TWI603978B - 對ｂａｆｆ及ｂ７ｒｐ１具專一性之蛋白質及其用途 - Google Patents

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Description

對BAFF及B7RP1具專一性之蛋白質及其用途
本文所闡述之雙專一性分子係在蛋白質治療劑之領域內。
大多數治療性蛋白質與單一靶蛋白結合且具有高專一性，由此干擾此單一靶蛋白之活性。該蛋白質可係一或多個調介所治療人類疾病之生物途徑的一部分，且因此該治療性蛋白質可抑制疾病進展。然而，治療性蛋白質很少對所有患者皆具有完整功效。治療性蛋白質之不完整功效在一些情形下可歸因於疾病之複雜性。例如，一些疾病可由多個生物途徑來調介，或不同生物途徑可在調介患有相同的臨床定義病況之不同患者的疾病活動性方面起主要作用。因此，在一些疾病中，同時抑制至少兩個生物途徑可能有利。
本文提供可與人類B7相關蛋白1(B7RP1，亦稱為GL50與T細胞共刺激分子配體(ICOSLG))及人類B細胞活化因子(BAFF，亦稱為腫瘤壞死因子超家族，成員13b(TNFSF13B))二者結合且抑制其生物活性之雙專一性蛋白質。BAFF在B細胞存活方面起作用，且B7RP1在T細胞共刺激方面起作用。因此，抑制兩種蛋白質活性之蛋白質會干擾B細胞及T細胞之活性。
本文闡述雙專一性蛋白質，其中該蛋白質可抑制BAFF介導之人 類B細胞增殖，且其中該蛋白質可抑制B7RP1介導之人類T細胞增殖。雙專一性蛋白質可包括包含兩個具有不同胺基酸序列之免疫球蛋白重鏈及兩個具有不同胺基酸序列之免疫球蛋白輕鏈之IgG抗體。IgG抗體可抑制BAFF介導之人類B細胞增殖及B7RP1介導之人類T細胞增殖。IgG抗體可為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體，且可為人類或人類化IgG抗體。雙專一性蛋白質可包括輕鏈互補決定區1(CDR1)，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：8；輕鏈互補決定區2(CDR2)，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：9；輕鏈互補決定區3(CDR3)，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：10；重鏈CDR1，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：11；重鏈CDR2，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：12；及重鏈CDR3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：13。此外，雙專一性蛋白質可包括包含SEQ ID NO：15或其變體之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：14或其變體之輕鏈可變區。該等變體序列可包括相對於參考序列每100個胺基酸中不超過10個的單一胺基酸缺失、插入或取代。
在替代實施例中，可抑制BAFF介導之人類B細胞增殖且可抑制B7RP1介導之人類T細胞增殖之雙專一性蛋白質可包括：(a)多肽，其包括具有下式之胺基酸序列：A-L1-P-L2-P，其中A係IgG抗體之免疫球蛋白重鏈，L1係不存在或長度為3至40個胺基酸之第一連接體，P係長度為10至40個胺基酸之BAFF結合肽，且L2係不存在或長度為5至50個胺基酸之肽連接體；及(b)免疫球蛋白輕鏈。(a)之免疫球蛋白重鏈及(b)之免疫球蛋白輕鏈可形成可結合B7RP1及/或可抑制B7RP1介導之人類T細胞增殖之IgG抗體，該抗體包括兩分子(a)之多肽及兩分子(b)之輕鏈。免疫球蛋白重鏈可在其緊鄰L1上游之C末端處丟失離胺酸。IgG抗體可為人類或人類化IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。BAFF結合肽P可具有胺基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。L1可具有胺基酸序列SEQ ID NO：4、37、38、39或40。L2 可具有胺基酸序列SEQ ID NO：5、6或7。雙專一性蛋白質可包括輕鏈CDR1，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：8(RASQGISNWLA)；輕鏈CDR2，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：9(AASSLQS)；輕鏈CDR3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：10(QQYDSYPRT)；重鏈CDR1，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：11(SYWMS)；重鏈CDR2，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：12(YIKQDGNEKYYVDSVKG)；及重鏈CDR3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：13(EGILWFGDLPTF)。雙專一性蛋白質可包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：14之免疫球蛋白輕鏈可變區及/或包含胺基酸序列SEQ ID NO：15之免疫球蛋白重鏈可變區。雙專一性蛋白質可包括胺基酸序列SEQ ID NO：19或其變體及胺基酸序列SEQ ID NO：17或18或其變體。該等變體序列可包括相對於參考序列每100個胺基酸中不超過10個的單一胺基酸缺失、插入或取代。
在另一態樣中，本文闡述包括以下各項之雙專一性蛋白質：(a)多肽，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18或其變體；及(b)另一多肽，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：19或其變體。該等變體序列可包括相對於參考序列每100個胺基酸中不超過10個的單一胺基酸缺失、插入或取代。雙專一性蛋白質可抑制BAFF介導之人類B細胞增殖及B7RP1介導之人類T細胞增殖。雙專一性蛋白質可為包括兩分子(a)之多肽及兩分子(b)之多肽之四聚體。
在另一實施例中，本文提供包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7之連接體之蛋白質。在一些實施例中，此蛋白質可抑制BAFF介導之人類B細胞增殖及/或B7RP1介導之人類T細胞增殖。該蛋白質可包括胺基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：14及/或SEQ ID NO：15。該蛋白質可包括包含至少兩個由SEQ ID NO：6或7間隔開之SEQ ID NO：1複本之胺基酸序列。在另一實施例中，該蛋白質可包含免疫球蛋白輕鏈及免疫球蛋白重鏈，且SEQ ID NO：6或7可位於重鏈C 端之下游。在該等實施例中，SEQ ID NO：6或7可側接有與除藉由重鏈及輕鏈結合之蛋白質外的蛋白質結合之肽。
此外，本文闡述一種醫藥組合物，其包括本文所闡述之雙專一性蛋白質或包括胺基酸序列SEQ ID NO：6或7之蛋白質中的任一者及生理學上可接受之賦形劑。
本文亦闡述編碼包含於本文所闡述之雙專一性蛋白質或包括SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7之蛋白質中之一者之任何多肽的核酸。編碼包含於雙專一性蛋白質中之多肽之實例性核酸尤其包含例如SEQ ID NO：55、56、60、61、62及63。本文闡述包括該等核酸之載體及含有該等載體及/或核酸之宿主細胞。本文進一步闡述製備雙專一性蛋白質之方法，其包括在表現核酸之條件下培養含有編碼本文所闡述之任一雙專一性蛋白質之核酸的宿主細胞，及自細胞團或培養基回收蛋白質。宿主細胞可為哺乳動物細胞(例如CHO細胞)或細菌細胞(例如大腸桿菌(Eschericha coli))。
在另一態樣中，本文闡述治療全身性紅斑狼瘡(包含狼瘡性腎炎)之方法，其包括向患者投與治療有效量之本文所闡述之任一雙專一性蛋白質或包括該雙專一性蛋白質之醫藥組合物。可在雙專一性蛋白質之前、之後或同時向患者投與另一治療劑。另一治療劑可為皮質類固醇、抗瘧疾藥、視黃酸、NSAID、環磷醯胺、去氫表雄固酮、麥考酚酸嗎乙酯(mycophenolate mofetil)、硫唑嘌呤、瘤克寧錠(chlorambucil)、胺甲喋呤、他克莫司(tacrolimus)、二胺苯碸、沙立度胺(thalidomide)、來氟米特(leflunomide)或環孢素。
在另一態樣中，本文闡述治療方法，其包括向患者投與治療有效量之本文所闡述之任一雙專一性蛋白質或包括本文所闡述之雙專一性蛋白質之醫藥組合物，其中該患者患有選自由以下組成之群之疾病：ANCA陽性血管炎、類風濕性關節炎(RA)、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、乳糜瀉、天皰瘡、天皰瘡樣病、亞急性皮膚型紅斑狼瘡(SCLE)、多發性硬化、慢性脫髓鞘多發性神經炎(CIDP)、重症肌無力、古德巴斯德症候群(Goodpasture’s syndrome)、腎小球腎炎、自體免疫溶血性貧血(AIHA)、特發性血小板減少性紫斑症(ITP)、慢性活動性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、休格倫氏症候群(Sjogren’s syndrome)、全身性硬化、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、格雷氏病(Graves’ disease)、愛迪生病(Addison’s disease)及多發性內分泌瘤(MEN)。
在另一態樣中，本文闡述一種醫藥組合物，其包括本文所闡述之雙專一性蛋白質或包括SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7之蛋白質中的任一者。該醫藥組合物可用於例如治療全身性紅斑狼瘡或狼瘡性腎炎。
在另一態樣中，闡述使用本文所提供之任一雙專一性蛋白質作為藥劑。
圖1：與BAFF及B7RP1結合之雙專一性蛋白質之圖。整個頂列列示每一構築物之標識符。整個第二列係關於每一構築物結構之簡短描述性片語。整個底列係每一構築物結構之圖。未填充之橢圓代表免疫球蛋白重鏈或輕鏈之恆定區。填充有水平線之橢圓代表免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變(VH或VL)區。實心填充之小正方形及環代表BAFF結合肽。鉸鏈區顯示為垂直粗線，而二硫橋顯示為水平粗線。
圖2：人類B細胞增殖分析中雙專一性蛋白質之活性。圖2A(頂部)及圖2B(底部)中所顯示之數據來自如實例1中所闡述實施之B細胞增殖分析。在兩圖中，x軸指示分析混合物中所含有之雙專一性蛋白質之濃度(log[nM])，且y軸指示3H-胸腺嘧啶攝取之量(每分鐘計數(cpm))。每一符號之含義係由所分析每一蛋白質之標識符來指示。標 識符之含義顯示於圖1中且例示於實例1中。
圖3：人類T細胞增殖分析中雙專一性蛋白質之活性。所顯示數據來自如實例1中所闡述實施之T細胞增殖分析。x軸指示分析混合物中雙專一性或αB7RP1抗體之濃度(log[nM])，且y軸指示在所指示濃度下在B7RP1抑制劑存在下之T細胞3H-胸腺嘧啶攝取相對於在無B7RP1抑制劑下之T細胞3H-胸腺嘧啶攝取之%(佔對照之%)。指示所測試之每一蛋白質之標識符。
圖4：使用葡萄球菌腸毒素B(Staphylococcus enterotoxin B，SEB)刺激之藉助人類扁桃腺細胞之細胞介素釋放。方法闡述於實例1中。y軸顯示根據製造商之說明書使用Meso Scale Discovery(Rockville,Maryland)套組量測之對多種細胞介素檢測到之信號位準。細胞經αB7RP1(分道1)、P74293(分道2)、CTLA4-Ig(分道3)或人類IgG(分道4)治療。所分析之細胞介素指示於圖中。
圖5：雙專一性構築物在小鼠中之藥物代謝動力學曲線。用於評價P71617、P71619、P71621、P71622、P74293及P74294在小鼠中之活體內藥物代謝動力學性質之方法闡述於實例1中。如實例1中所解釋，雙專一性蛋白質係藉由兩種不同分析來檢測，其中之一者僅檢測蛋白質之Fc部分(由經填充菱形指示之數據點；Fc分析)，且其中之一者檢測蛋白質之Fc及BAFF結合部分二者(由經填充正方形指示之數據點；完整分析)。x軸指示注射後之時間(小時)，且y軸指示血清中所檢測蛋白質之濃度(ng/mL)。所注射之構築物指示於每一圖中。
圖6A：與BAFF及B7RP1結合之鼠類替代雙專一性分子(「鼠類替代物」)對鼠類B細胞增殖之抑制。該分析係如實例2中所闡述來實施。鼠類替代物包括具有兩個附接至該抗體免疫球蛋白重鏈C端之BAFF結合肽複本之抗鼠類B7RP1 IgG抗體，如實例2中所解釋。陽性對照為BAFF結合肽體(「αBAFF」)。來自鼠類替代物及αBAFF之數據 分別由實心填充之圓形及正方形來指示。x軸指示分析中該等測試蛋白質之濃度(log[pM])，且y軸指示3H-胸腺嘧啶納入(cpm)。
圖6B：鼠類替代物對B7RP1與鼠類T細胞結合之抑制。該分析係如實例2中所闡述來實施。使用抗鼠類B7RP1 IgG抗體(「抗mB7RP1」)作為陽性對照。來自鼠類替代物及抗mB7RP1之數據分別由實心填充之圓形及正方形來指示。x軸指示分析中該等測試蛋白質之濃度(log[pM])，且y軸指示與T細胞結合之鼠類B7RP1-Fc之%。
圖7：向小鼠投與綿羊紅血球對免疫參數之活體內效應。此圖中所顯示之所有結果來自實例2中所闡述之分析。治療小鼠之蛋白質係藉由如下填充每一條來指示：未填充，抗mB7RP1；垂直線，αBAFF；水平線，抗mB7RP1加αBAFF；斜剖面線，鼠類替代物；棋盤式，mIgG1；及實心填充(僅在底圖中)，未經SBRC激發之小鼠。頂圖，經綿羊紅血球(SRBC)激發之小鼠中脾B細胞之百分比。y軸指示來自脾B細胞之細胞之%。中圖，在經SRBC激發之小鼠中為記憶T細胞之脾CD4+ T細胞之百分比。底圖，來自經SRBC激發之小鼠之血清中之抗SRBC抗體的含量。
圖8A：經不同蛋白質治療之NZB/NZW小鼠中之蛋白尿。方法闡述於實例2中。對每組小鼠之治療指示如下：經填充圓形，磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)；經填充正方形，鼠類IgG1(同種型對照；5mg/kg)；未填充正方形，抗mB7RP1(4.68mg/kg)；經填充上三角，αBAFF(1.88mg/kg)；未填充上三角，αBAFF(1.88mg/kg)加抗mB7RP1(4.68mg/kg)；及未填充下三角，鼠類替代物(5mg/kg)。x軸指示小鼠之年齡(月)，且y軸指示展現蛋白尿、即300mb/dL尿中蛋白質之小鼠之%。
圖8B：8.5個月大之經不同蛋白質治療之NZB/NZW小鼠中抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體之含量。方法闡述於實例2中。x軸指示治療小鼠之 分子之身份如下：1，抗mB7RP1(4.68mg/kg)；2，αBAFF(1.88mg/kg)；3，αBAFF(1.88mg/kg)加抗mB7RP1(4.68mg/kg)；4，雙專一性鼠類替代物(5mg/kg)；及5，mIgG1(同種型對照；5mg/kg)。y軸指示檢測到之抗dsDNA抗體之含量，以佔陽性對照之百分比表示。各點指示來自單一小鼠之數據。
圖9A：NZB/NZW小鼠中抗dsDNA IgG之含量。方法闡述於實例2中。對來自各組小鼠之數據鑑別如下：1，接受抗mB7RP1(14mg/kg)之小鼠；2，接受αBAFF(5.6mg/kg)之小鼠；3，接受抗mB7RP1(14mg/kg)與αBAFF(5.6mg/kg)之組合之小鼠；4，接受鼠類替代物(15mg/kg)之小鼠；5，接受mIgG同種型對照(15mg/kg)之小鼠；及6，接受PBS之小鼠。分道1、3及4上方之星號指示彼等分道之數據與分道5(mIgG)數據間之顯著(*，p<0.05；***，p<0.0001)差異。
圖9B：每組中具有蛋白尿之NZB/W F1小鼠之百分比。方法闡述於實例2中。對來自各組小鼠之數據鑑別如下：未填充正方形，接受抗mB7RP1(14mg/kg)之小鼠；經填充上三角，接受αBAFF(5.6mg/kg)之小鼠；未經填充上三角，接受抗mB7RP1(14mg/kg)與αBAFF(5.6mg/kg)之組合之小鼠；未填充下三角，接受鼠類替代物(15mg/kg)之小鼠；經填充正方形，接受mIgG同種型對照(15mg/kg)之小鼠；及經填充圓形，接受PBS之小鼠。在鼠類替代物對抗mB7RP1(p<0.01)、αBAFF(p<0.0001)與mIgG(p<0.0001)之間檢測到顯著差異。指示進行治療之時間窗口。
圖10：NZB/W F1小鼠之腎臟評分。如實例2中所解釋，若小鼠死亡發生在研究結束之前或研究結束時則收穫腎臟。如實例2中所闡述來測定腎臟評分，且較高評分指示更嚴重腎臟疾病。顯示每組小鼠之平均值加適宜誤差條。使小鼠群組接受以下治療：1)抗mB7RP1(14mg/kg)，填充有垂直線之條；2)αBAFF(5.6mg/kg)，填充有水平線之 條；3)抗mB7RP1(14mg/kg)與αBAFF(5.6mg/kg)之組合，填充有窗格紋之條；4)鼠類替代物(15mg/kg)，填充有棋盤圖案之條；5)mIgG(15mg/kg)，填充有黑色背景上之白點之條；及6)PBS，實心填充之條。星號指示來自經mIgG治療之小鼠之顯著差異，且p值為<0.05(*)或<0.001(***)。
圖11：BAFF及/或B7RP1對鼠類膠原誘導之關節炎之抑制效應。方法闡述於實例4中。使用如下指示之測試物質治療五組小鼠：mIgG，藉由實線連接之經填充正方形；PBS，藉由虛線連接之經填充正方形；抗mB7RP1，藉由虛線連接之經填充圓形；αBAFF，藉由實線連接之開口圓形；及抗mB7RP1與αBAFF之組合，藉由實線連接之經填充圓形。頂圖顯示各組之關節炎發病率%，且底圖顯示各組之平均關節炎評分。每一圖中之垂直下箭頭指示使用牛膠原進行第二次免疫之時間。
本文提供結合且抑制B細胞活化因子(BAFF；亦稱為BLYS、TALL1、THANK或TNFSF13B)及B7相關蛋白1(B7RP1；亦稱為ICOS配體、ICOSL、LICOS、B7同源物2、B7H2及GL50)二者之雙專一性蛋白質、編碼該等雙專一性蛋白質之核酸以及製備及使用該等蛋白質之方法。雙專一性蛋白質可抑制BAFF介導之B增殖及B7RP1介導之T細胞增殖二者。在另一態樣中，雙專一性蛋白質可抑制B7RP1與T細胞之結合。該雙專一性蛋白質可係包括兩個不同免疫球蛋白重鏈及兩個不同免疫球蛋白輕鏈之IgG抗體，其中一個重鏈/輕鏈對與BAFF結合且另一對與B7RP1結合。另一選擇為，雙專一性蛋白質之B7RP1結合部分可包括包含兩個相同重鏈及兩個相同輕鏈之IgG抗體，且雙專一性蛋白質之BAFF結合部分可包括一或多個BAFF結合肽，其可視情況經由免疫球蛋白重鏈或輕鏈之N端、免疫球蛋白重鏈之羧基端及/或在免疫球蛋白重鏈之CH2及/或CH3區內融合至抗B7RP1抗體。
定義
如本文所意指，「抗體」係包括重鏈及/或輕鏈免疫球蛋白可變區之蛋白質。
如本文所意指，「雙專一性」蛋白質係可與兩種在一些實施例中為蛋白質之不同分子專一性結合之蛋白質。例如，在一些實施例中，雙專一性蛋白質可與BAFF及B7RP1二者結合。
當患者在相同的一般時程、視情況在同一時間期間接受兩種或更多種治療劑時，使患者接受兩種或更多種治療劑之「同時」治療。例如，若在持續基礎上向患者每天投用一種治療劑，且亦在持續基礎上每月一次投用另一治療劑，則患者將同時接受該兩種藥物。類似地，投用兩種不同治療劑(各自為每兩週一次但非同一天投與)之患者將接受兩種治療劑之同時治療。此外，在持續基礎上接受每週一次一種治療劑及每天一次僅持續3天之另一治療劑之患者將接受該兩種治 療劑之短時間段治療。
如本文所意指，「Fc區」係由一或多個二硫鍵連接之兩個多肽鏈組成之二聚體，每一鏈包括鉸鏈結構域加CH2及CH3結構域之部分或全部。每一多肽鏈皆稱為「Fc多肽鏈」。更特定而言，預期與本發明一起使用之Fc區為IgG Fc區，其可為哺乳動物(例如人類)IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區。在人類IgG1 Fc區中，已知至少兩種對偶基因類型。相對於哺乳動物Fc多肽胺基酸序列，Fc多肽鏈之胺基酸序列與哺乳動物Fc多肽之胺基酸序列之差異不超過20、15、12、10、8、5或3個單一胺基酸取代、插入或缺失。另一選擇或此外，Fc多肽鏈之胺基酸序列可與已知或天然Fc多肽鏈之序列在序列之每100個胺基酸中相差不超過10個單一胺基酸插入、缺失或取代。在一些實施例中，該等變化形式可為「異源二聚化變化形式」，其幫助形成異源二聚體而非同源二聚體。在提及Fc多肽鏈內之具體位置時，使用EU編號系統(Edelman等人(1969),Proc.Natl.Acad.Sci.63：78-85)，如下表1中人類IgG Fc多肽鏈之比對所圖解說明。
在一些位置處，可出現天然多態性。例如，上文所給出IgG2序列中之位置282處之甲硫胺酸在天然IgG2序列中更通常為纈胺酸。類似地，IgG3序列中之位置296處之酪胺酸亦可為苯丙胺酸。
「異源二聚化變化形式」通常係指CH3區中兩個不同IgG重鏈之幫助形成不具相同胺基酸序列之異源二聚重鏈二聚體(即二聚化重鏈)之變化形式。異源二聚化變化形式可不對稱，即具有某一變化形式之一個重鏈可與具有不同變化形式之另一重鏈配對。該等變化形式有助於異源二聚化且不利於同源二聚化。該等成對異源二聚化變化形式之一實例係所謂的「隆凸與孔洞」取代。例如，參見美國專利7,695,936及美國專利申請公開案2003/0078385，該等專利之闡述該等突變之部分以引用方式併入本文中。如本文所意指，含有一對隆凸與孔洞取代之重鏈-重鏈對含有一個重鏈中之一個取代及另一重鏈中之另一取代。例如，已發現與利用未經修飾之重鏈所發現相比，以下隆凸與孔洞取代增加異源二聚體形成：1)一個鏈中之Y407T與另一鏈中之T366Y；2)一個鏈中之Y407A與另一鏈中之T366W；3)一個鏈中之F405A與另一鏈中之T394W；4)一個鏈中之F405W與另一鏈中之T394S；5)一個鏈中之Y407T與另一鏈中之T366Y；6)一個鏈中之T366Y及F405A與另一鏈中之T394W及Y407T；7)一個鏈中之T366W及F405W與另一鏈中之T394S及Y407A；8)一個鏈中之F405W及Y407A與另一鏈中之T366W及T394S；及9)Fc一個多肽中之T366W與另一鏈中之T366S、L368A及Y407V。如本文所意指，Fc多肽中之突變係以下列方式來表示。使用EU編號系統(其呈現於Edelman等人(1969),Proc.Natl.Acad.Sci.63：78-85中)通常存在於CH3區中給定位 置處之胺基酸(使用一字母代碼)在EU位置編號之前，其後為存在於該位置處之替代胺基酸。例如，Y407T意指通常存在於EU位置407處之酪胺酸經蘇胺酸置換。為清晰起見，EU編號系統圖解說明於下表1中。該等變化形式之另一選擇或除其之外，產生新二硫橋之取代可幫助異源二聚體形成。例如，參見美國專利申請公開案2003/0078385,該公開案中闡述該等突變之部分以引用方式併入本文中。IgG1 Fc區中之該等變化形式包含例如以下取代：一個Fc多肽鏈中之Y349C與另一鏈中之S354C；一個Fc多肽鏈中之Y349C與另一鏈中之E356C；一個Fc多肽鏈中之Y349C與另一鏈中之E357C；一個Fc多肽鏈中之L351C與另一鏈中之S354C；一個Fc多肽鏈中之T394C與另一鏈中之E397C；或一個Fc多肽鏈中之D399C與另一鏈中之K392C。類似地，改變例如CH3-CH3界面中一或多個殘基之電荷之取代可增強異源二聚體形成，如WO 2009/089004中所解釋，該專利中闡述該等取代之部分以引用方式併入本文中。該等取代在本文中稱為「電荷對取代」，且含有一對電荷對取代之Fc區含有一個重鏈中之一個取代與另一鏈中之不同取代。電荷對取代之一般實例包含以下各項：1)一個鏈中之R409D、R409E、K409D或K409E加另一鏈中之D399K或D399R；2)一個鏈中之N392D、N392E、K392D或K392E加另一鏈中之D399K或D399R；3)一個鏈中之K439D或K439E加另一鏈中之E356K、E356R、D356K或D356R；及4)一個鏈中之K370D或K370E加另一鏈中之E357K或E357R。此外，兩個鏈中之取代Q355D、Q355E、R355D、R355E、K360D或K360R在與其他異源二聚化變化形式一起使用時可穩定異源二聚體。專一性電荷對取代可單獨使用或與其他電荷對取代一起使用。單對電荷對取代及其組合之特定實例包含以下各項：1)一個鏈中之K409E加另一鏈中之D399K；2)一個鏈中之K409E加另一鏈中之D399R；3)一個鏈中之K409D加另一鏈中之 D399K；4)一個鏈中之K409D加另一鏈中之D399R；5)一個鏈中之K392E加另一鏈中之D399R；6)一個鏈中之K392E加另一鏈中之D399K；7)一個鏈中之K392D加另一鏈中之D399R；8)一個鏈中之K392D加另一鏈中之D399K；9)一個鏈中之K409D及K360D加另一鏈中之D399K及E356K；10)一個鏈中之K409D及K370D加另一鏈中之D399K及E357K；11)一個鏈中之K409D及K392D加另一鏈中之D399K,E356K及E357K；12)一個鏈上之K409D與另一鏈上之K392D及D399K；13)一個鏈上之K409D及K392D加另一鏈上之D399K及E356K；14)一個鏈上之K409D及K392D加另一鏈上之D399K及D357K；15)一個鏈上之K409D及K370D加另一鏈上之D399K及D357K；16)一個鏈上之D399K加另一鏈上之K409D及K360D；及17)一個鏈上之K409D及K439D加另一鏈上之D399K及E356K。該等異源二聚化變化形式中之任一者可為本文所闡述之免疫球蛋白IgG重鏈之一部分。
如本文所意指，「人類」抗體或蛋白質係由人類來源之核酸序列編碼之抗體或蛋白質。人類抗體或蛋白質可在所培養之非人類細胞中或在已引入編碼人類抗體或蛋白質之核酸分子之轉基因有機體活體內製備。另一選擇為，人類抗體或蛋白質可在所培養人類細胞中或在人類活體內製備。
如本文所意指，「IgG抗體」係基本上由存在於大多數天然IgG抗體中之免疫球蛋白結構域(即免疫球蛋白重鏈，其包括重鏈可變(VH)區、第一重鏈恆定(CH1)區、鉸鏈區、第二重鏈恆定(CH2)區及第三重鏈恆定(CH3)區；及輕鏈，其包括輕鏈可變(VL)區及輕鏈恆定(CL)區)組成之抗體。該等免疫球蛋白結構域之多個序列已於科學文獻(例如，在SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,Public Health Service,N.I.H.,Bethesda,MD,1991)中報導。如本文所意指， IgG抗體係基本上由兩個重鏈及兩個輕鏈組成之四聚體。天然抗體僅包含兩個免疫球蛋白重鏈且無免疫球蛋白輕鏈，例如有些出現於駱駝及鯊魚中者(例如，參見Muyldermans等人，2001,J.Biotechnol.74：277-302；Desmyter等人，2001,J.Biol.Chem.276：26285-90；Streltsov等人(2005),Protein Science 14：2901-2909)並非如本文所意指之「IgG抗體」。IgG抗體可為人類或可來自另一物種。此外，IgG抗體可含有相對於天然IgG抗體重鏈或輕鏈之胺基酸序列不超過40、35、30、25、20、15、10或5個的單一胺基酸取代、插入及/或缺失。
「免疫球蛋白重鏈」係指IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗體或其變體之重鏈，其相對於由源於自然界之核酸序列編碼之免疫球蛋白重鏈含有不超過40、30、25、20、15、10或5個單一胺基酸插入、缺失或取代。「免疫球蛋白IgG重鏈」限於來自IgG抗體或其變體之重鏈，其相對於由源於自然界之核酸序列編碼之IgG重鏈的胺基酸序列含有不超過40、30、25、20、15、10或5個單一胺基酸插入、缺失或取代。免疫球蛋白重鏈基本上係由多個包含VH區、CH1區、鉸鏈區、CH2區及CH3區之不同區域或結構域組成。在一些其他同種型(即IgM與IgA)中，在CH3區之下游包含其他區域。免疫球蛋白重鏈及本文所包含之區域通常闡述於例如Carayannopoulos及Capra，Immunoglobulins：Structure and Function，第283-314頁，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY，第3版，Paul編輯，Raven Press,New York,1993中，該文獻以引用方式併入本文中。此外，業內已知免疫球蛋白重鏈亞區之多個序列。例如，參見Kabat等人，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,MD,1991。在一些情形下，包含免疫球蛋白重鏈加一些非免疫球蛋白序列之多肽鏈在本文中將稱為「重鏈」。
如本文所意指，「免疫球蛋白輕鏈」係來自人類抗體或來自另一物種之抗體之κ或λ鏈。如本文所意指，在免疫球蛋白輕鏈中亦包含具有相對於由天然來源之核酸序列編碼之免疫球蛋白輕鏈不超過20、15、10或5個單一胺基酸插入、缺失及/或取代之蛋白質。免疫球蛋白輕鏈通常闡述於例如Carayannopoulos及Capra，Immunoglobulins：Structure and Function，第283-314頁，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY，第3版，Paul編輯，Raven Press,New York,1993中，該文獻以引用方式併入本文中。免疫球蛋白輕鏈含有VL區及CL區。業內已知該等區域之多個序列。例如，參見Kabat等人，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,MD,1991。在一些情形下，包含免疫球蛋白輕鏈加一些非免疫球蛋白序列之多肽鏈在本文中將稱為「輕鏈」。
如本文所意指，「免疫球蛋白可變區」係可為人類來源或來自另一物種之VH或VL區。免疫球蛋白可變區通常闡述於例如Carayannopoulos及Capra，Immunoglobulins：Structure and Function，第283-314，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY，第3版，Paul編輯，Raven Press,New York,1993中，該文獻以引用方式併入本文中。如本文所意指，在免疫球蛋白可變區中亦包含具有相對於由天然來源之核酸序列編碼之免疫球蛋白可變區不超過20、15、10或5個單一胺基酸插入、缺失及/或取代之蛋白質。免疫球蛋白可變區含有三個超變區，稱為互補決定區1(CDR1)、互補決定區2(CDR2)及互補決定區3(CDR3)。該等區域形成抗體之抗原結合位點。CDR嵌入較不可變框架區(FR1-FR4)內。該等亞區在可變區內之順序如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。業內已知免疫球蛋白可變區之多個序列。例如，參見Kabat等人，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,MD,1991。
CDR可以下列方式位於VH區序列中。CDR1在成熟VH區之約殘基31處開始且通常長度為約5-7個胺基酸，且其前幾乎始終為Cys-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx(SEQ ID NO：20)(其中「Xxx」為任何胺基酸)。重鏈CDR1後之殘基幾乎始終為色胺酸，通常為Trp-Val、Trp-Ile或Trp-Ala。在CDR1中之最後殘基與CDR2中之第一個殘基之間幾乎始終存在14個胺基酸，且CDR2通常含有16至19個胺基酸。CDR2之前可緊接Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(SEQ ID NO：21)，且之後可緊接Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala。其他胺基酸可在CDR2之前或之後。CDR2中之最後殘基與CDR3中第一個殘基之間幾乎始終存在32個胺基酸，且CDR3之長度可為約3至25個殘基。Cys-Xxx-Xxx幾乎始終在CDR3之前，且Trp-Gly-Xxx-Gly(SEQ ID NO：22)幾乎始終在CDR3之後。
輕鏈CDR可以下列方式位於VL區中。CDR1在成熟抗體之約殘基24處開始且通常長度為約10至17個殘基。其前幾乎始終為Cys。在CDR1之最後殘基與CDR2之第一個殘基之間幾乎始終存在15個胺基酸，且CDR2幾乎始終長度為7個殘基。CDR2之前通常為Ile-Tyr、Val-Tyr、Ile-Lys或Ile-Phe。在CDR2與CDR3之間幾乎始終存在32個殘基，且CDR3通常長度為約7至10個胺基酸。CDR3之前幾乎始終為Cys之後且之後通常為Phe-Gly-Xxx-Gly(SEQ ID NO：23)。
如本文所意指，「連接體」係連接兩個多肽之肽。連接體之長度可為1-80個胺基酸。在一些實施例中，連接體長度可為2-40、3-30或3-20個胺基酸。在一些實施例中，連接體可係長度不超過14、13、12、11、10、9、8、7、6或5個胺基酸之肽。在其他實施例中，連接體長度可為5-25、5-15、10-20或20-30個胺基酸。在其他實施例中， 連接體長度可為約、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸。在許多情形下，連接體缺少游離半胱胺酸殘基(即且因此不參與二硫鍵)且亦不含N-糖基化位點(即，Asn-Xxx-Ser/Thr，其中X可係除脯胺酸外之任何胺基酸)。
如本文所意指，「肽體」係一或多種融合至Fc區之生物活性肽。Shimamoto等人(2012),mAbs4(5)：586-591，該文獻中解釋肽體結構及其製備方法之部分以引用方式併入本文中。
如本文所意指，「肽」係由短胺基酸序列組成之多肽，其可或可不經糖基化及/或含有經修飾胺基酸。肽長度可為2至75個胺基酸。在一些實施例中、肽長度為3-60、3-50、3-40、3-30或3-20個胺基酸。在其他實施例中、肽長度可為5-25、5-15、10-20或20-30個胺基酸。在其他實施例中、肽長度可為約、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸。
用於治療疾病之藥物之「治療有效量」係可減輕疾病之嚴重程度，減輕一或多種與該疾病或其治療相關之症狀之嚴重程度，或延遲可在所治療病況後以一定頻率發生的更嚴重症狀或更嚴重疾病之發作的量。
本文所提及任何疾病之「治療」涵蓋緩和疾病之至少一種症狀、減輕疾病之嚴重程度或延遲或預防在一些情形下可伴隨疾病或引起至少一種其他疾病之疾病至更嚴重症狀之進展。治療並不意味著疾病完全治癒。有用治療劑僅需要減輕疾病之嚴重程度，減輕一或多種與該疾病或其治療相關之症狀之嚴重程度，或延遲可在所治療病況後以一定頻率發生的更嚴重症狀或更嚴重疾病之發作。例如，若疾病為發炎性腸病，則使用治療劑進行治療可減少腸中不同發炎位點之數量 或受侵襲腸之總發炎程度。其可減輕疼痛及/或腫脹，減輕諸如腹瀉、便秘或嘔吐等症狀及/或預防腸穿孔。患者之病況可藉由標準技術來評價，例如在鋇液灌腸或腸灌注後實施之x射線、內窺鏡檢查、結腸鏡檢查及/或生檢。適宜程序將根據患者之病況及症狀而變化。類似地，若所治療之疾病為全身性紅斑狼瘡(SLE)，則可使用SLEDAI指數評分來評估疾病活動性，如下文所解釋。
與BAFF及B7RP1結合之雙專一性蛋白質
本文揭示與B7RP1及BAFF結合及/或可在活體外抑制B7RP1介導之T細胞增殖及BAFF介導之B細胞增殖之雙專一性蛋白質。與如本文所闡述之雙專一性蛋白質結合之BAFF及B7RP1蛋白可為人類蛋白，及/或可係尤其來自諸如以下等另一物種之蛋白質：食蟹猴、恒河猴、黑猩猩、小鼠及/或兔。在一些實施例中，如本文所闡述之雙專一性蛋白質可與例如人類(智人(Homo sapiens))及食蟹猴(Macaca fascicularis)B7RP1及BAFF蛋白二者結合。
在一些實施例中，該等雙專一性蛋白質可係其中B7RP1結合部分及BAFF結合部分各自基本上係由免疫球蛋白IgG重鏈及免疫球蛋白輕鏈組成之雙專一性IgG抗體。因此，該雙專一性抗體含有兩個不同的免疫球蛋白重鏈及兩個不同的免疫球蛋白輕鏈。總之，該兩對免疫球蛋白重鏈及輕鏈形成完整的雙專一性IgG抗體。業內已知雙專一性IgG抗體，且亦已知雙專一性抗體之多種其他格式。例如，參見Kontermann,Bispecific Antibodies：Developments and Current Perspectives，第1-28頁，BISPECIFIC ANTIBODIES,Kontermann編輯，Springer-Verlag,Berlin,Heidelburg,2011，該文獻中闡述該等抗體之部分以引用方式併入本文中。可與BAFF及B7RP1結合之抗體無論格式如何皆涵蓋於本文中。雙專一性IgG抗體可為人類、人類化或嵌合抗體，且可具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。在一些實施 例中，雙專一性IgG抗體可偶聯至其他部分。業內已知抗BAFF且抗B7RP1抗體之胺基酸序列。例如，參見美國專利7,737,111及美國專利申請公開案US 2011/0117093。該等文件中闡述該等抗體之部分以引用方式併入本文中。在一些實施例中，該等雙專一性抗體可包括如上文所定義之「異源二聚化變化形式」，包含幫助形成異源四聚雙專一性IgG抗體之電荷對取代。
在其他實施例中，本文所闡述之雙專一性蛋白質可為包括與B7RP1結合之抗體(其包括免疫球蛋白IgG重鏈及免疫球蛋白輕鏈)及與BAFF結合之肽的融合蛋白。BAFF結合肽可以一或多個複本(例如2、3、4、5、6、7、8或高達16個複本)存在。BAFF結合肽可與來自多個物種之BAFF蛋白結合，可能物種尤其為例如小鼠、食蟹猴及/或人類。抗體可為與人類及/或食蟹猴B7RP1結合之抗B7RP1 IgG抗體，視情況為人類或人類化抗體。在一些實施例中，連接體可附接至抗B7RP1 IgG抗體重鏈之C端，其後為第一BAFF結合肽、另一連接體及第二BAFF結合肽。第三、第四、第五、第六、第七、第八或高達第十六個BAFF結合肽可在該兩個視情況與連接體間雜排列之結合肽之後。另一選擇或此外，可將1、2、3、4、5、6、7或8個BAFF結合肽插入抗B7RP1抗體中之其他位置中，例如免疫球蛋白重鏈或免疫球蛋白輕鏈之N端或CH2或CH3區之環區域中。IgG抗體可為哺乳動物抗體，例如人類或鼠類抗體。抗B7RP1抗體可為人類或人類化IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。在該等包括抗B7RP1 IgG抗體之雙專一性融合蛋白中，雙專一性蛋白質可包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：19之免疫球蛋白輕鏈。涵蓋包括重鏈之變體，該重鏈具有相對於SEQ ID NO：17或18含有不超過30、25、20、15、10、5或3個單一胺基酸插入、缺失或取代之胺基酸序列。類似地，涵蓋包括免疫球蛋白輕鏈之變體，該輕鏈 具有相對於SEQ ID NO：19含有不超過20、15、10、8、7、5或3個單一胺基酸插入、缺失或取代之胺基酸序列。該等雙專一性蛋白質可為包括兩個包含胺基酸序列SEQ ID NO：17或18或其變體之多肽及兩個包含胺基酸序列SEQ ID NO：19或其變體之輕鏈的四聚體。
如上文所闡述之雙專一性融合蛋白之BAFF結合肽部分可包括胺基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。該等BAFF結合肽闡述於美國專利7,737,111中，該專利之相關部分以引用方式併入本文中。在一些實施例中，在雙專一性蛋白質中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個該BAFF結合肽之複本。BAFF結合肽可例如經由連接體附接至抗B7RP1抗體之羧基末端。例如，抗B7RP1 IgG抗體之羧基末端之後可為具有例如胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：4)之連接體。其他適宜連接體之實例尤其包含Gly-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：37)、Gly-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO：38)、Gly-Gly-Gly-Gln(SEQ ID NO：39)及Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：40)。此連接體之後可為BAFF結合肽。BAFF結合肽之後可為包括例如胺基酸序列SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：24之另一連接體。亦可使用其他連接體。此連接體之後可為包括例如胺基酸序列SEQ ID NO：1之另一BAFF結合肽。
在上文剛剛闡述之雙專一性融合蛋白或上文所闡述之雙專一性異源四聚IgG抗體中，VL區可含有分別包括胺基酸序列SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之CDR1、CDR2及CDR3。VH區CDR1、CDR2及CDR3可分別包括胺基酸序列SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13。在一些實施例中，IgG抗體之VL區可包括胺基酸序列SEQ ID NO：14或其變體，且VH區可包括胺基酸序列SEQ ID NO：15或其變體。該等變體序列可包括相對於參考序列每100個胺基 酸中不超過10個的單一胺基酸缺失、插入或取代。
包括連接體之蛋白質
本文提供賦予含有其之蛋白質有利的物理性質之具有胺基酸序列SEQ ID NO：5、6或7之連接體。如下文實例1中所顯示，兩個具體連接體(即具有胺基酸序列SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7之彼等)之使用對雙專一性分子之諸如表現、穩定性及黏度等性質具有正效應。因此，與含有其他連接體之相似蛋白質相比，多種含有該等連接體之蛋白質可具有該等有利的性質。
雙專一性蛋白質之治療應用
本文所闡述與BAFF及B7RP1結合之雙專一性蛋白質可用作多種適應症之治療劑，尤其由自體抗體驅動之病況及/或由T細胞及B細胞二者介導之病況。該等病況包含例如SLE、狼瘡、腎炎、ANCA陽性血管炎、類風濕性關節炎(RA)、皮肌炎、多發性肌炎、胃腸疾病(例如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎及乳糜瀉)、皮膚病況(例如天皰瘡、天皰瘡樣病及亞急性皮膚型紅斑狼瘡(SCLE))、神經系統疾病(例如多發性硬化及慢性脫髓鞘多發性神經炎(CIDP))、神經性肌肉疾病(例如重症肌無力)、涉及腎臟之疾病(例如古德巴斯德症候群及腎小球腎炎)、血液病況(例如自體免疫溶血性貧血(AIHA)、特發性血小板減少性紫斑症(ITP)及自體免疫性嗜中性球減少症)、肝臟病況(例如慢性活動性肝炎及原發性膽汁性肝硬化)、休格倫氏症候群、全身性硬化及內分泌病況(包含橋本氏甲狀腺炎、格雷氏病、愛迪生病及多發性內分泌自體免疫衰竭(通常包含糖尿病、甲狀腺低能症、愛迪生病及性腺衰竭))。可向遭受該等病況中任一者之患者投與治療有效量之如本文所闡述之雙專一性蛋白質來治療病況。
在一實施例中，可使用可抑制BAFF介導之B細胞增殖及B7RP1介導之T細胞增殖之雙專一性蛋白質來治療遭受SLE之患者。SLE係病因 未知之特徵為對核自身抗原之自體反應性之自體免疫疾病。其臨床表現變化多端從而使得仍未確定其實際上係單一疾病抑或相關病況之群。Kotzin(1996)Systemic lupus erythematosus.Cell 85：303-306；Rahman及Isenberg(2008),Systemic lupus erythematosus.N.Engl.J.Med. 358：929-939。症狀可包含以下各項：全身症狀，例如不適、疲勞、發熱、厭食症及體重損失；各種皮膚症狀，包含急性、成人短暫性面疹、大皰性疾病以及慢性及有損外觀之頭頸疹；關節炎；肌肉疼痛及/或虛弱；心血管症狀，例如二尖瓣增厚、贅疣、反胃、狹窄、心包炎及局部缺血性心臟病，其中之一些可導致中風、栓塞性疾病、心臟衰竭、感染性心內膜炎或瓣膜衰竭；腎炎，其係SLE發病率之主要原因；神經症狀，包含認知功能障礙、抑鬱症、精神病、昏迷、癲癇、偏頭痛及其他頭痛症候群、無菌性腦膜炎、舞蹈病、中風及顱神經疾病；血液症狀，包含白血球減少症、血小板減少症、漿膜炎、貧血、凝血異常、脾腫大及淋巴腺病；及多種胃腸畸形。同前；Vratsanos等人，「Systemic Lupus Erythematosus」，第39章，Samter’s Immunological Diseases，第6版，Austen等人編輯，Lippincott Williams & Wilkins,Phiiladelphia,PA,2001。症狀之嚴重程度與病程一樣變化很大。SLE可致命。
SLE患者可在使用現有SLE療法治療之前、之後或同時使用抑制BAFF及B7RP1之雙專一性蛋白質進行治療。該等現有SLE療法包含皮質類固醇(例如潑尼松(prednisone)、潑尼松龍(prednisolone)及甲基潑尼松龍)、抗瘧疾藥(例如羥基氯喹(hydroxychloroquine)、奎那克林(quinacrine)及氯喹)、視黃酸、阿司匹林(aspirin)及其他非類固醇抗發炎藥物(NSAID)、環磷醯胺、去氫表雄固酮、麥考酚酸嗎乙酯、硫唑嘌呤、瘤克寧錠、胺甲喋呤、他克莫司、二胺苯碸、沙立度胺、來氟米特、環孢素、貝利木單抗(belimumab)、抗CD20抗體(例如利妥昔單 抗(rituximab))及融合蛋白(例如阿巴他賽(abatacept))。
SLE患者之疾病活動性可使用諸如全身性紅斑狼瘡疾病活動性指數(SLEDAI)等儀器來分級，該儀器為將以下根據嚴重程度加權之症狀考慮在內之疾病活動性提供評分：癲癇、精神病、器質性腦症候群、視覺障礙、顱神經病症、狼瘡頭痛、血管炎、關節炎、肌炎、尿液管型、血尿、蛋白尿、膿尿、新疹、禿發、黏膜潰瘍、胸膜炎、心包炎、低補體、DNA結合增加、發熱、血小板減少症及白血球減少症。Bombardier等人(1992),Arthr.& Rheum.35(6)：630-640，該文獻之相關部分以引用方式併入本文中。本文所闡述之治療可用於減輕或消除如藉由SLEDAI量測之SLE症狀。與同一患者在起始如本文所闡述之雙專一性蛋白質治療之前之基線值相比，本文所闡述治療之方法可改良患者之SLEDAI評分。
用於評價SLE疾病活動性之另一方法係不列顛群島狼瘡評價組(British Isles Lupus Assessment Group,BILAG)指數，其係基於醫師之治療意圖之原則用於SLE患者之疾病活動性評價系統。Stoll等人(1996),Ann.Rheum Dis.55：756-760；Hay等人(1993),Q.J.Med.86：447-458。該等參考文獻中闡述BILAG之部分以引用方式併入本文中。BILAG評分係藉由在8種基於器官之系統中之每一者中給出單獨的疾病活動性的數字或字母評分來指配，該等系統係全身(例如發熱及疲勞)、黏膜與皮膚(症狀尤其例如疹及禿發)、神經(症狀尤其例如癲癇、偏頭痛頭痛及精神病)、肌肉骨骼(例如關節炎)、心肺(例如心力衰竭及肺功能降低)、血管炎及血栓形成、腎(例如腎炎)及血液。同前。與起始如本文所闡述之雙專一性蛋白質治療之前之基線值相比，本文所闡述之治療可用於減輕或消除如藉由BILAG指數所量測之SLE症狀或降低患者之BILAG評分。
如本文所闡述抑制BAFF介導之B細胞增殖及B7RP1介導之T細胞 增殖之雙專一性蛋白質亦可用於治療類風濕性關節炎(RA)。RA係具有全身性症狀以及與關節特定相關之症狀之慢性疾病。症狀通常包含導致疼痛及關節腫脹之滑膜炎以及各種實驗室異常，例如高於正常含量之類風濕因子、抗瓜胺酸修飾蛋白(抗CCP)之抗體及C-反應蛋白(CRP)及紅血球沉降速率上升(ESR)。較不常見症狀包含多種關節外症狀，涉及例如肌腱、韌帶、血管、心臟及肺。疾病活動性通常可使用多個指數來量測。例如，參見Anderson等人(2012),Arthritis care & Res.64(5)：640-647，該文獻中論述該等指數之部分以引用方式併入本文中。包含於該等評分指數中之要素包含壓痛關節數、腫脹關節數、功能評價及多種實驗室發現(例如CRP、ESR等)。
在一些實施例中，遭受RA之患者可在使用當前用於RA之藥物治療之前、之後或同時使用抑制BAFF介導之B細胞增殖及B7RP1介導之T細胞增殖的雙專一性蛋白質來治療。當前用於類風濕性關節炎(RA)之治療劑尤其包含非類固醇抗發炎藥物(NSAID)(例如阿司匹林及環氧合酶-2(COX-2)抑制劑)、疾病改良抗發炎藥物(DMARD，例如胺甲喋呤、來氟米特及柳氮磺吡啶(sulfasalazine))、抗瘧疾藥(例如羥基氯喹)、環磷醯胺、D-青黴胺(D-penicillamine)、硫唑嘌呤、金鹽、腫瘤壞死因子抑制劑(例如依那西普(etanercept)、英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、戈利木單抗(golimumab)及賽妥珠單抗(certolizumab pegol))、CD20抑制劑(例如利妥昔單抗)、IL-1拮抗劑(例如阿那白滯素(anakinra))、IL-6抑制劑(例如托西莫單抗(tocilizumab))、Janus激酶(JAK)抑制劑(例如托法替尼(tofacitinib))、阿巴他賽及皮質類固醇。
治療有效量之如本文所闡述抑制BAFF介導之B細胞增殖及B7RP1介導之T細胞增殖之雙專一性蛋白質亦可用於治療發炎性腸病，例如克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎。克羅恩氏病涉及自口至肛門之消化道之 任何部分的異常發炎，但在大多數患者中異常發炎限於迴結腸、小腸及結腸-直腸區域。通常，發炎為不連續的。常見症狀包含腹痛、厭食症、體重損失、發熱、腹瀉、飽脹及/或右下腹壓痛、便秘、嘔吐以及肛門周圍不適及分泌物。其他可能的症狀尤其包含外周關節炎、生長遲滯、上鞏膜炎、口瘡口炎、結節性紅斑、壞疽性膿皮病、腎結石、尿液稀釋及鹼化作用受損、吸收不良及膽石。例如，參見Strober等人，Medical Immunology，第10版，第III部分，Ch.35(2001)；Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第17版，第3部分Ch.31(1999)。自患有克羅恩氏病之患者分離之巨噬細胞產生增加的IL-12、IFNγ、TNFα及其他發炎細胞性介素之量。
儘管潰瘍性結腸炎有時與克羅恩氏病難以區分，但其在若干方面與克羅恩氏病不同。第一，其通常限於結腸，而克羅恩氏病可發生在整個消化道中。第二，潰瘍性結腸炎主要僅涉及腸表層之發炎，此與克羅恩氏病不同，在克羅恩氏病中發炎可一直滲透穿過腸壁或消化道之其他位置。最後，潰瘍性結腸炎通常涉及發炎之連續區域，而非克羅恩氏病之典型發炎之不連續位點。與克羅恩氏病相同，潰瘍性結腸炎主要發現於市區。而且，遺傳因素可能在潰瘍性結腸炎中起作用，此乃因病例存在家族聚集性。在潰瘍性結腸炎患者中比在克羅恩氏病患者中更常觀察到自體抗體。自體抗體通常針對結腸上皮細胞組份。最常見抗體係對過氧化氫酶、α-烯醇酶及乳鐵蛋白具專一性之抗嗜中性球細胞質抗體。在一些情形下，該等抗體與結腸微生物交叉反應。
在臨床試驗中，通常使用克羅恩氏病活動性指數(CDAI)對克羅恩氏病活動性進行評分。CDAI基於8個要素提供疾病活動性評分，該等要素包含(1)每天液狀或軟便之次數，(2)每天腹痛量之患者分級，(3)總體幸福感之患者分級，(4)其他症狀之患者報告，包含關 節炎、虹膜炎、眼色素層炎、結節性紅斑、壞疽性膿皮病、阿弗他口炎(ephthous stomatitis)、肛裂、瘻或膿腫、其他瘻或發熱，(5)服用止瀉寧(lomotil)或其他腹瀉用鴉片劑之患者報告，(6)腹塊，(7)血球比容，及(8)體重。例如，參見Best等人(1976),Gastroenterol.70：439-444，該文獻之相關部分以引用方式併入本文中。
潰瘍性結腸炎之症狀可變。其可包含腹瀉、裏急後重、腹絞痛、便中帶有血液及黏液、發熱及直腸出血。亦可出現毒性巨結腸，其係其中結腸膨大超過約6公分且可損失其肌緊張度及/或穿孔之潛在的危及生命之病況。可伴隨潰瘍性結腸炎之其他症狀包含外周關節炎、關節黏連性脊椎炎、薦腸骨關節炎、前眼色素層炎、結節性紅斑、壞疽性膿皮病、上鞏膜炎、自體免疫性肝炎、原發性硬化性膽道炎、硬化及兒童生長發育遲緩。
在一些實施例中，遭受發炎性腸病(IBD)(例如克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎)之患者可在使用現有IBD療法治療之前、之後或同時使用與BAFF及B7RP1結合之雙專一性蛋白質來治療。現有IBD治療劑包含例如柳氮磺吡啶、5-胺基柳酸及其衍生物(例如奧沙拉(olsalazine)、巴柳氮(balsalazide)及美沙拉(mesalamine))、抗TNF抗體(包含英夫利昔單抗、阿達木單抗、戈利木單抗及賽妥珠單抗)、用於口服或非經腸投與之皮質類固醇(包含潑尼松、甲基潑尼松、布地奈德(budesonide)或氫化可體松(hydrocortisone))、促腎上腺皮質激素、抗生素(包含甲硝唑(metronidazole)、環丙沙星(ciprofloxacin)或利福昔明(rifaximin))、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、胺甲喋呤、環孢素、他克莫司及沙立度胺。
編碼雙專一性蛋白質之核酸
本文提供編碼可抑制B7RP1介導之T細胞增殖及BAFF介導之B細胞增殖之雙專一性蛋白質之核酸。例如，SEQ ID NO：52編碼具有胺 基酸序列SEQ ID NO：14之VL區，且SEQ ID NO：53編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：15之VH區。類似地，SEQ ID NO：55及56分別編碼胺基酸序列SEQ ID NO：17及18，其係包括抗B7RP1抗體之融合至兩個BAFF結合肽之重鏈之多肽。SEQ ID NO：57編碼抗B7RP1抗體之輕鏈，其可係異源四聚雙專一性IgG抗體或雙專一性融合蛋白之一部分，如上文所闡述。涵蓋編碼本文所提供之任何胺基酸序列之任何核酸序列。類似地，相對於本文所揭示之序列包含沉默突變或編碼上文所闡述胺基酸序列變體之核苷酸序列變體亦包含在本發明範圍內。更特定而言，涵蓋編碼與本文所揭示胺基酸序列相差每100個胺基酸中不超過10個的單一胺基酸插入、缺失或取代之胺基酸序列之核苷酸序列。
編碼本文所闡述之雙專一性蛋白質之核酸序列可由熟習此項技術者基於本文所提供之胺基酸序列及業內知識來確定。除產生編碼具體胺基酸序列之經選殖DNA區段之更多傳統方法外，尤其諸如DNA 2.0(Menlo Park,CA,USA)及BlueHeron(Bothell,WA,USA)等公司現以常規方式產生任何期望序列之經化學合成、基因大小之DNA以供訂購，從而簡化產生該等DNA之製程。可調節密碼子之使用以最佳化所選系統之表現。
製備與BAFF及B7RP1結合之雙專一性蛋白質之方法
可將編碼本文所闡述之雙專一性蛋白質之核酸插入適用於其中將表現核酸之宿主細胞的載體中。可藉由業內熟知之任一方法將該等核酸引入宿主細胞中。可使用之宿主細胞尤其包含細菌，包含大腸桿菌(Escherichia coli)；酵母菌，包含釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或甲醇畢赤酵母(Pichia pastoris)；昆蟲細胞，包含草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞；植物細胞；及哺乳動物細胞，包含中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞、幼倉鼠腎(BHK)細 胞、猴腎細胞、HeLa細胞、人類肝細胞癌細胞及293細胞。該等宿主細胞可在將表現所引入核酸之條件下進行培養，且可自培養物上清液或細胞團回收雙專一性蛋白質。
通常，用於將核酸引入宿主細胞中之程序可端視欲引入核酸之宿主細胞而定。將核酸引入細菌中之方法為業內所熟知。例如，通常使用電穿孔或氯化鈣轉化。將核酸引入酵母菌中之方法亦為業內所熟知，且包含例如使用乙酸鋰及聚乙二醇之轉化方法。用於將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法為業內所熟知，且包含(但不限於)葡聚糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、聚凝胺(polybrene)介導之轉染、原生質體融合、電穿孔術、脂質體中聚核苷酸之囊封及向核中直接微注射DNA。
用於任一宿主細胞中之表現載體可含有為DNA複製、含有載體之宿主細胞選擇及外源核苷酸序列表現所必需之序列。該等序列通常可包含以下核苷酸序列中之一或多者：啟動子、一或多個增強子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體及受體剪接位點之完整內含子序列、編碼用於多肽分泌之前導序列的序列、核糖體結合位點、多腺苷酸化序列、用於插入編碼欲表現多肽之核酸之多連接體區域及選擇標記元件。適於在多種宿主細胞中表現之多種表現載體為業內已知且市面有售。
醫藥組合物、投用及投與方法
本發明提供包括本文所闡述之雙專一性蛋白質之醫藥組合物。該等組合物可包括治療有效量之雙專一性蛋白質與一或多種其他組份(例如生理學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑)。該等其他組份尤其可包含緩衝液、碳水化合物、多元醇、胺基酸、螯合劑、穩定劑及/或防腐劑。許多該等其他組份闡述於例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，(A.R.Gernaro編輯),1990, Mack Publishing公司中，該文獻之相關部分以引用方式併入本文中。
可調節本文所闡述之雙專一性蛋白質之投用以達成期望效應。在許多情形下，因所治療疾病之慢性性質而將需要重複投用。例如，如本文所闡述之雙專一性蛋白質可如下投用：每週2次、每週1次、每2週一次、每3週一次、每4週一次、每5週一次、每6週一次、每7週一次、每8週一次、每9週一次或每10週一次或每2個月一次、每3個月一次、每4個月一次、每5個月一次或每6個月一次。每天投與之所投與雙專一性蛋白質之量可為約0.0036mg至約700mg。另一選擇為，可根據患者之所估計皮膚表面來校準劑量，且每一劑量可為約0.002μg/m2至約350mg/m2。在另一替代中，可根據患者之體重來校準劑量，且每一劑量可為約0.000051mg/kg至約10.0mg/kg。
雙專一性蛋白質或含有該等分子之醫藥組合物可藉由任何可行方法來投與。包括蛋白質之治療劑通常將藉由非經腸途徑(例如藉由注射)來投與，此乃因在一些特殊調配物或環境不存在時，口服投與將導致蛋白質在胃酸環境下水解。皮下、肌內、靜脈內、動脈內、病灶內及腹膜濃注係可能的投與途徑。雙專一性蛋白質亦可經由輸注(例如靜脈內或皮下輸注)來投與。尤其對於涉及皮膚之疾病，亦可進行局部投與。另一選擇為，雙專一性蛋白質可經由與黏膜接觸來投與，例如藉由鼻內、舌下、陰道或直腸投與或以吸入劑形式投與。另一選擇為，包括雙專一性蛋白質之某些適宜醫藥組合物可口服投與。
鑒於上文已以一般術語闡述本發明，以下實例僅以說明性方式提供而無限制性。
實例 實例1：設計並測試BAFF/B7RP1雙專一性分子以供人類治療應用
此系列實驗之目標係發現具有以下性質之雙專一性分子：(1)抑制BAFF介導之B細胞增殖及B7RP1介導之T細胞增殖，(2)在生物分 析中具有高活性，及(3)具有有利的生物物理性質。針對結合人類BAFF與抗人類B7RP1 IgG抗體(抗huB7RP1)之肽融合的多種示意性設計圖解說明於圖1中。BAFF結合肽之序列提供於SEQ ID NO：1中，且抗huB7RP1之免疫球蛋白重鏈及輕鏈之序列分別提供於SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：19中。
為確定何種設計具有最佳生物物理性質同時保留生物活性，製備並測試圖1中所繪製之雙專一性分子。在一構築物中，將BAFF結合肽與間插連接體(「1K連接體」，具有胺基酸序列SEQ ID NO：24)之兩個串聯複本融合至抗huB7RP1之免疫球蛋白重鏈(P71617)或免疫球蛋白輕鏈(P71618)之N端。參見圖1。P71617重鏈之胺基酸序列提供於SEQ ID NO：26中，且P71617輕鏈之胺基酸序列與抗huB7RP1之免疫球蛋白輕鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：19)相同。P71618輕鏈之胺基酸序列提供於SEQ ID NO：27中，且P71618重鏈之胺基酸序列與抗huB7RP1之免疫球蛋白重鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：25)相同。亦使用上文所提及之1K連接體(具有胺基酸序列SEQ ID NO：24；P71619)或兩個BAFF結合肽間之5×(G4S)連接體(P71620)將BAFF結合肽之兩個串聯複本融合至抗huB7RP1免疫球蛋白重鏈(具有胺基酸序列SEQ ID NO：25)之C末端。該兩個融合構築物重鏈之胺基酸序列提供於SEQ ID NO：16(P71619)及SEQ ID NO：28(P71620)中。在構築物P71621中，將BAFF結合肽與間插1K連接體之兩個串聯複本插入介於胺基酸序列SEQ ID NO：25(抗huB7RP1抗體免疫球蛋白重鏈之胺基酸序列)之殘基358與359間之抗體之CH3結構域中。P71621構築物重鏈之序列提供於SEQ ID NO：29中。在構築物P71622中，將BAFF結合肽插入抗huB7RP1免疫球蛋白重鏈之CH3結構域(介於SEQ ID NO：25之殘基358與359之間)中，且將BAFF結合肽之第二複本融合至重鏈之C末端。 P71622重鏈之胺基酸序列提供於SEQ ID NO：30中。在構築物P71623 中，將一個BAFF結合肽插入CH2區(介於SEQ ID NO：25之殘基268與269之間)中，且將第二BAFF結合肽插入CH3區(介於SEQ ID NO：25之殘基358與359之間)中。SEQ ID NO：31係P71623重鏈之胺基酸序列。 構築物P71619-P71623皆具有抗huB7RP1之免疫球蛋白輕鏈(SEQ ID NO：19)。
在構築物P74293及P74294中，介於構築物P71619中BAFF結合肽之兩個串聯複本間之連接體經修飾。P74293及P74294重鏈之胺基酸序列分別提供於SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18中。該等構築物之免疫球蛋白輕鏈亦具有胺基酸序列SEQ ID NO：19。
如下製備編碼上述構築物之核酸。以合成方式產生編碼N端BAFF肽融合物(P71617及P71618)之N端部分(包含兩個BAFF結合肽複本加免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變區)之核酸。在適宜載體中，經由方便的限制性內切酶位點將該等核酸連接至編碼免疫球蛋白重鏈或輕鏈恆定區之核酸。皆以合成方式產生編碼重鏈恆定區C端融合物(P71619及P71620)、Fc環插入物(P71621及P71623)及Fc環插入物/C端融合物(P71622)之核酸，且經由方便的限制性內切酶位點連接至含有重鏈可變區之載體。
在瞬時轉染之293細胞及穩定轉染之CHO細胞中表現上述各種雙專一性構築物。純化融合蛋白且測試其生物活性。觀察到在該兩種不同類型之宿主細胞中產生之蛋白質無差別。
在BAFF介導之人類原代B細胞增殖分析中測試雙專一性分子之BAFF抑制活性。簡言之，使用陰性選擇使用來自Miltenyi Biotec(Auburn,CA)之人類B細胞套組II自外周血單核細胞(PBMC)純化人類B細胞。在96孔微量滴定板中在最小必需培養基(MEM)加10%熱滅活胎牛血清(FBS)中在50ng/ml人類BAFF蛋白、2μg/ml山羊F(ab’)2抗人類IgM(Jackson ImmunoResearch)及不同濃度之上述雙專一性蛋白質存 在下在37℃下在5% CO2中將約105個經純化B細胞培養48小時。使用抗BAFF肽體作為陽性對照(「αBAFF」，其係含有兩個多肽鏈之同源二聚體，每一多肽鏈包括兩個融合至Fc多肽之BAFF結合肽)。αBAFF分子詳細闡述於美國專利7,259,137中，且此同源二聚體之一個多肽鏈之胺基酸序列提供於SEQ ID NO：32中。美國專利7,259,137中闡述αBAFF之部分以引用方式併入本文中。藉由在最後18小時培育期間放射性3H-胸腺嘧啶之攝取來量測增殖。結果顯示於圖2A及圖2B中。
圖2A中之數據指示，兩個C端融合構築物(P71619及P71620)彼此在抑制BAFF介導之B細胞增殖方面相當，且比此實驗中所測試之所有其他融合構築物更有效。P71620因其往往聚集而無法進一步追蹤到，此係治療性蛋白質中高度不期望之性質。圖2B中之數據指示，P71619與上文所闡述此構築物之兩個稍作修飾形式(P74293及P74294)相當，且在抑制BAFF介導之B細胞增殖方面與陽性對照(αBAFF)相當。因此，在所測試之雙專一性構築物中，P71619、P71620、P74293及P74294在BAFF介導之B細胞增殖之此分析中具有相當活性及優於所測試之所有其他構築物之活性。
使用人類B7RP1-Fc介導之T細胞增殖分析來分析P71619、P74293及P74294之B7RP1抑制活性。使用來自Miltenyi Biotec(Auburn,CA)之Pan T細胞分離套組自健康人類供體之PBMC純化原代人類T細胞，且用板結合抗CD3(1μg/mL)抗體及B7RP1-Fc融合蛋白(3μg/mL)在不同濃度之上述雙專一性蛋白質或IgG2抗人類B7RP1抗體(在本文中稱為「αB7RP1」)存在下進行刺激。48小時後，將3H-胸腺嘧啶添加至細胞中，且在24小時後量測3H-胸腺嘧啶之納入。所測試之所有雙專一性抗體皆具有相似的IC50，其與αB7RP1之IC50相似(圖3)。因此，該等數據表明，BAFF結合肽至抗huB7RP1抗體之偶聯對抗體抑制B7RP1活性之能力具有很小或無效應。
藉由動態棄除分析(KinExA®；Sapidyne Instruments,Boise,Idaho)量測異源二聚雙專一性抗體P74293及P74294對BAFF及B7RP1之結合親和力。兩種抗體對人類BAFF(具有約30pM之Kd)及對人類B7RP1(具有約40pM之Kd)皆具有高結合親和力。參見下表2。此外，該等雙專一性蛋白質中之兩者具有與人類BAFF相似之對食蟹猴BAFF之結合親和力及與人類B7RP1相似之對食蟹猴B7RP1之結合親和力。
為進一步評價P74293在使用人類細胞之活體外系統中之活性，在多種測試分子存在下評價藉由葡萄球菌腸毒素B(SEB)活化之人類扁桃腺細胞之細胞介素產生。簡言之，自組織分離人類扁桃腺細胞且在以下分子中之一者存在下使用SEB(1μg/mL)進行刺激：(1)αB7RP1，(2)P74293，(3)CTLA4-Ig(陽性對照)，或(4)人類IgG(陰性對照)。培養72小時後，收集細胞上清液，且根據製造商之說明書 使用來自Meso Scale Discovery之套組分析細胞介素含量。結果顯示於圖4中。
所有三個αB7RP1、P74293及CTLA4-Ig(在圖4之所有圖中分別為條1、2及3)皆抑制IL-17、IL-10、IL-4及IFNγ之釋放。IL-2之釋放僅受CTLA4-Ig之抑制。因此，αB7RP1及抗BAFF/B7RP1雙專一性P74293對藉助SEB活化之人類扁桃腺細胞之細胞介素分泌具有相當及專一性效應。
檢查三種異源二聚體雙專一性蛋白質(即P71619、P74293及P74294)之其他性質。來自產生該等蛋白質之宿主細胞培養物之蛋白質滴定指示，P74293及P74294係以P71619產生量的約兩倍產生。在40℃下儲存兩週後，P74293及P74294亦比P71619更穩定，如藉由粒徑排阻層析(SEC)所評價。P74293在儲存開始時及儲存4週後形成澄清溶液，而含有P74394之溶液在所有時間點下皆渾濁。P74293及P74294溶液之黏性小於P71619之溶液。因此，P74293及P74294係以高於P71619之量表現，且在所測試濃度範圍內亦比P71619更穩定且黏度更小。該等分子間之最明顯差別在於介於兩個BAFF結合肽間之連接體。該等數據表明，P74293及P74294中之連接體(SEQ ID NO：6及7)可賦予該等分子經改良之性質。
評估小鼠中所述雙專一性分子之藥物代謝動力學性質。給予雄性CD-1小鼠雙專一性融合蛋白P71617、P71619、P71621、P71622、P74293或P74294之單一靜脈內(IV)劑量(5mg/kg)。在投用前及投用後0.5、2、8、24、48、72、96、168、240、336、408、504小時時收集血清樣品。藉由兩種ELISA方法測定血清中雙專一性分子之濃度，一種方法記錄Fc部分之存在且一種方法記錄Fc部分及BAFF結合肽部分二者之存在。對於Fc部分量測，使用生物素化抗Fc抗體作為捕獲試劑，且使用ALEXA FLUOR® 647標記之抗Fc抗體作為檢測試劑。為檢 測雙專一性蛋白質之BAFF結合部分及Fc部分，使用生物素化BAFF蛋白作為捕獲試劑，且使用ALEXA FLUOR® 647標記之抗Fc抗體作為檢測試劑。在小鼠中，具有融合至重鏈之N端(P71617)、C端(P71619、P74293及P74294)或CH3結構域(P71621)之BAFF結合肽之兩個串聯複本的雙專一性蛋白質具有極相似之PK曲線。圖5。與其他雙專一性蛋白質相比，一個BAFF結合肽複本插入CH3結構域中且另一複本融合至重鏈C末端之雙專一性蛋白質(P71622)具有較低暴露。圖5。此外，兩種不同ELISA分析產生相似的雙專一性蛋白質血清濃度，此表明雙專一性蛋白質在活體內未發生顯著裂解。
亦藉由食蟹猴中之單一劑量研究來評價P74293及P74294異源二聚雙專一性抗體之藥物代謝動力學及藥物效應動力學參數。以P74293之靜脈內或皮下劑量(10mg/kg)或P74294之單一皮下劑量(10mg/kg)給予原初雄性食蟹猴(n=4)單一濃注。兩個雙專一性分子皆具有與IgG抗體相似之PK曲線。對P74293及P74294以及對抗huB7RP1觀察到之藥物代謝動力學參數報告於下表3中。
表3中之數據指示，P74293及P75294之藥物代謝動力學參數彼此相當且與抗huB7RP1抗體之彼等相當。
實例2：設計並測試鼠類雙專一性替代分子
為實施小鼠中之臨床前研究，構築可與鼠類B7RP1及鼠類BAFF結合之鼠類替代雙專一性分子(下文稱為「鼠類替代物」)。用於構築實例1中所闡述雙專一性構築物之抗huB7RP1抗體並不與鼠類B7RP1結合，而用於該等構築物中之BAFF結合肽確實與人類及鼠類BAFF二者結合。數據未顯示。鼠類替代物包括拮抗性IgG抗鼠類B7RP1抗體(在本文中稱為「抗mB7RP1」)，其係小鼠免疫球蛋白恆定區與大鼠抗鼠類B7RP1免疫球蛋白可變區之嵌合體。抗mB7RP1之應用闡述於Hu等人(2009),J.Immunol.182：1421中，其中其稱為1B7-V2。鼠類替代物具有兩個經由短連接體(長度為5個胺基酸)融合至抗mB7RP1免疫球蛋白重鏈C端之BAFF結合肽(SEQ ID NO：1)複本。兩個BAFF結合肽複本係由長度為23個胺基酸之另一連接體分離開。使用重疊PCR製備編碼鼠類替代物重鏈之核酸以將編碼αBAFF之BAFF結合部分之核酸連接至編碼1B7-V2(即抗mB7RP1)重鏈的核酸之下游端。
在BAFF介導之B細胞增殖分析中評估鼠類替代物對BAFF之抑制。根據製造商之說明書(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)藉由利用MACS CD43(ly-48)微球進行陰性選擇自C57BL/6脾分離小鼠B淋巴 球，或使用B細胞分離套組(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)自PBMC分離。使用0.1μg/ml抗IgM及200ng/ml BAFF在不同濃度之鼠類替代物或αBAFF存在下刺激經純化B細胞。在第4天時藉由3H-胸腺嘧啶納入來量測B細胞增殖。鼠類替代物及αBAFF之IC50分別為0.59nM及0.73nM。參見圖6A。因此，鼠類替代物可有效地抑制BAFF，且效能與αBAFF相當。
為量測鼠類替代物對B7RP1與其受體結合之抑制，首先藉由將其在包覆有抗CD3(5μg/ml)抗體之微量滴定孔中培育24小時來活化小鼠脾細胞以增強其B7RP1受體之表現。用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌經活化脾細胞，且然後在不同濃度之鼠類替代物存在下在4℃下與5μg/ml生物素化之muB7RP1：Fc一起培育30分鐘。將細胞洗滌，且然後用別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)偶聯之抗小鼠CD3抗體及抗生蛋白鏈菌素-藻紅素(抗生蛋白鏈菌素-PE)再染色20分鐘。藉由流式細胞術分析B7RP1-Fc與T細胞之結合。鼠類替代物及抗mB7RP1之IC50分別為4.01pM及2.8pM。參見圖6B。因此，在此分析中，鼠類替代物之活性與抗mB7RP1相似。因此，鼠類替代物抑制BAFF及B7RP1二者。
在經綿羊紅血球(SRBC)免疫之小鼠中評估鼠類替代物之活體內藥物效應動力學效應。簡言之，在第0天時使BALB/c小鼠(8週齡)接受初次免疫，且在第28天時使用於0.2ml PBS中之2×108個SRBC經由腹膜內注射進行加強免疫。自第0天至第33天使用以下分子中之一者以5mg/kg每週兩次治療小鼠(對於每一分子n=5)：鼠類替代物；αBAFF；抗mB7RP1；或鼠類IgG1。將經SRBC治療但未接受另一治療之小鼠用作陽性對照。在第34天時殺死小鼠，且收集血清及脾。
為量測脾中B細胞及記憶T細胞之比例，經由細胞濾器研磨脾組織來收穫脾細胞。將脾細胞與未經標記之抗CD16/32一起預培育以阻 斷抗體與Fc γ受體(FcγR)之非專一性結合。藉由用PE標記之抗B220(其在B細胞上表現)染色來測定B細胞之比例。藉由用FITC偶聯之抗CD44、PE偶聯之抗CD62L、APC偶聯之抗CD4及PerCP偶聯之抗CD3染色來測定記憶T細胞(CD44 hi CD62L lo CD4 T細胞)之比例。所有染色抗體皆購自BD Bioscience(San Diego,CA)。對於B細胞及T細胞二者之測定，使用FACSCALIBURTM(BD Bioscience,San Jose,CA)流式細胞儀來實施流式細胞術，且使用用於分析流式細胞術數據之FLOWJO®(TreeStar公司，Ashland,OR)軟體來分析數據。結果顯示於圖7中。
為量測血清中抗SRBC抗體之含量，在室溫下將包覆有10μg/ml可溶性SRBC抗原之微量滴定板與來自所治療小鼠之經稀釋血清一起培育兩小時。使用HRP偶聯之多株山羊抗小鼠IgG及IgM抗體(Southern Biotech,Birmingham,AL)檢測來自血清之專一性結合SRBC之Ig。根據製造商之說明書使用SUREBLUETM TMB微孔過氧化物酶受質(KPL,Gaithersburg,MD)實施受質反應，且使用Spectrum Max微量板讀取器(Molecular Devices)來讀取光學密度。作為陽性對照，將來自未經任何治療之SRBC免疫小鼠之血清混合物之連續稀釋物添加至每一板中，且自該等孔之讀數構築標準曲線。其他樣品之抗SRBC抗體之含量以佔此陽性對照之百分比報告於圖7中。
與在經鼠類IgG1治療之小鼠中觀察到之百分比相比，在經鼠類替代物治療之小鼠中為B細胞之脾細胞的百分比減小。圖7(頂圖)。在經αBAFF或αBAFF加抗mB7RP1治療之小鼠中觀察到相似的減小，但在僅經抗mB7RP1治療之小鼠中未觀察到減小。圖7(頂圖)。對於記憶T細胞，與在經muIgG1治療之小鼠中所觀察到之記憶T細胞的比例相比，經鼠類替代物、抗mB7RP1或抗mB7RP1加αBAFF治療之小鼠已使記憶T細胞之比例減小。圖7(中圖)。相比之下，使用αBAFF治療 與使用muIgG治療所觀察到相比並不改變脾中之記憶T細胞群。圖7(中圖)。鼠類替代物亦顯示血清中抗SRBC抗體含量之有效減少，此與使用抗mB7RP1或抗mB7RP1加αBAFF治療後所觀察到或在未注射SRBC之小鼠中所觀察到之抗體含量相似。圖7(底圖)。與使用mIgG1治療所觀察到之含量相比，在僅經αBAFF治療之小鼠中觀察到抗SRBC抗體含量之中等抑制。圖7(底圖)。該等數據指示，鼠類替代物在小鼠活體內在B細胞及T細胞區室中具有雙重抑制效應。
在NZB/W F1狼瘡模型中使用每一經測試分子之兩個不同劑量值評估鼠類替代物對疾病之影響。使用以下投用方案中之每一者每週兩次藉由腹膜內注射18週來治療雌性NZB/W F1小鼠(4.5個月大，n=20)：5mg/kg或15mg/kg鼠類替代物(MW160KDa)；4.68mg/kg或14mg/kg抗mB7RP1(MW150KDa)；1.88mg/kg或5.6mg/kg αBAFF(MW64KDa)；αBAFF(1.88mg/kg或5.6mg/kg)與抗mB7RP1(4.68mg/kg或14mg/kg)之組合；鼠類IgG1(15mg/kg；同種型對照)；或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(陰性對照)。在5個月大時開始使用ALBUSTIX®(Bayer,Elkhart,IN)每兩週一次量測尿中之蛋白尿。蛋白尿之發病率表示為在兩次連續量測中尿蛋白質之濃度為至少300mg/dl之小鼠的百分比。藉由ELISA量測血清抗dsDNA IgG含量。藉由檢查8種不同病灶之腎臟組織樣品對所有小鼠之腎臟疾病進行評分，該8種不同病灶即腎小球微血管增殖、系膜細胞增生、系膜基質增多、腎小球叢黏附、頂骨上皮增生、間質性腎炎、管狀膨大/蛋白管型及管狀萎縮/間質性纖維化。對每一類型之病灶給出0至5之嚴重程度評分，最大可能評分為32。將每組小鼠之評分平均化。監測存活率。
在12個月大時，經任一劑量值之鼠類替代物治療之小鼠皆未發生蛋白尿。相比之下，經兩個所測試劑量值之鼠類IgG1或PBS治療之100%小鼠展現蛋白尿。圖8A及圖9B。經較低劑量值之抗mB7RP1及 αBAFF治療之分別為約60%及35%的小鼠以及經較高劑量值之抗mB7RP1及αBAFF治療之分別為約50%及25%的小鼠發生蛋白尿。圖8A及圖9B。此外，與經muIgG1治療之陰性對照相比，兩個劑量值之鼠類替代物治療使得抗dsDNA IgG之血清含量顯著減小。圖8B及圖9A。與mIgG及PBS對照組相比，雙專一性治療亦顯著改良存活率。數據未顯示。然而，在實驗終止時在雙專一性對單一藥劑治療之間觀察到存活率無明顯差別。
收集所有經治療小鼠(包含在研究結束之前死亡之小鼠)之腎臟以對腎臟疾病之嚴重程度進行組織學評分。與經mIgG1治療之對照組相比，經αBAFF、αBAFF加抗mB7RP1之組合或鼠類替代物治療之小鼠組具有顯著較低之腎臟疾病評分。圖10。與單一藥劑治療組相比，經雙專一性替代物或組合治療之組亦顯示腎臟病理學減少之趨勢，此結果與上述蛋白尿結果高度相關。比較圖10與圖8A及圖9B。總之，在NZB/W F1狼瘡模型中，鼠類替代物或αBAFF加抗mB7RP1之組合治療對BAFF及B7RP1之雙重抑制在預防疾病發作及進展方面比僅BAFF(αBAFF)或僅B7RP1(抗mB7RP1)抑制更有效。
為確定BAFF及B7RP1二者之抑制是否可有效地抑制鼠類膠原誘導之關節炎之症狀，進行以下實驗。在第0天時使用於2×完全弗氏佐劑(Complete Freund’s adjuvant，CFA)中乳化之100μg II型牛膠原對雄性DBA小鼠實施免疫，且在第21天時使用於不完全弗氏佐劑(IFA)中之II型牛膠原實施加強免疫。自第0天開始在41週的研究過程期間使用測試物質中之一者每週兩次治療小鼠。評價在每一時間點下每組中展現關節炎症狀之小鼠的百分比及每組之平均關節炎評分。藉由檢查每一肢體且對每一肢體指配0-3之評分來確定關節炎評分，且較高評分對應更腫脹及/或發炎肢體。因此，最大關節炎總評分為12。若小鼠之任何肢體具有至少1之關節炎評分，則將其視為患有關節炎。 結果顯示於圖11中。該等數據指示，αBAFF與抗mB7RP1之組合(藉由實線連接之經填充圓形)在阻抑關節炎症狀方面比單獨αBAFF(藉由實線連接之開口圓形)或抗mB7RP1(藉由虛線連接之經填充圓形)有效的多。經mIgG(藉由實線連接之經填充正方形)或PBS(藉由虛線連接之經填充正方形)治療之陰性對照組具有最高的關節炎發病率%及最高的關節炎評分。該等結果表明，與僅抑制該等途徑中之一者相反，抑制BAFF及B7RP1二者可係自體免疫及/或發炎性關節炎病況(例如類風濕性關節炎)之有效治療。
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> DNA
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<221> source
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 72

Claims (35)

  1. 一種雙專一性蛋白質，其包含：一或多種抑制BAFF介導之人類B細胞增殖的肽，以及抑制B7RP1介導之人類T細胞增殖的抗體，其中該抗體包含：含有胺基酸序列SEQ ID NO：8(RASQGISNWLA)的輕鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：9(AASSLQS)的輕鏈CDR2、含有胺基酸序列SEQ ID NO：10(QQYDSYPRT)的輕鏈CDR3、含有胺基酸序列SEQ ID NO：11(SYWMS)的重鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：12(YIKQDGNEKYYVDSVKG)的重鏈CDR2以及含有胺基酸序列SEQ ID NO：13(EGILWFGDLPTF)的重鏈CDR3，其中該抗體包含多肽，該多肽包含具有下式之胺基酸序列：A-L1-P-L2-P，其中A係IgG抗體之免疫球蛋白重鏈，L1係不存在或長度為3至40個胺基酸之第一連接體，P係長度為10至40個胺基酸之BAFF結合肽，且L2係不存在或長度為5至50個胺基酸之肽連接體。
  2. 如請求項1之雙專一性蛋白質，其中該免疫球蛋白重鏈在其緊鄰L1上游之C末端處丟失離胺酸。
  3. 如請求項1之雙專一性蛋白質，其中該IgG抗體係人類或人類化抗B7RP1 IgG1抗體。
  4. 如請求項1之雙專一性蛋白質，其中該抑制B7RP1介導之人類T細胞增殖的抗體係人類或人類化IgG2抗體。
  5. 如請求項1之雙專一性蛋白質，其中該抑制B7RP1介導之人類T細胞增殖的抗體係人類或人類化IgG4抗體。
  6. 如請求項1之雙專一性蛋白質，其中P具有胺基酸序列SEQ ID NO：1(LPGCKWDLLIKQWVCDPL)。
  7. 如請求項1之雙專一性蛋白質，其中L1具有胺基酸序列SEQ ID NO：40(GGGGG)。
  8. 如請求項1之雙專一性蛋白質，其中該L2具有胺基酸序列SEQ ID NO：5。
  9. 如請求項8之雙專一性蛋白質，其中L2具有胺基酸序列SEQ ID NO：7。
  10. 如請求項8之雙專一性蛋白質，其中L2具有胺基酸序列SEQ ID NO：6。
  11. 如請求項1之雙專一性蛋白質，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：14之免疫球蛋白輕鏈可變區。
  12. 如請求項1之雙專一性蛋白質，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：15之免疫球蛋白重鏈可變區。
  13. 如請求項1之雙專一性蛋白質，其包括免疫球蛋白輕鏈，其中該免疫球蛋白輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：19。
  14. 如請求項1之雙專一性蛋白質，其中該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：17或18。
  15. 一種雙專一性蛋白質，其包括(a)多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18，及(b)另一多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：19。
  16. 如請求項15之雙專一性蛋白質，其係包括兩分子(a)之該多肽及兩分子(b)之該多肽之四聚體。
  17. 如請求項15或16之雙專一性蛋白質，其中(a)之該多肽包括胺基酸序列SEQ ID NO：17。
  18. 如請求項15或16之雙專一性蛋白質，其中(b)之該多肽包括胺基 酸序列SEQ ID NO：18。
  19. 一種蛋白質，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7之連接體。
  20. 如請求項19之蛋白質，其中該蛋白質可抑制BAFF介導之人類B細胞增殖，且其中該蛋白質可抑制B7RP1介導之人類T細胞增殖。
  21. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至18中任一項之雙專一性蛋白質或如請求項19或20之蛋白質及生理學上可接受之賦形劑。
  22. 一種核酸，其編碼如請求項1至18中任一項之雙專一性蛋白質或如請求項19或20之蛋白質。
  23. 一種載體，其包含如請求項22之核酸。
  24. 一種宿主細胞，其含有如請求項22之核酸及/或如請求項23之載體。
  25. 一種製備雙專一性蛋白質之方法，其包括在表現核酸之條件下培養如請求項24之宿主細胞，及自細胞團或培養基回收該蛋白質。
  26. 如請求項25之方法，其中該宿主細胞為哺乳動物細胞。
  27. 如請求項26之方法，其中該宿主細胞為CHO細胞。
  28. 如請求項25之方法，其中該宿主細胞為大腸桿菌(Eschericha coli)細胞。
  29. 一種如請求項1至18中任一項之雙專一性蛋白質、如請求項19或20之蛋白質或如請求項21之醫藥組合物之用途，其用於製造用來治療全身性紅斑狼瘡之藥劑。
  30. 如請求項29之用途，其中在該雙專一性蛋白質之前、之後或同時向患者投與另一 治療劑，且其中該另一治療劑係皮質類固醇、抗瘧疾藥、視黃酸、NSAID、環磷醯胺、去氫表雄固酮、麥考酚酸嗎乙酯(mycophenolate mofetil)、硫唑嘌呤(azathioprine)、瘤克寧錠(chlorambucil)、胺甲喋呤、他克莫司(tacrolimus)、二胺苯碸(dapsone)、沙立度胺(thalidomide)、來氟米特(leflunomide)或環孢素。
  31. 如請求項30之用途，其中另一治療劑係麥考酚酸嗎乙酯、皮質類固醇、抗瘧疾藥、胺甲喋呤或硫唑嘌呤。
  32. 一種如請求項1至18中任一項之雙專一性蛋白質、如請求項19或20之蛋白質或如請求項21之醫藥組合物之用途，其用於製造用來治療患有選自由以下組成之群之疾病之患者的藥劑：ANCA陽性血管炎、類風濕性關節炎(RA)、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、乳糜瀉、天皰瘡、天皰瘡樣病、亞急性皮膚型紅斑狼瘡(SCLE)、多發性硬化、慢性脫髓鞘多發性神經炎(CIDP)、重症肌無力、古德巴斯德症候群(Goodpasture’s syndrome)、腎小球腎炎、自體免疫溶血性貧血(AIHA)、特發性血小板減少性紫斑症(ITP)、慢性活動性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、休格倫氏症候群(Sjogren’s syndrome)、全身性硬化、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、格雷氏病(Graves’ disease)、愛迪生病(Addison’s disease)及多發性內分泌瘤(MEN)。
  33. 一種如請求項1至18中任一項之雙專一性蛋白質或如請求項19或20之蛋白質之用途，其用作藥劑。
  34. 一種用於治療全身性紅斑狼瘡之醫藥組合物，其包含如請求項1至18中任一項之雙專一性蛋白質或如請求項19或20之蛋白質。
  35. 一種用於治療狼瘡性腎炎之醫藥組合物，其包含如請求項1至18中任一項之雙專一性蛋白質或如請求項19或20之蛋白質。
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