BR112021015068A2

BR112021015068A2 - Métodos de tratamento profilático usando vwf recombinante (rvwf)

Info

Publication number: BR112021015068A2
Application number: BR112021015068-4A
Authority: BR
Inventors: Björn Mellgård; Bruce Ewenstein
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date: 2019-02-01
Filing date: 2020-01-31
Publication date: 2021-10-05
Also published as: US20200261546A1; EP3917557A1; KR20210134642A; JP2022524291A; SG11202108325YA; CA3128498A1; EA202192140A1; WO2020160460A1; MX2021009114A; IL285220A; AU2020216976A1; CO2021011340A2; CN113645993A

Abstract

métodos de tratamento profilático usando vwf recombinante (rvwf). a presente invenção se refere a um método para tratamento profilático de sangramento espontâneo em um sujeito com doença de von willebrand severa compreendendo administrar uma quantidade terapêutica de fator de von willebrand (rvwf) recombinante ao sujeito.

Description

MÉTODOS DE TRATAMENTO PROFILÁTICO USANDO VWF RECOMBINANTE (RVWF) REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. 62/800,370, depositado em 1 de fevereiro de 2019, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] As doenças de coagulação, como a doença de von Willebrand (VWD), geralmente resultam de uma deficiência na cascata de coagulação. Doença de von Willebrand (VWD) refere-se ao grupo de doenças causadas por uma deficiência do fator de von Willebrand. O fator de von Willebrand ajuda as plaquetas sanguíneas a se aglutinarem e a aderirem à parede do vaso sanguíneo, o que é necessário para a coagulação normal do sangue.

[0003] A doença de von Willebrand (VWD) é o distúrbio de sangramento hereditário mais comum, com uma taxa de prevalência estimada de 1% (Veyradier A, et al., Medicine (Baltimore). 2016, 95(11):e3038). No entanto, excluindo as formas mais leves da doença, apenas cerca de 1/10.000 pacientes realmente requerem tratamento. O tratamento atual para essas coagulopatias inclui uma terapia de substituição usando preparações farmacêuticas que compreendem o fator de coagulação normal.

[0004] VWF é uma glicoproteína que circula no plasma como uma série de multímeros que variam em tamanho de cerca de 500 a 20.000 kD. O comprimento total do cDNA de VWF foi clonado; o pró-polipeptídeo corresponde aos resíduos de aminoácidos 23 a 764 do pré-pró-VWF de comprimento total (Eikenboom et al (1995) Haemophilia, 1, 77 90). As formas multiméricas de VWF são compostas por subunidades polipeptídicas de 250 kD ligadas entre si por ligações dissulfeto. O VWF medeia a adesão plaquetária inicial ao subendotélio da parede do vaso danificado, com os multímeros maiores exibindo atividade hemostática intensificada. O VWF multimerizado se liga à glicoproteína de superfície plaquetária Gp1bα, por meio de uma interação no domínio A1 do VWF, facilitando a adesão plaquetária. Outros sítios no VWF medeiam a ligação à parede do vaso sanguíneo. Assim, o VWF forma uma ponte entre as plaquetas e a parede do vaso que é essencial para a adesão plaquetária e hemostasia primária em condições de alto estresse de cisalhamento. Normalmente, as células endoteliais secretam grandes formas poliméricas de VWF e as formas de VWF que têm um peso molecular mais baixo surgem da clivagem proteolítica. Os multímeros de massas moleculares excepcionalmente grandes são armazenados nos corpos de Weibel-Pallade das células endoteliais e liberados após estimulação por agonistas como a trombina e a histamina.

[0005] Para pacientes com VWD, recomenda-se que sejam tratados com reposição de fator de von Willebrand (VWF) devido à necessidade de hemostasia prolongada, particularmente em cirurgias de grande porte e em resposta a outros episódios de sangramento. No entanto, os tratamentos profiláticos não são bem descritos ou conhecidos. Permanece uma necessidade na técnica de ajudar os pacientes com antecedência de tais episódios de sangramento por meio de regimes de tratamento profilático. A presente invenção satisfaz esta necessidade ao fornecer métodos para o tratamento profilático de VWD com rVWF humano.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A presente invenção fornece um método para tratar profilaticamente episódios de sangramento espontâneo em um sujeito com doença de von Willebrand grave (VWD). O método compreende administrar ao sujeito duas vezes por semana pelo menos uma dose de Fator de von Willebrand (rVWF) recombinante variando de pelo menos cerca de 40 IU/kg a cerca de 80

IU/kg, desse modo reduzindo a frequência e/ou duração dos episódios de sangramento espontâneo.

[0007] Em algumas modalidades, a pelo menos uma dose de rVWF varia de pelo menos cerca de 50 IU/kg a cerca de 80 IU/kg.

[0008] Em algumas modalidades, o sujeito tem uma atividade de cofator de ristocetina de VWF de linha de base (VWF: RCo) variando de 20 IU/dL ou menos, ou é diagnosticado com VWD Tipo 1. Em certas modalidades, o sujeito é diagnosticado com VWD Tipo 2A, 2B ou 2M. Em modalidades particulares, o sujeito tem um teor VWF:antígeno (VWF: Ag) variando de 3 IU/dL ou mais, ou é diagnosticado com VWD Tipo 3.

[0009] Em algumas modalidades, o sujeito recebeu tratamento profilático de VWF derivado de plasma (pdVWF) nos últimos 12 meses antes da administração inicial de rVWF.

[0010] Em algumas modalidades, o sujeito experimentou pelo menos 3 episódios de sangramento espontâneo nos últimos 12 meses.

[0011] Em algumas modalidades do método, a administração de rVWF ocorre a cada 3 a 4 dias. Em algumas modalidades, a administração ocorre no dia 1 e no dia 5, no dia 2 e no dia 6, ou no dia 3 e no dia 7 de um período de 7 dias. Em certas modalidades, a administração ocorre pelo menos a cada 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas ou 84 horas. Em algumas modalidades, a administração ocorre pelo menos a cada 72 horas.

[0012] Em algumas modalidades, o método descrito compreende ainda administrar ao sujeito pelo menos uma dose de fator VIII recombinante (rFVIII). Em algumas modalidades, a administração de pelo menos uma dose de rFVIII é administrada concomitantemente ou sequencialmente com a pelo menos uma dose de rVWF.

[0013] Em algumas modalidades, o sujeito retoma o tratamento profilático após receber cirurgia eletiva ou cirurgia oral. Em algumas modalidades, se a cirurgia eletiva for uma cirurgia menor ou cirurgia oral e o sujeito tiver atividade de FVIII (FVIII:C) de pelo menos 0,4 IU/mL ou maior, ao sujeito é administrado rVWF sem rFVIII antes da cirurgia. Em algumas modalidades, se a cirurgia eletiva for uma cirurgia maior e o sujeito tiver atividade de FVIII (FVIII:C) de pelo menos 0,8 IU/mL ou maior, ao sujeito é administrado rVWF sem rFVIII antes da cirurgia.

[0014] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma redução de ≥25% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante a profilaxia de rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento.

[0015] Em algumas modalidades a eficácia de tratamento profilático é indicada por uma redução de ≥25%, ≥30%, ≥35%, ≥40%, ≥45%, ≥50%, ≥55%, ≥60%, ≥65%, ≥70%, ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90% ou ≥95% em taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante profilaxia de rVWF em relação a ABR de pré-tratamento.

[0016] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é medida examinando as atividades de vWF: RCo e/ou FVIII em amostras obtidas do sujeito antes e após o tratamento profilático com rVWF.

[0017] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é medida examinando as atividades de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII: C, VWF: RCo, VWF: Ag e/ou VWF em amostras obtidas do sujeito antes e após o tratamento profilático com rVWF.

[0018] Em algumas modalidades, as amostras para examinar FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou atividades de capacidade de ligação de colágeno de VWF são obtidas 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 48 horas, 72 horas ou 96 horas, após tratamento profilático com rVWF.

[0019] Em algumas modalidades, as amostras para examinar as atividades de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII: C, VWF: RCo, VWF: Ag e/ou VWF são obtidas 25 a 31 dias após o tratamento profilático com rVWF.

[0020] Em algumas modalidades, a eficácia de tratamento profilático é determinada após ou durante um episódio de sangramento, em que amostras para examinar FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou atividades de capacidade de ligação de colágeno de VWF são obtidas após o episódio de sangramento e ainda em que as amostras são obtidas antes de administração de rVWF, 2 horas após administração de rVWF e, em seguida, a cada 12-24 horas até resolução do episódio de sangramento.

[0021] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma melhoria nos níveis de atividade de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII: C, VWF: RCo, VWF: Ag e/ou VWF após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF.

[0022] Também é fornecido aqui um método para tratar profilaticamente episódios de sangramento espontâneo em um sujeito com doença de von Willebrand grave (VWD). O método compreende administrar ao sujeito uma dose semanal de Fator de von Willebrand (rVWF) recombinante substancialmente equivalente a uma dose semanal correspondente de VWF derivado de plasma (pdVWF) previamente administrada ao referido sujeito, desse modo reduzindo a frequência e/ou duração de episódios de sangramento espontâneo.

[0023] Em algumas modalidades, a dose semanal de rVWF é cerca de 10% menor que a dose semanal correspondente de pdVWF. Em algumas modalidades, a dose semanal de rVWF é cerca de 10% maior que a dose semanal correspondente de pdVWF.

[0024] Em algumas modalidades, a dose semanal de rVWF é de duas infusões individuais administradas em dias separados. Em algumas modalidades, a dose semanal de rVWF é de três infusões individuais administradas em dias separados. Em algumas modalidades, a dose semanal de rVWF é uma infusão única.

[0025] Em algumas modalidades, cada infusão individual compreende até 80 IU/kg rVWF.

[0026] Em algumas modalidades, cada infusão individual compreende 80 IU/kg rVWF.

[0027] Em algumas modalidades, cada infusão individual compreende 50 IU/kg de rVWF.

[0028] Em algumas modalidades, o sujeito tem uma atividade de cofator de ristocetina de VWF de linha de base (VWF: RCo) variando de 20 IU/dL ou menos, ou é diagnosticado com VWD Tipo 1. Em algumas modalidades, o sujeito é diagnosticado com VWD Tipo 2A, 2B ou 2M. Em algumas modalidades, o sujeito tem um teor VWF:antígeno (VWF: Ag) variando de 3 IU/dL ou mais, ou é diagnosticado com VWD Tipo 3.

[0029] Em algumas modalidades, o sujeito recebeu tratamento profilático de pdVWF por pelo menos 12 meses.

[0030] Em algumas modalidades, as duas infusões individuais são administradas no dia 1 e no dia 5, ou no dia 2 e no dia 6, ou no dia 3 e no dia 7 de um período de 7 dias. Em certas modalidades, as três infusões individuais são administradas no dia 1, dia 3 e dia 6 de um período de 7 dias. Em algumas modalidades, a administração ocorre pelo menos a cada 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas ou 84 horas. Em modalidades particulares, a administração ocorre pelo menos a cada 72 horas.

[0031] Em algumas modalidades, o método fornecido aqui compreende ainda administrar ao sujeito pelo menos uma dose de fator VIII recombinante (rFVIII).

[0032] Em algumas modalidades, a administração de pelo menos uma dose de rFVIII é administrada concomitantemente ou sequencialmente com a dose semanal de rVWF.

[0033] Em algumas modalidades, o sujeito retoma o tratamento profilático após receber cirurgia eletiva ou cirurgia oral. Em algumas modalidades, se a cirurgia eletiva for uma cirurgia menor ou cirurgia oral e o sujeito tiver uma atividade de FVIII (FVIII:C) de pelo menos 0,4 IU/mL ou maior, ao sujeito é administrado rVWF sem rFVIII antes da cirurgia. Em algumas modalidades, se a cirurgia eletiva for uma cirurgia maior e o sujeito tiver uma atividade de FVIII (FVIII:C) de pelo menos 0,8 IU/mL ou maior, ao sujeito é administrado rVWF sem rFVIII antes da cirurgia.

[0034] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma redução de ≥25% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante a profilaxia de rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento.

[0035] Em algumas modalidades a eficácia de tratamento profilático é indicada por uma redução de ≥25%, ≥30%, ≥35%, ≥40%, ≥45%, ≥50%, ≥55%, ≥60%, ≥65%, ≥70%, ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90% ou ≥95% em taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante profilaxia de rVWF em relação a ABR de pré-tratamento.

[0036] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é medida examinando as atividades de vWF: RCo e/ou FVIII em amostras obtidas do sujeito antes e após o tratamento profilático com rVWF.

[0037] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é medida examinando as atividades de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII,

FVIII: C, VWF: RCo, VWF: Ag e/ou VWF em amostras obtidas do sujeito antes e após o tratamento profilático com rVWF.

[0038] Em algumas modalidades, as amostras para examinar FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou atividades de capacidade de ligação de colágeno de VWF são obtidas 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 48 horas, 72 horas ou 96 horas, após tratamento profilático com rVWF.

[0039] Em algumas modalidades, as amostras para examinar as atividades de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII: C, VWF: RCo, VWF: Ag e/ou VWF são obtidas 25 a 31 dias após o tratamento profilático com rVWF.

[0040] Em algumas modalidades, a eficácia de tratamento profilático é determinada após ou durante um episódio de sangramento, em que amostras para examinar FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou atividades de capacidade de ligação de colágeno de VWF são obtidas após o episódio de sangramento e ainda em que as amostras são obtidas antes de administração de rVWF, 2 horas após administração de rVWF e, em seguida, a cada 12-24 horas até resolução do episódio de sangramento.

[0041] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma melhoria nos níveis de atividade de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII: C, VWF: RCo, VWF: Ag e/ou VWF após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF.

[0042] Em algumas modalidades, sangramento espontâneo ou episódio de sangramento compreende qualquer um selecionado do grupo que consiste em hemartrose, epistaxe, sangramento muscular, sangramento oral e sangramento gastrointestinal.

[0043] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos, o sujeito não é diagnosticado com VWD tipo 2N ou pseudo VWD.

[0044] Outros objetos, vantagens e modalidades da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0045] FIG. 1 mostra o desenho do estudo para o estudo de fase 3 global, multicêntrico, de rótulo aberto (NCT02973087, EudraCT no.: 2016-001478-14) aqui descrito.

[0046] FIG. 2 mostra uma tabela dos principais critérios de inclusão e exclusão do estudo.

[0047] FIG. 3 mostra uma tabela de programas de dosagem exemplificativos para a profilaxia de rVWF.

[0048] FIG. 4 mostra uma tabela de medidas de resultados do estudo principal.

[0049] FIG. 5A-FIG. 5C representa a sequência de ácido nucleico de prepro- VWF humano recombinante.

[0050] FIG. 6A-FIG. 6J representam a sequência de aminoácidos do prepro- VWF humano recombinante.

[0051] FIG. 7A-FIG. 7G representa a sequência de aminoácidos do VWF maduro humano recombinante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO INTRODUÇÃO

[0052] Para pacientes com VWD, recomenda-se que sejam tratados com reposição do fator de von Willebrand (VWF) devido à necessidade de hemostasia prolongada, particularmente em cirurgias de grande porte (Mannucci PM and Franchini M., Haemophilia, 2017, 23(2):182-187; National Institutes of Health. National Heart, Lung, and Blood Institute. The Diagnosis, Evaluation, and Management of von Willebrand Disease NIH Publication No. 08-5832;

December, 2007). As terapias com VWF derivadas do plasma contêm fator VIII (FVIII) e têm potencial para acumulação de FVIII com dosagens repetidas.

[0053] VONVENDI® que é aprovado para os EUA e seu equivalente aprovado pela UE, cada VEYVONDI® cobre concentrados de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) que são fabricados por tecnologia de DNA recombinante na linhagem de células de ovário de hamster chinês sem a adição de proteína exógena humana ou derivada de animal (Turecek PL, et al. Hämostaseologie. 2009;29(suppl 1):S32-38; Mannucci PM, et al. Blood, 2013;122(5):648-657; Gill JC, et al. Blood, 2015;126(17):2038-2046; European Medicines Agency. VEYVONDI Summary of Product Characteristics). rVWF contém o perfil completo de multímero de VWF, incluindo multímeros ultralargos que geralmente são deficientes em concentrados de VWF derivados de plasma (pdVWF) expostos a ADAMTS13, a proteína de clivagem de VWF.

[0054] A maioria dos pacientes com VWD apresenta sangramento da mucosa leve a moderado e sangramento após trauma ou cirurgia, embora sangramento com risco de vida também possa ocorrer, particularmente em paciente com doença grave (Nichols et al., Haemophilia, 2008, 14:171-232; Leebeek FW and Eikenboom JC, N Engl J Med, 2016, 375:2067-80). Espera-se que a redução da frequência e duração dos episódios de sangramento diminua a necessidade de transfusões de glóbulos vermelhos e diminua o risco de comorbidades debilitantes, incluindo artropatia.

[0055] Pacientes com VWD grave podem se beneficiar do tratamento profilático de rVWF para manter os níveis de VWF e FVIII para que o risco de episódios de sangramento espontâneo (BEs), incluindo hemartrose, epistaxe e sangramento gastrointestinal, seja reduzido (Abshire TC, Thromb Res 2009, 124(suppl 1):S23-6; Berntorp E, Haemophilia 2008, 14(suppl 5):47-53; Berntorp E and Petrini P, Blood Coagul Fibrinolysis, 2005, 16 (suppl 1): S23-6; Berntorp E,

Semin Thromb Hemost, 2006, 32:621-5; Abshire et al., Haemophilia, 2013, 19:76-81; Abshire TC, J Thromb Haemost, 2015, 13:1585-9).

[0056] A presente invenção fornece métodos para o tratamento profilático de sangramento espontâneo em um paciente com doença de von Willebrand grave (VWD). O método compreende administrar ao sujeito fator de von Willebrand recombinante (rVWF). Em algumas modalidades, o sujeito recebe uma dose duas vezes por semana que varia de cerca de 40-80 IU/kg de rVWF. Em algumas modalidades, o sujeito recebe uma dose semanal que varia de cerca de 40 a 80 IU/kg de rVWF. Em alguns casos, a dose semanal é fornecida como uma administração única uma vez por semana. Em certos casos, a dose semanal é fornecida como duas administrações separadas em dias diferentes durante uma semana. Em outros casos, a dose semanal é fornecida em três administrações separadas em dias diferentes durante uma semana.

[0057] A divulgação da Publicação do Pedido PCT WO2012/171031 é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins.

DEFINIÇÕES

[0058] Antes da invenção ser adicionalmente descrita, deve ser entendido que esta invenção não está limitada a modalidades particulares descritas, pois tais podem, é claro, variar. Também deve-se entender que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades específicas apenas e não pretende limitar o escopo da presente invenção, o qual será limitado somente pelas reivindicações anexas.

[0059] Como utilizado neste documento, “rVWF” refere-se a VWF recombinante.

[0060] Como utilizado neste documento, "rFVIII" refere-se a FVIII recombinante.

[0061] O termo "recombinante" quando usado com referência, por exemplo, a uma célula, ou ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor foi modificada pela introdução de um ácido nucleico heterólogo ou proteína ou a alteração de um ácido nucleico ou proteína nativo ou a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, as células recombinantes expressam genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante) da célula ou expressar genes nativos que de outra forma são anormalmente expressos, subexpressos ou não expressos de forma alguma.

[0062] Como utilizado neste documento, "VWF recombinante" inclui VWF obtido por meio de tecnologia de DNA recombinante. Em certas modalidades, as proteínas VWF da invenção podem compreender um construto, por exemplo, preparado como em WO 1986/06096 publicado em 23 de outubro de 1986 e o pedido de patente U.S. 07/559.509, depositado em 23 de julho de 1990, em nome de Ginsburg et al., que é aqui incorporado por referência no que diz respeito aos métodos de produção de VWF recombinante. O VWF na presente invenção pode incluir todas as formas potenciais, incluindo as formas monomérica e multimérica. Também deve ser entendido que a presente invenção abrange diferentes formas de VWF a serem usadas em combinação. Por exemplo, o VWF da presente invenção pode incluir diferentes multímeros, diferentes derivados e derivados biologicamente ativos e derivados não biologicamente ativos.

[0063] No contexto da presente invenção, o VWF recombinante abrange qualquer membro da família VWF de, por exemplo, um mamífero como um primata, humano, macaco, coelho, porco, roedor, camundongo, rato, hamster, gerbil, canino, felino e derivados biologicamente ativos dos mesmos. As proteínas VWF mutantes e variantes com atividade também estão incluídas, assim como fragmentos funcionais e proteínas de fusão das proteínas VWF.

Além disso, o VWF da invenção pode compreender ainda etiquetas que facilitam a purificação, detecção ou ambos. O VWF aqui descrito pode ainda ser modificado com uma fração terapêutica ou uma fração adequada de imageamento in vitro ou in vivo.

[0064] Como utilizado neste documento, "VWF derivado de plasma" ou "pdVWF" inclui todas as formas da proteína encontrada no sangue, incluindo o VWF maduro obtido de um mamífero com a propriedade de estabilização in vivo, por exemplo, ligação, de pelo menos uma molécula de FVIII.

[0065] O termo "VWF altamente multimérico" ou "VWF de alto peso molecular" refere-se a VWF compreendendo pelo menos 10 subunidades, ou 12, 14 ou 16 subunidades, a cerca de 20, 22, 24 ou 26 subunidades ou mais. O termo "subunidade" refere-se a um monômero de VWF. Como é conhecido na técnica, são geralmente dímeros de VWF que polimerizam para formar os multímeros de ordem maior. (ver Turecek et al., Semin. Thromb. Hemost. 2010, 36 (5): 510-521, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins e, em particular, para todos os ensinamentos relativos à análise de multímero de VWF).

[0066] Como utilizado neste documento, o termo "fator VIII" ou "FVIII" refere-se a qualquer forma de molécula de fator VIII com as características típicas do fator VIII de coagulação sanguínea, seja endógeno a um paciente, derivado de plasma sanguíneo ou produzido através do uso de técnicas recombinantes de DNA, incluindo todas as formas modificadas do fator VIII. O fator VIII (FVIII) existe naturalmente e em preparações terapêuticas como uma distribuição heterogênea de polipeptídeos originando-se de um único produto de gene (ver, por exemplo, Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:2979- 2983 (1986)). Os exemplos comercialmente disponíveis de preparações terapêuticas contendo Fator VIII incluem aquelas vendidas sob os nomes comerciais de HEMOFIL M, ADVATE e RECOMBINATE (disponíveis na Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, Ill., U.S.A.).

[0067] Como utilizado neste documento, "atividade de FVIII no plasma" e "atividade de FVIII in vivo" são usadas indistintamente. A atividade de FVIII in vivo medida usando ensaios padrão pode ser a atividade de FVIII endógena, a atividade de um FVIII administrado terapeuticamente (recombinante ou derivado de plasma) ou a atividade de FVIII endógena e administrada. Da mesma forma, "FVIII no plasma" refere-se a FVIII endógeno ou FVIII recombinante administrado ou derivado de plasma.

[0068] Como utilizado neste documento, "doença de von Willebrand" refere-se ao grupo de doenças causadas por uma deficiência do fator de von Willebrand. O fator de von Willebrand ajuda as plaquetas sanguíneas a se aglutinarem e a aderirem à parede do vaso sanguíneo, o que é necessário para a coagulação normal do sangue. Conforme descrito em mais detalhes neste documento, existem vários tipos de doença de Von Willebrand, incluindo os tipos 1, 2A, 2B, 2M e 3.

[0069] Os termos "isolado", "purificado" ou "biologicamente puro" referem-se ao material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham como encontrado em seu estado nativo. Pureza e homogeneidade são normalmente determinadas usando técnicas de química analítica, como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. O VWF é a espécie predominante presente em uma preparação substancialmente purificada. O termo "purificado" em algumas modalidades denota que um ácido nucleico ou proteína dá origem a essencialmente uma banda em um gel eletroforético. Em outras modalidades, isso significa que o ácido nucleico ou proteína é pelo menos 50% puro, mais preferencialmente pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,

97%, 98%, 99% ou mais puro. "Purificar" ou "purificação" em outras modalidades significa remover pelo menos um contaminante da composição a ser purificada. Nesse sentido, a purificação não requer que o composto purificado seja homogêneo, por exemplo, 100% puro.

[0070] Como utilizado neste documento, "administrar" (e todos os equivalentes gramaticais) inclui administração intravenosa, administração intramuscular, administração subcutânea, administração oral, administração como um supositório, contato tópico, administração intraperitoneal, intralesional ou intranasal, ou a implantação de um dispositivo de liberação lenta, por exemplo, uma bomba mini-osmótica, para um sujeito. A administração é por qualquer via, incluindo parenteral e transmucosa (por exemplo, oral, nasal, vaginal, retal ou transdérmica). A administração parenteral inclui, por exemplo, intravenosa, intramuscular, intra-arteríola, intradérmica, subcutânea, intraperitoneal, intraventricular e intracraniana. Outros modos de distribuição incluem, mas não estão limitados a, o uso de formulações lipossômicas, infusão intravenosa, emplastros transdérmicos, etc.

[0071] Os termos "quantidade ou dose terapeuticamente eficaz" ou "quantidade ou dose terapeuticamente suficiente" ou "quantidade ou dose eficaz ou suficiente" referem-se a uma dose que produz efeitos terapêuticos para a qual é administrada. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma droga útil para o tratamento da hemofilia pode ser a quantidade que é capaz de prevenir ou aliviar um ou mais sintomas associados à hemofilia. A dose exata dependerá do propósito do tratamento, e serão determináveis por um versado na técnica usando técnicas conhecidas (ver, e.g., Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition,

2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

[0072] Conforme usado neste documento, os termos "paciente" e "sujeito" são usados indistintamente e se referem a um mamífero (de preferência humano) que tem uma doença ou tem o potencial de contrair uma doença.

[0073] Como utilizado neste documento, o termo "cerca de" denota uma faixa aproximada de mais ou menos 10% de um valor especificado. Por exemplo, a linguagem “cerca de 20%” abrange uma faixa de 18-22%.

[0074] Como utilizado neste documento, o termo "meia-vida" se refere ao período de tempo que leva para a quantidade de uma substância em decomposição (ou depuração de uma amostra ou de um paciente) diminuir pela metade. I. FATOR DE VON WILLEBRAND RECOMBINANTE (RVWF)

[0075] A presente invenção utiliza composições compreendendo Fator de von Willebrand (rVWF) para o tratamento profilático de episódios de sangramento espontâneo em um sujeito com VWD grave. Em algumas modalidades, o tratamento reduz a gravidade, incidência (frequência) e/ou duração dos episódios de sangramento espontâneo.

[0076] Em certas modalidades, as proteínas VWF da invenção podem compreender um construto, por exemplo, preparado como em WO 1986/06096 publicado em 23 de outubro de 1986 e o pedido de patente U.S. 07/559.509, depositado em 23 de julho de 1990, em nome de Ginsburg et al., que é aqui incorporado por referência no que diz respeito aos métodos de produção de VWF recombinante. O VWF útil para a presente invenção inclui todas as formas potenciais, incluindo as formas monomérica e multimérica. Uma forma particularmente útil de VWF são homo-multímeros de pelo menos dois VWFs. As proteínas do VWF podem ser um derivado biologicamente ativo ou, quando usado apenas como um estabilizador para FVIII, o VWF pode estar em uma forma não biologicamente ativa. Também deve ser entendido que a presente invenção abrange diferentes formas de VWF a serem usadas em combinação. Por exemplo, a composição útil para a presente invenção pode incluir diferentes multímeros, diferentes derivados e derivados biologicamente ativos e derivados não biologicamente ativos.

[0077] Na hemostasia primária, o VWF atua como uma ponte entre as plaquetas e componentes específicos da matriz extracelular, como o colágeno. A atividade biológica do VWF neste processo pode ser medida por diferentes ensaios in vitro (Turecek et al., Semin. Thromb. Hemost. 28: 149-160, 2002). O ensaio de cofator de ristocetina é baseado na aglutinação de plaquetas frescas ou fixadas em formalina induzida pelo antibiótico ristocetina na presença de VWF.

[0078] O grau de aglutinação de plaquetas depende da concentração de VWF e pode ser medido pelo método turbidimétrico, por exemplo, pelo uso de um agregômetro (Weiss et al., J. Clin. Invest. 52: 2708-2716, 1973; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308, 1975). O segundo método é o ensaio de ligação do colágeno, que é baseado na tecnologia ELISA (Brown et Bosak, Thromb. Res. 43: 303-311, 1986; Favaloro, Thromb. Haemost. 83: 127-135, 2000). Uma placa de microtitulação é revestida com colágeno tipo I ou III. Em seguida, o VWF é ligado à superfície de colágeno e subsequentemente detectado com um anticorpo policlonal marcado com enzima. A última etapa é a reação do substrato, que pode ser monitorada fotometricamente com um leitor de ELISA. Conforme fornecido neste documento, a atividade específica do Cofator de Ristocetina do VWF (VWF:RCo) da presente invenção é geralmente descrita em termos de mU/μg de VWF, conforme medido usando ensaios in vitro.

[0079] Uma vantagem das composições de rVWF da presente invenção em relação ao pdVWF é que o rVWF exibe uma atividade específica mais elevada do que o pdVWF. Em algumas modalidades, o rVWF da invenção tem uma atividade específica de pelo menos cerca de 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 32,5, 35, 37,5, 40, 42,5, 45, 47,5, 50, 52,5, 55, 57,5, 60, 62,5, 65, 67,5, 70, 72,5, 75, 77,5, 80, 82,5, 85, 87,5, 90, 92,5, 95, 97,5, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 ou mais mU/μg.

[0080] O rVWF da presente invenção é altamente multimérico compreendendo cerca de 10 a cerca de 40 subunidades. Em outras modalidades, o rVWF multimérico produzido usando métodos da presente invenção compreende cerca de 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 subunidades. Em modalidades adicionais, o rVWF está presente em multímeros que variam em tamanho de dímeros a multímeros de mais de 40 subunidades (> 10 milhões de Daltons). Os maiores multímeros fornecem múltiplos sítios de ligação que podem interagir com os receptores plaquetários e com os sítios de lesão da matriz subendotelial e são a forma mais hemostaticamente ativa de VWF. A aplicação de ADAMTS13 irá clivar os multímeros rVWF ultralargos ao longo do tempo, mas durante a produção (geralmente através da expressão em cultura de células), as composições de rVWF da presente invenção geralmente não são expostas a ADAMTS13 e retêm sua estrutura altamente multimérica.

[0081] Em uma modalidade, uma composição de rVWF usada nos métodos descritos neste documento tem uma distribuição de oligômeros de rVWF caracterizada por 95% dos oligômeros ter entre 6 subunidades e 20 subunidades. Em outras modalidades, a composição de rVWF tem uma distribuição de oligômeros de rVWF caracterizada por 95% dos oligômeros ter uma faixa de subunidades selecionadas das variações 458 a 641 encontradas na Tabela 2 de WO 2012/171031, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins.

[0082] Em uma modalidade, uma composição de rVWF pode ser caracterizada de acordo com a porcentagem de moléculas de rVWF que estão presentes em um multímero de rVWF de ordem superior particular ou multímero maior. Por exemplo, em uma modalidade, pelo menos 20% das moléculas rVWF em uma composição rVWF usada nos métodos descritos neste documento estão presentes em um complexo oligomérico de pelo menos 10 subunidades. Em outra modalidade, pelo menos 20% das moléculas rVWF em uma composição rVWF usada nos métodos descritos neste documento estão presentes em um complexo oligomérico de pelo menos 12 subunidades. Em ainda outras modalidades, uma composição de rVWF usada nos métodos fornecidos neste documento tem uma porcentagem mínima (por exemplo, tem pelo menos X%) de moléculas de rVWF presentes em um multímero de rVWF de ordem superior particular ou multímero maior (por exemplo, um multímero de pelo menos subunidades Y) de acordo com qualquer uma das variações 134 a 457 encontradas na Tabela 3 à Tabela 5, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins.

[0083] De acordo com o acima, a composição de rVWF administrada ao sujeito (com ou sem FVIII) geralmente compreende uma porcentagem significativa de multímeros de rVWF de alto peso molecular (HMW). Em outras modalidades, a composição de multímero HMW rVWF compreende pelo menos 10% - 80% de decâmeros mat-rVWF ou multímeros de ordem superior. Em outras modalidades, a composição compreende cerca de 10-95%, 20-90%, 30- 85%, 40-80%, 50-75%, 60-70% de decâmeros ou multímeros de ordem superior. Em outras modalidades, a composição de multímero HMW rVWF compreende pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% decâmeros ou multímeros de ordem superior.

[0084] A avaliação do número e da porcentagem de multímeros rVWF pode ser conduzida usando métodos conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação,

métodos usando eletroforese e métodos de cromatografia de exclusão de tamanho para separar multímeros VWF por tamanho, por exemplo, como discutido por Cumming et al, (J Clin Pathol. Maio de 1993; 46 (5): 470-473, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins e, em particular, para todos os ensinamentos relacionados à avaliação de multímeros VWF). Essas técnicas podem incluir ainda técnicas de imunotransferência (como Western Blot), em que o gel é imunotransferido com um anticorpo radiomarcado contra VWF seguido por detecção quimioluminescente (ver, por exemplo, Wen et al., (1993), J. Clin. Lab. Anal., 7:317-323, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins e em particular para todos os ensinamentos relacionados à avaliação de multímeros de VWF). Outros ensaios para VWF incluem VWF:Antígeno (VWF:Ag), VWF:Cofator de Ristocetina (VWF:RCof) e VWF:Ensaio de Atividade de Ligação de Colágeno (VWF:CBA), que são frequentemente usados para diagnóstico e classificação da Doença de Von Willebrand. (ver, por exemplo, Favaloro et al., Pathology, 1997, 29 (4): 341-456, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins e em particular para todos os ensinamentos relacionados a ensaios para VWF).

[0085] Em outras modalidades, os multímeros rVWF de ordem superior da invenção são estáveis por cerca de 1 a cerca de 90 horas após a administração. Em ainda outras modalidades, os multímeros rVWF de ordem superior são estáveis por cerca de 5-80, 10-70, 15-60, 20-50, 25-40, 30-35 horas após a administração. Em ainda outras modalidades, os multímeros rVWF de ordem superior são estáveis por pelo menos 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 horas após a administração. Em certas modalidades, a estabilidade dos multímeros rVWF é avaliada in vitro.

[0086] Em uma modalidade, os multímeros rVWF de ordem superior usados nas composições e métodos aqui fornecidos têm uma meia-vida de pelo menos 12 horas após a administração. Em outra modalidade, os multímeros rVWF de ordem superior têm uma meia-vida de pelo menos 24 horas após a administração. Em ainda outras modalidades, os multímeros de rVWF de ordem superior têm uma meia-vida selecionada das variações 642 a 1045 encontradas na Tabela 6 de WO 2012/171031, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins.

[0087] Em aspectos específicos, o rVWF (recombinante ou derivado de plasma) utilizado de acordo com a presente invenção não é modificado com qualquer conjugação, pós-tradução ou modificações covalentes. Em modalidades particulares, o rVWF purificado da presente invenção não é modificado com um polímero solúvel em água, incluindo, sem limitação, um polietileno glicol (PEG), um polipropileno glicol, um polioxialquileno, um ácido polissiálico, hidroxi etil amido, uma fração poli-carboidrato e semelhantes.

[0088] Em outros aspectos, o rVWF (recombinante ou derivado de plasma) usado de acordo com a presente invenção é modificado por conjugação, modificação pós-tradução ou modificação covalente, incluindo modificações dos resíduos N- ou C- terminais, bem como modificações de cadeias laterais selecionadas, por exemplo, em grupos sulfidrila livres, aminas primárias e grupos hidroxil. Em uma modalidade, um polímero solúvel em água está ligado à proteína (diretamente ou por meio de um ligante) por um grupo lisina ou outra amina primária. Em uma modalidade, as proteínas rVWF purificado da presente invenção pode ser modificado por conjugação de um polímero solúvel em água, incluindo, sem limitação, um polietileno glicol (PEG), um polipropileno glicol, um polioxialquileno, um ácido polissiálico, hidroxi etil amido, uma fração poli- carboidrato e semelhantes.

[0089] Os polímeros solúveis em água que podem ser usados para modificar o rVWF e/ou FVIII incluem estruturas lineares e ramificadas. Os polímeros conjugados podem ser ligados diretamente às proteínas de coagulação da invenção ou, alternativamente, podem ser ligados através de uma fração de ligação. Exemplos não limitativos de conjugação de proteínas com polímeros solúveis em água podem ser encontrados na Pat. U.S. 4.640.835; 4,496,689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 e 4.179.337, bem como em Abuchowski e Davis Abuchowski and Davis “Enzymes as Drugs,” Holcenberg and Roberts, Eds., pp. 367 383, John Wiley and Sons, New York (1981), and Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2nd Ed., Academic Press, Inc. 2008.

[0090] A conjugação de proteínas pode ser realizada por uma série de técnicas bem conhecidas na técnica, por exemplo, ver Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2nd Ed., Academic Press, Inc. 2008. Os exemplos incluem a ligação através da ligação peptídica entre um grupo carboxil em uma das proteínas de coagulação ou fração de polímero solúvel em água e um grupo amina da outra, ou uma ligação éster entre um grupo carboxil de um e um grupo hidroxil da outra. Outra ligação pela qual uma proteína de coagulação da invenção poderia ser conjugada a um composto de polímero solúvel em água é através de uma base de Schiff, entre um grupo amino livre na fração de polímero sendo reagido com um grupo aldeído formado na extremidade não redutora do polímero por oxidação com periodato (Jennings and Lugowski, J. Immunol. 1981; 127:1011-8; Femandes and Gregonradis, Biochim Biophys Acta. 1997; 1341; 26- 34). A Base de Schiff gerada pode ser estabilizada por redução específica com NaCNBH3 para formar uma amina secundária. Uma abordagem alternativa é a geração de grupos amino livres terminais no polímero por aminação redutiva com NH4Cl após oxidação prévia. Reagentes bifuncionais podem ser usados para ligar dois grupos amino ou dois grupos hidroxil. Por exemplo, um polímero contendo um grupo amino pode ser acoplado a um grupo amino da proteína de coagulação com reagentes como BS3 (Bis(sulfosuccinimidyl)suberate/Pierce, Rockford, Ill.). Além disso, reagentes de reticulação heterobifuncional como Sulfo-EMCS (N-epsilon-Maleimidocaproiloxi) sulfosuccinimida éster/Pierce) podem ser usados, por exemplo, para ligar grupos amina e tiol. Em outras modalidades, um grupo reativo de aldeído, como alcóxido de PEG mais dietil acetal de bromoacetaldeído; PEG mais DMSO e anidrido acético e cloreto de PEG mais o fenóxido de 4-hidroxibenzaldeído, ésteres ativos de succinimidil, ditiocarbonato ativado PEG, 2,4,5-triclorofenilcloroformato e P- nitrofenilcloroformato ativado PEG podem ser usados na conjugação de uma proteína de coagulação.

[0091] Em alguns aspectos, o rVWF usado nos métodos da presente invenção foi maturado in vitro com furina. Em outras modalidades, a furina é furina recombinante.

[0092] Em outros aspectos, o rVWF usado nos métodos da presente invenção é produzido por expressão em uma cultura de células de mamíferos usando métodos conhecidos na técnica. Em modalidades particulares, a cultura de mamífero compreende células CHO. Numa modalidade exemplificativa, o rVWF da invenção compreende a proteína rVWF isolada de um sistema de expressão de células CHO. Em uma outra modalidade, a remoção do pró- peptídeo é mediada in vitro através da exposição do pró-VWF à furina - em ainda uma outra modalidade, a Furina usada para a remoção do pró-peptídeo é a furina recombinante. Em ainda outra modalidade, os glicanos do grupo sanguíneo ABO/totalmente glicosilados estão ausentes.

[0093] Em ainda outras modalidades, o rVWF é usado em métodos e composições da presente invenção por expressão em um sistema hospedeiro eucariótico adequado. Exemplos de células eucarióticas incluem, sem limitação, células de mamíferos, tais como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep e HepG2;

células de inseto, por exemplo, células SF9, células SF21, células S2 e células High Five; e células de levedura, por exemplo, células Saccharomyces ou Schizosaccharomyces. Em uma modalidade, o VWF pode ser expresso em células de levedura, células de inseto, células aviárias, células de mamífero e semelhantes. Por exemplo, em uma linhagem celular humana, uma linhagem celular de hamster ou uma linhagem celular murina. Em uma modalidade particular, a linhagem celular é uma linhagem celular CHO, BHK ou HEK. Tipicamente, células de mamíferos, por exemplo, células CHO de uma linhagem celular contínua, podem ser usadas para expressar o VWF da presente invenção.

[0094] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica para VWF pode ser um vetor. O vetor pode ser distribuído por um vírus ou pode ser um plasmídeo. A sequência de ácido nucleico que codifica a proteína pode ser um gene específico ou uma parte biologicamente funcional do mesmo. Em uma modalidade, a proteína é pelo menos uma parte biologicamente ativa do VWF. Uma grande variedade de vetores pode ser usada para a expressão do VWF e pode ser selecionada a partir de vetores de expressão eucarióticos. Exemplos de vetores para expressão eucariótica incluem: (i) para expressão em levedura, vetores como pAO, pPIC, pYES, pMET, usando promotores como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc; (ii) para expressão em células de inseto, vetores como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., usando promotores como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc., e (iii) para expressão em células de mamíferos, vetores como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., e vetores derivados de sistemas virais, como vírus vaccinia, vírus adenoassociados, vírus herpes, retrovírus, etc., usando promotores como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV e β-actina.

[0095] Em algumas modalidades da presente invenção, a sequência de ácido nucleico pode compreender ainda outras sequências adequadas para uma expressão controlada de uma proteína, como sequências promotoras, intensificadores, caixas TATA, sítios de iniciação da transcrição, poli-ligantes, sítios de restrição, sequências poli-A, sequências de processamento de proteínas, marcadores de seleção e semelhantes que são geralmente conhecidos por um versado na técnica.

[0096] Em certas modalidades, os métodos de cultura de células da invenção podem compreender utilizar um microtransportador. Em algumas modalidades, as culturas de células das modalidades podem ser realizadas em grandes biorreatores sob condições adequadas para fornecer áreas de superfície de cultura de alto volume específico para atingir altas densidades celulares e expressão de proteína. Um meio para fornecer tais condições de crescimento é usar microtransportadores para cultura de células em biorreatores de tanque agitado. O conceito de crescimento celular em microtransportadores foi descrito pela primeira vez por van Wezel (van Wezel, A. L., Nature 216:64-5 (1967)) e permite a fixação de células na superfície de pequenas partículas sólidas suspensas no meio de crescimento. Esses métodos fornecem altas razões de superfície para volume e, portanto, permitem a utilização eficiente de nutrientes. Além disso, para a expressão de proteínas segregadas em linhas de células eucarióticas, a razão superfície-volume aumentada permite níveis mais elevados de secreção e, portanto, rendimentos de proteína mais elevados no sobrenadante da cultura. Finalmente, esses métodos permitem o fácil aumento de escala de culturas de expressão eucariótica.

[0097] As células que expressam VWF podem ser ligadas a um microtransportador esférico ou poroso durante o crescimento da cultura de células. O microtransportador pode ser um microtransportador selecionado do grupo de microtransportadores com base em dextrano, colágeno, plástico, gelatina e celulose e outros, conforme descrito em Butler (1988. In: Spier &

Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). Também é possível fazer crescer as células até uma biomassa em microtransportadores esféricos e fazer a subcultura das células quando elas atingirem a biomassa do fermentador final e antes da produção da proteína expressa em um microtransportador poroso ou vice-versa. Microtransportadores esféricos adequados podem incluir microtransportadores de superfície lisa, como Cytodex™ 1, Cytodex™ 2, e Cytode™ 3 (GE Healthcare) e microtransportadores macroporosos, como Cytopore™. 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1, e Cytoline™ 2 (GE Healthcare).

[0098] Em certas modalidades, o rVWF é expresso em células cultivadas em meio de cultura de células que produz rVWF de alto peso molecular. Os termos "solução de cultura de células", "meio ou meios de cultura de células" e "sobrenadante de cultura de células" referem-se a aspectos dos processos de cultura de células geralmente bem conhecidos na técnica. No contexto da presente invenção, uma solução de cultura de células pode incluir meios de cultura de células e sobrenadante de cultura de células. Os meios de cultura de células são adicionados externamente à solução de cultura de células, opcionalmente em conjunto com suplementos, para fornecer nutrientes e outros componentes para a cultura de células que expressam VWF. O sobrenadante de cultura de células refere-se a uma solução de cultura de células que compreende os nutrientes e outros componentes do meio de cultura de células, bem como produtos liberados, metabolizados e/ou excretados das células durante a cultura. Em outras modalidades, o meio pode ser livre de proteína animal e definido quimicamente. Métodos de preparação de meios de cultura sem proteína animal e quimicamente definidos são conhecidos na técnica, por exemplo, em US 2008/0009040 e US 2007/0212770, que são ambos incorporados aqui para todos os fins e em particular para todos ensinamentos relacionados aos meios de cultura de células. "Livre de proteínas" e termos relacionados referem-se a proteínas que são de uma fonte exógena para ou outra que não as células na cultura, que liberam proteínas naturalmente durante o crescimento. Em outra modalidade, o meio de cultura é livre de polipeptídeos. Em outra modalidade, o meio de cultura é isento de soro. Em outra modalidade, o meio de cultura é isento de proteína animal. Em outra modalidade, o meio de cultura é isento de componente animal. Em outra modalidade, o meio de cultura contém proteína, por exemplo, proteína animal de soro, tal como soro fetal de vitela. Em outra modalidade, a cultura possui proteínas recombinantes adicionadas exogenamente. Em outra modalidade, as proteínas são de um animal livre de patógenos certificado. O termo "definido quimicamente", conforme usado neste documento, significa que o meio não compreende quaisquer suplementos indefinidos, como, por exemplo, extratos de componentes animais, órgãos, glândulas, plantas ou leveduras. Consequentemente, cada componente de um meio quimicamente definido é definido com precisão. Numa modalidade preferida, os meios são isentos de componentes animais e isentos de proteínas.

[0099] Em outras modalidades, após a purificação de uma cultura de células de mamífero, o rFVIII é reconstituído antes da administração. Em ainda outras modalidades, o rVWF é tratado com furina antes ou após a reconstituição. Em outras modalidades, a furina é furina recombinante. Em ainda outras modalidades, o rVWF da invenção não é exposto a ADAMTS13, com o resultado de que ultralargos (isto é, compreendendo 10 ou mais subunidades) estão presentes nas composições de rVWF da invenção.

[00100] Em aspectos específicos, o rVWF usado nos métodos da presente invenção está contido em uma formulação contendo um tampão, um açúcar e/ou um álcool de açúcar (incluindo, sem limitação, trealose e manitol), um estabilizador (tal como glicina) e um tensoativo (tal como polissorbato 80). Em outras modalidades, para formulações contendo rFVIII, a formulação pode incluir ainda sódio, histidina, cálcio e glutationa.

[00101] Em um aspecto, as formulações que compreendem rVWF são liofilizadas antes da administração. A liofilização é realizada usando técnicas comuns na técnica e deve ser otimizada para a composição a ser desenvolvida [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200. (2004) and Chang et al., Pharm Res. 13:243- 9 (1996)].

[00102] Os métodos de preparação de formulações farmacêuticas podem incluir uma ou mais das seguintes etapas: adicionar um agente estabilizador, conforme descrito neste documento, à referida mistura antes da liofilização, adicionar pelo menos um agente selecionado de um agente de volume, um agente regulador da osmolaridade e um tensoativo, cada um dos quais como aqui descrito, à referida mistura antes da liofilização. Uma formulação liofilizada é, em um aspecto, pelo menos composta por um ou mais de um tampão, um agente de volume e um estabilizador. Nesse aspecto, a utilidade de um tensoativo é avaliada e selecionada nos casos em que a agregação durante a etapa de liofilização ou durante a reconstituição se torna um problema. Um agente tampão apropriado é incluído para manter a formulação dentro de zonas estáveis de pH durante a liofilização.

[00103] A prática de reconstituição padrão para material liofilizado é adicionar de volta um volume de água pura ou água estéril para injeção (WFI) (normalmente equivalente ao volume removido durante a liofilização), embora soluções diluídas de agentes antibacterianos sejam às vezes usadas na produção de produtos farmacêuticos para administração parenteral [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Consequentemente, são fornecidos métodos para a preparação de composições de VWF recombinantes reconstituídas compreendendo a etapa de adição de um diluente a uma composição de VWF recombinante liofilizada da invenção.

[00104] O material liofilizado pode ser reconstituído como uma solução aquosa. Uma variedade de transportadores aquosos, por exemplo, água estéril para injeção, água com conservantes para uso em doses múltiplas ou água com quantidades adequadas de tensoativos (por exemplo, uma suspensão aquosa que contém o composto ativo em mistura com excipientes adequados para a fabricação de suspensões). Em vários aspectos, tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo e sem limitação, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentes dispersantes ou umectantes são um fosfatídeo de ocorrência natural, por exemplo e sem limitação, lecitina ou produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo e sem limitação, estearato de polioxietileno ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo e sem limitação, heptadecaetileneoxicetanol ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e um hexitol, como mono-oleato de polioxietileno sorbitol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo e sem limitação, mono-oleato de polietileno sorbitano. Em vários aspectos, as suspensões aquosas também contêm um ou mais conservantes, por exemplo e sem limitação, etil, ou n-propil, p- hidroxibenzoato.

[00105] Em certas modalidades, as composições da presente invenção são formulações líquidas para administração com o uso de uma seringa ou outro recipiente de armazenamento. Em outras modalidades, essas formulações líquidas são produzidas a partir de material liofilizado aqui descrito reconstituído como uma solução aquosa.

[00106] Em um aspecto adicional, as composições da invenção compreendem ainda um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis. As frases "farmaceuticamente" ou "farmacologicamente" aceitáveis referem-se a entidades moleculares e composições que são estáveis, inibem a degradação de proteínas, como produtos de agregação e clivagem e, além disso, não produzem reações alérgicas ou outras reações adversas quando administradas por vias bem conhecidas em na técnica conforme descrito abaixo. "Transportadores farmaceuticamente aceitáveis" incluem todos e quaisquer solventes clinicamente úteis, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção e semelhantes, incluindo os agentes divulgados acima. II. PRODUÇÃO DE VWF RECOMBINANTE

[00107] O Fator de von Willebrand (rVWF) recombinante maduro livre da presente invenção pode ser produzido de forma recombinante. Um versado na técnica reconhece métodos úteis para expressar uma proteína recombinante em uma célula hospedeira. Em alguns casos, o método inclui a expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica rVWF em uma célula hospedeira, como uma célula CHO, e a cultura da célula hospedeira resultante sob certas condições para produzir rVWF, pré-pró-VWF, pró-VWF e semelhantes.

[00108] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica para VWF pode ser um vetor de expressão. O vetor pode ser distribuído por um vírus ou pode ser um plasmídeo. A sequência de ácido nucleico que codifica a proteína pode ser um gene específico ou uma parte biologicamente funcional do mesmo. Em uma modalidade, a proteína é pelo menos uma parte biologicamente ativa do VWF. A sequência de ácido nucleico pode compreender ainda outras sequências adequadas para uma expressão controlada de uma proteína, como sequências promotoras, intensificadores, caixas TATA, sítios de iniciação da transcrição, poli- ligantes, sítios de restrição, sequências poli-A, sequências de processamento de proteínas, marcadores de seleção e semelhantes que são geralmente conhecidos por um versado na técnica.

[00109] Uma grande variedade de vetores pode ser usada para a expressão do VWF e pode ser selecionada a partir de vetores de expressão eucarióticos. Exemplos de vetores para expressão eucariótica incluem: (i) para expressão em levedura, vetores como pAO, pPIC, pYES, pMET, usando promotores como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc; (ii) para expressão em células de inseto, vetores como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., usando promotores como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc., e (iii) para expressão em células de mamíferos, vetores como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., e vetores derivados de sistemas virais, como vírus vaccinia, vírus adeno-associados, vírus herpes, retrovírus, etc., usando promotores como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV e β-actina.

[00110] Em alguns aspectos, o rVWF usado nos métodos da presente invenção é produzido por expressão em uma cultura de células de mamíferos usando métodos conhecidos na técnica. Em modalidades particulares, a cultura de mamífero compreende células CHO. Em outras modalidades, o rVWF é coexpresso com Fator VIII recombinante (rFVIII) na mesma cultura. Em tais modalidades, o rVWF e o rFVIII são purificados juntos (copurificados) ou separadamente usando métodos conhecidos na técnica. Em outras modalidades, o rVWF é expresso em uma cultura que não contém rFVIII.

[00111] Em algumas modalidades, o rVWF é expresso e isolado de um sistema hospedeiro eucariótico adequado. Exemplos de células eucarióticas incluem, sem limitação, células de mamíferos, tais como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep e HepG2; células de inseto, por exemplo, células SF9, células SF21,

células S2 e células High Five; e células de levedura, por exemplo, células Saccharomyces ou Schizosaccharomyces. Em uma modalidade, o VWF pode ser expresso em células de levedura, células de inseto, células aviárias, células de mamífero e semelhantes. Por exemplo, em uma linhagem celular humana, uma linhagem celular de hamster ou uma linhagem celular murina. Em uma modalidade particular, a linhagem celular é uma linhagem celular CHO, BHK ou HEK. Tipicamente, células de mamíferos, por exemplo, células CHO de uma linhagem celular contínua, podem ser usadas para expressar o VWF da presente invenção. Em certos casos, a proteína VWF é expressa e isolada de um sistema de expressão de células CHO.

[00112] O VWF pode ser produzido em um sistema de cultura de células ou de acordo com qualquer método de cultura de células reconhecido por aqueles na técnica. Em algumas modalidades, as culturas de células podem ser realizadas em grandes biorreatores sob condições adequadas para fornecer áreas de superfície de cultura de alto volume específico para atingir altas densidades celulares e expressão de proteína. Um meio para fornecer tais condições de crescimento é usar microtransportadores para cultura de células em biorreatores de tanque agitado. O conceito de crescimento celular em microtransportadores foi descrito pela primeira vez por van Wezel (van Wezel, A.L., Nature, 1967, 216: 64-5) e permite a fixação de células na superfície de pequenas partículas sólidas suspensas no meio de crescimento. Esses métodos fornecem altas razões de superfície para volume e, portanto, permitem a utilização eficiente de nutrientes. Além disso, para a expressão de proteínas segregadas em linhas de células eucarióticas, a razão superfície-volume aumentada permite níveis mais elevados de secreção e, portanto, rendimentos de proteína mais elevados no sobrenadante da cultura. Finalmente, esses métodos permitem o fácil aumento de escala de culturas de expressão eucariótica.

[00113] As células que expressam VWF podem ser ligadas a um microtransportador esférico ou poroso durante o crescimento da cultura de células. O microtransportador pode ser um microtransportador selecionado do grupo de microtransportadores com base em dextrano, colágeno, plástico, gelatina e celulose e outros, conforme descrito em Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). Também é possível fazer crescer as células até uma biomassa em microtransportadores esféricos e fazer a subcultura das células quando elas atingirem a biomassa do fermentador final e antes da produção da proteína expressa em um microtransportador poroso ou vice-versa. Microtransportadores esféricos adequados podem incluir microtransportadores de superfície lisa, como Cytodex™ 1, Cytodex™ 2 e Cytodex™ 3 (GE Healthcare) e microtransportadores macroporosos, como Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1 e Cytoline™ 2 (GE Healthcare).

[00114] Em uma outra modalidade, o pró-peptídeo de VWF é clivado do VWF não maduro in vitro por meio da exposição do pró-VWF à furina. Em algumas modalidades, a furina usada para clivagem de pró-peptídeo é furina recombinante.

[00115] Em certas modalidades, o rVWF é expresso em células cultivadas em meio de cultura de células que produz rVWF de alto peso molecular. Os termos "solução de cultura de células", "meio ou meios de cultura de células" e "sobrenadante de cultura de células" referem-se a aspectos dos processos de cultura de células geralmente bem conhecidos na técnica. No contexto da presente invenção, uma solução de cultura de células pode incluir meios de cultura de células e sobrenadante de cultura de células. Os meios de cultura de células são adicionados externamente à solução de cultura de células, opcionalmente em conjunto com suplementos, para fornecer nutrientes e outros componentes para a cultura de células que expressam VWF. O sobrenadante de cultura de células refere-se a uma solução de cultura de células que compreende os nutrientes e outros componentes do meio de cultura de células, bem como produtos liberados, metabolizados e/ou excretados das células durante a cultura. Em outras modalidades, o meio pode ser livre de proteína animal e definido quimicamente. Métodos de preparação de meios de cultura sem proteína animal e quimicamente definidos são conhecidos na técnica, por exemplo, em US 2006/0094104, US 2007/0212770 e US 2008/0009040, que são ambos incorporados aqui para todos os fins e em particular para todos ensinamentos relacionados aos meios de cultura de células. "Livre de proteínas" e termos relacionados referem-se a proteínas que são de uma fonte exógena para ou outra que não as células na cultura, que liberam proteínas naturalmente durante o crescimento. Em outra modalidade, o meio de cultura é livre de polipeptídeos. Em outra modalidade, o meio de cultura é isento de soro. Em outra modalidade, o meio de cultura é isento de proteína animal. Em outra modalidade, o meio de cultura é isento de componente animal. Em outra modalidade, o meio de cultura contém proteína, por exemplo, proteína animal de soro, tal como soro fetal de vitela. Em outra modalidade, a cultura possui proteínas recombinantes adicionadas exogenamente. Em outra modalidade, as proteínas são de um animal livre de patógenos certificado. O termo "definido quimicamente", conforme usado neste documento, significa que o meio não compreende quaisquer suplementos indefinidos, como, por exemplo, extratos de componentes animais, órgãos, glândulas, plantas ou leveduras. Consequentemente, cada componente de um meio quimicamente definido é definido com precisão. Numa modalidade preferida, os meios são isentos de componentes animais e isentos de proteínas.

[00116] Em certas modalidades, a cultura de células que expressam VWF pode ser mantida por pelo menos cerca de 7 dias, ou pelo menos cerca de 14 dias, 21 dias, 28 dias ou pelo menos cerca de 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas ou pelo menos cerca de 2 meses ou 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. A densidade celular na qual uma cultura de células é mantida para a produção de uma proteína VWF recombinante dependerá das condições de cultura e do meio usado para a expressão da proteína. Um versado na técnica será facilmente capaz de determinar a densidade celular ideal para uma cultura de células que produz um VWF. Em uma modalidade, a cultura é mantida a uma densidade celular entre cerca de 0,5x106 e 4x107 células/ml por um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, a densidade celular é mantida a uma concentração entre cerca de 1,0x106 e cerca de 1,0x107 células/ml por um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, a densidade celular é mantida a uma concentração entre cerca de 1,0x106 e cerca de 4,0x106 células/ml por um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, a densidade celular é mantida a uma concentração entre cerca de 1,0x106 e cerca de 4,0x106 células/ml por um período de tempo prolongado. Em ainda outras modalidades, a densidade celular pode ser mantida a uma concentração entre cerca de 2,0x106 e cerca de 4,0x106, ou entre cerca de 1,0x106 e cerca de 2,5x106, ou entre cerca de 1,5x106 e cerca de 3,5x106, ou qualquer outra faixa semelhante, por um período de tempo prolongado. Após um tempo apropriado em cultura de células, o rVWF pode ser isolado do sistema de expressão usando métodos conhecidos na técnica.

[00117] Em uma modalidade específica, a densidade celular da cultura de células contínua para a produção de rVWF é mantida a uma concentração não superior a 2,5x106 células/mL por um período de tempo prolongado. Em outras modalidades específicas, a densidade celular é mantida em não superior a 2,0x106 células/mL, 1,5x106 células/mL, 1,0x106 células/mL, 0,5x106 células/mL,

ou menos. Em uma modalidade, a densidade celular é mantida entre 1,5x10 6 células/mL e 2,5x106 células/mL.

[00118] Em uma modalidade das culturas de células descritas acima, a solução de cultura de células compreende um suplemento de meio que compreende cobre. Tais soluções de cultura de células são descritas, por exemplo, na Patente U.S. 8.852.888 e Patente U.S. 9.409.971, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins e em particular para todos os ensinamentos relacionados a métodos de cultura de células e composições para a produção de VWF recombinante.

[00119] As sequências polinucleotídicas e de aminoácidos de pré-pró-VWF são apresentadas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente, e estão disponíveis nos Números de Acessão do GenBank. NM_000552 (mRNA do fator Homo sapiens von Willebrand (VWF)) e NP_000543, respectivamente. A sequência de aminoácidos correspondente à proteína VWF madura é apresentada na SEQ ID NO: 3 (correspondendo aos aminoácidos 764-2813 da sequência de aminoácidos pré-pró-VWF de comprimento total). Em algumas modalidades, o VWF exibe pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:

3. Em algumas modalidades, o rVWF da invenção exibe pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 3. Ver, por exemplo, Patente U.S. 8.597.910, Publicação de Patente U.S. 2016/0129090, bem como FIGS. 5A-5C, 6A-6J e 7A- 7G.

[00120] Uma forma de rVWF útil tem pelo menos a propriedade de estabilização in vivo, por exemplo, ligação, de pelo menos uma molécula de Fator

VIII (FVIII) e tendo opcionalmente um padrão de glicosilação que é farmacologicamente aceitável. Exemplos específicos dos mesmos incluem VWF sem o domínio A2, portanto resistente à proteólise (Lankhof et al., Thromb. Haemost. 77:1008-1013, 1997), e um fragmento VWF de Val 449 a Asn 730 incluindo o domínio de ligação Ib da glicoproteína e sítios de ligação para colágeno e heparina (Pietu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339- 1347, 1989). A determinação da capacidade de um VWF para estabilizar pelo menos uma molécula de FVIII é, em um aspecto, realizada em mamíferos com deficiência de VWF de acordo com métodos conhecidos no estado da técnica.

[00121] O rVWF da presente invenção pode ser produzido por qualquer método conhecido na técnica. Um exemplo específico é divulgado em WO86/06096 publicado em 23 de outubro de 1986 e no Pedido de Patente U.S. 07/559.509, depositado em 23 de julho de 1990, que é aqui incorporado por referência em relação aos métodos de produção de VWF recombinante. Assim, os métodos são conhecidos na técnica por (i) produzir DNA recombinante por engenharia genética, por exemplo, via transcrição reversa de RNA e/ou amplificação de DNA, (ii) introduzir DNA recombinante em células procarióticas ou eucarióticas por transfecção, por exemplo, por eletroporação ou microinjeção, (iii) cultivar as células transformadas, por exemplo, de maneira contínua ou descontínua, (iv) expressar VWF, por exemplo, constitutivamente ou por indução, e (v) isolar o VWF, por exemplo, do meio de cultura ou pela colheita do transformado células, a fim de (vi) obter rVWF purificado, por exemplo, por meio de cromatografia de troca aniônica ou cromatografia de afinidade. Um VWF recombinante é, em um aspecto, feito em células hospedeiras transformadas usando técnicas de DNA recombinante bem conhecidas na técnica. Por exemplo, as sequências que codificam para o polipeptídeo podem ser excisadas do DNA utilizando enzimas de restrição adequadas.

Alternativamente, a molécula de DNA é, em outro aspecto, sintetizada usando técnicas de síntese química, como o método do fosforamidato. Além disso, em ainda outro aspecto, uma combinação dessas técnicas é usada.

[00122] A invenção também fornece vetores que codificam polipeptídeos da invenção em um hospedeiro apropriado. O vetor compreende o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo operacionalmente ligado a sequências de controle de expressão apropriadas. Os métodos para efetuar esta ligação operativa, antes ou depois do polinucleotídeo ser inserido no vetor, são bem conhecidos. As sequências de controle de expressão incluem promotores, ativadores, intensificadores, operadores, sítios de ligação ribossômica, sinais de início, sinais de parada, sinais de cap, sinais de poliadenilação e outros sinais envolvidos com o controle de transcrição ou tradução. O vetor resultante com o polinucleotídeo é utilizado para transformar um hospedeiro apropriado. Esta transformação pode ser realizada usando métodos bem conhecidos na técnica.

[00123] Qualquer uma de um grande número de células hospedeiras disponíveis e bem conhecidas são utilizadas na prática desta invenção. A seleção de um hospedeiro específico depende de uma série de fatores reconhecidos pela técnica, incluindo, por exemplo, compatibilidade com o vetor de expressão escolhido, toxicidade dos peptídeos codificados pela molécula de DNA, taxa de transformação, facilidade de recuperação dos peptídeos, características de expressão, biossegurança e custos. Um equilíbrio desses fatores deve ser alcançado com a compreensão de que nem todas as células hospedeiras são igualmente eficazes para a expressão de uma sequência de DNA particular. Dentro dessas diretrizes gerais, células hospedeiras microbianas úteis incluem, sem limitação, bactérias, leveduras e outros fungos, insetos, plantas, células de mamíferos (incluindo humanos) em cultura ou outros hospedeiros conhecidos na técnica.

[00124] As células hospedeiras transformadas são cultivadas em condições de fermentação convencionais de modo que os compostos desejados sejam expressos. Tais condições de fermentação são bem conhecidas na técnica. Finalmente, os polipeptídeos são purificados a partir do meio de cultura ou das próprias células hospedeiras por métodos bem conhecidos na técnica.

[00125] Dependendo da célula hospedeira utilizada para expressar um composto da invenção, grupos de carboidratos (oligossacarídeos) são opcionalmente ligados a sítios que são conhecidos como sítios de glicosilação em proteínas. Geralmente, os oligossacarídeos ligados a O são ligados a resíduos de serina (Ser) ou treonina (Thr), enquanto os oligossacarídeos ligados a N são ligados a resíduos de asparagina (Asn) quando fazem parte da sequência Asn-X- Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto prolina. X é de preferência um dos 19 aminoácidos de ocorrência natural sem contar a prolina. As estruturas de oligossacarídeos ligados a N e ligados a O e os resíduos de açúcar encontrados em cada tipo são diferentes. Um tipo de açúcar comumente encontrado em oligossacarídeos ligados a N e ligados a O é o ácido N-acetilneuramínico (conhecido como ácido siálico). O ácido siálico é normalmente o resíduo terminal de ambos os oligossacarídeos ligados a N e ligados a O e, em virtude de sua carga negativa, em um aspecto, confere propriedades ácidas ao composto glicosilado. Tal(is) sítio(s) pode(m) ser incorporados no ligante dos compostos desta invenção e são preferencialmente glicosilados por uma célula durante a produção recombinante dos compostos polipeptídicos (por exemplo, em células de mamíferos, tais como CHO, BHK, COS). Em outros aspectos, tais sítios são glicosilados por procedimentos sintéticos ou semissintéticos conhecidos na técnica.

[00126] Em algumas modalidades, a sialização (também referida como sialilação) pode ser realizada na coluna como parte dos procedimentos de purificação descritos neste documento (incluindo a troca aniônica, troca catiônica, exclusão de tamanho e/ou métodos de imunoafinidade). Em algumas modalidades, a sialilação resulta em estabilidade aumentada do rVWF em comparação com rVWF que não sofreu sialilação.

Em algumas modalidades, a sialilação resulta em estabilidade aumentada do rVWF na circulação sanguínea (por exemplo, após a administração a um sujeito) em comparação com rVWF que não sofreu sialilação.

Em algumas modalidades, a estabilidade aumentada de rVWF salivado resulta em um aumento de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação com rVWF que não sofreu sialilação.

Em algumas modalidades, a sialilação resulta em meia-vida aumentada do rVWF em comparação com rVWF que não sofreu sialilação.

Em algumas modalidades, a sialilação resulta em meia-vida aumentada do rVWF na circulação sanguínea (por exemplo, após a administração a um sujeito) em comparação com rVWF que não sofreu sialilação.

Em algumas modalidades, a meia-vida aumentada de rVWF sialilado resulta em um aumento de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação com rVWF que não sofreu sialilação.

Em algumas modalidades, a meia-vida aumentada de rVWF sialilado resulta em rVWF que é estável por 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas ou mais na circulação sanguínea (por exemplo, após a administração a um sujeito) em comparação com rVWF que não sofreu sialilação.

Em algumas modalidades, a sialilação aumenta o número de sialilação 2,3 e/ou sialilação 2,6. Em algumas modalidades, a sialilação é aumentada pela adição de 2,3 sialiltransferase e/ou 2,6 sialiltransferase e CMP-NANA (sal de sódio do ácido citidina-5'-monofosfo-N- acetilneuramínico) como uma etapa tampão adicional.

Em algumas modalidades, a sialilação é aumentada pela adição de 2,3 sialiltransferase e CMP-NANA (sal de sódio do ácido citidina-5′-monofosfo-N-acetilneuramínico) como uma etapa tampão adicional.

Em algumas modalidades, a sialilação 2,3 é aumentada pela adição de 2,3 sialiltransferase e CMP-NANA (sal de sódio do ácido citidina-5'-monofosfo-N-acetilneuramínico) como uma etapa tampão adicional.

[00127] Em algumas modalidades, a sialilação 2,6 é aumentada pela adição de 2,6 sialiltransferase e CMP-NANA (sal de sódio do ácido citidina-5'- monofosfo-N-acetilneuramínico) como uma etapa tampão adicional. Em algumas modalidades, a sialilação 2,3 e/ou a sialilação 2,6 são aumentadas pela adição de 2,3 sialiltransferase e/ou 2,6 sialiltransferase e CMP-NANA (sal de sódio do ácido citidina-5'-monofosfo-N-acetilneuramínico) como uma etapa tampão adicional. Em algumas modalidades, CMP-NANA é quimicamente ou enzimaticamente modificado para transferir ácido siálico modificado para a posição livre potencial. Em algumas modalidades, a sialilação é realizada carregando rVWF na resina, lavando com um ou mais tampões como aqui descrito para esgotar impurezas indesejadas, aplicar um ou mais tampões contendo sialiltransferase e CMP-NANA em condições que permitem sialilação adicional e lavar com um ou mais tampões para esgotar o excesso dos reagentes de sialilação e eluir com um ou mais tampões o rVWF intensificado (por exemplo, o rVWF com sialilação aumentada). Em algumas modalidades, o processo de sialilação é realizado como parte de um método de troca catiônica, um método de troca aniônica, um método de exclusão de tamanho ou um método de purificação de imunoafinidade, conforme descrito neste documento.

[00128] Alternativamente, os compostos são preparados por métodos sintéticos usando, por exemplo, técnicas de síntese em fase sólida. As técnicas adequadas são bem conhecidas na técnica e incluem as descritas em Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; Pat. U.S.

3.941.763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; and Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527. A síntese em fase sólida é a técnica preferida de produção de peptídeos individuais, uma vez que é o método mais econômico de produção de pequenos peptídeos

[00129] Fragmentos, variantes e análogos de VWF podem ser produzidos de acordo com métodos que são bem conhecidos na técnica. Fragmentos de um polipeptídeo podem ser preparados usando, sem limitação, clivagem enzimática (por exemplo, tripsina, quimotripsina) e também usando meios recombinantes para gerar fragmentos de polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos específica. Fragmentos de polipeptídeo podem ser gerados compreendendo uma região da proteína com uma atividade particular, tal como um domínio de multimerização ou qualquer outro domínio VWF identificável conhecido na técnica.

[00130] Os métodos de preparação de análogos de polipeptídeos também são bem conhecidos. Os análogos da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo podem ser análogos de substituição, inserção, adição ou deleção. Análogos de deleção, incluindo fragmentos de um polipeptídeo, não possuem um ou mais resíduos da proteína nativa que não são essenciais para a função ou atividade imunogênica. Os análogos de inserção envolvem a adição de, por exemplo, aminoácido(s) em um ponto não terminal no polipeptídeo. Este análogo pode incluir, por exemplo e sem limitação, a inserção de um epítopo imunorreativo ou simplesmente um único resíduo. Análogos de adição, incluindo fragmentos de um polipeptídeo, incluem a adição de um ou mais aminoácidos em um ou ambos os terminais de uma proteína e incluem, por exemplo, proteínas de fusão. Combinações dos análogos acima mencionados também são contempladas.

[00131] Os análogos de substituição trocam tipicamente um aminoácido do tipo selvagem por outro em um ou mais sítios dentro da proteína e podem ser concebidos para modular uma ou mais propriedades do polipeptídeo sem a perda completa de outras funções ou propriedades. Em um aspecto, as substituições são substituições conservativas. "Substituição conservativa de aminoácidos" é a substituição de um aminoácido por um aminoácido com uma cadeia lateral ou um caráter químico semelhante. Aminoácidos semelhantes para fazer substituições conservativas incluem aqueles que possuem uma cadeia lateral acídica (ácido glutâmico, ácido aspártico); uma cadeia lateral básica (arginina, lisina, histidina); uma cadeia lateral de amida polar (glutamina, asparagina); uma cadeia lateral alifática hidrofóbica (leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina); uma cadeia lateral aromática (fenilalanina, triptofano, tirosina); uma pequena cadeia lateral (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); ou uma cadeia lateral de hidroxil alifática (serina, treonina).

[00132] Em um aspecto, os análogos são substancialmente homólogos ou substancialmente idênticos ao VWF recombinante do qual são derivados. Análogos incluem aqueles que retêm pelo menos parte da atividade biológica do polipeptídeo de tipo selvagem, por exemplo, atividade de coagulação do sangue.

[00133] Variantes de polipeptídeos contemplados incluem, sem limitação, polipeptídeos quimicamente modificados por técnicas como ubiquitinação, glicosilação, incluindo polissialação (ou polissialilação), conjugação a agentes terapêuticos ou de diagnóstico, marcação, ligação de polímero covalente, como peguilação (derivatização com polietilenoglicol), introdução de ligações não hidrolisáveis e inserção ou substituição por síntese química de aminoácidos como a ornitina, que normalmente não ocorrem em proteínas humanas. As variantes retêm as mesmas ou essencialmente as mesmas propriedades de ligação das moléculas não modificadas da invenção. Tal modificação química pode incluir a ligação direta ou indireta (por exemplo, por meio de um ligante)

de um agente ao polipeptídeo VWF. No caso de ligação indireta, é contemplado que o ligante pode ser hidrolisável ou não hidrolisável.

[00134] A preparação de análogos polipeptídicos peguilados irá, em um aspecto, compreender as etapas de (a) reagir polipeptídeo com polietileno glicol (tal como um éster reativo ou derivado aldeído de PEG) sob condições em que o construto de ligação polipeptídico se torna ligado a um ou mais grupos PEG, e (b) obter o(s) produto(s) da reação. Em geral, as condições de reação ideais para as reações de acilação são determinadas com base em parâmetros conhecidos e no resultado desejado. Por exemplo, quanto maior for a razão de PEG: proteína, maior será a porcentagem de produto poli-peguilado. Em algumas modalidades, o construto de ligação tem uma única fração PEG no terminal N. O polietileno glicol (PEG) pode ser ligado ao fator de coagulação do sangue para, por exemplo, fornecer uma meia-vida mais longa in vivo. O grupo PEG pode ter qualquer peso molecular conveniente e é linear ou ramificado. O peso molecular médio do PEG varia de cerca de 2 kiloDalton ("kD") a cerca de 100 kDa, de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, ou de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa. Em certos aspectos, os grupos PEG são ligados ao fator de coagulação do sangue por meio de acilação ou alquilação redutiva através de um grupo reativo natural ou engenheirado na fração PEG (por exemplo, um grupo aldeído, amino, tiol ou éster) a um grupo reativo no fator de coagulação do sangue (por exemplo, um grupo aldeído, amino ou éster) ou por qualquer outra técnica conhecida na técnica.

[00135] Métodos para preparar polipeptídeo polissialilado são descritos na Publicação de Patente dos Estados Unidos 20060160948, Fernandes et Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341: 26-34, 1997, and Saenko et al., Haemophilia 12:42-51, 2006. Resumidamente, uma solução de ácido colomínico (CA) contendo NaIO4 0,1 M é agitada no escuro à temperatura ambiente para oxidar o CA. A solução de CA ativada é dialisada contra, por exemplo, tampão de fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,2 no escuro e esta solução foi adicionada a uma solução de rVWF e incubada por 18 h em temperatura ambiente no escuro sob agitação suave. Os reagentes livres são opcionalmente separados do conjugado rVWF-ácido polissiálico por, por exemplo, ultrafiltração/diafiltração. A conjugação de rVWF com ácido polissiálico é obtida usando glutaraldeído como reagente de reticulação (Migneault et al., Biotechniques 37: 790-796, 2004).

[00136] Também é contemplado em outro aspecto que os polipeptídeos pré-pró-VWF e pró-VWF fornecerão um benefício terapêutico nas formulações da presente invenção. Por exemplo, a Patente U.S. 7.005.502 descreve uma preparação farmacêutica compreendendo quantidades substanciais de pró-VWF que induz a geração de trombina in vitro. Além de fragmentos recombinantes, biologicamente ativos, variantes ou outros análogos do VWF maduro de ocorrência natural, a presente invenção contempla o uso de fragmentos, variantes ou análogos biologicamente ativos recombinantes do pré-pró-VWF (estabelecido em SEQ ID NO : 2) ou polipeptídeos pró-VWF (resíduos de aminoácidos 23 a 764 de SEQ ID NO: 2) ou rVWF (estabelecido em SEQ ID NO:3) nas formulações aqui descritas.

[00137] Os polinucleotídeos que codificam fragmentos, variantes e análogos podem ser facilmente gerados por um versado para codificar fragmentos biologicamente ativos, variantes ou análogos da molécula de ocorrência natural que possuem a mesma atividade biológica ou semelhante à da molécula de ocorrência natural. Em vários aspectos, estes polinucleotídeos são preparados usando técnicas de PCR, digestão/ligação da molécula que codifica o DNA e semelhantes. Assim, um versado na técnica será capaz de gerar alterações de base única na fita de DNA para resultar em um códon alterado e uma mutação missense, usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não se limitando a mutagênese específica do sítio. Como utilizado neste documento, a frase "condições de hibridização moderadamente rigorosas" significa, por exemplo, hibridização a 42 ºC em 50% de formamida e lavagem a 60 ºC em 0,1 x SSC, 0,1% de SDS. É entendido por aqueles versados na técnica que a variação nestas condições ocorre com base no comprimento e no conteúdo de base de nucleotídeo GC das sequências a serem hibridadas. As fórmulas padrão na técnica são apropriadas para determinar as condições exatas de hibridação. Ver Sambrook et al., 9.47-9.51 in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). A. VWF MULTÍMEROS

[00138] A avaliação do número e da porcentagem de multímeros rVWF pode ser conduzida usando métodos conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, métodos usando eletroforese e métodos de cromatografia de exclusão de tamanho para separar multímeros de VWF por tamanho, por exemplo, conforme discutido por Cumming et al., (J Clin Pathol., 1993 May; 46(5): 470-473, que é incorporado por meio deste por referência em sua totalidade para todos os fins e em particular para todos os ensinamentos relacionados à avaliação de multímeros VWF). Essas técnicas podem incluir ainda técnicas de imunotransferência (como Western Blot), em que o gel é imunotransferido com um anticorpo radiomarcado contra VWF seguido por detecção quimioluminescente (ver, por exemplo, Wen et al., J. Clin. Lab. Anal., 1993, 7:317-323, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins e em particular para todos os ensinamentos relacionados à avaliação de multímeros de VWF). Outros ensaios para VWF incluem VWF:Antígeno (VWF:Ag), VWF:Cofator de Ristocetina (VWF:RCof) e VWF:Ensaio de Atividade de Ligação de Colágeno (VWF:CBA), que são frequentemente usados para diagnóstico e classificação da Doença de Von Willebrand (ver, por exemplo, Favaloro et al., Pathology, 1997, 29(4): 341-456; Sadler, JE, Annu Rev

Biochem, 1998, 67:395-424; and Turecek et al., Semin Thromb Hemost, 2010, 36:510-521, que são incorporados neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins e, em particular, para todos os ensinamentos relacionados a ensaios para VWF). Em algumas modalidades, o rVWF obtido usando os presentes métodos inclui qualquer padrão de multímero presente na amostra de carregamento do rVWF. Em algumas modalidades, o rVWF obtido usando os presentes métodos inclui padrões de multímero de ocorrência fisiológica, bem como padrões de multímero de VWF ultralargo. B. ENSAIOS DE VWF

[00139] Na hemostasia primária, o VWF atua como uma ponte entre as plaquetas e componentes específicos da matriz extracelular, como o colágeno. A atividade biológica do VWF neste processo pode ser medida por diferentes ensaios in vitro (Turecek et al., Semin Thromb Hemost, 2010, 36: 510-521).

[00140] O ensaio VWF:Cofator de Ristocetina (VWF:RCo) é baseado na aglutinação de plaquetas frescas ou fixadas em formalina induzida pelo antibiótico ristocetina na presença de VWF. O grau de aglutinação de plaquetas depende da concentração de VWF e pode ser medido pelo método turbidimétrico, por exemplo, pelo uso de um agregômetro (Weiss et al., J. Clin. Invest., 1973, 52: 2708-2716; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh., 1975, 34: 306-308). Conforme fornecido neste documento, a atividade de cofator de ristocetina específica do VWF (VWF:RCo) da presente invenção é geralmente descrita em termos de mU/µg de VWF, conforme medido usando ensaios in vitro.

[00141] Em algumas modalidades, o rVWF purificado de acordo com os métodos da presente invenção tem uma atividade específica de pelo menos cerca de 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 32,5, 35, 37,5, 40, 42,5, 45, 47,5, 50, 52,5, 55, 57,5, 60, 62,5, 65, 67,5, 70, 72,5, 75, 77,5, 80, 82,5, 85, 87,5, 90, 92,5, 95, 97,5,

100, 105, 110, 1 15, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 ou mais mU/µg.

Em algumas modalidades, rVWF usado nos métodos descritos neste documento tem uma atividade específica de 20 mU/μg a 150 mU/μg.

Em algumas modalidades, o rVWF tem uma atividade específica de 30 mU/μg a 120 mU/μg.

Em algumas modalidades, o rVWF tem uma atividade específica de 40 mU/μg a 90 mU/μg.

Em algumas modalidades, o rVWF tem uma atividade específica selecionada das variações 1 a 133 encontradas na Tabela 3, abaixo.

Tabela 3. Modalidades exemplificativas para a atividade específica de rVWF encontradas nas composições e usadas nos métodos aqui fornecidos. (mU/µg) (mU/µg) (mU/µg) (mU/µg) 20 Var. 1 110 Var. 35 40-150 Var. 68 70-120 Var. 101 22,5 Var. 2 115 Var. 36 40-140 Var. 69 70-110 Var. 102 25 Var. 3 120 Var. 37 40-130 Var. 70 70-100 Var. 103 27,5 Var. 4 125 Var. 38 40-120 Var. 71 70-90 Var. 104 30 Var. 5 130 Var. 39 40-110 Var. 72 70-80 Var. 105 32,5 Var. 6 135 Var. 40 40-100 Var. 73 80-150 Var. 106 35 Var. 7 140 Var. 41 40-90 Var. 74 80-140 Var. 107 37,5 Var. 8 145 Var. 42 40-80 Var. 75 80-130 Var. 108 40 Var. 9 150 Var. 43 40-70 Var. 76 80-120 Var. 109 42,5 Var. 10 20-150 Var. 44 40-60 Var. 77 80-110 Var. 110 45 Var. 11 20-140 Var. 45 40-50 Var. 78 80-100 Var. 111 47,5 Var. 12 20-130 Var. 46 50-150 Var. 79 80-90 Var. 112 50 Var. 13 20-120 Var. 47 50-140 Var. 80 90-150 Var. 113 52,5 Var. 14 20-110 Var. 48 50-130 Var. 81 90-140 Var. 114 55 Var. 15 20-100 Var. 49 50-120 Var. 82 90-130 Var. 115 57,5 Var. 16 20-90 Var. 50 50-110 Var. 83 90-120 Var. 116 60 Var. 17 20-80 Var. 51 50-100 Var. 84 90-110 Var. 117 62,5 Var. 18 20-70 Var. 52 50-90 Var. 85 90-100 Var. 118 65 Var. 19 20-60 Var. 53 50-80 Var. 86 100-150 Var. 119

(mU/µg) (mU/µg) (mU/µg) (mU/µg) 67,5 Var. 20 20-50 Var. 54 50-70 Var. 87 100-140 Var. 120 70 Var. 21 20-40 Var. 55 50-60 Var. 88 100-130 Var. 121 72,5 Var. 22 30-150 Var. 56 60-150 Var. 89 100-120 Var. 122 75 Var. 23 30-140 Var. 57 60-140 Var. 90 100-110 Var. 123 77,5 Var. 24 30-130 Var. 58 60-130 Var. 91 110-150 Var. 124 80 Var. 25 30-120 Var. 59 60-120 Var. 92 110-140 Var. 125 82,5 Var. 26 30-110 Var. 60 60-110 Var. 93 110-130 Var. 126 85 Var. 27 30-100 Var. 61 60-100 Var. 94 110-120 Var. 127 87,5 Var. 28 30-90 Var. 62 60-90 Var. 95 120-150 Var. 128 90 Var. 29 30-80 Var. 63 60-80 Var. 96 120-140 Var. 129 92,5 Var. 30 30-70 Var. 64 60-70 Var. 97 120-130 Var. 130 95 Var. 31 30-60 Var. 65 70-150 Var. 98 130-150 Var. 131 97,5 Var. 32 30-50 Var. 66 70-140 Var. 99 130-140 Var. 132 100 Var. 33 30 - 40 Var. 67 70-130 Var. 100 140-150 Var. 133 105 Var. 34 Var. = Variação

[00142] O rVWF da presente invenção é altamente multimérico compreendendo cerca de 10 a cerca de 40 subunidades. Em outras modalidades, o rVWF multimérico produzido usando métodos da presente invenção compreende cerca de 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 subunidades. Em algumas modalidades, o rVWF está presente em multímeros que variam em tamanho de dímeros a multímeros de mais de 40 subunidades (> 10 milhões de Daltons). Os maiores multímeros fornecem múltiplos sítios de ligação que podem interagir com os receptores plaquetários e com os sítios de lesão da matriz subendotelial e são a forma mais hemostaticamente ativa de VWF. Em algumas modalidades, o rVWF da presente invenção compreende multímeros ultralargos (ULMs). Geralmente, multímeros altos e ultralargos são considerados hemostaticamente mais eficazes (ver, por exemplo, Turecek, P.,

Hämostaseologie, (Vol. 37): Supplement 1, páginas S15-S25 (2017)). Em algumas modalidades, o rVWF está entre 500 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, qualquer padrão de multímero desejado pode ser obtido usando os métodos descritos. Em algumas modalidades, quando métodos de troca de ânions e/ou trocadores de cátions são empregados, o pH, condutividade e/ou concentração de contra-íons dos tampões em uma ou mais etapas de lavagem ou os tampões em gradiente podem ser manipulados para obter o desejado padrão multímero. Em algumas modalidades, então, métodos de cromatografia de exclusão de tamanho são empregados, os critérios de coleta podem ser empregados para obter o padrão de multímero desejado. Em algumas modalidades, o padrão de multímero descrito compreende multímeros ultralargos. Em algumas modalidades, os multímeros ultralargos têm pelo menos

10.000 kDa, pelo menos 11.000 kDa, pelo menos 12.000 kDa, pelo menos 13.000 kDa, pelo menos 14.000 kDa, pelo menos 15.000 kDa, pelo menos 16.000 kDa, pelo menos 17.000 kDa, pelo menos 18.000 kDa, pelo menos 19.000 kDa, pelo menos 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultralargos estão entre cerca de 10.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultralargos estão entre cerca de 11.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultralargos estão entre cerca de 12.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultralargos estão entre cerca de 13.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultralargos estão entre cerca de 14.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultralargos estão entre cerca de 15.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultralargos estão entre cerca de 16.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultralargos estão entre cerca de 17.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultralargos estão entre cerca de 18.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultralargos estão entre cerca de 19.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, o rVWF obtido usando os presentes métodos inclui qualquer padrão de multímero presente na amostra de carregamento do rVWF. Em algumas modalidades, o rVWF obtido usando os presentes métodos inclui padrões de multímero de ocorrência fisiolócica, bem como padrões de multímero de VWF ultralargo.

[00143] Em algumas modalidades, a composição rVWF preparada pelo método de purificação aqui descrito tem uma distribuição de oligômeros de rVWF caracterizada por 95% dos oligômeros ter entre 6 subunidades e 20 subunidades. Em algumas modalidades, a composição rVWF tem uma distribuição de oligômeros rVWF caracterizada por 95% dos oligômeros ter uma faixa de subunidades selecionadas das variações 458 a 641 encontradas em 4. Tabela 4. Modalidades exemplificativas para a distribuição de oligômeros rVWF encontradas nas composições e usadas nos métodos aqui fornecidos. Subunidades Subunidades Subunidades Subunidades 2-40 Var. 458 6-16 Var. 504 12-20 Var. 550 20-28 Var. 596 2-38 Var. 459 6-14 Var. 505 12-18 Var. 551 20-26 Var. 597 2-36 Var. 460 6-12 Var. 506 12-16 Var. 552 20-24 Var. 598 2-34 Var. 461 6-10 Var. 507 12-14 Var. 553 20-22 Var. 599 2-32 Var. 462 6-8 Var. 508 14-40 Var. 554 22-40 Var. 600 2-30 Var. 463 8-40 Var. 509 14-38 Var. 555 22-38 Var. 601 2-28 Var. 464 8-38 Var. 510 14-36 Var. 556 22-36 Var. 602 2-26 Var. 465 8-36 Var. 511 14-34 Var. 557 22-34 Var. 603 2-24 Var. 466 8-34 Var. 512 14-32 Var. 558 22-32 Var. 604 2-22 Var. 467 8-32 Var. 513 14-30 Var. 559 22-30 Var. 605 2-20 Var. 468 8-30 Var. 514 14-28 Var. 560 22-28 Var. 606 2-18 Var. 469 8-28 Var. 515 14-26 Var. 561 22-26 Var. 607 2-16 Var. 470 8-26 Var. 516 14-24 Var. 562 22-24 Var. 608 2-14 Var. 471 8-24 Var. 517 14-22 Var. 563 24-40 Var. 609

2-12 Var. 472 8-22 Var. 518 14-20 Var. 564 24-38 Var. 610 2-10 Var. 473 8-20 Var. 519 14-18 Var. 565 24-36 Var. 611 2-8 Var. 474 8-18 Var. 520 14-16 Var. 566 24-34 Var. 612 4-40 Var. 475 8-16 Var. 521 16-40 Var. 567 24-32 Var. 613 4-38 Var. 476 8-14 Var. 522 16-38 Var. 568 24-30 Var. 614 4-36 Var. 477 8-12 Var. 523 16-36 Var. 569 24-28 Var. 615 4-34 Var. 478 8-10 Var. 524 16-34 Var. 570 24-26 Var. 616 4-32 Var. 479 10-40 Var. 525 16-32 Var. 571 26-40 Var. 617 4-30 Var. 480 10-38 Var. 526 16-30 Var. 572 26-38 Var. 618 4-28 Var. 481 10-36 Var. 527 16-28 Var. 573 26-36 Var. 619 4-26 Var. 482 10-34 Var. 528 16-26 Var. 574 26-34 Var. 620 4-24 Var. 483 10-32 Var. 529 16-24 Var. 575 26-32 Var. 621 4-22 Var. 484 10-30 Var. 530 16-22 Var. 576 26-30 Var. 622 4-20 Var. 485 10-28 Var. 531 16-20 Var. 577 26-28 Var. 623 4-18 Var. 486 10-26 Var. 532 16-18 Var. 578 28-40 Var. 624 4-16 Var. 487 10-24 Var. 533 18-40 Var. 579 28-38 Var. 625 4-14 Var. 488 10-22 Var. 534 18-38 Var. 580 28-36 Var. 626 4-12 Var. 489 10-20 Var. 535 18-36 Var. 581 28-34 Var. 627 4-10 Var. 490 10-18 Var. 536 18-34 Var. 582 28-32 Var. 628 4-8 Var. 491 10-16 Var. 537 18-32 Var. 583 28-30 Var. 629 6-40 Var. 492 10-14 Var. 538 18-30 Var. 584 30 - 40 Var. 630 6-38 Var. 493 10-12 Var. 539 18-28 Var. 585 30-38 Var. 631 6-36 Var. 494 12-40 Var. 540 18-26 Var. 586 30-36 Var. 632 6-34 Var. 495 12-38 Var. 541 18-24 Var. 587 30-34 Var. 633 6-32 Var. 496 12-36 Var. 542 18-22 Var. 588 30-32 Var. 634 6-30 Var. 497 12-34 Var. 543 18-20 Var. 589 32-40 Var. 635 6-28 Var. 498 12-32 Var. 544 20-40 Var. 590 32-38 Var. 636 6-26 Var. 499 12-30 Var. 545 20-38 Var. 591 32-36 Var. 637 6-24 Var. 500 12-28 Var. 546 20-36 Var. 592 32-34 Var. 638 6-22 Var. 501 12-26 Var. 547 20-34 Var. 593 34-40 Var. 639 6-20 Var. 502 12-24 Var. 548 20-32 Var. 594 36-38 Var. 640 6-18 Var. 503 12-22 Var. 549 20-30 Var. 595 38-40 Var. 641

Var. = Variação

[00144] Em algumas modalidades, a composição rVWF preparada pelos métodos fornecidos neste documento pode ser caracterizada de acordo com a porcentagem de moléculas rVWF que estão presentes em um multímero rVWF de ordem superior particular ou multímero maior. Por exemplo, em uma modalidade, pelo menos 20% das moléculas rVWF em uma composição rVWF usada nos métodos descritos neste documento estão presentes em um complexo oligomérico de pelo menos 10 subunidades. Em outra modalidade, pelo menos 20% das moléculas rVWF em uma composição rVWF usada nos métodos descritos neste documento estão presentes em um complexo oligomérico de pelo menos 12 subunidades. Em ainda outras modalidades, uma composição rVWF usada nos métodos fornecidos neste documento tem uma porcentagem mínima (por exemplo, tem pelo menos X%) de moléculas rVWF presentes em um multímero rVWF de ordem superior particular ou multímero maior (por exemplo, um multímero de pelo menos Y subunidades) de acordo com qualquer uma das variações 134 a 457 encontradas na Tabela 5 a Tabela 7. Tabela 5. Modalidades exemplificativas para a porcentagem de moléculas rVWF que estão presentes em um multímero rVWF de ordem superior particular ou multímero maior encontrado nas composições e usado nos métodos fornecidos neste documento. Número mínimo de subunidades no multímero rVWF 6 8 10 12 14 16 10% Var. 134 Var. 152 Var. 170 Var. 188 Var. 206 Var. 224 Porcentagem mínima de 15% Var. 135 Var. 153 Var. 171 Var. 189 Var. 207 Var. 225 moléculas rVWF 20% Var. 136 Var. 154 Var. 172 Var. 190 Var. 208 Var. 226 25% Var. 137 Var. 155 Var. 173 Var. 191 Var. 209 Var. 227 30% Var. 138 Var. 156 Var. 174 Var. 192 Var. 210 Var. 228 35% Var. 139 Var. 157 Var. 175 Var. 193 Var. 211 Var. 229

Número mínimo de subunidades no multímero rVWF 6 8 10 12 14 16 40% Var. 140 Var. 158 Var. 176 Var. 194 Var. 212 Var. 230 45% Var. 141 Var. 159 Var. 177 Var. 195 Var. 213 Var. 231 50% Var. 142 Var. 160 Var. 178 Var. 196 Var. 214 Var. 232 55% Var. 143 Var. 161 Var. 179 Var. 197 Var. 215 Var. 233 60% Var. 144 Var. 162 Var. 180 Var. 198 Var. 216 Var. 234 65% Var. 145 Var. 163 Var. 181 Var. 199 Var. 217 Var. 235 70% Var. 146 Var. 164 Var. 182 Var. 200 Var. 218 Var. 236 75% Var. 147 Var. 165 Var. 183 Var. 201 Var. 219 Var. 237 80% Var. 148 Var. 166 Var. 184 Var. 202 Var. 220 Var. 238 85% Var. 149 Var. 167 Var. 185 Var. 203 Var. 221 Var. 239 90% Var. 150 Var. 168 Var. 186 Var. 204 Var. 222 Var. 240 95% Var. 151 Var. 169 Var. 187 Var. 205 Var. 223 Var. 241

Var. = Variação Tabela 6. Modalidades exemplificativas para a porcentagem de moléculas rVWF que estão presentes em um multímero rVWF de ordem superior particular ou multímero maior encontrado nas composições e usado nos métodos fornecidos neste documento.

Número mínimo de subunidades no multímero rVWF 18 20 22 24 26 28 10% Var. 242 Var. 260 Var. 278 Var. 296 Var. 314 Var. 332 Porcentagem mínima de moléculas

15% Var. 243 Var. 261 Var. 279 Var. 297 Var. 315 Var. 333 20% Var. 244 Var. 262 Var. 280 Var. 298 Var. 316 Var. 334 25% Var. 245 Var. 263 Var. 281 Var. 299 Var. 317 Var. 335 rVWF

30% Var. 246 Var. 264 Var. 282 Var. 300 Var. 318 Var. 336 35% Var. 247 Var. 265 Var. 283 Var. 301 Var. 319 Var. 337 40% Var. 248 Var. 266 Var. 284 Var. 302 Var. 320 Var. 338 45% Var. 249 Var. 267 Var. 285 Var. 303 Var. 321 Var. 339 50% Var. 250 Var. 268 Var. 286 Var. 304 Var. 322 Var. 340

Número mínimo de subunidades no multímero rVWF 18 20 22 24 26 28 55% Var. 251 Var. 269 Var. 287 Var. 305 Var. 323 Var. 341 60% Var. 252 Var. 270 Var. 288 Var. 306 Var. 324 Var. 342 65% Var. 253 Var. 271 Var. 289 Var. 307 Var. 325 Var. 343 70% Var. 254 Var. 272 Var. 290 Var. 308 Var. 326 Var. 344 75% Var. 255 Var. 273 Var. 291 Var. 309 Var. 327 Var. 345 80% Var. 256 Var. 274 Var. 292 Var. 310 Var. 328 Var. 346 85% Var. 257 Var. 275 Var. 293 Var. 311 Var. 329 Var. 347 90% Var. 258 Var. 276 Var. 294 Var. 312 Var. 330 Var. 348 95% Var. 259 Var. 277 Var. 295 Var. 313 Var. 331 Var. 349

Var. = Variação Tabela 7. Modalidades exemplificativas para a porcentagem de moléculas rVWF que estão presentes em um multímero rVWF de ordem superior particular ou multímero maior encontrado nas composições e usado nos métodos fornecidos neste documento.

Número mínimo de subunidades no multímero rVWF 30 32 34 36 38 40 10% Var. 350 Var. 368 Var. 386 Var. 404 Var. 422 Var. 440 15% Var. 351 Var. 369 Var. 387 Var. 405 Var. 423 Var. 441 Porcentagem mínima de moléculas rVWF

20% Var. 352 Var. 370 Var. 388 Var. 406 Var. 424 Var. 442 25% Var. 353 Var. 371 Var. 389 Var. 407 Var. 425 Var. 443 30% Var. 354 Var. 372 Var. 390 Var. 408 Var. 426 Var. 444 35% Var. 355 Var. 373 Var. 391 Var. 409 Var. 427 Var. 445 40% Var. 356 Var. 374 Var. 392 Var. 410 Var. 428 Var. 446 45% Var. 357 Var. 375 Var. 393 Var. 411 Var. 429 Var. 447 50% Var. 358 Var. 376 Var. 394 Var. 412 Var. 430 Var. 448 55% Var. 359 Var. 377 Var. 395 Var. 413 Var. 431 Var. 449 60% Var. 360 Var. 378 Var. 396 Var. 414 Var. 432 Var. 450 65% Var. 361 Var. 379 Var. 397 Var. 415 Var. 433 Var. 451

Número mínimo de subunidades no multímero rVWF 30 32 34 36 38 40 70% Var. 362 Var. 380 Var. 398 Var. 416 Var. 434 Var. 452 75% Var. 363 Var. 381 Var. 399 Var. 417 Var. 435 Var. 453 80% Var. 364 Var. 382 Var. 400 Var. 418 Var. 436 Var. 454 85% Var. 365 Var. 383 Var. 401 Var. 419 Var. 437 Var. 455 90% Var. 366 Var. 384 Var. 402 Var. 420 Var. 438 Var. 456 95% Var. 367 Var. 385 Var. 403 Var. 421 Var. 439 Var. 457 Var. = Variação

[00145] De acordo com o acima, o rVWF compreende uma porcentagem significativa de multímeros rVWF de alto peso molecular (HMW). Em outras modalidades, a composição de multímero HMW rVWF compreende pelo menos 10% - 80% de decâmeros rVWF ou multímeros de ordem superior. Em outras modalidades, a composição compreende cerca de 10-95%, 20-90%, 30-85%, 40- 80%, 50-75%, 60-70% de decâmeros ou multímeros de ordem superior. Em outras modalidades, a composição de multímero HMW rVWF compreende pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% decâmeros ou multímeros de ordem superior.

[00146] A avaliação do número e da porcentagem de multímeros rVWF pode ser conduzida usando métodos conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, métodos usando eletroforese e métodos de cromatografia de exclusão de tamanho para separar multímeros rVWF por tamanho, por exemplo, como discutido por Cumming et al, (J Clin Pathol. Maio de 1993; 46 (5): 470-473, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins e, em particular, para todos os ensinamentos relacionados à avaliação de multímeros rVWF). Essas técnicas podem incluir ainda técnicas de imunotransferência (como Western Blot), em que o gel é imunotransferido com um anticorpo radiomarcado contra VWF seguido por detecção quimioluminescente (ver, por exemplo, Wen et al., (1993), J. Clin. Lab. Anal., 7:317–323, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins e em particular para todos os ensinamentos relacionados à avaliação de multímeros de rVWF). Outros ensaios para VWF incluem VWF:Antígeno (VWF:Ag), VWF:Cofator de Ristocetina (VWF:RCof) e VWF:Ensaio de Atividade de Ligação de Colágeno (VWF:CBA), que são frequentemente usados para diagnóstico e classificação da Doença de Von Willebrand. (ver, por exemplo, Favaloro et al., Pathology, 1997, 29 (4): 341-456, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins e em particular para todos os ensinamentos relacionados a ensaios para VWF).

[00147] Em algumas modalidades, a razão da atividade pró-coagulante rFVIII (IU rFVIII:C) para a atividade do cofator rVWF Ristocetina (IU rVWF:RCo) para o rVWF preparado de acordo com os métodos da presente invenção está entre 3:1 e 1:5. Em outras modalidades, a razão está entre 2:1 e 1:4. Em ainda outras modalidades, a razão está entre 5:2 e 1:4. Em outras modalidades, a razão está entre 3:2 e 1:3. Em ainda outras modalidades, a razão é de cerca de 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 2:1, 2:3, 2:4, 2:5, 3:1, 3:2, 3:4, ou 3:5. Em outras modalidades, a razão está entre 1:1 e 1:2. Em ainda outras modalidades, a razão é de 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1 ou 2:1. Em certas modalidades, a razão da atividade pró-coagulante do rFVIII (IU rFVIII:C) para a atividade do cofator da rVWF Ristocetina (IU rVWF:RCo) em uma composição útil para um método aqui descrito é selecionada das variações de 1988 a 2140 encontradas na Tabela 8. Tabela 8. Modalidades exemplificativas para a razão da atividade pró- coagulante de rFVIII (IU rFVIII:C) para atividade de cofator de Ristocetina rVWF (IU rVWF:RCo) em composições e usadas nos métodos aqui fornecidos.

(IU (IU (IU (IU rFVIII:C) rFVIII:C) rFVIII:C) rFVIII:C) para (IU para (IU para (IU para (IU rVWF:RCo) rVWF:RCo) rVWF:RCo) rVWF:RCo) Var.

Var. 4:1 3:1-3:5 4:3-1:4 Var. 2065 4:5-2:3 Var. 2103 1988 2027 Var.

Var. 3:1 3:1-2:3 4:3-1:3 Var. 2066 4:5-3:4 Var. 2104 1989 2028 Var.

Var. 2:1 3:1-3:4 4:3-2:5 Var. 2067 3:4-1:6 Var. 2105 1990 2029 Var.

Var. 3:2 3:1-4:5 4:3-1:2 Var. 2068 3:4-1:5 Var. 2106 1991 2030 Var.

Var. 4:3 3:1-5:6 4:3-3:5 Var. 2069 3:4-1:4 Var. 2107 1992 2031 Var.

Var. 1:1 3:1-1:1 4:3-2:3 Var. 2070 3:4-1:3 Var. 2108 1993 2032 Var.

Var. 5:6 3:1-4:3 4:3-3:4 Var. 2071 3:4-2:5 Var. 2109 1994 2033 Var.

Var. 4:5 3:1-3:2 4:3-4:5 Var. 2072 3:4-1:2 Var. 2110 1995 2034 Var.

Var. 3:4 3:1-2:1 4:3-5:6 Var. 2073 3:4-3:5 Var. 2111 1996 2035 Var.

Var. 2:3 2:1-1:6 4:3-1:1 Var. 2074 3:4-2:3 Var. 2112 1997 2036 Var.

Var. 3:5 2:1-1:5 1:1-1:6 Var. 2075 2:3-1:6 Var. 2113 1998 2037 Var.

Var. 1:2 2:1-1:4 1:1-1:5 Var. 2076 2:3-1:5 Var. 2114 1999 2038 Var.

Var. 2:5 2:1-1:3 1:1-1:4 Var. 2077 2:3-1:4 Var. 2115 2000 2039 Var.

Var. 1:3 2:1-2:5 1:1-1:3 Var. 2078 2:3-1:3 Var. 2116 2001 2040

Var. 1:4 2:1-1:2 1:1-2:5 Var. 2079 2:3-2:5 Var. 2117 2002 2041 Var.

Var. 1:5 2:1-3:5 1:1-1:2 Var. 2080 2:3-1:2 Var. 2118 2003 2042 Var.

Var. 1:6 2:1-2:3 1:1-3:5 Var. 2081 2:3-3:5 Var. 2119 2004 2043 Var.

Var. 4:1-1:6 2:1-3:4 1:1-2:3 Var. 2082 3:5-1:6 Var. 2120 2005 2044 Var.

Var. 4:1-1:5 2:1-4:5 1:1-3:4 Var. 2083 3:5-1:5 Var. 2121 2006 2045 Var.

Var. 4:1-1:4 2:1-5:6 1:1-4:5 Var. 2084 3:5-1:4 Var. 2122 2007 2046 Var.

Var. 4:1-1:3 2:1-1:1 1:1-5:6 Var. 2085 3:5-1:3 Var. 2123 2008 2047 Var.

Var. 4:1-2:5 2:1-4:3 5:6-1:6 Var. 2086 3:5-2:5 Var. 2124 2009 2048 Var.

Var. 4:1-1:2 2:1-3:2 5:6-1:5 Var. 2087 3:5-1:2 Var. 2125 2010 2049 Var.

Var. 4:1-3:5 3:2-1:6 5:6-1:4 Var. 2088 1:2-1:6 Var. 2126 2011 2050 Var.

Var. 4:1-2:3 3:2-1:5 5:6-1:3 Var. 2089 1:2-1:5 Var. 2127 2012 2051 Var.

Var. 4:1-3:4 3:2-1:4 5:6-2:5 Var. 2090 1:2-1:4 Var. 2128 2013 2052 Var.

Var. 4:1-4:5 3:2-1:3 5:6-1:2 Var. 2091 1:2-1:3 Var. 2129 2014 2053 Var.

Var. 4:1-5:6 3:2-2:5 5:6-3:5 Var. 2092 1:2-2:5 Var. 2130 2015 2054

(IU (IU (IU (IU rFVIII:C) rFVIII:C) rFVIII:C) rFVIII:C) para (IU para (IU para (IU para (IU rVWF:RCo) rVWF:RCo) rVWF:RCo) rVWF:RCo) Var. Var. 4:1-1:1 3:2-1:2 5:6-2:3 Var. 2093 2:5-1:6 Var. 2131 2016 2055 Var. Var. 4:1-4:3 3:2-3:5 5:6-3:4 Var. 2094 2:5-1:5 Var. 2132 2017 2056 Var. Var. 4:1-3:2 3:2-2:3 5:6-4:5 Var. 2095 2:5-1:4 Var. 2133 2018 2057 Var. Var. 4:1-2:1 3:2-3:4 4:5-1:6 Var. 2096 2:5-1:3 Var. 2134 2019 2058 Var. Var. 4:1-3:1 3:2-4:5 4:5-1:5 Var. 2097 1:3-1:6 Var. 2135 2020 2059 Var. Var. 3:1-1:6 3:2-5:6 4:5-1:4 Var. 2098 1:3-1:5 Var. 2136 2021 2060 Var. Var. 3:1-1:5 3:2-1:1 4:5-1:3 Var. 2099 1:3-1:4 Var. 2137 2022 2061 Var. Var. 3:1-1:4 3:2-4:3 4:5-2:5 Var. 2100 1:4-1:6 Var. 2138 2023 2062 Var. Var. 3:1-1:3 4:3-1:6 4:5-1:2 Var. 2101 1:4-1:5 Var. 2139 2024 2063 Var. Var. 3:1-2:5 4:3-1:5 4:5-3:5 Var. 2102 1:5-1:6 Var. 2140 2025 2064 Var. 3:1-1:2 2026 Var. = Variação

[00148] Em outras modalidades, os multímeros rVWF de ordem superior da invenção são estáveis por cerca de 1 a cerca de 90 horas após a administração. Em ainda outras modalidades, os multímeros rVWF de ordem superior são estáveis por cerca de 5-80, 10-70, 15-60, 20-50, 25-40, 30-35 horas após a administração. Em ainda outras modalidades, os multímeros rVWF de ordem superior são estáveis por pelo menos 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 horas após a administração. Em certas modalidades, a estabilidade dos multímeros rVWF é avaliada in vitro.

[00149] Em uma modalidade, os multímeros rVWF de ordem superior usados nas composições e métodos aqui fornecidos têm uma meia-vida de pelo menos 12 horas após a administração. Em outra modalidade, os multímeros rVWF de ordem superior têm uma meia-vida de pelo menos 24 horas após a administração. Em ainda outras modalidades, os multímeros rVWF de ordem superior têm uma meia-vida selecionada das variações 642 a 1045 encontradas na Tabela 9. Tabela 9. Modalidades exemplificativas para a meia-vida de multímeros rVWF de ordem superior encontrados nas composições preparadas pelos métodos fornecidos neste documento. Horas Horas Horas Horas pelo menos 1 Var. 642 4-22 Var. 743 14-78 Var. 844 24-30 Var. 945 pelo menos 2 Var. 643 4-20 Var. 744 14-72 Var. 845 24-27 Var. 946 pelo menos 3 Var. 644 4-18 Var. 745 14-66 Var. 846 27-90 Var. 947 pelo menos 4 Var. 645 4-16 Var. 746 14-60 Var. 847 27-84 Var. 948 pelo menos 5 Var. 646 4-14 Var. 747 14-54 Var. 848 27-78 Var. 949 pelo menos 6 Var. 647 4-12 Var. 748 14-48 Var. 849 27-72 Var. 950 pelo menos 7 Var. 648 4-10 Var. 749 14-45 Var. 850 27-66 Var. 951 pelo menos 8 Var. 649 4-8 Var. 750 14-42 Var. 851 27-60 Var. 952 pelo menos 9 Var. 650 4-6 Var. 751 14-39 Var. 852 27-54 Var. 953 pelo menos 10 Var. 651 6-90 Var. 752 14-36 Var. 853 27-48 Var. 954 pelo menos 11 Var. 652 6-84 Var. 753 14-33 Var. 854 30-90 Var. 955 pelo menos 12 Var. 653 6-78 Var. 754 14-30 Var. 855 30-84 Var. 956 pelo menos 14 Var. 654 6-72 Var. 755 14-27 Var. 856 30-78 Var. 957 pelo menos 16 Var. 655 6-66 Var. 756 14-24 Var. 857 30-72 Var. 958 pelo menos 18 Var. 656 6-60 Var. 757 14-22 Var. 858 30-66 Var. 959

Horas Horas Horas Horas pelo menos 20 Var. 657 6-54 Var. 758 14-20 Var. 859 30-60 Var. 960 pelo menos 22 Var. 658 6-48 Var. 759 14-18 Var. 860 30-54 Var. 961 pelo menos 24 Var. 659 6-45 Var. 760 14-16 Var. 861 30-48 Var. 962 pelo menos 27 Var. 660 6-42 Var. 761 16-90 Var. 862 30-45 Var. 963 pelo menos 30 Var. 661 6-39 Var. 762 16-84 Var. 863 30-42 Var. 964 pelo menos 33 Var. 662 6-36 Var. 763 16-78 Var. 864 30-39 Var. 965 pelo menos 36 Var. 663 6-33 Var. 764 16-72 Var. 865 30-36 Var. 966 pelo menos 39 Var. 664 6-30 Var. 765 16-66 Var. 866 30-33 Var. 967 pelo menos 42 Var. 665 6-27 Var. 766 16-60 Var. 867 33-90 Var. 968 pelo menos 45 Var. 666 6-24 Var. 767 16-54 Var. 868 33-84 Var. 969 pelo menos 48 Var. 667 6-22 Var. 768 16-48 Var. 869 33-78 Var. 970 pelo menos 54 Var. 668 6-20 Var. 769 16-45 Var. 870 33-72 Var. 971 pelo menos 60 Var. 669 6-18 Var. 770 16-42 Var. 871 33-66 Var. 972 pelo menos 66 Var. 670 6-16 Var. 771 16-39 Var. 872 33-60 Var. 973 pelo menos 72 Var. 671 6-14 Var. 772 16-36 Var. 873 33-54 Var. 974 pelo menos 78 Var. 672 6-12 Var. 773 16-33 Var. 874 33-48 Var. 975 pelo menos 84 Var. 673 6-10 Var. 774 16-30 Var. 875 33-45 Var. 976 pelo menos 90 Var. 674 6-8 Var. 775 16-27 Var. 876 33-42 Var. 977 2-90 Var. 675 8-90 Var. 776 16-24 Var. 877 33-29 Var. 978 2-84 Var. 676 8-84 Var. 777 16-22 Var. 878 33-36 Var. 979 2-78 Var. 677 8-78 Var. 778 16-20 Var. 879 36-90 Var. 980 2-72 Var. 678 8-72 Var. 779 16-18 Var. 880 36-84 Var. 981 2-66 Var. 679 8-66 Var. 780 18-90 Var. 881 36-78 Var. 982 2-60 Var. 680 8-60 Var. 781 18-84 Var. 882 36-72 Var. 983 2-54 Var. 681 8-54 Var. 782 18-78 Var. 883 36-66 Var. 984 2-48 Var. 682 8-48 Var. 783 18-72 Var. 884 36-60 Var. 985 2-45 Var. 683 8-45 Var. 784 18-66 Var. 885 36-54 Var. 986 2-42 Var. 684 8-42 Var. 785 18-60 Var. 886 36-48 Var. 987 2-39 Var. 685 8-39 Var. 786 18-54 Var. 887 36-45 Var. 988 2-36 Var. 686 8-36 Var. 787 18-48 Var. 888 36-42 Var. 989

Horas Horas Horas Horas 2-33 Var. 687 8-33 Var. 788 18-45 Var. 889 36-39 Var. 990 2-30 Var. 688 8-30 Var. 789 18-42 Var. 890 39-90 Var. 991 2-27 Var. 689 8-27 Var. 790 18-39 Var. 891 39-84 Var. 992 2-24 Var. 690 8-24 Var. 791 18-36 Var. 892 39-78 Var. 993 2-22 Var. 691 8-22 Var. 792 18-33 Var. 893 39-72 Var. 994 2-20 Var. 692 8-20 Var. 793 18-30 Var. 894 39-66 Var. 995 2-18 Var. 693 8-18 Var. 794 18-27 Var. 895 39-60 Var. 996 2-16 Var. 694 8-16 Var. 795 18-24 Var. 896 39-54 Var. 997 2-14 Var. 695 8-14 Var. 796 18-22 Var. 897 39-48 Var. 998 2-12 Var. 696 8-12 Var. 797 18-20 Var. 898 39-45 Var. 999 2-10 Var. 697 8-10 Var. 798 20-90 Var. 899 39-42 Var. 1000 2-8 Var. 698 10-90 Var. 799 20-84 Var. 900 42-90 Var. 1001 2-6 Var. 699 10-84 Var. 800 20-78 Var. 901 42-84 Var. 1002 2-4 Var. 700 10-78 Var. 801 20-72 Var. 902 42-78 Var. 1003 3-90 Var. 701 10-72 Var. 802 20-66 Var. 903 42-72 Var. 1004 3-84 Var. 702 10-66 Var. 803 20-60 Var. 904 42-66 Var. 1005 3-78 Var. 703 10-60 Var. 804 20-54 Var. 905 42-60 Var. 1006 3-72 Var. 704 10-54 Var. 805 20-48 Var. 906 42-54 Var. 1007 3-66 Var. 705 10-48 Var. 806 20-45 Var. 907 42-48 Var. 1008 3-60 Var. 706 10-45 Var. 807 20-42 Var. 908 42-45 Var. 1009 3-54 Var. 707 10-42 Var. 808 20-39 Var. 909 45-90 Var. 1010 3-48 Var. 708 10-39 Var. 809 20-36 Var. 910 45-84 Var. 1011 3-45 Var. 709 10-36 Var. 810 20-33 Var. 911 45-78 Var. 1012 3-42 Var. 710 10-33 Var. 811 20-30 Var. 912 45-72 Var. 1013 3-39 Var. 711 10-30 Var. 812 20-27 Var. 913 45-66 Var. 1014 3-36 Var. 712 10-27 Var. 813 20-24 Var. 914 45-60 Var. 1015 3-33 Var. 713 10-24 Var. 814 20-22 Var. 915 45-54 Var. 1.016 3-30 Var. 714 10-22 Var. 815 22-90 Var. 916 45-48 Var. 1017 3-27 Var. 715 10-20 Var. 816 22-84 Var. 917 48-90 Var. 1018 3-24 Var. 716 10-18 Var. 817 22-78 Var. 918 48-84 Var. 1019

Horas Horas Horas Horas 3-22 Var. 717 10-16 Var. 818 22-72 Var. 919 48-78 Var. 1020 3-20 Var. 718 10-14 Var. 819 22-66 Var. 920 48-72 Var. 1021 3-18 Var. 719 10-12 Var. 820 22-60 Var. 921 48-66 Var. 1022 3-16 Var. 720 12-90 Var. 821 22-54 Var. 922 48-60 Var. 1023 3-14 Var. 721 12-84 Var. 822 22-48 Var. 923 48-54 Var. 1024 3-12 Var. 722 12-78 Var. 823 22-45 Var. 924 54-90 Var. 1025 3-10 Var. 723 12-72 Var. 824 22-42 Var. 925 54-84 Var. 1026 3-8 Var. 724 12-66 Var. 825 22-39 Var. 926 54-78 Var. 1027 3-6 Var. 725 12-60 Var. 826 22-36 Var. 927 54-72 Var. 1028 3-4 Var. 726 12-54 Var. 827 22-33 Var. 928 54-66 Var. 1029 4-90 Var. 727 12-48 Var. 828 22-30 Var. 929 54-60 Var. 1030 4-84 Var. 728 12-45 Var. 829 22-27 Var. 930 60-90 Var. 1031 4-78 Var. 729 12-42 Var. 830 22-24 Var. 931 60-84 Var. 1032 4-72 Var. 730 12-39 Var. 831 24-90 Var. 932 60-78 Var. 1033 4-66 Var. 731 12-36 Var. 832 24-84 Var. 933 60-72 Var. 1034 4-60 Var. 732 12-33 Var. 833 24-78 Var. 934 60-66 Var. 1035 4-54 Var. 733 12-30 Var. 834 24-72 Var. 935 66-90 Var. 1036 4-48 Var. 734 12-27 Var. 835 24-66 Var. 936 66-84 Var. 1037 4-45 Var. 735 12-24 Var. 836 24-60 Var. 937 66-78 Var. 1038 4-42 Var. 736 12-22 Var. 837 24-54 Var. 938 66-72 Var. 1039 4-39 Var. 737 12-20 Var. 838 24-48 Var. 939 72-90 Var. 1040 4-36 Var. 738 12-18 Var. 839 24-45 Var. 940 72-84 Var. 1041 4-33 Var. 739 12-16 Var. 840 24-42 Var. 941 72-78 Var. 1042 4-30 Var. 740 12-14 Var. 841 24-39 Var. 942 78-90 Var. 1043 4-27 Var. 741 14-90 Var. 842 24-36 Var. 943 78-84 Var. 1044 4-24 Var. 742 14-84 Var. 843 24-33 Var. 944 84-90 Var. 1045 Var. = Variação

[00150] Em algumas modalidades, o pró-VWF e/ou rVWF purificado de acordo com a presente invenção não é modificado com qualquer conjugação,

pós-tradução ou modificações covalentes. Em modalidades particulares, o pró- VWF e/ou rVWF purificado da presente invenção não é modificado com um polímero solúvel em água, incluindo, sem limitação, um polietileno glicol (PEG), um polipropileno glicol, um polioxialquileno, um ácido polissiálico, hidroxi etil amido, uma fração poli-carboidrato e semelhantes.

[00151] Em algumas modalidades, o pró-VWF e/ou VWF purificado de acordo com a presente invenção é modificado por conjugação, modificaçãopós- tradução ou modificação covalente, incluindo modificações dos resíduos N- ou C- terminais, bem como modificações de cadeias laterais selecionadas, por exemplo, em grupos sulfidrila livres, aminas primárias e grupos hidroxil. Em uma modalidade, um polímero solúvel em água está ligado à proteína (diretamente ou por meio de um ligante) por um grupo lisina ou outra amina primária. Em algumas modalidades, o pró-VWF e/ou rVWF purificado da presente invenção pode ser modificado por conjugação de um polímero solúvel em água, incluindo, sem limitação, um polietileno glicol (PEG), um polipropileno glicol, um polioxialquileno, um ácido polissiálico, hidroxi etil amido, uma fração poli- carboidrato e semelhantes.

[00152] Os polímeros solúveis em água que podem ser usados para modificar o pró-VWF e/ou rVWF purificado incluem estruturas lineares e ramificadas. Os polímeros conjugados podem ser ligados diretamente às proteínas de coagulação da invenção ou, alternativamente, podem ser ligados através de uma fração de ligação. Exemplos não limitativos de conjugação de proteínas com polímeros solúveis em água podem ser encontrados nas Patentes U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 e 4.179.337, bem como em Abuchowski and Davis “Enzymes as Drugs,” Holcenberg and Roberts, Eds., pp. 367 383, John Wiley and Sons, New York (1981), and Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2nd Ed., Academic Press, Inc. 2008.

[00153] A conjugação de proteínas pode ser realizada por uma série de técnicas bem conhecidas na técnica, por exemplo, ver Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2nd Ed., Academic Press, Inc. 2008. Os exemplos incluem a ligação através da ligação peptídica entre um grupo carboxil em uma das proteínas de coagulação ou fração de polímero solúvel em água e um grupo amina da outra, ou uma ligação éster entre um grupo carboxil de um e um grupo hidroxil da outra.

Outra ligação pela qual uma proteína de coagulação da invenção poderia ser conjugada a um composto de polímero solúvel em água é através de uma base de Schiff, entre um grupo amino livre na fração de polímero sendo reagido com um grupo aldeído formado na extremidade não redutora do polímero por oxidação com periodato (Jennings and Lugowski, J.

Immunol. 1981; 127:1011-8; Femandes and Gregonradis, Biochim Biophys Acta. 1997; 1341; 26- 34). A Base de Schiff gerada pode ser estabilizada por redução específica com NaCNBH3 para formar uma amina secundária.

Uma abordagem alternativa é a geração de grupos amino livres terminais no polímero por aminação redutiva com NH4Cl após oxidação prévia.

Reagentes bifuncionais podem ser usados para ligar dois grupos amino ou dois grupos hidroxil.

Por exemplo, um polímero contendo um grupo amino pode ser acoplado a um grupo amino da proteína de coagulação com reagentes como BS3 (Bis(sulfosuccinimidil)suberato/Pierce, Rockford, Ill.). Além disso, reagentes de reticulação heterobifuncional como Sulfo-EMCS (N--Maleimidocaproiloxi) sulfosuccinimida éster/Pierce) podem ser usados, por exemplo, para ligar grupos amina e tiol.

Em outras modalidades, um grupo reativo de aldeído, como alcóxido de PEG mais dietil acetal de bromoacetaldeído; PEG mais DMSO e anidrido acético e cloreto de PEG mais o fenóxido de 4-hidroxibenzaldeído, ésteres ativos de succinimidil, ditiocarbonato ativado PEG, 2,4,5-triclorofenilcloroformato e P-nitrofenilcloroformato ativado PEG podem ser usados na conjugação de uma proteína de coagulação.

[00154] Outro método para medir a atividade biológica do VWF é o ensaio de ligação ao colágeno, que se baseia na tecnologia ELISA (Brown and Bosak, Thromb. Res., 1986, 43:303-311; Favaloro, Thromb. Haemost., 2000, 83 127- 135). Uma placa de microtitulação é revestida com colágeno tipo I ou III. Em seguida, o VWF é ligado à superfície de colágeno e subsequentemente detectado com um anticorpo policlonal marcado com enzima. A última etapa é uma reação do substrato, que pode ser monitorada fotometricamente com um leitor de ELISA.

[00155] Os ensaios imunológicos dos fatores de von Willebrand (VWF:Ag) são imunoensaios que medem a concentração da proteína VWF no plasma. Eles não fornecem nenhuma indicação quanto à função de VWF. Existem vários métodos para medir VWF:Ag e estes incluem o ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) ou imunoensaios de látex automatizados (LIA). Muitos laboratórios agora usam um imunoensaio de látex totalmente automatizado. Historicamente, os laboratórios usaram uma variedade de técnicas, incluindo o eletroimunoensaio Laurell 'Laurell Rockets', mas estes raramente são usados na maioria dos laboratórios hoje. III. KITS

[00156] Como um aspecto adicional, a invenção inclui kits que compreendem uma ou mais composições liofilizadas embaladas de uma maneira que facilita a sua utilização para administração a sujeitos. Em uma modalidade, tal kit inclui formulação farmacêutica aqui descrita (por exemplo, uma composição compreendendo uma proteína ou peptídeo terapêutico), embalada em um recipiente, como uma garrafa ou recipiente vedado, com um rótulo afixado ao recipiente ou incluído na embalagem que descreve o uso do composto ou composição na prática do método. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é embalada no recipiente de modo que a quantidade de espaço livre no recipiente (por exemplo, a quantidade de ar entre a formulação líquida e o topo do recipiente) seja muito pequena. De preferência, a quantidade de espaço aéreo é insignificante (por exemplo, quase nenhum). Em uma modalidade, o kit contém um primeiro recipiente com uma proteína terapêutica ou composição de peptídeo e um segundo recipiente com uma solução de reconstituição fisiologicamente aceitável para a composição. Em um aspecto, a formulação farmacêutica é embalada em uma forma de dosagem unitária. O kit pode ainda incluir um dispositivo adequado para administrar a formulação farmacêutica de acordo com uma via de administração específica. De preferência, o kit contém um rótulo que descreve o uso das formulações farmacêuticas. IV. RVWF PARA MÉTODOS DE TRATAMENTO PROFILÁTICO DE

SANGRAMENTO ESPONTÂNEO EM PACIENTES COM VWD GRAVE

[00157] Uma das vantagens de administrar rVWF a sujeitos com VWD grave para tratamento profilático de episódios de sangramento espontâneo é que a maior atividade específica de rVWF em comparação com pdVWF permite flexibilidade na quantidade de rVWF administrada e o número de vezes que o sujeito recebe a dose novamente. Como será apreciado e como é discutido em mais detalhes aqui, o FVIII coadministrado pode ser recombinante ou derivado de plasma.

[00158] Administrações únicas ou múltiplas de rVWF são realizadas com os níveis de dose e padrão sendo selecionados pelo médico assistente. Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada depende do tipo de doença a ser tratada (por exemplo, doença de von Willebrand), a gravidade e o curso da doença, se a droga é administrada para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, o histórico clínico do paciente e a resposta à droga, e a critério do médico assistente.

[00159] Em alguns aspectos, o rVWF é administrado profilaticamente a um sujeito em uma dose que varia de 40-80 IU/kg, por exemplo, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 40-80, 45-80, 50-80, 45- 70, 45-60, 45-55, 45-50, 50-60, 55-60, 60-65, 55 -65, 60-70, 65-70, 60-75, 70-80 ou 75-80 IU/kg. Em algumas modalidades, a dose varia de 40 IU/kg a 60 IU/kg. Em algumas modalidades, a dose varia de 45 IU/kg a 55 IU/kg. Em algumas modalidades, a dose é de cerca de 40 IU/kg, cerca de 50 IU/kg ou cerca de 60 IU/kg. Em algumas modalidades, a dose é de cerca de 50 IU/kg. Em algumas modalidades, a dose é de cerca de 80 IU/kg. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado uma vez por semana, duas vezes por semana, três vezes por semana, quatro vezes por semana, cinco vezes por semana ou mais. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado duas vezes por semana. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado duas vezes por semana. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado duas vezes por semana como uma dose que varia de 40 IU/kg a 60 IU/kg. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado duas vezes por semana como uma dose que varia de 40 IU/kg a 60 IU/kg por infusão IV.

[00160] Em algumas modalidades, as amostras de sangue para medir vWF:Ag, vWF:RCo, vWF:CB e os níveis de atividade de FVIII foram tomadas pré- dose, em 15 minutos, 30 minutos e 60 minutos após a infusão da droga, e em 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 48 horas, 72 horas e 96 horas. Em algumas modalidades, as amostras, incluindo, por exemplo, amostras de sangue, podem ser obtidas para examinar a atividade de vWF:RCo e FVIII. Em algumas modalidades, as amostras para FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e atividade de capacidade de ligação ao colágeno de VWF são obtidas antes do tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, amostras para examinar FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e atividade de capacidade de ligação de colágeno de VWF são obtidas 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 48 horas, 72 horas ou 96 horas, após tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, amostras para examinar a atividade de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII: C, VWF: RCo, VWF: Ag e VWF são obtidas 25 a 31 dias após o tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, as amostras para FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e atividade de capacidade de ligação ao colágeno de VWF são obtidas após um episódio de sangramento e em tais modalidades, uma amostra é retirada antes da administração de rVWF, 2 horas após administrador e a cada 12-24 horas até a resolução do evento de sangramento. Em algumas modalidades, a atividade de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e VWF versus perfis de tempo são determinados com base nas amostras. Em algumas modalidades, FVIII:C também é medido por um ensaio de coagulação de 1 estágio versus perfis de tempo.

[00161] Em algumas modalidades, o rVWF é administrado ao sujeito em uma faixa de 40-80 IU/kg, por exemplo, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 40-80, 45-80, 50-80, 45-70, 45-60, 45-55, 45- 50, 50-60, 55-60, 60-65, 55-65, 60-70, 65-70, 60-75, 70-80 ou 75-80 IU/kg como uma (primeira) administração inicial. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado ao sujeito em uma faixa de 40-80 IU/kg, por exemplo, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 40-80, 45-80, 50- 80, 45-70, 45-60, 45-55, 45-50, 50-60, 55-60, 60-65, 55-65, 60-70, 65-70, 60-75, 70-80 ou 75-80 IU/kg como uma segunda administração. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado ao sujeito em uma faixa de 40-80 IU/kg,

por exemplo, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 40-80, 45-80, 50-80, 45-70, 45-60, 45-55, 45-50, 50-60, 55-60, 60-65, 55- 65, 60-70, 65-70, 60-75, 70-80 ou 75-80 IU/kg como uma terceira administração. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado ao sujeito em uma faixa de 40- 80 IU/kg, por exemplo, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 40-80, 45-80, 50-80, 45-70, 45-60, 45-55, 45-50, 50-60, 55-60, 60-65, 55-65, 60-70, 65-70, 60-75, 70-80 ou 75-80 IU/kg como uma administração subsequente.

[00162] As composições de rVWF podem estar contidas em formulações farmacêuticas, conforme descrito neste documento. Essas formulações podem ser administradas por via oral, tópica, transdérmica, parenteral, por inalação de spray, vaginal, retal ou por injeção intracraniana. O termo parenteral, como utilizado neste documento, inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injeção intracisternal ou técnicas de infusão. A administração por injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e/ou implantação cirúrgica em um determinado local também é contemplada. Geralmente, as composições são essencialmente isentas de pirogênios, bem como de outras impurezas que podem ser prejudiciais ao receptor.

[00163] Em um aspecto, as formulações da invenção são administradas por um bolus inicial seguido por uma infusão contínua para manter os níveis circulantes terapêuticos do produto de droga. Como outro exemplo, o composto da invenção é administrado como uma dose única. Aqueles versados na técnica irão prontamente otimizar dosagens eficazes e regimes de administração conforme determinado pela boa prática médica e a condição clínica do paciente individual. A via de administração pode ser, mas não está limitada a, por administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. A frequência da dosagem depende dos parâmetros farmacocinéticos dos agentes e da via de administração. A formulação farmacêutica ótima é determinada por um versado na técnica, dependendo da via de administração e da dosagem desejada. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 páginas 1435-1712, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins e em particular para todos os ensinamentos relacionados a formulações, vias de administração e dosagens para produtos farmacêuticos. Tais formulações influenciam o estado físico, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de eliminação in vivo dos agentes administrados. Dependendo da via de administração, uma dose adequada é calculada de acordo com o peso corporal, área de superfície corporal ou tamanho do órgão. As dosagens apropriadas podem ser determinadas através da utilização de ensaios estabelecidos para determinar as dosagens ao nível do sangue em conjunto com os dados de resposta à dose apropriados. O regime de dosagem final é determinado pelo médico assistente, considerando vários fatores que modificam a ação dos drogas, por exemplo, a atividade específica da droga, a gravidade do dano e a capacidade de resposta do paciente, a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a gravidade de qualquer infecção, o tempo de administração e outros fatores clínicos. A título de exemplo, uma dose típica de um VWF recombinante da presente invenção é de aproximadamente 50 IU/kg, igual a 500 μg/kg. À medida que os estudos são conduzidos, mais informações surgirão sobre os níveis de dosagem apropriados e a duração do tratamento para várias doenças e condições.

[00164] Para administrar composições a humanos ou animais de teste, em um aspecto, as composições compreendem um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis. As frases "farmaceuticamente" ou "farmacologicamente" aceitáveis referem-se a entidades moleculares e composições que são estáveis, inibem a degradação de proteínas, como produtos de agregação e clivagem e, além disso, não produzem reações alérgicas ou outras reações adversas quando administradas por vias bem conhecidas em na técnica conforme descrito abaixo. "Transportadores farmaceuticamente aceitáveis" incluem todos e quaisquer solventes clinicamente úteis, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção e semelhantes, incluindo os agentes divulgados acima.

[00165] As formulações farmacêuticas são administradas por via oral, tópica, transdérmica, parenteral, por inalação de spray, vaginal, retal ou por injeção intracraniana. O termo parenteral, como utilizado neste documento, inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injeção intracisternal ou técnicas de infusão. A administração por injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar em um determinado local também é contemplada. Geralmente, as composições são essencialmente isentas de pirogênios, bem como de outras impurezas que podem ser prejudiciais ao receptor.

[00166] Administrações únicas ou múltiplas de rVWF são realizadas com os níveis de dose e padrão sendo selecionados pelo médico assistente. Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada depende do tipo de doença a ser tratada (por exemplo, doença de von Willebrand), a gravidade e o curso da doença, se a droga é administrada para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, o histórico clínico do paciente e a resposta à droga, e a critério do médico assistente.

A. FORMULAÇÕES VWF LIOFILIZADAS

[00167] O presente método também fornece formulações de rVWF para uso nos métodos de tratamento aqui fornecidos. Em algumas modalidades, a composição rVWF é usada para a produção de uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, o rVWF pode ser formulado em uma formulação liofilizada.

[00168] Em algumas modalidades, as formulações que compreendem um polipeptídeo VWF da invenção são liofilizadas após purificação e antes da administração a um sujeito. A liofilização é realizada usando técnicas comuns na técnica e deve ser otimizada para a composição a ser desenvolvida (Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) and Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)).

[00169] Um ciclo de liofilização é, em um aspecto, composto de três etapas: congelamento, secagem primária e secagem secundária (A. P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977)). Na etapa de congelamento, a solução é resfriada para iniciar a formação de gelo. Além disso, esta etapa induz a cristalização do agente de volume. O gelo sublima na etapa de secagem primária, que é conduzida reduzindo a pressão da câmara abaixo da pressão de vapor do gelo, usando vácuo e introduzindo calor para promover a sublimação. Finalmente, a água adsorvida ou ligada é removida no estágio de secagem secundária sob pressão reduzida da câmara e a uma temperatura de prateleira elevada. O processo produz um material conhecido como torta liofilizada. Depois disso, a torta pode ser reconstituída com água estéril ou diluente adequado para injeção.

[00170] O ciclo de liofilização não apenas determina o estado físico final dos excipientes, mas também afeta outros parâmetros, como tempo de reconstituição, aparência, estabilidade e teor de umidade final. A estrutura da composição no estado congelado passa por várias transições (por exemplo,

transições de vidro, umedecimento e cristalizações) que ocorrem em temperaturas específicas e a estrutura pode ser usada para entender e otimizar o processo de liofilização. A temperatura de transição vítrea (Tg e/ou Tg') pode fornecer informações sobre o estado físico de um soluto e pode ser determinada por calorimetria de varredura diferencial (DSC). Tg e Tg' são um parâmetro importante que deve ser levado em consideração ao projetar o ciclo de liofilização. Por exemplo, Tg' é importante para a secagem primária. Além disso, no estado seco, a temperatura de transição vítrea fornece informações sobre a temperatura de armazenamento do produto final. B. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E EXCIPIENTES EM GERAL

[00171] Excipientes são aditivos que conferem ou intensificam a estabilidade e distribuição de um produto de droga (por exemplo, proteína). Independentemente do motivo de sua inclusão, os excipientes são um componente integral de uma formulação e, portanto, precisam ser seguros e bem tolerados pelos pacientes. Para drogas proteicas, a escolha dos excipientes é particularmente importante porque eles podem afetar a eficácia e a imunogenicidade da droga. Portanto, as formulações de proteínas precisam ser desenvolvidas com a seleção apropriada de excipientes que proporcionem estabilidade, segurança e comercialização adequadas.

[00172] Uma formulação liofilizada é, em um aspecto, pelo menos composta por um ou mais de um tampão, um agente de volume e um estabilizador. Nesse aspecto, a utilidade de um tensoativo é avaliada e selecionada nos casos em que a agregação durante a etapa de liofilização ou durante a reconstituição se torna um problema. Um agente tampão apropriado é incluído para manter a formulação dentro de zonas estáveis de pH durante a liofilização. Uma comparação dos componentes do excipiente contemplados para formulações de proteínas líquidas e liofilizadas é fornecida na Tabela 10.

Tabela 10: Componentes de excipientes de formulações de proteínas liofilizadas Componente Excipiente Função na formulação liofilizada Tampão o Manter o pH da formulação durante a liofilização e após a reconstituição Agente de o Estabilizadores incluem crio e licoprotetores tonicidade/estabilizador o Os exemplos incluem polióis, açúcares e polímeros o Os crioprotetores protegem as proteínas do estresse de congelamento o Os lioprotetores estabilizam as proteínas no estado liofilizado Agente de volume o Usado para intensificar a elegância do produto e evitar estouro o Fornece resistência estrutural para a torta de lio o Exemplos incluem manitol e glicina Tensoativo o Empregado se a agregação durante o processo de liofilização for um problema o Pode servir para reduzir os tempos de reconstituição o Os exemplos incluem polissorbato 20 e 80 Antioxidante o Normalmente não empregadas, as reações moleculares na torta de lio são geralmente retardadas Íons metálicos/agente o Pode ser incluído se um íon de metal específico for quelante incluído apenas como um cofator de onde o metal é necessário para a atividade de protease o Os agentes quelantes geralmente não são necessários em formulações de lio Conservantes o Apenas para formulações de múltiplas doses o Fornece proteção contra o crescimento microbiano na formulação o Geralmente é incluído no diluente de reconstituição (por exemplo, bWFI)

[00173] O principal desafio no desenvolvimento de formulações para proteínas é estabilizar o produto contra as tensões de fabricação, transporte e armazenamento. O papel dos excipientes da formulação é fornecer estabilização contra essas tensões. Excipientes também são empregados para reduzir a viscosidade de formulações de proteínas de alta concentração, a fim de permitir sua distribuição e aumentar a conveniência do paciente. Em geral, os excipientes podem ser classificados com base nos mecanismos pelos quais estabilizam as proteínas contra vários estresses químicos e físicos. Alguns excipientes são usados para aliviar os efeitos de um estresse específico ou para regular uma suscetibilidade particular de uma proteína específica. Outros excipientes têm efeitos mais gerais sobre as estabilidades físicas e covalentes das proteínas. Os excipientes descritos neste documento são organizados por seu tipo químico ou por seu papel funcional nas formulações. Breves descrições dos modos de estabilização são fornecidas ao discutir cada tipo de excipiente.

[00174] Dados os ensinamentos e orientações fornecidas neste documento, aqueles versados na técnica saberão qual quantidade ou faixa de excipiente pode ser incluída em qualquer formulação particular para atingir uma formulação biofarmacêutica da invenção que promove a retenção na estabilidade do biofarmacêutico (por exemplo, uma proteína). Por exemplo, a quantidade e o tipo de um sal a ser incluído em uma formulação biofarmacêutica da invenção são selecionados com base na osmolalidade desejada (por exemplo, isotônica, hipotônica ou hipertônica) da solução final, bem como as quantidades e osmolalidade de outros componentes a serem incluídos na formulação.

[00175] A título de exemplo, a inclusão de cerca de 5% de sorbitol pode atingir a isotonicidade, enquanto cerca de 9% de um excipiente de sacarose é necessário para atingir a isotonicidade. A seleção da quantidade ou faixa de concentrações de um ou mais excipientes que podem ser incluídos em uma formulação biofarmacêutica da invenção foi exemplificada acima por referência a sais, polióis e açúcares. No entanto, aqueles versados na técnica entenderão que as considerações aqui descritas e ainda exemplificadas por referência a excipientes específicos são igualmente aplicáveis a todos os tipos e combinações de excipientes, incluindo, por exemplo, sais, aminoácidos, outros agentes de tonicidade, tensoativos, estabilizadores, agentes de volume, crioprotetores, lioprotetores, antioxidantes, íons metálicos, agentes quelantes e/ou conservantes.

[00176] Além disso, quando um excipiente particular é relatado em concentração molar, aqueles versados na técnica reconhecerão que a porcentagem equivalente (%) p/v (por exemplo, (gramas de substância em uma amostra de solução/mL de solução) X 100%) de solução também é contemplada.

[00177] Claro, uma pessoa com conhecimento comum na técnica reconheceria que as concentrações dos excipientes aqui descritos compartilham uma interdependência dentro de uma formulação particular. A título de exemplo, a concentração de um agente de volume pode ser reduzida onde, por exemplo, há uma alta concentração de proteína ou onde, por exemplo, há uma alta concentração de agente estabilizador. Além disso, uma pessoa com habilidade comum na técnica reconheceria que, a fim de manter a isotonicidade de uma formulação particular na qual não há agente de volume, a concentração de um agente de estabilização seria ajustada em conformidade (por exemplo, uma quantidade "tonicificante" de estabilizador seria usada). Excipientes comuns são conhecidos na técnica e podem ser encontrados em Powell et al., Compendium of Excipients for Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52:238-311. C. TAMPÕES FARMACÊUTICOS E AGENTES TAMPÃO

[00178] A estabilidade de uma formulação de proteína farmacologicamente ativa é geralmente observada como máxima em uma faixa estreita de pH. Esta faixa de pH de estabilidade ideal precisa ser identificada precocemente durante os estudos de pré-formulação. Várias abordagens, tais como estudos de estabilidade acelerada e estudos de triagem calorimétrica, são úteis neste esforço (Remmele R.L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)). Uma vez que a formulação é finalizada, a proteína deve ser fabricada e mantida ao longo de sua vida útil. Portanto, os agentes tampão são quase sempre empregados para controlar o pH na formulação.

[00179] A capacidade tampão da espécie tampão é máxima a um pH igual ao pKa e diminui à medida que o pH aumenta ou diminui em relação a este valor. Noventa por cento da capacidade tampão existe dentro de uma unidade de pH de seu pKa. A capacidade do tampão também aumenta proporcionalmente com o aumento da concentração do tampão.

[00180] Vários fatores precisam ser considerados ao escolher um tampão. Em primeiro lugar, a espécie tampão e sua concentração precisam ser definidas com base em seu pKa e no pH da formulação desejada. Igualmente importante é garantir que o tampão seja compatível com a proteína e outros excipientes da formulação e não catalise nenhuma reação de degradação. Um terceiro aspecto importante a ser considerado é a sensação de ardência e irritação que o tampão pode induzir durante a administração. Por exemplo, o citrato é conhecido por causar ardor após a injeção (Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)). O potencial de ardência e irritação é maior para drogas administradas por via subcutânea (SC) ou intramuscular (IM), onde a solução de droga permanece no local por um período de tempo relativamente mais longo do que quando administrado por via IV, onde a formulação dilui-se rapidamente no sangue após a administração. Para formulações que são administradas por infusão IV direta, a quantidade total de tampão (e qualquer outro componente da formulação) precisa ser monitorada. Deve-se ter especial cuidado com os íons de potássio administrados na forma de tampão de fosfato de potássio, que podem induzir efeitos cardiovasculares em um paciente (Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)).

[00181] Os tampões para formulações liofilizadas precisam de consideração adicional. Alguns tampões, como o fosfato de sódio, podem cristalizar a partir da fase amorfa da proteína durante o congelamento, resultando em mudanças no pH. Outros tampões comuns, como acetato e imidazol, podem sublimar ou evaporar durante o processo de liofilização, alterando assim o pH da formulação durante a liofilização ou após a reconstituição.

[00182] O sistema tampão presente nas composições é selecionado para ser fisiologicamente compatível e para manter um pH desejado da formulação farmacêutica. Em uma modalidade, o pH da solução está entre pH 2,0 e pH 12,0. Por exemplo, o pH da solução pode ser 2.0, 2.3, 2.5, 2.7, 3.0, 3.3, 3.5, 3.7, 4.0,

4.3, 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7,

9.0, 9.3, 9.5, 9.7, 10.0, 10.3, 10.5, 10.7, 11.0, 11.3, 11.5, 11.7, ou 12.0.

[00183] O composto de tamponamento de pH pode estar presente em qualquer quantidade adequada para manter o pH da formulação em um nível predeterminado. Em uma modalidade, a concentração de tampão de pH está entre 0,1 mM e 500 mM (1 M). Por exemplo, é contemplado que o agente tampão de pH é pelo menos 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 ou 500 mM.

[00184] Os agentes tamponantes de pH exemplificativos usados para tamponar a formulação conforme estabelecido neste documento incluem, mas não estão limitados a ácidos orgânicos, glicina, histidina, glutamato, succinato,

fosfato, acetato, citrato, Tris, HEPES e aminoácidos ou misturas de aminoácidos, incluindo, mas não se limitando a aspartato, histidina e glicina. Em uma modalidade da presente invenção, o agente tamponante é citrato. D. ESTABILIZADORES FARMACÊUTICOS E AGENTES DE VOLUME

[00185] Em um aspecto das presentes formulações farmacêuticas, um estabilizador (ou uma combinação de estabilizantes) é adicionado para prevenir ou reduzir a agregação induzida pelo armazenamento e degradação química. Uma solução turva ou obscura na reconstituição indica que a proteína precipitou ou pelo menos agregou. O termo "estabilizador" significa um excipiente capaz de prevenir a agregação ou degradação física, incluindo degradação química (por exemplo, autólise, desamidação, oxidação, etc.) em um estado aquoso. Os estabilizadores contemplados incluem, mas não estão limitados a, sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glicose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glucosamina, frutose, manitol, sorbitol, glicina, arginina HCL, compostos poli-hidroxi, incluindo polissacarídeos como dextrano, amido, hidroxietilamido, ciclodextrinas, N-metilpirolideno, celulose e ácido hialurônico, cloreto de sódio (Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)). Nas presentes formulações, o estabilizante é incorporado em uma concentração de cerca de 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 ou 1000 mM. Em uma modalidade da presente invenção, manitol e trealose são usados como agentes estabilizadores.

[00186] Se desejado, as formulações também incluem quantidades apropriadas de agentes de volume e reguladores da osmolalidade. Os agentes de volume incluem, por exemplo e sem limitação, manitol, glicina, sacarose, polímeros como dextrano, polivinilpirolidona, carboximetilcelulose, lactose, sorbitol, trealose ou xilitol. Em uma modalidade, o agente de volume é manitol.

O agente de volume é incorporado em uma concentração de cerca de 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 ou 1000 mM. E. TENSOATIVOS FARMACÊUTICOS

[00187] As proteínas têm uma alta propensão a interagir com as superfícies, tornando-as suscetíveis à adsorção e desnaturação nas interfaces ar- líquido, frasco-líquido e líquido-líquido (óleo de silicone). Observou-se que esta via de degradação é inversamente dependente da concentração de proteína e resulta na formação de agregados de proteína solúvel e insolúvel ou na perda de proteína da solução por adsorção às superfícies. Além da adsorção da superfície do recipiente, a degradação induzida pela superfície é exacerbada com agitação física, como ocorreria durante o transporte e manuseio do produto.

[00188] Os tensoativos são comumente usados em formulações de proteínas para prevenir a degradação induzida pela superfície. Os tensoativos são moléculas anfipáticas com a capacidade de competir com proteínas por posições interfaciais. As porções hidrofóbicas das moléculas de tensoativos ocupam posições interfaciais (por exemplo, ar/líquido), enquanto as porções hidrofílicas das moléculas permanecem orientadas para o solvente em massa. Em concentrações suficientes (normalmente em torno da concentração micelar crítica do detergente), uma camada superficial de moléculas de tensoativos serve para evitar que as moléculas de proteína sejam adsorvidas na interface. Assim, a degradação induzida pela superfície é minimizada. Os tensoativos aqui contemplados incluem, sem limitação, ésteres de ácidos graxos de polietoxilatos de sorbitano, por exemplo, polissorbato 20 e polissorbato 80. Os dois diferem apenas no comprimento da cadeia alifática que confere caráter hidrofóbico às moléculas, C-12 e C-18, respectivamente. Consequentemente, o polissorbato-80 é mais tensoativo e tem uma concentração micelar crítica mais baixa do que o polissorbato-20.

[00189] Os detergentes também podem afetar a estabilidade conformacional termodinâmica das proteínas. Aqui, novamente, os efeitos de um determinado excipiente detergente serão específicos para proteínas. Por exemplo, foi demonstrado que os polissorbatos reduzem a estabilidade de algumas proteínas e aumentam a estabilidade de outras. A desestabilização de proteínas por detergente pode ser racionalizada em termos das caudas hidrofóbicas das moléculas de detergente que podem se envolver em ligação específica com estados de proteína parcialmente ou totalmente desdobrados. Esses tipos de interações podem causar uma mudança no equilíbrio conformacional em direção aos estados de proteína mais expandidos (por exemplo, aumentando a exposição de porções hidrofóbicas da molécula de proteína em complemento ao polissorbato de ligação). Alternativamente, se o estado nativo da proteína exibir algumas superfícies hidrofóbicas, a ligação do detergente ao estado nativo pode estabilizar essa conformação.

[00190] Outro aspecto dos polissorbatos é que eles são inerentemente suscetíveis à degradação oxidativa. Frequentemente, como matéria-prima, eles contêm quantidades suficientes de peróxidos para causar a oxidação das cadeias laterais de resíduos de proteínas, especialmente a metionina. O potencial de dano oxidativo decorrente da adição de estabilizante enfatiza o ponto de que as menores concentrações eficazes de excipientes devem ser usadas nas formulações. Para tensoativos, a concentração eficaz para uma determinada proteína dependerá do mecanismo de estabilização.

[00191] Os tensoativos também são adicionados em quantidades apropriadas para evitar o fenômeno de agregação relacionado à superfície durante o congelamento e a secagem (Chang, B, J. Pharm. Sci. 85:1325, (1996)). Assim, tensoativos exemplificativos incluem, sem limitação, tensoativos aniônicos, catiônicos, não iônicos, zwitteriônicos e anfotéricos, incluindo tensoativos derivados de aminoácidos de ocorrência natural. Os tensoativos aniônicos incluem, mas não estão limitados a, lauril sulfato de sódio, dioctil sulfo succinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio, ácido quenodeoxicólico, sal de sódio de N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, sal de sódio de ácido 1- octanossulfônico, colato de sódio hidratado, desoxicolato de sódio, e sal de sódio do ácido glico-oxicólico. Os tensoativos catiônicos incluem, mas não estão limitados a, cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridínio mono-hidratado e brometo de hexadeciltrimetilamônio. Os tensoativos zwitteriônicos incluem, mas não estão limitados a, CHAPS, CHAPSO, SB3-10 e SB3-12. Os tensoativos não iônicos incluem, mas não estão limitados a, digitonina, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20 e TWEEN-80. Os tensoativos também incluem, mas não estão limitados a lauromacrogol 400, polioxil 40 estearato, óleo de rícino hidrogenado de polioxietileno 10, 40, 50 e 60, monoestearato de glicerol, polissorbato 40, 60, 65 e 80, lecitina de soja e outros fosfolipídeos, como dioleil fosfatidil colina (DOPC), dimiristoilfosfatidil glicerol (DMPG), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) e (dioleil fosfatidil glicerol) DOPG; éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. As composições compreendendo estes tensoativos, individualmente ou como uma mistura em diferentes razões, são portanto fornecidas adicionalmente. Em uma modalidade da presente invenção, o tensoativo é TWEEN-80. Nas presentes formulações, o tensoativo é incorporado em uma concentração de cerca de 0,01 a cerca de 0,5 g/L. Nas formulações fornecidas, a concentração de tensoativo é 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0 g/L. F. SAIS FARMACÊUTICOS

[00192] Os sais são frequentemente adicionados para aumentar a força iônica da formulação, o que pode ser importante para a solubilidade da proteína, estabilidade física e isotonicidade. Os sais podem afetar a estabilidade física das proteínas de várias maneiras. Os íons podem estabilizar o estado nativo das proteínas ligando-se a resíduos carregados na superfície da proteína. Alternativamente, os sais podem estabilizar o estado desnaturado ligando-se a grupos peptídicos ao longo da espinha dorsal da proteína (-CONH-). Os sais também podem estabilizar a conformação nativa da proteína protegendo as interações eletrostáticas repulsivas entre os resíduos dentro de uma molécula de proteína. Os sais nas formulações de proteínas também podem proteger as interações eletrostáticas atrativas entre as moléculas de proteínas que podem levar à agregação e insolubilidade das proteínas. Nas formulações fornecidas, a concentração de sal está entre 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 e 500 mM. G. OUTROS COMPONENTES DE EXCIPIENTES COMUNS: AMINOÁCIDOS

FARMACÊUTICOS

[00193] Os aminoácidos encontraram uso versátil em formulações de proteínas como tampões, agentes de volume, estabilizadores e antioxidantes. Assim, em um aspecto, histidina e ácido glutâmico são empregados para tamponar formulações de proteína na faixa de pH de 5,5 - 6,5 e 4,0 - 5,5, respectivamente. O grupo imidazol da histidina possui um pKa = 6,0 e o grupo carboxil da cadeia lateral do ácido glutâmico possui um pKa de 4,3 o que torna esses aminoácidos adequados para tamponamento em suas respectivas faixas de pH. O ácido glutâmico é particularmente útil em tais casos. A histidina é comumente encontrada em formulações de proteínas comercializadas e este aminoácido fornece uma alternativa ao citrato, um tampão conhecido por pinicar após a injeção. Curiosamente, a histidina também foi relatada como tendo um efeito estabilizador, com relação à agregação quando usada em altas concentrações em apresentações líquidas e liofilizadas (Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)). A histidina também foi observada por outros para reduzir a viscosidade de uma formulação de alta concentração de proteína. No entanto, no mesmo estudo, os autores observaram agregação e descoloração aumentadas em formulações contendo histidina durante estudos de congelamento-descongelamento do anticorpo em recipientes de aço inoxidável. Outra nota de cautela com a histidina é que ela sofre foto-oxidação na presença de íons metálicos (Tomita M, et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)). O uso de metionina como antioxidante em formulações parece promissor; observou- se que é eficaz contra várias tensões oxidativas (Lam XM, et al., J Pharm ScL, 86(11): 1250-5 (1997)).

[00194] Em vários aspectos, são fornecidas formulações que incluem um ou mais dos aminoácidos glicina, prolina, serina, arginina e alanina que estabilizam as proteínas pelo mecanismo de exclusão preferencial. A glicina também é um agente de volume comumente usado em formulações liofilizadas. A arginina mostrou ser um agente eficaz na inibição da agregação e tem sido usada em formulações líquidas e liofilizadas. Nas formulações fornecidas, a concentração de aminoácidos está entre 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 e 500 mM. Em uma modalidade da presente invenção, o aminoácido é glicina. H. OUTROS COMPONENTES DE EXCIPIENTES COMUNS: ANTIOXIDANTES

FARMACÊUTICOS

[00195] A oxidação de resíduos de proteínas surge de várias fontes diferentes. Além da adição de antioxidantes específicos, a prevenção de danos oxidativos às proteínas envolve o controle cuidadoso de uma série de fatores ao longo do processo de fabricação e armazenamento do produto, como oxigênio atmosférico, temperatura, exposição à luz e contaminação química. A invenção,

portanto, contempla o uso de antioxidantes farmacêuticos incluindo, sem limitação, agentes redutores, captadores de oxigênio/radicais livres ou agentes quelantes. Os antioxidantes em formulações de proteínas terapêuticas são, em um aspecto, solúveis em água e permanecem ativos durante toda a vida útil do produto. Agentes redutores e eliminadores de oxigênio/radicais livres agem ablando espécies ativas de oxigênio em solução. Os agentes quelantes, como o EDTA, são eficazes ao se ligar a contaminantes metálicos que promovem a formação de radicais livres. Por exemplo, o EDTA foi utilizado na formulação líquida do fator de crescimento de fibroblasto ácido para inibir a oxidação catalisada por íon metálico de resíduos de cisteína.

[00196] Além da eficácia de vários excipientes para prevenir a oxidação de proteínas, o potencial dos próprios antioxidantes de induzirem outras alterações covalentes ou físicas na proteína é preocupante. Por exemplo, os agentes redutores podem causar a interrupção das ligações dissulfeto intramoleculares, o que pode levar ao embaralhamento de dissulfeto. Na presença de íons de metal de transição, foi demonstrado que o ácido ascórbico e o EDTA promovem a oxidação da metionina em várias proteínas e peptídeos (Akers MJ, and Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editors. Pharmaceutical Science. Taylor and Francis, UK (1999)); Fransson J.R., /. Pharm. Sci. 86(9): 4046-1050 (1997); Yin J, et al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)). Foi relatado que o tiossulfato de sódio reduz os níveis de oxidação de metionina induzida pela luz e temperatura em rhuMab HER2; no entanto, a formação de um aduto tiossulfato-proteína também foi relatada neste estudo (Lam XM, Yang JY, et al., J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997)). A seleção de um antioxidante apropriado é feita de acordo com as tensões e sensibilidades específicas da proteína. Os antioxidantes contemplados em certos aspectos incluem, sem limitação, agentes redutores e captadores de oxigênio/radicais livres, EDTA e tiossulfato de sódio. I. OUTROS COMPONENTES DE EXCIPIENTES COMUNS: ÍONS METÁLICOS

FARMACÊUTICOS

[00197] Em geral, os íons de metais de transição são indesejados nas formulações de proteínas porque podem catalisar reações de degradação física e química nas proteínas. No entanto, íons metálicos específicos são incluídos em formulações quando são cofatores de proteínas e em formulações de suspensão de proteínas onde formam complexos de coordenação (por exemplo, suspensão de zinco de insulina). Recentemente, o uso de íons magnésio (10-120 mM) foi proposto para inibir a isomerização do ácido aspártico em ácido isoaspártico (WO 2004039337).

[00198] Dois exemplos em que os íons metálicos conferem estabilidade ou atividade aumentada em proteínas são a desoxirribonuclease humana (rhDNase, Pulmozyme®) e o Fator VIII. No caso da rhDNase, os íons Ca+ 2 (até 100 mM) aumentaram a estabilidade da enzima através de um sítio de ligação específico (Chen B, et al.,/Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999)). Na verdade, a remoção dos íons de cálcio da solução com EGTA causou um aumento na desamidação e agregação. No entanto, esse efeito foi observado apenas com íons Ca+2 ; outros cátions divalentes Mg+2, Mn+2 e Zn+2 foram observados para desestabilizar a rhDNase. Efeitos semelhantes foram observados no Fator VIII. Os íons Ca+2 e Sr+2 estabilizaram a proteína Mg+2, Mn+2 e Zn+2, Cu+2 e Fe+2 desestabilizaram a enzima (Fatouros, A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997). Em um estudo separado com Fator VIII, um aumento significativo na taxa de agregação foi observado na presença de íons Al+3 (Derrick TS, et al., /. Pharm. Sci., 93(10): 2549-57 (2004)). Os autores observam que outros excipientes, como sais de tampão, estão frequentemente contaminados com íons Al+3 e ilustram a necessidade de usar excipientes de qualidade apropriada em produtos formulados. J. OUTROS COMPONENTES DE EXCIPIENTES COMUNS: CONSERVANTES

FARMACÊUTICOS

[00199] Os conservantes são necessários no desenvolvimento de formulações parenterais multiuso que envolvem mais de uma extração do mesmo recipiente. Sua função principal é inibir o crescimento microbiano e garantir a esterilidade do produto ao longo de sua vida útil ou período de uso do produto de droga. Os conservantes comumente usados incluem, sem limitação, álcool benzílico, fenol e m-cresol. Embora os conservantes tenham uma longa história de uso, o desenvolvimento de formulações de proteínas que incluam conservantes pode ser desafiador. Os conservantes quase sempre têm um efeito desestabilizador (agregação) nas proteínas, e isso se tornou um fator importante na limitação do seu uso em formulações de proteínas multidoses (Roy S, et al., J Pharm ScL, 94(2): 382-96 (2005)).

[00200] Até o momento, a maioria dos medicamentos proteicos foi formulada apenas para uso único. No entanto, quando as formulações multidose são possíveis, elas têm a vantagem adicional de permitir a conveniência do paciente e aumentar a comercialização. Um bom exemplo é o do hormônio de crescimento humano (hGH), em que o desenvolvimento de formulações preservadas levou à comercialização de apresentações de caneta injetável multiuso mais convenientes. Pelo menos quatro desses dispositivos de caneta contendo formulações preservadas de hGH estão atualmente disponíveis no mercado. Norditropin® (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQ® (líquido, Genentech) & Genotropin (liofilizado - cartucho de câmara dupla, Pharmacia & Upjohn) contêm fenol, enquanto Somatrope® (Eli Lilly) é formulado com m- cresol.

[00201] Vários aspectos precisam ser considerados durante o desenvolvimento da formulação de formas de dosagem preservadas. A concentração de conservante eficaz no produto de droga precisa ser otimizada. Isso requer o teste de um determinado conservante na forma de dosagem com faixas de concentração que conferem eficácia antimicrobiana sem comprometer a estabilidade da proteína. Por exemplo, três conservantes foram selecionados com sucesso no desenvolvimento de uma formulação líquida para o receptor de interleucina-1 (Tipo I), usando calorimetria de varredura diferencial (DSC). Os conservantes foram ordenados com base no seu impacto na estabilidade em concentrações normalmente utilizadas nos produtos comercializados (Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)).

[00202] O desenvolvimento de formulações líquidas contendo conservantes é mais desafiador do que as formulações liofilizadas. Os produtos liofilizados podem ser liofilizados sem o conservante e reconstituídos com um diluente contendo conservante no momento do uso. Isso diminui o tempo durante o qual um conservante está em contato com a proteína, minimizando significativamente os riscos de estabilidade associados. Com formulações líquidas, a eficácia e estabilidade do conservante devem ser mantidas durante todo o prazo de validade do produto (- 18 -24 meses). Um ponto importante a se notar é que a eficácia do conservante deve ser demonstrada na formulação final que contém a droga ativa e todos os componentes do excipiente.

[00203] Alguns conservantes podem causar reações no sítio da injeção, que é outro fator que deve ser considerado ao escolher um conservante. Em ensaios clínicos que se concentraram na avaliação de conservantes e tampões em Norditropina, a percepção da dor foi observada como sendo inferior em formulações contendo fenol e álcool benzílico em comparação com uma formulação contendo m-cresol (Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3:98-103 (2004)). Curiosamente, entre os conservantes comumente usados, o álcool benzílico possui propriedades anestésicas (Minogue SC, and Sun DA., AnesthAnalg., 100(3): 683-6 (2005)). Em vários aspectos, o uso de conservantes fornece um benefício que supera quaisquer efeitos colaterais. K. MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

[00204] A presente invenção contempla ainda métodos para a preparação de formulações farmacêuticas.

[00205] Os presentes métodos compreendem ainda uma ou mais das seguintes etapas: adicionar um agente estabilizador, conforme descrito neste documento, à referida mistura antes da liofilização, adicionar pelo menos um agente selecionado de um agente de volume, um agente regulador da osmolalidade e um tensoativo, cada um dos quais como aqui descrito, à referida mistura antes da liofilização.

[00206] A prática de reconstituição padrão para material liofilizado é adicionar de volta um volume de água pura ou água estéril para injeção (WFI) (normalmente equivalente ao volume removido durante a liofilização), embora soluções diluídas de agentes antibacterianos sejam às vezes usadas na produção de produtos farmacêuticos para administração parenteral (Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)). Consequentemente, são fornecidos métodos para a preparação de composições de rVWF reconstituídas compreendendo a etapa de adição de um diluente a uma composição de rVWF liofilizada da invenção.

[00207] O material liofilizado pode ser reconstituído como uma solução aquosa. Uma variedade de transportadores aquosos, por exemplo, água estéril para injeção, água com conservantes para uso em doses múltiplas ou água com quantidades adequadas de tensoativos (por exemplo, uma suspensão aquosa que contém o composto ativo em mistura com excipientes adequados para a fabricação de suspensões). Em vários aspectos, tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo e sem limitação, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentes dispersantes ou umectantes são um fosfatídeo de ocorrência natural, por exemplo e sem limitação, lecitina ou produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo e sem limitação, estearato de polioxietileno ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo e sem limitação, heptadecaetil-eneoxicetanol ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e um hexitol, como mono-oleato de polioxietileno sorbitol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo e sem limitação, mono-oleato de polietileno sorbitano. Em vários aspectos, as suspensões aquosas também contêm um ou mais conservantes, por exemplo e sem limitação, etil, ou n-propil, p- hidroxibenzoato. L. FORMULAÇÃO EXEMPLIFICATIVA DE RVWF PARA ADMINISTRAÇÃO

[00208] Em algumas modalidades, os presentes métodos fornecem uma formulação intensificada que permite um produto final com alta potência (alta concentração de rVWF e estabilidade intensificada de longo prazo) a fim de reduzir o volume para o tratamento (100 IU/ml a 10.000 IU/ml). Em algumas modalidades, a concentração de rVWF na formulação para administração é de cerca de 100 IU/ml a 10.000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração de rVWF na formulação para administração é de cerca de 500 IU/ml a 10.000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração de rVWF na formulação para administração é de cerca de 1.000 IU/ml a 10.000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração de rVWF na formulação para administração é de cerca de 2.000 IU/ml a 10.000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração de rVWF na formulação para administração é de cerca de 3.000 IU/ml a 10.000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração de rVWF na formulação para administração é de cerca de 4.000 IU/ml a 10.000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração de rVWF na formulação para administração é de cerca de 5.000 IU/ml a 10.000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração de rVWF na formulação para administração é de cerca de 6.000 IU/ml a 10.000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração de rVWF na formulação para administração é de cerca de 7.000 IU/ml a 10.000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração de rVWF na formulação para administração é de cerca de 8.000 IU/ml a 10.000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração de rVWF na formulação para administração é de cerca de 9.000 IU/ml a 10.000 IU/ml.

[00209] Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende um ou mais compostos zwitteriônicos, incluindo, por exemplo, aminoácidos como Histidina, Glicina, Arginina. Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende um componente com característica anfipática tendo um mínimo de um grupo hidrofóbico e um hidrofílico, incluindo, por exemplo, polissorbato 80, octilpiranosídeo, dipeptídeos e/ou peptídeos anfipáticos. Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende um açúcar não redutor ou álcool de açúcar ou dissacarídeos, incluindo, por exemplo, sorbitol, manitol, sacarose ou trealose. Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende um sal solúvel em água não tóxico, incluindo, por exemplo, cloreto de sódio, que resulta em uma osmolalidade fisiológica. Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende um pH na faixa de 6,0 a 8,0. Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende um pH de cerca de 6,0, cerca de 6,5, cerca de 7, cerca de 7,5 ou cerca de 8,0. Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende um ou mais cátions bivalentes que estabilizam rVWF, incluindo, por exemplo, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+ e/ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende cerca de 1 mM a cerca de 50 mM de Glicina, cerca de 1 mM a cerca de 50 mM de Histidina, cerca de zero a cerca de 300 mM de cloreto de sódio (por exemplo, menos de 300 mM de sódio), cerca de 0,01% a cerca de 0,05% de polissorbato 20 (ou polissorbato 80) e cerca de 0,5% a cerca de 20% (p/p) de sacarose com um pH de cerca de 7,0 e tendo uma osmolaridade fisiológica no momento da administração.

[00210] Em algumas modalidades, a formulação para administração pode ser liofilizada. Em algumas modalidades, a formulação para administração é estável e pode ser armazenada no estado líquido a cerca de 2°C a cerca de 8°C, bem como a cerca de 18°C a cerca de 25°C. Em algumas modalidades, a formulação para administração é estável e pode ser armazenada no estado líquido a cerca de 2°C a cerca de 8°C. Em algumas modalidades, a formulação para administração é estável e pode ser armazenada no estado líquido a cerca de 18°C a cerca de 25°C. V. ADMINISTRAÇÃO DE RVWF PARA MÉTODOS DE TRATAMENTO

PROFILÁTICO EM PACIENTES COM VWD GRAVE

[00211] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece para tratar profilaticamente episódios de sangramento espontâneo em um sujeito com doença de von Willebrand grave (VWD). Em algumas modalidades, o tratamento profilático compreende administrar ao sujeito um fator de von Willebrand recombinante (rVWF) a fim de reduzir a frequência e/ou duração dos episódios de sangramento espontâneo.

[00212] Em algumas modalidades, os episódios de sangramento espontâneo incluem qualquer episódio não relacionado ao trauma. Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é indicada por uma redução no número de episódios de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, uma redução é o número de episódios de sangramento espontâneo é indicada por uma redução na taxa de sangramento anual (ABR). Em algumas modalidades, o ABR de pré-tratamento é determinado com base na seguinte fórmula: número de sangramentos/dias sem regime de tratamento. Em algumas modalidades, o ABR de pré-tratamento é determinado com base na seguinte fórmula: número de sangramentos/12 meses antes do tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, o ABR profilático (ABR após tratamento profilático) é determinado com base na seguinte fórmula: número de sangramentos/dias no regime de tratamento.

[00213] Em algumas modalidades, uma redução de ≥25% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante a profilaxia de rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento é indicativo de eficácia do tratamento profilático. Em algumas modalidades, uma redução de ≥30% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante tratamento profilático com rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento é indicativo de eficácia do tratamento profilático. Em algumas modalidades, uma redução de ≥35% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante o tratamento profilático com rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento é indicativo de eficácia do tratamento profilático. Em algumas modalidades, uma redução de ≥40% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante tratamento profilático com rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento é indicativo de eficácia do tratamento profilático. Em algumas modalidades, uma redução de ≥45% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante o tratamento profilático com rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento é indicativo de eficácia do tratamento profilático.

Em algumas modalidades, uma redução de ≥50% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante tratamento profilático com rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento é indicativo de eficácia do tratamento profilático.

Em algumas modalidades, uma redução de ≥55% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante o tratamento profilático com rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento é indicativo de eficácia do tratamento profilático.

Em algumas modalidades, uma redução de ≥60% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante tratamento profilático com rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento é indicativo de eficácia do tratamento profilático.

Em algumas modalidades, uma redução de ≥65% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante o tratamento profilático com rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento é indicativo de eficácia do tratamento profilático.

Em algumas modalidades, uma redução de ≥70% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante tratamento profilático com rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento é indicativo de eficácia do tratamento profilático.

Em algumas modalidades, uma redução de ≥75% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante o tratamento profilático com rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento é indicativo de eficácia do tratamento profilático.

Em algumas modalidades, uma redução de ≥80% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante tratamento profilático com rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento é indicativo de eficácia do tratamento profilático.

Em algumas modalidades, uma redução de ≥85% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante o tratamento profilático com rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento é indicativo de eficácia do tratamento profilático. Em algumas modalidades, uma redução de ≥90% na taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante tratamento profilático com rVWF em relação ao ABR de pré-tratamento é indicativo de eficácia do tratamento profilático.

[00214] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático pode ser medida através da obtenção de amostras e exame das atividades de vWF: RCo e/ou FVIII antes e após o tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, as amostras para examinar as atividades de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII: C, VWF: RCo, VWF: Ag e/ou VWF são obtidas antes do tratamento profilático com rVWF e após o tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, amostras para examinar FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e atividade de capacidade de ligação de colágeno de VWF são obtidas 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 48 horas, 72 horas ou 96 horas, após tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, amostras para examinar a atividade de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII: C, VWF: RCo, VWF: Ag e VWF são obtidas 25 a 31 dias após o tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, as amostras para FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e atividade de capacidade de ligação ao colágeno de VWF são obtidas após ou durante um episódio de sangramento e em tais modalidades, uma amostra é retirada antes da administração de rVWF, 2 horas após administração e a cada 12-24 horas até a resolução do evento de sangramento. Em algumas modalidades, a eficácia de tratamento pode ser determinada após ou durante um episódio de sangramento, e em tais modalidades, amostras para examinar FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou atividades de capacidade de ligação de colágeno de VWF são obtidas após o episódio de sangramento e ainda em que as amostras são obtidas antes de administração de rVWF, 2 horas após administração de e, em seguida, a cada 12-24 horas até resolução do evento de sangramento. Em algumas modalidades, a atividade de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII: C, VWF: RCo, VWF: Ag e VWF versus perfis de tempo são determinados com base nas amostras a fim de monitorar a eficácia do tratamento para o tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, FVIII: C também é medido por um ensaio de coagulação de 1 estágio versus perfis de tempo, a fim de monitorar a eficácia do tratamento para o tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, os níveis de atividade de capacidade de ligação ao colágeno FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, e/ou VWF são melhorados após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, os níveis de atividade de capacidade de ligação ao colágeno, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, e/ou VWF são melhorados após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF e esta melhora é indicativa da eficácia do tratamento. Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma melhoria nos níveis de atividade de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII: C, VWF: RCo, VWF: Ag e/ou VWF após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, uma melhoria nos níveis de atividade de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, e/ou VWF inclui uma mudança nos níveis de atividade de modo que os níveis de atividade estejam mais próximos dos níveis normais, por exemplo, níveis em um sujeito que não tem VWD.

[00215] Em alguns aspectos, a eficácia do tratamento profilático da administração de rVWF é determinada após ou durante um episódio de sangramento.

Em algumas modalidades, as amostras para examinar as atividades de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, e/ou VWF são obtidas após o episódio de sangramento.

Em algumas modalidades, as amostras para examinar as atividades de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, e/ou VWF são obtidas durante o episódio de sangramento.

Em alguns casos, as amostras são obtidas de um paciente durante um episódio de sangramento, de modo que as atividades de capacidade de ligação ao colágeno de FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, e/ou VWF possam ser determinadas usando as amostras.

Em outros casos, as amostras são obtidas de um paciente após um episódio de sangramento.

Em algumas modalidades, as amostras são obtidas antes da administração de rVWF.

Em algumas modalidades, as amostras são obtidas após a administração de rVWF.

Em algumas modalidades, as amostras são obtidas 2 horas após a administração de rVWF.

Em algumas modalidades, as amostras são obtidas a cada 12-24 horas até a resolução do episódio de sangramento.

Em certas modalidades, as amostras são obtidas antes da administração de rVWF e 2 horas após a administração de rVWF.

Em algumas modalidades, as amostras são obtidas antes da administração de rVWF e a cada 12-24 horas até a resolução do episódio de sangramento.

Em outras modalidades, as amostras são obtidas antes da administração de rVWF, 2 horas após a administração de rVWF e a cada 12-24 horas até a resolução do episódio de sangramento.

Como tal, as amostras podem ser obtidas antes da administração de rVWF e antes de um episódio de sangramento.

Em algumas modalidades, as amostras são obtidas após a administração de rVWF e antes de um episódio de sangramento.

Em algumas modalidades, as amostras são obtidas após a administração de rVWF e durante um episódio de sangramento.

Em certas modalidades, as amostras são obtidas após a administração de rVWF e após a resolução de um episódio de sangramento.

[00216] Em alguns aspectos, o rVWF é administrado a um sujeito em uma faixa de 40-80 IU/kg, por exemplo, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 40- 100, 40 -80, 50-80, 60-80, 70-80, 40-50, 40-60, 40-70, 40-50, 50-60, 60-70 ou 70- 80 IU/kg. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado pelo menos uma vez por semana para prevenir um episódio de sangramento espontâneo. Em alguns casos, o sujeito recebe uma única administração de rVWF. Em alguns casos, o sujeito é administrado com uma única infusão de rVWF.

[00217] Em alguns aspectos, o rVWF é administrado a um sujeito em uma faixa de 40-80 IU/kg, por exemplo, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 40- 100, 40 -80, 50-80, 60-80, 70-80, 40-50, 40-60, 40-70, 40-50, 50-60, 60-70 ou 70- 80 IU/kg. Em algumas modalidades, a dose varia de 40 IU/kg a 60 IU/kg. Em algumas modalidades, a dose varia de 45 IU/kg a 55 IU/kg. Em algumas modalidades, a dose é de cerca de 40 IU/kg, cerca de 50 IU/kg ou cerca de 60 IU/kg. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado pelo menos duas vezes a cada semana para prevenir um episódio de sangramento espontâneo. Em outras modalidades, o rVWF é administrado duas ou mais vezes, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais vezes, por semana para prevenir um episódio de sangramento espontâneo. Em alguns casos, o sujeito recebe duas administrações de rVWF. Em alguns casos, o sujeito recebe duas infusões de rVWF. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado duas vezes por semana. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado duas vezes por semana como uma dose de infusão que varia de 40 IU/kg a 60 IU/kg. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado duas vezes por semana como uma dose de infusão que varia de 40 IU/kg a 60 IU/kg por infusão IV. Cada infusão pode incluir uma faixa de cerca de 40-80 IU/kg rVWF, por exemplo, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 40-80, 50-80, 60-80, 70- 80,

40-50, 40-60, 40-70, 40-50, 50-60, 60-70 ou 70-80 IU/kg rVWF. Em algumas modalidades, cada infusão varia de 40 IU/kg a 60 IU/kg. Em algumas modalidades, cada infusão varia de 45 IU/kg a 55 IU/kg. Em algumas modalidades, cada infusão é de cerca de 40 IU/kg, cerca de 50 IU/kg ou cerca de 60 IU/kg. Em algumas modalidades, as infusões podem ser substancialmente iguais em quantidade. Por exemplo, uma primeira infusão e uma segunda infusão podem ser substancialmente iguais em quantidade. Em algumas modalidades, a dose total de rVWF administrada ao sujeito é de cerca de 40-160 IU/kg, por exemplo, 40-150, 40-125, 40-100, 40-90, 40-75, 50-150, 50- 100, 75- 150, 100-125 ou 100-160 IU/kg.

[00218] Em alguns aspectos, o rVWF é administrado a um sujeito em uma faixa de 40-80 IU/kg, por exemplo, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 40- 100, 40 -80, 50-80, 60-80, 70-80, 40-50, 40-60, 40-70, 40-50, 50-60, 60-70 ou 70- 80 IU/kg. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado pelo menos duas vezes a cada semana para prevenir um episódio de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado pelo menos três vezes a cada semana para prevenir um episódio de sangramento espontâneo. Em outras modalidades, o rVWF é administrado três ou mais vezes, por exemplo, 3, 4, 5 ou mais vezes, por semana para prevenir um episódio de sangramento espontâneo. Em alguns casos, o sujeito recebe três administrações de rVWF. Em alguns casos, o sujeito recebe três infusões de rVWF. Cada infusão pode incluir uma faixa de cerca de 40-80 IU/kg rVWF, por exemplo, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 40- 80, 50-80, 60-80, 70- 80, 40-50, 40-60, 40-70, 40-50, 50-60, 60-70 ou 70-80 IU/kg rVWF. Em algumas modalidades, as infusões podem ser substancialmente iguais em quantidade. Por exemplo, uma primeira infusão, segunda infusão e terceira infusão podem ser substancialmente iguais em quantidade. Em algumas modalidades, a dose total de rVWF administrada ao sujeito é de cerca de 80-240

IU/kg, por exemplo, 120-240, 140-240, 140-200, 160-240, 180-240, 200-240, 80- 120, 80-160, 80-200, 120-220 ou 220-240 IU/kg. Em algumas modalidades, a dose total de rVWF administrada ao sujeito é inferior a cerca de 160 IU/kg por semana. Em algumas modalidades, a dose total de rVWF administrada ao sujeito é inferior a cerca de 240 IU/kg por semana.

[00219] Em algumas modalidades, o rVWF é administrado pelo menos uma vez por semana, pelo menos duas (duas vezes) por semana, pelo menos três vezes (três vezes) por semana, todos os dias, todos os dias, a cada 2-3 dias, a cada 2-4 dias, a cada 2-5 dias e assim por diante. Em alguns casos, o rVWF é administrado por um total de 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias ou 7 dias ao longo de um período de 7 dias. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado em dias não consecutivos. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado em dias consecutivos.

[00220] Em algumas modalidades, o rVWF é administrado pelo menos a cada 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 60 horas, 72 horas, 84 horas ou 96 horas. Em alguns casos, o rVWF é administrado pelo menos a cada 60 horas, 72 horas ou 84 horas. Em alguns casos, o rVWF é administrado pelo menos a cada 72 horas.

[00221] Em algumas modalidades, o fator VIII recombinante (rFVIII) também é administrado ao sujeito com VWD grave para prevenir ou reduzir a frequência e/ou duração de um episódio de sangramento espontâneo. Em alguns casos, o tratamento administrado compreende rVWF e rFVIII. Em outros casos, o tratamento administrado não inclui rFVIII. Em algumas modalidades, o rFVIII é administrado ao sujeito em uma faixa de cerca de 10-70 IU/kg, por exemplo, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, 20- 30, 30-40, 40-50, 50-60 ou 60-70 IU/kg. Em alguns casos, o rFVIII é administrado na dose inicial (primeira) ou na infusão inicial (primeira). Em alguns casos, o rFVIII não é administrado na dose inicial (primeira) ou na infusão inicial (primeira). Em alguns casos, o rFVIII é administrado como parte de uma segunda dose ou segunda infusão. Em alguns casos, o rFVIII não é administrado como parte de uma segunda dose ou segunda infusão. Em alguns casos, o rFVIII é administrado como parte de uma terceira dose ou terceira infusão. Em alguns casos, o rFVIII não é administrado como parte de uma terceira dose ou terceira infusão.

[00222] Em algumas modalidades, um sujeito com VWD que está em risco de ter um episódio de sangramento espontâneo é administrado com uma única infusão de rVWF e rFVIII. Em algumas modalidades, a segunda administração de rVWF não é administrada com FVIII. Em algumas modalidades, a terceira administração de rVWF não é administrada com FVIII.

[00223] Em algumas modalidades, um sujeito com VWD que está em risco de ter um episódio de sangramento espontâneo é administrado com uma única infusão de rVWF e rFVIII. Em algumas modalidades, a segunda administração de rVWF é administrada com FVIII. Em algumas modalidades, a terceira administração de rVWF não é administrada com FVIII.

[00224] Em algumas modalidades, um sujeito com VWD que está em risco de ter um episódio de sangramento espontâneo é administrado com uma única infusão de rVWF e rFVIII. Em algumas modalidades, a segunda administração de rVWF é administrada com FVIII. Em algumas modalidades, a terceira administração de rVWF é administrada com FVIII.

[00225] Em algumas modalidades, um sujeito com VWD que está em risco de ter um episódio de sangramento espontâneo é administrado com uma única infusão de rVWF e não rFVIII. Em algumas modalidades, a segunda administração de rVWF é administrada com FVIII. Em algumas modalidades, a terceira administração de rVWF é administrada com FVIII.

[00226] Em algumas modalidades, um sujeito com VWD que está em risco de ter um episódio de sangramento espontâneo é administrado com uma única infusão de rVWF e não rFVIII. Em algumas modalidades, a segunda administração de rVWF não é administrada com FVIII. Em algumas modalidades, a terceira administração de rVWF é administrada com FVIII.

[00227] Em algumas modalidades, um sujeito com VWD que está em risco de ter um episódio de sangramento espontâneo é administrado com uma única infusão de rVWF e não rFVIII. Em algumas modalidades, a segunda administração de rVWF é administrada com FVIII. Em algumas modalidades, a terceira administração de rVWF não é administrada com FVIII.

[00228] Em algumas modalidades, um sujeito com VWD que está em risco de ter um episódio de sangramento espontâneo é administrado uma primeira infusão e uma segunda infusão de rVWF. Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda infusão de rVWF é administrada com FVIII.

[00229] Em algumas modalidades, um sujeito com VWD que está em risco de ter um episódio de sangramento espontâneo é administrado uma primeira infusão, segunda infusão e terceira infusão de rVWF. Em algumas modalidades, a primeira, segunda e/ou terceira infusão de rVWF é administrada com FVIII.

[00230] Em algumas modalidades, do método, quando rVWF e FVIII são administrados juntos, a razão rVWF para FVIII é de cerca de 1,5: 0,8. Em algumas modalidades, do método, quando rVWF e FVIII são administrados juntos, a razão rVWF para FVIII é de cerca de 1,3:1. Em algumas modalidades, do método, quando rVWF e FVIII são administrados juntos, a razão rVWF para FVIII é de cerca de 1,1: 0,8. Em algumas modalidades, do método, quando rVWF e FVIII são administrados juntos, a razão rVWF para FVIII é de cerca de 1,5:1. Em algumas modalidades, do método, quando rVWF e FVIII são administrados juntos, a razão rVWF para FVIII é de cerca de 1,1:1,2.

[00231] Em algumas modalidades, cerca de 40 IU/kg rVWF do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, cerca de 45 IU/kg do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, cerca de 50 IU/kg do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, cerca de 55 IU/kg do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, cerca de 60 IU/kg do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, cerca de 65 IU/kg do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, cerca de 70 IU/kg do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, cerca de 75 IU/kg do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, cerca de 80 IU/kg do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, cerca de 40 IU/kg-80 IU/kg rVWF do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, cerca de 50 IU/kg-80 IU/kg do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, cerca de 40 IU/kg-70 IU/kg rVWF do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, cerca de 50 IU/kg-80 IU/kg do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, cerca de 40 IU/kg-60 IU/kg rVWF do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, cerca de 50 IU/kg-80 IU/kg do rVWF são administrados para profilaxia de sangramento espontâneo.

[00232] Em algumas modalidades, 40-80 IU/kg rVWF do rVWF são administrados duas vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 50-80 IU/kg do rVWF são administrados duas vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 40 IU/kg rVWF do rVWF são administrados duas vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 45 IU/kg do rVWF são administrados duas vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 50 IU/kg do rVWF são administrados duas vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 55 IU/kg do rVWF são administrados duas vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 60 IU/kg do rVWF são administrados duas vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 65 IU/kg do rVWF são administrados duas vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 70 IU/kg do rVWF são administrados duas vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 75 IU/kg do rVWF são administrados duas vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 80 IU/kg do rVWF são administrados duas vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo.

[00233] Em algumas modalidades, 40-80 IU/kg rVWF do rVWF são administrados três vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 50-80 IU/kg do rVWF são administrados três vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 40 IU/kg rVWF do rVWF são administrados três vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 45 IU/kg do rVWF são administrados três vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 50 IU/kg do rVWF são administrados três vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 55 IU/kg do rVWF são administrados três vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 60 IU/kg do rVWF são administrados três vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 65 IU/kg do rVWF são administrados três vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 70 IU/kg do rVWF são administrados três vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 75 IU/kg do rVWF são administrados três vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 80 IU/kg do rVWF são administrados três vezes por semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 50 IU/kg do rVWF são administrados pelo menos a cada 72 horas para tratamento profilático de sangramento espontâneo.

[00234] Em algumas modalidades, 40-80 IU/kg rVWF do rVWF é administrado uma vez a cada 2 ou 3 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 50-80 IU/kg do rVWF são administrados uma vez a cada 2 ou 3 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 40 IU/kg rVWF do rVWF é administrado uma vez a cada 2 ou 3 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 45 IU/kg do rVWF são administrados uma vez a cada 2 ou 3 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 50 IU/kg do rVWF são administrados uma vez a cada 2 ou 3 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 55 IU/kg do rVWF são administrados uma vez a cada 2 ou 3 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 60 IU/kg do rVWF são administrados uma vez a cada 2 ou 3 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 65 IU/kg do rVWF são administrados uma vez a cada 2 ou 3 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 70 IU/kg do rVWF são administrados uma vez a cada 2 ou 3 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 75 IU/kg do rVWF são administrados uma vez a cada 2 ou 3 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 80 IU/kg do rVWF são administrados uma vez a cada 2 ou 3 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo.

[00235] Em algumas modalidades, 40-80 IU/kg do rVWF é administrado uma vez a cada 3 ou 4 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 50-80 IU/kg do rVWF são administrados uma vez a cada 3 ou 4 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 40 IU/kg do rVWF é administrado uma vez a cada 3 ou 4 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 45 IU/kg do rVWF são administrados uma vez a cada 3 ou 4 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 50 IU/kg do rVWF é administrado uma vez a cada 3 ou 4 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 55 IU/kg do rVWF são administrados uma vez a cada 3 ou 4 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 60 IU/kg do rVWF é administrado uma vez a cada 3 ou 4 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades,

65 IU/kg do rVWF são administrados uma vez a cada 3 ou 4 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 70 IU/kg do rVWF é administrado uma vez a cada 3 ou 4 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 75 IU/kg do rVWF são administrados uma vez a cada 3 ou 4 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 80 IU/kg do rVWF é administrado uma vez a cada 3 ou 4 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo.

[00236] Em algumas modalidades, 40-80 IU/kg do rVWF é administrado uma vez no dia 1 e no dia 5, no dia 2 e no dia 6 ou no dia 3 e no dia 7 de um período de 7 dias (semana) para tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 50-80 IU/kg do rVWF é administrado uma vez no dia 1 e no dia 5, no dia 2 e no dia 6, ou no dia 3 e no dia 7 de um período de 7 dias (semana) para tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 40 IU/kg do rVWF é administrado uma vez no dia 1 e no dia 5, no dia 2 e no dia 6 ou no dia 3 e no dia 7 de um período de 7 dias (semana) para tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 45 IU/kg do rVWF é administrado uma vez no dia 1 e no dia 5, no dia 2 e no dia 6, ou no dia 3 e no dia 7 de um período de 7 dias (semana) para tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 50 IU/kg do rVWF é administrado uma vez no dia 1 e no dia 5, no dia 2 e no dia 6, ou no dia 3 e no dia 7 de um período de 7 dias (semana) para tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 55 IU/kg rVWF do rVWF é administrado uma vez no dia 1 e no dia 5, no dia 2 e no dia 6, ou no dia 3 e no dia 7 de um período de 7 dias (semana) para tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 60 IU/kg do rVWF é administrado uma vez no dia 1 e no dia 5, no dia 2 e no dia 6, ou no dia

3 e no dia 7 de um período de 7 dias (semana) para tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 65 IU/kg do rVWF é administrado uma vez no dia 1 e no dia 5, no dia 2 e no dia 6, ou no dia 3 e no dia 7 de um período de 7 dias (semana) para tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 70 IU/kg do rVWF é administrado uma vez no dia 1 e no dia 5, no dia 2 e no dia 6, ou no dia 3 e no dia 7 de um período de 7 dias (semana) para tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 75 IU/kg do rVWF é administrado uma vez no dia 1 e no dia 5, no dia 2 e no dia 6, ou no dia 3 e no dia 7 de um período de 7 dias (semana) para tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, 80 IU/kg do rVWF é administrado uma vez no dia 1 e no dia 5, no dia 2 e no dia 6, ou no dia 3 e no dia 7 de um período de 7 dias (semana) para tratamento profilático de sangramento espontâneo.

[00237] Em algumas modalidades, o sujeito recebe tratamento profilático de sangramento espontâneo por pelo menos um mês. Em algumas modalidades, o sujeito recebe tratamento profilático de sangramento espontâneo por pelo menos 6 meses. Em algumas modalidades, o sujeito recebe tratamento profilático de sangramento espontâneo por pelo menos 1 ano. Em algumas modalidades, o sujeito recebe tratamento profilático de sangramento espontâneo por pelo menos 2 anos. Em algumas modalidades, o sujeito recebe tratamento profilático de sangramento espontâneo por pelo menos 5 anos. Em algumas modalidades, o sujeito recebe tratamento profilático de sangramento espontâneo por pelo menos 10 anos.

[00238] Em algumas modalidades, a um sujeito com VWD grave é administrada uma dose semanal de rVWF para o tratamento profilático de episódios de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF que é substancialmente equivalente a uma dose semanal de VWF derivado de plasma (pdVWF) é administrada ao sujeito para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF que é funcionalmente equivalente a uma dose semanal de VWF derivado de plasma (pdVWF) é administrada ao sujeito para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF que é cerca de 10% menor que uma dose semanal de VWF derivado de plasma (pdVWF) é administrada ao sujeito para profilaxia de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF que é cerca de 10% maior que uma dose semanal de VWF derivado de plasma (pdVWF) é administrada ao sujeito para profilaxia de sangramento espontâneo.

[00239] Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é administrada como pelo menos duas doses separadas ou pelo menos 2 infusões. Em algumas modalidades, um sujeito recebe pelo menos duas doses por semana. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é administrada como 2 infusões. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é administrada como 2 infusões intravenosas. Em alguns casos, o sujeito recebe uma dose duas vezes por semana de rVWF ou, em outras palavras, o sujeito recebe rVWF duas vezes por semana. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é administrada como 2 infusões intravenosas. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado ao sujeito duas vezes por semana. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado ao sujeito a cada 3 ou 4 dias. Em algumas modalidades, uma primeira infusão de rVWF é administrada e uma segunda infusão de rVWF é administrada 4 dias depois ao longo de um período de 7 dias. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado uma vez no dia 1 e no dia 5 de um período de 7 dias (uma semana) para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, um sujeito recebe uma dose semanal que é dividida em duas infusões de modo que o sujeito receba uma primeira infusão no dia 1 e a segunda infusão no dia 5 do período da semana. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado uma vez no dia 2 e no dia 6 de um período de uma semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, um sujeito é administrado com uma dose semanal que é dividida em duas infusões de modo que o sujeito receba uma primeira infusão no dia 2 e a segunda infusão no dia 6 do período da semana. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado uma vez no dia 3 e no dia 7 de um período de uma semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, um sujeito recebe uma dose semanal que é dividida em duas infusões de modo que o sujeito receba uma primeira infusão no dia 3 e a segunda infusão no dia 7 do período da semana. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é de até 80 IU/kg de rVWF por cada infusão. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é dividida em 2 infusões intravenosas de até 80 IU/kg de rVWF por cada infusão.

[00240] Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é administrada como pelo menos 3 doses separadas ou pelo menos 3 infusões. Em algumas modalidades, um sujeito recebe pelo menos 3 doses por semana. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é administrada como 3 infusões intravenosas. Em alguns casos, o sujeito recebe uma dose três vezes por semana de rVWF ou, em outras palavras, o sujeito recebe rVWF três vezes por semana. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado ao sujeito três vezes por semana. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é administrada como 3 infusões intravenosas, de modo que cada infusão seja administrada em um dia diferente. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado ao sujeito a cada 2 ou 3 dias. Em algumas modalidades, uma primeira infusão de rVWF é administrada, uma segunda infusão de rVWF é administrada 2 dias depois e uma terceira infusão de rVWF é administrada 3 dias depois ao longo de um período de 7 dias. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado uma vez no dia 1, dia 3 e dia 6 de um período de 7 dias para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, um sujeito é administrado com uma dose semanal que é dividida em 3 infusões de modo que o sujeito receba uma primeira infusão no dia 1, a segunda infusão no dia 3, uma terceira infusão no dia 6 do período da semana. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado uma vez no dia 1, no dia 3 e no dia 6 de um período de uma semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, um sujeito é administrado com uma dose semanal que é dividida em 3 infusões de modo que o sujeito receba uma primeira infusão no dia 2, segunda infusão no dia 4, uma terceira infusão no dia 7 do período da semana. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado uma vez no dia 2, no dia 4 e no dia 7 de um período de uma semana para o tratamento profilático de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é de até 80 IU/kg de rVWF por cada infusão. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é dividida em 3 infusões intravenosas de até 80 IU/kg de rVWF por cada infusão.

[00241] Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é administrada como uma dose única ou uma infusão única. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é administrada como uma única infusão. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é administrada como uma única infusão intravenosa. Em algumas modalidades, um sujeito é administrado com uma dose uma vez por semana de rVWF se o sujeito tiver recebido anteriormente uma dose uma vez por semana de pdVWF. Em algumas modalidades, uma dose semanal de rVWF é de até 80 IU/kg de rVWF para tal infusão.

[00242] Em algumas modalidades, o sujeito experimenta pelo menos uma redução de 5% (por exemplo, 5%, 7%, 10%, 12%, 14%, 15%, 17%, 20%, 22%, 24%, 25%, 27 %, 30%, 32%, 34%, 35%, 37%, 40%, 42%, 44%, 45%, 47%, 50% ou mais redução) na taxa de sangramento anual (ABR) para eventos de sangramento espontâneo após receber o tratamento profilático aqui descrito. Em algumas modalidades, o sujeito experimenta pelo menos uma redução de 25% (por exemplo, 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou mais redução) no ABR para eventos de sangramento espontâneo ao receber o tratamento profilático. Em algumas modalidades, uma redução é o número de episódios de sangramento espontâneo é indicada por uma redução na taxa de sangramento anual (ABR). Em algumas modalidades, o ABR de pré- tratamento é determinado com base na seguinte fórmula: número de sangramentos/dias sem regime de tratamento. Em algumas modalidades, o ABR de pré-tratamento é determinado com base na seguinte fórmula: número de sangramentos/12 meses antes do tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, o ABR profilático (ABR após tratamento profilático) é determinado com base na seguinte fórmula: número de sangramentos/dias no regime de tratamento.

[00243] Em algumas modalidades, o sujeito não experimenta eventos de sangramento espontâneo durante o curso do tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, o sujeito experimenta 1-2 eventos de sangramento espontâneo durante o curso do tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, o sujeito experimenta 1-3 eventos de sangramento espontâneo durante o curso do tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, o sujeito experimenta 3-5 eventos de sangramento espontâneo durante o curso do tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, o sujeito experimenta 1-5 eventos de sangramento espontâneo durante o curso do tratamento profilático com rVWF. Em algumas modalidades, o sujeito experimenta mais que 5 eventos de sangramento espontâneo durante o curso do tratamento profilático com rVWF.

[00244] Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para 0 por ano. Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para 1 por ano. Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para 2 por ano. Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para 3 por ano. Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para 4 por ano. Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para 5 por ano. Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para mais que 5 por ano. Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para 1-5 por ano. Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para 3-5 por ano. Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para 1-3 por ano. Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para menos que 5 por ano. Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para menos que 4 por ano. Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para menos que 3 por ano. Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para menos que 2 por ano. Em algumas modalidades, a administração de rVWF reduz o número de eventos de sangramento espontâneo para menos que 1 por ano.

[00245] Em algumas modalidades, o tratamento profilático reduz ou diminui a gravidade (por exemplo, episódios de sangramento leves, moderados e graves), incidência, frequência ou duração de um episódio de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, o sujeito administrado rVWF tem menos episódios de sangramento espontâneo do que um sujeito de controle que não recebeu tratamento profilático. Em algumas modalidades, o sujeito administrado com rVWF tem menos episódios de sangramento espontâneo ao longo do curso do tratamento em comparação com antes de iniciar o tratamento.

[00246] Geralmente, VWD Tipo 1 é indicado por <30 IU/dL VWF:RCo, <30 IU/dL VWF:Ag, FVIII baixo ou normal e razão > 0,5-0,7 IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag. Em algumas modalidades, um sujeito diagnosticado com VWD Tipo 1 tem <20 IU/dL VWF:RCo. VWD Tipo 2A é indicado por <30 IU/dL VWF:RCo, <30-200 IU/dL VWF:Ag, FVIII baixo ou normal e razão <0,5-0,7 IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag. VWD Tipo 2B é indicado por <30-200 IU/dL VWF:RCo, 30 IU/dL VWF:Ag, FVIII baixo ou normal e geralmente razão 0,5-0,7 IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag. VWD Tipo 2M é indicado por <30 IU/dL VWF:RCo, <30-200 IU/dL VWF:Ag, FVIII baixo ou normal e razão <0,5-0,7 IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag. VWD Tipo 2N é indicado por 30-2000 IU/dL VWF:RCo, 30-200 IU/dL VWF:Ag, FVIII muito baixo e razão >0,5-0,7 IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag. O VWD do tipo 3 é indicado por <3 IU/dL VWF: RCo, <3 IU/dL VWF: Ag, FVIII extremamente baixo (<10 IU/dL) e a razão VWF:RCo/VWF:Ag não é aplicável. Em algumas modalidades, um sujeito diagnosticado com VWD Tipo 3 tem <3 IU/dL VWF:Ag. Normal é indicado por 50-200 IU/dL VWF:RCo, 50-200 IU/dL VWF:Ag, FVIII normal e Razão > 0,5-0,7 IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag. Em algumas modalidades, o sujeito tem VWD Tipo 3. Em algumas modalidades, o sujeito tem VWD tipo 1 grave. Em algumas modalidades, o sujeito tem VWD tipo 2 grave. Em algumas modalidades, o sujeito tem VWD tipo 2A grave. Em algumas modalidades, o sujeito tem VWD tipo 2B grave. Em algumas modalidades, o sujeito tem VWD tipo 2M grave. Em algumas modalidades, o sujeito tem VWD tipo 3 grave.

[00247] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma melhora nos níveis de atividade de FVIII, VWF:RCo e/ou VWF:Ag após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF em pacientes com VWD Tipo 1. Em algumas modalidades, uma melhoria nos níveis de atividade de FVIII, VWF: RCo e/ou VWF: Ag inclui uma mudança nos níveis de atividade de modo que os níveis de atividade estejam mais próximos dos níveis normais, por exemplo, níveis em um sujeito que não tem VWD Tipo 1. Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma melhora nos níveis de atividade de FVIII, VWF: RCo e/ou VWF: Ag após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF em pacientes com VWD Tipo 1 grave. Em algumas modalidades, uma melhoria nos níveis de atividade de FVIII, VWF: RCo e/ou VWF: Ag inclui uma mudança nos níveis de atividade de modo que os níveis de atividade estejam mais próximos dos níveis normais, por exemplo, níveis em um sujeito que não tem VWD Tipo 1. Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma melhora nos níveis de atividade de FVIII, VWF:RCo e/ou VWF:Ag após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF em pacientes com VWD Tipo 2A. Em algumas modalidades, uma melhoria nos níveis de atividade de FVIII, VWF: RCo e/ou VWF: Ag inclui uma mudança nos níveis de atividade de modo que os níveis de atividade estejam mais próximos dos níveis normais, por exemplo, níveis em um sujeito que não tem VWD Tipo 2A.

Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma melhora nos níveis de atividade de FVIII, VWF: RCo e/ou VWF: Ag após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF em pacientes com VWD Tipo 2A grave.

Em algumas modalidades, uma melhoria nos níveis de atividade de FVIII, VWF: RCo e/ou VWF: Ag inclui uma mudança nos níveis de atividade de modo que os níveis de atividade estejam mais próximos dos níveis normais, por exemplo, níveis em um sujeito que não tem VWD Tipo 2A.

Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma melhora nos níveis de atividade de FVIII, VWF:RCo e/ou VWF:Ag após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF em pacientes com VWD Tipo 2M.

Em algumas modalidades, uma melhoria nos níveis de atividade de FVIII, VWF: RCo e/ou VWF: Ag inclui uma mudança nos níveis de atividade de modo que os níveis de atividade estejam mais próximos dos níveis normais, por exemplo, níveis em um sujeito que não tem VWD Tipo 2M.

Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma melhora nos níveis de atividade de FVIII, VWF: RCo e/ou VWF: Ag após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF em pacientes com VWD Tipo 2M grave.

Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma melhora nos níveis de atividade de FVIII, VWF:RCo e/ou VWF:Ag após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF em pacientes com VWD Tipo 2N.

Em algumas modalidades, uma melhoria nos níveis de atividade de FVIII, VWF: RCo e/ou VWF: Ag inclui uma mudança nos níveis de atividade de modo que os níveis de atividade estejam mais próximos dos níveis normais, por exemplo, níveis em um sujeito que não tem VWD Tipo 2N.

Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma melhora nos níveis de atividade de FVIII, VWF: RCo e/ou VWF: Ag após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF em pacientes com VWD Tipo 2N grave.

Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma melhora nos níveis de atividade de FVIII, VWF:RCo e/ou VWF:Ag após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF em pacientes com VWD Tipo 3. Em algumas modalidades, uma melhoria nos níveis de atividade de FVIII, VWF: RCo e/ou VWF: Ag inclui uma mudança nos níveis de atividade de modo que os níveis de atividade estejam mais próximos dos níveis normais, por exemplo, níveis em um sujeito que não tem VWD Tipo 3. Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma melhora nos níveis de atividade de FVIII, VWF: RCo e/ou VWF: Ag após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis anteriores ao tratamento profilático com rVWF em pacientes com VWD Tipo 3 grave.

Em algumas modalidades, uma melhoria nos níveis de atividade de FVIII, VWF: RCo e/ou VWF: Ag inclui uma mudança nos níveis de atividade de modo que os níveis de atividade estejam mais próximos dos níveis normais, por exemplo, níveis em um sujeito que não tem VWD Tipo 3. Em algumas modalidades, uma melhoria nos níveis de atividade de FVIII, VWF: RCo e/ou VWF: Ag inclui uma mudança nos níveis de atividade de modo que os níveis de atividade estejam mais próximos dos níveis normais, por exemplo, níveis em um sujeito que não tem qualquer forma de VWD.

[00248] Em algumas modalidades, o sujeito recebeu um diagnóstico de VWD. Em alguns casos, o diagnóstico de VWD é confirmado por teste genético, análise de multímero, histórico do paciente ou uma combinação dos mesmos.

[00249] Em algumas modalidades, o sujeito foi tratado por pelo menos 1 evento de sangramento espontâneo nos 12 meses anteriores. Em algumas modalidades, o sujeito foi tratado por mais de 1 evento de sangramento espontâneo nos 12 meses anteriores. Em algumas modalidades, o sujeito foi tratado por pelo menos 3 evento de sangramento espontâneo nos 12 meses anteriores. Em algumas modalidades, o sujeito foi tratado por 3 ou mais eventos de sangramento espontâneo nos 12 meses anteriores.

[00250] Em algumas modalidades, o sujeito está atualmente recebendo tratamento sob demanda para um evento de sangramento espontâneo (por exemplo, episódio). Em algumas modalidades, o sujeito está atualmente recebendo terapia com VWF (por exemplo, terapia com rVWF ou pdVWF) para tratar um evento de sangramento espontâneo. Em algumas modalidades, o sujeito não está recebendo tratamento sob demanda para um evento de sangramento espontâneo (por exemplo, episódio). Em algumas modalidades, o sujeito não está atualmente recebendo terapia com VWF (por exemplo, terapia com rVWF ou pdVWF) para tratar um evento de sangramento espontâneo.

[00251] Em algumas modalidades, o sujeito foi tratado profilaticamente para sangramento espontâneo por administração de pdVWF nos 12 meses anteriores. Em algumas modalidades, o sujeito foi tratado profilaticamente para sangramento espontâneo por administração de pdVWF nos 12 meses anteriores. Em algumas modalidades, o sujeito foi tratado profilaticamente para sangramento espontâneo por administração de pdVWF por pelo menos 12 meses anteriores. Em algumas modalidades, o sujeito não foi tratado profilaticamente para sangramento espontâneo por administração de pdVWF nos 12 meses anteriores. Em algumas modalidades, o sujeito não foi tratado profilaticamente para sangramento espontâneo por administração de pdVWF nos 12 meses anteriores. Em algumas modalidades, o sujeito não foi tratado profilaticamente para sangramento espontâneo por administração de pdVWF por pelo menos 12 meses anteriores.

[00252] Geralmente, o sangramento leve é caracterizado por sangramento clinicamente evidente agudo ou subagudo que não satisfez os critérios de sangramento forte e levou à internação hospitalar por sangramento, tratamento médico ou cirúrgico guiado por médico para sangramento ou uma mudança na terapia antitrombótica (incluindo drogas do estudo) para sangramento (definição clínica de Aristóteles); Todos os outros sangramentos (exceto fortes e ICH) (definição clínica RE-LY); Sangramento evidente que não atende aos critérios de sangramento forte, mas requer intervenção médica, contato não programado (visita ou telefone) com um médico, interrupção temporária da droga do estudo (ou seja, dosagem retardada), dor ou comprometimento das atividades diárias) Definição clínica Rocket-AF); Sangramento clinicamente relevante foi definido como hematoma cutâneo > 25 cm2, sangramento nasal espontâneo de > 5 minutos de duração, hematúria macroscópica, sangramento retal espontâneo, sangramento gengival por > 5 minutos, qualquer sangramento que leva à hospitalização, qualquer sangramento que leva à transfusão < 2 U, ou qualquer outro sangramento considerado relevante pelo investigador (definição Petro clínica); e/ou CRNM (sangramento não forte clinicamente relevante)

definido como agudo ou subagudo, clinicamente evidente, não forte e levando à internação hospitalar por sangramento, tratamento médico ou cirúrgico guiado por médico para sangramento, ou também uma mudança na terapia antitrombótica como eventos de sangramento menores definidos como eventos clinicamente evidentes agudos que não atendem aos critérios para sangramento forte ou CRNM (definição clínica de Aristóteles-J). Ver, por exemplo, Wells G, Coyle D, Cameron C, et al. Segurança, eficácia e custo-eficácia de novos anticoagulantes orais comparados com varfarina na prevenção de derrame e outros eventos cardiovasculares em pacientes com fibrilação atrial [Internet]. Ottawa (ON): Canadian Agency for Drugs and Technologies in Health; 2012 Apr

9. 3, CLINICAL REVIEW. Disponível na World Wide Web at www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169813/. O sangramento leve pode incluir eventos que foram definidos como aqueles que não cumprem os critérios de sangramento forte ou clinicamente significativo; sangramento leve de uma ferida (sangramento no local da injeção, epistaxe ou hematoma na ferida que não requer descompressão cirúrgica); sangramento evidente que não atendeu aos critérios de hemorragia forte e associado a ≥1 dos seguintes: epistaxe durando mais de 5 minutos ou exigindo intervenção, equimoses ou hematoma > 5 cm em sua maior dimensão, hematúria não associada à trauma relacionado ao cateter urinário, sangramento gastrointestinal não relacionado à intubação ou colocação de um tubo NG, hematoma ou complicações da ferida, hemorragia subconjuntival que exige a suspensão da medicação; sangramento leve no GI ou no trato gastrointestinal e hematoma no local da injeção; e/ou sangramento evidente que não atende aos critérios de hemorragia forte. Ver, por exemplo, Sobieraj DM, Coleman CI, Tongbram V, et al. Profilaxia de Tromboembolismo Venoso em Cirurgia Ortopédica [Internet]. Rockville (MD): Agency for Healthcare Research and Quality (EUA); Março de 2012 (Comparative Effectiveness Reviews,

No. 49.) Apêndice F, Tabelas de evidências adicionais. Disponível na World Wide Web em www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92309/.

[00253] Geralmente, o sangramento forte é caracterizado pelos padrões da Sociedade Internacional de Trombose e Hemostasia (ISTH) e inclui qualquer sangramento com risco de vida e/ou fatal; sangramento sintomático em uma área ou órgão crítico e o sangramento maior foi separado em sangramento intracraniano (intracerebral, subdural) e extracraniano (GI, não GI) (definição clínica RE-LY); sangramento sintomático em um local anatômico crítico (definição clínica Rocket-AF); Sangramento retroperitoneal, intracraniano, intraocular ou intraespinhal com risco de vida; ou sangramento exigindo cirurgia (definição clínica Artistotle-J). Os eventos de sangramento forte podem incluir aqueles em que há queda na hemoglobina de pelo menos 20g/L ou transfusão de > 2 unidades de sangue total (células concentradas mencionadas na definição de sangramento com risco de vida; definição RE-LY de sangramento com risco de vida: ≥ 1 dos seguintes critérios: (1) sangramento intracraniano sintomático fatal; (2) redução no nível de hemoglobina de pelo menos 5,0 g/L; (3) transfusão de pelo menos 4 U de sangue ou células concentradas; (4) associada a hipotensão exigindo o uso de agentes inotrópicos intravenosos; ou (5) intervenção cirúrgica necessária); queda na hemoglobina > 2g/dL ou transfusão de > 2 unidades de sangue total/hemácias (ISTH ou definição clínica Rocket-AF); e/ou sangramento exigindo cirurgia ou transfusão de ≥2 U ou associado a uma diminuição na hemoglobina de episódios ≥ 2,0 g/L. Ver, por exemplo, Wells G, Coyle D, Cameron C, et al. Segurança, eficácia e custo-eficácia de novos anticoagulantes orais comparados com varfarina na prevenção de derrame e outros eventos cardiovasculares em pacientes com fibrilação atrial [Internet]. Ottawa (ON): Canadian Agency for Drugs and Technologies in Health; 2012 Apr

9. 3, CLINICAL REVIEW. Disponível na World Wide Web at www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169813/. O sangramento forte pode incluir sangramento clinicamente evidente associado a uma queda > 20 g/L em Hb; clinicamente evidente levando à transfusão de células empacotadas > 2U ou sangue total; sangramento fatal, retroperitoneal, intracraniana, intraocular ou intraespinhal; sangramento justificando a interrupção do tratamento ou levando à reoperação; sangramento fatal, retroperitoneal, intracraniano ou intraespinhal; sangramento que envolvia qualquer outro órgão crítico; sangramento levando à reoperação; sangramento evidente com índice de sangramento ≥ 2; sangramento importante de uma ferida (hematoma da ferida que requer descompressão cirúrgica) ou sangramento importante não relacionado a uma ferida (hemorragia gastrointestinal ou intracerebral); sangramento clinicamente evidente associado a uma diminuição em Hb ≥2 g/dL ou à necessidade de transfusão de ≥2U de RBC; intracraniana ou retroperitoneal (resultou na descontinuação permanente da anticoagulação). Ver, por exemplo, Sobieraj DM, Coleman CI, Tongbram V, et al. Profilaxia de Tromboembolismo Venoso em Cirurgia Ortopédica [Internet]. Rockville (MD): Agency for Healthcare Research and Quality (EUA); Março de 2012 (Comparative Effectiveness Reviews, No. 49.) Apêndice F, Tabelas de evidências adicionais. Disponível na World Wide Web em www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92309/.

[00254] As composições de rVWF podem estar contidas em formulações farmacêuticas, conforme descrito neste documento. Essas formulações podem ser administradas por via oral, tópica, transdérmica, parenteral, por inalação de spray, vaginal, retal ou por injeção intracraniana. O termo parenteral, como utilizado neste documento, inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injeção intracisternal ou técnicas de infusão. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado por via intravenosa. A administração por injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal,

intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e/ou implantação cirúrgica em um determinado local também é contemplada. Geralmente, as composições são essencialmente isentas de pirogênios, bem como de outras impurezas que podem ser prejudiciais ao receptor.

[00255] Em um aspecto, as formulações da invenção são administradas por um bolus inicial seguido por uma infusão contínua para manter os níveis circulantes terapêuticos do produto de droga. Como outro exemplo, o composto da invenção é administrado como uma dose única. Aqueles versados na técnica irão prontamente otimizar dosagens eficazes e regimes de administração conforme determinado pela boa prática médica e a condição clínica do paciente individual. A via de administração pode ser, mas não está limitada a, por administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. A frequência da dosagem depende dos parâmetros farmacocinéticos dos agentes e da via de administração. A formulação farmacêutica ótima é determinada por um versado na técnica, dependendo da via de administração e da dosagem desejada. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 páginas 1435-1712, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins e em particular para todos os ensinamentos relacionados a formulações, vias de administração e dosagens para produtos farmacêuticos. Tais formulações influenciam o estado físico, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de eliminação in vivo dos agentes administrados. Dependendo da via de administração, uma dose adequada é calculada de acordo com o peso corporal, área de superfície corporal ou tamanho do órgão. As dosagens apropriadas podem ser determinadas através da utilização de ensaios estabelecidos para determinar as dosagens ao nível do sangue em conjunto com os dados de resposta à dose apropriados. O regime de dosagem final é determinado pelo médico assistente, considerando vários fatores que modificam a ação dos drogas, por exemplo, a atividade específica da droga, a gravidade do dano e a capacidade de resposta do paciente, a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a gravidade de qualquer infecção, o tempo de administração e outros fatores clínicos. A título de exemplo, uma dose típica de um VWF recombinante da presente invenção é de aproximadamente 50 IU/kg, igual a 500 μg/kg. À medida que os estudos são conduzidos, mais informações surgirão sobre os níveis de dosagem apropriados e a duração do tratamento para várias doenças e condições.

[00256] A prática da presente invenção pode empregar, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais e descrições de química orgânica, tecnologia de polímero, biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro da habilidade na técnica. Essas técnicas convencionais incluem a síntese de arranjo de polímero, hibridação, ligação e detecção de hibridação usando um marcador. Ilustrações específicas de técnicas adequadas podem ser obtidas por referência ao exemplo aqui abaixo. No entanto, outros procedimentos convencionais equivalentes podem, é claro, também ser usados. Essas técnicas e descrições convencionais podem ser encontradas em manuais de laboratório padrão, como Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, Highly stabilized York, Gait, “Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach” 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y. and Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., Highly estabilized York, N.Y., todos os quais são aqui incorporados em sua totalidade por referência para todos os fins.

[00257] Observe que como usado neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, e “o/a” incluem referentes plurais a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um anticorpo" inclui uma pluralidade de tais anticorpos e a referência a "uma célula hospedeira" inclui a referência a uma ou mais células hospedeiras e seus equivalentes conhecidos pelos versados na técnica e assim por diante. Note-se ainda que as reivindicações podem ser redigidas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração se destina a servir de base antecedente para o uso de tal terminologia exclusiva como "exclusivamente", "único" e semelhantes em conjunto com a recitação de elementos de reivindicação ou a utilização de uma limitação "negativa".

[00258] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as publicações mencionadas neste documento são incorporadas neste documento por referência com o propósito de descrever e divulgar dispositivos, composições, formulações e metodologias que são descritas na publicação e que podem ser usadas em conexão com a invenção presentemente descrita.

[00259] Se for fornecida uma gama de valores, entende-se cada valor interveniente, até o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto dite claramente de outro modo, entre o limite superior e inferior desse intervalo e qualquer outro valor declarado ou interveniente em que a gama especificada está englobada no âmbito da invenção. Os limites superior e inferior destes intervalos menores que podem, independentemente, ser incluídos nos intervalos menores, também estão englobados no âmbito da invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo indicada. Quando o intervalo indicado inclui um ou ambos os limites, os intervalos excluindo qualquer um de ambos desses limites incluídos estão também incluídos na invenção.

[00260] Na descrição acima, numerosos detalhes específicos são apresentados para fornecer uma compreensão mais completa da presente invenção. No entanto, será evidente para os versados na técnica que a presente invenção pode ser praticada sem um ou mais desses detalhes específicos. Em outros casos, características e procedimentos bem conhecidos pelos versados na técnica não foram descritos a fim de evitar obscurecer a invenção.

[00261] Embora a presente invenção seja descrita principalmente com referência a modalidades específicas, também se prevê que outras modalidades se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica após a leitura da presente divulgação, e pretende-se que tais modalidades estejam contidas no presente método inventivo.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: EFICÁCIA E SEGURANÇA DA PROFILAXIA COM FATOR DE VON WILLEBRAND RECOMBINANTE (VWF) NA DOENÇA DE VON WILLEBRAND GRAVE (VWD): PROJETO DE UM ESTUDO PROSPECTIVO, DE FASE 3, ABERTO,

MULTICÊNTRICO INTERNACIONAL INTRODUÇÃO

[00262] Pacientes com doença de von Willebrand (VWD) têm hemostasia prejudicada devido a um déficit quantitativo ou qualitativo no Fator de von Willebrand (VWF), uma grande glicoproteína plasmática multimérica com funções hemostáticas chave mediando a agregação plaquetária e estabilizando o fator de coagulação do sangue VIII (FVIII) na circulação (1-3). A maioria dos pacientes com VWD apresenta sangramento da mucosa leve a moderado e sangramento após trauma ou cirurgia, embora sangramento com risco de vida também possa ocorrer, particularmente em pacientes com doença grave (1,2).

[00263] O VWF recombinante (rVWF, vonicog alfa, VEYVONDI™; Baxalta Innovations GmbH, uma empresa Takeda, Viena, Áustria) é fabricado por tecnologia de DNA recombinante na linhagem de células de ovário de hamster chinês sem a adição de proteína exógena humana ou animal (4). O VWF contém o perfil de multímero VWF completo, incluindo multímeros ultralargos que geralmente são deficientes em concentrados de VWF derivados de plasma (pdVWF) expostos a ADAMTS13, a protease de clivagem de VWF (5-7)

[00264] Pacientes com VWD grave podem se beneficiar do tratamento profilático com rVWF para manter os níveis de VWF e FVIII de modo que o risco de episódios de sangramento espontâneo (BEs), incluindo hemartrose, epistaxe e sangramento gastrointestinal, seja reduzido (8-13).

[00265] Reduzir a frequência e a duração dos BEs provavelmente diminuiu a necessidade de transfusões de glóbulos vermelhos e diminuiu o risco de comorbidades debilitantes, incluindo artropatia (8,9)

OBJETIVOS DO ESTUDO

[00266] O objetivo do estudo foi investigar a eficácia e segurança do tratamento profilático de longo prazo com rVWF em pacientes com VWD grave.

PROJETO DO ESTUDO

[00267] É descrito aqui um estudo global, multicêntrico, aberto, de fase 3 (NCT02973087, EudraCT no .: 2016-001478-14) para avaliar prospectivamente a eficácia, segurança e farmacocinética do tratamento profilático contínuo com rVWF em pacientes adultos com VWD grave (atividade de cofator de ristocetina de VWF de linha de base [VWF:RCo] <20 IU/dL) que necessitaram de terapia com pdVWF para controlar BEs no ano anterior à inscrição (FIG. 1).

[00268] Os pacientes pertencem a 1 ou 2 coortes, dependendo do tipo de regime de VWF recebido antes da inclusão no estudo: tratamento sob demanda

(coorte sob demanda) e tratamento profilático com um produto pdVWF (coorte alternada). Os pacientes em ambas as coortes receberão tratamento profilático com rVWF por 1 ano.

PACIENTES

[00269] Pacientes  de 18 anos de idade com diagnóstico de VWD grave (VWF basal: RCo <20 IU/dL) que requerem tratamento com VWF para controlar o sangramento (os principais critérios de elegibilidade do estudo estão detalhados na FIG. 2) O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética local relevante e todos os pacientes terão fornecido consentimento informado por escrito antes da inscrição.

TRATAMENTO DO ESTUDO

[00270] Os pacientes receberam profilaxia com rVWF conforme descrito abaixo.

[00271] Para a coorte sob demanda, uma dose profilática padrão de 50  10 IU/kg rVWF:RCo foi administrada por infusão intravenosa. A dose pode ser aumentada até 80 IU/kg.

[00272] Todos os pacientes foram iniciados com dosagem duas vezes por semana (FIG. 3, Esquema A).

[00273] Para a coorte de troca, uma dose semanal de rVWF equivalente a  10% da dose semanal de pdVWF recebida anteriormente foi dividida em 2 infusões intravenosas (FIG. 3, Esquema A), até um máximo de 80 IU/kg por infusão. A dose semanal foi administrada em 3 infusões (FIG. 3, Esquema B), de acordo com o julgamento clínico; a dosagem uma vez por semana só era permitida se o paciente tivesse recebido a dosagem uma vez por semana anterior com pdVWF.

[00274] A dose de rVWF pode ser ainda mais individualizada com o intervalo especificado com base em dados farmacocinéticos, histórico de BEs e resultados de avaliações clínicas e laboratoriais. Os pacientes que experimentam BEs que requerem tratamento com VWF teriam recebido rVWF para tratar o sangramento. A dosagem ajustada pelo peso deve ser baseada no tipo e gravidade do BE e nas medidas clínicas e laboratoriais apropriadas. FVIII recombinante (fator anti-hemofílico [recombinante] [ADVATE; Baxalta US Inc., uma empresa Takeda, Lexington, MA]) teria sido administrado se um aumento imediato do nível de FVIII fosse clinicamente indicado.

[00275] Os pacientes que necessitaram de cirurgia eletiva ou procedimentos odontológicos durante o estudo foram tratados com rVWF para controlar o sangramento cirúrgico e, em seguida, retomaram seu esquema de tratamento profilático com rVWF. Antes da cirurgia, o rVWF foi administrado sem FVIII recombinante se os níveis de atividade do FVIII (FVIII:C) estiverem no nível alvo recomendado de: 0,4 IU/mL para cirurgia oral ou pequena e 0,8 IU/mL para cirurgia grande.

MEDIDAS DE RESULTADO DO ESTUDO E ANÁLISE ESTATÍSTICA

[00276] As principais medidas de resultados do estudo estão listadas na FIG. 4 (Tabela 3).

[00277] A análise estatística incluiu aproximadamente 22 pacientes, incluindo pelo menos 5 pacientes com VWD tipo 3 e pelo menos 8 pacientes em cada coorte do estudo; nenhum cálculo formal do tamanho da amostra foi feito.

[00278] A análise de eficácia primária foi conduzida em todos os pacientes que receberam tratamento profilático com rVWF. ABRs espontâneos serão estimados usando uma regressão binominal negativa para cada coorte do estudo (coorte sob demanda ou coorte de troca). A comparação de ABRs espontâneos pré-estudo e em estudo foi baseada nos pacientes da coorte de troca. A avaliação usará um modelo linear generalizado de efeitos mistos. A razão ABR foi relatada com um intervalo de confiança de 95% dos 2 lados para cada coorte do estudo.

STATUS DO ESTUDO E CONCLUSÃO

[00279] A inscrição no estudo está concluída.

[00280] Os resultados deste estudo prospectivo de fase 3 forneceram dados sobre a eficácia e segurança de rVWF para profilaxia contra sangramentos espontâneos em pacientes com VWD grave.

[00281] O período de estudo do tratamento profilático com rVWF foi de 1 ano, e a medida de resultado de eficácia primária é o ABR para sangramentos espontâneos (não traumáticos).

MEDIDAS DE RESULTADO PRIMÁRIO

[00282] Taxa de sangramento anual registrada prospectivamente (ABR) para episódios de sangramento espontâneo (não relacionado a trauma) durante o tratamento profilático com (rVWF) e o histórico de ABR dos participantes para episódios de sangramento espontâneo durante o tratamento sob demanda (Período de tempo: aproximadamente 1 ano).

MEDIDAS DE RESULTADO SECUNDÁRIO REVISADAS

[00283] Número de participantes com redução da taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo (não relacionado a trauma) durante a profilaxia em relação ao próprio ABR histórico dos participantes durante o tratamento sob demanda (período de tempo: aproximadamente 1 ano).

[00284] Número de participantes sem sangramento durante o tratamento profilático com fator de von Willebrand recombinante (rVWF) (período de tempo: aproximadamente 1 ano).

[00285] Número de infusões de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE por mês durante o tratamento profilático, bem como durante o tratamento sob demanda (período de tempo: aproximadamente 1 ano).

[00286] Número de infusões de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE por ano durante o tratamento profilático, bem como durante o tratamento sob demanda (período de tempo: aproximadamente 1 ano).

[00287] Consumo total ajustado pelo peso de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE por mês durante o tratamento profilático, bem como durante o tratamento sob demanda (período de tempo: aproximadamente 1 ano).

[00288] Consumo total ajustado pelo peso de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE por ano durante o tratamento profilático, bem como durante o tratamento sob demanda (período de tempo: aproximadamente 1 ano).

[00289] Incidência de eventos tromboembólicos (período de tempo: ao longo do período de estudo de aproximadamente 22 meses).

[00290] Incidência de reações de hipersensibilidade graves (período de tempo: ao longo do período de estudo de aproximadamente 22 meses).

[00291] Número de participantes que desenvolveram anticorpos neutralizantes para o fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e Fator VIII (FVIII) (período de tempo: ao longo do período de estudo de aproximadamente 22 meses).

[00292] Número de participantes que desenvolveram anticorpos de ligação total ao fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e Fator VIII (FVIII) (período de tempo: ao longo do período de estudo de aproximadamente 22 meses).

[00293] Número de participantes que desenvolveram anticorpos para proteínas de ovário de hamster chinês (CHO), imunoglobulina G de camundongo (IgG) e rFurina (período de tempo: ao longo do período de estudo de aproximadamente 22 meses).

[00294] Farmacocinética - recuperação incremental (IR) (período de tempo: 30 minutos pré-infusão; e pós-infusão em 30 minutos e 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas).

[00295] Farmacocinética - meia-vida terminal (T1/2) (período de tempo: 30 minutos pré-infusão; e pós-infusão em 30 minutos e 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas).

[00296] Farmacocinética - Tempo médio de residência (MRT) (período de tempo: 30 minutos pré-infusão; e pós-infusão em 30 minutos e 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas).

[00297] Farmacocinética - Área sob a curva/dose (AUC/dose) (período de tempo: 30 minutos antes da infusão; e pós-infusão aos 30 minutos e 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas).

[00298] Farmacocinética - Área sob a curva de momento/dose (AUMC/dose) (período de tempo: 30 minutos antes da infusão; e pós-infusão aos 30 minutos e 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas).

[00299] Farmacocinética - Volume de distribuição no estado estacionário (Vss) (período de tempo: 30 minutos antes da infusão; e pós-infusão aos 30 minutos e 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas).

[00300] Farmacocinética - Liberação (CL) (período de tempo: 30 minutos pré-infusão; e pós-infusão em 30 minutos e 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas).

[00301] Número de infusões de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE (rFVIII) por episódio de sangramento espontâneo (BE) (período de tempo: ao longo do período de estudo, até aproximadamente 22 meses).

[00302] Número de infusões de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE (rFVIII) por episódio de sangramento traumático (BE) (período de tempo: ao longo do período de estudo, até aproximadamente 22 meses).

[00303] Consumo ajustado pelo peso de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE (rFVIII) por episódio de sangramento espontâneo (BE) (período de tempo: ao longo do período de estudo, até aproximadamente 22 meses).

[00304] Consumo ajustado pelo peso de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE (rFVIII) por episódio de sangramento traumático (BE) (período de tempo: ao longo do período de estudo, até aproximadamente 22 meses).

[00305] Classificação geral de eficácia hemostática na resolução do sangramento (período de tempo: ao longo do período de estudo, até aproximadamente 22 meses). Usou uma escala de 4 pontos: Excelente, Bom, Moderado, Nenhum.

[00306] Perda de sangue real intraoperatória versus perda de sangue prevista - se a cirurgia for necessária (Período de tempo: Dia 0 (na conclusão da cirurgia)). Avaliado pelo cirurgião operacional) no final da cirurgia.

[00307] Eficácia hemostática intraoperatória - se a cirurgia for necessária (Período de tempo: Dia 0 (na conclusão da cirurgia)). Pontuação em uma escala de excelente, bom, moderado ou nenhum - avaliado pelo cirurgião no final da cirurgia.

[00308] Para cirurgia eletiva: uma avaliação geral da eficácia hemostática 24 horas e no dia 7 e no dia 14 após a última infusão perioperatória de rVWF (período de tempo: 24 horas e nos dias 7 e 14 após a última infusão perioperatória de rVWF). Pontuação em uma escala de excelente, bom, moderado ou nenhum.

[00309] Dose diária intra e pós-operatória ajustada ao peso (Período de tempo: Dia 0 (dia da cirurgia) até o dia pós-operatório 14). Dose diária ajustada pelo peso intra e pós-operatório de rVWF com ou sem ADVATE.

MEDIDAS DE RESULTADO SECUNDÁRIO ORIGINAL

[00310] Número de participantes com redução da taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo (não relacionado a trauma) durante a profilaxia em relação ao próprio ABR histórico dos participantes durante o tratamento sob demanda (período de tempo: aproximadamente 1 ano).

[00311] Número de participantes sem sangramento durante o tratamento profilático com fator de von Willebrand recombinante (rVWF) (período de tempo: aproximadamente 1 ano).

[00312] Número de infusões de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE por mês durante o tratamento sob demanda (período de tempo: aproximadamente 1 ano).

[00313] Número de infusões de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE por ano durante o tratamento sob demanda (período de tempo: aproximadamente 1 ano).

[00314] Consumo total ajustado pelo peso de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE por mês durante o tratamento sob demanda (período de tempo: aproximadamente 1 ano).

[00315] Consumo total ajustado pelo peso de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE por ano durante o tratamento sob demanda (período de tempo: aproximadamente 1 ano).

[00316] Incidência de eventos tromboembólicos (período de tempo: ao longo do período de estudo de aproximadamente 22 meses).

[00317] Incidência de reações de hipersensibilidade graves (período de tempo: ao longo do período de estudo de aproximadamente 22 meses).

[00318] Número de participantes que desenvolveram anticorpos neutralizantes para o fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e Fator VIII (FVIII) (período de tempo: ao longo do período de estudo de aproximadamente 22 meses).

[00319] Número de participantes que desenvolveram anticorpos de ligação total ao fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e Fator VIII (FVIII) (período de tempo: ao longo do período de estudo de aproximadamente 22 meses).

[00320] Número de participantes que desenvolveram anticorpos para proteínas de ovário de hamster chinês (CHO), imunoglobulina G de camundongo (IgG) e rFurina (período de tempo: ao longo do período de estudo de aproximadamente 22 meses).

[00321] Farmacocinética - recuperação incremental (IR) (período de tempo: 30 minutos pré-infusão; e pós-infusão em 30 minutos e 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas).

[00322] Farmacocinética - meia-vida terminal (T1/2) (período de tempo: 30 minutos pré-infusão; e pós-infusão em 30 minutos e 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas).

[00323] Farmacocinética - Tempo médio de residência (MRT) (período de tempo: 30 minutos pré-infusão; e pós-infusão em 30 minutos e 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas).

[00324] Farmacocinética - Área sob a curva/dose (AUC/dose) (período de tempo: 30 minutos antes da infusão; e pós-infusão aos 30 minutos e 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas).

[00325] Farmacocinética - Área sob a curva de momento/dose (AUMC/dose) (período de tempo: 30 minutos antes da infusão; e pós-infusão aos 30 minutos e 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas).

[00326] Farmacocinética - Volume de distribuição no estado estacionário (Vss) (período de tempo: 30 minutos antes da infusão; e pós-infusão aos 30 minutos e 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas).

[00327] Farmacocinética - Liberação (CL) (período de tempo: 30 minutos pré-infusão; e pós-infusão em 30 minutos e 1, 6, 12, 24, 48 e 72 horas).

[00328] Número de infusões de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE (rFVIII) por episódio de sangramento espontâneo (BE) (período de tempo: ao longo do período de estudo, até aproximadamente 22 meses).

[00329] Número de infusões de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE (rFVIII) por episódio de sangramento traumático (BE) (período de tempo: ao longo do período de estudo, até aproximadamente 22 meses).

[00330] Consumo ajustado pelo peso de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE (rFVIII) por episódio de sangramento espontâneo (BE) (período de tempo: ao longo do período de estudo, até aproximadamente 22 meses).

[00331] Consumo ajustado pelo peso de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) e ADVATE (rFVIII) por episódio de sangramento traumático (BE) (período de tempo: ao longo do período de estudo, até aproximadamente 22 meses).

[00332] Classificação geral de eficácia hemostática na resolução do sangramento (período de tempo: ao longo do período de estudo, até aproximadamente 22 meses). Usou uma escala de 4 pontos: Excelente, Bom, Moderado, Nenhum.

REFERÊNCIAS

1. Nichols WL, et al., Haemophilia 2008; 14:171-232.

2. Leebeek FW, Eikenboom JC. N Engl J Med 2016;375:2067-80.

3. Reininger AJ. Hamostaseologie 2015; 35:225-33.

4. European Medicines Agency. VEYVONDI Summary of Product Characteristics. https://www.ema,europa,ed/documents/product- information/veyvondi-epar-product-information_en.pdf.

5. Mannucci PM et al., Blood 1994; 83:3018-27.

6. Turecek PL et al., Hamostaseologie 2009; 20(suppl 1):S32-8.

7. Favaloro EJ., Blood Transfus. 2016;14:262-76.

8. Abshire T., Thromb Res 2009; 124(suppl 1):S15-9.

9. Berntorp E., Haemophilia 2008; 14(suppl 5):47-53.

10. Berntorp E., Petrini P., Blood Coagul Fibrinolysis 2005; 16(suppl 1):S23-

6.

11. Berntorp E., Semin Thromb Hemost 2006; 32:621-5.

12. Abshire TC, et al., Haemophilia 2013; 19:76-81.

13. Abshire T et al., J Thromb Haemost 2015; 13:1585-9.

[00333] Embora as modalidades exemplificativas da presente invenção tenham sido mostradas e descritas aqui, será óbvio para os versados na técnica que essas modalidades são apresentadas apenas a título de exemplo. Numerosas variações, mudanças e substituições ocorrerão para aqueles versados na técnica sem se afastar da invenção. Deve-se compreender que várias alternativas às modalidades da invenção descritas aqui podem ser empregadas na prática da invenção. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que os métodos e as estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam abrangidos.

[00334] Os exemplos apresentados acima são fornecidos para dar aos versados na técnica uma divulgação e descrição completa de como fazer e usar as modalidades das composições, sistemas e métodos da invenção, e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção. As modificações dos modos acima descritos para realizar a invenção que são óbvias para os versados na técnica devem estar dentro do escopo das seguintes reivindicações. Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório descritivo são indicativas dos níveis de habilidade dos versados na técnica aos quais a invenção pertence. Todas as referências citadas nesta divulgação são incorporadas por referência na mesma medida como se cada referência tivesse sido incorporada por referência em sua totalidade individualmente.

[00335] Todos os títulos e designações de seção são usados para fins de clareza e referência apenas e não devem ser considerados limitativos de nenhuma forma. Por exemplo, aqueles versados na técnica apreciarão a utilidade de combinar vários aspectos de diferentes títulos e seções conforme apropriado de acordo com o espírito e escopo da invenção aqui descrita.

[00336] Todas as referências citadas neste documento são incorporadas por referência neste documento em sua totalidade e para todos os fins, na mesma medida como se cada publicação individual ou patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins.

[00337] Muitas modificações e variações deste pedido podem ser feitas sem se afastar de seu espírito e escopo, como será evidente para aqueles versados na técnica. As modalidades e os exemplos específicos aqui descritos são oferecidos apenas a título de exemplo, e o pedido será limitado apenas pelos termos das reivindicações anexas, juntamente com o pleno escopo de equivalentes aos quais as reivindicações têm direito.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para tratar profilaticamente episódios de sangramento espontâneo em um sujeito com doença de von Willebrand (VWD) severa, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito duas vezes por semana pelo menos uma dose de Fator de von Willebrand (rVWF) recombinante variando de pelo menos cerca de 40 IU/kg a cerca de 80 IU/kg, desse modo reduzindo a frequência e/ou duração dos episódios de sangramento espontâneo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma dose de rVWF varia de pelo menos cerca de 50 IU/kg a cerca de 80 IU/kg.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem uma atividade de cofator de ristocetina VWF (VWF:RCo) de linha de base variando de 20 IU/dL ou menos, ou é diagnosticado com VWD Tipo

1.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o sujeito é diagnosticado com VWD Tipo 2A, 2B ou 2M.

5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem um teor de VWF:antígeno (VWF:Ag) variando de 3 IU/dL ou maior, ou é diagnosticado com VWD Tipo 3.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que ao sujeito foi administrado tratamento profilático de VWF derivado de plasma (pdVWF) dentro dos últimos 12 meses antes da administração inicial de rVWF.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o sujeito experimentou pelo menos 3 episódios de sangramento espontâneo dentro dos últimos 12 meses.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a administração ocorre a cada 3 a 4 dias.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a administração ocorre no dia 1 e no dia 5, no dia 2 e no dia 6, ou no dia 3 e no dia 7 de um período de 7 dias.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a administração ocorre pelo menos a cada 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas ou 84 horas.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a administração ocorre pelo menos a cada 72 horas.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar ao sujeito pelo menos uma dose de Fator VIII recombinante (rFVIII).

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a administração da pelo menos uma dose de rFVIII é administrada concomitantemente ou sequencialmente com a pelo menos uma dose de rVWF.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o sujeito retoma o tratamento profilático após receber cirurgia eletiva ou cirurgia oral.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que se a cirurgia eletiva for uma cirurgia menor ou cirurgia oral e o sujeito tiver atividade de FVIII (FVIII:C) de pelo menos 0,4 IU/mL ou maior, ao sujeito é administrado rVWF sem rFVIII antes da cirurgia.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que se a cirurgia eletiva for uma cirurgia maior e o sujeito tiver atividade de FVIII (FVIII:C) de pelo menos 0,8 IU/mL ou maior, ao sujeito é administrado rVWF sem rFVIII antes da cirurgia.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma redução de ≥25% em taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante profilaxia de rVWF em relação a ABR de pré-tratamento.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a eficácia de tratamento profilático é indicada por uma redução de ≥25%, ≥30%, ≥35%, ≥40%, ≥45%, ≥50%, ≥55%, ≥60%, ≥65%, ≥70%, ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90% ou ≥95% em taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante profilaxia de rVWF em relação a ABR de pré-tratamento.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a eficácia de tratamento profilático é medida examinando as vWF:RCo e/ou atividades de FVIII em amostras obtidas do sujeito antes e após tratamento profilático com rVWF.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a eficácia de tratamento profilático é medida examinando FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou atividades de capacidade de ligação de colágeno de VWF em amostras obtidas do sujeito antes e depois de tratamento profilático com rVWF.

21. Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que as amostras para examinar FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou atividades de capacidade de ligação de colágeno de VWF são obtidas 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 48 horas, 72 horas ou 96 horas, após tratamento profilático com rVWF.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21,

caracterizado pelo fato de que as amostras para examinar FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou atividades de capacidade de ligação de colágeno de VWF são obtidas 25 a 31 dias após tratamento profilático com rVWF.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a eficácia de tratamento profilático é determinada após ou durante um episódio de sangramento, em que amostras para examinar FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou atividades de capacidade de ligação de colágeno de VWF são obtidas após o episódio de sangramento e ainda em que as amostras são obtidas antes de administração de rVWF, 2 horas após administração de rVWF e, em seguida, a cada 12-24 horas até resolução do episódio de sangramento.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a eficácia de tratamento profilático é indicada por uma melhoria em FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou níveis de atividade de capacidade de ligação de colágeno de VWF após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis antes do tratamento profilático com rVWF.

25. Método para tratar profilaticamente episódios de sangramento espontâneo em um sujeito com Doença de von Willebrand (VWD) severa, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma dose semanal de Fator de von Willebrand (rVWF) recombinante substancialmente equivalente a uma dose semanal correspondente de VWF derivado de plasma (pdVWF) previamente administrada ao referido sujeito, desse modo reduzindo a frequência e/ou duração de episódios de sangramento espontâneo.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a dose semanal de rVWF é cerca de 10% menor que a dose semanal correspondente de pdVWF.

27. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a dose semanal de rVWF é cerca de 10% maior que a dose semanal correspondente de pdVWF.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que a dose semanal de rVWF é de duas infusões individuais administradas em dias separados.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que a dose semanal de rVWF é três infusões individuais administradas em dias separados.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que a dose semanal de rVWF é uma infusão única.

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizado pelo fato de que cada infusão individual compreende até 80 IU/kg de rVWF.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizado pelo fato de que cada infusão individual compreende 80 IU/kg de rVWF.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizado pelo fato de que cada infusão individual compreende até 50 IU/kg de rVWF.

34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 33, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem uma atividade de cofator de ristocetina de VWF (VWF:RCo) de linha de base variando de 20 IU/dL ou menos, ou é diagnosticado com VWD Tipo 1.

35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 34, caracterizado pelo fato de que o sujeito é diagnosticado com VWD Tipo 2A, 2B ou 2M.

36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 35,

caracterizado pelo fato de que o sujeito tem um teor de VWF:antígeno (VWF:Ag) variando de 3 IU/dL ou maior, ou é diagnosticado com VWD Tipo 3.

37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 36, caracterizado pelo fato de que o sujeito recebeu tratamento profilático de pdVWF por pelo menos 12 meses.

38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 e 31 a 37, caracterizado pelo fato de que as duas infusões individuais são administradas no dia 1 e no dia 5, ou no dia 2 e no dia 6, ou no dia 3 e no dia 7 de um período de 7 dias.

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 e 31 a 37, caracterizado pelo fato de que as três infusões individuais são administradas no dia 1, dia 3 e dia 6 de um período de 7 dias.

40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 37, caracterizado pelo fato de que a administração ocorre pelo menos a cada 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas ou 84 horas.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 37, caracterizado pelo fato de que a administração ocorre pelo menos a cada 72 horas.

42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 41, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar ao sujeito pelo menos uma dose de Fator VIII recombinante (rFVIII).

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a administração da pelo menos uma dose de rFVIII é administrada concomitantemente ou sequencialmente com a dose semanal de rVWF.

44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 43, caracterizado pelo fato de que o sujeito retoma o tratamento profilático após receber cirurgia eletiva ou cirurgia oral.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que se a cirurgia eletiva for uma cirurgia menor ou cirurgia oral e o sujeito tiver uma atividade de FVIII (FVIII:C) de pelo menos 0,4 IU/mL ou maior, ao sujeito é administrado rVWF sem rFVIII antes da cirurgia.

46. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que se a cirurgia eletiva for uma cirurgia maior e o sujeito tiver uma atividade de FVIII (FVIII:C) de pelo menos 0,8 IU/mL ou maior, ao sujeito é administrado rVWF sem rFVIII antes da cirurgia.

47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 43, caracterizado pelo fato de que a eficácia do tratamento profilático é indicada por uma redução de ≥25% em taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante profilaxia de rVWF em relação a ABR de pré-tratamento.

48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 47, caracterizado pelo fato de que a eficácia de tratamento profilático é indicada por uma redução de ≥25%, ≥30%, ≥35%, ≥40%, ≥45%, ≥50%, ≥55%, ≥60% , ≥65%, ≥70%, ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90% ou ≥95% em taxa de sangramento anual (ABR) para episódios de sangramento espontâneo durante profilaxia de rVWF em relação a ABR de pré-tratamento.

49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 48, caracterizado pelo fato de que a eficácia de tratamento profilático é medida examinando as vWF:RCo e/ou atividades de FVIII em amostras obtidas do sujeito antes e após tratamento profilático com rVWF.

50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 49, caracterizado pelo fato de que a eficácia de tratamento profilático é medida examinando FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou atividades de capacidade de ligação de colágeno de VWF em amostras obtidas do sujeito antes e depois de tratamento profilático com rVWF.

51. Método de acordo com a reivindicação 49 ou 50, caracterizado pelo fato de que as amostras para examinar FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou atividades de capacidade de ligação de colágeno de VWF são obtidas 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 48 horas, 72 horas ou 96 horas, após tratamento profilático com rVWF.

52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 51, caracterizado pelo fato de que as amostras para examinar FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou atividades de capacidade de ligação de colágeno de VWF são obtidas 25 a 31 dias após tratamento profilático com rVWF.

53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 52, caracterizado pelo fato de que a eficácia de tratamento profilático é determinada após ou durante um episódio de sangramento, em que amostras para examinar FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou atividades de capacidade de ligação de colágeno de VWF são obtidas após o episódio de sangramento e ainda em que as amostras são obtidas antes de administração de rVWF, 2 horas após administração de rVWF e, em seguida, a cada 12-24 horas até resolução do episódio de sangramento.

54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 53, caracterizado pelo fato de que a eficácia de tratamento profilático é indicada por uma melhoria em FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag e/ou níveis de atividade de capacidade de ligação de colágeno de VWF após o tratamento profilático com rVWF em comparação com os níveis antes do tratamento profilático com rVWF.

55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 54, caracterizado pelo fato de que o sangramento espontâneo compreende qualquer um selecionado do grupo que consiste em hemartrose, epistaxe, sangramento muscular, sangramento oral e sangramento gastrointestinal.

56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 55, caracterizado pelo fato de que o sujeito não é diagnosticado com VWD tipo 2N ou pseudo VWD.