JP2012506382A - 遊離可能peg試薬を有するプロドラッグpegタンパク質結合体において活性成分(インビトロ脱ペグ化)を決定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2008年10月21日に出願された米国仮特許出願番号61/107,257、および2009年9月15日に出願された米国仮特許出願番号61/242,634の利益を主張し、上記米国仮特許出願の各々は、その全容が参照によって本明細書に援用される。
本発明は一般的に、可逆的に結合した水溶性ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)およびポリシアル酸(PSA))で修飾されたタンパク質からの、水溶性ポリマーの遊離を強制するインビトロアッセイシステムの開発に関連する。本発明は、水溶性ポリマーの遊離を分析する方法、および回復したタンパク質活性を測定する方法を含む。本発明はさらに、PEGおよびPSAのようなポリマーを含む、遊離可能水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質の品質管理に適当な方法を含む。
血液凝固第VIII因子(FVIII)の欠損または機能不全は、出血性障害血友病Aに関連する。血友病Aの管理のための処置の選択は、血漿由来または組換えFVIII(rFVIII)濃縮物による置換療法である。重症の血友病A、すなわちFVIIIレベルが1%より少ない患者は、FVIIIレベルを1%より上の中間的な量に維持する目的の予防的治療によって最もよく処置されることが、一般的に受け入れられている。循環中における様々なFVIII製品の平均半減期を考慮して、この循環濃度を、通常、FVIIIを1週間に2から3回投与することによって達成し得る。現在の予防治療の利便性を増すために、全ての他の製品の特徴を維持しながら、増強された薬力学的および薬物動態学的性質を有する次世代の製品の開発は、週1回ベースの投与を可能にすることが予想される。
本発明は、可逆的に結合した水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質からの、ポリエチレングリコール(PEG)およびポリシアル酸(PSA)のような水溶性ポリマーの遊離を強制する、インビトロアッセイシステムの開発に関連する分野における1つまたはそれ以上のニーズに取り組む。本発明は、水溶性ポリマーの遊離を分析する方法、および回復したタンパク質活性を測定する方法を含む。本発明はさらに、遊離可能水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質の品質管理に適当な方法を含む。
本発明は、可逆的な結合でタンパク質に共有結合した水溶性ポリマーの遊離に関連する、タンパク質の活性の回復率を調査するための、インビトロアッセイシステムの開発に関連する。タンパク質の「活性の回復」という用語は、水溶性ポリマーが遊離した後の、生物学的機能、受容体結合、および酵素活性のような活性を含むがこれに限らないタンパク質活性の増加を指す。タンパク質のこの型の水溶性ポリマー修飾は、遊離可能水溶性ポリマー、すなわちPEG−FMOC−NHS試薬の、関心のあるタンパク質の露出したリシン残基への結合によって達成される。「FMOC」という用語は、9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニルを表し、それはペプチドまたはポリペプチド鎖の保護基を説明する。
本発明のさらなる局面および詳細が、以下の実施例から明らかであり、それは制限ではなく説明であることを意図する。実施例1は、上昇したpHにおける遊離可能PEG−rVWFのインビトロ脱ペグ化を説明する;実施例2は、1級アミンの存在下および高いpHにおける遊離可能PEG−rVWFのインビトロ脱ペグ化を説明する;実施例3は、選択された遊離アミンの存在下における、遊離可能PEG−RFVIIIのタンパク質活性のインビトロにおける回復を説明する;実施例4は、遊離アミンの組み合わせの存在下における、遊離可能PEG−rFVIIIのインビトロ脱ペグ化を説明する;実施例5は、Hepes/Trisの存在下における、遊離可能PEG−rFVIIIのインビトロ脱ペグ化を説明する;実施例6は、選択された遊離アミンの存在下における、遊離可能PEG−rFVIIIのタンパク質活性のインビトロにおける回復を説明する;実施例7は、種の分離を伴わない、蛍光測定によるPEG−rFVIIIからのPEG遊離の検出を説明する;実施例8は、グルタチオンによるPEG−ジベンゾフルベンの除去を説明する;実施例9は、PEG−ジベンゾフルベン産生に対するpHの影響を示す;実施例10は、上昇したpHにおける遊離可能PSA−rVWFのインビトロ解重合を議論する;実施例11は、1級アミンの存在下および高いpHにおける遊離可能PSA−rVWFのインビトロ解重合を説明する;実施例12は、選択された遊離アミンの存在下における、遊離可能PSA−RFVIIIのタンパク質活性のインビトロにおける回復を説明する;実施例13は、遊離アミンの組み合わせの存在下における、遊離可能PSA−rFVIIIのインビトロ解重合を説明する;および実施例14は、Hepes/Trisの存在下における、遊離可能PSA−rFVIIIのインビトロ解重合を説明する。
(上昇したpHにおける遊離可能PEG−rVWFのインビトロ脱ペグ化)
遊離可能rVWF結合体(20Kの分岐PEGと結合)の脱ペグ化を、タンパク質を2つの異なるpH値、pH6.5およびpH8.1でインキュベートすることによって行った。精製PEG−rVWFを、6.5のpH値を有する0.02Mのクエン酸ナトリウム、0.15MのNaClに溶解した。アルカリ性サンプルのために、同じ緩衝液を、0.1MのNaOHを加えることによってpH8.1に調整した。規定された時点でサブサンプルを取り、そしてそのVWF抗原(VWF:Ag)の含有量、遊離PEG、全PEG、およびマルチマーのVWF組成に関して分析した。
(1級アミンの存在下および高いpHにおける遊離可能PEG−rVWFのインビトロ脱ペグ化)
遊離可能PEG−rVWF(20kの分岐PEG)結合体を、100mMのリシンを含む、pH9.8の0.02Mのクエン酸ナトリウム、0.15MのNaCl緩衝液で希釈し、そして37℃でインキュベートした。規定された時点でサブサンプルを取り、そしてそのVWF抗原の含有量(VWF:Ag)、遊離PEG、全PEG、およびマルチマー組成に関して分析した。高密度水平SDSアガロースゲル電気泳動、およびヒトVWF(Dako、Glostrup、Denmark)またはPEG(研究室内で開発したポリクローナルウサギ抗PEG抗体)のいずれかに対する抗体を用いた免疫染色によって、マルチマー分析を行った。その結果を表2、図2、および図3にまとめる。
(選択された遊離アミンの存在下における、遊離可能PEG−rFVIIIのタンパク質活性のインビトロにおける回復)
遊離可能PEG−rFVIII結合体(20K分岐PEG)を、7.3のpHを有する緩衝液(10mMのヒスチジン、90mMのNaCl、1.7mMのCaCl2、10mMのTris、0.26mMのグルタチオン、176mMのマンニトール、23.5mMのトレハロース、および0.1g/lのTween80)中で、5IU/mlのFVIII色素形成活性まで希釈した;その緩衝液はさらに、リシン、ヒスチジン、または両方のアミノ酸の組み合わせを含んでおり、そしてその緩衝液を37℃でインキュベートして、タンパク質結合体からのPEGのインビトロ遊離を強制した。規定された時点(24時間、48時間、および72時間)においてサブサンプルを取り、そしてFVIII色素形成アッセイを使用することによって、FVIII色素形成活性をオンライン(online)で決定した。その結果を図5にまとめる。
(遊離アミンの組み合わせの存在下における、遊離可能PEG−rFVIIIのインビトロ脱ペグ化)
遊離可能PEG−rFVIII結合体(20K分岐PEG)を、7.3のpHを有する緩衝液(20mMのクエン酸Na3、1.7mMのCaCl2、176mMのマンニトール、36mMのショ糖、および0.1g/lのTween80)中でインキュベートした;その緩衝液はさらに、100mMのヒスチジンおよび100mMのリシンを含み、そして+37℃でインキュベートした。168時間までの規定された時点でサブサンプルを取り、そしてPEG−rFVIIIの機能的活性を、FVIII色素形成アッセイの使用によってオンラインで決定した。それに加えて、PEGの遊離を、凍結サブサンプルから、Nektar Therapeutics(Huntsville、AL)によって提供されるHPLC法によって、遊離PEGおよび全PEGを測定することによって確認した。その結果を、図6および表3にまとめる。
(HEPES/TRISの存在下における、遊離可能PEG−rFVIIIのインビトロ脱ペグ化)
遊離可能PEG−rFVIII(20K分岐PEG)を、pH7.4において典型的なアミンを含む緩衝物質の組み合わせ、すなわち200mMのHEPESおよび200mMのTris中において、37℃でインキュベートした。規定された時点においてサブサンプルを取り、FVIII活性の回復を色素形成アッセイによってモニターし、そしてそのVWFと相互作用する能力を決定した。循環中におけるFVIIIの生存を決定的に決定するVWF結合を、表面プラズモン共鳴技術を用いることによってモニターした。Biacore装置を用いて、様々なPEG−rFVIIIサンプルを移動相に注入し、そして固定化VWFとの相互作用に関して試験した。PEG−rFVIIIはほんの低レベルでしかrVWFに結合しなかったが、サンプルの結合はPEG遊離と共に増加した。図7は、rFVIIIのVWFへの結合の増加を伴う、経時的な色素形成性FVIII活性の増加を示し、これは、脱ペグ化のシグナルである。実施例5のデータは、広いスペクトルのアミンを、そのような結合体からPEGの遊離を強制するために使用し得ることを示す。色素形成活性およびVWFへの結合の両方の回復はさらに、機能的タンパク質が時間につれて産生されることを示す。
(遊離アミンの存在下におけるPEG−rFVIIIのインキュベーションに際した、FVIII活性増加の初速度)
実施例4において、37℃におけるインキュベーションの0から6時間の時間間隔として定義された、PEG−rFVIIIからのPEG遊離の最初の急速期を、バッチごとの一貫性を調査するためのパラメーターとしての適合性に関して分析した。図8は、最初の6時間の、37℃におけるpH7.3の100mMのヒスチジン/100mMのリシン緩衝液中でのインキュベーションに際したFVIII活性の増加を示す。
(種の分離を伴わない蛍光測定による、PEG−rFVIIIからのPEG遊離の検出)
6.0IU/mlの開始活性rFVIII(20k分岐PEG)と比較して、FVIII色素形成活性が21.9IU/mlに増加し、1リットルあたり32mgのマンニトール、12gのショ糖、2.5gのCaCl2・2H2O、および100mgポリソルベート80を含む20mMのクエン酸緩衝液、pH=6.0に処方され、そして凍結乾燥された遊離可能PEGを、360mgのタンパク質(ビチンコン酸(bichinchonic acid)アッセイ)および345mgの全PEGを含む溶液へ再構成した。この溶液を、1リットルあたり32gのマンニトール、12gのショ糖、2.5gのCaCl2・2H2O、10mMのEDTA、および100mgのポリソルベート80を含む(99%オレイン酸、Nippon Oils and Fats)、100mMの炭酸水素ナトリウム溶液、pH8.5中に1:5に希釈し、そして20−25℃におけるインキュベーションに際し、規定された時間間隔で、350−355nmの間の狭いピークでPEG−FMOC化合物、および460−560nmの間の広いピークで遊離PEG−ジベンゾフルベン(PEG−DBF)を示す蛍光スペクトルを、Perkin Elmer LS50B分光蛍光計(0.4(励起)×1(発光)cmのPTFE−ストッパー付き石英キュベット中1.25mL、330nm励起/340−600nm発光波長、5/5nmスリット幅、180nm/分スキャニングスピード、800V光電子増倍電圧(photomultiplier voltage))で測定した(図9)。
(グルタチオンによるPEG−ジベンゾフルベンの除去)
実施例7の炭酸水素溶液に、10mMの還元グルタチオン(GSH)を加え、そして希釈、インキュベーション、測定、サンプリング、および分析を、実施例8で述べたように行った。スペクトルを図10に示す。約24時間後、蛍光キュベットの中ではなく、サンプリングリザーバー中のグルタチオンが、酸化によって消耗したようであった(表6)。
(PEG−ジベンゾフルベンの産生に対するpHの効果の実証)
実施例8のFVIII溶液を、1リットルあたり32gのマンニトール、12gのショ糖、2.5gのCaCl2・2H2O、および100mgのポリソルベート80(99%オレイン酸)を含む、20mMのクエン酸緩衝液、pH6.0で1:5に希釈した。インキュベーション、測定、サンプリング、および分析を、実施例7で述べたように行った。スペクトルを図11に示す。pH6.0において、PEG−ジベンゾフルベンの遊離は、pH=8.5のときよりも低かった(表7を表5と比較する)。そのデータは、β脱離のメカニズムが、水酸化物陰イオンのような、塩基性求核剤の攻撃によって行われることを示唆する。
(上昇したpHにおける遊離可能PSA−rVWFのインビトロ解重合)
ポリシアル酸(PSA)−rVWF結合体のような、遊離可能水溶性ポリマー結合体の解重合を、そのタンパク質結合体のpHを上昇させることによって行う。異なるpH値において、例えば約6のpH、および約8または約10のpHにおいて、タンパク質結合体をインキュベートすることによって、解重合を測定する。精製PSA−rVWFを、約6のpH値を有する、0.02Mのクエン酸Na、0.15MのNaClに溶解する。アルカリ性のサンプルに関して、同じ緩衝液を、0.1MのNaOHの添加によって、約8または約10の上昇したpHへ調整する。規定された時点においてサブサンプルを取り、そしてそのVWF抗原(VWF:Ag)の含有量、遊離PSA、全PSA、およびマルチマーのVWF組成に関して分析する。
(1級アミンの存在下および高いpHにおける遊離可能PSA−rVWFのインビトロ解重合)
ポリシアル酸(PSA)−rVWF結合体のような、遊離可能水溶性ポリマー結合体の解重合を、別の局面において、タンパク質結合体緩衝液のアミン濃度を増加させることによって行う。遊離可能PSA−rVWF結合体を、100mMのリシンを含む、約9.8のpHの0.02Mのクエン酸ナトリウム、0.15MのNaCl緩衝液中で希釈し、そして37℃でインキュベートする。規定された時点でサブサンプルを取り、そしてそのVWF抗原(VWF:Ag)の含有量、遊離PSA、全PSA、およびマルチマー組成に関して分析する。マルチマー分析を、高密度水平SDSアガロースゲル電気泳動、およびヒトVWF(Dako、Glostrup、Denmark)またはPSA(Millipore、Temecula、CA、USA)のいずれかに対する抗体を用いた免疫染色によって行う。
(選択された遊離アミンの存在下における、遊離可能PSA−rFVIIIのタンパク質活性のインビトロにおける回復)
水溶性ポリマー結合体化タンパク質のタンパク質活性は、遊離アミンの存在下で増加することが予期され、アミン濃度が上昇するときにポリマーの遊離を示す。この実験において、遊離可能PSA−rFVIII結合体を、約7.3のpHを有する緩衝液(10mMのヒスチジン、90mMのNaCl、1.7mMのCaCl2、10mMのTris、0.26mMのグルタチオン、176mMのマンニトール、23.5mMのトレハロース、および0.1g/lのTween80)において、5IU/mlのFVIII色素形成活性へ希釈する;その緩衝液はさらにリシン、ヒスチジン、または両方のアミノ酸の組み合わせを含み、そしてその緩衝液を37℃でインキュベートして、タンパク質結合体からのPSAのインビトロにおける遊離を強制する。規定された時点(24時間、48時間、および72時間)においてサブサンプルを取り、そしてFVIII色素形成活性を、FVIII色素形成性アッセイの使用によって、オンラインで決定する。FVIII活性は、濃度漸増のリシン、ヒスチジン、または両方のアミンの組み合わせを有する緩衝液において、時間につれて増加することが予期される。
(遊離アミンの組み合わせの存在下における、遊離可能PSA−rFVIIIのインビトロ解重合)
遊離可能PSA−rFVIII結合体を、pH7.3の緩衝液(20mMのクエン酸Na3、1.7mMのCaCl2、176mMのマンニトール、36mMのショ糖、および0.1g/lのTween80)中でインキュベートする;その緩衝液はさらに100mMのヒスチジンおよび100mMのリシンを含み、そして+37℃でインキュベートする。あるいは、その緩衝液を、ヒスチジンおよびリシンを加えずに、pHを高いpH(例えば9.8)まで増加させる。168時間までの規定された時点でサブサンプルを取り、そしてPSA−rFVIIIの機能的活性を、FVIII色素形成性アッセイを用いることによって決定する(前に記載したように)。それに加えて、PSAの遊離を、凍結サブサンプルからHPLCによって遊離PSAおよび全PSAを測定することによって確認する。そのような条件は、インビトロでrFVIIIタンパク質からのPSAの遊離を引き起こすことが予期される。
(HEPES−Trisの存在下における、遊離可能PSA−rFVIIIのインビトロ解重合)
以前の実験は、緩衝液のアミン濃度の増加は、遊離可能水溶性ポリマーのタンパク質結合体からの遊離を強制することを示す。この実験において、遊離可能PSA−rFVIIIを、約7.4のpHにおいて、典型的なアミンを含む緩衝物質の組み合わせ、すなわち200mMのHEPESおよび200mMのTris中で、37℃でインキュベートする。規定された時点でサブサンプルを取る。FVIII活性の回復を色素形成性アッセイによってモニターし、そしてそのVWFと相互作用する能力を決定する。循環中のFVIIIの生存を決定的に決定するVWF結合を、表面プラズモン共鳴技術を用いることによってモニターする。Biacoreシステムを用いて、様々なPSA−rFVIIIサンプルを移動相に注入し、そして固定化VWFとの相互作用に関して試験する。VWFの結合は、PSAの遊離と共に増加することが予期される。従って、経時的な色素形成性FVIII活性の増加は、rFVIIIのVWFへの結合の増加を伴うはずであり、それは解重合のシグナルである(PSAの除去)。以前の実施例において述べたように、広いスペクトルのアミンを、そのような結合体からのPSAの遊離を強制するために使用し得ることが予期される。色素形成活性およびVWFへの結合の増加は、時間につれて機能的タンパク質が産生されることを示す。
Claims (27)
- 可逆的に結合した水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質から該水溶性ポリマーを遊離させる方法であって、該方法は、該タンパク質を、該水溶性ポリマーを遊離させるために有効な1つまたはそれ以上の条件下でインキュベートする工程を含む、方法。
- 可逆的に結合した水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質の活性を増加させる方法であって、該方法は、該タンパク質を、該水溶性ポリマーを遊離させるために有効な1つまたはそれ以上の条件下でインキュベートする工程を含む、方法。
- 前記水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件が、前記タンパク質を含む緩衝液のpHを、約pH6から約pH10まで上昇させることを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記条件が、前記緩衝液のpHを、約6.1から約9.8まで上昇させることを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記条件が、前記緩衝液のpHを、約7.3から約9.8まで上昇させることを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記条件が、前記緩衝液のpHを、約6.5から約8.1まで上昇させることを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件が、前記タンパク質を含む緩衝液の遊離アミン濃度を増加させることを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記緩衝液の遊離アミン濃度の増加が、リシンの濃度の増加の結果である、請求項7に記載の方法。
- 前記緩衝液の遊離アミン濃度の増加が、ヒスチジンの濃度の増加の結果である、請求項7に記載の方法。
- 前記緩衝液の遊離アミン濃度の増加が、アミンの組み合わせの増加の結果である、請求項7に記載の方法。
- 前記アミンの組み合わせが、リシンおよびヒスチジンである、請求項10に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件が、前記緩衝液の温度を、室温付近から約37℃へ上昇させることを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件が、前記緩衝液の温度を、約4℃から約37℃へ上昇させることを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件が、前記タンパク質をインキュベートする時間を、約5分から約168時間へ延長することを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記時間が、約5分から約48時間の範囲である、請求項14に記載の方法。
- 遊離可能水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質の品質管理をアッセイする方法であって、該方法は、該タンパク質を0時間から約6時間まで37℃で、約100mMのヒスチジンおよび約100mMのリシンを含む、約pH7.3の緩衝液中でインキュベートする工程、ならびに最初の6時間以内にタンパク質活性を分析する工程を含む、方法。
- 可逆的に結合した水溶性ポリマーによって修飾されたタンパク質の活性の増加または回復をモニターする方法であって、該方法は、該タンパク質から該可逆的に結合した水溶性ポリマーを除去する前および後に、タンパク質の活性を測定する工程を含む、方法。
- 可逆的に結合した水溶性ポリマーによって修飾されたタンパク質からの水溶性ポリマー遊離の動態を測定する方法であって、該方法は、反応混合物においてある期間にわたって、遊離の水溶性ポリマーの量およびタンパク質に結合体化した水溶性ポリマーの量を同時に測定する工程を含み、ここで該遊離の水溶性ポリマーの量の変化および該タンパク質に結合体化した水溶性ポリマーの量の変化から動態を決定する、方法。
- 前記測定する工程が、蛍光発光スペクトルに基づき、ここで、該同時に測定する工程が、水溶性ポリマー−9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニル(fmoc)結合体に関しては約350−355nmの発光ピーク、そして水溶性ポリマー−ジベンゾフルベンに関しては約460−560nmの発光ピークにおける蛍光を用いて実行される、請求項18に記載の方法。
- 前記測定する工程が、遊離の水溶性ポリマー−9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニル(fmoc)および水溶性ポリマー−ジベンゾフルベンに関する高速液体クロマトグラフィーに基づく、請求項18に記載の方法。
- 前記測定する工程が、免疫化学的に、水溶性ポリマー結合体化タンパク質および遊離の該タンパク質に関する酵素結合イムノソルベント検定法に基づく、請求項18に記載の方法。
- 前記タンパク質が、第VIII因子(FVIII)である、請求項18〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、フォンビルブランド因子(VWF)である、請求項18〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニル(fmoc)、ジベンゾフルベン、またはその誘導体を有する前記タンパク質に可逆的に結合する、請求項1、2、16、17または18に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニル(fmoc)、またはその誘導体に結合する、請求項24に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールである、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、ポリシアル酸である、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
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