ES2692172T3 - Factores sanguíneos modificados que comprenden un bajo grado de polímero soluble en agua - Google Patents

Abstract

Molécula de factor VIII (FVIII) modificada químicamente que comprende una molécula de FVIII recombinante y 1 ó 2 restos de poli(ácido siálico) (PSA) por molécula de FVIII, en la que los restos de PSA se unen a la molécula de FVIII a través de aminación reductora.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Factores sangumeos modificados que comprenden un bajo grado de poKmero soluble en agua Campo de la invencion

La presente invencion se refiere, en general, a materiales y metodos para la preparacion de factores sangumeos modificados que comprenden bajos niveles de moleculas de polfmero soluble en agua pero que presentan actividad biologica similar a moleculas que tienen un numero superior de restos de polfmero soluble en agua.

Antecedentes de la invencion

La coagulacion sangumea es un proceso complejo que incluye la interaccion secuencial de una serie de componentes, en particular de fibrinogeno, factor II, factor V, factor VII, factor Vila, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, factor XII y factor de von Willebrand. La perdida de uno de estos componentes o la inhibicion de su funcionalidad puede provocar o bien un aumento de la tendencia a la coagulacion sangumea o bien una incapacidad para coagularse, cualquiera de las cuales puede ser potencialmente mortal en algunos pacientes.

El factor VIII es un cofactor para el factor IXa que convierte el factor X en el factor Xa en la cascada de reacciones que conducen a la coagulacion sangumea. Una deficiencia en la cantidad de actividad del factor VIII en la sangre da como resultado el trastorno de coagulacion hemofilia A, un trastorno hereditario que afecta principalmente a los varones. La hemofilia A se trata actualmente con preparaciones terapeuticas de factor VIII derivado de plasma humano o fabricado usando tecnologfa de ADN recombinante. Tales preparaciones se administran o bien en respuesta a un episodio de hemorragia o bien a intervalos frecuentes y regulares para prevenir la hemorragia incontrolada (profilaxis).

El factor de von Willebrand (VWF) circula en el plasma complejado con el factor VIII, que estabiliza la protema factor VIII y la protege de la degradacion proteolttica. Debido a su funcion en la agregacion plaquetaria, el VWF tambien interfiere directamente en la coagulacion sangumea. La deficiencia de von Willebrand (VWD) (tambien conocida como smdrome de von Willebrand) resulta o bien de una deficiencia o bien de una sobreexpresion de VWF. La deficiencia de VWF da como resultado una enfermedad similar a la hemofilia debido a la rapida degradacion de factor VIII que carece de cofactor de VWF.

En el tratamiento de hemofilia A y smdrome de von Willebrand, ha habido varios intentos de tratar pacientes con factor VII, VWF o complejo de factor VIII/VWF purificado. Sin embargo, se ha mostrado que el desarrollo de anticuerpos contra la protema exogena administrada disminuye la eficacia del tratamiento y presenta un desaffo al tratamiento de estos pacientes. Por ejemplo, anticuerpos anti-FVIII son especialmente prevalentes en pacientes con hemofilia grave y moderadamente grave, que desarrollan anticuerpos anti-FVIII a una frecuencia del 50 % (Gilles et al., Blood 82:2452-61, 1993; Lacroix-Desmazes et al., J Immunol. 177:1355-63, 2006). La administracion de dosis inferiores de protema terapeutica que tienen mayor eficacia in vivo ayudana a reducir o limitar la aparicion de anticuerpos contra el factor sangumeo administrado.

Las propiedades farmacocineticas e inmunologicas de protemas terapeuticas pueden mejorarse mediante conjugacion con un polfmero soluble en agua tal como polietilenglicol (PEG). En particular, la union de una protema fisiologicamente activa a una molecula de polfmero fisiologicamente aceptable puede prolongar sustancialmente su semivida in vivo. La pegilacion de moleculas tambien puede conducir a un aumento de la resistencia de farmacos a la degradacion enzimatica, una reduccion de la frecuencia de dosificacion, una disminucion de la inmunogenicidad, un aumento de la estabilidad ffsica y termica, un aumento de la solubilidad, un aumento de la estabilidad en lfquidos y una reduccion de la agregacion.

La patente estadounidense 4.970.300 describe que la conjugacion de una molecula de polfmero (dextrano) a factor VIII (FVIII) da como resultado que la protema fViII pueda activarse por trombina, y que tenga una antigenicidad e inmunorreactividad sustancialmente disminuidas y un tiempo de retencion in vivo sustancialmente aumentado en el torrente sangumeo de un mairnfero. La solicitud de patente internacional WO 94/15625 describe que la conjugacion de FVIII a una molecula de polfmero fisiologicamente aceptable mejora la funcion in vivo de FVIII (i) aumentando su resistencia a la hidrolisis in vivo y prolongando por tanto su actividad tras la administracion, (ii) prolongando significativamente su vida circulante in vivo con respecto a la protema no modificada y (iii) aumentando su tiempo de absorcion en el torrente sangumeo. La patente estadounidense 6.037.452 describe conjugados de FVIII y factor IX (FIX), en los que la protema se une covalentemente a un poli(oxido de alquileno) a traves de grupos carbonilo en la protema. Ademas, la mejora de la funcion in vivo de FIX mediante conjugacion a moleculas de polfmero fisiologicamente aceptables, en particular poli(etilenglicol) (“PEG”), se ha descrito en la publicacion de patente internacional WO 94/29370. Un FVIII pegilado que conserva la actividad espedfica se divulgo en la publicacion de patente internacional WO/2007/126808.

La conjugacion de polfmero soluble en agua a un agente activo tal como una protema puede realizarse preparando conjugados de polfmero-protema estables o conjugados de polfmero-protema en los que el polfmero soluble en agua

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

se une a la protema por medio de enlaces covalentes liberables (concepto de profarmaco), es dedr, un ligador hidrolizable, degradable o liberable. Por ejemplo, se ha desarrollado un resto de PEG liberable usando un sistema de conjugacion de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC) que contiene dos cadenas de PEG (Nektar Inc., Huntsville AL). Ademas, un grupo ester de N-hidroxisuccinimida (NHS), que es util para la modificacion qmmica de residuos de lisina de la protema, puede unirse al sistema de anillos de fluoreno por medio del grupo metoxicarbonilo para generar el resto de PEG liberable. La publicacion de patente internacional WO 2008/082669 (incorporada en el presente documento por referencia) describe una series de variantes de FVIII recombinantes pegiladas basadas en el concepto de PEG liberable.

Un proceso qmmico que conduce a un grado relativamente alto de modificacion y contenido en polfmero soluble en agua en la protema terapeutica no es economico debido a las altas cantidades de reactivos requeridos para su preparacion. Ademas, altos grados de polfmero soluble en agua, tal como PEG, conducen a un aumento del riesgo toxicologico o inmunologico debido a las altas cantidades del polfmero y el ligador.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad en la tecnica de composiciones terapeuticas que comprendan polfmeros solubles en agua que mejoren la semivida y estabilidad de una protema terapeutica sin los efectos inmunologicos o la toxicidad resultantes.

Sumario de la invencion

La presente memoria descriptiva se refiere a materiales y metodos para generar variantes de factores sangumeos que comprenden bajas cantidades de un polfmero soluble en agua. La invencion proporciona una molecula de factor sangumeo modificada qmmicamente que comprende un factor sangumeo recombinante, es decir FVIII, y 1 o 2 restos de polfmero soluble en agua por molecula de factor sangumeo, en la que el polfmero soluble en agua es poli(acido sialico) (PSA) y en la que los restos de PSA se unen a la molecula de FVIII a traves de aminacion reductora.

En una realizacion relacionada, el factor sangumeo modificado comprende 2 restos de polfmero soluble en agua por molecula de factor sangumeo. En todavfa otra realizacion, el factor sangumeo modificado comprende 1 polfmero soluble en agua por molecula de factor sangumeo.

Se contempla que el resto de polfmero soluble en agua se una a la molecula de factor sangumeo a traves de un ligador estable o a traves de un ligador liberable o degradable. En una realizacion, el ligador liberable es un ligador hidrolizable.

El polfmero soluble en agua poli(acido sialico) (PSA).

En un aspecto de referencia, el polfmero soluble en agua es polietilenglicol (PEG). Se contempla ademas que la molecula de PEG sea un resto de PEG lineal o un resto de PEG ramificado.

En otro aspecto de referencia, el PEG tiene un peso molecular de entre 3 kD y 200 kD. En una realizacion relacionada el peso molecular promedio del PEG oscilara entre aproximadamente 3 y 200 kilodalton (“kDa”), desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 120 kDa, desde aproximadamente 10 kDa hasta aproximadamente 100 kDa, desde aproximadamente 20 kDa hasta aproximadamente 50 kDa, desde aproximadamente 10 kDa hasta aproximadamente 25 kDa, desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 50 kDa o desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 10 kDa.

La invencion contempla que el factor sangumeo modificado sea factor VIII. En una realizacion adicional, la molecula de factor sangumeo es humana.

En un aspecto de referencia, el factor sangumeo modificado comprende al menos 4 y menos de 10 restos de PEG por molecula de factor VIII. En otro aspecto de referencia el factor sangumeo modificado comprende entre 4 y 8 restos de PEG, inclusive, por molecula de factor VIII. En todavfa otro aspecto de referencia el factor sangumeo modificado comprende entre 1 y 4 restos de PEG, inclusive, por molecula de factor VIII. En todavfa otro aspecto de referencia el factor sangumeo modificado comprende entre 4 y 6 restos de PEG, inclusive, por molecula de factor VIII. En todavfa otro aspecto de referencia el factor sangumeo modificado comprende 1 o 2 restos de PEG por molecula de factor VIII.

El factor sangumeo modificado comprende 1 o 2 restos de PSA por molecula de factor VIII. En otra realizacion el factor sangumeo modificado comprende 1 o 2 restos de PSA por molecula de factor VIII, en el que los polfmeros estan conectados por medio de un ligador estable, liberable o hidrolizable.

En otro aspecto de referencia, el factor sangumeo modificado comprende entre 1 y 6 restos de polfmero soluble en agua, inclusive, por molecula de FVIIa. En un aspecto de referencia relacionado, el factor sangumeo modificado comprende 1 o 2 restos de polfmero soluble en agua por molecula de FVIIa. En un aspecto de referencia, el polfmero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en PEG o PSA. En un aspecto de referencia, los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

poKmeros estan conectados por medio de un ligador estable, liberable o hidrolizable.

En otro aspecto adicional de referencia, el factor sangumeo modificado comprende entre 1 y 6 restos de polfmero soluble en agua, inclusive, por molecula de FVIIa. En otro aspecto de referencia adicional mas, el factor sangumeo modificado comprende 1 o 2 restos de polfmero soluble en agua por molecula de FIX. En determinados aspectos de referencia, el polfmero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en PEG o PSA. En un aspecto de referencia, los polfmeros estan conectados por medio de un ligador estable, liberable o hidrolizable.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende el factor sangumeo modificado tal como se describe en el presente documento.

En otro aspecto de referencia, la memoria descriptiva contempla un metodo de preparacion de una molecula de factor sangumeo modificada que tiene un bajo numero de polfmero soluble en agua conjugado a la molecula de factor sangumeo que comprende, poner en contacto la molecula de factor sangumeo con un exceso molar de polfmero soluble en agua menor de o igual a polfmero soluble en agua en exceso de 30 M con respecto a molecula de factor sangumeo en condiciones que permiten la union de al menos 1 y menos de 10 polfmeros solubles en agua a la molecula de factor sangumeo.

En una realizacion, el exceso molar de polfmero soluble en agua es de entre un exceso de 2 M y un exceso de 30 M. En otra realizacion, el exceso molar de polfmero soluble en agua es de entre un exceso de 10 M y uno de 25 M. En otra realizacion adicional, el exceso molar de polfmero soluble en agua es un exceso de aproximadamente 2 M, aproximadamente 5 M, aproximadamente 10 M, aproximadamente 15 M, aproximadamente 20 M, aproximadamente 25 M o aproximadamente 30 M.

En otro aspecto adicional, la memoria descriptiva proporciona un metodo de tratamiento de un sujeto que padece un trastorno de la coagulacion sangumea que comprende administrar al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de un factor sangumeo modificado tal como se describe en el presente documento.

En una realizacion, el trastorno de la coagulacion sangumea se selecciona del grupo que consiste en hemofilia A, hemofilia B, smdrome de von Willebrand, deficiencia de factor X, deficiencia de factor VII, enfermedad de Alexander, smdrome de Rosenthal (hemofilia C) y deficiencia de factor XIII.

En una realizacion relacionada, el trastorno de la coagulacion sangumea es hemofilia A y el factor sangumeo modificado comprende una molecula de factor VIII.

En una realizacion adicional, el polfmero soluble en agua para su uso en los metodos es un polfmero soluble en agua tal como se describio anteriormente.

En otro aspecto adicional de referencia, el factor sangumeo para su uso en los metodos se selecciona del grupo que consiste en factor II, factor III, factor V, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, factor de von Willebrand y fibrinogeno. En una realizacion, la molecula de factor sangumeo es factor VIII. En todavfa otra realizacion el factor sangumeo es FVIIa. En una realizacion adicional, el factor sangumeo es FIX. En una realizacion adicional, la molecula de factor sangumeo es humana.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra un gel de SDS-PAGE de factor VIII poco pegilado preparado usando un exceso molar bajo de PEG. Figura 1A: tenido con anticuerpo anti-FVIII, figura 1B: tenido con anticuerpo anti-PEG.

La figura 2 representa el perfil farmacocinetico de FVIII poco pegilado tal como se detecta in vivo en un modelo de raton deficiente en FVIII. Los datos estan ajustados a la dosis a 200 U/kg.

La figura 3 ilustra la comparacion del grado de pegilacion del FVIII correlacionado con la AUC (figura 3A) de la protema pegilada, con la semivida (HL, figura 3B) y con el tiempo de resistencia medio (MRT, figura 3C) tal como se detecta in vivo en un modelo de raton deficiente en FVII.

La figura 4 representa el perfil farmacocinetico de rFVIII poco polisialilado tal como se detecta in vivo en un modelo de raton deficiente en FVIII. Los datos estan ajustados a 200 U/kg.

Descripcion detallada de la invencion

La presente memoria descriptiva se refiere a materiales y metodos para generar variantes de factores sangumeos que comprenden bajas cantidades de un polfmero soluble en agua en los que la cantidad del polfmero soluble en agua, tal como PEG, es suficiente para prolongar la semivida de la molecula. Se contempla que el factor sangumeo modificado que comprende una baja cantidad de polfmero soluble en agua demuestre toxicidad reducida en comparacion con moleculas de factores sangumeos preparadas usando protocolos de preparacion convencionales.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto habitual en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definicion general de muchos de los terminos usados en esta invencion: Singleton, et al, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2a ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walquer ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5a ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale y Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991).

Se indica en el presente documento que, tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Tal como se usan en el presente documento, los siguientes terminos tienen los significados asignados a los mismos a menos que se especifique otra cosa.

El termino “factor sangumeo modificado” se refiere a un factor sangumeo que tiene una o mas modificaciones tales como conjugacion a un polfmero soluble en agua, conjugacion a restos de hidrato de carbono adicionales o modificado de otra forma con respecto al factor de coagulacion sangumea de tipo natural o nativo. Un “factor sangumeo” o “factor de coagulacion sangumea” tal como se usa en el presente documento se refiere a protemas implicadas en la coagulacion sangumea en un sujeto, incluyendo las implicadas en la cascada de la coagulacion. Los factores sangumeos, incluyen, pero no se limitan a, factor II, factor III, factor V, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, factor de von Willebrand y fibrinogeno.

El termino “protema” se refiere a cualquier protema, complejo proteico o polipeptido, incluyendo protemas, complejos proteicos y polipeptidos recombinantes compuestos por residuos de aminoacido unidos por medio de enlaces peptfdicos. Las protemas se obtienen mediante aislamiento a partir de fuentes in vivo (es decir, que se producen de manera natural), mediante metodos de smtesis o mediante tecnologfa de ADN recombinante. Se sintetizan polipeptidos sinteticos, por ejemplo, usando un sintetizador de polipeptidos automatizado. Una protema recombinante usada segun la presente invencion se produce mediante cualquier metodo conocido en la tecnica tal como se describe a continuacion en el presente documento. En una realizacion, la protema es una protema fisiologicamente activa, incluyendo una protema terapeutica o un derivado biologicamente activo de la misma. El termino “derivado biologicamente activo” se refiere a un derivado de una protema que tiene sustancialmente las mismas propiedades funcionales y/o biologicas de dicha protema. El termino “protema” se refiere normalmente a polipeptidos grandes. El termino “peptido” se refiere normalmente a polipeptidos cortos. Independientemente de la distincion, tal como se usan en el presente documento, polipeptido, protema y peptido se usan de manera intercambiable.

Un “fragmento” de un polipeptido se refiere a cualquier porcion del polipeptido mas pequena que el polipeptido o producto de expresion de protema de longitud completa. Los fragmentos son, en un aspecto, analogos de delecion del polipeptido de longitud completa en el que uno o mas residuos de aminoacido se han eliminado del extremo amino terminal y/o el extremo carboxilo terminal del polipeptido de longitud completa. Por consiguiente, los “fragmentos” son un subconjunto de los analogos de delecion descritos a continuacion.

Un “analogo” o “derivado” es un compuesto, por ejemplo, un peptido, que se refiere a un polipeptido de estructura sustancialmente similar y que tiene la misma actividad biologica, aunque en determinados casos en un grado diferente, a una molecula que se produce de manera natural. Los analogos difieren en la composicion de sus secuencias de aminoacidos en comparacion con el polipeptido que se produce de manera natural a partir del cual se deriva el analogo, basandose en una o mas mutaciones que implican (i) delecion de uno o mas residuos de aminoacido en uno o mas extremos terminales del polipeptido y/o una o mas regiones internas de la secuencia de polipeptido que se produce de manera natural, (ii) insercion o adicion de uno o mas aminoacidos en uno o mas extremos terminales (normalmente un analogo de “adicion”) del polipeptido y/o una o mas regiones internas (normalmente un analogo de “insercion”) de la secuencia de polipeptido que se produce de manera natural o (iii) sustitucion de uno o mas aminoacidos por otros aminoacidos en la secuencia de polipeptido que se produce de manera natural.

En un aspecto, un analogo presenta aproximadamente el 70 % de similitud de secuencia pero menos del 100 % de similitud de secuencia con un compuesto dado, por ejemplo, un peptido. Tales analogos o derivados, en un aspecto, estan comprendidos por residuos de aminoacido que no se producen de manera natural, incluyendo a modo de ejemplo y no de limitacion, homoarginina, ornitina, penicilamina y norvalina, asf como residuos de aminoacido que se producen de manera natural. Tales analogos o derivados, en otro aspecto, estan compuestos por uno o una pluralidad de residuos de D-aminoacido, o contienen conexiones no peptfdicas entre dos o mas residuos de aminoacido. El termino “derivado de” tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de peptido o polipeptido que es una modificacion (incluyendo sustitucion o delecion de aminoacidos) de una secuencia de peptido o polipeptido de tipo natural o que se produce de manera natural y tiene una o mas sustituciones, adiciones o deleciones de aminoacidos, de manera que la secuencia del derivado comparte aproximadamente el

5

10

15

20

25

30

35

70 % pero menos del 100 % de similitud de secuencia con la secuencia de tipo natural o que se produce de manera natural. En una realizacion, el derivado puede ser un fragmento de un polipeptido, en el que fragmento es sustancialmente homologo (es decir, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % homologo) a lo largo de una longitud de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoacidos del polipeptido de tipo natural.

Para la comparacion de secuencias, normalmente una secuencia actua como secuencia de referencia, con la que se comparan secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparacion de secuencias, se introducen secuencias de referencia y de prueba en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencias, si es necesario, y se designan parametros del programa de algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparacion de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencias para la(s) secuencia(s) de prueba en relacion con la secuencia de referencia, basandose en los parametros de programa designados.

Pueden realizarse alineaciones optimas de secuencias para comparacion, por ejemplo, mediante el algoritmo de homologfa local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineacion de homologfa de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el metodo de busqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspeccion visual. Un ejemplo de un algoritmo util es PILEUP, que usa una simplificacion del metodo de alineacion progresiva de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351360 (1987) y es similar al metodo descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). Otro algoritmo util para generar multiples alineaciones de secuencias es Clustal W (Thompson, et al., Nucleic Acids Research 22: 46734680 (1994)). Un ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo bLaST (Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989); Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). El software para realizar los analisis de BLAST esta disponible publicamente a traves del National Center for Biotechnology Information.

Las sustituciones son conservativas o no conservativas basandose en la relacion fisicoqmmica o funcional del aminoacido que esta reemplazandose y el aminoacido que lo reemplaza. Las sustituciones de este tipo se conocen bien en la tecnica. Alternativamente, la memoria descriptiva abarca sustituciones que son tambien no conservativas. Se describen sustituciones conservativas a modo de ejemplo en Lehninger, [Biochemistry, 2a edicion; Worth Publishers, Inc., Nueva York (1975), pags. 71-77] y se exponen a continuacion.

SUSTITUCIONES CONSERVATIVAS

CADENA LATERAL CARACTERISTICA

AMINOACIDO

No polar (hidrofoba):

A. Alifatica

A L I V P

B. Aromatica

F W

C. Que contiene azufre

M

D. Lfmite

G

Polar no cargada:

A. Hidroxilo

S T Y

B. Amidas

N Q

C. Sulfhidrilo

C

D. Lfmite

G

Cargada positivamente (basica)

K R H

Cargada negativamente (acida)

D E

Alternativamente, se exponen inmediatamente a continuacion sustituciones conservativas a modo de ejemplo.

SUSTITUCIONES CONSERVATIVAS II

RESIDUO ORIGINAL

Ala (A)

Arg (R)

Asn(N)

Asp (D)

Cys (C)

Gln (Q)

Glu (E)

His (H)

Ile (I)

Leu (L)

Lys (K)

Met (M)

Phe (F)

SUSTITUCION A MODO DE EJEMPLO

Val, Leu, Ile Lys, Gln, Asn Gln, His, Lys, Arg Glu Ser Asn Asp

Asn, Gln, Lys, Arg Leu, Val, Met, Ala, Phe,

Ile, Val, Met, Ala, Phe Arg, Gln, Asn Leu, Phe, Ile Leu, Val, Ile, Ala

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Pro (P)

Gly

Ser (S)

Thr

Thr (T)

Ser

Trp (W)

Tyr

Tyr (Y)

Trp, Phe, Thr, Ser

Val (V)

Ile, Leu, Met, Phe, Ala

El termino “variante” se refiere a una protema o analogo de la misma que se modifica para comprender restos qmmicos adicionales que no son normalmente una parte de la molecula. Tales restos mejoran, en diversos aspectos, incluyendo pero sin limitarse a, la solubilidad, absorcion y semivida biologica de la molecula. Los restos pueden disminuir alternativamente la toxicidad de la molecula y eliminar o atenuar cualquier efecto secundario no deseado de la molecula, etc. Se divulgan restos que pueden mediar en tales efectos en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Se conocen bien en la tecnica procedimientos para acoplar tales restos a una molecula. En determinados aspectos, sin limitacion, las variantes son polipeptidos que se modifican mediante glicosilacion, pegilacion o polisialilacion.

El termino “que se produce de manera natural”, tal como se aplica a una protema o polipeptido, se refiere a una protema que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polinucleotido o polipeptido que esta presente en un organismo (incluyendo virus) que se afsla a partir de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado deliberadamente por el hombre en el laboratorio se produce de manera natural. Los terminos “que se produce de manera natural” y “de tipo natural” se usan de manera intercambiable todo el tiempo.

El termino “derivado de plasma”, tal como se aplica a una protema o polipeptido, se refiere a un polipeptido que se produce de manera natural o fragmento del mismo que se encuentra en suero o plasma sangumeo de un sujeto.

El termino “polfmero soluble en agua” se refiere a moleculas de polfmero que son sustancialmente solubles en disolucion acuosa o estan presentes en forma de una suspension y no tienen sustancialmente un impacto negativo en mairnferos tras la administracion de una protema conjugada a dicho polfmero en una cantidad farmaceuticamente eficaz y pueden considerarse como biocompatibles. En una realizacion, las moleculas fisiologicamente aceptables comprenden desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 300 unidades de repeticion. Los polfmeros solubles en agua a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, poli(alquilenglicoles) tales como polietilenglicol (PEG), poli(propilenglicol) (“PpG”), copolfmeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poli(poliol oxietilado), poli(alcohol olefmico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(metacrilato de hidroxialquilo), poli(sacaridos), poli(a-hidroxiacido), poli(alcohol vimlico), polifosfosfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina), polfmeros de poli(oxido de alquileno), poli(acido maleico), poli(DL-alanina), polisacaridos, tales como carboximetilcelulosa, dextrano, almidon o derivados de almidon, acido hialuronico y quitina, poli(met)acrilatos, y combinaciones de cualquiera de los anteriores.

La molecula de polfmero soluble en agua no se limita a una estructura particular y, en determinados aspectos, es ramificada o de multiples brazos, dendntica, o con uniones degradables, liberables o hidrolizables. Ademas, la estructura interna de la molecula de polfmero, en todavfa otros aspectos, se organiza en cualquiera de varios patrones diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en, sin limitacion, homopolfmero, copolfmero alterno, copolfmero al azar, copolfmero de bloque, tripolfmero alterno, tripolfmero al azar y tripolfmero de bloque.

El termino “pegilado” se refiere a una protema, complejo proteico o polipeptido unido a uno o mas restos de PEG. El termino “pegilacion” tal como se usa en el presente documento se refiere al proceso de unir uno o mas PEG a una protema. El peso molecular del PEG puede estar en el intervalo de desde 2 hasta 200 kDa, desde 5 hasta 120 kDa, desde 10 hasta 100 kDa, desde 20 hasta 50 kDa, desde 10 hasta 25 kDa, desde 5 kDa hasta 10 kDa o desde 2 kDa hasta 5 kDa.

El termino “polisialilado” se refiere a una protema, complejo proteico o polipeptido unido a uno o mas restos de poli(acido sialico) (PSA). El termino “polisialilacion” tal como se usa en el presente documento se refiere al proceso de unir uno o mas restos de PSA a una protema. En una realizacion, el peso molecular de dicho PSA esta en el intervalo de desde 2 hasta 80 kDa, desde 5 hasta 60 kDa, desde 10 hasta 40 kDa o desde 15 hasta 25 kDa.

El termino “ligador” se refiere a un fragmento molecular que une el polfmero soluble en agua a una molecula biologicamente activa. El fragmento tiene normalmente dos grupos funcionales que pueden acoplarse a o activarse para reaccionar con otro ligador o directamente con el nucleofilo biologicamente activo. Como ejemplo, se usa comunmente acido o-aminoalcanoico tal como lisina. En la presente invencion, los ligadores incluyen ligadores estables, liberables, degradables e hidrolizables.

El termino “composicion farmaceutica” se refiere a una composicion adecuada para uso farmaceutico en un animal sujeto, incluyendo humanos y mamfferos. Una composicion farmaceutica comprende una cantidad

farmacologicamente eficaz de un conjugado de polfmero-polipeptido y tambien comprende un portador farmaceuticamente aceptable. Una composicion farmaceutica abarca una composicion que comprende el/los principio(s) activo(s), y el/los componente(s) inerte(s) que constituyen el portador farmaceuticamente aceptable, asf

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combinacion, complejacion o agregacion de dos cualesquiera dos o mas de los componentes. Por consiguiente, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion abarcan cualquier composicion preparada mezclando un compuesto o conjugado de la presente invencion y un portador farmaceuticamente aceptable.

El termino “portador farmaceuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion, tampones y excipientes clmicamente utiles, tales como una disolucion salina tamponada con fosfato, disolucion acuosa al 5 % de dextrosa y emulsiones, tales como una emulsion de aceite/agua o de agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes y/o adyuvantes. Se describen formulaciones y portadores farmaceuticos adecuados en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995). Los portadores farmaceuticos utiles para la composicion dependen del modo previsto de administracion del principio activo. Los modos tfpicos de administracion incluyen, pero no se limitan a, enteral (por ejemplo, oral) o parenteral (por ejemplo, inyeccion subcutanea, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal; o administracion topica, transdermica o transmucosa). Una “sal farmaceuticamente aceptable” es una que puede formularse para dar un compuesto o conjugado para uso farmaceutico incluyendo, por ejemplo, sales de metal (sodio, potasio, magnesio, calcio, etc.) y sales de amoniaco o aminas organicas.

El termino “farmaceuticamente aceptable” o “farmacologicamente aceptable” quiere decir un material que no es biologicamente o de otra forma indeseable, es decir, el material puede administrarse a un individuo sin provocar efectos biologicos no deseados o interaccionar de una manera perjudicial con cualquiera de los componentes de la composicion en la que esta contenido, o cuando se administra usando vfas bien conocidas en la tecnica, tal como se describe a continuacion.

El termino “trastorno de la coagulacion sangumea” o “trastorno hemorragico” se refiere a cualquiera de varias deficiencias heredadas o desarrolladas en factores de coagulacion sangumea que conducen a la incapacidad de la sangre para formar eficazmente coagulos, y la posterior hemorragia aberrante en un sujeto. Los trastornos de la coagulacion sangumea incluyen pero no se limitan a, hemofilia A, hemofilia B, smdrome de von Willebrand, deficiencia de factor X, deficiencia de factor VII, enfermedad de Alexander, smdrome de Rosenthal (hemofilia C) y deficiencia de factor XIII. Tratamiento de un trastorno de la coagulacion sangumea se refiere a tratamiento profilactico o tratamiento terapeutico.

“Tratamiento” se refiere a tratamiento profilactico o tratamiento terapeutico. Un tratamiento “profilactico” es un tratamiento administrado a un sujeto que no presenta signos de una enfermedad o presenta solo signos tempranos para el proposito de disminuir el riesgo de desarrollar una patologfa. Los compuestos o conjugados de la invencion pueden administrarse como tratamiento profilactico para reducir la probabilidad de desarrollar una patologfa o para minimizar la gravedad de la patologfa, si se desarrolla. Un tratamiento “terapeutico” es un tratamiento administrado a un sujeto que presenta signos o smtomas de una patologfa para el proposito de disminuir o eliminar esos signos o smtomas. Los signos o smtomas pueden ser bioqmmicos, celulares, histologicos, funcionales, subjetivos u objetivos. Las composiciones de la invencion pueden administrarse como tratamiento terapeutico o para diagnostico.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “sujeto” abarca mairnferos y sujetos distintos de mamfferos. Los ejemplos de mamfferos incluyen, pero no se limitan a, cualquier miembro de la clase de los mamfferos: humanos, primates no humanos tales como chimpances, y otros simios y especies de monos; animales de granja tales como ganado, caballos, ovejas, cabras, cerdos; animales domesticos tales como conejos, perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores, tales como ratas, ratones y cobayas, y similares. Los ejemplos de sujetos distintos de mamfferos incluyen, pero no se limitan a, aves, peces, y similares. El termino no indica un genero o edad particular.

El termino “cantidad eficaz” significa una dosificacion suficiente para producir un resultado deseado sobre un estado de salud, patologfa y enfermedad de un sujeto o para un proposito de diagnostico. El resultado deseado puede comprender una mejora subjetiva u objetiva en el receptor de la dosificacion. “Cantidad terapeuticamente eficaz” se refiere a la cantidad de un agente eficaz para producir el efecto beneficioso previsto sobre la salud. Una cantidad “eficaz” apropiada en cualquier caso individual puede determinarla un experto habitual en la tecnica usando experimentacion de rutina.

Protemas y complejos proteicos

Las protemas contempladas para su uso en composiciones farmaceuticas incluyen factores de coagulacion sangumea fisiologicamente activos utiles para su administracion a un sujeto. El factor de coagulacion sangumea es una protema o cualquier fragmento, analogo o variante de tales que conserve todavfa parte, sustancialmente toda o toda la actividad biologica o terapeutica de la protema. En algunas realizaciones, el factor de coagulacion sangumea es uno que, si no se expresa ni se produce o si tiene una expresion o produccion sustancialmente reducida, dana lugar a una enfermedad. En un aspecto, el factor de coagulacion sangumea se deriva o se obtiene de un mam^era.

El factor de coagulacion sangumea conjugado a un polfmero soluble en agua puede ser un factor de coagulacion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

sangumea o fragmento del mismo que presenta una actividad biologica de la protema, y tiene una secuencia de aminoacidos identica a la secuencia de aminoacidos para la parte correspondiente de la protema humana o de mairnfero. El factor de coagulacion sangumea del conjugado puede ser una protema nativa para la especie del humano o mai^ero. El factor de coagulacion sangumea o fragmento del mismo puede ser sustancialmente homologo (es decir, al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, mas preferiblemente el 98 %, o lo mas preferiblemente el 99 % identico en secuencia de aminoacidos a lo largo de una longitud de al menos 10, 25, 50, 100, 150 o 200 aminoacidos, o toda la longitud del agente activo) a una secuencia nativa de la protema humana o de marnffero correspondiente.

Metodos de preparacion de una protema

Se conocen bien en la tecnica metodos para preparar protemas recombinantes. Se describen metodos de produccion de celulas, incluyendo celulas de mamffero, que expresan ADN o ARN que codifica para una protema recombinante en las patentes estadounidenses numeros 6.048.729, 5.994.129 y 6.063.630.

Un constructo de acido nucleico usado para expresar un polipeptido o fragmento, variante o analogo del mismo es, en un aspecto, uno que se expresa de manera extracromosomica (episomal) en la celula de mamffero transfectada o uno que se integra, o bien aleatoriamente o bien en un sitio diana preseleccionado a traves de recombinacion homologa, en el genoma de la celula del receptor. Un constructo que se expresa de manera extracromosomica comprende, ademas de secuencias que codifican para polipeptido, secuencias suficientes para la expresion de la protema en las celulas y, opcionalmente, para la replicacion del constructo. Opcionalmente incluye un promotor, una secuencia de ADN que codifica para polipeptido y/o un sitio de poliadenilacion. El ADN que codifica para la protema esta situado en el constructo de una manera tal que su expresion esta bajo el control del promotor. Opcionalmente, el constructo contiene componentes adicionales tales como uno o mas de los siguientes: un sitio de corte y empalme, una secuencia potenciadora, un gen marcador seleccionable bajo el control de un promotor apropiado y un gen marcador amplificable bajo el control de un promotor apropiado.

En aquellas realizaciones en las que el constructo de ADN se integra en el genoma de la celula, en un aspecto, necesita incluir solo las secuencias de acido nucleico que codifican para polipeptido. Opcionalmente, el constructo incluye una secuencia promotora y una potenciadora, un sitio o sitios de poliadenilacion, un sitio o sitios de corte y empalme, secuencias de acido nucleico que codifican para un marcador o marcadores seleccionables, secuencias de acido nucleico que codifican para un marcador amplificable y/o ADN homologo a ADN genomico en la celula receptora para dirigir la integracion del ADN a un sitio seleccionado en el genoma (seleccion como diana de ADN o secuencias de ADN).

Celulas huesped

Celulas huesped usadas para producir protemas recombinantes son, por ejemplo y sin limitacion, celulas bacterianas, de levaduras, de insectos, de vertebrados no mamfferos o de mamfferos; las celulas de mamffero incluyen, pero no se limitan a, celulas de hamster, mono, chimpance, perro, gato, bovinas, porcinas, de raton, de rata, de conejo, de oveja y humanas. Las celulas huesped son celulas inmortalizadas (una lmea celular) o celulas no inmortalizadas (primarias o secundarias) y son de una amplia variedad de tipos de celulas, tales como, pero sin limitarse a, fibroblastos, queratinocitos, celulas epiteliales (por ejemplo, celulas epiteliales de mamffero, celulas epiteliales intestinales), celulas de ovario (por ejemplo, celulas de ovario de hamster chino o CHO), celulas endoteliales, celulas gliales, celulas neuronales, elementos formados de la sangre (por ejemplo, linfocitos, celulas de medula osea), celulas musculares, hepatocitos y precursores de estos tipos de celulas somaticas. Las celulas huesped comunmente usadas incluyen, sin limitacion: celulas procariotas tales como bacterias Gram-negativas o Gram-positivas, es decir, cualquier cepa de E. coli, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Salmonella, y similares; celulas eucariotas tales como celulas CHO (de ovario de hamster chino); celulas de rinon de cna de hamster (BHK); celulas 293 de rinon humano; celulas COS-7; celulas de insectos tales como D. Mel-2, Sf4, Sf5, Sf9 y Sf21 y High 5; celulas vegetales y diversas celulas de levaduras tales como Saccharomyces y Pichia.

Las celulas huesped que contienen el ADN o ARN que codifica para polipeptido se cultivan en condiciones apropiadas para el crecimiento de las celulas y la expresion del ADN o ARN. Las celulas que expresan el polipeptido se identifican, usando metodos conocidos, y la protema recombinante se afsla y se purifica, usando metodos conocidos; o bien con o bien sin amplificacion de la produccion de polipeptido. La identificacion se lleva a cabo, por ejemplo y sin limitacion, a traves de examen de celulas de mai^ero modificadas geneticamente que presentan un fenotipo indicativo de la presencia de ADN o ARN que codifica para la protema, tal como examen por PCR, examen mediante analisis de transferencia de tipo Southern o examen para la expresion de la protema. La seleccion de celulas que han incorporado ADN que codifica para protema se logra, por ejemplo, incluyendo un marcador seleccionable en el constructo de ADN y cultivando celulas transfectadas o infectadas que contienen un gen marcador seleccionable en condiciones apropiadas para la supervivencia de solo las celulas que expresan el gen marcador seleccionable. La amplificacion adicional del constructo de ADN introducido se efectua cultivando celulas geneticamente modificadas en condiciones apropiadas para la amplificacion (por ejemplo, cultivando celulas geneticamente modificadas que contienen un gen marcador amplificable en presencia de una concentracion de un farmaco a la que solo celulas que contienen multiples copias del gen marcador amplificable pueden sobrevivir).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las protemas recombinantes que son protemas fisiologicamente activas o protemas terapeuticas incluyen, pero no se limitan a, citocinas, factores de crecimiento, factores de coagulacion sangumea, enzimas, quimiocinas, receptores de superficie celular solubles, moleculas de adhesion celular, anticuerpos, hormonas, protemas del citoesqueleto, protemas de la matriz, protemas chaperona, protemas estructurales, protemas metabolicas y otras protemas terapeuticas conocidas por los expertos en la tecnica.

Los factores de coagulacion sangumea recombinantes a modo de ejemplo que se usan como productos terapeuticos incluyen, pero no se limitan a, factor II, factor III, factor V, factor VII, factor Vila, factor VIII, factor IX , factor X, factor XI, factor de von Willebrand y fibrinogeno. El complejo proteico puede ser un complejo que comprende uno o mas factores sangumeos.

Factores sangumeos

El factor VIII (FVIII) es una glicoprotema de plasma sangumeo de aproximadamente 260 kDa de masa molecular producida en el fngado de marnfferos (n.° de registro de Genbank NP_000123). Es un componente cntico de la cascada de reacciones de coagulacion que conducen a la coagulacion sangumea. Dentro de esta cascada esta una etapa en la que el factor IXa, conjuntamente con FVIII, convierte el factor X (n.° de registro de Genbank NP_000495) en una forma activada, factor Xa. El FVIII actua como cofactor en esta etapa, requiriendose con iones de calcio y fosfolfpido para la actividad del factor IXa. Los dos trastornos hemofflicos mas comunes estan provocados por una deficiencia de FVIII funcional (hemofilia A, aproximadamente el 80 % de todos los casos) o factor IXa funcional (hemofilia B o enfermedad de factor Christmas). El FVIII circula en el plasma a una concentracion muy baja y esta unido de manera no covalente a factor de von Willebrand (VWF). Durante la hemostasia, el FVIII se separa de VWF y actua como cofactor para la activacion de factor X (FX) mediada por factor IX activado (FIXa) potenciando la velocidad de activacion en presencia de calcio y fosfolfpidos o membranas celulares.

El FVIII se sintetiza como un precursor de una sola cadena de aproximadamente 270-330 kD con la estructura de dominios A1-A2-B-A3-C1-C2. Cuando se purifica del plasma, el FVIII se compone de una cadena pesada (A1-A2-B) y una cadena ligera (A3-C1- C2). La masa molecular de la cadena ligera es de 80 kD mientras que, debido a la proteolisis dentro del dominio B, la cadena pesada esta en el intervalo de 90-220 kD.

El FVIII tambien se sintetiza como una protema recombinante para uso terapeutico en trastornos hemorragicos. Se han ideado diversos ensayos in vitro para determinar la posible eficacia de FVIII recombinante (rFVIII) como medicamento terapeutico. Estos ensayos imitan los efectos in vivo de FVIII endogeno. El tratamiento con trombina in vitro de FVIII da como resultado un aumento rapido y una disminucion posterior en su actividad procoagulante, tal como se mide mediante un ensayo in vitro. Esta activacion e inactivacion coincide con la proteolisis limitada espedfica tanto en las cadenas pesadas como ligeras, que alteran la disponibilidad de diferentes epttopos de union en FVIII, por ejemplo, permitiendo que FVIII se disocie de VWF y se una a una superficie de fosfolfpidos o alterando la capacidad de union a determinados anticuerpos monoclonales.

Hasta hace poco, el tratamiento convencional de la hemofilia A implicaba una infusion frecuente de preparaciones de concentrados de FVIII derivados de los plasmas de donantes humanos. Aunque esta terapia de sustitucion es generalmente eficaz, tal tratamiento pone a los pacientes en riesgo de enfermedades transmisibles por virus tales como hepatitis y SIDA. Aunque este riesgo se ha reducido mediante la purificacion adicional de FVIII del plasma mediante inmunopurificacion usando anticuerpos monoclonales, y mediante la inactivacion de virus mediante tratamiento con o bien un disolvente organico o bien calor, tales preparaciones han aumentado enormemente el coste del tratamiento y no carecen de riesgos. Por estos motivos, los pacientes se han tratado ocasionalmente, en vez de profilacticamente. Una complicacion adicional es que aproximadamente el 15% de pacientes desarrollan anticuerpos inhibidores frente a FVIII derivado de plasma. Los pacientes con hemofilia A grave con niveles de FVIII por debajo del 1 %, siguen generalmente una terapia profilactica con el objetivo de mantener FVIII por encima del 1 % entre las dosis. Teniendo en cuenta las semividas promedio de los diversos productos de FVIII en la circulacion, esto puede lograrse habitualmente administrando FVIII de dos a tres veces a la semana.

Un avance importante en el tratamiento de la hemofilia A fue el aislamiento de clones de ADNc que codifican para la secuencia de 2.351 aminoacidos completa de FVIII humano (vease, Wood et al, Nature, 312: 330 (1984) y la patente estadounidense n.° 4.757.006) y la provision de la secuencia de ADN del gen de FVIII humano y metodos recombinantes para su produccion. Los productos de FVIII para el tratamiento de la hemofilia incluyen, pero no se limitan a: ADVATE® (factor antihemofflico (recombinante), metodo libre de plasma/albumina, rAHF-PFM), factor antihemofflico recombinante (BIOCLATE™, GENARC®, HELIXATE FS®, KOATE®, KOGENATE FS®, RECOMBINATE®): MONOClAtE-P®, preparacion purificada de factor VIII:C, complejo de factor

antihemofflico/factor de von Willebrand (humano) HuMATE-P® y ALPHANATE®, complejo de factor

antihemofflico/factor de von Willebrand (humano); y HYATE C®, factor VIII de cerdo purificado. ADVATE® se produce en celulas CHO y lo fabrica Baxter Healthcare Corporation. No se anade ninguna albumina o protema plasmatica humana o animal en el proceso de cultivo celular, purificacion o formulacion final de ADVATE®.

El factor de von Willebrand existe en el plasma en una serie de formas multimericas de un peso molecular de desde

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1x106 hasta 20x106 Dalton. El VWF (n.° de registro de Genbank NP_000543) es una glicoprotema formada principalmente en las celulas endoteliales de mairnferos y posteriormente secretada a la circulacion. En este sentido, partiendo de una cadena de polipeptido que tiene un peso molecular de aproximadamente 220 kD, se produce un dfmero de VWF que tiene un peso molecular de 550 kD en las celulas mediante la formacion de varios enlaces de azufre. Se forman polfmeros adicionales del VWF con pesos moleculares crecientes, de hasta 20 millones de Dalton, mediante la union de dfmeros de VWF. Se supone que particularmente los multimeros de VWF de alto peso molecular tienen una importancia esencial en la coagulacion sangumea.

El smdrome de VWF se manifiesta clmicamente cuando hay o bien una subproduccion o bien una sobreproduccion de VWF. La sobreproduccion de VWF provoca trombosis aumentada (formacion de un coagulo o trombo dentro de un vaso sangumeo, que obstruye el flujo de sangre) mientras que niveles reducidos de, o la falta de, formas de alto peso molecular de vWf provocan un aumento de la hemorragia y un tiempo de hemorragia aumentado debido a la inhibicion de la agregacion plaquetaria y el cierre de heridas.

Una deficiencia de VWF puede provocar tambien una hemofilia A fenotfpica puesto que el VWF es un componente esencial del factor VIII funcional. En estos casos, la semivida del factor VIII se reduce hasta un grado tal que su funcion en la cascada de coagulacion sangumea se ve alterada. Los pacientes que padecen enfermedad de von Willebrand (VWD) o smdrome de VWF presentan frecuentemente una deficiencia de factor VIII. En estos pacientes, la actividad del factor VIII reducida no es la consecuencia de un defecto del gen cromosomico X, sino una consecuencia indirecta del cambio cuantitativo y cualitativo de VWF en el plasma. La diferenciacion entre hemofilia A y VWD puede efectuarse normalmente midiendo el antfgeno VWF o determinando la actividad de cofactor de ristocetina. Tanto el contenido en antfgeno VWF como la actividad de cofactor de ristocetin estan disminuidos en la mayona de los pacientes con VWD, mientras que son normales en pacientes con hemofilia A. Los productos de VWF para el tratamiento del smdrome de vWf incluyen, pero no se limitan a: HUMATE-P, iMmUNATE®, INNOBRAND® y 8Y®, que son terapias que comprenden concentrado de FVIII/VWF a partir del plasma.

El factor VII (proconvertina), una enzima serina proteasa, es una de las protemas centrales en la cascada de coagulacion sangumea (n.° de registro de Genbank NP_000122). El papel principal del factor VII (FVII) es iniciar el proceso de coagulacion conjuntamente con factor tisular (TF). Tras la lesion del vaso, el TF se expone a la sangre y el factor VII circulante. Una vez unido a TF, el FVII se activa a FVIIa mediante diferentes proteasas, entre las cuales estan trombina (factor IIa), factor X activado y el propio complejo de FVIIa-TF. Se ha introducido factor VIIa humano recombinante (NOVOSEVEN®) para su uso en hemorragia incontrolable en pacientes con hemofilia que han desarrollado inhibidores contra el factor de coagulacion de sustitucion.

El factor IX (FIX, factor Christmas) (n.° de registro de Genbank NP_000124) es una serina proteasa que es inactiva a menos que se active por el factor XIa o factor VIIa (de la ruta del factor tisular). Cuando se activa a factor IXa, actua hidrolizando un enlace arginina-isoleucina en el factor X para formar factor Xa. El factor VIII es un cofactor requerido para la actividad proteasa de FIX (Lowe GD, Br. J. Haematol. 115: 507-13, 2002). La deficiencia de factor IX provoca hemofilia B o enfermedad de Christmas.

Los factores sangumeos adicionales incluyen factor II (trombina) (n.° de registro de Genbank NP_000497), cuyas deficiencias provocan trombosis y disprotrombinemia; factor V, (n.° de registro de Genbank NP_000121), cuyas deficiencias provocan diatesis hemorragica o una forma de trombofilia, que se conoce como resistencia a protema C activada, factor XI (n.° de registro de Genbank NP_000119), cuyas deficiencias provocan smdrome de Rosenthal (hemofilia C) y subunidad A (n.° de registro de Genbank NP_000120) y subunidad B (n.° de registro de Genbank NP_001985) de factor XIII, cuyas deficiencias se caracterizan como deficiencia de tipo I (deficiencia de tanto las subunidades A como B) y deficiencia de tipo II (deficiencia de la subunidad A sola), cualquiera de las cuales puede dar como resultado una tendencia a la hemorragia permanente, cicatrizacion de heridas defectuosa y aborto habitual.

Analogos o variantes de polipeptidos

Se conocen bien en la tecnica metodos para preparar fragmentos, variantes o analogos de polipeptidos. Se preparan fragmentos de un polipeptido usando metodos que incluyen escision enzimatica (por ejemplo, tripsina, quimotripsina) y tambien usando medios recombinantes para generar un fragmento de polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos espedfica. Se generan fragmentos, en un aspecto, para que comprendan un dominio de union a ligando, un dominio de union a receptor, un dominio de dimerizacion o multimerizacion o cualquier otro dominio identificable conocido en la tecnica.

Los analogos son, en determinados aspectos, sustancialmente homologos o sustancialmente identicos al polipeptido que se produce de manera natural del cual se deriva el analogo, y los analogos contemplados por la invencion son los que conservan al menos parte de la actividad biologica del polipeptido que se produce de manera natural tal como se describio anteriormente.

Los analogos de sustitucion intercambian normalmente un aminoacido del tipo natural por otro en uno o mas sitios dentro de la protema, y pueden disenarse para modular una o mas propiedades del polipeptido, tales como

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

estabilidad frente a la escision proteolftica, sin la perdida de otras funciones o propiedades. Sustituciones de este tipo son generalmente conservativas. Por “sustitucion de aminoacido conservativa” quiere decirse la sustitucion de un aminoacido por un aminoacido que tiene una cadena lateral de un caracter qmmico similar. Los aminoacidos similares para realizar sustituciones conservativas incluyen aquellos que tienen una cadena lateral acida (acido glutamico, acido aspartico); una cadena lateral basica (arginina, lisina, histidina); una cadena lateral de amida polar (glutamina, asparagina); una cadena lateral hidrofoba, alifatica (leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina); una cadena lateral aromatica (fenilalanina, triptofano, tirosina); una cadena lateral pequena (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); o una cadena lateral de hidroxilo alifatica (serina, treonina).

Un operario experto genera facilmente analogos y fragmentos de polinucleotidos para que codifiquen para fragmentos o analogos biologicamente activos de la molecula que se produce de manera natural que presenta la misma o similar actividad biologica que la molecula que se produce de manera natural. Los metodos puestos en practica de manera rutinaria incluyen tecnicas de PCR, digestion enzimatica de ADN que codifica para la molecula de protema y ligacion a secuencias de polinucleotido heterologas, y similares. Por ejemplo, puede emplearse mutagenesis puntual, usando PCR y otras tecnicas bien conocidas en la tecnica, para identificar con particularidad que residuos de aminoacido son importantes en actividades particulares asociadas con la actividad de la protema. Por tanto, un experto en la tecnica sera capaz de generar cambios en bases individuales en la hebra de ADN dando como resultado un codon alterado y una mutacion de cambio de sentido.

Se contempla ademas que la protema o el polipeptido se modifique para preparar un analogo que es una protema tal como se describe en el presente documento que comprende ademas un segundo agente que es un polipeptido, es decir, una protema de fusion. En una realizacion, el segundo agente que es un polipeptido es una citocina, factor de crecimiento, factor sangumeo, enzima, quimiocina, receptor de superficie celular soluble, molecula de adhesion celular, anticuerpo, hormona, protema del citoesqueleto, protema de la matriz, protema chaperona, protema estructural, protema metabolica y otras protemas terapeuticas conocidas por los expertos en la tecnica, o fragmento o dominio activo de una protema descrita anteriormente o de cualquier otro tipo de protema conocida en la tecnica. En una realizacion relacionada, el segundo agente es un factor de coagulacion sangumea tal como factor II, factor III, factor V, factor VII, factor Vila, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, factor de von Willebrand y fibrinogeno. La protema de fusion contemplada se prepara mediante tecnicas qmmicas o recombinantes bien conocidas en la tecnica.

Las variantes de protemas contempladas incluyen polipeptidos modificados qmmicamente mediante tecnicas tales como ubiquitinacion, glicosilacion, conjugacion a agentes terapeuticos o de diagnostico, marcaje (por ejemplo, con radionuclidos o diversas enzimas), union de un polfmero covalente tal como pegilacion (derivatizacion con polietilenglicol), introduccion de enlaces no hidrolizables e insercion o sustitucion mediante smtesis qrnmica de aminoacidos tales como ornitina, que no aparecen normalmente en protemas humanas. Las variantes conservan las propiedades de union de moleculas de la invencion no modificadas.

Otras variantes de polipeptidos utiles en los metodos de la presente invencion incluyen polipeptidos que comprenden restos polisialilados (PSA). Se describen metodos para preparar polipeptido polisialilado en la publicacion de patente estadounidense 20060160948 y Saenko et al. Haemophilia 12:42-51,2006.

Polimeros solubles en agua

La memoria descriptiva contempla protemas o polipeptidos modificados qmmicamente, que se han unido a un resto qmmico que proporciona efectos ventajosos a la produccion, viabilidad de la protema o polipeptido. Por ejemplo, se conoce en la tecnica que la conjugacion no espedfica o espedfica de sitio (por ejemplo, N-terminal) de polfmeros solubles en agua, por ejemplo, PEG o PEO, a polipeptidos mejora la semivida reduciendo potencialmente la inmunogenicidad, el aclaramiento renal y/o mejorando la resistencia a proteasas. Los polipeptidos pueden comprender polfmeros solubles en agua, tales como PEG, unidos covalentemente al extremo N- o C-terminal del peptido para aumentar la semivida y/o estabilidad de la molecula.

Polfmeros solubles en agua, incluyendo pero sin limitarse a, poli(alquilenglicoles) tales como polietilenglicol (PEG), poli(propilenglicol) (“PPG”), copolfmeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poli(poliol oxietilado), poli(alcohol olefmico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(metacrilato de hidroxialquilo), poli(sacaridos), poli(a-hidroxiacido), poli(alcohol vimlico), polifosfosfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina), polfmeros de poli(oxido de alquileno), poli(acido maleico), poli(DL-alanina), polisacaridos, tales como carboximetilcelulosa, dextrano, almidon o derivados de almidon, acido hialuronico y quitina, poli(met)acrilatos, asf como poli(acido sialico) (PSA), y combinaciones de cualquiera de los anteriores, se conjugan comunmente con protemas o peptidos para aumentar la estabilidad o el tamano de una protema o un peptido.

La modificacion qrnmica de macromoleculas se realiza, en un aspecto, de un modo no espedfico (conduciendo a mezclas de especies derivatizadas) o de un modo espedfico de sitio (basandose en derivatizacion dirigida por la reactividad de la macromolecula de tipo natural y/o modificacion selectiva de sitio usando una combinacion de mutagenesis dirigida al sitio y modificacion qrnmica) o, alternativamente, usando metodos de ligacion de protemas expresadas (Curr Opin Biotechnol. 13(4):297-303 (2002)).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La memoria descriptiva contempla el uso de poKmeros solubles en agua, por ejemplo, moleculas de PEG o PEO que pueden variar en tipo, conjugacion, union y longitud. Los conjugados de PEG-protema incluyen pero no se limitan a conjugados lineales o ramificados, conjugados de poUmero-protemas unidos mediante qmmica basada en NHS (N- hidroxisuccinimida) o aldetndo, variantes con una union qmmica diferente entre la cadena de polfmero soluble en agua y el sitio de conjugacion, y variantes que difieren en las longitudes. El peso molecular promedio del PEG puede oscilar entre aproximadamente 2 y 200 kilodalton (“kDa”), entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 120 kDa, entre aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 100 kDa, entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 50 kDa, entre aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 25 kDa, entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa, entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 10 kDa o entre aproximadamente 2 kDa y 5 kDa.

En un aspecto de referencia, la memoria descriptiva contempla conjugados de PEG-protema seleccionados del grupo que consiste en conjugados de PEG-protema lineales que estan conjugados a NHS y oscilan en longitud entre -(CH2-CH2-O)n-, en donde n = de 10 a 2000, conjugados de PEG-protema lineales que estan conjugados a aldetndo y oscilan en longitud entre -(CH2-CH2-O)n-, en donde n = de 10 a 2000, conjugados de PEG-protema de multiples brazos y ramificados de dos brazos y oscilan en longitud desde 10 hasta 2000, y conjugados de PEG- protema ramificados de tres brazos que estan conjugados a NHS. La memoria descriptiva tambien contempla conjugados de PEG-protema que contienen diferentes uniones qmmicas, por ejemplo, -CO(CH2)n- y -(CH2)n- (en donde n = de 1 a 5) entre su sitio de conjugacion y la cadena de PEG. La memoria descriptiva contempla ademas conjugados de PEG-protema cargados, anionicos para reducir el aclaramiento renal, incluyendo pero sin limitarse a compuestos carboxilados, sulfatados y fosforilados (anionicos) (Caliceti, Adv Drug Deliv Rev 55:1261-77, 2003; Perlman, J Clin Endo Metab 88:3227-35, 2003; Pitkin, Antimicrb Ag Chemo 29: 440-44, 1986; Vehaskari, Kidney Intl 22:127-135, 1982). En una realizacion adicional, el peptido esta conjugado opcionalmente a un resto que incluye bisfosfonato, hidratos de carbono, acidos grasos o aminoacidos adicionales.

Los PEG y PEO incluyen moleculas con una distribucion de pesos moleculares, es decir, polidispersas. La distribucion de tamano puede caracterizarse estadfsticamente por su peso molecular promedio en peso (Mw) y su peso molecular promedio en numero (Mn), cuya razon se denomina mdice de polidispersidad (Mw/Mn). Mw y Mn pueden medirse mediante espectroscopfa de masas. La mayona de los conjugados de PEG-protema, particularmente los conjugados a PEG mayor de 1 KD, presentan un intervalo de pesos moleculares debido a la naturaleza polidispersa de la molecula de PEG original. Por ejemplo, en el caso de mPEG2K (Sunbright ME-020HS, NOF), las masas moleculares reales se distribuyen a lo largo de un intervalo de 1,5 ~ 3,0 KD con un mdice de polidispersidad de 1,036. Excepciones son protemas conjugadas a reactivos a base de MS(PEG)n (N=4, 8, 12 o 24, por ejemplo, PEO4, PEO12) (Pierce), que se preparan especialmente como mezclas monodispersas con longitud de cadena diferenciada y peso molecular definido.

Para determinar si la semivida terapeutica in vivo de un peptido se beneficiana de la pegilacion, se sintetiza una variedad de diferentes conjugados de PEG-protema, se caracterizan in vitro e in vivo para determinar la farmacocinetica.

Los metodos para preparar la protema pegilada de la presente memoria descriptiva comprenden generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar la protema de interes con polietilenglicol en condiciones mediante las cuales el PEG se une al extremo N-terminal/C-terminal de la protema, y (b) obtener el/los producto(s) de reaccion. Debido a que la pegilacion de una protema alterana significativamente la actividad intrmseca de la protema, se exploran diferentes tipos de PEG. La qmmica que puede usarse para la pegilacion de la protema incluye la acilacion de las aminas primarias de la protema usando el ester de NHS de metoxi-PEG (O-[(N-succinimidiloxicarbonil)-metil]-O'- metilpolietilenglicol). La acilacion con metoxi-PEG-NHS o metoxi-PEG-SPA da como resultado una union amida que elimina la carga de la amina primaria original (tambien, Boc-PEG para el extremo C-terminal). A diferencia de la smtesis de protemas en ribosomas, la smtesis de peptidos sinteticos avanza desde el extremo C-terminal hasta el extremo N-terminal. Por tanto, Boc-PEG es un metodo (es decir, usando smtesis de terc-(B)utilo(o)xi(c)arbonilo (Boc, t-Boc)) para unir PEG al extremo C-terminal del peptido (R. B. Merrifield (1963). “Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide”. J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154). Alternativamente, se usa qmmica de (F)luorenil-(m)et(o)xi-(c)arbonilo (FMOC) (Atherton, E.; Sheppard, R.C. (1989). Solid Phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford, England: IRL Press.) porque no requiere el uso peligroso acido flurhndrico para eliminar grupos protectores de cadenas laterales.

En la invencion, cuando el polfmero soluble en agua es PSA, el peso molecular promedio del PSA oscilara entre aproximadamente 2 y 80 kDa, entre 5 y 60 kDa, entre 10 y 40 kDa o entre 15 y 25 kDa.

Los ligadores estables a modo de ejemplo que pueden facilitar la conjugacion del polfmero soluble en agua al polipeptido de interes incluyen, pero no se limitan a, uniones amida, amina, eter, carbamato, tiourea, urea, tiocarbamato, tiocarbonato, tioeter, tioestery ditiocarbamato, tales como o,ro-aminoalcano, N-carboxialquilmaleimida, o acidos aminoalcanoicos, ester de sulfosuccinimida de maleimidobenzoMo, glutaraldehndo, o anhndrido succmico, N,N'-disuccinimidiloxalato de N-carboximetilmaleimida y oxalato de 1,1'-bis[6-(trifluorometil)benzo-triazolilo].

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En otras realizaciones, el pokmero soluble en agua se conjuga al polipeptido usando ligadores liberables, degradables o hidrolizables, segun las reivindicaciones. Un enlace hidrolizable es un enlace relativamente debil que reacciona con agua (es decir, se hidroliza) en condiciones fisiologicas. La tendencia de un enlace a hidrolizarse en agua dependera no solo del tipo general de union que conecta dos atomos centrales sino tambien de los sustituyentes unidos a estos atomos centrales. Se describen metodos de preparacion de conjugados que comprenden polfmeros solubles en agua que tienen ligadores hidrolizables en la patente estadounidense 7.259.224 (Nektar Therapeutics) y la patente estadounidense 7.267.941 (Nektar Therapeutics y National Institutes of Health). Por ejemplo, puede prepararse un PEG que tiene uniones ester en la estructura principal del polfmero que se someten a hidrolisis. Esta hidrolisis da como resultado la escision del polfmero en fragmentos de peso molecular inferior. Los ligadores hidroltticamente inestables, liberables o degradables apropiados incluyen pero no se limitan a ester de carboxilato, ester de fosfato, anhfdridos, acetales, cetales, acil oxialquil eter, iminas, ortoesteres, peptidos y oligonucleotidos, tioesteres, tiolesteres y carbonatos. Los ligadores hidrolfticamente degradables que pueden estar contenidos dentro de la estructura principal del polfmero incluyen uniones carbamato, carbonato, sulfato y acil oxialquil eter; uniones imina, que resultan, por ejemplo, de la reaccion de una amina y un aldehfdo (vease, por ejemplo, Ouchi et al., Polymer Preprints, 38(1):582-3 (1997)); uniones carbamato, ester de fosfato, hidrazona, acetal, cetal u ortoester, incluyendo ligadores de acetona-bis-(N-maleimidoetil)cetal (MK).

Los presentes metodos proporcionan una mezcla sustancialmente homogenea de conjugado de polfmero-:protema. “Sustancialmente homogenea” tal como se usa en el presente documento significa que solo se observan moleculas de conjugado de pokmero-protema. El conjugado de pokmero-protema tiene actividad biologica y las presentes preparaciones de protemas pegiladas “sustancialmente homogeneas” son las que son lo suficientemente homogeneas como para mostrar las ventajas de una preparacion homogenea, por ejemplo, facilidad de aplicacion clmica en la predictibilidad de la farmacocinetica de lote a lote.

Las moleculas de polfmero contempladas para su uso en los metodos de union descritos en el presente documento pueden seleccionarse de polfmeros solubles en agua o una mezcla de los mismos. El polfmero puede tener un unico grupo reactivo, tal como un ester activo para la acilacion o un aldehfdo para la alquilacion, de modo que el grado de polimerizacion puede controlarse. El polfmero soluble en agua, o mezcla del mismo si se desea, puede seleccionarse del grupo que consiste en, por ejemplo, PEG, monometoxi-PEG, PEO, dextrano, almidon o derivados de almidon, poli-(N-vinilpirrolidona), homopolfmeros de propilenglicol, acidos grasos, un copolfmero de oxido de polipropileno/oxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), HPMA, FLEXlMAR ™, y poli(alcohol vimlico), mono-(C1-C10)alcoxi-PEG, ariloxi-PEG, tresilmonometoxi-PEG, PEG-propionaldehndo, carbonato de bis- succinimidilo-PEG, celulosa, otros polfmeros a base de hidratos de carbono, o mezclas de los mismos. El polfmero seleccionado debe ser soluble en agua de modo que la protema a la que se une no precipite en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiologico. El polfmero puede estar ramificado o no ramificado. Preferiblemente, para uso terapeutico de la preparacion de producto final, el polfmero sera farmaceuticamente aceptable. En la tecnica se conocen bien metodos para generar peptidos que comprenden un resto de PEG. Vease, por ejemplo, la patente estadounidense 5.824.784.

El termino PEG pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras protemas, tales como mono-ariloxi o alcoxi (C1-C10)-polietilenglicol. El polfmero de PEG puede estar ramificado o no ramificado. Preferiblemente, para uso terapeutico de la preparacion de producto final, el polfmero sera farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, el aldehfdo reactivo es PEG-propionaldehfdo, que es estable en agua, o derivados de mono-ariloxilo o alcoxilo C1-C10 del mismo (vease la patente estadounidense n.° 5.252.714).

La presente memoria descriptiva contempla varias longitudes de polfmeros de PEG lineales diferentes incluyendo pero sin limitarse a de 10 a 2000 unidades de repeticion (-CH2-CH2-O-) o conjugados de polfmeros de PEG ramificados de dos brazos. Se contemplan ademas PEG-(CH2CH2O)n a base de nHs o aldehfdo, que tienen desde 12 hasta 50 unidades. En general, para las reacciones de pegilacion contempladas en el presente documento, el peso molecular promedio del resto de PEG anadido es de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 60 kDa (indicando el termino “aproximadamente” +/-1 kDa). Mas preferiblemente, el peso molecular promedio es de aproximadamente 10 - 40 kDa.

La invencion proporciona protemas modificadas, concretamente FVIII, que tienen un bajo grado de polfmero soluble en agua conjugado a la protema. En un aspecto de referencia, la forma poco pegilada de la protema se genera usando un exceso molar disminuido de polfmero soluble en agua con respecto a protema en la reaccion de conjugacion. Por ejemplo, los metodos tfpicos para pegilar una protema usan un exceso de 61,8 M de PEG con respecto a la protema de interes. Se contempla que se generen protemas poco pegiladas tal como se describe en el presente documento usando un exceso molar en la reaccion que es menor que el usado en tecnicas convencionales. Se divulga que el polfmero soluble en agua puede ser polietilenglicol (PEG). Se contempla que el PEG sea un PEG lineal o ramificado, y puede tener el peso molecular y las caractensticas descritos en el presente documento.

Adicionalmente, se contempla que la protema poco pegilada descrita en el presente documento comprenda al menos uno y no mas de 10 restos de polfmero soluble en agua por molecula de factor sangumeo. En un aspecto de referencia, la protema modificada comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 restos de polfmero soluble en agua por

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

molecula de protema. En otro aspecto de referencia la protema modificada comprende entre 4 y 8 restos de poKmero soluble en agua, inclusive (es decir, incluye 4, 5, 6, 7 y 8 restos de polfmero), por molecula de protema. La protema modificada es un factor sangumeo. El factor sangumeo modificado puede comprender entre 1 y 4 restos de polfmero soluble en agua, inclusive, por molecula de protema. El factor sangumeo modificado puede comprender entre 4 y 6 restos de polfmero soluble en agua, inclusive, por molecula de protema. En todavfa otra realizacion el factor sangumeo modificado comprende 1 o 2 restos de polfmero soluble en agua por molecula de protema segun las reivindicaciones.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “entre” cuando se usa en el contexto de numeros de polfmeros solubles en agua, por ejemplo, “comprende entre 4 y 8 polfmeros solubles en agua”, incluye los numeros mencionados y los numeros entre los numeros mencionados. Por ejemplo, entre 4 y 8 polfmeros solubles en agua se refiere a 4, 5, 6, 7 y 8 polfmeros solubles en agua.

El factor sangumeo es factor VIII. En una realizacion todavfa adicional, la molecula de factor sangumeo es humana.

En otro aspecto de referencia el factor sangumeo modificado comprende entre 4 y 8 restos de PEG, entre 4 y 6 restos de PEG o entre 1 y 4 restos de PEG, inclusive, por molecula de factor VIII. En todavfa otro aspecto de referencia el factor sangumeo modificado comprende 1 o 2 restos de PEG por molecula de factor VIII. Se contempla que las moleculas de PEG esten conectadas o conjugadas al factor sangumeo por medio de un ligador estable, liberable o hidrolizable.

El factor sangumeo modificado comprende 1 o 2 restos de PSA por molecula de factor VIII. Se contempla que las moleculas de PSA esten conectadas o conjugadas al factor sangumeo por medio de un ligador estable, liberable o hidrolizable.

En otro aspecto de referencia, el factor sangumeo modificado es FVIIa. En un aspecto de referencia relacionado, el factor sangumeo modificado comprende entre 1 y 6 restos de polfmero soluble en agua, inclusive, por molecula de FVIIa. En algunos aspectos de referencia, el factor sangumeo modificado comprende 1 o 2 restos de polfmero soluble en agua por molecula de FVIIa. En un aspecto de referencia relacionado, el polfmero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en PEG o PSA. En determinadas realizaciones, los polfmeros estan conectados por medio de un ligador estable, liberable o hidrolizable.

En todavfa otros aspectos de referencia, el factor sangumeo modificado es FIX. En un aspecto de referencia, el factor sangumeo modificado comprende entre 1 y 6 restos de polfmero soluble en agua, inclusive, por molecula de FIX. En algunos aspectos de referencia, el factor sangumeo modificado comprende 1 o 2 restos de polfmero soluble en agua por molecula de FIX. En un aspecto de referencia relacionado, el polfmero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en PEG o PSA. En una realizacion, los polfmeros estan conectados por medio de un ligador estable, liberable o hidrolizable.

Composiciones farmaceuticas

La presente invencion contempla composiciones farmaceuticas que comprenden cantidades eficaces de protema o productos derivados de la invencion junto con diluyentes, estabilizadores, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o portadores farmaceuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen diluyentes de diverso contenido en tampon (por ejemplo, Tris-HCl, fosfato), pH y fuerza ionica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80), antioxidantes (por ejemplo, acido ascorbico, metabisulfito de sodio), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bendlico) y sustancias de carga (por ejemplo, lactosa, manitol); vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edicion (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.) paginas 1435:1712. Una cantidad eficaz de principio activo es una cantidad terapeutica, profilactica o diagnosticamente eficaz, que puede determinarla facilmente un experto en la tecnica teniendo en consideracion factores tales como peso corporal, edad y objetivo terapeutico.

Las composiciones de polfmero-protema de la presente invencion pueden incluir tambien un agente tamponante para mantener el pH de la disolucion dentro de un intervalo deseado. Los agentes preferidos incluyen acetato de sodio, fosfato de sodio y citrato de sodio. Tambien pueden usarse mezclas de estos agentes tamponantes. La cantidad de agente tamponante util en la composicion depende en gran medida del tampon particular usado y el pH de la disolucion. Por ejemplo, el acetato es un tampon mas eficaz a pH 5 que a pH 6 de modo que puede usarse menos acetato en una disolucion a pH 5 que a pH 6. El intervalo de pH preferido para las composiciones de la presente invencion es pH 3,0-7,5.

Las composiciones de la presente invencion pueden incluir ademas un agente de ajuste de la isotonicidad para hacer que la disolucion sea isotonica y mas compatible para la inyeccion. El agente mas preferido es cloruro de sodio dentro de un intervalo de concentracion de 0-150 mM.

Los metodos descritos en el presente documento usan composiciones farmaceuticas que comprenden las moleculas descritas anteriormente, junto con uno o mas excipientes o vehmulos farmaceuticamente aceptables, y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

opcionalmente otros componentes terapeuticos y/o profilacticos. Tales excipientes incluyen Kquidos tales como agua, solucion salina, glicerol, polietilenglicol, acido hialuronico, etanol, ciclodextrinas, ciclodextrinas modificadas (es decir, sulfobutil eter ciclodextrinas), etc. Los expertos en la tecnica tambien conocen excipientes adecuados para formulaciones no Kquidas.

Pueden usarse sales farmaceuticamente aceptables en las composiciones de la presente invencion e incluyen, por ejemplo, sales de acido mineral tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos, y similares; y las sales de acidos organicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y similares. Esta disponible una discusion concienzuda de excipientes y sales farmaceuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edicion (Easton, Pensilvania: Mack Publishing Company, 1990).

Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes biologicas, tensioactivos, y similares, pueden estar presentes en tales vehmulos. Un tampon biologico puede ser practicamente cualquier disolucion que sea farmacologicamente aceptable y que dote a la formulacion del pH deseado, es decir, un pH en el intervalo fisiologicamente aceptable. Los ejemplos de disoluciones tampon incluyen solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, solucion salina tamponada con Tris, solucion salina tamponada de Hank, y similares.

Kits

Como aspecto adicional, la memoria descriptiva incluye kits que comprenden uno o mas compuestos o composiciones envasados de una manera que facilita su uso para poner en practica los metodos de la invencion. En una realizacion, un kit de este tipo incluye un compuesto o composicion descrito en el presente documento (por ejemplo, una composicion que comprende un factor sangumeo modificado, tal como factor VIII poco pegilado), envasado en un recipiente tal como un frasco o botella sellado, con una etiqueta fijada al recipiente o incluida en el envase que describe el uso del compuesto o la composicion en la puesta en practica del metodo. Preferiblemente, el compuesto o la composicion se envasa en una forma de dosificacion unitaria. El kit puede incluir ademas un dispositivo adecuado para administrar la composicion segun una via de administracion espedfica. Preferiblemente, el kit contiene una etiqueta que describe el uso de la composicion de factor sangumeo modificado.

Aspectos y detalles adicionales de la invencion resultaran evidentes a partir de los siguientes ejemplos, que se pretende que sean ilustrativos.

Ejemplos

Ejemplo de referencia 1 Smtesis de factor VIII poco pegilado

La modificacion de factores de coagulacion sangumea mediante la adicion de polfmeros solubles en agua se ha llevado a cabo con el fin de prolongar la semivida y mejorar la estabilidad de moleculas que se administran como protemas terapeuticas. Sin embargo, un alto grado de union de polfmeros solubles en agua puede conducir a mayor toxicidad in vivo. Por tanto, con el fin de mejorar la eficacia de moleculas terapeuticas, se realizaron experimentos para reducir el grado de conjugacion de polfmeros solubles en agua.

La sintesis de rFVIII pegilado que contiene un dominio B intacto se describe en la publicacion de patente estadounidense 20070244301 y la publicacion de patente internacional WO 2007/126808. Este rFVIII pegilado que contiene un dominio B intacto mostro caractensticas in vitro e in vivo mejoradas en condiciones experimentales, y dio como resultado una cadena ligera al menos parcialmente pegilada (A3-C1-C2) de la molecula de rFVIII.

Sin embargo, un proceso qmmico que conduce a un grado relativamente alto de modificacion de la protema terapeutica no es economico debido a las altas cantidades requeridas de reactivos. Ademas, altos grados de pegilacion conducen a un aumento del riesgo toxicologico debido a las altas cantidades del polfmero y el ligador. Por tanto, con el fin de generar una molecula que tiene un menor grado de restos de PEG, la concentracion de reactivos en el proceso de preparacion se redujo y se prepararon diferentes PEGrFVIII reduciendo la concentracion de reactivos desde un exceso de 61,8 M (convencional) hasta un exceso de 30 M, 25 M, 20 M y 15 M, respectivamente.

Las variantes de pegilacion descritas en la tecnica tienen caractensticas de liberacion variables asf como diferentes pesos moleculares de las cadenas de PEG. Veanse, por ejemplo, los documentos WO 2008082669 y US20080234193 (Nektar Therapeutics y Baxter Healthcare). Se preparo una variante de rFVIII pegilado que tema una ramificacion (ramificacion larga de Lys 20K) con un peso molecular de la cadena de PEG de 20 kD con una caractenstica de liberacion prolongada mediante el uso de un exceso de 61,8 M de un reactivo de PEG liberable. Este rFVIII pegilado se selecciono como candidato principal para modificar el grado de pegilacion debido a los datos in vitro e in vivo medidos de las moleculas. Para el candidato de rFVIII pegilado inicial, se midio un grado de pegilacion de 11,1 PEG/rFVIII (mol/mol) mediante el uso de metodos de HPLC tal como se describe en la tecnica (vease por ejemplo, Chen et al., Bioconjug Chem. 18:371-8, 2007) cuando se preparo el conjugado usando un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

exceso de 61,8 M de PEG.

El proceso para la pegilacion de rFVIII fue tal como sigue: pegilacion de rFVIII durante 2 h a T.A. a pH 7,2 +/- 0,2 (c = 2 mg/ml); concentracion de reactivos (3,9 mg de reactivo/mg de protema - exceso de 61,8 M); detencion/extincion de la reaccion mediante la adicion de glicina; purificacion sobre Q-Sepharose HP. Elucion con NaCl ~ 0,5 M; UF/DF y formulacion final de la molecula pegilada. Se prepararon los conjugados con bajo contenido en PEG como anteriormente usando el exceso molar indicado del polfmero de PEG. Las muestras de PEG-rFVIII usadas fueron las siguientes: exceso de 15 M: VIEHLUFB08007PHR; exceso de 20 M: VIEHLUFB08016PHR; exceso de 25 M: VIEHLUFB08017PHR; exceso de 30 M: VIEHLUFB08008PHR, VIEHLUFB08009PHR, VIEHLUFB07029PHR; exceso de 61,8 M (protocolo convencional en la tecnica) y FVIII nativo: VIEHLUFB08018PHR, ORHLUFB07016PHR, ORHLUFB07017PHR, ORHLUFB08001PHR, ORHLUFB08002PHR.

Para el candidato resintetizado, se determino un grado de 8 PEG/rFVIII. Se caracterizaron adicionalmente los FVIII con bajo contenido en PEG in vitro e in vivo tal como se describe en los ejemplos a continuacion.

Ejemplo de referencia 2

Analisis de moleculas de factores sangumeos poco pegiladas in vitro

En un aspecto, se analizaron las muestras con bajo contenido en PEG para determinar el peso molecular y la estructura general de la molecula de PEGFVIII, asf como para determinar la actividad espedfica de la molecula de FVIII conjugada con PEG. Se llevo a cabo el analisis de SDS-PAGE de la estructura de PEG-FVIII como en el documento WO 2007/126808. En resumen, se caracterizo rFVIII nativo mediante SDS PAGE en condiciones reductoras usando un gel de gradiente de poliacrilamida al 4-12% obtenido de Invitrogen (Carlsbad, California, EE.UU.) segun las instrucciones del fabricante. Como marcadores de peso molecular (PM) se usaron marcadores Precision Plus (10 kD - 250 kD) obtenidos de Bio-Rad (Hercules, Ca, EE.UU.). Entonces se transfirieron las protemas sobre una membrana de PVDF obtenida de Bio-Rad (Hercules, CA, EE.UU.) mediante electrotransferencia y se incubaron posteriormente con un anticuerpo de oveja policlonal anti-FVIII:C humano obtenido de Cedarlane (Hornby, Ontario, Canada). Las ultimas etapas del procedimiento de inmunotincion fueron la incubacion con una fosfatasa alcalina (ALP) conjugada con anticuerpo anti-oveja obtenido de Accurate (Westbury, NY, EE.UU.) seguido por la visualizacion final mediante el uso de un kit de sustrato de ALP (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).

Adicionalmente, se sometio a ensayo la actividad espedfica de la molecula de FVIII tal como se describe en el documento WO 2007/126808, usando el ensayo cromogenico de FVIII (Rosen S, Scand J Haematol 33:(supl. 40):139-45, 1984). El metodo se basa en la Ph. Eur. 5a edicion (5.05) 2.7.4 Assay of Blood Coagulation Factor vIiI. Se mezcla una muestra, que contiene factor VIII, con trombina, factor IX activado (FIXa), fosfolfpidos y factor X (FX) en un tampon que contiene calcio. El FVIII se activa por trombina y posteriormente forma un complejo con fosfolfpidos, FIXa e iones de calcio. Este complejo activa el factor X a factor Xa, que a su vez escinde el sustrato cromogenico FXa-1 (AcOH*CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA). El transcurso temporal de la para-nitroanilina (pNA) liberada se mide con un lector de microplacas a 405 nm. La pendiente de la reaccion es proporcional a la concentracion de factor VIII en la muestra. El valor de antfgeno FVIII se midio mediante el uso de un sistema de ELISA comercialmente disponible (Cedarlane, Hornby, Ontario, Canada) con modificaciones menores. A partir de estos valores, se calcularon las razones de cromogeno de FVIII/antigeno FVIII. Se determino el contenido en protema en las preparaciones midiendo la densidad optica a 280 nm. A partir de estos datos, se calculo el contenido en protema.

En la figura 1 se muestran los resultados de SDS-PAGE. La evaluacion por SDS-PAGE del contenido en FVIII usando anticuerpos espedficos para FVIII demuestra que FVIII combinado con un exceso molar inferior de moleculas de PEG (exceso de 15, 20, 25 y 30 M) produjo moleculas de peso molecular inferior en comparacion con el FVIII nativo, pero las moleculas de FVIII detectadas son similares a las que aparecen cuando se usa un exceso superior de moleculas de PEG (exceso de 61,8 M). El estudio con sonda de la SDS-PAGE con un anticuerpo espedfico para PEG detecto especies de peso molecular superior del PEG-FVIII en todas las muestras de PEG sometidas a prueba.

En la tabla 1 se muestra el analisis de la actividad espedfica de FVIII poco pegilado (y datos de productos relevantes). Estos resultados muestran que la actividad espedfica del FVIII poco pegilado es mas similar a FVIII nativo que PEG-FVIII preparado usando el exceso molar alto. Por ejemplo, la muestra de PEG-FVIII preparada usando solo un exceso de 15 M de PEG demostro una actividad espedfica de 2221 Ul/mg en comparacion con la actividad espedfica de FVIII nativa de 3706 Ul/mg. En cambio, muestras preparadas usando el protocolo de pegilacion comun, que teman un exceso de 61,8 M de PEG, mostraron una actividad espedfica desde tanto como 398 Ul/mg hasta tan solo 104 Ul/mg. Por tanto, PEG-FVIII preparado usando un exceso de 15 M de PEG presento aproximadamente 5,5 veces mas actividad que la actividad mas alta de un PEG-FVIII preparado usando protocolos convencionales (exceso de 61,8 M). De manera similar, FVIII preparado con un exceso de 20 M de PEG mostro una actividad al menos 3,8 veces mayor que FVIII preparado usando protocolos convencionales, un exceso de 25 M de moleculas de PEG-FVIII presento una actividad al menos 3,2 veces mayor que los protocolos de preparacion convencionales y un exceso de 30 M de PEG-FVIII (969 Ul/ml) mostro al menos 2,4 veces mas que los protocolos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

de preparacion convencionales (exceso de 61,8 M de PEG).

Estos resultados ilustran que las protemas FVIII pegiladas usando una razon de exceso molar bajo de PEG con respecto a FVIII dan como resultado FVIII con bajo contenido en PEG que tiene una actividad biologica cercana a la de la protema FVIII nativa en comparacion con PEG-FVIII preparado usando un exceso molar alto de PEG, que muestra una actividad espedfica aproximadamente 9 veces menor que FVIII nativo. El aumento de la actividad espedfica y el numero reducido inferior de PEG proporciona una molecula terapeutica mas eficaz que tiene una posibilidad reducida de efectos secundarios toxicos.

Ejemplo de referencia 3

Farmacocinetica de moleculas poco pegiladas in vivo

Con el fin de determinar la farmacocinetica del rFVIII poco pegilado in vivo, se uso un modelo de raton con desactivacion deficiente en FVIII. Se usaron ratones deficientes en FVIII tal como se describen en Bi et al. (Nat Genet 1995; 10:119-21) como modelo de hemofilia A humana grave.

Los ratones (n=6) recibieron una inyeccion en bolo por medio de la vena de la cola de o bien FVIII con bajo contenido en PEG preparado segun el ejemplo 1 o bien rFVIII nativo en una dosis de 20-30 |ig/kg de peso corporal. Las muestras de PEG-rFVIII usadas fueron las siguientes: rFVIIIPEGH07001FC (grado de 8,5 PEG - mol/mol, PEG unido) a 297 |ig/kg; VIEHLUFB07029PHR (grado de 7,9 PEG - mol/mol, PEG unido) a 144 |ig/kg; VIEHLUFB08007PHR (grado de 4,4 PEG - mol/mol, PEG unido) a 66 |ig/kg. Se preparo plasma con citrato mediante puncion cardiaca tras la anestesia a partir de los grupos respectivos, a los 5 minutos, 3, 6, 9, 16, 24 y 32 horas, y en algunos casos a las 48, 56 y 72 horas tras la inyeccion. Se midieron los niveles de actividad de FVIII en muestras de plasma. Se realizo el calculo de la semivida con MicroMath Scientist, modelo 1 a partir de la biblioteca farmacocinetica (MicroMath, Saint Louis, MO, EE.UU.).

Los resultados de este experimento se resumen en las figuras 2 y 3 y la tabla 2. Los resultados muestran que la semivida terminal es similar para PEG-rFVIII con grados de pegilacion de entre 4,4 y 8,5 (figura 3 y tabla 2). La tabla 2 ilustra que la semivida (HL) y el tiempo de residencia medio (MRT) del rFVIII poco pegilado aumentan en comparacion con el FVIII nativo. Adicionalmente, el area bajo la curva (AUC) aumenta en el FVIII poco pegilado en comparacion con FVIII nativo, indicando la farmacocinetica mejorada de la variante de FVIII poco pegilada en comparacion con rFVIII nativo. Ademas, la carga de protema para lograr la dosis de actividad de FVIII deseada es menor con variantes de PEG-rFVIII con menor grado de pegilacion.

Un grafico de los datos de AUC, semivida y MRT frente al grado de pegilacion (figura 4) muestra que hay una correlacion lineal de AUC y MRT con el grado de pegilacion de hasta aproximadamente 8 PEG/FVIII, y no hay ningun aumento adicional con mayores grados de pegilacion. La semivida terminal aumenta ligeramente cuando el numero de moleculas de PEG por FVIII es mayor de 5 PEG/FVIII.

En resumen, los datos sugieren que las variantes de rFVIII poco pegiladas preparadas usando un exceso de 15 M, 20 M, 25 M y 30 M de PEG, tienen propiedades in vivo e in vitro mejoradas en comparacion con PEG-rFVIII preparado segun el proceso convencional (exceso de 61,8 M de PEG). La actividad de la forma poco pegilada de FVIII es mas similar a la de la molecula nativa que preparaciones previas de FVIII con alto contenido en PEG, lo que sugiere que pueden usarse factores sangumeos con bajo contenido en PEG a una dosis inferior durante la terapia, reduciendo de ese modo la posibilidad de desarrollar anticuerpos neutralizantes contra el factor sangumeo y reduciendo la toxicidad de la composicion.

Ejemplo de referencia 4

Preparacion de rFIX poco pegilado

Se contempla que otras protemas de factores sangumeos se conjuguen a polfmeros solubles en agua tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se pegila FIX recombinante (rFIX) mediante el uso de un reactivo de pegilacion de 20 kD lineal que contiene un grupo NHS. Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie SuNbRIGHT® ME de NOF (NOF Corp., Tokio, Japon). rFIX se pegila a pH 7,4 en tampon Hepes (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM) a una concentracion de protema de 2 mg/ml y una concentracion de reactivo de 5 mg/ml. La reaccion de pegilacion se lleva a cabo a TA durante 2 horas con agitacion suave. Entonces se detiene la reaccion mediante la adicion de glicina (concentracion final: 10 mM) e incubacion durante 1 hora a temperatura ambiente. Entonces se aplica la mezcla a una columna de Q - Sepharose HP (GE-Healthcare, Uppsala, Suecia) para la purificacion y separacion de rFIX monopegilado, que contiene solo un residuo de PEG, a partir de rFIX nativo y trazas de rFIX di y tripegilado. Finalmente, se recogen las fracciones que contienen rFIX monopegilado y se someten a ultrafiltracion/diafiltracion (UF/DF) usando una membrana de 30 kD hecha de celulosa regenerada (Millipore).

Ejemplo de referencia 5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Preparacion de rFVIIa poco pegilado

Se pegila FVIIa recombinante (rFVIIa) mediante el uso de un reactivo de pegilacion de 20 kD lineal que contiene un grupo NHS. Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie SUNBRIGHT® GS de NOF (NOF Corp., Tokio, Japon). rFVIIa se pegila a pH 7,4 en tampon Hepes (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM) a una concentracion de protema de 2 mg/ml y una concentracion de reactivo de 5 mg/ml. La reaccion de pegilacion se lleva a cabo a TA durante 2 horas con agitacion suave. Se detiene la reaccion mediante la adicion de glicina (concentracion final: 10 mM) e incubacion durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente se purifica el conjugado de PEG-rFVIIa mediante cromatograffa de intercambio ionico sobre Q-Sepharose FF (GE Healthcare). Se carga la disolucion sobre la columna, que se equilibra previamente con tampon Hepes 20 mM que contiene CaCl2 1 mM, pH 7,4 (capacidad de carga: 1,5 mg de protema/ml de gel). Se eluye el conjugado con tampon Hepes 20 mM que contiene CaCl2 1 mM y cloruro de sodio 500 mM. El eluato contiene predominantemente rFVIIa monopegilado. Finalmente se concentra el eluato mediante UF/DF usando una membrana de 30 kD hecha de polietersulfona (Millipore).

Ejemplo 6

Preparacion de rFVIII poco polisialilado

Ademas de la pegilacion, las protemas de factores sangumeos se conjugan con otros polfmeros solubles en agua.

Se polisialilo rFVIII mediante aminacion reductora usando poli(acido sialico) (PSA) oxidado con una distribucion de tamano estrecha (PD < 1,1) y un PM de 20 kD, que se obtuvo del Serum Institute de la India (Pune, India).

La conjugacion de PSA con rFVIII se llevo a cabo a + 4 °C en una sala fna. Se realizo la conjugacion con una concentracion de rFVIII de 2 mg/ml, y con un exceso molar de 200 veces de PSA oxidado. Se disolvio el PSA en tampon Hepes (tampon Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 350 mM, pH 7,4) para dar una concentracion final de 200 mg de PSA/ml. Se anadio la disolucion de PSA a la disolucion de rFVIII y se anadio la cantidad requerida de NaCNBH3 en una disolucion de 80 mg/ml en tampon Hepes, pH 7,4 para dar una concentracion final de 50 mM. Se mezclo suavemente la mezcla de reaccion y se ajusto el pH a 7,4 mediante adicion gota a gota de NaOH 0,5 M hasta pH 7,4. Se agito suavemente la mezcla de reaccion en la oscuridad durante 16 horas a +4 °C en una sala fna. Entonces se purifico el conjugado mediante cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) sobre fenil - Sepharose FF (GE Healthcare). Tras la reaccion qmmica, se diluyo la mezcla de reaccion con NH4Ac 8 M en tampon Hepes (Hepes 50 mM, NaCl 350 mM, CaCl2 5 mM, pH 6,9) para dar una concentracion final de 2,5 M y se corrigio el pH mediante la adicion de NaOH 0,5 M hasta pH 6,9. Entonces se cargo la muestra sobre la columna de HIC. Se lavo la columna con aproximadamente 2,5 volumenes de columna (CV) de tampon de lavado (NH4Ac 2,5 M en Hepes 50 mM, NaCl 350 mM, CaCl2 5 mM, pH 6,9) seguido por lavado con aproximadamente 10 CV de tampon de lavado (NaCl 3 M en Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM; pH 6,9). Se eluyo la columna con 6 CV de tampon de elucion (Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 7,4). Se sometio la fraccion que contema conjugado a UF/DF usando una membrana de 30 kD (celulosa regenerada/Millipore).

Ejemplo 7

Caracterizacion in vitro e in vivo de rFVIII poco polisialilado

Se sometio a ensayo el conjugado de PSA-rFVIII que tema un bajo grado de polisialilacion preparado mediante aminacion reductora segun el ejemplo 6 para determinar la actividad proteica in vitro e in vivo.

Se caracterizo analfticamente la preparacion de PSA-rFVIII midiendo el contenido en protema (ensayo de BCA) y la actividad cromogenica de FVIII. Se calculo una actividad espedfica de 2469 UI/mg para esta preparacion. Esto es un 44 % en comparacion con el material de partida de rFVIII. Se determino el grado de polisialilacion mediante el ensayo de resorcinol (Svennerholm L, Biochim Biophys Acta 24:604-11; 1957). Se midio un grado de polisialilacion de 2,1 moleculas de PSA/monomero de FVIII.

Tambien se uso el PSA-rFVIII para estudios de farmacocinetica (PK) en ratones hemofflicos. Grupos de 6 ratones hemofflicos recibieron una inyeccion en bolo por medio de la vena de la cola en una dosis de 200 UI de FVIII/kg de peso corporal. Se preparo plasma con citrato mediante puncion cardiaca tras la anestesia a partir de los grupos respectivos, a los 5 minutos, 3, 6, 9, 16, 24, 32 horas y en algunos casos a las 42 horas tras la inyeccion. Se midieron los niveles de actividad de FVIII en muestras de plasma. Se realizo el calculo de la semivida y el area bajo la curva (AUC) con MS Excel. Los resultados de este experimento se ilustran en la figura 4. Para esta curva de eliminacion, se midio una AUC ajustada a la dosis de 0,054 (UI x h/ml)/(UI/kg) para FVIII y de 0,076 (UI x h/ml)/(UI/kg) para el conjugado de PSA-rFVIII. Los resultados muestran que el PSA-rFVIII circula mas tiempo que rFVIII nativo y la AUC correspondiente de PSA-rFVIII aumenta en un factor de 1,4.

Ejemplo de referencia 8

Preparacion de rFIX poco polisialilado

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

FIX recombinante (rFIX) se polisialila mediante aminacion reductora usando poli(acido sialico) (PSA) oxidado con una distribucion de tamano estrecha (PD < 1,1) y un PM de 20 kD, que puede obtenerse del Serum Institute de la India (Pune, India).

La conjugacion de PSA con rFIX se lleva a cabo a + 4 °C en una sala fna. Se realiza la conjugacion usando una concentracion de rFIX de 2 mg/ml, y con un exceso molar de 160 veces de PSA oxidado. Se disuelve el PSA en tampon Hepes (tampon Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 350 mM, pH 7,4) para dar una concentracion final de 200 mg de PSA/ml. Se anade la disolucion de PSA a la disolucion de rFIX y se anade la cantidad requerida de NaCNBH3 en una disolucion de 80 mg/ml en tampon Hepes, pH 7,4 para dar una concentracion final de 50 mM y el pH de la disolucion obtenida se ajusta mediante adicion gota a gota de NaOH 0,5 M hasta pH 7,4. Se agita suavemente la mezcla de reaccion en la oscuridad durante 16 horas a +4 °C en una sala fna. Posteriormente, se purifica el conjugado mediante cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) sobre butil Sepharose FF (GE Healthcare). Tras la reaccion qmmica, se diluye la mezcla de reaccion con NaCl 5 M en tampon Hepes (Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 6,9) para dar una concentracion final de 3 M y se ajusta el pH hasta pH 6,9 usando NaOH 0,5 M. Se carga la muestra sobre la columna de HIC y se lava con 10 volumenes de columna (CV) de tampon de equilibrio (NaCl 3,0 M en Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 6,9). Posteriormente, se eluye el conjugado de PSA-rFIX con 6 CV de tampon de elucion (Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 7,4). Se somete la fraccion que contiene conjugado a UF/DF usando una membrana de 30 kD (celulosa regenerada/Millipore). Se espera que la preparacion contenga predominantemente rFIX con uno y dos grupos PSA.

Ejemplo de referencia 9

Preparacion de rFVIIa poco polisialilado

Se polisialila rFVIIa mediante aminacion reductora usando poli(acido sialico) (PSA) oxidado con una distribucion de tamano estrecha (PD < 1,1) y un PM de 20 kD, que puede obtenerse del Serum Institute de la India (Pune, India).

La conjugacion de PSA con rFVIIa se lleva a cabo a + 4 °C en una sala fna. Se realiza la conjugacion usando una concentracion de rFVIIa de 2 mg/ml, y con un exceso molar de 125 veces de PSA oxidado. Se disuelve el PSA en tampon Hepes (tampon Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 350 mM, pH 7,4) y se ajusta el pH a 7,4 mediante adicion gota a gota de NaOH 2 M para dar una concentracion final de 150 mg/ml. Se anade la disolucion de PSA a la disolucion de rFVIIa y se anade la cantidad requerida de NaCNBH3 en una disolucion de 80 mg/ml en tampon Hepes, pH 7,4 para dar una concentracion final de 50 mM. Se mezcla suavemente la mezcla de reaccion y se ajusta el pH a 7,4 de nuevo. Se agita suavemente la mezcla de reaccion en la oscuridad durante 16 horas. Posteriormente, se purifica el conjugado mediante cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) sobre butil Sepharose FF (GE Healthcare). Tras la reaccion qmmica, se diluye la mezcla de reaccion con NaCl 5 M en tampon Hepes (Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 6,9) para dar una concentracion final de 3 M. Se carga entonces la muestra sobre la columna de HIC y se lava con 10 volumenes de columna (CV) de tampon de equilibrio (NaCl 3,0 M en Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 6,9). Posteriormente, se eluye el conjugado de PSA-rFVIIa con 10 CV de tampon de elucion (Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 7,4). Se combinan las fracciones que contienen conjugado y se someten a UF/DF usando una membrana de 30 kD (celulosa regenerada/Millipore). Finalmente, se concentra el eluato mediante UF/DF usando una membrana hecha de polietersulfona (Millipore). Se espera que la preparacion contenga predominantemente rFVIIa con uno y dos grupos PSA.

Ejemplo 10

Tratamiento de trastornos de la coagulacion sangmnea usando factores sangmneos modificados con un baio grado polimero soluble en agua

Se tratan sujetos que tienen una deficiencia en un factor de coagulacion sanguinea con composiciones de factor sangmneo modificado tal como se describe en el presente documento. La administracion de factor(es) sangmneo(s) modificado(s) que tiene(n) un bajo grado de polfmero soluble en agua en modelos animales de trastornos de la coagulacion sanguinea y usando protocolos conocidos en la tecnica para tratar a humanos que padecen trastornos sanguineos proporciona la base para administrar a los sujetos el/los factor(es) sangmneo(s) modificado(s) descrito(s) en el presente documento solo(s) o en combinacion con otros agentes terapeuticos, por ejemplo agentes quimioterapicos o radioterapicos, citocinas, factores de crecimiento, y otros agentes terapeuticos comunmente usados.

Por ejemplo, se tratan pacientes con hemofilia A que tienen una deficiencia en FVIII con FVIII poco pegilado a dosis terapeuticamente eficaces, tal como determina facilmente el medico encargado. Vease por ejemplo, Di Paola et al., Haemophilia. 13:124-30, 2007, que describen la administracion y comparacion de dos preparaciones diferentes de FVIII de sustitucion a pacientes con hemofilia grave.

Tambien se tratan pacientes con hemofilia que pueden tener o no una deficiencia de protema FVIII (por ejemplo, pacientes con hemofilia B o C) con otros factores sanguineos modificados tales como VWF, FVII, FIX, FXI

5

10

15

20

25

30

35

40

modificado o los apropiados para el estado patologico. Vease, por ejemplo, Konkle et al., J Thromb Haemost. 5:1904-13, 2007, que describen el tratamiento de pacientes con hemofilia que desarrollaron inhibidores contra FVIII y FIX con FVIIa purificado.

Se ha usado VWF purificado para tratar a pacientes que padecen enfermedad de Willebrand (Majumdar et al., Blood Coagul Fibrinolysis. 4:1035-7, 1993). Se usa VWF modificado que tiene un bajo grado de polfmero soluble en agua tal como se describe en el presente documento en regfmenes conocidos por los expertos en la tecnica para tratar a pacientes que se beneficianan de VWF de sustitucion.

Adicionalmente, otros trastornos de la coagulacion sangumea conocidos en la tecnica, por ejemplo, deficiencia de factor X, deficiencia de factor VII, enfermedad de Alexander y deficiencia de factor XIII pueden tratarse con dosis terapeuticamente eficaces del/de los factor(es) sangumeo(s) modificado(s) apropiado(s).

La administracion de los factores sangumeos modificados puede durar 1-24 horas, o mas tiempo, y puede optimizarse usando experimentacion de rutina. El factor sangumeo modificado puede administrarse tambien durante una duracion que no requiere tratamiento prolongado. Adicionalmente, la composicion de factor sangumeo modificado puede administrarse diariamente, semanalmente, bisemanalmente o a otras frecuencias eficaces, tal como podna determinar un experto habitual en la tecnica.

Se contempla que se administre un factor sangumeo modificado a pacientes en combinacion con otros agentes terapeuticos, tales como con otros agentes quimioterapicos o radioterapicos, o con factores de crecimiento o citocinas. Cuando se administra en combinacion con otro agente, la cantidad de factor sangumeo modificado puede reducirse como corresponda. Se administran segundos agentes en una cantidad determinada para que sean seguros y eficaces en la mejora de la enfermedad humana.

Se contempla que se administren citocinas o factores de crecimiento, y agentes quimioterapicos o agentes radioterapicos en la misma formulacion que el factor sangumeo modificado y se administren simultaneamente. Alternativamente, los agentes pueden administrarse tambien en una formulacion independiente y todavfa se administran simultaneamente con el factor sangumeo modificado. Tal como se usa en el presente documento, simultaneamente se refiere a agentes administrados en el plazo de 30 minutos uno de otro. El segundo agente puede administrarse tambien antes de la administracion del factor sangumeo modificado. Administracion previa se refiere a la administracion del agente en el plazo del intervalo de una semana antes del tratamiento con factor sangumeo modificado hasta 30 minutos antes de la administracion de factor sangumeo modificado. Se contempla ademas que el segundo agente se administre posteriormente a la administracion del factor sangumeo modificado. La administracion posterior pretende describir la administracion desde 30 minutos despues del tratamiento con factor sangumeo modificado hasta una semana despues de la administracion del factor sangumeo modificado. Tambien pueden administrarse composiciones de factor sangumeo modificado conjuntamente con un regimen de radioterapia en un sujeto que tiene un trastorno de la coagulacion sangumea y una forma de cancer, llevandose a cabo el tratamiento tal como prescribe el medico encargado.

Se espera que se les ocurran numerosas modificaciones y variaciones en la invencion tal como se expone en los ejemplos ilustrativos a los expertos en la tecnica. En consecuencia, la invencion solo debe estar limitada por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Molecula de factor VIII (FVIII) modificada qmmicamente que comprende una molecula de FVIII recombinante y 1 o 2 restos de poli(acido sialico) (PSA) por molecula de FVIII, en la que los restos de PSA

   5

   se unen a la molecula de FVIII a traves de aminacion reductora.

2. 2.

   Molecula de FVIII modificada qmmicamente segun la reivindicacion 1, en la que los restos de PSA se unen por medio de un ligador liberable o hidrolizable, o por medio de un ligador estable.

   10 3.

   Molecula de FVIII modificada qmmicamente segun la reivindicacion 1, en la que el peso molecular del PSA esta en el intervalo de desde 2 hasta 80 kDa, preferiblemente en el intervalo de desde 5 hasta 60 kDa, mas preferiblemente en el intervalo de desde 10 hasta 40 kDa o lo mas preferiblemente en el intervalo de desde 15 hasta 25 kDa.

   15 4.

   Composicion farmaceutica que comprende la molecula de FVIII modificada segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

3. 5.

   Molecula de FVIII modificada qmmicamente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece un trastorno de la coagulacion sangmnea.

4. 20 6.

   Molecula de FVIII modificada qmmicamente para el uso segun la reivindicacion 5, en la que el trastorno de la coagulacion sangmnea se selecciona del grupo que consiste en hemofilia A y smdrome de von Willebrand.

   LO CM

   Molecula de FVIII modificada qmmicamente para el uso segun la reivindicacion 5, en la que el trastorno de la coagulacion sangmnea es hemofilia A.