JP2021042244A - 血液凝固タンパク質複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書に説明するとき、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、およびADAMTS13プロテアーゼを含むが、これらに限定されない、血液凝固タンパク質が、本発明によって意図される。本明細書に使用するとき、「血液凝固タンパク質」という用語は、任意の第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、およびADAMTS13プロテアーゼを指し、それらは特定の天然血液凝固タンパク質に関連する、生物学的活性を呈する。
一態様では、本発明の出発物質は、血液凝固タンパク質であり、それは、ヒト血漿に由来することができるか、または米国特許第4,757,006号、米国特許第5,733,873号、米国特許第5,198,349号、米国特許第5,250,421号、米国特許第5,919,766号、およびEP第306 968号に説明する、組換え操作技術によって産生することができる。本明細書に説明するとき、血液凝固タンパク質という用語は、天然血液凝固タンパク質に関連する生物学的活性を呈する、任意の血液凝固タンパク質分子を指す。本発明の一実施形態では、血液凝固タンパク質分子は、完全長の血液凝固タンパク質である。
保存的置換
側鎖の特徴 アミノ酸
非分極性(疎水性):
A.脂肪族 ALIVP
B.芳香族 FW
C.硫黄含有 M
D.境界 G
非荷電極性:
A.ヒドロキシル STY
B.アミド NQ
C.スルフヒドリル C
D.境界 G
正電荷(塩基性) KRH
負電荷(酸性) DE
保存的置換II
元の残基 例示の置換
Ala(A) Val、Leu、Ile
Arg(R) Lys、Gln、Asn
Asn(N) Gln、His、Lys、Arg
Asp(D) Glu
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
His(H) Asn、Gln、Lys、Arg
Ile(I) Leu、Val、Met、Ala、Phe
Leu(L) Ile、Val、Met、Ala、Phe
Lys(K) Arg、Gln、Asn
Met(M) Leu、Phe、Ile
Phe(F) Leu、Val、Ile、Ala
Pro(P) Gly
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp、Phe、Thr、Ser
Val(V) Ile、Leu、Met、Phe、Ala
本発明の血液凝固タンパク質をコードする核酸としては、例えば、遺伝子、pre−mRNA、mRNA、cDNA、多形変異体、対立遺伝子、合成および自然発生の変異が挙げられるが、これらに限定されない。
FVII(安定因子またはプロコンベルチンとも称される)は、止血および凝固における中枢的役割を有する、ビタミンK依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質である(Eigenbrot,Curr Protein Pept Sci.2002;3:287−99)。
FIXは、カルシウムイオン、リン脂質、およびFVIIIaの存在下で、FXをその活性型に変換することによって、血液凝固の内因性経路に関与するビタミンK依存性血漿タンパク質である。FIXの主要な触媒能力は、FX内の特定のアルギニン−イソロイシン結合に対して特性を有する、セリンプロテアーゼとしての触媒能力である。FIXの活性化は、FIXからの活性化ペプチドの切除をもたらし、1つまたは複数のジスルフィド結合によって保持される2つの鎖を含む活性FIX分子を産生する、FXIaによって生じる。FIXの欠損は、X連鎖血友病Bの原因である。
凝固第VIII因子(FVIII)は、非常に低い濃度で血漿中を循環し、フォンヴィレブランド因子(VWF)に非共有結合する。止血中、FVIIIは、VWFから分離され、カルシウムおよびリン脂質、または細胞膜の存在下で、活性化の速度を強化させることによって、活性第IX因子(FIXa)媒介のFX活性化のための補因子として機能する。
フォンヴィレブランド因子(VWF)は、約500〜20,000kDの範囲のサイズの一連の多量体として血漿中を循環する糖タンパク質である。VWFの多量体形態は、ジスルフィド結合によって相互に連結された250kDのポリペプチドサブユニットから成る。VWFは、損傷した血管壁の内皮下層への初期血小板粘着を媒介する。より大きな多量体のみが止血活性を呈する。内皮細胞は大きいポリマー形態のVWFを分泌し、低分子重量を有するVWFの形態(低分子重量のVWF)はタンパク質分解開裂から生じることが想定されている。高分子質量を有する多量体は、内皮細胞のバイベルパラーデ小体内に保管され、刺激時に遊離される。
血液凝固タンパク質の産生は、(i)遺伝子操作による組換えDNAの産生、(ii)例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションによる(これらに限定されない)原核細胞または真核細胞への組換えDNAの導入、(iii)形質転換細胞のインキュベーション、(iv)例えば、構造的に、または誘導時の血液凝固タンパク質の発現、および(v)精製された血液凝固タンパク質を得るために、例えば、培養培地から、または形質転換細胞を収集することによる血液凝固タンパク質の単離のための、当該技術分野において既知の任意の方法を含む。
一実施形態では、本発明の共役された血液凝固タンパク質は、静脈内、筋肉内、または腹腔内注入等の注入によって投与されてもよい。
一態様では、提供される血液凝固タンパク質誘導体(すなわち、共役された血液凝固タンパク質)分子は、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、ポリシアル酸(PSA)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)が挙げられるが、これらに限定されない、水溶性ポリマーに結合する。本発明の一実施形態では、水溶性ポリマーは、350〜120,000、500〜100,000、1000〜80,000、1500〜60,000、2,000〜45,000Da、3,000〜35,000Da,および5,000〜25,000Daの範囲の分子重量を有する、シアル酸分子から成る。水溶性ポリマーの結合は、タンパク質への直接結合によって、またはリンカー分子を介して実行することができる。化学的リンカーの一例は、炭水化物−選択的ヒドラジドおよびスルフヒドリル反応マレイミド基を含有する、MBPH(4−[4−N−マレイミドフェニル]酪酸ヒドラジド)である(Chamow et al.,J Biol Chem 1992;267:15916−22)。他の例示的および好ましいリンカーは、下記に説明される。
本明細書に使用するとき、「シアル酸部分」は、水性溶液または懸濁液中で可溶性であり、薬学的に有効量のPSA−血液凝固タンパク質複合体の投与時に、哺乳類への副作用等の悪影響がわずか、または全くない、シアル酸モノマーまたはポリマー(「多糖類」)を含む。一態様では、ポリマーは、1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、または500個のシアル酸単位を有することを特徴とする。ある特定の態様では、異なるシアル酸単位が鎖に組み込まれる。
ある特定の態様では、血液凝固因子、例えば、FVIII、FVIIa、FIX、または他の血液凝固因子分子は、種々の化学的方法のいずれかによって、水溶性ポリマーに共役される(Roberts JM et al.,Advan Drug Delivery Rev 2002;54:459−76)。例えば、一実施形態では、FVIII、FVIIa、またはFIXは、PEGの共役によって、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを使用して、タンパク質の遊離アミノ基に修飾される。別の実施形態では、水溶性ポリマー、例えば、PEGは、マレインイミド化学、または前酸化後に、FVIII、FVIIa、もしくはFIXの炭水化物部分へのPEGヒドラジドもしくはPEGアミンの結合を使用して、遊離SH基に結合される。
mPEG−プロピオン酸スクシンイミジル(mPEG−SPA)
分岐PEG N−ヒドロキシスクシンイミド(mPEG2−NHS)
直鎖PEG誘導体(NOF Corp.)の一般構造:
血液凝固タンパク質は、当業者に既知の種々の技術のいずれかによって、多糖化合物に共有連結され得る。本発明の種々の態様では、シアル酸部分は、例えば、米国特許第4,356,170号に説明される方法(参照により、本明細書に組み込まれる)によって、血液凝固タンパク質、例えば、FIX、FVIII、FVIIa、またはVWFに結合される。
本発明の一実施形態では、オキシム基を形成するための、アルデヒド(例えば、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後の炭水化物部分上)とのヒドロキシルアミンまたはヒドロキシアミン誘導体の反応が、血液凝固タンパク質の複合体の調製に適用される。例えば、糖タンパク質(例えば、本発明に従う血液凝固タンパク質)は、まず、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)等の酸化剤で酸化される(Rothfus JA et Smith EL.,J Biol Chem 1963,238,1402−10、およびVan Lenten L and Ashwell G.,J Biol Chem 1971,246,1889−94)。糖タンパク質の過ヨウ素酸塩酸化は、1928年のthe oxidation of vicinal diols with periodate to form an active aldehyde group(Malaprade L.,Aanalytical application,Bull Soc Chim France,1928,43,683−96)に説明された古典的マラプラード反応に基づく。かかる酸化剤のさらなる例は、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、酢酸マンガン(MnO(Ac)3)、酢酸コバルト(Co(OAc)2)、酢酸タリウム(TlOAc)、硫酸セリウム(Ce(SO4)2)(米国特許第4,367,309号)、または過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)(Marko et al.,J Am Chem Soc 1997,119,12661−2)である。「酸化剤」とは、炭水化物中の隣接ジオールを酸化し、それによって、生理学的反応条件下で、活性アルデヒド基を生成することが可能な温和な酸化化合物を意味する。
ホモ二官能性リンカーNH2[OCH2CH2]2ONH2の調製
ホモ二官能性リンカーNH2[OCH2CH2]2ONH2
ホモ二官能性リンカーNH2[OCH2CH2]4ONH2の調製
ホモ二官能性リンカーNH2[OCH2CH2]4ONH2
アミノオキシ−PSAの調製
Serum Institute of India(Pune,India)から得た500mgの酸化PSA(分子量=18.8kD)を、8mLの50mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.5中に溶解した。次に、100mgの3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンを添加した。室温で、2時間、振とうした後、44mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。4℃で、さらに4時間、振とうした後、反応混合物を、Slide−A−Lyzer(Pierce,Rockfold,IL)透析カセット(3.5kDの膜、再生成セルロース)に装填し、4日間、PBS pH7.2に対して透析した。生成物を、−80℃で凍結した。本手順に従うアミノオキシ−PSAの調製を、図4に示す。
Serum Institute of India(Pune,India)から得た1000mgの酸化PSA(分子量=20kD)を、16mLの50mMのリン酸緩衝液、pH6.0中に溶解した。次いで、170mgの3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンを、反応混合物に与えた。室温で、2時間、振とうした後、78.5mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、反応を、一晩、18時間実行した。次いで、反応混合物を、再生成されたセルロース(Millipore)から作製された5kDのカットオフを有する膜を使用して、限外ろ過/ダイアろ過手順(UF/DF)に供した。
rFIXへのアミノオキシ−PSAの結合、および複合体の精製
6.3mLの50mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH6.0中に溶解した、12.6mgのrFIXに、289μLの水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液(10mM)を添加した。混合物を、4℃で、1時間、暗室で、振とうし、6.5μLの1Mのグリセロールの添加によって、室温で、15分間、反応停止処理をした。低分子重量の不純物を、ビバスピン(Sartorius,Goettingen,Germany)濃縮器(30kDの膜、再生成セルロース)を採用する限外ろ過/ダイアろ過手順(UF/DF)によって除去した。次に、43mgのアミノオキシ−PSAを、UF/DF残余分に添加し、混合物を、4℃で、18時間、振とうした。過剰なPSA試薬を、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって除去した。冷却した反応混合物の伝導率を、180mS/cmに引き上げ、50mMのHEPES、3Mの塩化ナトリウム、6.7mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化した5mLのHiTrapブチルFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)HICカラム(1.6×2.5cm)上に装填した。複合体を、5mL/分の流量で、2.4カラム体積(CV)で、50mMのHEPES、6.7mMの塩化カルシウム、0.005%のTween80、pH7.4で溶出した。調製物を、総タンパク質(BCA)およびFIX色原体活性を測定することによって分析的に特徴付けた。PSA−rFIX複合体に対して、80.2IU/mgのタンパク質の特異的活性を決定した(天然rFIXと比較して56.4%)。結果を、表1に要約する。
求核触媒としてのアニリンの存在下でのrFIXへのアミノオキシ−PSAの結合
1.4mLの50mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH6.0中に溶解した、3.0mgのrFIXに、14.1μLの水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液(10mM)を添加した。混合物を、4℃で、1時間、暗室で、振とうし、1.5μLの1Mのグリセロールの添加によって、室温で、15分間、反応停止処理をした。低分子重量の不純物を、PD−10脱塩カラム(GE Healthcare,Fairfield,CT)を用いる、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって除去した。1.33mLの50mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH6.0中に溶解した、1.2mgの酸化rFIXを、70μLのアニリン(200mMの水性貯蔵溶液)と混合し、室温で、45分間、振とうした。次に、4.0mgのアミノオキシ−PSAを添加し、混合物を、室温で、2時間、4℃で、さらに16時間振とうした。サンプルを、1時間後、2時間後、および18時間後の反応の最後に引き出した。次に、過剰のPSA試薬および遊離rFIXを、HICによって除去した。冷却した反応混合物の伝導率を、180mS/cmに引き上げ、50mMのHEPES、3Mの塩化ナトリウム、6.7mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化した5mLのHiTrapブチルFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)HICカラム(1.6×2.5cm)上に装填した。複合体を、5mL/分の流量で、20CVで、50mMのHEPES、6.7mMの塩化カルシウム、0.005%のTween80、pH7.4に対して直線勾配で溶出した。
rFIXへのアミノオキシ−PSAの結合、およびNaCNBH3での還元
5.25mLの50mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH6.0中に溶解した、10.5mgのrFIXに、53μLの水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液(10mM)を添加した。混合物を、4℃で、1時間、暗室で、振とうし、5.3μLの1Mのグリセロールの添加によって、室温で、15分間、反応停止処理をした。低分子重量の不純物を、ビバスピン(Sartorius,Goettingen,Germany)濃縮器(30kDの膜、再生成セルロース)を用いるUF/DFによって除去した。次に、35.9mgのアミノオキシ−PSAを、UF/DF残余分に添加し、混合物を、室温で、2時間、振とうした。次いで、53μLの水性シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液(5M)を添加し、反応を、さらに16時間進行させた。次いで、過剰なPSA試薬を、HISによって除去した。冷却した反応混合物の伝導率を、180mS/cmに引き上げ、50mMのHEPES、3Mの塩化ナトリウム、6.7mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化した5mLのHiTrapブチルFF HIC(GE Healthcare,Fairfield,CT)カラム(1.6×2.5cm)上に装填した。複合体を、5mL/分の流量で、2.4CV内で、50mMのHEPES、6.7mMの塩化カルシウム、0.005%のTween80、pH7.4で溶出した。
rFIXへのアミノオキシ−PSA(リンカー:NH2[OCH2CH2]4ONH2)の結合、および複合体の精製
2.8mLの50mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH6.0中に溶解した、5.6mgのrFIXに、102μLの過ヨウ素酸ナトリウムの水溶液(10mM)を添加した。混合物を、4℃で、1時間、暗室で、振とうし、2.9μLの1Mのグリセロールの添加によって、室温で、15分間、反応停止処理をした。低分子重量の不純物を、ビバスピン(Sartorius,Goettingen,Germany)濃縮器(30kDの膜、再生成セルロース)を用いるUF/DFによって除去した。次いで、19mgのアミノオキシ−PSAを、UF/DF残余分に添加し、混合物を、4℃で、18時間、振とうした。過剰なPSA試薬を、HICによって除去した。冷却した反応混合物の伝導率を、180mS/cmに引き上げ、50mMのHEPES、3Mの塩化ナトリウム、6.7mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化した5mLのHiTrapブチルFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)HICカラム(1.6×2.5cm)上に装填した。複合体を、5mL/分の流量で、2.4CV内で、50mMのHEPES、6.7mMの塩化カルシウム、0.005%のTween80、pH7.4で溶出した。
rFVIIIへのアミノオキシ−PSAの結合
11mLのHepes緩衝液、pH6(50mMのHepes、5mMのCaCl2、150mMのNaCl、0.01%のTween)中に溶解した、11mgのrFVIIIに、57μLの10mMの過ヨウ素酸ナトリウムを添加した。混合物を、4℃で、30分間、暗室で、振とうし、107μLの1Mのグリセロール水溶液の添加によって、4℃で30分間反応停止処理をした。次いで、19.8mgのアミノオキシ−PSA(18.8kD)を添加し、混合物を、4℃で、一晩、振とうした。イオン強度を、8Mの酢酸アンモニウム(8Mの酢酸アンモニウム、50mMのHepes、5mMのCaCl2、350mMのNaCl、0.01%のTween80、pH6.9)を含有する緩衝液の添加によって増大して、最終濃度の2.5Mの酢酸アンモニウムを得た。次に、反応混合物を、HiTrapブチルFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)カラム上に装填し、平衡緩衝液(2.5Mの酢酸アンモニウム、50mMのHepes、5mMのCaCl2、350mMのNaCl、0.01%のTween80、pH6.9)で平衡化した。生成物を、溶出緩衝液(50mMのHepes、5mMのCaCl2、0.01%のTween80、pH7.4)で溶出し、溶出物を、30,000MWCOを有するビバスピン(Sartorius,Goettingen,Germany)デバイスを使用する遠心ろ過によって濃縮した。
血友病マウスにおけるPKの試験
FIX欠損マウスに、10mL/kgの体重の体積用量の製剤緩衝液(10mMのヒスチジン、260mMのグリシン、29mMのスクロース、0.005%のTween80、pH6.8)中のrFIXまたはPSA−rFIX(実施例4に従い調製)のいずれかを注入した。6匹のマウスのグループを、物質注射の5分後、3時間後、9時間後、16時間後、24時間後、および48時間後に安楽死させ、血液を心臓穿孔によって収集した。クエン酸血漿を調製し、FIX活性の分析まで冷凍保存した。
血液凝固タンパク質のポリシアル化
本明細書に説明するポリシアル化は、他の凝固タンパク質まで拡大され得る。例えば、本発明の種々の態様では、実施例5、6、および9に説明する、アミノオキシ−PSAでの上記のポリシアル化を、FVIII、FVIIa、およびVWF等の凝固タンパク質で繰り返す。
ホモ二官能性リンカーNH2[OCH2CH2]6ONH2の調製
ホモ二官能性リンカーNH2[OCH2CH2]6ONH2
マレイミド/アミノオキシリンカー系を用いるrFIXのポリシアル化
A.修飾試薬の調製
アミノオキシ−PSA試薬を、マレイミド/アミノオキシリンカー系の使用によって調製する(Toyokuni et al.,Bioconjugate Chem 2003;14,1253−9)。遊離末端SH−基を含有するPSA−SH(20kD)を、2ステップ手順(a)国際公開第05016973A1号に従う、NH4Clでの酸化PSAの還元アミン化によるPSA−NH2の調製、およびb)米国特許第7645860号に説明するとおり、2−イミノチオラン(トラウト試薬/Pierce,Rockford,IL)との末端一級アミノ基の反応によるスルフヒドリル基の導入)を使用して調整する。PSA−SHを、10倍のモル過剰のリンカー、および50mg/mLのPSA−SH濃度を使用して、PBS−緩衝液中のpH7.5のリンカーのマレイミド基に結合する。反応混合物を、室温で、穏やかな振とうで、2時間、インキュベートする。次いで、過剰リンカー試薬を除去し、アミノオキシ−PSAを、ダイアろ過によって、酸化緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム、pH6.0)に緩衝液交換する。緩衝液を、Pellicon XL 5kDで再生成されたセルロース膜(Millipore,Billerica,MA)を用いて、25回交換する。
rFIXを、緩衝液中の100μMの過ヨウ素酸ナトリウムを用いて、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中で酸化する。混合物を、4℃で、1時間、暗室で、振とうし、5mMの最終濃度まで、グリセロールの添加によって、室温で、15分間、反応停止処理をした。低分子重量の不純物を、PD−10脱塩カラム(GE Healthcare,Fairfield,CT)を用いるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって除去した。次いで、酸化rFIXを、アニリンでスパイクして、10mMの最終濃度を得、アミノオキシ−PSA試薬と混合して、5倍のモル過剰のPSAを達成する。反応混合物を、室温で、暗室で、穏やかな振とうで、2時間インキュベートした。
過剰のPSA試薬および遊離rFIXをHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、180mS/cmに引き上げ、50mMのHepes、3Mの塩化ナトリウム、6.7mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で、事前に平衡化した48mLのブチル−セファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填されたカラム上に装填した。その後、複合物を、40CVで、60%の溶出緩衝液(50mMのHepes,6.7mMの塩化カルシウム、pH7.4)の線形勾配で溶出する。最後に、PSA−rFIXを含有する画分を収集し、再生成されたセルロース(Millipore)から作製された30kDの膜の使用によって、UF/DFに供する。調製を、総タンパク質(BCA)およびFIX色原体活性を測定することによって、分析的に特徴付ける。両方の変異体で調製されたPSA−rFIX複合体に対して、天然のrFIXと比較して、50%超の特性活性を決定する。
アミノオキシ−PSA試薬の調製
アミノオキシ−PSA試薬を実施例3に従い調製した。最終生成物を、5kDの膜(再生成されたセルロース、Millipore)を使用して、緩衝液、pH7.2(50mMのHepes)に対してダイアろ過し、−80℃で凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、試薬を、適切な水容積中で溶解し、炭水化物修飾を介してPSA−タンパク質複合体の調製のために使用した。
FVIII欠損ノックアウトマウスモデルにおけるポリシアル化されたrFVIIIの薬物動態
PSA−FVIII複合体を実施例8に従い調製した。複合体は、6237IU/mgの特異的活性(色原体アッセイによって決定されたFVIII活性、ブラッドフォードアッセイによって決定された総タンパク質)を示し、レソルシノールアッセイ(Svennerholm L,Biochim Biophys Acta 1957;24:604−11)によって測定して、6.7のポリシアル化の度合い(モルFVIII当たりモルPSA)を有した。
アミノオキシ−PSA試薬の詳細な合成
3−オキサ−ペンタン−1,5ジオキシアミンを、実施例1に列挙する2ステップの有機合成で、Boturynら(Tetrahedron 1997;53:5485−92)に従い合成した。
700mLの無水N,N−ジメチルホルムアミド中のエンド−N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシミドの(59.0g;1.00等量)の溶液に、無水K2CO3(45.51g、1.00等量)および2,2−ジクロロジエチルエーテル(15.84mL、0.41等量)を添加した。反応混合物を、50℃で22時間攪拌した。混合物を、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残基を、2Lのジクロロメタン中で懸濁し、NaCl飽和水溶液(各1L)で2回、抽出した。ジクロロメタン層を、Na2SO4で乾燥させ、次いで、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、高真空内で乾燥して、白黄色の固体(中間体1)として64.5gの3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシ−エンド−2’,3’−ジカルボキシジイミドノールボルネンを得た。
800mLの無水エタノール中の中間体1(64.25g、1.00等量)の溶液に、31.0mLのヒドラジン水和物(4.26等量)を添加した。次いで、反応混合物を、2時間、還流させた。混合物を、減圧下で、溶媒を蒸発させることによって、出発容量の半分まで濃縮した。生じた沈殿物をろ過した。残りのエタノール層を、減圧下で、乾燥するまで蒸発させた。粗生成物3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンを含有する残基を、真空内で乾燥させ、46.3gを得た。粗生成物をさらに、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル60、ジクロロメタン/メタノール混合物での定組成溶離、9+1)によって精製して、11.7gの純最終生成物3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンを得た。
PSAヒドラジドを使用するrFIXのポリシアル化
rFIXを、アジピン酸ジヒドラジド(ADH)との酸化PSAの反応によって調製されたPSAヒドラジド試薬の使用によってポリシアル化する。
Serum Institute of India(Pune,India)から得た500mgの酸化PSA(分子量=20kD)を、8mLの50mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.5中に溶解した。次いで、100mgのアジピン酸ジヒドラジド(ADH)を添加した。溶液を、2時間、弱く振とうした。次いで、44mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応物を、4℃で、さらに4時間、インキュベートした後、反応混合物を、Slide−A−Lyzer(Pierce,Rockford,IL)透析カセット(3.5kDの膜、再生成セルロース)に装填し、4日間、PBS pH7.2に対して透析した。生成物を−80℃で凍結した。
rFIXを、ステップ1に説明するPSAヒドラジド試薬の使用によってポリシアル化する。rFIX(濃度1mg/mL)を、穏やかな振とうで、暗室で、NaIO4(濃度:80μM)で、4℃で、1時間、酸化する。反応を、グリセロールの添加によって停止し、酸化FIXを、再生成されたセルロース(Vivaspin)から作製された30kDの膜の使用によって、UF/DFに供する。次いで、酸化rFIXを、200倍のモル過剰の試薬、および1mg/mLのタンパク質濃度を使用して、pH6.5でポリシアル化する。rFIXおよびポリシアル化試薬を、室温で、暗室で、穏やかな振とうで、2時間、インキュベートする。最後に、PSA−rFIX複合体を、HICによって精製する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウムを含有する緩衝液(50mMのHepes、350mMのNaCl、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、0.01%のTween80、pH6.9)を添加することによって、130mS/cmに引き上げ、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化したHiTrapブチルFFカラム(5mL、GE Healthcare,Fairfield,CT)上に装填する。その後、複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH7.4で溶出する。最後に、留分を含有するPSA−rFIXを収集し、再生成されたセルロース(Vivaspin)から作製された30kDの膜の使用によって、UF/DFに供する。PEG−rFIX複合体では、天然のrFIXと比較して、50%超の特異性活性を決定する(色原体アッセイ)。
求核触媒としてのアニリンの存在下で、PSAヒドラジドを使用するrFIXのポリシアル化
123mgのrFIXを、60mLのリン酸緩衝液(50mMのNaPO4、pH6.5)緩衝液中に溶解する。次いで、1.2mLの水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液(10mM)を添加し、混合物を、穏やかな攪拌で、4℃で、暗室で、1時間、インキュベートする。その後、反応物を、600μLの1Mのグリセロール水溶液の添加によって、室温で、15分間、反応停止処理する。その後、混合物を、Pellicon XL Ultracel 30kDの膜を使用するUF/DFに供する。
rFIXのポリシアル化および2ステップ手順を使用する精製
140mgのrFIXを、62mLのリン酸緩衝液(50mMのNaPO4、pH6.0)緩衝液中に溶解した。次いで、1.92mLの水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液(10mM)を添加し、混合物を、穏やかな攪拌で、4℃で、暗室で、1時間、インキュベートし、64μLの1Mの水性グリセロール溶液の添加によって、室温で、15分間、反応停止処理をした。その後、混合物を、Pellicon XL Ultracel 30kDの膜を採用するUF/DFに供した。
rFVIIaへのアミノオキシ−PSAの結合、および複合体の精製
5mLの反応緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中の10mgのrFVIIaの溶液を、NaIO4の水溶液(最終濃度:100μM)と混合し、暗室で、穏やかな攪拌で、4℃で、1時間、インキュベートし、15分間、システインの水性溶液(最終濃度:1mM)の添加によって反応停止処理する。その後、反応混合物を、UF/DFに供する。残余分(10mL)に、30倍モル過剰のアミノオキシ試薬(実施例1に従い調製)を添加する。結合反応を、暗室で、室温で、2時間、実行する。過剰のアミノオキシ試薬を、HICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム(50mMのHepes、350mMのNaCl、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、0.01%のTween80、pH6.9)を含有する緩衝液を添加することによって、130mS/cmに引き上げ、HiTrap ブチルFFカラム(5mL、GE Healthcare,Fairfield,CT)上に装填し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡する。その後、複合体を、20CV中の100%溶出緩衝液の線形勾配によって、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH7.4で溶出する。最後に、PSA−rFVIIaを含有するを画分を収集し、再生成されたセルロース(Vivaspin)から作製された30kDの膜の使用によるUF/DFに供する。調製を、総タンパク質(BCA)およびFVIIa色原体活性(Staclotアッセイ、Diagnostica Stago,Asnieres,France)を測定することによって分析的に特徴付け、rFVIIa出発物質と比較して、20%超の特異的活性を示す。
求核触媒としてのアニリンの存在下でのrFVIIaへのアミノオキシ−PSAの結合
1.4mLの50mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH6.0中に溶解した、3.0mgのrFVIIaに、14.1μLの水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液(10mM)を添加する。混合物を、4℃で、1時間、暗室で、振とうし、1.5μLの1Mのグリセロールの添加によって、室温で15分間反応停止処理する。低分子重量の不純物を、PD−10脱塩カラム(GE Healthcare,Fairfield,CT)を用いる、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって除去する。3mLの50mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH6.0中に溶解した、3mgの酸化されたrFVIIaを、アニリン(求核触媒、最終濃度:10mM)と混合し、室温で、30分間、振とうする。次に、アミノオキシ−PSAを添加して、5倍のモル過剰を得、混合物を、室温で、2時間、振とうする。その後、過剰PSA試薬および遊離rFIXを、HICによって除去する。冷却した反応混合物の伝導率を、180mS/cmに引き上げ、5mLのHiTrapブチルFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)HICカラム(1.6×2.5cm)上に装填し、50mMのHEPES、3Mの塩化ナトリウム、6.7mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化する。複合体を、5mL/分の流量で、20CVで、50mMのHepes、6.7mMの塩化カルシウム、0.005%のTween80、pH7.4に対する線形勾配で溶出する。
アミノオキシ−PEG試薬の調製
分岐PEG−アルデヒド(分子量40kD)を、実施例1に説明するとおり調製する、ジアミノオキシリンカーへ結合のために使用する。このPEG−アルデヒド試薬は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)から入手可能である。500mgのPEG−アルデヒドを、8mLの50mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.5中に溶解する。次いで、100mgの3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンを添加する。室温で、2時間、振とうした後、44mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加する。4℃で、さらに4時間、振とうした後、反応混合物を、Slide−A−Lyzer(Pierce,Rockford,IL)透析カセット(3.5kDの膜、再生成されたセルロース)上に装填し、4日間、PBS、pH7.2に対して透析する。生成物を、−80℃で凍結する。
アミノオキシPEG試薬でのrFIXのPEG化
rFIXを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。rFIXを、反応緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中で、4℃で、暗室で、穏やかな振とうで、1時間、NaIO4(最終:濃度:100μM)での2mg/mLのタンパク質濃度で酸化させ、15分間、グリセロールの水性溶液(最終濃度:1mM)の添加によって反応停止処理する。その後、反応混合物を、UF/DFに供する。残余分に、3倍のモル過剰のアミノオキシ試薬およびアニリン(求核触媒、最終濃度:10mM)を追加する。結合反応を、穏やかな振とうで、暗室で、室温で、2時間、実行する。最後に、PEG−rFIX複合体を、Q−セファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、カラム上に装填し、50mMのトリス、pH8.0で事前に平衡する。複合体を、20CVで、50mMのトリス、および1Mの塩化ナトリウム、pH8.0で溶出し、次いで、30kDの膜を使用するUF/DFに供する。調製を、総タンパク質(BCA)およびFIX色原体活性を測定することによって分析的に特徴付ける。PSA−rFIX複合体では、天然のrFIXと比較して、75%超の特異的活性が決定される。
アミノオキシPEG試薬でのrFVIIIのPEG化
rFVIIIを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。この種類の試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。rFVIIIを、反応緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中で、4℃で、暗室で、穏やかな振とうで、1時間、NaIO4(最終:濃度:100μM)での1mg/mLのタンパク質濃度で酸化させ、15分間、システインの水性溶液(最終濃度:1mM)の添加によって反応停止処理する。その後、反応混合物を、UF/DFに供する。残余分に、20倍のモル過剰のアミノオキシ試薬およびアニリン(求核触媒、最終濃度:10mM)を追加する。結合反応を、穏やかな振とうで、暗室で、室温で2時間実行する。最後に、PEG−rFVIII複合体を、Q−セファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、カラム上に装填し、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で事前に平衡する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、30kDの膜を使用するUF/DFに供する。FVIII色原体アッセイによる複合体の分析的特長付け、および総タンパク質(BCAアッセイ)決定は、rFVIII出発物質と比較して、60%超の特異的活性が決定される。
アミノオキシPEG試薬でのrFVIIaのPEG化
rFVIIaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。rFVIIaを、反応緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中で、4℃で、暗室で、 穏やかな振とうで、1時間、NaIO4(最終:濃度:100μM)での2mg/mLのタンパク質濃度で酸化させ、15分間、グリセロールの水性溶液(最終濃度:1mM)の添加によって反応停止処理する。その後、反応混合物を、UF/DFに供する。残余分に、5倍のモル過剰のアミノオキシ試薬およびアニリン(求核触媒、最終濃度:10mM)を追加する。結合反応を、穏やかな振とうで、暗室で、室温で、2時間、実行する。最後に、PEG−rFVIIa複合体を、Q−セファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、カラム上に装填し、1mMのCaCl2、pH7.4を含有する20mMのHepes緩衝液で事前に平衡する。複合体を、1mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する、20mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、30kDの膜を使用するUF/DFに供する。FVIIa活性(Staclotアッセイ、Diagnostica Stago,Asnieres,France)、および総タンパク質(BCAアッセイ)を測定することによる複合体の分析的特長付けは、rFVIIa出発物質と比較して、25%超の特異的活性を示す。
PEGヒドラジド試薬でのrFIXのPEG化
rFIXを、ヒドラジド基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)HZシリーズである。rFIXを、反応緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中で、4℃で、暗室で、穏やかな振とうで、1時間、NaIO4(最終:濃度:100μM)での2mg/mLのタンパク質濃度で酸化させ、15分間、グリセロールの水性溶液(最終濃度:1mM)の添加によって反応停止処理する。その後、反応混合物を、UF/DFに供する。残余分に、50倍のモル過剰のヒドラジド試薬およびアニリン(求核触媒、最終濃度:10mM)を追加する。結合反応を、穏やかな振とうで、暗室で、室温で、2時間、実行する。最後に、PEG−rFIX複合体を、Q−セファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。反応混合物を、カラム(1.5mgのタンパク質/mLゲル)上に装填し、50mMのトリス−緩衝液、pH8.0で事前に平衡する。複合体を、20CVのトリス−緩衝液、pH8.0(50mMのトリス、1MのNaCl)で溶出し、次いで、30kDの膜を使用するUF/DFに供する。調製を、総タンパク質(BCA)およびFIX色原体活性を測定することによって分析的に特徴付ける。PSA−rFIX複合体では、天然のrFIXと比較して、50%超の特異的活性が決定される(色原体アッセイ)。
2mMのアニリンの存在下でのrFVIIIのポリシアル化
rFVIIIを、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6)に移し、1mg/mLのタンパク質濃度まで希釈し、反応緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中で、4℃で、暗室で、 穏やかな振とうで、1時間、NaIO4(最終:濃度:100μM)で酸化させ、15分間、システインの水性溶液(最終濃度:1mM)の添加によって反応停止処理する。その後、反応混合物を、UF/DFに供する。残余分に、20倍のモル過剰のアミノオキシ試薬およびアニリン(求核触媒、最終濃度:2mM)を添加する。結合反応を、穏やかな振とうで、暗室で、室温で、2時間、実行する。過剰なアミノオキシ試薬をHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウムを含有する緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、0.01%のTween80、pH6.9)を添加することによって、130mS/cmに引き上げ、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化した53mLのブチル−セファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填されたカラム上に装填する。その後、複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH7.4で溶出する。最後に、留分を含有するPSA−rFIXを収集し、再生成されたセルロース(Millipore,Billerica,MA)から作製された、30kDの膜を使用することによるUF/DFに供する。調製を、総タンパク質(BCA)およびFVIII色原体活性を測定することによって分析的に特徴付ける。PSA−rFVIII複合体では、天然rFVIIIと比較して、80%の特異的活性が決定される。
10mMのアニリンの存在下でのrFVIIIのポリシアル化
rFVIIIを、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6)に移し、1mg/mLのタンパク質濃度まで希釈し、反応緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中で、4℃で、暗室で、 穏やかな振とうで、1時間、NaIO4(最終:濃度:100μM)で酸化させ、15分間、システインの水性溶液(最終濃度:1mM)の添加によって反応停止処理する。その後、反応混合物を、UF/DFに供する。残余分に、20倍のモル過剰のアミノオキシ試薬およびアニリン(求核触媒、最終濃度:10mM)を添加する。結合反応を、穏やかな振とうで、暗室で、室温で、2時間、実行する。過剰なアミノオキシ試薬をHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウムを含有する緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、0.01%のTween80、pH6.9)を添加することによって、130mS/cmに引き上げ、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化した53mLのブチル−セファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填されたカラム上に装填する。その後、複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH7.4で溶出する。最後に、PSA−rFIXを含有する画分を収集し、再生成されたセルロース(Millipore,Billerica,MA)から作製された、30kDの膜を使用することによるUF/DFに供する。調製物を、総タンパク質(BCA)およびFVIII色原体活性を測定することによって分析的に特徴付ける。PSA−rFVIII複合体では、天然のrFVIIIと比較して、80%の特異的活性が決定される。
分岐PEGを使用する血液凝固タンパク質のPEG化
血液凝固タンパク質(実施例22〜25に説明するFIX、FVIII、およびFVIIa等)のPEG化は、実施例21に説明する分岐または直鎖PEG試薬まで延長されてもよく、それは、アルデヒド、および活性アミノオキシ基を含有する好適なリンカーから作製される。
Claims (1)
- 水溶性ポリマーを、血液凝固タンパク質の酸化炭水化物部分に共役させる方法であって、共役を可能にする条件下で、前記酸化炭水化物部分を、活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、
前記血液凝固タンパク質は、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子(FXI)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、およびADAMTS13プロテアーゼ、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体から成る群より選択され、
前記水溶性ポリマーは、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、ポリシアル酸(PSA)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)から成る群より選択され、
前記炭水化物部分は、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)から成る群より選択される酸化剤を含む緩衝液でのインキュベーションによって酸化され、オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分と前記水溶性ポリマー上の前記活性アミノオキシ基との間に形成される、方法。
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