JP2012505917A - 低度の水溶性ポリマーを含む改変血液因子 - Google Patents

Abstract

本発明は、血液因子にコンジュゲートされている低レベルの水溶性ポリマー分子を含むが、より多くの数の水溶性ポリマー部分を有する分子に類似した、またはより優れた生物活性を示す、改変血液因子の調製のための材料および方法に一般に関する。本発明は、少量の水溶性ポリマーを含む血液因子変異体を生成するための材料および方法を目的とする。一態様では、本発明は、組換え血液因子および血液因子１分子につき少なくとも１個かつ１０個以下の水溶性ポリマー部分を含む改変血液因子分子を提供する。

Description

本発明は、低レベルの水溶性ポリマー分子を含むが、より多くの水溶性ポリマー部分を有する分子に類似した生物活性を示す、改変血液因子の調製のための材料および方法に一般に関する。

血液凝固は、一連の成分、特にフィブリノーゲン、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子およびフォン・ヴィレブランド因子の連続的な相互作用を含む複雑な過程である。これらの成分の１つが欠損し、またはその機能性が阻害されると、血液凝固傾向の増加または凝固不能が引き起こされることがあり、そのいずれも一部の患者では生命にかかわることがある。

第ＶＩＩＩ因子は、血液凝固をもたらす反応カスケードにおいて第Ｘ因子を第Ｘａ因子に変換する第ＩＸａ因子のコファクターである。血液中の第ＶＩＩＩ因子活性量の欠乏は、主に男性に影響を及ぼす遺伝性の状態である凝固障害、血友病Ａをもたらす。現在、血友病Ａは、ヒト血漿に由来するかまたは組換えＤＮＡ技術を使って製造される、第ＶＩＩＩ因子の治療調製物によって治療される。そのような調製物は、制御不能の出血を防ぐ（予防）ために、出血事例に応じて、または頻繁に一定の間隔をおいて投与される。

フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、第ＶＩＩＩ因子と複合体を形成して血漿中を循環し、それは第ＶＩＩＩ因子タンパク質を安定化し、このタンパク質をタンパク質分解から保護する。ＶＷＦは、血小板凝集において機能するため、血液凝固を直接に妨害もする。フォン・ヴィレブランド欠乏症（ＶＷＤ）（別名フォン・ヴィレブランド症候群）は、ＶＷＦの欠乏または過剰発現のいずれかから生じる。ＶＷＦの欠乏は、ＶＷＦコファクターを欠く第ＶＩＩＩ因子が速やかに分解するため、血友病に類似した疾患をもたらす。

血友病Ａおよびフォン・ヴィレブランド症候群の治療では、患者を精製された第ＶＩＩ因子、ＶＷＦまたは第ＶＩＩＩ因子／ＶＷＦ複合体で治療するいくつかの試みがあった。しかし、投与された外因性タンパク質に対する抗体の発生が治療効力を低下させることが明らかになっており、これらの患者の治療を困難にしている。例えば、５０％の頻度で抗ＦＶＩＩＩ抗体を生じる重度および中等度の血友病患者で、抗ＦＶＩＩＩ抗体が特に多発する（非特許文献１；非特許文献２）。ｉｎ ｖｉｖｏでより高い効力を有する治療用タンパク質をより低い用量で投与すれば、投与される血液因子に対する抗体の出現を減少または制限するのに役立つであろう。

治療用タンパク質の薬物動態学的および免疫学的特性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーとのコンジュゲーションによって改善することができる。詳細には、生理的活性タンパク質を生理的に許容されるポリマー分子に結合させることにより、そのｉｎ ｖｉｖｏ半減期をかなり延長することができる。分子のＰＥＧ化は、酵素的分解に対する薬剤の耐性の増加、投薬頻度の低下、免疫原性の低下、物理的および熱的安定性の増加、溶解性の増加、液体安定性の増加、ならびに凝集の減少をもたらすこともできる。

特許文献１は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）にポリマー分子（デキストラン）をコンジュゲートさせることにより、ＦＶＩＩＩタンパク質は、トロンビンによって活性化可能になり、抗原性および免疫活性が相当低下し、哺乳動物の血流中でのｉｎ ｖｉｖｏ保持時間が相当延長することを記載している。特許文献２は、ＦＶＩＩＩを生理的に許容されるポリマー分子にコンジュゲートさせることにより、（ｉ）ＦＶＩＩＩのｉｎ ｖｉｖｏ加水分解に対する耐性を増加させ、したがって投与後のＦＶＩＩＩの活性を延長すること、（ｉｉ）未改変タンパク質よりもＦＶＩＩＩのｉｎ ｖｉｖｏ循環寿命を相当延長すること、および（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩの血流中への吸収時間を増加させることによってＦＶＩＩＩのｉｎ ｖｉｖｏ機能が改善されることを記載する。特許文献３は、タンパク質がそのタンパク質のカルボニル基を介してポリ（アルキレンオキシド）に共有結合している、ＦＶＩＩＩと第ＩＸ因子（ＦＩＸ）のコンジュゲートを記載する。さらに、特許文献４には、生理的に許容されるポリマー分子、特にポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）にコンジュゲートさせることにより、ＦＩＸのｉｎ ｖｉｖｏ機能が改善されることが記載されている。特許文献５には、比活性を保持するＰＥＧ化ＦＶＩＩＩが開示された。

タンパク質などの活性剤への水溶性ポリマーのコンジュゲーションは、安定なポリマー−タンパク質コンジュゲート、あるいは水溶性ポリマーが遊離可能な共有結合（プロドラッグの概念）、すなわち加水分解性、分解性または遊離可能なリンカーを介してタンパク質に結合しているポリマー−タンパク質コンジュゲートを調製することによって実施することができる。例えば、遊離可能なＰＥＧ部分は、２つのＰＥＧ鎖を含む９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）コンジュゲーション系（Ｎｅｋｔａｒ Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＬ）を用いて開発されている。さらに、タンパク質のリシン残基の化学的修飾に有用であるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）基を、メトキシカルボニル基を介してフルオレン環系に連結させて、遊離可能なＰＥＧ部分を生成することができる。特許文献６（参照により本明細書に組み込まれる）は、遊離可能なＰＥＧの概念に基づく、一連のＰＥＧ化された組換えＦＶＩＩＩ変異体を記載する。

治療用タンパク質に対して比較的高い程度の修飾および水溶性ポリマー含量をもたらす化学プロセスは、調製に必要とされる試薬が多量であるため経済的ではない。さらに、高い程度の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧは、ポリマーおよびリンカーが多量であるため、毒物学的または免疫学的リスクの増加をもたらす。

米国特許第４，９７０，３００号明細書 国際公開第９４／１５６２５号 米国特許第６，０３７，４５２号明細書 国際公開第９４／２９３７０号 国際公開第２００７／１２６８０８号 国際公開第２００８／０８２６６９号

Ｇｉｌｌｅｓら、Ｂｌｏｏｄ ８２巻：２４５２〜６１頁、１９９３年 Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７７巻：１３５５〜６３頁、２００６年

したがって、当技術分野では、結果として生じる毒性または免疫学的影響を伴わずに治療用タンパク質の半減期および安定性を改善する水溶性ポリマーを含む治療組成物が依然として必要とされている。

本発明は、少量の水溶性ポリマーを含む血液因子変異体を生成するための材料および方法を目的とする。一態様では、本発明は、組換え血液因子および血液因子１分子につき少なくとも１個かつ１０個以下の水溶性ポリマー部分を含む改変血液因子分子を提供する。一実施形態では、改変血液因子は、血液因子１分子につき少なくとも２、３、４、５、６、７、８または９個の水溶性ポリマー部分を含む。

さらなる実施形態では、改変血液因子は、血液因子１分子につき４個以上８個以下の水溶性ポリマー部分（すなわち、４、５、６、７および８個のポリマー部分を含む）を含む。一部の実施形態では、血液因子は、血液因子１分子につき１個以上４個以下の水溶性ポリマーを含む。他の実施形態では、血液因子は、血液因子１分子につき４個以上６個以下の水溶性ポリマーを含む。さらに他の実施形態では、血液因子は、血液因子１分子につき１〜２個のポリマーを含む。

関連する実施形態では、改変血液因子は、血液因子１分子につき８個の水溶性ポリマー部分を含む。さらなる実施形態では、改変血液因子は、血液因子１分子につき５個の水溶性ポリマー部分を含む。別の実施形態では、改変血液因子は、血液因子１分子につき４個の水溶性ポリマー部分を含む。関連する実施形態では、改変血液因子は、血液因子１分子につき２個の水溶性ポリマー部分を含む。さらに別の実施形態では、改変血液因子は、血液因子１分子につき１個の水溶性ポリマーを含む。

水溶性ポリマー部分は、安定なリンカーを介して、または遊離可能もしくは分解可能なリンカーを介して血液因子分子に結合していることが想定される。一実施形態では、遊離可能なリンカーは、加水分解性リンカーである。

一実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｓｐｈａｚｅｎｅ）、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー類、ポリ（マレイン酸）、ポリ（ＤＬ−アラニン）、多糖類、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、デンプンもしくはデンプン誘導体、ヒアルロン酸、キチン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリシアル酸（ＰＳＡ）およびそれらの組合せからなる群から選択される。

関連する実施形態では、水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ分子は直鎖状ＰＥＧ部分または分枝状ＰＥＧ部分であることがさらに企図される。

別の実施形態では、ＰＥＧは３ｋＤ〜２００ｋＤの分子量を有する。関連する実施形態では、ＰＥＧの平均分子量は、約３〜２００キロダルトン（「ｋＤａ」）、約５ｋＤａ〜約１２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、または約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲である。

本発明は、改変血液因子が、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子およびフィブリノーゲンからなる群から選択されることを企図する。一実施形態では、血液因子分子は第ＶＩＩＩ因子である。一実施形態では、血液因子分子は第ＶＩＩａ因子である。一実施形態では、血液因子分子は第ＩＸ因子である。さらなる実施形態では、血液因子分子はヒトのものである。

一実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき少なくとも４個かつ１０個未満のＰＥＧ部分を含む。別の実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき４個以上８個以下のＰＥＧ部分を含む。さらに別の実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき１個以上４個以下のＰＥＧ部分を含む。さらに別の実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき４個以上６個以下のＰＥＧ部分を含む。さらに別の実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき１個または２個のＰＥＧ部分を含む。

さらに別の実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき１個以上４個以下のＰＳＡ部分を含む。さらに別の実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき４個以上６個以下のＰＳＡ部分を含む。さらに別の実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき１個または２個のＰＳＡ部分を含む。

別の実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき４個以上６個以下のＰＥＧまたはＰＳＡ部分を含み、ポリマーは、遊離可能なリンカーまたは加水分解性のリンカーによって連結される。別の実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき１個または２個のＰＥＧまたはＰＳＡ部分を含み、ポリマーは、安定なリンカー、遊離可能なリンカーまたは加水分解性のリンカーによって連結される。

別の実施形態では、改変血液因子は、ＦＶＩＩａ１分子につき１個以上６個以下の水溶性ポリマー部分を含む。関連する実施形態では、改変血液因子は、ＦＶＩＩａ１分子につき１個または２個の水溶性ポリマー部分を含む。関連する実施形態では、水溶性ポリマーは、ＰＥＧまたはＰＳＡからなる群から選択される。一実施形態では、ポリマーは、安定なリンカー、遊離可能なリンカーまたは加水分解性のリンカーを介して連結される。

さらに別の実施形態では、改変血液因子は、ＦＶＩＩａ１分子につき１個以上６個以下の水溶性ポリマー部分を含む。なおさらなる実施形態では、改変血液因子は、ＦＩＸ１分子につき１個または２個の水溶性ポリマー部分を含む。特定の実施形態では、水溶性ポリマーは、ＰＥＧまたはＰＳＡからなる群から選択される。一実施形態では、ポリマーは、安定なリンカー、遊離可能なリンカーまたは加水分解性のリンカーを介して連結される。

さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の改変血液因子を含む医薬組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、その血液因子分子にコンジュゲートされている少数の水溶性ポリマーを有する改変血液因子分子を作製する方法であって、前記血液因子分子への少なくとも１個かつ１０個未満の水溶性ポリマーの結合を可能にする条件下で、前記血液因子分子を、血液因子分子に対して３０Ｍ過剰以下の水溶性ポリマーであるモル濃度過剰の水溶性ポリマーと接触させる工程を含む方法を企図する。

一実施形態では、モル濃度過剰の水溶性ポリマーは、２Ｍ過剰〜３０Ｍ過剰である。別の実施形態では、モル濃度過剰の水溶性ポリマーは、１０Ｍ過剰〜２５Ｍ過剰である。さらに別の実施形態では、モル濃度過剰の水溶性ポリマーは、約２Ｍ、約５Ｍ、約１０Ｍ、約１５Ｍ、約２０Ｍ、約２５Ｍまたは約３０Ｍ過剰である。

さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載の改変血液因子の治療的有効量を患者に投与する工程を含む、血液凝固障害を起こしている被験体を治療する方法を提供する。

一実施形態では、血液凝固障害は、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド症候群、第Ｘ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、アレキサンダー病、ローゼンタール症候群（血友病Ｃ）および第ＸＩＩＩ因子欠乏症からなる群から選択される。

関連する実施形態では、血液凝固障害は血友病Ａであり、改変血液因子は第ＶＩＩＩ因子分子を含む。

さらなる実施形態では、本方法で用いられる水溶性ポリマーは、上記の水溶性ポリマーである。関連する実施形態では、水溶性ポリマーはポリエチレングリコールである。

さらに別の実施形態では、本方法で用いられる血液因子は、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子およびフィブリノーゲンからなる群から選択される。一実施形態では、血液因子分子は第ＶＩＩＩ因子である。さらに別の実施形態では、血液因子はＦＶＩＩａである。さらなる実施形態では、血液因子はＦＩＸである。さらなる実施形態では、血液因子分子はヒトのものである。

図１は、低モル濃度過剰のＰＥＧを使用して調製した低度にペグ化された第ＶＩＩＩ因子のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図１Ａ：抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて染色、図１Ｂ：抗ＰＥＧ抗体を用いて染色。 図１は、低モル濃度過剰のＰＥＧを使用して調製した低度にペグ化された第ＶＩＩＩ因子のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図１Ａ：抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて染色、図１Ｂ：抗ＰＥＧ抗体を用いて染色。 図２は、ＦＶＩＩＩ欠乏マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで検出された低度にペグ化されたＦＶＩＩＩの薬物動態プロファイルを示す。このデータは、２００Ｕ／ｋｇに用量調節している。 図３は、ＦＶＩＩ欠乏マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで検出された、ペグ化されたタンパク質のＡＵＣ（図３Ａ）、半減期（ＨＬ、図３Ｂ）、および平均滞留時間（ＭＲＴ、図３Ｃ）と相関させたＦＶＩＩＩのペグ化度の比較を示す。 図４は、ＦＶＩＩＩ欠乏マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで検出された低度にポリシアル酸化されたｒＦＶＩＩＩの薬物動態プロファイルを示す。このデータは、２００Ｕ／ｋｇに調節している。 表１である。 表２である。

本発明は、少量の水溶性ポリマーを含む血液因子変異体を生成するための材料および方法を目的とし、この水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの量は、分子の半減期を延長するのに十分である。少量の水溶性ポリマーを含む改変血液因子は、標準の調製プロトコールを用いて調製される血液因子分子と比較して毒性が低いことを実証することが企図される。

他に定義されていない場合は、本明細書で用いるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、この発明で用いられる用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（第２版１９９４年）；ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８年）；ＴＨＥ ＧＬＯＳＳＡＲＹ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣＳ、第５版、Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１年）；およびＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ、ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１年）。

本明細書で引用される各刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それが本開示と矛盾しない程度に参照によりその全体が組み込まれる。

本明細書および添付の特許請求の範囲で用いるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の指示がない限り、複数体を含む。

本明細書で用いるように、以下の用語は、特に明記しない限りそれらに付される意味を有する。

用語「改変血液因子」は、水溶性ポリマーへのコンジュゲーション、追加の炭水化物部分へのコンジュゲーションなどの１つまたは複数の改変を有するか、さもなければ天然または野生型の血液凝固因子から改変された血液因子を指す。本明細書で用いる「血液因子」または「血液凝固因子」は、凝固カスケードに関与するものを含む、被験体で血液凝固に関与するタンパク質を指す。血液因子には、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子およびフィブリノーゲンが含まれるが、これらに限定されない。

用語「タンパク質」は、任意のタンパク質、タンパク質複合体またはポリペプチドを指し、ペプチド結合を介して連結されるアミノ酸残基で構成される組換えタンパク質、タンパク質複合体およびポリペプチドを含む。タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏ源（すなわち、天然に存在する）からの単離によって、合成法によって、または組換えＤＮＡ技術によって得られる。合成ポリペプチドは、例えば自動ポリペプチドシンセサイザーを用いて合成される。本発明によって用いられる組換えタンパク質は、本明細書で下に記載される、当技術分野で公知である任意の方法によって生成される。一実施形態では、タンパク質は生理活性タンパク質であり、治療タンパク質またはその生物活性誘導体を含む。用語「生物活性誘導体」は、そのタンパク質の実質的に同じ機能的および／または生物学的特性を有するタンパク質の誘導体を指す。用語「タンパク質」は、大きなポリペプチドを一般的に指す。用語「ペプチド」は、短いポリペプチドを一般的に指す。相違に関係なく、本明細書で用いるように、ポリペプチド、タンパク質およびペプチドは互換的に用いられる。

ポリペプチドの「断片」は、完全長ポリペプチドまたはタンパク質発現生成物よりも小さな、ポリペプチドの任意の部分を指す。一態様では、断片は、１つまたは複数のアミノ酸残基が完全長ポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端から除去されている、完全長ポリペプチドの欠失類似体である。したがって、「断片」は、下に記載される欠失類似体のサブセットである。

「類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）」、「類似体（ａｎａｌｏｇ）」または「誘導体」は、化合物、例えばペプチドであり、特定の例では異なる程度にではあるが、天然に存在する分子に構造が実質的に類似し、同じ生物活性を有するポリペプチドを指す。類似体は、その類似体が由来する天然に存在するポリペプチドと比較して、（ｉ）そのポリペプチドの１つまたは複数の末端および／または天然に存在するポリペプチド配列の１つまたは複数の内部領域における１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、（ｉｉ）そのポリペプチドの１つまたは複数の末端（一般的に「付加」類似体）および／または天然に存在するポリペプチド配列の１つまたは複数の内部領域（一般的に「挿入」類似体）における１つまたは複数のアミノ酸の挿入または付加、あるいは（ｉｉｉ）天然に存在するポリペプチド配列での１つまたは複数のアミノ酸の他のアミノ酸に代えての置換を含む１つまたは複数の変異に基づき、それらのアミノ酸配列の組成が異なる。

一態様では、類似体は、所与の化合物、例えばペプチドと約７０％の配列類似性であるが、１００％未満の配列類似性を示す。一態様では、そのような類似体または誘導体は、それらに限定されないが例として、ホモアルギニン、オルニチン、ペニシラミンおよびノルバリンを含む天然に存在しないアミノ酸残基、ならびに天然に存在するアミノ酸残基で構成される。別の態様では、そのような類似体または誘導体は、１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基で構成されるか、または２つ以上のアミノ酸残基の間で非ペプチド相互連結（ｉｎｔｅｒｌｉｎｋａｇｅ）を含む。本明細書で用いる用語「に由来する」は、野生型または天然に存在するポリペプチド配列またはペプチド配列の改変形（アミノ酸置換または欠失を含む）であって、その誘導体配列が、野生型または天然に存在する配列と約７０％、しかし１００％未満の配列類似性を共有するように、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失を有するポリペプチドまたはペプチド配列を指す。一実施形態では、誘導体は、その断片が、野生型ポリペプチドの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸の長さにわたって実質的に相同（すなわち、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％相同）である、ポリペプチドの断片であることができる。

配列比較のために、一般的に、１つの配列が参照配列の役割を演じ、それと試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列と比較した試験配列（複数可）の配列同一性割合を次に計算する。

比較のために最適な配列の整列は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２巻：４８２頁（１９８１年）のローカルホモロジーアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８巻：４４３頁（１９７０年）のホモロジーアラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行、または目視検査によって実行することができる。有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰであり、それはＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３５巻：３５１〜３６０頁（１９８７年）のプログレッシブアラインメント法の簡略化したものを使い、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ ５巻：１５１〜１５３頁（１９８９年）によって記載されている方法に類似する。配列の複数の整列を生成するのに有用な別のアルゴリズムは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２巻：４６７３〜４６８０頁（１９９４年））である。配列同一性割合および配列類似性を決定するために適するアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）、ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９巻：１０９１５頁（１９８９年）、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻：５８７３〜５７８７頁（１９９３年））。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公開されている。

置換は、置換されるアミノ酸およびそれを置換するアミノ酸の物理化学的または機能的関連性に基づき、保存的であるかまたは非保存的である。この種の置換は、当技術分野において周知である。あるいは、本発明は、非保存的でもある置換を包含する。例示的な保存的置換が、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５年）、７１〜７７頁）に記載され、下に提示される。

あるいは、例示的な保存的置換をすぐ下に提示する。

用語「変異体」は、通常その分子の一部ではない追加の化学物質部分を含むように改変される、タンパク質またはその類似体を指す。そのような部分は、様々な態様で、例えば、それらに限定されないが、分子の溶解性、吸収および生物学的半減期を改善する。あるいはそれらの部分は、分子の毒性を低減させること、分子の任意の望ましくない副作用を除去するかまたは減弱させることなどができる。そのような効果を媒介することができる部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０年）に開示されている。そのような部分を分子に結合させる手順は、当技術分野で周知である。特定の態様では、非限定的に、変異体は、グリコシル化、ＰＥＧ化またはポリシアリル化によって改変されるポリペプチドである。

タンパク質またはポリペプチドに適用される用語「天然に存在する」は、天然で見られるタンパク質を指す。例えば、天然源から単離され、研究室で人によって故意に改変されていない生物体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。用語「天然に存在する」および「野生型」は、全体を介して互換的に用いられる。

タンパク質またはポリペプチドに適用される用語「血漿由来」は、被験体の血漿または血清で見られる、天然に存在するポリペプチドまたはその断片を指す。

用語「水溶性ポリマー」は、水溶液に実質的に溶解性であるかまたは懸濁液の形態で存在し、薬学的に有効な量での前記ポリマーにコンジュゲートされたタンパク質の投与後に哺乳動物に実質的にいかなる悪影響も及ぼさず、生体適合性であるとみなすことができるポリマー分子を指す。一実施形態では、生理的に許容される分子は、約２〜約３００個の反復単位を含む。例示的な水溶性ポリマーには、それらに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体などのポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー類、ポリ（マレイン酸）、ポリ（ＤＬ−アラニン）、多糖類、例えばカルボキシメチルセルロース、デキストラン、デンプンもしくはデンプン誘導体、ヒアルロン酸およびキチン、ポリ（メタ）アクリレート、ならびに上のいずれかの組合せが含まれる。

水溶性ポリマー分子は特定の構造に限定されず、特定の態様では、分枝状、多重アーム、樹状であるか、または、分解可能、遊離可能もしくは加水分解性の結合を有する。さらに、ポリマー分子の内部構造は、さらに他の態様では、任意の数の異なるパターンで組織され、それらに限定されないが、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリポリマー、ランダムトリポリマーおよびブロックトリポリマーからなる群から選択される。

用語「ＰＥＧ化（ペグ化）」は、１つまたは複数のＰＥＧ部分に結合しているタンパク質、タンパク質複合体またはポリペプチドを指す。本明細書で用いる用語「ＰＥＧ化」は、１つまたは複数のＰＥＧをタンパク質に結合する工程を指す。一実施形態では、前記ＰＥＧの分子量は、２〜２００ｋＤａ、５〜１２０ｋＤａ、１０〜１００ｋＤａ、２０〜５０ｋＤａ、１０〜２５ｋＤａ、５ｋＤａ〜１０ｋＤａ、または２ｋＤａ〜５ｋＤａの範囲にある。

用語「ポリシアリル化」は、１つまたは複数のポリシアル酸（ＰＳＡ）部分に結合しているタンパク質、タンパク質複合体またはポリペプチドを指す。本明細書で用いる用語「ポリシアリル化」は、１つまたは複数のＰＳＡ部分をタンパク質に結合する工程を指す。一実施形態では、前記ＰＳＡの分子量は、２〜８０ｋＤａ、５〜６０ｋＤａ、１０〜４０ｋＤａ、または１５〜２５ｋＤａの範囲にある。

用語「リンカー」は、水溶性ポリマーを生物活性分子に連結する分子断片を指す。断片は、別のリンカーに、または直接に生物活性求核体に結合させるかまたはそれと反応するように活性化することができる、２つの官能基を一般に有する。例えば、リシンなどのω−アミノアルカン酸が一般に用いられる。本発明では、リンカーには、安定なリンカー、遊離可能なリンカー、分解可能なリンカーおよび加水分解性のリンカーが含まれる。

用語「医薬組成物」は、ヒトおよび哺乳動物を含む被験体動物での医薬使用に適する組成物を指す。医薬組成物は、ポリマー−ポリペプチドコンジュゲートの薬理学的に有効な量を含み、さらに、薬学的に許容される担体を含む。医薬組成物は、有効成分（複数可）、および薬学的に許容される担体を構成する不活性成分（複数可）、ならびに、成分の任意の２つ以上の組合せ、複合体化または集合から直接または間接に生じる任意の生成物を含む組成物を包含する。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物またはコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を混ぜることによって作製される任意の組成物を包含する。

用語「薬学的に許容される担体」は、任意のそしてすべての臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤ならびに賦形剤、例えばリン酸緩衝生理食塩水、デキストロースの５％水溶液、ならびに乳剤、例えば水中油型乳剤または油中水型乳剤、ならびに各種の湿潤剤および／またはアジュバントを含む。適する薬学的担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、１９９５年）に記載されている。組成物のために有用な薬学的担体は、活性剤の意図される投与様式によって決まる。一般的な投与様式には、経腸（例えば、経口）または非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内もしくは腹腔内の注射、または局所、経皮もしくは経粘膜投与）が含まれるが、これらに限定されない。「薬学的に許容される塩」は、薬学的使用のために化合物またはコンジュゲートに製剤化することができる塩であり、例えば金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）およびアンモニアまたは有機アミンの塩が含まれる。

用語「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、生物学的に、または他の種類で望ましくないことはない物質を意味し、すなわち、その物質は、下記のように当技術分野で周知の経路を用いて投与された場合に、いかなる望ましくない生物学的作用も引き起こさずに、またはそれが含まれる組成物の成分のいずれとも有害な方法で相互作用することなく個体に投与することができる。

用語「血液凝固障害」または「出血障害」は、被験体で血液が効率的に血塊を形成することができないことおよび以降の異常な出血をもたらす、いくつかの血液凝固因子の遺伝性欠乏症または発達した欠乏症のいずれかを指す。血液凝固障害には、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド症候群、第Ｘ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、アレキサンダー病、ローゼンタール症候群（血友病Ｃ）および第ＸＩＩＩ因子欠乏症が含まれるが、これらに限定されない。血液凝固障害の処置とは、予防的処置または治療的処置を指す。

「処置」とは、予防的処置または治療的処置を指す。「予防」処置は、病状の発生の危険を低減させるために、疾患の徴候を示さないか、または初期の徴候だけを示す被験体に投与される処置である。本発明の化合物またはコンジュゲートは、病状の発生の可能性を低減させるか、または発生した場合に病状の重症度を最小にするための予防的処置として与えることができる。「治療」処置は、病状の徴候または症状を低減または除去するために、病状の徴候または症状を示す被験体に投与される処置である。徴候または症状は、生化学的、細胞学的、組織学的、機能的、主観的または客観的であってよい。本発明の組成物は、治療処置として、または診断のために与えることができる。

本明細書で用いるように、用語「被験体」は、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例には、それらに限定されないが、哺乳動物綱の任意のメンバー、すなわち、ヒト、ヒト以外の霊長類、例えばチンパンジー、および他の類人猿およびサルの種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの畜産動物；ウサギ、イヌおよびネコなどの家畜動物；齧歯動物、例えばラット、マウスおよびモルモットを含む実験動物などが含まれる。非哺乳動物の例には、鳥、魚などが含まれるがこれらに限定されない。本用語は、特定の年齢または性別を表さない。

用語「有効量」は、被験体の健康状態、病状および疾患に対して所望の結果を生成するのに十分な、または診断目的のために十分な投薬量を意味する。所望の結果は、投薬のレシピエントにおける主観的または客観的な改善を含むことができる。「治療的有効量」は、健康に対する意図する有益な効果を生成するのに有効な薬剤の量を指す。任意の個々の場合での適当な「有効な」量は、当業者が通常の実験を用いて決定することができる。

タンパク質およびタンパク質複合体
医薬組成物で用いることが企図されるタンパク質には、被験体への投与に有用な生理活性血液凝固因子が含まれる。血液凝固因子は、タンパク質、またはそのタンパク質の治療活性または生物活性の一部、実質的にすべて、またはすべてを依然として保持するそのようなタンパク質の任意の断片、類似体または変異体である。一部の実施形態では、血液凝固因子は、発現もしくは生成されない場合、または発現もしくは生成が実質的に減少する場合、疾患を引き起こすであろうものである。一態様では、血液凝固因子は、哺乳動物に由来するかまたはそれから得られる。

本発明の様々な実施形態では、水溶性ポリマーにコンジュゲートされる血液凝固因子は、血液凝固因子またはそのタンパク質の生物活性を有するその断片であり、ヒトまたは哺乳動物のタンパク質の対応する部分のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、コンジュゲートの血液凝固因子は、ヒトまたは哺乳動物の種に本来備わっているタンパク質である。他の実施形態では、血液凝固因子またはその断片は、対応するヒトまたは哺乳動物のタンパク質の天然配列に実質的に相同である（すなわち、活性剤の少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０または２００アミノ酸の長さまたは全長にわたって、アミノ酸配列が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、より好ましくは９８％、または最も好ましくは９９％同一である）。

タンパク質の作製方法
組換えタンパク質の作製方法は、当技術分野で周知である。組換えタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを発現する、哺乳動物の細胞を含む細胞を生成する方法は、米国特許第６，０４８，７２９号、第５，９９４，１２９号および第６，０６３，６３０号に記載されている。これらの出願のそれぞれの教示は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

ポリペプチドまたはその断片、変異体もしくは類似体を発現するために用いられる核酸構築物は、一態様では、トランスフェクトされた哺乳動物細胞で染色体外（エピソーム）に発現されるもの、または、レシピエント細胞のゲノムにランダムに、もしくは相同組換えを介して前選択された標的部位に組み込まれるものである。染色体外に発現される構築物は、ポリペプチドをコードする配列に加えて、細胞でのタンパク質の発現に十分な配列、および任意選択で、構築物の複製に十分な配列を含む。それは、プロモーター、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列および／またはポリアデニル化部位を任意選択で含む。タンパク質をコードするＤＮＡは、その発現がプロモーターの支配下にあるように構築物中に位置する。任意選択で、構築物は、追加の成分、例えば以下の１つまたは複数を含む：スプライス部位、エンハンサー配列、適当なプロモーターの支配下の選択可能なマーカー遺伝子、および適当なプロモーターの支配下の増幅可能なマーカー遺伝子。

ＤＮＡ構築物が細胞のゲノムに組み込まれる実施形態では、一態様では、それはポリペプチドをコードする核酸配列だけを含む必要がある。任意選択で、構築物は、プロモーターおよびエンハンサー配列、１つまたは複数のポリアデニル化部位、１つまたは複数のスプライス部位、選択可能な１つまたは複数のマーカーをコードする核酸配列、増幅可能なマーカーをコードする核酸配列、および／またはゲノム中の選択部位へのＤＮＡの組込みを標的にするためのレシピエント細胞中のゲノムＤＮＡに相同なＤＮＡ（ターゲティングＤＮＡまたはＤＮＡ配列）を含む。

宿主細胞
組換えタンパク質を生成するのに用いられる宿主細胞は、それらに限定されないが、例えば細菌、酵母、昆虫、非哺乳類脊椎動物または哺乳動物の細胞である。哺乳動物の細胞には、それらに限定されないが、ハムスター、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヒトの細胞が含まれる。宿主細胞は不死化細胞（細胞系）または非不死化（一次もしくは二次）細胞であり、多種多様の細胞型、例えばそれらに限定されないが、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば、乳房上皮細胞、腸上皮細胞）、卵巣細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞すなわちＣＨＯ細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の形成要素（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、筋細胞、肝細胞およびこれらの体細胞型の前駆体のいずれかである。一般に用いられる宿主細胞には、それらに限定されないが以下のものが含まれる：グラム陰性またはグラム陽性の細菌などの原核生物の細胞、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａなどの任意の株；ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞などの真核生物の細胞；乳仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；ヒト腎臓２９３細胞；ＣＯＳ−７細胞；Ｄ．Ｍｅｌ−２、Ｓｆ４、Ｓｆ５、Ｓｆ９、およびＳｆ２１およびＨｉｇｈ５などの昆虫細胞；植物細胞ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａなどの様々な酵母細胞。

ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む宿主細胞は、細胞の増殖およびＤＮＡまたはＲＮＡの発現に適当な条件下で培養される。ポリペプチドを発現する細胞は公知の方法を用いて同定され、組換えタンパク質は公知の方法を用いて単離および精製されるが、ポリペプチド生成の増幅を伴っても伴わなくてもよい。同定は、それらに限定されないが、例えばタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの存在を示す表現型を提示する遺伝子改変哺乳動物細胞のスクリーニング、例えばＰＣＲスクリーニング、サザンブロット分析によるスクリーニングまたはタンパク質の発現についてのスクリーニングを介して実施される。タンパク質をコードするＤＮＡを組み込んでいる細胞の選択は、例えば、ＤＮＡ構築物中に選択可能なマーカーを含ませ、選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞だけの生存に適当な条件下で、選択可能なマーカー遺伝子を含むトランスフェクトまたは感染させた細胞を培養することによって達成される。導入されたＤＮＡ構築物のさらなる増幅は、増幅に適当な条件下で遺伝子改変細胞を培養すること（例えば、増幅可能なマーカー遺伝子の複数のコピーを含む細胞だけが生存することができる薬剤濃度の存在下で増幅可能なマーカー遺伝子を含む遺伝子改変細胞を培養すること）によって影響を受ける。

生理活性タンパク質または治療タンパク質である組換えタンパク質には、それらに限定されないが、サイトカイン、増殖因子、血液凝固因子、酵素、ケモカイン、可溶性細胞表面受容体、細胞接着分子、抗体、ホルモン、細胞骨格タンパク質、マトリックスタンパク質、シャペロンタンパク質、構造タンパク質、代謝タンパク質、および当業者に公知である他の治療タンパク質が含まれる。

治療薬として用いられる例示的な組換え血液凝固因子には、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子およびフィブリノーゲンが含まれるが、これらに限定されない。関連する実施形態では、タンパク質複合体は、１つまたは複数の血液因子を含む複合体である。

血液因子
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、哺乳動物の肝臓で生成される約２６０ｋＤａ分子量の血漿糖タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１２３）である。それは、血液凝固をもたらす凝固反応カスケードの重要な成分である。このカスケードの中には、第ＩＸａ因子が、ＦＶＩＩＩと一緒に第Ｘ因子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００４９５）を活性型の第Ｘａ因子に変換する工程がある。ＦＶＩＩＩはこの工程でコファクターとして働き、第ＩＸａ因子の活性のためにカルシウムイオンおよびリン脂質と共に必要とされる。２つの最も一般的な血友病障害は、機能的ＦＶＩＩＩ（血友病Ａ、全症例の約８０％）または機能的第ＩＸａ因子（血友病Ｂまたはクリスマス因子疾患）の欠乏に起因する。ＦＶＩＩＩは血漿中で非常に低い濃度で循環し、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）に非共有結合で結合している。止血の間、ＦＶＩＩＩは、ＶＷＦから分離し、カルシウムおよびリン脂質または細胞膜の存在下、活性化速度を上昇させることによって、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）媒介第Ｘ因子（ＦＸ）活性化のコファクターとしての役割を果たす。

ＦＶＩＩＩは、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を有する約２７０〜３３０ｋＤの単鎖前駆体として合成される。血漿から精製すると、ＦＶＩＩＩは重鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂ）および軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）で構成される。軽鎖の分子量は８０ｋＤであるが、重鎖は、Ｂドメイン中のタンパク質分解のために９０〜２２０ｋＤの範囲である。

ＦＶＩＩＩは、出血障害での治療的使用のための組換えタンパク質としても合成される。治療薬としての組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の潜在効力を判定するために、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが考案されている。これらのアッセイは、内因性ＦＶＩＩＩのｉｎ ｖｉｖｏ効果を模倣する。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって測定すると、ＦＶＩＩＩのｉｎ ｖｉｔｒｏトロンビン処理は、そのプロコアギュラント活性の速やかな増加および以降の減少をもたらす。この活性化および不活化は、ＦＶＩＩＩの異なる結合性エピトープの利用可能性を変化させる、例えばＦＶＩＩＩをＶＷＦから解離させてリン脂質表面に結合させるか、または特定のモノクローナル抗体への結合能力を変化させる、重鎖および軽鎖の両方での特異的タンパク質限定分解と一致する。

最近までは、血友病Ａの標準の治療は、ヒトドナーの血漿に由来するＦＶＩＩＩ濃縮製剤の頻繁な注入を含んでいた。この補充療法は全般的に有効であるが、そのような治療は、肝炎およびエイズなどのウイルス伝染性の疾患の危険に患者を置く。この危険は、モノクローナル抗体を用いる免疫精製による血漿からのＦＶＩＩＩのさらなる精製によって、および有機溶媒または熱による処理でウイルスを不活性化することによって低減されたが、そのような製剤は治療費を大いに増加させ、危険がないわけではない。これらの理由から、患者は予防的にではなく対症療法的に治療されてきた。さらなる課題（ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）は、約１５％の患者が血漿由来のＦＶＩＩＩに対する阻害抗体を発達させることである。ＦＶＩＩＩレベルが１％未満にある重度の血友病Ａを有する患者は、投薬間に１％を上回るＦＶＩＩＩを維持する目的で一般に予防療法を受ける。様々なＦＶＩＩＩ製品の循環中の平均半減期を考慮すると、通常、週につき２〜３回のＦＶＩＩＩの投与によってこれを達成することができる。

血友病Ａの治療における重要な進歩は、ヒトＦＶＩＩＩの完全な２，３５１アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡクローンの単離（Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻：３３０頁（１９８４年）および米国特許第４，７５７，００６号を参照）ならびにその生成のためのヒトＦＶＩＩＩ遺伝子ＤＮＡ配列および組換え方法の提供であった。血友病の治療のためのＦＶＩＩＩ製品には、それらに限定されないが、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（抗血友病因子（組換え）、血漿／アルブミンを含まない方法、ｒＡＨＦ−ＰＦＭ）、組換え抗血友病因子（ＢＩＯＣＬＡＴＥ（商標）、ＧＥＮＡＲＣ（登録商標）、ＨＥＬＩＸＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＫＯＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＧＥＮＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標））：ＭＯＮＯＣＬＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、第ＶＩＩＩ因子：Ｃの精製調製物、抗血友病因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体（ヒト）ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ（登録商標）およびＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）、抗血友病因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体（ヒト）；ならびにＨＹＡＴＥ Ｃ（登録商標）、精製ブタ第ＶＩＩＩ因子が含まれる。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）は、ＣＨＯ細胞で生成され、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造される。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の細胞培養工程、精製または最終製剤で、ヒトおよび動物の血漿タンパク質およびアルブミンは加えない。

フォン・ヴィレブランド因子は、１×１０^６〜２０×１０^６ダルトンの分子量の一連のマルチマーの形で血漿に存在する。ＶＷＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５４３）は、主に哺乳動物の内皮細胞で形成され、その後循環中に分泌される糖タンパク質である。この関係で、約２２０ｋＤの分子量を有するポリペプチド鎖から開始する、５５０ｋＤの分子量を有するＶＷＦ二量体は、いくつかの硫黄結合の形成によって細胞内で生成される。最高２０，０００，０００ダルトンまでの増大する分子量を有するＶＷＦのさらなるポリマーは、ＶＷＦ二量体の連結によって形成される。特に高分子ＶＷＦマルチマーが、血液凝固で本質的重要性を有すると推定される。

ＶＷＦ症候群は、ＶＷＦの過少生産または過剰生産がある場合に臨床上明らかになる。ＶＷＦの過剰生産は、血栓症（血液の流れを妨げる血管内側の血塊または血栓の形成）の増加を起こすが、高分子形態のＶＷＦのレベルの低下または不足は、血小板凝集および創傷閉鎖の阻害による出血の増加および出血時間の延長を起こす。

ＶＷＦは機能的第ＶＩＩＩ因子の必要不可欠な成分であるので、ＶＷＦの欠乏は表現型の血友病Ａを引き起こし得る。これらの例では、第ＶＩＩＩ因子の半減期は、血液凝固カスケード中でのその機能が損なわれる程度まで短くなる。フォン・ヴィレブランド疾患（ＶＷＤ）またはＶＷＦ症候群の患者は、第ＶＩＩＩ因子欠乏症をしばしば示す。これらの患者では、低下した第ＶＩＩＩ因子活性は、Ｘ染色体遺伝子の欠損の帰結でなく、血漿中のＶＷＦの定量的および定性的変化の間接的帰結である。血友病ＡとＶＷＤとの間の区別は、通常、ＶＷＦ抗原の測定、またはリストセチン−コファクター活性の測定によって達成することができる。ＶＷＦ抗原含量およびリストセチンコファクター活性の両方は、ほとんどのＶＷＤ患者で低下するが、それらは血友病Ａ患者では正常である。ＶＷＦ症候群の治療のためのＶＷＦ製品には、それらに限定されないが、ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ、ＩＭＭＵＮＡＴＥ（登録商標）、ＩＮＮＯＢＲＡＮＤ（登録商標）および８Ｙ（登録商標）が含まれ、それらは血漿からのＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ濃縮物を含む療法である。

セリンプロテアーゼ酵素である第ＶＩＩ因子（プロコンベルチン）は、血液凝固カスケード中の中心的タンパク質の１つである（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１２２）。第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）の主要な役割は、組織因子（ＴＦ）といっしょになって凝固過程を開始することである。血管損傷後、ＴＦは血液および循環第ＶＩＩ因子に曝露させられる。ＦＶＩＩは、ＴＦに結合すると、種々のプロテアーゼによってＦＶＩＩａに活性化されるが、それらのプロテアーゼには、トロンビン（第ＩＩａ因子）、活性化第Ｘ因子およびＦＶＩＩａ−ＴＦ複合体自体が含まれる。組換えヒト第ＶＩＩａ因子（ＮＯＶＯＳＥＶＥＮ（登録商標））は、補充（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）凝固因子に対する阻害因子を発達させた血友病患者において、制御不能の出血で使用するために導入されている。

第ＩＸ因子（ＦＩＸ、クリスマス因子）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１２４）は、第ＸＩａ因子または第ＶＩＩａ因子（組織因子経路の）によって活性化されない限り不活性である、セリンプロテアーゼである。第ＩＸａ因子に活性化されると、それは、第Ｘ因子のアルギニン−イソロイシン結合を加水分解することによって作用し、第Ｘａ因子を形成する。第ＶＩＩＩ因子は、ＦＩＸプロテアーゼ活性のための必要なコファクターである（Ｌｏｗｅ ＧＤ、Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． １１５巻：５０７〜１３頁、２００２年）。第ＩＸ因子の欠乏は、血友病Ｂすなわちクリスマス病を引き起こす。

追加の血液因子には、その欠乏が血栓症および異常プロトロンビン血症を引き起こす第ＩＩ因子（トロンビン）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００４９７）、その欠乏が出血性素因、または活性化プロテインＣ耐性として知られる形態の血栓形成傾向を引き起こす第Ｖ因子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１２１）、その欠乏がローゼンタール症候群（血友病Ｃ）を引き起こす第ＸＩ因子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１１９）、ならびにその欠乏がＩ型欠乏症（ＡおよびＢサブユニット両方の欠乏）およびＩＩ型欠乏症（Ａサブユニット単独の欠乏）として特徴付けられ、そのいずれも生涯の出血傾向、創傷治癒の欠陥および習慣性流産をもたらし得る第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１２０）およびサブユニットＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１９８５）が含まれる。

ポリペプチド類似体または変異体
ポリペプチドの断片、変異体または類似体を調製する方法は、当技術分野で周知である。ポリペプチドの断片は、酵素切断（例えば、トリプシン、キモトリプシン）を含む方法を用いて、さらに特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を生成する組換え手段を用いて調製される。断片は、一態様では、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン、二量体化もしくは多量体化ドメイン、または当技術分野で公知である任意の他の識別可能なドメインを含むように生成される。

類似体は、特定の態様では、その類似体が由来する天然に存在するポリペプチドに実質的に相同であるかまたは実質的に同一であり、本発明によって企図される類似体は、前記した天然に存在するポリペプチドの生物活性の少なくとも一部を保持するものである。

置換類似体は、一般的にタンパク質中の１つまたは複数の部位で野生型の１つのアミノ酸を別のものと交換し、他の機能または特性の喪失なしで、タンパク分解性切断に対する安定性などの、ポリペプチドの１つまたは複数の特性を調節するように設計することができる。この種の置換は、一般に保存的である。「保存的なアミノ酸置換」は、類似した化学特性の側鎖を有するアミノ酸によるアミノ酸の置換を意味する。保存的な置換を作製するための類似したアミノ酸には、酸性側鎖（グルタミン酸、アスパラギン酸）；塩基性側鎖（アルギニン、リシン、ヒスチジン）、極性アミド側鎖（グルタミン、アスパラギン）；疎水性の脂肪族側鎖（ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン）；芳香族側鎖（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）；小さな側鎖（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）；または脂肪族ヒドロキシル側鎖（セリン、スレオニン）を有するものが含まれる。

ポリヌクレオチドの類似体および断片は、天然に存在する分子に同じであるかまたは類似した生物活性を有する、天然に存在する分子の生物活性断片または類似体をコードするように、当分野の実施者（ｗｏｒｋｅｒ ｏｆ ｓｋｉｌｌ）によって容易に生成される。通常実施される方法には、ＰＣＲ技術、タンパク質分子をコードするＤＮＡの酵素消化、および異種ポリヌクレオチド配列とのライゲーションなどが含まれる。例えば、ＰＣＲおよび当分野で周知である他の技術を用いる点変異誘発は、どのアミノ酸残基がタンパク質活性に関連する特定の活性で重要であるかについて詳細に特定するために使用することができる。したがって、当業者は、変化したコドンおよびミスセンス変異をもたらすように、ＤＮＡ鎖で単一の塩基の変化を生成することができる。

タンパク質またはポリペプチドが、ポリペプチドである第二の薬剤をさらに含む本明細書に記載のタンパク質、すなわち融合タンパク質である類似体を作製するように改変されることが、さらに企図される。一実施形態では、ポリペプチドである第二の薬剤は、サイトカイン、増殖因子、血液因子、酵素、ケモカイン、可溶性の細胞表面受容体、細胞接着分子、抗体、ホルモン、細胞骨格タンパク質、マトリックスタンパク質、シャペロンタンパク質、構造タンパク質、代謝タンパク質、および当業者に公知である他の治療タンパク質、または、上記のタンパク質の断片または活性ドメイン、もしくは当技術分野で公知である任意の他の型のタンパク質の断片または活性ドメインである。関連する実施形態では、第二の薬剤は、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子およびフィブリノーゲンなどの血液凝固因子である。企図される融合タンパク質は、当技術分野で周知である化学的または組換えの技術によって作製される。

企図されるタンパク質変異体には、ユビキチン化、グリコシル化、治療剤もしくは診断剤へのコンジュゲーション、標識化（例えば、放射性核種もしくは様々な酵素による）、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）などの共有結合性ポリマー結合、非加水分解性結合の導入、および化学合成によるオルニチンなどのアミノ酸の挿入もしくは置換のような技術によって化学的に改変されるポリペプチドが含まれ、それらは、ヒトタンパク質では通常発生しない。変異体は、本発明の非改変分子の結合特性を保持する。

本発明の方法で有用な追加のポリペプチド変異体には、ポリシアリル化された（ＰＳＡ）部分を含むポリペプチドが含まれる。ポリシアリル化ポリペプチドを調製する方法は、米国特許出願公開第２００６０１６０９４８号およびＳａｅｎｋｏら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １２巻：４２〜５１頁、２００６年に記載されている。

水溶性ポリマー
一実施形態では、本発明は、そのタンパク質またはポリペプチドの生成、生存に有益な効果を提供する化学部分に連結されている、化学改変されたタンパク質またはポリペプチドを企図する。例えば、ポリペプチドへの水溶性ポリマー、例えばＰＥＧまたはＰＥＯの非特異的または部位特異的（例えば、Ｎ末端）コンジュゲーションは、免疫原性、腎クリアランスを潜在的に低減させることによって、および／またはプロテアーゼ抵抗性を改善することによって半減期を改善することが当技術分野で公知である。一部の実施形態では、本発明に用いられるポリペプチドは、その分子の半減期および／または安定性を向上させるためにペプチドのＮ末端またはＣ末端に共有結合で連結される、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーを含む。

タンパク質またはペプチドの安定性またはサイズを増加させるために、水溶性ポリマー、例えばそれらに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体などのポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、ポリ（マレイン酸）、ポリ（ＤＬ−アラニン）、多糖類、例えばカルボキシメチルセルロース、デキストラン、デンプンもしくはデンプン誘導体、ヒアルロン酸およびキチン、ポリ（メタ）アクリレート、ならびにポリシアル酸（ＰＳＡ）、および上のいずれかの組合せが、タンパク質またはペプチドに通常コンジュゲートされる。

高分子化学的改変は、一態様では、非特異的方法（誘導体化された種類の混合物をもたらす）で、または部位特異的方法（野生型高分子反応性に導かれる誘導体化および／または部位特異的変異誘発および化学的改変の組合せを用いる部位選択的改変に基づく）で、あるいは発現タンパク質ライゲーション方法を用いて実施される（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １３巻（４号）：２９７〜３０３頁（２００２年））。

本発明は、型、コンジュゲーション、結合および長さが異なる水溶性ポリマー、例えばＰＥＧまたはＰＥＯ分子の使用を企図する。特定の実施形態では、ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートには、それらに限定されないが、直鎖または分枝状のコンジュゲート、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）−またはアルデヒドに基づく化学物質によって連結されるポリマー−タンパク質コンジュゲート、水溶性ポリマー鎖とコンジュゲーション部位との間に異なる化学結合を有する変異体、および長さが異なる変異体が含まれる。一実施形態では、水溶性ポリマーがＰＥＧである場合、ＰＥＧの平均分子量は、約２〜２００キロダルトン（「ｋＤａ」）、約５ｋＤａ〜約１２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａまたは約２ｋＤａ〜約５ｋＤａである。

一態様では、本発明は、ＮＨＳにコンジュゲートし、長さが−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−であってｎ＝１０〜２０００である直鎖状ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲート、アルデヒドにコンジュゲートし、長さが−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−であってｎ＝１０〜２０００である直鎖状ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲート、ＮＨＳにコンジュゲートし、長さが１０〜２０００である２アーム分枝および多重アームのＰＥＧ−タンパク質コンジュゲート、ならびにＮＨＳにコンジュゲートしている３アーム分枝ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートからなる群から選択されるＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートを企図する。本発明は、そのコンジュゲーション部位とＰＥＧ鎖との間に異なる化学結合、例えば−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−、および−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎ＝１〜５）を含むＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートも企図する。本発明は、それらに限定されないが、例えば、カルボキシ化、硫酸化およびリン酸化された化合物（アニオン性）を含む、腎クリアランスを低減させるための荷電された、アニオン性ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートをさらに企図する（Ｃａｌｉｃｅｔｉ、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５５巻：１２６１〜７７頁、２００３年、Ｐｅｒｌｍａｎ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏ Ｍｅｔａｂ ８８巻：３２２７〜３５頁、２００３年、Ｐｉｔｋｉｎ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｂ Ａｇ Ｃｈｅｍｏ ２９巻：４４０〜４４頁、１９８６年、Ｖｅｈａｓｋａｒｉ、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ ２２巻：１２７〜１３５頁、１９８２年）。さらなる実施形態では、ペプチドは、ビスホスホネート、炭水化物、脂肪酸またはさらなるアミノ酸を含む部分に、任意選択でコンジュゲートされる。

ＰＥＧおよびＰＥＯには、分子量の分布を有する、すなわち多分散の分子が含まれる。サイズ分布は、その重量平均分子量（Ｍｗ）およびその数平均分子量（Ｍｎ）によって統計的に特徴付けることができ、それらの比率は多分散指数（Ｍｗ／Ｍｎ）と呼ばれる。ＭｗおよびＭｎは、質量分析によって測定することができる。ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートのほとんど、特に１ＫＤよりも大きなＰＥＧにコンジュゲートしているものは、親ＰＥＧ分子の多分散の性質のために様々な分子量を示す。例えば、ｍＰＥＧ２Ｋ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ−０２０ＨＳ、ＮＯＦ）の場合には、実際の分子量は１．５〜３．０ＫＤの範囲に分散し、多分散指数は１．０３６である。例外は、ＭＳ（ＰＥＧ）ｎ（Ｎ＝４、８、１２または２４、例えばＰＥＯ４、ＰＥＯ１２）に基づく試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）にコンジュゲートしているタンパク質であり、それらは、別々の鎖長および既定の分子量を有する単分散の混合物として特別に調製される。

ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ治療的半減期がＰＥＧ化から利益を受けるかどうか判定するために、様々な異なるＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートを合成して、薬物動態についてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで特徴付ける。

一般に、本発明のＰＥＧ化タンパク質の調製方法は、（ａ）ＰＥＧがそのタンパク質のＮ末端／Ｃ末端に結合する条件下で目的のタンパク質をポリエチレングリコールと反応させる工程、および（ｂ）反応生成物（複数可）を得る工程を含む。タンパク質のＰＥＧ化は、タンパク質の固有の活性をかなり変化させるかもしれないので、異なる型のＰＥＧが探究される。タンパク質のＰＥＧ化のために用いることができる化学物質には、メトキシ−ＰＥＧ（Ｏ−［（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）−メチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール）のＮＨＳエステルを用いる、タンパク質の一級アミンのアシル化が含まれる。メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳまたはメトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡによるアシル化は、元の一級アミンから電荷を除去するアミド結合を生じる（同じく、Ｃ末端のＢｏｃ−ＰＥＧも）。リボソームタンパク質の合成と異なり、合成ペプチドの合成は、Ｃ末端からＮ末端にかけて進行する。したがって、Ｂｏｃ−ＰＥＧは、ペプチドのＣ末端にＰＥＧを結合する１つの方法（すなわち、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔｅｒｔ−（Ｂ）ｕｔｙｌ（ｏ）ｘｙ（ｃ）ａｒｂｏｎｙｌ）（Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｏｃ）合成を用いる）である（Ｒ． Ｂ． Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３年）、「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｉ． Ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ」、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５巻：２１４９〜２１５４頁）。あるいは、側鎖保護基を除去するためにフッ化水素酸の危険な使用を必要としないので、フルオレニルメトキシカルボニル（（Ｆ）ｌｕｏｒｅｎｙｌ−（ｍ）ｅｔｈ（ｏ）ｘｙ−（ｃ）ａｒｂｏｎｙｌ）（ＦＭＯＣ）化学（Ａｔｈｅｒｔｏｎ， Ｅ．、Ｓｈｅｐｐａｒｄ， Ｒ．Ｃ．（１９８９年）、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ．）が用いられる。

一実施形態では、水溶性ポリマーがＰＳＡである場合、ＰＳＡの平均分子量は、約２〜８０ｋＤａ、５〜６０ｋＤａ、１０〜４０ｋＤａまたは１５〜２５ｋＤａの範囲である。

目的のポリペプチドへの水溶性ポリマーのコンジュゲーションを促進することができる例示的な安定なリンカーには、それらに限定されないが、アミド、アミン、エーテル、カルバメート、チオ尿素、尿素、チオカルバメート、チオカーボネート、チオエーテル、チオエステルおよびジチオカルバメート結合、例えばω，ω−アミノアルカン、Ｎ−カルボキシアルキルマレイミドまたはアミノアルカン酸、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒド、または無水コハク酸、Ｎ−カルボキシメチルマレイミドＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレートおよび１，１’−ビス［６−（トリフルオロメチル（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙ））ベンゾ−トリアゾリル］オキサレートが含まれる。

他の実施形態では、水溶性ポリマーは、遊離可能、分解可能または加水分解性のリンカーを用いてポリペプチドにコンジュゲートされる。加水分解性の結合は、生理的条件の下で水と反応する（すなわち、加水分解される）比較的弱い結合である。水中で加水分解する結合の傾向は、２つの中心原子を連結する結合の一般型だけでなく、これらの中心原子に結合する置換基にも依存する。加水分解性リンカーを有する水溶性ポリマーを含むコンジュゲートの作製方法は、米国特許第７，２５９，２２４号（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）および米国特許第７，２６７，９４１号（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓおよびアメリカ国立衛生研究所）に記載されている。例えば、加水分解を受けるエステル結合をポリマー骨格に有するＰＥＧを調製することができる。この加水分解は、より低い分子量の断片へのポリマーの切断をもたらす。加水分解的に不安定、遊離可能または分解可能である適当な結合には、それらに限定されないが、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール類、ケタール類、アシルオキシアルキルエーテル、イミン類、オルソエステル類、ペプチド類およびオリゴヌクレオチド類、チオエステル類、チオールエステル類ならびに炭酸エステル類が含まれる。ポリマー骨格に含ませることができる加水分解的に分解可能な結合には、カルバメート、カルボネート、サルフェートおよびアシルオキシアルキルエーテル結合；例えばアミンおよびアルデヒドの反応から生じるイミン結合（例えば、Ｏｕｃｈｉら、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ、３８巻（１号）：５８２〜３頁（１９９７年）を参照）；カルバミン酸エステル、リン酸エステル、ヒドラゾン、アセタール、ケタールまたはオルソエステル結合、例えばアセトン−ビス−（Ｎ−マレイミドエチル）ケタールリンカー（ＭＫ）が含まれる。

本方法は、ポリマー−：タンパク質コンジュゲートの実質的に均質の（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）混合物を提供する。本明細書で用いる「実質的に均質の」は、ポリマー−タンパク質コンジュゲート分子だけが観察されることを意味する。ポリマー−タンパク質コンジュゲートは生物活性を有し、本「実質的に均質の」ＰＥＧ化タンパク質調製物は、均質の調製物の利点、例えば臨床適用におけるロット間の薬物動態の予測可能性の容易さを提示するのに十分均質であるものである。

本明細書に記載される結合方法での使用が企図されるポリマー分子は、水溶性ポリマーまたはその混合物の中から選択することができる。重合度を調節することができるように、ポリマーは、単一の反応基、例えばアシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドを有することができる。水溶性ポリマー、または所望によりその混合物は、例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ−ＰＥＧ、ＰＥＯ、デキストラン、デンプンもしくはデンプン誘導体、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）、プロピレングリコールホモポリマー類、脂肪酸類、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えば、グリセロール）、ＨＰＭＡ、ＦＬＥＸＩＭＡＲ（商標）、およびポリビニルアルコール、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧ、アリールオキシ−ＰＥＧ、トレシルモノメトキシＰＥＧ、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ビス−スクシンイミジルカーボネートＰＥＧ、セルロース、他の炭水化物に基づくポリマー類、またはそれらの混合物からなる群から選択することができる。選択されるポリマーは、それが結合するタンパク質が、水性環境、例えば生理的環境で沈殿しないように水溶性であるべきである。ポリマーは、分枝状でも非分枝状でもよい。好ましくは、最終生成物の調製物の治療的使用のために、ポリマーは薬学的に許容される。ＰＥＧ部分を含むペプチドを生成する方法は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第５，８２４，７８４号を参照。

用語ＰＥＧは、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールなどの他のタンパク質を誘導体化するのに用いられているＰＥＧの形態のいずれも包含するものとする。ＰＥＧポリマーは、分枝状でもよくまたは非分枝状でもよい。好ましくは、最終生成物の調製物の治療的使用のために、ポリマーは薬学的に許容される。一実施形態では、反応性アルデヒドは、水安定性のＰＥＧ−プロピオンアルデヒド、またはモノ−Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照）。

本発明は、それらに限定されないが１０〜２０００個の反復単位（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）を含むいくつかの異なる直鎖状ＰＥＧポリマー長、または２アーム分枝状ＰＥＧポリマーのコンジュゲートを企図する。１２〜５０個の単位を有する、ＮＨＳまたはアルデヒドに基づくＰＥＧ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎがさらに企図される。一般に、本明細書で企図されるＰＥＧ化反応のために、加えられるＰＥＧ部分の平均分子量は、約１ｋＤａ〜約６０ｋＤａ（用語「約」は±１ｋＤａを示す）である。より好ましくは、平均分子量は約１０〜４０ｋＤａである。

本発明は、タンパク質にコンジュゲートしている低度の水溶性ポリマーを有する血液因子などの改変タンパク質を提供する。タンパク質の低度ＰＥＧ化形態は、コンジュゲーション反応において、タンパク質に対して低下したモル濃度過剰の水溶性ポリマーを用いて生成される。例えば、タンパク質をＰＥＧ化する一般的な方法は、目的のタンパク質に対して６１．８Ｍ過剰のＰＥＧを用いる。本明細書で記載される低度ＰＥＧ化タンパク質は、標準の技術で用いられるものよりも小さいモル濃度過剰を反応で用いて生成されることが企図される。一実施形態では、水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧが直鎖状または分枝状のＰＥＧであり、本明細書に記載される分子量および特徴を有することができることが企図される。

さらに、本明細書に記載の低度ＰＥＧ化タンパク質が、血液因子１分子につき少なくとも１個かつ１０個以下の水溶性ポリマー部分を含むことが企図される。一実施形態では、改変タンパク質は、タンパク質１分子につき少なくとも２、３、４、５、６、７、８または９個の水溶性ポリマー部分を含む。別の実施形態では、改変タンパク質は、タンパク質１分子につき４個以上８個以下の水溶性ポリマー部分を含む（すなわち、４、５、６、７および８個のポリマー部分を含む）。一部の実施形態では、改変タンパク質は、血液因子である。さらなる実施形態では、改変血液因子は、タンパク質１分子につき１個以上４個以下の水溶性ポリマー部分を含む。さらに別の実施形態では、改変血液因子は、タンパク質１分子につき４個以上６個以下の水溶性ポリマー部分を含む。さらなる別の実施形態では、改変血液因子は、タンパク質１分子につき１個または２個の水溶性ポリマー部分を含む。

本明細書で用いるように、用語「の間」は、水溶性ポリマーの数との関連で用いられる場合、例えば「４〜８個の水溶性ポリマーを含む」は、挙げられた数字、および挙げられた数字の間の数字を含む。例えば、４〜８個の水溶性ポリマーは、４個、５個、６個、７個および８個の水溶性ポリマーを指す。

関連する実施形態では、血液因子は、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子およびフィブリノーゲンからなる群から選択される。さらなる実施形態では、血液因子分子は、第ＶＩＩＩ因子である。さらなる実施形態では、血液因子分子はヒトのものである。関連する実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき少なくとも４個かつ１０個未満のＰＥＧ部分を含む。まださらなる実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき４、５、６、７、８、９または１０個の水溶性ポリマー部分を含む。

別の実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき４個以上８個以下のＰＥＧ部分、４個以上６個以下のＰＥＧ部分、または１個以上４個以下のＰＥＧ部分を含む。さらに別の実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき１個または２個のＰＥＧ部分を含む。ＰＥＧ分子は、安定なリンカー、遊離可能なリンカーまたは加水分解性リンカーを介して血液因子に連結またはコンジュゲートすることが企図される。

さらに別の実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき１個以上４個以下のＰＳＡ部分を含む。さらに別の実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき４個以上６個以下のＰＳＡ部分を含む。さらに別の実施形態では、改変血液因子は、第ＶＩＩＩ因子１分子につき１個または２個のＰＳＡ部分を含む。ＰＳＡ分子は、安定なリンカー、遊離可能なリンカーまたは加水分解性リンカーを介して血液因子に連結またはコンジュゲートすることが企図される。

別の実施形態では、改変血液因子はＦＶＩＩａである。関連する実施形態では、改変血液因子は、ＦＶＩＩａ１分子につき１個以上６個以下の水溶性ポリマー部分を含む。一部の実施形態では、改変血液因子は、ＦＶＩＩａ１分子につき１個または２個の水溶性ポリマー部分を含む。関連する実施形態では、水溶性ポリマーは、ＰＥＧまたはＰＳＡからなる群から選択される。特定の実施形態では、ポリマーは、安定なリンカー、遊離可能なリンカーまたは加水分解性リンカーを介して連結される。

さらに他の実施形態では、改変血液因子はＦＩＸである。一実施形態では、改変血液因子は、ＦＩＸ１分子につき１個以上６個以下の水溶性ポリマー部分を含む。一部の実施形態では、改変血液因子は、ＦＩＸ１分子につき１個または２個の水溶性ポリマー部分を含む。関連する実施形態では、水溶性ポリマーは、ＰＥＧまたはＰＳＡからなる群から選択される。一実施形態では、ポリマーは、安定なリンカー、遊離可能なリンカーまたは加水分解性リンカーを介して連結される。

医薬組成物
本発明は、本発明のタンパク質または誘導体生成物の有効量を、薬学的に許容される希釈剤、安定剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と一緒に含む医薬組成物を企図する。そのような組成物は、様々な緩衝剤含量（例えば、トリス−ＨＣｌ、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版（１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．）１４３５頁：１７１２頁を参照。有効成分の有効量は、治療的、予防的にまたは診断上有効な量であり、それは、体重、年齢および治療目標などの因子を考慮することによって当業者が容易に決定することができる。

本発明のポリマー−タンパク質組成物は、溶液のｐＨを所望の範囲内に維持するために、緩衝剤を含むこともできる。好ましい剤には、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムが含まれる。これらの緩衝剤の混合物を用いることもできる。組成物で有用な緩衝剤の量は、用いる特定のバッファーおよび溶液のｐＨに大きく依存する。例えば、アセテートはｐＨ６よりもｐＨ５でより効率的なバッファーであるので、ｐＨ６よりもｐＨ５の溶液でより少ないアセテートを用いることができる。本発明の組成物のための好ましいｐＨ範囲は、ｐＨ３．０〜７．５である。

本発明の組成物は、溶液を等張性にして注射により適合させるために、等張性調節剤をさらに含むことができる。最も好ましい作用物質（ａｇｅｎｔ）は、０〜１５０ｍＭの濃度範囲内の塩化ナトリウムである。

本明細書に記載の方法は、上記の分子を、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤またはビヒクル、および任意選択で他の治療成分および／または予防成分と一緒に含む医薬組成物を用いる。そのような賦形剤には、例えば、水、食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノール、シクロデキストリン類、改変シクロデキストリン類（すなわち、スルホブチル（ｓｕｆｏｂｕｔｙｌ）エーテルシクロデキストリン類）などの液体が含まれる。非液体製剤のために適する賦形剤も、当業者に公知である。

薬学的に許容される塩を本発明の組成物で用いることができ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸塩が含まれる。薬学的に許容される賦形剤および塩に関する完全な解説は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版（Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）で入手できる。

さらに、補助剤、例えば湿潤剤または乳化剤、生物学的緩衝物質、界面活性剤、などがそのようなビヒクルに存在してもよい。生物学的バッファーは、薬理学的に許容され、所望のｐＨ、すなわち生理的許容範囲のｐＨを有する製剤を提供する、実質的に任意の溶液であってもよい。バッファー溶液の例には、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝食塩水、Ｈａｎｋの緩衝食塩水、などが含まれる。

キット
追加の態様として、本発明は、本発明の方法を実施するためのそれらの使用を促進する方法でパックされる、１つまたは複数の化合物または組成物を含むキットを含む。一実施形態では、そのようなキットは、密封されたボトルまたは容器などの容器にパックされている、本明細書に記載の化合物または組成物（例えば、低度ＰＥＧ化第ＶＩＩＩ因子などの改変血液因子を含む組成物）を含み、ラベルがその容器に貼付されるか、またはその方法を実施する際のその化合物または組成物の使用法を記載するパッケージに含まれる。好ましくは、化合物または組成物は、単位剤形でパックされる。キットは、特定の投与経路によって組成物を投与するのに適する用具をさらに含むことができる。好ましくは、キットは、改変血液因子組成物の使用法を記載するラベルを含む。

本発明の追加の態様および詳細は以下の実施例から明らかであり、それらは限定ではなく例示することが目的である。

（実施例１）
低度にペグ化された（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）第ＶＩＩＩ因子の合成
治療用タンパク質として投与される分子の半減期を延長し、安定性を改善するために、水溶性ポリマー加えることによって血液凝固因子の改変を行った。しかし、水溶性ポリマーが高度に結合することにより、ｉｎ ｖｉｖｏの毒性が強くなる恐れがある。したがって、治療用分子の有効性を改善するために、水溶性ポリマーのコンジュゲートの程度を低下させるための実験を行った。

インタクトなＢドメインを含有するペグ化されたｒＦＶＩＩＩの合成は、米国特許公開第２００７０２４４３０１号および国際特許公開第ＷＯ２００７／１２６８０８号パンフレットに記載されている。このインタクトなＢドメインを含有するペグ化されたｒＦＶＩＩＩは、実験条件下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性およびｉｎ ｖｉｖｏ特性の改善を示し、少なくとも部分的にペグ化されたｒＦＶＩＩＩ分子の軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）がもたらされた。

しかし、治療用タンパク質の比較的高度な改変をもたらす化学的なプロセスは、大量の試薬を必要とするため、経済的でない。さらに、高度なペグ化度は、大量のポリマーおよびリンカーによる毒性学的危険性の増加をもたらす。したがって、低度のＰＥＧ部分を有する分子を生成するために、調製プロセスにおける試薬濃度を減らし、試薬濃度を６１．８Ｍ過剰（標準）から、それぞれ、３０Ｍ過剰、２５Ｍ過剰、２０Ｍ過剰および１５Ｍ過剰まで減らすことによって異なるＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩを調製した。

当技術分野で記載されるペグ化変異体は、変化する遊離特性ならびに異なる分子量のＰＥＧ鎖を有する。例えば、ＷＯ２００８０８２６６９およびＵＳ２００８０２３４１９３（Ｎｅｋｔａｒ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓおよびＢａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を参照されたい。６１．８Ｍ過剰の遊離可能なＰＥＧ試薬を使用することにより、長時間の遊離特性を持つ、ＰＥＧ鎖の分子量が２０ｋＤである分枝（分枝長Ｌｙｓ２０Ｋ）を有するペグ化されたｒＦＶＩＩＩ変異体の１つを調製した。このペグ化されたｒＦＶＩＩＩを、この分子がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのデータにおいて測定されたので、ペグ化度を改変するための主要な候補として選択した。最初のペグ化されたｒＦＶＩＩＩ候補について、６１．８Ｍ過剰のＰＥＧを使用してコンジュゲートを調製した際に、当技術分野で記載されるＨＰＬＣ法を使用することにより（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．、１８巻：３７１〜８頁、２００７年を参照されたい）、ペグ化度１１．１ＰＥＧ／ｒＦＶＩＩＩ（ｍｏｌ／ｍｏｌ）が測定された。

ｒＦＶＩＩＩをペグ化するためのプロセスは以下の通りであった：室温、ｐＨ７．２＋／−０．２で２時間、ｒＦＶＩＩＩをペグ化（ｃ＝２ｍｇ／ｍｌ）；試薬濃度（試薬３．９ｍｇ／ｍｇタンパク質−６１．８Ｍ過剰）；グリシンを加えることによる反応の停止／クエンチ；ＱセファロースＨＰでの精製。約０．５ＭのＮａＣｌを用いる溶出：ＵＦ／ＤＦおよびペグ化された分子の最終製剤化。低ＰＥＧコンジュゲートを、指示されたモル濃度過剰のＰＥＧポリマーを使用して上記の通り調製した。使用したＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ試料は以下の通りであった：１５Ｍ過剰：ＶＩＥＨＬＵＦＢ０８００７ＰＨＲ；２０Ｍ過剰：ＶＩＥＨＬＵＦＢ０８０１６ＰＨＲ；２５Ｍ過剰：ＶＩＥＨＬＵＦＢ０８０１７ＰＨＲ；３０Ｍ過剰：ＶＩＥＨＬＵＦＢ０８００８ＰＨＲ、ＶＩＥＨＬＵＦＢ０８００９ＰＨＲ、ＶＩＥＨＬＵＦＢ０７０２９ＰＨＲ；６１．８Ｍ過剰（当技術分野で標準のプロトコール）および天然のＦＶＩＩＩ：ＶＩＥＨＬＵＦＢ０８０１８ＰＨＲ、ＯＲＨＬＵＦＢ０７０１６ＰＨＲ、ＯＲＨＬＵＦＢ０７０１７ＰＨＲ、ＯＲＨＬＵＦＢ０８００１ＰＨＲ、ＯＲＨＬＵＦＢ０８００２ＰＨＲ。

再合成された候補について、８ＰＥＧ／ｒＦＶＩＩＩ度が決定された。低ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩを、以下の実施例に記載の通りｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでさらに特徴付けた。

（実施例２）
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏにおける低度にペグ化された血液因子分子の分析
一態様では、低ＰＥＧ試料を、ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ分子の分子量および一般構造について、ならびにＰＥＧをコンジュゲートしたＦＶＩＩＩ分子の比活性について分析した。ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ構造のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析をＷＯ ２００７／１２６８０８にある通りに行った。簡単に述べると、天然のｒＦＶＩＩＩを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）から入手した４〜１２％のポリアクリルアミド勾配ゲルを製造者の説明書に従って使用することにより、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付けた。分子量マーカー（ＭＷ）として、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手したＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓマーカー（１０ｋＤ〜２５０ｋＤ）を使用した。次いで、タンパク質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手したＰＶＤＦ膜に電気ブロッティングによって移し、その後、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ（Ｈｏｒｎｂｙ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）から入手したポリクローナルヒツジ抗ヒトＦＶＩＩＩ：Ｃ抗体と一緒にインキュベートした。免疫染色手順の最後の工程は、Ａｃｃｕｒａｔｅ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）から入手したアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）をコンジュゲートした抗ヒツジ抗体と一緒にインキュベートした後、ＡＬＰ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用することによって最終的に可視化することであった。

そのうえ、ＦＶＩＩＩ分子の比活性を、ＷＯ２００７／１２６８０８に記載の通り、ＦＶＩＩＩ色素形成アッセイ（Ｒｏｓｅｎ Ｓ， Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ３３巻：（追補４０）：１３９〜４５頁、１９８４年）を使用してアッセイした。この方法は、Ｐｈ． Ｅｕｒ． 第５版（５．０５）２．７．４ Ａｓｓａｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩに基づいている。第ＶＩＩＩ因子を含有する試料を、カルシウムを含有するバッファー中でトロンビン、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、リン脂質および第Ｘ因子（ＦＸ）と混合する。ＦＶＩＩＩは、トロンビンによって活性化され、その後、リン脂質、ＦＩＸａおよびカルシウムイオンと複合体を形成する。この複合体が第Ｘ因子を第Ｘａ因子に活性化し、今度はそれが色素形成基質ＦＸａ−１（ＡｃＯＨ＊ＣＨ３ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を切断する。遊離したパラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）の時間経過を、マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍにおいて測定する。反応の傾きは、試料中の第ＶＩＩＩ因子の濃度に比例する。ＦＶＩＩＩの抗原価を、市販のＥＬＩＳＡシステム（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｈｏｒｎｂｙ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を軽度に改変して使用することにより測定した。これらの値から、ＦＶＩＩＩ色原体／ＦＶＩＩＩ抗原の比を算出した。調製物中のタンパク質含有量を、２８０ｎｍにおける光学濃度を測定することによって決定した。これらのデータから、タンパク質含有量を算出した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１に示す。ＦＶＩＩＩ特異的抗体を使用したＦＶＩＩＩ含有量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価により、より低いモル濃度過剰のＰＥＧ分子（１５Ｍ過剰、２０Ｍ過剰、２５Ｍ過剰および３０Ｍ過剰）と組み合わせたＦＶＩＩＩが、天然のＦＶＩＩＩと比較してより低い分子量の分子を産生したが、検出されたＦＶＩＩＩ分子は、より過剰なＰＥＧ分子（６１．８Ｍ過剰）を使用した場合に現れるＦＶＩＩＩ分子と同様であることが実証されている。ＰＥＧ特異的抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの探索により、試験したすべてのＰＥＧ試料においてより高い分子量種のＰＥＧ−ＦＶＩＩＩが検出された。

低度にペグ化されたＦＶＩＩＩの比活性の分析（および関連産物データ）を表１に示す。これらの結果は、低度にペグ化されたＦＶＩＩＩの比活性は、高モル濃度過剰を使用して調製したＰＥＧ−ＦＶＩＩＩよりも天然のＦＶＩＩＩに類似していることを示している。例えば、天然のＦＶＩＩＩの比活性、３７０６ＩＵ／ｍｇと比較して、たった１５Ｍ過剰のＰＥＧを使用して調製したＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ試料の比活性は２２２１ＩＵ／ｍｇであることが実証された。対照的に、一般的なペグ化プロトコール（６１．８Ｍ過剰のＰＥＧを有する）を使用して調製した試料は、３９８ＩＵ／ｍｇの高さから１０４ＩＵ／ｍｇの低さまでの比活性を示した。したがって、１５Ｍ過剰のＰＥＧを使用して調製したＰＥＧ−ＦＶＩＩＩは、標準のプロトコール（６１．８Ｍ過剰）を使用して調製したＰＥＧ−ＦＶＩＩＩの最高活性よりもおよそ５．５倍強い活性を示した。同様に、２０Ｍ過剰のＰＥＧを用いて調製したＦＶＩＩＩは、標準のプロトコールを使用して調製したＦＶＩＩＩよりも少なくとも３．８倍強い活性を示し、２５Ｍ過剰のＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ分子は、標準の調製プロトコールよりも少なくとも３．２倍強い活性を示し、３０Ｍ過剰のＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ（９６９ＩＵ／ｍｌ）は、標準の（６１．８Ｍ過剰のＰＥＧ）調製プロトコールよりも少なくとも２．４倍強い活性を示した。

これらの結果は、ＦＶＩＩＩに対する低モル濃度過剰のＰＥＧの比率を使用してペグ化したＦＶＩＩＩタンパク質により、天然のＦＶＩＩＩのおよそ９分の１より低い比活性を示す、高モル濃度過剰のＰＥＧを使用して調製したＰＥＧ−ＦＶＩＩＩと比較して、天然のＦＶＩＩＩタンパク質の生物活性と近い生物活性を有する低ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩがもたらされることを例示している。比活性が増加し、ＰＥＧ分子数がより低減することにより、毒性副作用の可能性が減少したより有効な治療用分子がもたらされる。

（実施例３）
低度にペグ化された分子のｉｎ ｖｉｖｏにおける薬物動態
ｉｎ ｖｉｖｏにおける低度にペグ化されたｒＦＶＩＩＩの薬物動態を決定するために、ＦＶＩＩＩ欠乏ノックアウトマウスモデルを使用した。Ｂｉら（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９９５年；１０巻：１１９〜２１頁）に記載のＦＶＩＩＩ欠乏マウスを重度のヒト血友病Ａのモデルとして使用した。

マウス（ｎ＝６）に、実施例１に従って調製した低ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩまたは天然のｒＦＶＩＩＩのいずれかを２０〜３０μｇ／ｋｇ体重の用量で用いた、尾静脈を経由したボーラス投与を受けさせた。使用したＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ試料は以下の通りであった：ｒＦＶＩＩＩＰＥＧＨ０７００１ＦＣ（８．５ＰＥＧ度−ｍｏｌ／ｍｏｌ、結合ＰＥＧ）、２９７μｇ／ｋｇ；ＶＩＥＨＬＵＦＢ０７０２９ＰＨＲ（７．９ＰＥＧ度−ｍｏｌ／ｍｏｌ、結合ＰＥＧ）、１４４μｇ／ｋｇ；ＶＩＥＨＬＵＦＢ０８００７ＰＨＲ（４．４ＰＥＧ度−ｍｏｌ／ｍｏｌ、結合ＰＥＧ）、６６μｇ／ｋｇ。注射の５分後、３時間後、６時間後、９時間後、１６時間後、２４時間後および３２時間後、および場合によっては４８時間後、５６時間後および７２時間後の間隔でそれぞれの群から、麻酔した後、心臓穿刺によってクエン酸塩血漿を調製した。ＦＶＩＩＩの活性レベルを血漿試料において測定した。ＭｉｃｒｏＭａｔｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、薬物動態ライブラリーからのモデル１（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて半減期の算出を行った。

この実験の結果を図２および３および表２に示す。結果は、終末半減期はペグ化度が４．４〜８．５のＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩと同様であること示している（図３および表２）。表２は、低度にペグ化されたｒＦＶＩＩＩの半減期（ＨＬ）および平均滞留時間（ＭＲＴ）が天然のＦＶＩＩＩと比較して増加することを例示している。そのうえ、曲線下面積（ＡＵＣ）は、低度にペグ化されたＦＶＩＩＩでは天然のＦＶＩＩＩと比較して増加し、これは、天然のｒＦＶＩＩＩと比較して低度にペグ化されたＦＶＩＩＩ変異体の薬物動態が改善されたことを示している。さらに、所望のＦＶＩＩＩ活性用量を得るためのタンパク質負荷は、ペグ化度が低いＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ変異体でより低い。

ペグ化度に対するＡＵＣ、半減期およびＭＲＴのデータのプロット（図４）は、ＡＵＣおよびＭＲＴとペグ化度に、およそ８ＰＥＧ／ＦＶＩＩＩまで直線的な相関があり、ペグ化がより増加するとさらなる増加のないことを示している。終末半減期は、ＦＶＩＩＩ当たりのＰＥＧ分子の数が５ＰＥＧ／ＦＶＩＩＩを超えたときに、わずかに増加する。

要約すれば、それらのデータにより、１５Ｍ過剰、２０Ｍ過剰、２５Ｍ過剰および３０Ｍ過剰のＰＥＧを使用して調製した、低度にペグ化されたｒＦＶＩＩＩ変異体が、標準のプロセス（６１．８Ｍ過剰のＰＥＧ）に従って調製したＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩと比較して改善されたｉｎ ｖｉｖｏにおける性質およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける性質を有することが示唆される。ＦＶＩＩＩの低度にペグ化された形態の活性は、以前の高ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ調製物よりも天然の分子の活性に類似しており、これにより、治療の間、低ＰＥＧ血液因子を低用量で使用することができ、それによって血液因子に対する中和抗体が発生する可能性が減少し、組成物の毒性が減少することが示唆される。

（実施例４）
低度にペグ化されたｒＦＩＸの調製
本明細書に記載のように、他の血液因子タンパク質を水溶性ポリマーにコンジュゲートすることが意図されている。例えば、組換えＦＩＸ（ｒＦＩＸ）を、ＮＨＳ基を含有する２０ｋＤの直鎖状ペグ化試薬を使用することによってペグ化する。この種の試薬の例は、ＮＯＦ（日油株式会社、東京、日本）からのＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥシリーズである。ｒＦＩＸを、ヘペスバッファー（２０ｍＭのヘペス、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中、ｐＨ７．４、タンパク質濃度２ｍｇ／ｍｌおよび試薬濃度５ｍｇ／ｍｌでペグ化する。ペグ化反応は、穏やかな振とう下、室温で２時間行う。次いで、グリシンを加えることによって（最終濃度：１０ｍＭ）反応を停止させ、室温で１時間インキュベートする。次いでその混合物を、天然のｒＦＩＸおよび微量のジペグ化ｒＦＩＸおよびトリペグ化ｒＦＩＸから、１つのＰＥＧ残基のみを含有するモノペグ化ｒＦＩＸを精製し、分離するために、ＱセファロースＨＰカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に適用する。最後に、モノペグ化ｒＦＩＸを含有する画分を採取して、再生セルロースでできた３０ｋＤの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）に供する。

（実施例５）
低度にペグ化されたｒＦＶＩＩａの調製
組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）を、ＮＨＳ基を含有する２０ｋＤの直鎖状ペグ化試薬を使用することによってペグ化する。この種の試薬の例は、ＮＯＦ（日油株式会社、東京、日本）からのＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＧＳシリーズである。ｒＦＶＩＩａを、ヘペスバッファー（２０ｍＭのヘペス、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中、ｐＨ７．４、タンパク質濃度２ｍｇ／ｍｌおよび試薬濃度５ｍｇ／ｍｌでペグ化する。ペグ化反応は、穏やかな振とう下、室温で２時間行う。グリシンを加えることによって（最終濃度：１０ｍＭ）反応を停止させ、室温で１時間インキュベートする。最後に、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａコンジュゲートを、ＱセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。溶液を、１ｍＭのＣａＣｌ_２を含有する２０ｍＭのヘペスバッファー、ｐＨ７．４を用いて予め平衡化したカラムにローディングする（ローディング能（ｌｏａｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）：タンパク質１．５ｍｇ／ゲル１ｍｌ）。コンジュゲートを１ｍＭのＣａＣｌ_２および５００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭのヘペスバッファーで溶出する。溶出物は、主にモノペグ化ｒＦＶＩＩａを含有する。最後に、溶出物を、ポリエーテルスルホンでできた３０ｋＤの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したＵＦ／ＤＦによって濃縮する。

（実施例６）
低度にポリシアル酸化されたｒＦＶＩＩＩの調製
ペグ化に加え、血液因子タンパク質を、他の水溶性ポリマーにコンジュゲートする。

ｒＦＶＩＩＩを、Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ （Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から入手した、サイズ分布が狭く（ＰＤ≦１．１）、ＭＷが２０ｋＤである酸化型のポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用した還元的アミノ化によってポリシアル酸化した。

ＰＳＡとｒＦＶＩＩＩのコンジュゲーションを、低温室内、＋４℃で行った。コンジュゲーションを、２ｍｇ／ｍｌの濃度のｒＦＶＩＩＩを用いて、および２００倍のモル濃度過剰の酸化ＰＳＡを用いて行った。ヘペスバッファー（５０ｍＭのヘペス緩衝剤、５ｍＭのＣａＣｌ_２、３５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）にＰＳＡを溶解させて最終濃度をＰＳＡ２００ｍｇ／ｍｌにした。ＰＳＡ溶液をｒＦＶＩＩＩ溶液に加え、必要量のＮａＣＮＢＨ_３をヘペスバッファー中８０ｍｇ／ｍｌの溶液、ｐＨ７．４に加えて最終濃度を５０ｍＭにした。反応混合物を穏やかに混合し、０．５ＭのＮａＯＨを液滴によってｐＨ７．４まで加えることによってｐＨを７．４に調整した。反応混合物を、低温室内、暗闇の中、＋４℃で１６時間、穏やかに振とうした。次いでコンジュゲートを、フェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって精製した。化学反応後、反応混合物を、ヘペスバッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ６．９）中８ＭのＮＨ_４Ａｃで希釈して、最終濃度を２．５Ｍにし、０．５ＭのＮａＯＨを加えることによって、ｐＨをｐＨ６．９に補正した。次いで、試料をＨＩＣカラムにローディングした。カラムをおよそ２．５カラム体積（ＣＶ）の洗浄バッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ中２．５ＭのＮＨ_４Ａｃ、３５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ６．９）で洗浄し、その後およそ１０ＣＶの洗浄バッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ中３ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２；ｐＨ６．９）で洗浄した。カラムを、６ＣＶの溶出バッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．４）で溶出した。コンジュゲートを含有する画分を、３０ｋＤの膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したＵＦ／ＤＦに供した。

（実施例７）
低度にポリシアル酸化されたｒＦＶＩＩＩの、Ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける特徴付け
実施例７に従った還元的アミノ化によって調製した、ポリシアル酸化度が低いＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩコンジュゲートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるタンパク質活性についてアッセイした。

ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ調製物を、タンパク質含有量（ＢＣＡアッセイ）およびＦＶＩＩＩの色素形成活性を測定することによって分析的に特徴付けた。この調製物について、２４６９ＩＵ／ｍｇの比活性が算出された。これは、ｒＦＶＩＩＩ出発原料と比較して４４％である。ポリシアル酸化度を、レゾルシノールアッセイを使用することによって決定した（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ Ｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２４巻：６０４〜１１頁；１９５７年）。ＰＳＡ２．１分子／ＦＶＩＩＩ単量体のポリシアル酸化度が測定された。

ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩもまた、血友病マウスにおける薬物動態（ＰＫ）研究に使用した。血友病マウス６匹の群に、ＦＶＩＩＩ２００ＩＵ／ｋｇ体重の用量の、尾静脈を経由したボーラス投与を受けさせた。注射の５分後、３時間後、６時間後、９時間後、１６時間後、２４時間後、３２時間後、および場合によっては４２時間後に、それぞれの群から、麻酔した後、心臓穿刺によってクエン酸塩血漿を調製した。ＦＶＩＩＩの活性レベルを血漿試料において測定した。ＭＳ Ｅｘｃｅｌを用いて半減期および曲線下面積（ＡＵＣ）の算出を行った。この実験の結果を図４に例示する。この消失曲線について、ＦＶＩＩＩに対して０．０５４（ＩＵ×ｈ／ｍｌ）／（ＩＵ／ｋｇ）、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩコンジュゲートに対して０．０７６（ＩＵ×ｈ／ｍｌ）／（ＩＵ／ｋｇ）の用量調整ＡＵＣを測定した。この結果は、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩが、天然のｒＦＶＩＩＩよりも長く循環し、対応するＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩのＡＵＣは１．４倍だけ増加することを示している。

（実施例８）
低度にポリシアル酸化されたｒＦＩＸの調製
組換えＦＩＸ（ｒＦＩＸ）を、Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から入手することができる、サイズ分布が狭く（ＰＤ≦１．１）、ＭＷが２０ｋＤである酸化ポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用した還元的アミノ化によってポリシアル酸化した。

ＰＳＡとｒＦＩＸのコンジュゲーションを、低温室内、＋４℃で行った。コンジュゲーションを、２ｍｇ／ｍｌの濃度のｒＦＩＸを使用し、１６０倍のモル濃度過剰の酸化ＰＳＡを用いて行った。ヘペスバッファー（５０ｍＭのヘペス緩衝剤、５ｍＭのＣａＣｌ_２、３５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）にＰＳＡを溶解させて最終濃度をＰＳＡ２００ｍｇ／ｍｌにした。ＰＳＡ溶液をｒＦＩＸ溶液に加え、必要量のＮａＣＮＢＨ_３をヘペスバッファー中８０ｍｇ／ｍｌの溶液、ｐＨ７．４に加えて最終濃度を５０ｍＭにし、０．５ＭのＮａＯＨを液滴によって加えることによって得られた溶液のｐＨを７．４に調整した。反応混合物を、低温室内、暗闇の中、＋４℃で１６時間、穏やかに振とうした。次いでコンジュゲートを、ブチルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって精製した。化学反応後、反応混合物を、ヘペスバッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ６．９）中５ＭのＮａＣｌで希釈して、最終濃度を３Ｍにし、０．５ＭのＮａＯＨを使用してｐＨをｐＨ６．９に調整した。試料をＨＩＣカラムにローディングし、１０カラム体積（ＣＶ）の平衡化バッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ中３．０ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ６．９）で洗浄した。その後、ＰＳＡ−ｒＦＩＸコンジュゲートを６ＣＶの溶出バッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．４）内で溶出した。コンジュゲートを含有する画分を、３０ｋＤの膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したＵＦ／ＤＦに供した。調製物は主にモノＰＳＡ化ｒＦＩＸまたはジＰＳＡ化ｒＦＩＸを含有すると予想される。

（実施例９）
低度にポリシアル酸化されたｒＦＶＩＩａの調製
ｒＦＶＩＩａを、Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から入手することができる、サイズ分布が狭く（ＰＤ≦１．１）、ＭＷが２０ｋＤである酸化ポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用した還元的アミノ化によってポリシアル酸化する。

ＰＳＡとｒＦＶＩＩａのコンジュゲーションを、低温室内、＋４℃で行った。コンジュゲーション反応を、２ｍｇ／ｍｌの濃度のｒＦＶＩＩａを使用し、１２５倍のモル濃度過剰の酸化ＰＳＡを用いて行う。ヘペスバッファー（５０ｍＭのヘペス緩衝剤、５ｍＭのＣａＣｌ_２、３５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）にＰＳＡを溶解させ、２ＭのＮａＯＨを液滴によって加えることによりｐＨを７．４に調整して最終濃度を１５０ｍｇ／ｍｌにする。ＰＳＡ溶液をｒＦＶＩＩａ溶液に加え、必要量のＮａＣＮＢＨ_３をヘペスバッファー中８０ｍｇ／ｍｌの溶液、ｐＨ７．４に加えて最終濃度を５０ｍＭにする。反応混合物を穏やかに混合し、ｐＨを再度７．４に調整する。反応混合物を、暗闇の中で１６時間、穏やかに振とうする。次いでコンジュゲートを、ブチルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって精製する。化学反応後、反応混合物を、ヘペスバッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ６．９）中５ＭのＮａＣｌで希釈して、最終濃度を３Ｍにする。次いで、試料をＨＩＣカラムにローディングし、１０カラム体積（ＣＶ）の平衡化バッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ中３．０ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．４）で洗浄する。その後、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩａコンジュゲートを１０ＣＶの溶出バッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．４）で溶出する。コンジュゲートを含有する画分を合わせ、３０ｋＤの膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したＵＦ／ＤＦに供する。最後に、溶出物をポリエーテルスルホンでできた３０ｋＤの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したＵＦ／ＤＦによって濃縮する。調製物は主にモノペグ化ｒＦＶＩＩａまたはジペグ化ｒＦＶＩＩａを含有すると予想される。

（実施例１０）
低度の水溶性ポリマーを用いて改変した血液因子を使用した血液凝固障害の治療
血液凝固因子の欠乏症を有する被験体を、本明細書に記載の改変血液因子組成物を用いて治療する。低度の水溶性ポリマーを有する改変血液因子（複数可）を血液凝固障害の動物モデルに投与すること、および血液障害に罹患したヒトを治療するために当技術分野で公知のプロトコールを使用することにより、被験体に本明細書に記載の改変血液因子（複数可）を単独で、または他の治療剤、例えば化学療法剤もしくは放射線治療剤、サイトカイン、成長因子、および他の一般的に使用される治療法と組み合わせて投与するための基礎が提供される。

例えば、ＦＶＩＩＩの欠乏症を有する血友病Ａの患者を、処置する医師が容易に決定することができるような治療有効量の、低度にペグ化されたＦＶＩＩＩを用いて治療する。例えば、重度の血友病の患者への２つの異なるＦＶＩＩＩ補充調製物の投与および比較について記載されている、Ｄｉ Ｐａｏｌａら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ． １３巻：１２４〜３０頁、２００７年を参照されたい。

さらなる実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質の欠乏症を有する可能性がある、またはＦＶＩＩＩタンパク質の欠乏症を有さない可能性がある血友病患者（例えば、血友病ＢまたはＣの患者）もまた、改変ＶＷＦ、改変ＦＶＩＩ、改変ＦＩＸ、改変ＦＸＩなどの他の改変血液因子または疾患の状態に適した改変血液因子を用いて治療する。例えば、精製ＦＶＩＩａを用いた、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸに対する阻害因子を発生した血友病患者の治療について記載されている、Ｋｏｎｋｌｅら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ． ５巻：１９０４〜１３頁、２００７年を参照されたい。

フォン・ヴィレブランド病に罹患した患者を治療するために、精製ＶＷＦが使用されている（Ｍａｊｕｍｄａｒら、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ． ４巻：１０３５〜７頁、１９９３年）。本明細書に記載の低度の水溶性ポリマーを有する改変ＶＷＦは、ＶＷＦ補充が有効である患者を治療するために、当業者に公知のレジメンにおいて使用される。

あるいは、当技術分野で公知の他の血液凝固障害、例えば、第Ｘ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、アレキサンダー病、および第ＸＩＩＩ因子欠乏症が、治療有効量の適切な改変血液因子（複数可）を用いて治療できる。

改変血液因子の投与は、１〜２４時間、またはそれより長く続いてよく、通例の実験法を使用して最適化しやすい。改変血液因子は、治療の延長を必要としない期間の間に与えることもできる。そのうえ、改変血液因子組成物は、当業者によって決定可能になるよう、毎日、週に１回、１週間に２回、または他の効果的な頻度で投与することができる。

改変血液因子を、他の治療法と組み合わせて、例えば他の化学療法剤もしくは放射線治療剤と組み合わせて、または成長因子もしくはサイトカインと組み合わせて患者に投与することが意図されている。別の薬剤と組み合わせて与える場合、改変血液因子の量はそれに応じて減少させ得る。第２の薬剤は、ヒトの疾患を改善させるのに安全かつ有効であると決定された量を投与する。

サイトカインまたは成長因子、および化学療法剤または放射線治療剤を改変血液因子と同じ製剤で投与し、同時に与えることが意図されている。あるいは、薬剤は、別々の製剤で投与してもよく、さらに改変血液因子と同時に投与してもよい。本明細書では、同時とは、薬剤が互いに３０分以内に与えられることを指す。第２の薬剤は、改変血液因子を投与する前に投与してもよい。投与する前とは、改変血液因子での処置の１週間前から改変血液因子を投与する３０分前までの範囲内に薬剤を投与することを指す。第２の薬剤を改変血液因子の投与の後に投与することもさらに意図されている。後に投与するとは、改変血液因子での処置の３０分後から改変血液因子を投与した１週間後までに投与することの記載を意味している。改変血液因子組成物は、治療をしている医師によって処方された治療を行っている、血液凝固障害、および癌の一形態を有する被験体における放射線治療のレジメンと組み合わせて投与することもできる。

上記の例示的な実施例に示したように、当業者により、本発明の多数の改変および変形が想起されることが予想される。したがって、添付の特許請求の範囲において見られるような限定のみが、本発明に設けられるべきである。

Claims (50)

1. 組換え血液因子および血液因子１分子につき少なくとも１個かつ１０個以下の水溶性ポリマー部分を含む、改変血液因子分子。
2. 前記改変血液因子が血液因子１分子につき少なくとも２、３、４、５、６、７、８または９個の水溶性ポリマー部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
3. 前記改変血液因子が血液因子１分子につき８個の水溶性ポリマー部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
4. 前記改変血液因子が血液因子１分子につき４個以上８個以下の水溶性ポリマー部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
5. 前記改変血液因子が血液因子１分子につき１個以上４個以下の水溶性ポリマー部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
6. 前記改変血液因子が血液因子１分子につき４個以上６個以下の水溶性ポリマー部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
7. 前記改変血液因子が血液因子１分子につき１個または２個の水溶性ポリマー部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
8. 前記改変血液因子が血液因子１分子につき５個の水溶性ポリマー部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
9. 前記改変血液因子が血液因子１分子につき４個の水溶性ポリマー部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
10. 前記水溶性ポリマー部分が遊離可能なリンカーを介して前記血液因子分子に結合している、請求項１から９のいずれか一項に記載の改変血液因子分子。
11. 前記遊離可能なリンカーが加水分解性リンカーである、請求項１０に記載の改変血液因子分子。
12. 前記水溶性ポリマー部分が安定なリンカーを介して前記血液因子分子に結合している、請求項１から９のいずれか一項に記載の改変血液因子分子。
13. 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー類、ポリ（マレイン酸）、ポリ（ＤＬ−アラニン）、多糖類、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、デンプンもしくはデンプン誘導体、ヒアルロン酸、キチン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリシアル酸（ＰＳＡ）およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の改変血液因子分子。
14. 前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１３に記載の改変血液因子分子。
15. 前記ＰＥＧが直鎖状ＰＥＧ部分である、請求項１４に記載の改変血液因子分子。
16. 前記ＰＥＧが分枝状ＰＥＧ部分である、請求項１４に記載の改変血液因子分子。
17. 前記ＰＥＧが２ｋＤ〜２００ｋＤの分子量を有する、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の改変血液因子分子。
18. 前記血液因子が、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子およびフィブリノーゲンからなる群から選択される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の改変血液因子分子。
19. 前記血液因子分子がヒトのものである、請求項１８に記載の改変血液因子分子。
20. 前記血液因子分子が第ＶＩＩＩ因子である、請求項１８に記載の改変血液因子分子。
21. 前記改変血液因子が第ＶＩＩＩ因子１分子につき少なくとも４個かつ１０個未満のＰＥＧ部分を含む、請求項２０に記載の改変血液因子分子。
22. 前記血液因子分子が第ＶＩＩａ因子である、請求項１８に記載の改変血液因子。
23. 前記血液因子分子が第ＩＸ因子である、請求項１８に記載の改変血液因子。
24. 第ＶＩＩＩ因子１分子につき４個以上８個以下のポリエチレングリコール部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
25. 第ＶＩＩＩ因子１分子につき４個以上６個以下のポリエチレングリコール部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
26. 第ＶＩＩＩ因子１分子につき１個以上４個以下のポリエチレングリコール部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
27. 前記ポリエチレングリコール部分が、遊離可能なリンカーまたは加水分解性リンカーを介して結合している、請求項２５または２６に記載の改変血液因子分子。
28. 第ＶＩＩＩ因子１分子につき１個または２個のポリエチレングリコール部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
29. 前記ポリエチレングリコール部分が安定なリンカーを介して結合している、請求項２８に記載の改変血液因子分子。
30. 第ＶＩＩＩ因子１分子につき４個以上６個以下のポリシアル酸部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
31. 第ＶＩＩＩ因子１分子につき１個以上４個以下のポリシアル酸部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
32. 前記ポリシアル酸部分が、遊離可能なリンカーまたは加水分解性リンカーを介して結合している、請求項３０または３１に記載の改変血液因子分子。
33. 第ＶＩＩＩ因子１分子につき１個または２個のポリシアル酸部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
34. 前記ポリシアル酸部分が安定なリンカーを介して結合している、請求項３３に記載の改変血液因子分子。
35. 第ＶＩＩａ因子１分子につき１個以上６個以下の水溶性ポリマー部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
36. 第ＩＸ因子１分子につき１個以上６個以下の水溶性ポリマー部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
37. 前記水溶性ポリマー部分が、遊離可能なリンカーまたは加水分解性リンカーを介して結合している、請求項３５または３６に記載の改変血液因子分子。
38. 第ＶＩＩａ因子１分子につき１個または２個の水溶性部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
39. 第ＩＸ因子１分子につき１個または２個の水溶性部分を含む、請求項１に記載の改変血液因子分子。
40. 前記水溶性ポリマー部分が、安定なリンカー、遊離可能なリンカーまたは加水分解性リンカーを介して結合している、請求項３８または３９に記載の改変血液因子分子。
41. 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリシアル酸（ＰＳＡ）からなる群から選択される、請求項３５から４０のいずれか一項に記載の改変血液因子分子。
42. 請求項１から４１のいずれか一項に記載の改変血液因子を含む医薬組成物。
43. 少数の水溶性ポリマーとコンジュゲートしている改変血液因子分子を作製する方法であって、前記血液因子１分子に対して少なくとも１個かつ１０個未満の水溶性ポリマーの結合を可能にする条件下で、前記血液因子分子を、血液因子１分子に対して３０Ｍ過剰以下の水溶性ポリマーであるモル濃度過剰の水溶性ポリマーと接触させる工程を含む方法。
44. 前記モル濃度過剰の水溶性ポリマーが２Ｍ過剰〜３０Ｍ過剰である、請求項４３に記載の方法。
45. 前記モル濃度過剰の水溶性ポリマーが１０Ｍ過剰〜２５Ｍ過剰である、請求項４３に記載の方法。
46. 前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記血液因子が第ＶＩＩＩ因子である、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 請求項１から４１のいずれか一項に記載の改変血液因子の治療的有効量を患者に投与する工程を含む、血液凝固障害に罹患している被験体を治療する方法。
49. 前記血液凝固障害が、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド症候群、第Ｘ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、アレキサンダー病、ローゼンタール症候群（血友病Ｃ）および第ＸＩＩＩ因子欠乏症からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
50. 前記血液凝固障害が血友病Ａであり、前記改変血液因子が第ＶＩＩＩ因子分子を含む、請求項４８に記載の方法。