb.Hamost.69:436−440,1993)。その後、mPEGスクシンイミジルスクシネート(200mg/mgのVWF)を混合物に加え、静かに振とうさせなら、PEG付加を室温で1時間行う。混合物を等量の2MNaCl含有HEPES緩衝液(pH7.4)で希釈する。ゲルを濾過によって上清から分離する。次に、ゲルは2mlHEPES緩衝液(pH7.4)(20mM HEPES、1MNaCl)で3回洗浄し、上清および洗い溶液を組み合わせる。続いて、PEG付加VWFを含む溶液を限界濾過法によって濃縮し、再生セルロース(Millipore)からなる100kD膜を用いて20mM HEPES緩衝液(pH7.4)(150mM NaCl、3%のサッカロース)に対して透析する。得られた誘導体は、バイアコア技術またはECA試験(試験システムは、米国仮特許出願第60/668,378号(2005年4月4日出願)に記載されている)の使用によって、完全なFVIII結合能を示す。
ヒアルロン酸(HA)によるリジン残基の修飾を、Sigma(C53747)から得られるヒアルロン酸を使用して還元性アミノ化によって行った。HAを、新たに調製された0.1MのNaIO4溶液に溶解して最終濃度を5mgHA/mlにした。次に、静かに撹拌させながら15分間にわたり酸化を行った。1mlの酸化HA溶液に対して2mlのエチレングリコールを添加し、室温、暗所で30分間さらに撹拌することで、反応を停止させた。溶液を、0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)に対して、暗所4℃で一晩透析を行った。続いて、この溶液のアリコートを、0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2))からなるrVWF溶液(40UVWF:Ag/ml)に添加して、最終濃度50mgの活性化HA/mgタンパク質を得た。この混合物を、暗所、室温で120分間にわたり撹拌した。NaCNBH3を添加し(1mg/mgタンパク質)、混合物を静かに振とうさせながら、18時間、室温でインキュベートした。つぎに、100μlの1MTris緩衝液(pH7.2)をこの混合物1mlに対して添加し、1時間にわたり撹拌することで、反応を停止させた。遊離試薬を、100kD膜(再生セルロース/Millipore)を使用して、UF/DFによりrVWFHA結合体から分離した。
実施例19によりRVWFをポリシアル化した。この実施例に記載のパラメーター、例えば等電点電気泳動(図20)、実施例16によるECA試験(54%)および実施例12による表面プラズモン共鳴(70%)によってFVIII結合能の測定に加えて、比率VWF:RCo/VWF:Agを算出した。VWF抗原量を、市販のアッセイシステム(Asserachrom vWF,Roche,Basel,Switzerland)を用いて側定した。Macfarlane et al.(Thromb.Diath.Haemorrh 34:306−308,1975)に記載のように、調製試料の機能的な活性をリストセチンコファクターアッセイで測定した。rVWF出発原料に関して算出される0.39という比率の値は、ポリシアル酸付加後に減少して0.13となる。
成熟rVWF(35UVWF:Ag/ml)含有20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.4、0.5%ショ糖含有)の溶液を実施例23により調製した。次に、静かに撹拌させながら、NOF会社(NOF Europe,Grobbendonk,Belgium)によって供給される分枝mPEGスクシンイミジルグルタレート(PE−SG/鎖長:20kD)を、この溶液に添加し(5mgPEG−SG/mgタンパク質)、0.5MNaOHを滴加することでpH値を7.4に合わせた。次に、室温で1時間、静かに撹拌させながらPEG付加を行った。続いて、反応混合物を平衡イオン交換クロマトグラフィー樹脂(Fractogel EMD TMAE 650M)含有20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.4、0.5%ショ糖含有)に載せた。次に、このカラムを20CV平衡化緩衝液で洗い、PEG付加rVWFを溶離緩衝液(20mM HEPES、0.5MNaCl、0.5%ショ糖、pH7.4)で溶出した。溶出液を、20mMのHEPES、150mMのNaCl、0.5%ショ糖、pH7.4からなる緩衝系を用い、再生セルロースからなる膜および100kD分子量カットオフで、限界濾過法/ダイアフィルトレーションにより濃縮した。得られたPEG付加誘導体のVWF:RCo/VWF:Ag 比は、rVWF出発材料(VWF:Rco/VWF:Ag比:0.89)と比較して、わずかに減少して0.79であった。また、PEG付加rVWF出発原料のFVIII結合能は、ECA試験(実施例16)で計測されたように、83%であった。
FVIII欠乏マウス(Bi et al.,Nat.Genet.10:119−121,1995)を、重度ヒト血友病Aのモデルとして使用した。マウス5匹からなる群に対して、PEG−rVWF(分岐PEG,SG)およびrFVIIIの混合物またはネイティブrVWFおよびrFVIIIの混合物を経尾静脈によるボーラス注入法(10ml/kg)によって投与することで、30UFVIII/mlおよび25UVWF/mlを達成した。注射後5分、3、9、24、および32時間、麻酔後の心臓穿刺によってそれぞれの群からクエン酸血漿を調製した。FVIII活性およびVWF抗原回収濃度を血漿サンプルで計測した。VWFおよびFVIIIの抽出曲線を図23および図24に示す。VWF半減期は1.4から9.7時間へと増大し、VWFのAUCは11.8から49.2U*h/mlに増加した。FVIIIの半減期は、1.2時間(ネイティブrVWF存在下)から4.4時間(PEG−rVWFとともに適用)へと増大し、血中濃度時間曲線下面積(AUC)が12.1から30.5U*h/mlへと増大した。
FVIII欠乏K.O.マウス5匹からなる群に対して、PEG−rVWF(25mg分岐PEG−SG20000/mgタンパク質)とrFVIII(A:20IUPEG−rVWF/ml+20IUFVIII/ml、B:10IUPEG−rVWF/ml+20IUFVIII/ml、C:3IUPEG−rVWF/ml+20IUFVIII/ml)の種々の混合物を経尾静脈によるボーラス注入法(10ml/kg)によって投与した。PEG付加rVWFについて、算出された比率は3モルPEG/moleリジンであった。異なるPEG−rVWF/rFVIII混合物において等量(単位換算)のPEG−rVWFとrFVIIIとを比較すると、以下のPEG/FVIII比が算出された。すなわち、3:1(A)、1.5:1(B)、0.45:1(C)である。麻酔後、クエン酸血漿を注射後5分、1、3、9、および24時間で、それぞれの群から心臓穿刺によって調製した。FVIII半減期(A:2.1時間(B):2.0時間、および(C):2.5時間)とAUC(A:18.9(B):14.5、およびC:13.2U*hr/ml)との間に関連した違いは見出されなかった。FVIIIの抽出曲線を図25に示す。
FVIII×VWFダブルノックアウトマウスを、FVIII欠乏マウスとVWF欠乏マウスとの交雑育種によって得た。それらのマウスは、VWF欠乏と同様にFVIII欠乏を患う。FVIII×VWFダブルノックアウトマウス5匹からなる群に対して、ネイティブrVWF/rFVIII(100/150IU/kg)混合物、PEG付加rVWF#AとrFVIIIとの混合物(100/150IU/kg)、あるいはPEG付加rVWF#BとrFVIIIとの混合物(150/150IU/kg)を経尾静脈により注入した。PEG−rVWF#A(5mg PEG−SS 5000/mgタンパク質)およびPEG−rVWF#B(20mg PEG−SS 5000/mgタンパク質)を実施例24により調製した。調製試料#Aに関しては、算出された比率は2.5molePEG/moleリジンであった。調製試料#Bに関しては、算出された比率は10molePEG/moleリジンであった。このクエン酸血漿に関して、試料適用後5分、1、3、9、および24時間、試料を調製した。VWF:Agの血漿レベルおよびFVIII活性を計測し、最大血漿レベルのパーセントに概ね注射後5分で達する。VWFおよびFVIIIの抽出曲線を、それぞれ図26および図27に示す。半減期は、PEG−rVWF #Aおよび#Bに関して、それぞれ6.3時間および8.1時間であった。ネイティブrVWFに関しては、算出された半減期は2.0時間であった。PEG付加rVWF両方の正規化AUC(%最大×h)は、360%*h(ネイティブrVWF)から901%*h(#A)および1064%*h(#B)へと増大した。同時注入されたrFVIIIの循環時間は、ネイティブVWFと比較してPEG付加rVWFによって改善された。FVIIIの半減期は、ネイティブrVWFの存在下で0.8時間であって、それぞれPEG付加rVWF#Aおよび#Bが注入される場合、1.5および1.8時間へと増大した。FVIIIのAUCは、214、370、および358%*hであった。
VWFダイマー(58IUのVWF:Ag/ml)(組換えCHO細胞株の条件培地から精製(Baxter BioScience))を20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.4、0.5%ショ糖)で調製した。NOF社から供給された分岐mPEGスクシンイミジルグルタレート(PE−SG/鎖長:20kD)を、静かに撹拌しながらこの溶液に添加し(5mgPEG−SG/mgタンパク質)、0.5MNaOHを滴加してpH値を7.4に合わせた。PEG付加を、室温で1時間、静かに撹拌させながら行った。続いて、反応混合物を、反応混合物を平衡イオン交換クロマトグラフィー樹脂(Fractogel EMD TMAE 650M)含有20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.4、0.5%ショ糖含有)に載せた。次に、カラムを20CV平衡化緩衝液で洗い、過剰の試薬を取り除いた。PEG付加rVWFダイマーを溶離緩衝液(20mM HEPES、0.5MNaCl、0.5%ショ糖、pH7.4)で溶離させた。溶出液を、20mM HEPES、150mM NaCl、0.5%ショ糖、pH7.4からなる緩衝系を使用し、再生セルロース(Millipore)からなる膜および100kD分子量カットオフで、限界濾過法/ダイアフィルトレーションによって濃縮した。
成熟rVWFを、実施例23により精製した。精製手法は、イオン交換クロマトグラフィーステップおよびスペローズ6上での最終ゲル濾過ステップを含むもので、該手法を20mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4で実行し、高マルチマーrVWF(17のマルチマー)がボイド容量で溶出した。VWFマルチマー分析を、1.0%のアガロースゲルを使用してRuggeri and Zimmerman(Blood 57:1140−43,1981)により行った。低マルチマーrVWF調製試料(6マルチマー)がサイド分画から得られ、より高い持続時間で溶離した。0.5%のショ糖pH7.4を加えることにより、この分画を安定化させた。次に、低マルチマーrVWFを、mPEGスクシンイミジルスクシネート(PEG−SS)を使用してPEG付加した。PEG−SSを、静かに撹拌させながらこの溶液に添加し(5mgPEG−SS/mgタンパク質)、0.5MNaOHを滴加することでpH値を7.4に合わせた。PEG付加を、室温で1時間、静かに撹拌させながら行った。その後、20mM HEPES、150mM NaCl、0.5%ショ糖、pH7.4からなる緩衝系を用いて過剰試薬を、再生セルロースからなる膜および100kDの分子量カットオフで、限界濾過法/ダイアフィルトレーションによって除去した。実施例16によるECAアッセイによって測定されるFVIII結合能は、出発原料の49%からPEG付加調製試料の34%まで、わずかに減少した。低マルチマーrVWFについて計測されたVWF:RCo/VWF:Ag比率の値は、0.02であり、PEG付加手法の影響を受けなかった。
クロマトグラフィーカラム(15mm×148mm)をヘパリンハイパーD(Bio−Sepra)で充填し、20mM HEPES、68mM NaCl、0.5%ショ糖、pH7.4からなる平衡化緩衝液で平衡させた。次に、成熟rVWF(48IUVWF:Ag/ml)含有20mM HEPES(150mM NaCl、0.5ショ糖)の溶液をH2Oで希釈することで伝導率を7〜8mS/cmとし、線流速1.5cm/分を使用してカラム上に載せた。その後、NOF社(NOF Europe,Grobbendonk,Belgium)によって供給された分枝mPEGスクシンイミジルグルタレート(鎖長:20kD)を新たに15mlの平衡化緩衝液に溶かし、最終濃度を5mgPEG−SG/mg結合タンパク質とした。次に、この試薬液をカラム上にポンプで送り、PEG付加を静的条件下で2時間行った。次に、0.05%リジンを含む10CV平衡化緩衝液でカラムを洗った。次に、保護されたFVIII結合エピトープによるPEG付加rVWFを20mM HEPES、1MNaCl、0.5%ショ糖、pH7.4からなる緩衝液で溶出させた。最終的に、再生セルロース(Millipore)からなる100kD膜を使用して、20mM HEPES緩衝液(pH7.4、150mM NaCl、0.5%ショ糖)に対する限界濾過法/ダイアフィルトレーションによって、この溶液を濃縮した。得られた誘導体のVWF:RCo/VWF:Ag比率は0.48であり、rVWF出発原料(比率0.47)と同一であった。実施例36に記載の分枝PEG−SG20000によるrVWFのPEG付加手法と対照的にFVIII結合能は、ECA試験(実施例16)によって計測されるように、FVIIIエピトープキャッピングでこのPEG付加手法に影響を受けなかった。
成熟rVWFを、実施例23によって精製する。次に、このrVWF(40UVWF:Ag/ml)含有20mM HEPES緩衝液(150mM NaCl、pH7.4、0.5%ショ糖含有)の溶液を、調製する。続いて、PEG付加は、静かに撹拌させながら、mPEG−(カルボキシメチル)−3−ヒドロキシ−ブタン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(鎖長:5kD)をこの溶液に加えることによって行い(5mgのPEG試薬/mgタンパク質)、0.5MNaOHを滴加することでpH値を7.4に合わせた。次に、PEG付加反応を、室温で1時間、静かに撹拌させながら行った。その後、20mM HEPES、150mM NaCl、0.5%ショ糖、pH7.4からなる緩衝系を用いて過剰試薬を、再生セルロースからなる膜および100kDの分子量カットオフで、限界濾過法/ダイアフィルトレーションによって、PEG付加rVWFから分離した。
Claims (140)
- タンパク質性構築物であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子と、
(b)該VWF分子に結合した少なくとも1つの生理学的に許容可能なポリマー分子と、を含み、
該構築物が少なくとも1つの第VIII因子(FVIII)分子またはFVIIIの生物活性誘導体に対する結合能を有し、該構築物の生体内半減期がVWF分子の生体内半減期と比較して増大している、タンパク質性構築物。 - 前記構築物の生体内半減期がVWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも約1.5倍増大している、請求項1に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物の生体内半減期がVWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも約2倍増大している、請求項1に記載のタンパク質性構築物。
- 前記少なくとも1つの生理学的に許容可能なポリマー分子が前記VWFまたは前記VWFの生物活性誘導体の糖質残基に結合している、請求項1に記載のタンパク質性構築物。
- 前記少なくとも1つの生理学的に許容可能なポリマー分子が前記VWFまたは前記VWFの生物活性誘導体のリジン残基に結合している、請求項1に記載のタンパク質性構築物。
- 前記生理学的に許容可能なポリマー分子は、ポリ(アルキレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィンアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリルアミド)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリレート)、ポリ(サッカライド)、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファスファゼン、ポリオキサゾリン、およびポリ(N−アクリロイルモルホリン)からなる群から選択される、請求項1に記載のタンパク質性構築物。
- 前記生理学的に許容可能なポリマー分子がポリエチレングリコール(PEG)またはその誘導体である、請求項1に記載のタンパク質性構築物。
- 前記生理学的に許容可能なポリマー分子がポリシアル酸(PSA)またはその誘導体である、請求項1に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物に含まれる前記VWFが、VWFの一次止血における生物学的活性を保持し、前記生物学的活性が、血小板上の受容体に対する結合および細胞間マトリックス成分上の受容体に対する結合を含み、前記成分がコラーゲンを含む、請求項1に記載のタンパク質性構築物。
- タンパク質性構築物であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子と、
(b)前記VWF分子に結合した少なくとも1つの生理学的に許容可能なポリマー分子と、を含み、
該構築物が少なくとも1つのFVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体に対する結合能を有し、該構築物に結合した該FVIII分子の生体内半減期が、該構築物とは結合していないFVIII分子の生体内半減期と比較して増大している、タンパク質性構築物。 - 前記構築物に結合した場合、前記FVIII分子の生体内半減期が、前記構築物とは結合していないFVIII分子の生体内半減期と比較して、少なくとも約1.5倍増大している、請求項10に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物に結合した場合、前記FVIII分子の生体内半減期が、前記構築物とは結合していないFVIII分子の生体内半減期と比較して、少なくとも約2倍増大している、請求項10に記載のタンパク質性構築物。
- 前記VWFまたは前記その生物活性誘導体が組換え産物である、請求項1または10に記載のタンパク質性構築物。
- 請求項1または10に記載のタンパク質性構築物および少なくとも1つのFVIII分子またはその生物活性誘導体を含む、複合体。
- 前記FVIII分子またはその生物活性誘導体が組換え産物である、請求項14に記載の複合体。
- FVIIIの機能的な欠陥または欠乏に関連した出血性障害を持つ哺乳動物血液中でのFVIIIまたはその生物活性誘導体の生体内半減期を延長させるための方法であって、
(a)請求項1または10に記載の少なくとも1つのタンパク質性構築物の第1の用量を該哺乳動物に対して投与するステップと、
(b)少なくとも1つのFVIII分子またはその生物活性誘導体の第1の用量を該哺乳動物に対して投与するステップと、
を含む、方法。 - FVIIIおよびVWFのうちの少なくとも1つの機能的な欠陥に関連した出血性障害を持つ哺乳動物血液中でのFVIIIまたはその生物活性誘導体の生体内半減期およびVWFまたはその生物活性誘導体の生体内半減期を延長させるための方法であって、
(a)請求項1または10に記載の少なくとも1つのタンパク質性構築物の第1の用量を該哺乳動物に対して投与するステップと、
(b)少なくとも1つのFVIII分子またはその生物活性誘導体の第1の用量を該哺乳動物に対して投与するステップと、
を含む、方法。 - FVIIIおよびVWFのうちの少なくとも1つの機能的な欠陥または欠乏に関連した出血性障害を持つ哺乳動物血液中での第VIII因子(FVIII)またはその生物活性誘導体およびVWFまたはその生物活性誘導体の生体内半減期を延長させるための方法であって、
(a)請求項1または10の少なくとも1つのタンパク質性構築物を提供するステップと、
(b)少なくとも1つのFVIII分子またはその生物活性誘導体を提供するステップと、
(c)前記タンパク質性構築物と前記FVIII分子またはその生物活性誘導体との間で複合体を形成するステップと、
を含む、方法。 - FVIIIの機能的な欠陥に関連した出血性障害またはFVIIIの機能的な欠陥もしくは欠乏に関連した障害を持つ哺乳動物血液中での第VIII因子(FVIII)またはその生物活性誘導体の生体内半減期を延長させるための方法であって、
(a)請求項1または10に記載の少なくとも1つのタンパク質性構築物を提供するステップと、
(b)少なくとも1つのFVIII分子またはその生物活性誘導体を提供するステップと、
(c)該タンパク質性構築物と該FVIII分子またはその生物活性誘導体との間で複合体を形成するステップと、
を含む、方法。 - ステップ(c)の複合体を前記哺乳動物に投与する、請求項18または19に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのFVIII分子またはその生物活性誘導体を、前記タンパク質性構築物と同時に投与する、請求項16または17に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのFVIII分子またはその生物活性誘導体を、前記タンパク質性構築物の投与前または投与後に、逐次投与する、請求項16または17に記載の方法。
- 医薬組成物であって、
請求項1、2、3、または6に記載のタンパク質性構築物の有効量と、
薬学的に許容可能な担体、希釈剤、塩、緩衝液および賦形剤からなる群から選択される一つ以上の化合物と、
を含む、医薬品組成物。 - 医薬組成物であって、
請求項10、11、または12に記載のタンパク質性構築物の有効量と、
薬学的に許容可能な担体、希釈剤、塩、緩衝液および賦形剤からなる群から選択される一つ以上の化合物と、
を含む、医薬品組成物。 - 複合体であって、
(a)タンパク質性構築物であって、
(i)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子と、
(ii)該VWF分子に結合した少なくとも1つの生理学的に許容可能なポリマー分子とを含む、タンパク質性構築物と、
(b)該タンパク質性構築物に結合した少なくとも1つのFVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体と、
を含み、
前記複合体の生体内半減期が、VWFに結合したFVIIIの生体内半減期と比較して、増大している、複合体。 - 前記複合体の生体内半減期が、VWFに結合したFVIIIの生体内半減期と比較して、少なくとも約1.5倍増大している、請求項25に記載の複合体。
- 前記複合体の生体内半減期が、VWFに結合したFVIIIの生体内半減期と比較して、少なくとも約2倍増大している、請求項25に記載の複合体。
- VWF分子と、該VWF分子上の少なくとも1つの糖質残基に共有結合したPEG部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子を提供するステップと、
(b)該VWF分子上の糖質残基を酸化するステップと、
(c)該糖質残基を、ヒドラジド基含有PEG試薬と接触させるステップと、
(d)該試薬PEGヒドラジドを該VWF上の少なくとも1つの糖質残基と共有結合させることにより、前記構築物を形成させるステップとを含み、
前記構築物の生体内半減期がVWF分子の生体内半減期と比較して増大しており、
前記構築物が、少なくとも1つのFVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体に結合することが可能である、方法。 - 前記酸化ステップ(b)が化学的酸化剤を使用して実行される、請求項28に記載の方法。
- 前記化学的酸化剤がNaIO4である、請求項29に記載の方法。
- 前記酸化ステップ(b)が酵素的酸化剤を使用して実行される、請求項28の方法。
- 前記酵素的酸化剤がガラクトースオキシダーゼである、請求項31に記載の方法。
- 前記PEG試薬が、直鎖状アルコキシPEG、直鎖状二官能性PEG、分岐状PEG、マルチアームPEG、フォーク状PEG、ポリオール核に結合したPEG、樹状PEG、安定な結合を有するPEG、分解可能な結合を有するPEG、および加水分解可能な結合を有するPEGからなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記PEG試薬が、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、およびブロックトリポリマーからなる群から選択される内部構造を有する、請求項33に記載の方法。
- 請求項28に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも約1.5倍増大している、請求項35に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも約2倍増大している、請求項35に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも約1.5倍増大している、請求項35に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも約2倍増大している、請求項35に記載のタンパク質性構築物。
- 前記PEG試薬が約0.1〜約200mg PEG/mg VWFタンパク質の比率で提供される、請求項28に記載の方法。
- 前記PEG試薬が約1.0〜約25mg PEG/mg VWFタンパク質の比率で提供される、請求項28に記載の方法。
- VWF分子と、該VWF分子上の少なくとも1つの一級アミノ基に共有結合したPEG部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子を提供するステップと、
(b)該VWF分子上の該一級アミノ基をPEG試薬と接触させるステップと、
(c)該PEG試薬を該VWF上の該一級アミノ基と共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップとを含み、
該構築物の生体内半減期がVWF分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも1つのFVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体に結合することが可能である、方法。 - 前記一級アミノ基が、前記VWF分子のリジン残基上に含まれる、請求項42に記載の方法。
- 前記一級アミノ基が、前記VWF分子のN末端上に含まれる、請求項42に記載の方法。
- 前記PEG試薬が、N−ヒドロキシスクシンイミド−エステル、PEGカーボネート、カルボキシル基含有PEG誘導体、およびアルデヒド基含有PEG誘導体からなる群から選択される、請求項42に記載の方法。
- 前記試薬が、PEG−スクシンイミジルスクシネート、PEG−スクシンイミジルグルタレート、PEG−スクシンイミジルブタノエート、PEG−スクシンイミジルヘキサノエート、分解性PEG試薬、および加水分解性PEG試薬からなる群から選択されるN−ヒドロキシスクシンイミド−エステルである、請求項45に記載の方法。
- 前記試薬が、p−ニトロフェニルカーボネートまたはスクシンイミジルカーボネートであるPEGカーボネートである、請求項45に記載の方法。
- 前記試薬が、水溶性カルボジイミドの使用によって一級アミノ基に連結することができるカルボキシル基を含むPEG誘導体の群から選択される、請求項45に記載の方法。
- 前記試薬がPEGプロピオンアルデヒドであり、還元性アミノ化によって一級アミノ基に連結することができる、請求項45に記載の方法。
- VWF分子と、該VWF分子上の少なくとも1つの一級アミノ基に、還元的アミノ化によって共有結合したPEG部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子を提供するステップと、
(b)溶液中で該VWF分子上のリジン残基をアルデヒド基含有PEG試薬と接触させてシッフ塩基を形成するステップと、
(c)該溶液を還元剤と接触させて二級アミド結合を形成するステップと、
(d)該PEG試薬を前記VWF分子に共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップと、
を含み、
該構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも1つの第VIII因子(FVIII)分子またはFVIIIの生物活性誘導体と結合することができる、方法。 - 前記還元剤がNaCNBH3である、請求項50に記載の方法。
- 前記一級アミノ基が前記VWF分子上のN末端アミノ基であり、該N末端アミノ基が選択的にPEG付加されている、請求項50に記載の方法。
- 前記PEG試薬が、直鎖状アルコキシPEG、直鎖状二官能性PEG、分岐状PEG、マルチアームPEG、フォーク状PEG、ポリオール核に結合したPEG、樹状PEG、安定な結合を有するPEG、分解可能な結合を有するPEG、および加水分解可能な結合を有するPEGからなる群から選択される、請求項50に記載の方法。
- 前記PEG試薬が、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、およびブロックトリポリマーからなる群から選択される内部構造を有する、請求項53に記載の方法。
- 請求項50に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項55に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項55に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項55に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項55に記載のタンパク質性構築物。
- 前記PEG試薬が約0.1〜約200mg PEG/mg VWFタンパク質の比率で提供される、請求項50に記載の方法。
- 前記PEG試薬が約1.0〜約25mg PEG/mg VWFタンパク質の比率で提供される、請求項50に記載の方法。
- VWF分子と、該VWF分子上の少なくとも1つのリジン残基に共有結合したPEG部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子を提供するステップと、
(b)溶液中で該VWF分子上のリジン残基を試薬PEGアルデヒドと接触させてシッフ塩基を形成するステップと、
(c)該溶液を反応性試薬と接触させて二級アミド結合を形成するステップと、
(d)該PEG試薬を該VWF分子に共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップと、
を含み、
該構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも1つの第VIII因子(FVIII)分子またはFVIIIの生物活性誘導体と結合することができる、方法。 - VWF分子と、該VWF分子上の少なくとも1つの遊離または生成スルフヒドリル基に共有結合したPEG部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子を提供するステップと、
(b)該VWF分子上の該スルフヒドリル基を、マレイミド基含有PEG試薬と接触させるステップと、
(c)該PEG試薬を該VWF分子上の少なくとも1つのスルフヒドリル基に共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップと、
を含み、
該構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも1つの第VIII因子(FVIII)分子またはFVIIIの生物活性誘導体と結合することができる、方法。 - 前記PEG試薬が、直鎖状アルコキシPEG、直鎖状二官能性PEG、分岐状PEG、マルチアームPEG、フォーク状PEG、ポリオール核に結合したPEG、樹状PEG、安定な結合を有するPEG、分解可能な結合を有するPEG、および加水分解可能な結合を有するPEGからなる群から選択される、請求項63に記載の方法。
- 前記PEG試薬が、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、およびブロックトリポリマーからなる群から選択される内部構造を有する、請求項64に記載の方法。
- 請求項63に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項66に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項66に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項66に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項66に記載のタンパク質性構築物。
- 前記PEG試薬が約0.1〜約200mg PEG/mg VWFタンパク質の比率で提供される、請求項63に記載の方法。
- 前記PEG試薬が約1.0〜約25mg PEG/mg VWFタンパク質の比率で提供される、請求項71に記載の方法。
- VWF分子と、該VWF分子上の少なくとも1つのカルボキシル基に共有結合したPEG部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子を提供するステップと、
(b)該VWF分子上のカルボキシル基を、アミノ基および水溶性カルボジイミドを含むPEG試薬と接触させてアミド結合を形成するステップと、
(c)該PEG部分を該VWFに共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップと、
を含み、
該構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも1つのFVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体と結合することができる、方法。 - 前記PEG試薬が、直鎖状アルコキシPEG、直鎖状二官能性PEG、分岐状PEG、マルチアームPEG、フォーク状PEG、ポリオール核に結合したPEG、樹状PEG、安定な結合を有するPEG、分解可能な結合を有するPEG、および加水分解可能な結合を有するPEGからなる群から選択される、請求項73に記載の方法。
- 前記PEG試薬が、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、およびブロックトリポリマーからなる群から選択される内部構造を有する、請求項74に記載の方法。
- 請求項73に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項76に記載の構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項76に記載の構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項76に記載の構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項76に記載の構築物。
- 前記PEG試薬が約0.1〜約200mg PEG/mg VWFタンパク質の比率で提供される、請求項73に記載の方法。
- 前記PEG試薬が約1.0〜約25mg PEG/mg VWFタンパク質の比率で提供される、請求項81に記載の方法。
- VWF分子と、該VWF分子上に共有結合しており、該VWF分子のFVIII結合部位に対しては結合していないPEG部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子を提供するステップと、
(b)該VWF分子上のFVIII結合部位を第VIII因子結合部位保護剤と接触させることにより、保護されたFVIII結合部位を持つVWF分子を形成させるステップと、
(c)ステップ(b)の該VWF分子上の反応部位をPEG試薬と接触させるステップと、
(d)該PEG試薬を該VWF分子と共有結合させるステップと、
(e)該VWF分子から該FVIII結合部位保護剤を分離することにより、該構築物を形成させるステップと、
を含み、
該構築物の生体内半減期がVWF分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも1つの第VIII因子(FVIII)分子またはFVIIIの生物活性誘導体と結合することができる、方法。 - 前記第VIII因子結合部位保護剤が親和性カラムに含まれる、請求項83に記載の方法。
- 前記第VIII因子結合部位保護剤が、第VIII因子、FVIIIの誘導体、ヘパリン、およびヘパリンの誘導体からなる群から選択される、請求項83の方法。
- 前記PEG試薬が、直鎖状アルコキシPEG、直鎖状二官能性PEG、分岐状PEG、マルチアームPEG、フォーク状PEG、ポリオール核に結合したPEG、樹状PEG、安定な結合を有するPEG、分解可能な結合を有するPEG、および加水分解可能な結合を有するPEGからなる群から選択される、請求項83に記載の方法。
- 前記PEG試薬が、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、およびブロックトリポリマーからなる群から選択される内部構造を有する、請求項86に記載の方法。
- 請求項83に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項88に記載の構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項88に記載の構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項88に記載の構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項88に記載の構築物。
- 前記PEG試薬が約0.1〜約200mg PEG/mg VWFタンパク質の比率で提供される、請求項83に記載の方法。
- 前記PEG試薬が約1.0〜約25mg PEG/mg VWFタンパク質の比率で提供される、請求項93に記載の方法。
- VWF分子と、該VWF分子上の少なくとも1つのリジン残基と共有結合したポリシアル酸(PSA)部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子を提供するステップと、
(b)溶液中で、PSAを、アルデヒド含有PEG試薬と接触させてシッフ塩基を形成するステップと、
(c)該溶液を還元剤と接触させて二級アミド結合を形成するステップと、
(d)該PSAを該VWF上の少なくとも1つのリジン残基と共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップとを含み、
該構築物の生体内半減期がVWF分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも1つのFVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体と結合することができる、方法。 - 前記還元剤がNaCNBH3である、請求項95に記載の方法。
- 請求項95に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項97に記載の構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項97に記載の構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項97に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項97に記載のタンパク質性構築物。
- VWF分子と、該VWF分子と共有結合により架橋したポリシアル酸(PSA)部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子を提供するステップと、
(b)該VWF分子を、PSAとグルタルアルデヒドとを含む溶液と接触させるステップと、
(c)該PSAを該VWFへと共有結合により架橋させることにより、該構築物を形成させるステップとを含み、
該構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも1つのFVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体と結合することができる、方法。 - 請求項102に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項103に記載の構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項103に記載の構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項103に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項103に記載のタンパク質性構築物。
- VWF分子と、該VWF分子上の少なくとも1つの糖質残基に共有結合したPSA部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子を提供するステップと、
(b)該VWF分子上の糖質残基を酸化するステップと
(c)該糖質残基を、ヒドラジド基含有PSA試薬と接触させるステップと、
(d)該PSA試薬を該VWF上の少なくとも1つの糖質残基と共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップとを含み、
該構築物の生体内半減期がVWF分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも1つのFVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体と結合できる、方法。 - 前記酸化ステップ(b)が酵素的酸化剤を用いて実行される、請求項108に記載の方法。
- 前記酵素的酸化剤がガラクトースオキシダーゼである、請求項109に記載の方法。
- VWF分子と、該VWF分子上の少なくとも1つのリジン残基に共有結合したヒアルロン酸(HA)部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子を提供するステップと、
(b)HAの溶液を酸化剤と接触させて活性化HAを形成させるステップと、
(c)該VWF分子を該活性化HAと接触させることにより、該構築物を形成させるステップとを含み、
前記構築物の生体内半減期がVWF分子の生体内半減期と比較して増大している、前記構築物が、少なくとも1つのFVIII因子分子またはFVIIIの生物活性誘導体と結合できる、方法。 - 請求項111に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項112に記載の構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項112に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項112に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項112に記載のタンパク質性構築物。
- VWF分子と、前記VWF分子上の少なくとも1つの糖質基に共有結合したPEG部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子を提供するステップと、
(b)該VWF分子上の糖質基を酸化酵素と接触させて、該VWF上で酸化型の糖質部分を形成させるステップと、
(c)該VWF上の該酸化型の糖質部分をヒドラジド基含有PEG試薬と接触させるステップと、
(d)該PEG部分を該VWFに共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップと、
を含み、
該構築物の生体内半減期がVWF分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも1つのFVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体と結合できる、方法。 - 請求項117に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項118に記載の構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項118に記載の構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項118に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項118に記載のタンパク質性構築物。
- VWF分子と、該VWF分子に共有結合したPEG部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
(a)血漿フォンビルブラント因子(VWF)、組換え型VWF、VWFの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるVWF分子を提供するステップと、
(b)該VWF分子をPEG試薬に接触させて溶液を形成するステップと、
(c)該溶液を灌流チェンバーに入れ、蠕動ポンプの使用により前記VWF分子上に剪断応力を発生させるステップと、
(c)該PEG試薬を該VWFに共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップと、
を含み、
該構築物の生体内半減期がVWF分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも1つのFVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体と結合することができる、方法。 - 前記PEG試薬が、N−ヒドロキシスクシンイミド−エステル、PEGカーボネート、カルボキシル基含有PEG誘導体、およびアミノ基含有PEG誘導体からなる群から選択される、請求項123に記載の方法。
- 前記PEG試薬がPEG−スクシンイミジルスクシネート、PEG−スクシンイミジルグルタレート、PEG−スクシンイミジルブタノエート、PEG−スクシンイミジルヘキサノエート、加水分解感受性のエステルまたはアミド結合によって結合される加水分解性PEG、mPEG−(カルボキシメチル)−3−ヒドロキシ−ブタン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、PEG−p−ニトロフェニルカーボネート、および、PEG−スクシンイミジルカーボネートからなる群から選択される、請求項123に記載の方法。
- 請求項123に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項126に記載の構築物。
- 前記構築物の生体内半減期が、VWF分子の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項126に記載の構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも1.5倍増大している、請求項126に記載の構築物。
- 前記構築物に結合した場合、FVIII分子またはFVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該FVIII分子または該FVIIIの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも2倍増大している、請求項126に記載の構築物。
- 前記少なくとも1つの生理学的に許容可能なポリマー分子が前記VWFまたは前記VWFの生物活性誘導体の糖質残基に結合している、請求項10に記載のタンパク質性構築物。
- 前記少なくとも1つの生理学的に許容可能なポリマー分子が前記VWFまたは前記VWFの生物活性誘導体のリジン残基に結合している、請求項10に記載のタンパク質性構築物。
- 前記生理学的に許容可能なポリマー分子は、ポリ(アルキレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィンアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリルアミド)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリレート)、ポリ(サッカライド)、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファスファゼン、ポリオキサゾリン、およびポリ(N−アクリロイルモルホリン)からなる群から選択される、請求項10に記載のタンパク質性構築物。
- 前記生理学的に許容可能なポリマー分子がポリエチレングリコール(PEG)またはその誘導体である、請求項10に記載のタンパク質性構築物。
- 前記生理学的に許容可能なポリマー分子がポリシアル酸(PSA)またはその誘導体である、請求項10に記載のタンパク質性構築物。
- 前記構築物に含まれる前記VWFが、VWFの一次止血における生物学的活性を保持し、前記生物学的活性が、血小板上の受容体に対する結合および細胞間マトリックス成分上の受容体に対する結合を含み、前記成分がコラーゲンを含む、請求項10に記載のタンパク質性構築物。
- 前記生理学的に許容可能なポリマー分子は、ポリ(アルキレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィンアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリルアミド)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリレート)、ポリ(サッカライド)、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファスファゼン、ポリオキサゾリン、およびポリ(N−アクリロイルモルホリン)からなる群から選択される、請求項10に記載のタンパク質性構築物。
- 前記生理学的に許容可能なポリマー分子がポリエチレングリコール(PEG)またはその誘導体である、請求項25に記載の複合体。
- 前記生理学的に許容可能なポリマー分子がポリエチレングリコール(PEG)またはその誘導体である、請求項26に記載の複合体。
- 前記生理学的に許容可能なポリマー分子がポリシアル酸(PSA)またはその誘導体である、請求項26に記載の複合体。
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