JP2022541900A - Hiv結合剤 - Google Patents
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Abstract
本開示は、HIVに特異的なLN02M結合剤、並びにそれを使用してHIV感染及び/又はAIDSを治療、予防、及び/又は改善するための方法に関する。幾つかの実施態様では、本開示は、図6Aから6Eに示される可変領域;図7Aから7D及び/又は図8Aから8Fのいずれかの突然変異体のアミノ酸配列、並びにそれらのいずれかの有効な(例えば、HIVの中和)組合せ;配列番号3~92、95~233、248~482、又は491~699のいずれか1つ以上;及び/又はそれらの組合せを含む、(一又は複数の)結合剤を提供する。
Description
本願は、その各々の全体が本開示に組み込まれる、2019年7月15日出願の米国仮特許出願第62/874,042号、及び2019年7月15日出願の米国仮特許出願第62/874,057号に対する優先権を主張する。
本開示は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に特異的な結合剤、それらの製造方法、並びにHIV感染を治療及び/又は予防するためにそれらを使用する方法に関する。
HIVの流行は30年以上に及んでおり、HIVの病因の理解及び強力かつ安全な抗ウイルス薬の開発に大きな進歩が成し遂げられている。30を超える抗ウイルス薬が登録されており、罹患率及び死亡率の両方に対する併用抗レトロウイルス療法(ART)の影響は顕著である。しかしながら、ARTを最適に順守している患者ではHIVの複製が長期的に抑制されているにもかかわらず、HIVは治療の中断後に必ず逆戻りする。さらには、治療が成功しても、ARTの不存在下でHIV複製を制御することができるウイルス特異的免疫応答の回復/発達は誘発されない、又は可能にならない。したがって、HIVに感染した対象の大多数には、HIVの複製及び関連する疾患を制御するために、生涯にわたってARTが必要である。
過去に多くの免疫学的介入が研究されており、現在、持続的な抗ウイルス療法なしにウイルスの複製が抑制されるというHIVの機能的治癒を達成することを目的として、さらなる開発が行われている。治療的ワクチン戦略は、研究した主要な介入戦略であったが、結果は、CMVをベースとしたベクターHIVワクチン(NHPモデルで50%の有効性)を除き、実験動物モデル及び患者においてささやかな有効性を示した。最近の研究は、HIV感染の治療薬として抗エンベロープの広域中和抗体(bNabs)を使用する可能性について興味深い結果をもたらした。
当技術分野では、HIVを標的としたさらなる試薬、中和抗体、及びそれらを使用する方法が必要とされている。本開示は、HIV、並びにそれに感染した及び/又はその宿主となる細胞及び/又は組織を標的として使用することができる試薬及び方法を提供することによって、これらのニーズに対処するものである。
本開示は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に特異的な結合剤、このような結合剤を製造する方法、並びにHIV感染を治療、予防、及び/又は改善するためにこのような結合剤を使用する方法に関する。幾つかの実施態様では、本開示は、図6Aから6Eに示される可変領域;図7Aから7D及び/又は図8Aから8Fのいずれかの突然変異体のアミノ酸配列、及びそれらのいずれかの有効な(例えば、HIVの中和)組合せ;配列番号3~92、95~233、248~482、又は491~699のいずれか1つ以上、及びそれらのいずれかの有効な(例えば、HIVの中和)組合せ;表9に示される軽鎖と重鎖との組合せ(すなわち、ML085、Mx152、MX067、MX129、MX130、ML126、Mx175、Mx176、及びMx181);表10Aから10C、表11、表12Aから12D、表13Aから13D、又は表14に示される軽鎖と重鎖との組合せ;並びに、それらの変異体を含む、(一又は複数の)結合剤を提供する。試薬及びそれを製造及び/又は使用する方法もまた、開示される。本開示から当業者には明らかであるように、他の実施態様も企図されている。
以下に、添付の図面について簡単に説明する。これらの図面は、本発明をより詳細に説明することが意図されている。しかしながら、それらは、いかなる方法でも本発明の主題を限定することを意図するものではない。
本開示は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対して結合親和性を有する結合剤に関する。幾つかの実施態様では、結合剤は、ウイルス粒子自体、又はインビトロ及び/又はインビボでの細胞表面において、HIV抗原に結合することができる。結合剤はまた、典型的にはインビトロで、単離されたHIV抗原及び/又はそれらの断片及び/又は誘導体に結合することもできる。このような結合剤を使用して、HIVに関連する1つ以上の疾患を診断、治療、予防、及び/又は改善する方法も提供される。例えば、結合剤は、HIVのエピトープ又はそのポリペプチドと反応及び/又は結合することができる抗体(例えば、モノクローナル抗体)でありうる。結合剤は、後天性免疫不全症候群(AIDS)など、HIVによって引き起こされる疾患の治療に有用でありうる。幾つかの実施態様では、本明細書に記載される結合剤は、HIV、及び/又はHIVを含む(例えば、複製能力のあるHIV)及び/又はそのタンパク質を発現するHIV感染細胞を、選択的に標的化及び/又は排除することができる。幾つかの実施態様では、このような細胞は、複製能力のあるHIVの貯蔵庫でありうる。幾つかの実施態様では、例えば、異なる特異性(例えば、異なるエピトープを認識する)を有する結合剤は、感染、複製、及び/又は他の細胞への拡散などのHIV活性に結合させることができる。幾つかの実施態様では、本明細書に記載される結合剤はまた、HIV又はHIV発現細胞の選択的排除及び/又は抑制も提供することができる。幾つかの実施態様では、本明細書に記載される結合剤を使用して、例えばHIV感染及び/又はAIDSを治療するために、HIV及び/又はHIV発現細胞を抑制及び/又は排除することができる。他の実施態様、使用法などが以下に説明される。
結合剤は、モノクローナル抗体などの抗体でありうる。本明細書の実施例に示されるように、以下に説明する技法は、本明細書(例えば、図1及び図6A~E)並びに他の箇所に記載されている特定のアミノ酸配列及び特性を有する、「LN02」と呼ばれる完全ヒトmAbを特定するために使用されている。LN02結合剤の変異体(改変LN02結合剤(「LN02M」))が、本明細書に説明され、実施例に示されている。組換え分子生物学技法を使用して、LN02M結合剤を調製した。幾つかの実施態様では、LN02M結合剤は、その可変性及び/又は相補性決定領域(「CDR」)に対応するアミノ酸配列及び/又は核酸配列を参照することによって説明される。CDRは、Kabat、Chothia、Kabat及びChothiaの両方の蓄積、AbM、接触、及び/又はコンホメーション定義、若しくは当技術分野でよく知られているCDRを決定する任意の方法、抗体モデリングソフトウェア(現在はAccelrys(登録商標))、又はMacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745に記載されている抗原接触の観察に基づいたCDRの「接触定義」に従って同定された可変領域内にアミノ酸配列を含むことが当技術分野で知られている。CDRの「コンホメーション定義」では、CDRの位置は、抗原結合に対しエンタルピー的に寄与する残基として識別することができる(Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166)。さらに他のCDRの境界定義は、上記のアプローチの1つに厳密には従わない場合があるが、それでもなお、KabatのCDRの少なくとも一部と重複しうる。ただし、特定の残基又は残基群、あるいはCDR全体でさえ抗原結合に有意な影響を与えないという予測又は実験的発見に照らせば、それらは短縮又は延長される可能性がある。本明細書で用いられる場合、CDRは、手法の組合せを含む、当技術分野で知られている任意の手法によって定義されるCDRを指しうる。本明細書で用いられる方法では、これらの手法のいずれかに従って定義されたCDRが利用されうる。複数のCDRを含む任意の所与の実施態様では、CDRは、Kabat、Chothia、拡張、AbM、接触、及び/又はコンホメーションの定義のいずれかに従って定義されうる。一実施態様では、当業者は、例えば、図1に示され(例えば、配列番号234及び235;配列番号1及び93も参照)、以下で論じられるものを参照することにより、本開示からLN02M結合剤のCDRの意味及び特徴(アミノ酸配列を含む)を理解するであろう。
LN02M結合剤(例えば、抗体)の3つの重鎖CDR(CDRH1、CDRH2、CDRH3)、3つの軽鎖CDR(CDRL1、CDRL2、CDRL3)、VH及びVLドメインの例示的かつ好ましいアミノ酸配列が、以下及び図1に要約されている。特定の例、及び幾つかの実施態様では、好ましいLN02M結合剤、及び/又はその一部が、配列番号3~92、配列番号95~233、及び図6A~Eに記載されている。例示的なLN02M結合剤の機能的表現型(例えば、特定の活性)は、表1~3、並びに図2~5、及び下記の実施例のセクションにも記載されている。幾つかの実施態様では、LN02M結合剤は、図1及び/又は図6A~E及び/又は配列番号3~92、及び/又は配列番号95~233、及び/又は配列番号248~482、及び/又は配列番号491~699に記載されるCDRの1つ以上を含む抗体、及び/又は表1~3及び/又は表1~14のいずれかに記載されるもの、及び/又は図2~5及び/又は図9に示されているような機能的表現型を有する抗体である。幾つかの好ましい実施態様では、LN02M結合剤は、図1に示されるCDRの1つ以上、例えば、配列番号3~92、及び/又は配列番号95~233のいずれか1つ以上、及び表1~3並びに図2~5に記載される機能的表現型を含む。幾つかの好ましい実施態様では、LN02M結合剤は、配列番号3~92、配列番号95~233、配列番号248~482、及び/又は配列番号491~699、及び/又は図6A~E、図7A~E、図8A~Fに示されるポリペプチド配列、並びに表1~3及び/又は表7~14、及び/又は図2~5及び/又は図9のいずれかに記載される機能的表現型のうちの1つ以上を含む。
幾つかの実施態様では、LN02M結合剤は、図1に示されるLN02_VHアミノ酸配列(配列番号234)のアミノ酸26~35に対応し、かつY1、G2、S3、I4、S5、R6、H7、F8、W9、及びG10として左から右に番号を付した、修飾されたLN02 CDRH1(YGSISRHFWG)を含み、これは、次の置換のすべて、又は幾つかの実施態様ではそれらの1つ以上の保存的変異体を含みうる:W、D、H、又はRによるY1;W、Y、T、又はQによるS3;W、T、Y、M、又はAによるS5;W、K、Y、E、又はQによるR6;W、Y、Q、N、D、E、A、T、又はSによるH7;W又はYによるF8;及び/又はFによるW9の置換。野生型LN02と比較したHIV中和効力(すなわち、1.4倍を超える増加(例えば、図1))に基づいて選択された、LN02 CDRH1(YGSISRHFWG)に対する特に好ましい置換は、S3からY又はTへの;S5からTへの;及び/又は、H7からDへの置換である。
幾つかの実施態様では、LN02M結合剤は、図1に示されるLN02_VHアミノ酸配列(配列番号234)のアミノ酸50~64に対応し、かつH1、M2、H3、H4、L5、G6、V7、K8、Y9、V10、N11、P12、S13、L14、及びK15として左から右に番号を付した、修飾されたLN02 CDRH2(HMHHLGVKYVNPSLK)を含み、これは、次の置換のすべて、又は幾つかの実施態様ではそれらの1つ以上の保存的変異体を含みうる:Y、Q、又はTによるH1;W、I、F、又はRによるM2;Y、Q、又はTによるH3;Y、Q、又はTによるH4;W、F、R、E、Y、V、又はAによるL5;DによるG6;W、T、F、Y、又はHによるV7;W、D、E、又はRによるK8;D、Q、H、I、又はEによるY9;S、M、T、又はAによるV10;FによるN11;GによるP12;TによるS13;W、F、又はVによるL14;及び/又は、D、E、又はHによるK15の置換。野生型LN02と比較したHIV中和効力(すなわち、1.4倍を超える増加(例えば、図1))に基づいて選択された、LN02 CDRH2(HMHHLGVKYVNPSLK)に対する特に好ましい置換は、F又はRによるM2;Q又はTによるH4;F又はYによるV7;D、Q、又はEによるY9;及び/又はF又はVによるL14の置換である。
幾つかの実施態様では、LN02M結合剤は、図1に示されるLN02M_VHアミノ酸配列(配列番号234)のアミノ酸96~112に対応し、かつV1、R2、M3、G4、A5、R6、M7、S8、D9、I10、A11、F12、F13、S14、F15、G16、及びD17として左から右に番号を付した、修飾されたLN02 CDRH3(VRMGARMSDIAFFSFGD)を含み、これは、次の置換のすべて、又は幾つかの実施態様ではそれらの1つ以上の保存的変異体を含みうる:AによるV1;I又はYによるM3;T、S、又はYによるA5;WによるR6;W、A、V、又はYによるM7;W、A、Y、T、H、D、V、又はQによるS8;W、E、又はRによるD9;W、V、又はYによるI10;Q、W、Y、又はHによるA11;W、Y、H、又はMによるF12;YによるF13;A、T、又はYによるS14;W又はYによるF15;D又はSによるG16;及び/又は、EによるD17の置換。野生型LN02と比較したHIV中和効力(すなわち、1.4倍を超える増加(例えば、図1))に基づいて選択された、LN02 CDRH3(VRMGARMSDIAFFSFGD)に対する特に好ましい置換は、SによるA5;W又はYによるM7;W、A、Y、又はTによるS8;QによるA11;WによるF12;YによるF13;YによるS14;及び/又はYによるF15の置換である。
幾つかの実施態様では、LN02M結合剤は、図1に示されるLN02M_VL配列(配列番号235)のアミノ酸23~33に対応し、かつW1、G2、Y3、Y4、M5、G6、S7、K8、P9、V10、及びN11として左から右に番号を付した、修飾されたLN02 CDRL1(WGYYMGSKPVN)を含み、これは、次の置換のすべて、又は幾つかの実施態様ではそれらの1つ以上の保存的変異体を含みうる:GによるW1;W、S、又はDによるY3;W、F、D、又はHによるY4;W、F、L、又はIによるM5;W、A、Y、V、H、又はSによるS7;W、Y、又はEによるK8;S又はGによるP9;IによるV10;及び/又は、EによるN11の置換。野生型LN02と比較したHIV中和効力置換(すなわち、1.4倍を超える増加(例えば、図1))に基づいて選択された、LN02 CDRL1(WGYYMGSKPVN)に対する特に好ましいは、WによるY3;WによるY4;Y又はVによるS7;YによるK8;IによるV10;及び/又は、EによるN11の置換である。
幾つかの実施態様では、LN02M結合剤は、図1に示されるLN02M_VL配列(配列番号235)のアミノ酸49~55に対応し、かつY1、D2、D3、E4、R5、D6、及びS7として左から右に番号を付した、修飾されたLN02 CDRL2(YDDERDS)を含み、これは、次の置換のすべて、又は幾つかの実施態様ではそれらの1つ以上の保存的変異体を含みうる:W又はFによるY1;EによるD2;N、Q、E、又はYによるD3;W又はDによるE4;YによるR5;TによるD6;及び、W、H、D、Y又はQによるS7の置換。野生型LN02と比較したHIV中和効力(すなわち、1.4倍を超える増加(例えば、図1))に基づいて選択されたLN02 CDRL2(YDDERDS)に対する特に好ましい置換は、TによるD6;及び/又はD又はQによるS7である。
幾つかの実施態様では、LN02M結合剤は、図1に示されるLN02M_VL配列(配列番号235)のアミノ酸88~98に対応し、かつCDRL3 Q1、V2、W3、D4、S5、K6、Y7、E8、E9、I10、及びY11として左から右に番号を付した、修飾されたLN02 CDRL3(QVWDSKYEEIY)を含み、これは、次の置換のすべて、又は幾つかの実施態様ではそれらの1つ以上の保存的変異体を含みうる:YによるQ1;IによるV2;EによるD4;A、Y、T、M、H、D、及びQによるS5;G、W、R、H、Y、T、又はHによるK6;WによるY7;D、Y、R、又はHによるE8;W、又はVによるI10;並びに、W、T、又はFによるY11の置換。野生型LN02と比較したHIV中和効力(すなわち、1.4倍を超える増加(例えば、図1))に基づいて選択されたLN02 CDRL3(QVWDSKYEEIY)に対する特に好ましい置換は、Y、H、又はQによるS5;W、又はYによるK6;WによるY7;YによるE8;及び/又はVによるI10の置換である。
幾つかの実施態様では、LN02M結合剤は、そのCDRが図1に示されているように、CDRの外側のLN02可変重鎖領域及び/又は可変軽鎖領域のアミノ酸配列への修飾を含みうる。例えば、幾つかの実施態様では、配列番号234を参照すると、S19は、W、H、又はRで置換されてよく;T21は、W、Y、又はSで置換されてよく;S68、D72、T73、S74、K75、又はN76は、Wで置換されてよく;N65は、S又はWで置換されてよく;H94は、Yで置換されてよく;及び/又は、P105はWで置換されてもよい。野生型LN02と比較したHIV中和効力(すなわち、1.4倍を超える増加(例えば、図1))に基づいて選択された、CDRの外側のLN02可変重鎖(配列番号234を参照)に対する特に好ましい置換は、H又はRによるS19;YによるT21;及び/又は、WによるS74の置換である。幾つかの実施態様では、配列番号235を参照すると、Q16は、Eで置換されてよく;S48は、W、Y、T、又はFで置換されてよく;G56は、Eで置換されてよく;A59は、Eで置換されてよく;H65は、Nで置換されてよく;S68は、Nで置換されてよく;N76は、Rで置換されてよく;V78は、Eで置換されてよく;P79は、Aで置換されてよく;及び/又は、A80は、Gで置換されてもよい。野生型LN02と比較したHIV中和効力(すなわち、1.4倍を超える増加(例えば、図1))に基づいて選択された、CDRの外側のLN02可変軽鎖(配列番号235を参照)に対する特に好ましい置換は、TによるS48;RによるN76;及び/又は、EによるV78の置換である。CDRの外側のLN02可変重鎖及び可変軽鎖(それぞれ、配列番号234及び235を参照)に対するこれらの置換のいずれか1つ以上を、上記のLN02M CDRのいずれかを含む結合剤に含めることができる。このようなアミノ酸配列に対する追加の保存的置換も、当業者によって理解されるように、利用することができる。
幾つかの実施態様では、LN02M結合剤は、図1に示されるように修飾されたLN02Mポリペプチドを含むことができる。幾つかの実施態様では、LN02M結合剤は、図6A~Eのいずれかに記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。表1~2に提示されている効力データに基づいた、好ましいLN02Mポリペプチドは、野生型LN02よりも高い中和活性を示すものであり(倍増加が括弧内に示されている)、これらには、LN02M可変重鎖領域MH01(1.59)(配列番号95)、MH16(1.69)(配列番号110)、MH22(1.18)(配列番号116)、MH26(1.40)(配列番号120)、MH30(3.37)(配列番号124)、MH32(1.32)(配列番号126)、MH35(1.91)(配列番号129)、MH36(1.37)(配列番号130)、MH37(1.75)(配列番号131)、MH43(1.90)(配列番号136)、MH44(1.38)(配列番号137)、MH48(2.12)(配列番号141)、MH49(1.71)(配列番号142)、MH50(2.74)(配列番号143)、MH51(2.46)(配列番号144)、MH53(1.45)(配列番号146)、MH59(1.31)(配列番号151)、MH61(1.43)(配列番号153)、MH64(1.52)(配列番号156)、MH68(1.12)(配列番号159)、MH73(1.83)(配列番号163)、MH84(1.16)(配列番号174)、MH89(2.26)(配列番号177)、MH91(1.36)(配列番号178)、MH92(1.45)(配列番号179)、MH106(1.16)(配列番号193)、MH107(2.19)(配列番号194)、MH108(1.91)(配列番号195)、MH111(3.34)(配列番号198)、MH112(2.77)(配列番号199)、MH115(1.41)(配列番号202)、MH119(1.32)(配列番号206)、MH120(1.55)(配列番号207)、MH124(1.67)(配列番号211)、MH131(1.55)(配列番号218)、MH135(1.60)(配列番号222)、MH136(1.84)(配列番号223)、MH138(1.20)(配列番号225)、及び/又はMH146(1.65)(配列番号232);及び/又はLN02M可変軽鎖領域ML01(1.29)(配列番号3)、ML02(1.93)(配列番号4)、ML05(1.45)(配列番号7)、ML08(2.31)(配列番号10)、ML10(1.51)(配列番号12)、ML11(1.25)(配列番号13)、ML12(3.90)(配列番号14)、ML31(5.74)(配列番号31)、ML32(1.38)(配列番号32)、ML44(1.57)(配列番号42)、ML49(1.40)(配列番号47)、ML51(1.10)(配列番号48)、ML52(1.36)(配列番号49)、ML60(1.17)(配列番号56)、ML71(1.38)(配列番号66)、ML73(1.20)(配列番号68)、ML74(1.10)(配列番号69)、ML79(1.46)(配列番号74)、ML84(1.59)(配列番号79)、ML85(9.94)(配列番号80)、ML92(4.79)(配列番号87)、及びML94(6.42)(配列番号89);及び/又は、それらの保存的に置換された変異体及び/又は断片を含むものが含まれる。特に好ましいLN02M結合剤は、LN02 MH30(配列番号95)、LN02 MH111(配列番号95)、LN02 ML12(配列番号95)、LN02 ML31(配列番号95)、LN02 ML85(配列番号95)、LN02 ML92(配列番号95)、及びLN02 ML94(配列番号95)を含むものであり、これらの各々が、LN02野生型対照(表1~2)、及び/又はそれらの保存的に置換された変異体及び/又は断片と比較して、BaLウイルスに対して3倍を超える改善された中和効力を示す。
本開示の結合剤は、上記の修飾されたCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、及びCDRL3アミノ酸配列のいずれか、又はそれらの保存的に置換された変異体を含みうる。このような結合剤は、以下により詳細に説明されるように、抗体などのポリペプチドでありうる。
本開示の結合剤は、例えば、配列番号3~92、配列番号95~233、及び/又は図1及び図6A~Eに示されるアミノ酸配列(すなわち、ポリペプチド配列)のうちのいずれか1つ以上;及び/又は、それらの保存的に置換された変異体を含みうる。それらの断片及び/又は誘導体(例えば、保存的置換などの置換アミノ酸を含む)もまた開示される。幾つかの実施態様では、本開示の結合剤は、該結合剤が本明細書に記載される(例えば、図2~5及び実施例のセクションに示されているような)機能的特徴を示すことを条件として、配列番号3~92、配列番号95~233、及び/又は図6A~Eに示されるものの1つ以上(すなわち、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は7つ)を含みうる。好ましい実施態様では、結合剤は、図1に示される修飾されたCDRの少なくとも1つ;配列番号3~92の少なくとも1つ及び配列番号95~233の少なくとも1つ;及び/又は、図6A~Eに示されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含み;さらになお好ましくは、このようなLN02M結合剤は、表1~3及び/又は図2~5のいずれかに提示される、及び/又は本明細書の実施例のセクションに記載される特性の1つ以上を示す。まとめて、本明細書に開示される修飾されたLN02アミノ酸配列は、「LN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列」と呼ぶことができ、これは、図1及び図6A~E、並びに配列番号3~92及び95~233に示されるLN02Mアミノ酸配列を指す。LN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列は、典型的には、少なくとも6つのアミノ酸残基の配列(例えば、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、又は15のアミノ酸残基の少なくともいずれかの配列)を含む。
LN02 CDRとLN02M CDRの組合せ、並びにCDRの外側の修飾されたアミノ酸配列は、HIV偽ウイルスの中和(表1~3及び表7~14、図2~5及び図9、及び実施例に示されるような)などの機能的特徴を維持しつつ、必要に応じて互いに組み合わせることができる。例示的な組合せは表4に記載されており、次の組合せも含まれる:LN02M可変軽鎖のML01(配列番号3)と、LN02M可変重鎖のMH02(配列番号96)、MH04(配列番号98)、MH22(配列番号116)、MH23(配列番号117)、MH30(配列番号124)、MH31(配列番号125)、MH35(配列番号129)、MH36(配列番号130)、及び/又はMH37(配列番号131);LN02M可変軽鎖のML12(配列番号14)と、LN02M可変重鎖のMH02(配列番号96)、MH04(配列番号98)、MH22(配列番号116)、MH23(配列番号117)、MH30(配列番号124)、MH31(配列番号125)、MH35(配列番号129)、MH36(配列番号130)、及び/又はMH37(配列番号131);LN02M可変軽鎖のML23(配列番号24と、LN02M可変重鎖のMH31(配列番号125)、MH43(配列番号136)、MH48(配列番号141)、及びMH51(配列番号144);LN02M可変軽鎖のML30(配列番号30と、LN02M可変重鎖のMH31(配列番号125)、MH43(配列番号136)、MH48(配列番号141)、又はMH51(配列番号144);LN02M可変軽鎖のML31(配列番号31と、LN02M可変重鎖のMH02(配列番号96)、MH04(配列番号98)、MH22(配列番号116)、MH23(配列番号117)、MH30(配列番号124)、MH31(配列番号125)、MH35(配列番号129)、MH36(配列番号130)、MH37(配列番号131)、MH43(配列番号136)、MH48(配列番号141)、又はMH51(配列番号144);LN02M可変軽鎖のML32(配列番号32)と、LN02M可変重鎖のMH31(配列番号125);LN02M可変軽鎖のML85(配列番号80)と、LN02M可変重鎖のMH31(配列番号125)、MH35(配列番号129)、MH43(配列番号136)、MH49(配列番号142)、MH60(配列番号152)、MH76(配列番号166)、MH111(配列番号198)、又はMH112(配列番号199);及び/又は、それらの保存的に置換された変異体及び/又は断片。特に好ましいLN02M結合剤は、LN02 ML8542(配列番号99)及びLN02 MX048(LN02 ML85(配列番号80)とLN02 MH31(配列番号125)との組合せ(表4));及び/又は、それらの保存的に置換された変異体及び/又は断片である。当業者に理解されるように、他の組合せもまた本明細書において企図されている。
幾つかの実施態様では、結合剤は、モノクローナル抗体(mAb)若しくはそれらの断片又は誘導体でありうる。幾つかの実施態様では、結合剤は、このようなモノクローナル抗体(mAb)のHIV結合断片でありうる。幾つかの実施態様では、1つ以上のLN02M CDR、及び/又はこのようなCDRを含むアミノ酸配列、並びに幾つかの実施態様では、CDR領域の外側に存在する他の修飾された配列(例えば、図1を参照)は、標準的な技法を使用してIgG(例えば、IgG1又はIgG3)骨格(例えば、フレームワーク)へとクローン化されうる。他の適切な実施態様は、本開示から当業者によって導き出すことができる。
結合剤(例えば、抗体、又はその抗原結合断片)は、少なくとも1つのLN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列(例えば、図1に示される修飾されたCDR;配列番号3~92又は491~699の少なくとも1つ及び配列番号95~233又は248~482の少なくとも1つ;及び/又は図6A~E、図7A~E、又は図8A~Fに示されるアミノ酸配列の少なくとも1つ)に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性を有する1つ以上のアミノ酸配列を含むことが好ましく、さらになお好ましくは、LN02M結合剤はさらに、表1~3及び/又は表7~14、及び/又は図2~5及び/又は図9のいずれかに提示される、及び/又は本明細書の実施例のセクションに記載される特性の1つ以上を示す。以下に論じられるように、100%未満の同一性は、保存的置換の場合のように、1つ以上のアミノ酸を別の(一又は複数の)アミノ酸で天然又は合成で置換した結果でありうる(例えば、表4参照)。LN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列のさまざまな組合せもまた企図されており、本明細書に記載される技法を使用して当業者が確認することができる又は当業者が他の方法で利用可能でありうる目的と同様の目的に(例えば、抗HIV抗体として)有用でありうる。好ましい実施態様では、本明細書に記載されるLN02M結合剤は、HIV、及び/又はHIVに感染した細胞、及び/又はHIVタンパク質を発現している細胞に結合することができる。幾つかのとりわけ好ましい実施態様では、本明細書に記載されるLN02M結合剤は、HIVを中和することができる(例えば、中和結合剤(例えば、抗体)として機能する)。好ましい実施態様では、LN02M結合剤は、HIV、及び/又はHIVに感染した及び/又はHIVタンパク質を発現している細胞の両方に結合し、HIVを中和することができる。
LN02M可変領域及び/又はLN02M CDR及び/又は非CDRアミノ酸配列は、当業者に利用可能な1つ以上の他の可変領域/CDRアミノ酸配列と組み合わせて使用することができる。このような可変領域/CDRアミノ酸配列は、代替的に、及び/又は加えて、抗体分子の1タイプ以上の定常領域ポリペプチドに接合しうる。例えば、LN02M CDRは、同じ又は異なる種(例えば、ヒト、ヤギ、ラット、ヒツジ、ニワトリ)のいずれかの抗体分子、及び/又はCDRアミノ酸配列の由来となるその抗体サブタイプの定常領域に接合しうる、又はそれらと関連付けることができる。例えば、例示的な結合剤LN02Mは、1つ以上のLN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列を含む別の結合剤とほぼ同じ中和活性を有するもの、及び/又は同じ又は類似のエピトープに結合するもの、及び/又はほぼ同じ親和性を示すものでありうるか、又はそれらに由来しうる。結合剤は、各々が1つ以上の定常領域及び/又可変領域を含む、抗体重鎖及び/又は軽鎖を含みうる。本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか(例えば、LN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列)、及び/又はそれらの断片及び/又は誘導体はまた、任意の他の可変領域及び/又はCDRと任意の順序及び/又は組合せで組み合わせて、新しい結合剤、例えば、ハイブリッド及び/又は融合結合剤を形成し、及び/又は標準的な技法を使用して他の重鎖及び/又は軽鎖可変領域に挿入することもできる。
本開示はまた、HIV、及び/又はHIVの宿主となる及び/又はHIVに感染する及び/又はHIV抗原を発現する細胞を単離、同定、及び/又は標的化するためのこのような結合剤の使用を提供する。ある特定の実施態様では、このような結合剤は、細胞の表面に発現されるタンパク質などのHIV抗原に対して反応性でありうる。幾つかの実施態様では、(一又は複数の)結合剤は、(一又は複数の)抗体である。(一又は複数の)「抗体」という用語は、未精製又は部分的に精製された形態(例えば、ハイブリドーマ上清、腹水、ポリクローナル抗血清)、若しくは精製された形態の全抗体又は断片化された抗体を指しうる。抗体は、例えば、マウス(例えば、マウスハイブリドーマ細胞によって産生される)を含む、任意の適切な起源又は形態のものでありうるか、又はヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体などとして発現されうる。例として、抗体は、例えば、全体的に又は部分的に、ヒト(例えば、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1及びIgA2)、IgD、及びIgE)、イヌ(例えば、IgGA、IgGB、IgGC、IgGD)、ニワトリ(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY)、ヤギ(例えば、IgG)、マウス(例えば、IgG、IgD、IgE、IgG、IgM)、ブタ(例えば、IgG、IgD、IgE、IgG、IgM)、及び/又はラット(例えば、IgG、IgD、IgE、IgG、IgM)抗体由来でありうる。さまざまなタイプの抗体を調製、利用、及び保存する方法は、当業者によく知られており、本発明の実施に適しているであろう(例えば、Harlow, et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Harlow, et al. Using Antibodies: A Laboratory Manual, Portable Protocol No. 1, 1998; Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)); Jones et al. Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature, 332:323-329 (19
88); Presta (Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); Verhoeyen et al. (Science, 239:1534-1536 (1988); Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995);並びに、米国特許第4,816,567号;同第5,545,807号;同第5,545,806;5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;及び、同第5,661,016号の各明細書を参照)。ある特定の用途では、抗体は、ハイブリドーマ上清又は腹水内に含まれ、それ自体で直接、又は標準的な技法を使用して濃縮した後に利用することができる。他の用途では、抗体は、例えば、塩分画及びイオン交換クロマトグラフィ、あるいはプロテインA、プロテインG、プロテインA/G、及び/又はアガロースビーズなどの固体支持体に共有結合したプロテインLリガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィ、若しくはこれらの技法の組合せを使用してさらに精製することができる。抗体は、凍結調製物(例えば、-20℃又は-70℃)として、凍結乾燥形態で、又は通常の冷蔵条件下(例えば、4℃)を含む、任意の適切な形式で保存することができる。例えば、液体形態で保存される場合には、トリス緩衝生理食塩水(TBS)又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの適切な緩衝液が利用されることが好ましい。幾つかの実施態様では、結合剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の懸濁液など、注射可能な調製物として調製することができる。利用することができる適切なビヒクル及び溶媒には、とりわけ、水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液、TBS、及び/又はPBSが含まれる。このような調製物は、インビトロ又はインビボでの使用に適しており、当技術分野で知られているように調製することができ、その正確な調製物は、特定の用途に依存しうる。
88); Presta (Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); Verhoeyen et al. (Science, 239:1534-1536 (1988); Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995);並びに、米国特許第4,816,567号;同第5,545,807号;同第5,545,806;5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;及び、同第5,661,016号の各明細書を参照)。ある特定の用途では、抗体は、ハイブリドーマ上清又は腹水内に含まれ、それ自体で直接、又は標準的な技法を使用して濃縮した後に利用することができる。他の用途では、抗体は、例えば、塩分画及びイオン交換クロマトグラフィ、あるいはプロテインA、プロテインG、プロテインA/G、及び/又はアガロースビーズなどの固体支持体に共有結合したプロテインLリガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィ、若しくはこれらの技法の組合せを使用してさらに精製することができる。抗体は、凍結調製物(例えば、-20℃又は-70℃)として、凍結乾燥形態で、又は通常の冷蔵条件下(例えば、4℃)を含む、任意の適切な形式で保存することができる。例えば、液体形態で保存される場合には、トリス緩衝生理食塩水(TBS)又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの適切な緩衝液が利用されることが好ましい。幾つかの実施態様では、結合剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の懸濁液など、注射可能な調製物として調製することができる。利用することができる適切なビヒクル及び溶媒には、とりわけ、水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液、TBS、及び/又はPBSが含まれる。このような調製物は、インビトロ又はインビボでの使用に適しており、当技術分野で知られているように調製することができ、その正確な調製物は、特定の用途に依存しうる。
しかしながら、本明細書に記載される結合剤は、抗体(すなわち、全抗体)に決して限定されるものではない。例えば、結合剤は、別のものと同様の結合特性を示す任意の化合物(例えば、模倣物)であってもよい。例えば、例示的な結合剤は、HIVに結合するもの、及び/又はそれに対して特異性を有する別の結合剤と競合することができるものでありうる(例えば、LN02M抗体などのモノクローナル抗体)。幾つかの実施態様では、模倣物は、それが比較されている結合剤(例えば、モノクローナル抗体)と結合アッセイにおいて実質的に同じ親和性を示すことができる。特定の結合剤の親和性は、細胞表面のHIV抗原(例えば、ポリペプチド)のFACS染色を含むがこれに限定されない任意の適切なアッセイによって測定することができる。ある結合剤は、測定値(例えば、nm)が、互いに約1~20、1~5、5~10、10~15、又は15~20パーセントのいずれかの範囲内にある場合、別の結合剤と「実質的に同じ親和性」を有すると言うことができる。例示的な模倣物には、例えば、HIVに特異的に結合する有機化合物、又はアフィボディ(Nygren、et al. FEBS J. 275 (11): 2668-76 (2008))、アフィリン(Ebersbach, et al. J. Mol. Biol. 372 (1): 172-85 (2007))、アフィチン(Krehenbrink, et al.J. Mol.Biol.383 (5): 1058-68 (2008))、アンチカリン(Skerra, A. FEBS J. 275 (11): 2677-83 (2008))、アビマー(Silverman, et al. Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556-61 (2005))、DARPin(Stumpp, et al. Drug Discov. Today 13 (15-16): 695-701 (2008))、フィノマー(Grabulovski, et al. J. Biol. Chem. 282 (5): 3196-3204 (2007))、クニッツドメインペプチド(Nixon, et al. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 9 (2): 261-8 (2006))、及び/又はモノボディ(Koide, et al.Methods Mol.Biol. 352: 95-109 (2007))が含まれうる。他の模倣物は、例として、例えば、Fab、Fab2、Fab’一本鎖抗体、Fv、単一ドメイン抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ-ヒトキメラ抗体、イヌ-マウスキメラ抗体、イヌFcを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化、CDRグラフト化抗体、サメ抗体、ナノボディ、ラクダ抗体、マイクロボディ、及び/又はイントラボディ;及び/又はそれらの誘導体などの抗体の誘導体を含みうる。当業者によって理解されるように、他の結合剤もまた、本明細書で提供される。
当業者に知られているいずれかの方法を使用して、HIVに対する特異性(例えば、HIVへの結合)を有する結合剤を生成することができる。例えば、モノクローナル抗体を生成及び単離するために、マウスなどの動物に1つ以上のHIVタンパク質を投与(例えば、免疫化)することができる。次に、活性化されたヒトTリンパ球上で発現されたHIVに対する血清反応性(例えば、フローサイトメトリ及び/又は顕微鏡検査によって決定される)を示す動物を、抗HIVハイブリドーマ細胞株の生成のために選択することができる。これを複数回繰り返すことができる。スクリーニングはまた、例えば、HIVに特異的である結合剤を同定するための親和性結合及び/又は機能的特徴付けも含みうる。本明細書の実施例などの幾つかの実施態様では、HIVに対する抗体の発現についてヒトをスクリーニングすることができる。幾つかの実施態様では、HIVに感染したヒトの血漿サンプルを、抗HIV抗体、特に中和抗体を発現する個人を同定するためにスクリーニングすることができる。次に、このような個人の中和抗体産生細胞を単離し、続いて、それによって産生された抗体の単離及び特徴付けを(例えば、本明細書の実施例のように)行うことができる。中和抗体は、HIVによる細胞の感染を中和又は抑制する能力を示すものでありうる。概して、中和アッセイは、典型的には、ウイルスと特定の抗体との反応によるウイルスの感染力の低下を測定する。典型的には、感染力の低下は、標的細胞への結合、侵入、及び/又はウイルス放出を含むがこれらに限定されない、ウイルス複製ステップのいずれかとの結合抗体による干渉によって引き起こされる。中和されていないウイルスの存在は、当業者によって利用可能な系(例えば、ルシフェラーゼをベースとした系)のいずれかを使用して、標的細胞の感染を測定することによって、所定の時間、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、又は14日後に検出される。中和アッセイの非限定的な例は、所与の量のウイルス又は偽ウイルス(以下を参照)を組み合わせ、異なる濃度の試験抗体又は対照(通常、別々にアッセイされる陽性対照及び陰性対照)抗体を適切な条件下で混合し(例えば、室温で1時間)、次に適切な標的細胞培養(例えば、TZM-bl細胞)に接種することを含みうる。例えば、結合剤産生細胞(例えば、抗体を産生するB細胞)は、エプスタイン・バーウイルス(EBV)(これは、ポリクローナルにメモリーB細胞も刺激する)、成長因子のカクテル(例えば、TLR9アゴニストCpG-2006、IL-2(1000IU/ml)、IL-6(10ng/ml)、IL-21(10ng/ml)、及び抗B細胞受容体(BCR)ヤギ抗体(BCRをトリガする))の存在下、ヒトフィーダー細胞上での単一細胞マイクロ培養としてこのような細胞を別々のプレートに播種することにより、HIV-1中和抗体の産生についてアッセイすることができる。適切な時間(例えば、14日)後、このような培養物の上清は、このような細胞に生産的に感染する、2つ以上の代表的なHIV-1ウイルス又は偽ウイルスを使用して、一次ルシフェラーゼベーススクリーニング系において試験することができる。偽ウイルスは、宿主細胞(例えば、3000TZM-bl細胞)を加える前に、B細胞培養上清とともに適切な時間及び温度(例えば、37%(5%CO2)で1時間)インキュベートされうる。次に、適切な時間(例えば、72時間)のインキュベーションが続き、その後、上清を除去し、Steadylite試薬(Perkin Elmer社)を加えることができる(例えば、15μl)。次に、ルシフェラーゼ活性をSynergyマイクロプレートルミノメーター(BioTek社)で(例えば、5分後に)決定することができる。陰性対照と比較したルシフェラーゼ活性の低下は、通常、ウイルスの中和を示す。本開示の結合剤を分析するのに適した、これらのような中和アッセイは、当技術分野で知られている(例えば、Montefiori, D.C. Curr. Protocol. Immunol. Chapter 12, Unit 12.11 (2005); Edmonds, et al. Virology, 408(1): 1-13 (2010); Seaman, et al. J. Virol. 84(3): 1439-1452 (2010); Pace, et al. PNAS USA, 110(33): 13540-13545 (2013)を参照)。幾つかの実施態様では、試験サンプルは、HIV偽ウイルスのパネルを中和することができる抗体の存在についてスクリーニングすることができる(例えば、本明細書の実施例で行われたHIV-1基準株のグローバルパネルからの8つのHIV-1偽ウイルス(これらの偽ウイルスは、TRO.11(B)、246F3(AC)、BJOX2000(CRF007_BC)、CE1176(C)、CH119(CRF07_BC)、CNE55(CRF01_AE)、25710(C)、及びX1632(例えば、図2~5を参照)であるが、約10μg/ml以下の対照ウイルスSVA-MLVでは中和されない(例えば、図5);DeCamp, A. et al. Global panel of HIV-1 Env reference strains for standardized assessments of vaccine-elicited neutralizing antibodies. J Virol 88, 2489-2507 (2014)。偽ウイルスのより大きいパネルの中和も試験することができる;例えば、de Campらは、12の偽ウイルス(HIV-1 Env基準株としても知られる)の群を記載している:398F1、25710、CNE8、TRO11、X2278、BJOX2000、X1632、CE1176、246F3、CH119、CE0217、及びCNE55。幾つかの実施態様では、10のHIV分離株のパネルを試験することができ、bNabは、9の偽ウイルスのパネルの6、7、8、9の成員;若しくは、12の偽ウイルスのパネルの6、7、8、9、10、11、又は12の成員を中和するものとして特定することができる。このような偽ウイルスのより大きいパネル(例えば、本明細書の実施例にあるような57の偽ウイルスのパネル)のスクリーニングも実施することができる。一実施態様では、次に、試験サンプルを中和抗体について試験することができる、実施例で用いられる57の偽ウイルスの例示的なパネルは、例えば、図2~5に示されているもの(例えば、クレードA(T/F)、クレードB、クレードB(T/F)、クレードBC、クレードC、クレードC(T/F)、クレードE(T/F)、又はクレードG)を含みうる。幾つかの実施態様では、中和は、ウイルス感染の約50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は99%を中和することができるモノクローナル抗体の濃度(例えば、μg/ml)の尺度として決定することができる(中和率によって、及び/又は「IC50」及び/又は「IC80」値を決定することによって測定されうる)。幾つかの実施態様では、結合剤は、例えば、約10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、100、101、102、又は103μg/mlのいずれかの濃度でウイルス感染の50%を中和することができる場合に、中和すると見なすことができる(例えば、図2~5に示されるIC80値)。幾つかの実施態様では、ウイルス感染を中和する中和抗体の能力は、中和率として表すことができる(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は99%(例えば、図5のように))。また、幾つかの実施態様では、本明細書の実施例のように、ウイルス感染を中和する中和抗体の能力は、IC50及び/又はIC80値で表すことができ、好ましい実施形態では、IC50及び/又はIC80値は25μg/ml未満であり、さらになお好ましくは、約15、10、5、2、1、0.5、0.25、0.1、0.05、又は0.01μg/ml未満のいずれかである(例えば、図2~5参照)。中和の他の手段もまた、当業者による決定に適切でありうる。
幾つかの実施態様では、本明細書に記載される結合剤は、HIV感染者から得られた生物学的サンプル(例えば、血漿)において同定された広域中和抗体(bNab)でありうる。上記のように、かつ本明細書の実施例に示されるように、このようなbNabは、HIVに慢性的に感染している患者(好ましくは、抗レトロウイルス療法を受けていない患者)の血漿サンプルを、マルチクレードHIV分離株を中和する能力について試験することによって特定することができる(例えば、最初に、偽ウイルスの9又は12の成員のパネルを使用し、次に、より大きいパネル(例えば、57の成員)を使用する)。幾つかの実施態様では、サンプルは、ウイルス血症が血漿1mlあたりのHIV RNAコピーが50未満である「エリートコントローラ」として知られる患者に由来しうる。これらのようなスクリーニング手順は、bNabを産生するB細胞のその後の単離及び特徴付けのためのリンパ節ドナーとして役立ちうる患者の識別につながりうる。このようなスクリーニングアッセイを実施する際には、中和活性は、通常、マウス白血病ウイルス(MLV)偽ウイルスなどの陰性対照と比較される。
幾つかの実施態様では、中和結合剤(例えば、抗体)を発現する患者の胚中心細胞及びメモリーIgG型B細胞を単離し、さらに研究することができる。幾つかの実施態様では、細胞を、IgG(例えば、IgA及びIgM陰性細胞)、CD19、及びCD38の発現に応じて別々に分類し(胚中心B細胞はCD38陽性である)、HIV-1中和抗体の産生について調査することができる。例えば、高純度のIgG型メモリーB細胞及びIgG生殖細胞を、エプスタイン・バーウイルス(EBV)(これは、ポリクローナルにメモリーB細胞も刺激する)及び成長因子のカクテルなど(例えば、構成されたTLR9アゴニストCpG-2006、IL-2(1000IU/ml)、IL-6(10ng/ml)、IL-21(10ng/ml)、及び抗BCRヤギ抗体(B細胞受容体(BCR)のトリガ))の存在下、ヒトフィーダー細胞上での単一細胞のマイクロ培養として別々のプレートに播種することができる。次に、このような培養物(例えば、14日目の培養物から)の上清を、一次スクリーニングにおいて試験することができる(例えば、本明細書の実施例に示されるように、クレードC及びCRF07を代表する2つの株CE1176及びBJOX2000を並行して使用した384ウェルベースのHIV-1偽ウイルス中和アッセイを使用)。中和アッセイは、任意の適切な宿主細胞を使用して行うことができる(例えば、TZM-bl細胞(Seaman, et al.J. Virol.84(3): 1439-52 (2010); NIH AIDS Reagent Program Catalog Number 8129))。次に、有意な(例えば、50~100×104RLUの)出力相対光単位(RLU)をもたらす(すなわち、細胞の増殖性感染を示す)HIV-1偽ウイルスを、宿主細胞(例えば、3000のTZM-bl細胞)を添加する前に、B細胞培養上清とともに適切な時間及び温度で(例えば、37%(5%CO2)で1時間)インキュベートすることができる。通常、適切な時間(例えば、72時間)のインキュベーションが続き、その後、上清を除去し、Steadylite試薬(Perkin Elmer社)を加えることができる(例えば、15μl)。次に、Synergyマイクロプレートルミノメータ(BioTek社)で(例えば、5分後に)、ルシフェラーゼ活性を検出することができる。ルシフェラーゼ活性の低下は、細胞から放出されるウイルスの量がより少なく、ウイルスが中和されていることを示す。例えば、特定の偽ウイルスのベースRLUが50~100×104RLUの場合、中和抗体は、その偽ウイルスのRLUを25~50×104RLU(すなわち、50%の低下)、又はそれ未満に低下させるように決定することができる。このような系を使用して、株を交差中和することができる上清を同定し、さらに採取し、かつ他の偽ウイルスを中和するそれらの能力について試験することができる。
次に、抗体の可変領域及び相補性決定領域(CDR)のアミノ酸及びヌクレオチド配列を決定することによって、このような中和抗体含有培養物に由来する抗体をさらに特徴付けることができる。これらの技法を使用して、「LN02」と呼ばれるHIV中和結合剤を、図1に示されるCDR、VH、及びVL配列(配列番号234、235を含む)を有するIgG3型完全ヒトモノクローナル抗体として同定した。本明細書に記載されるように、LN02の変異体が現在開発されており、驚くべき機能的特性(例えば、HIV偽ウイルスの中和の増加)を示すことが示されている。幾つかの実施態様では、結合剤の可変重鎖(VH)及び可変軽鎖(VL)遺伝子を、同じアイソタイプ又は異なるアイソタイプのIgG発現ベクターにクローン化することができる。実施例に示されるように、例えば、LN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列をコードする核酸をIgG1骨格にクローン化し、適切な宿主細胞(例えば、Expi293F細胞)をトランスフェクトすることによって組換えIgG1ベースの抗体を産生させた。次に、抗体完全長IgG1ベースの抗体を、標準的な技法を使用して精製することができる(例えば、組換えプロテインAカラム(GE-Healthcare社)を使用して、完全長のIgG1ベースの抗体を精製することができる)。次に、組換え産生されたIgG1抗体を、適切な宿主細胞(例えば、TZM-bl細胞)上で、本明細書に記載されているもののいずれかなどの偽ウイルスのパネルのいずれか(例えば、実施例で使用されている9つのHIV-1参照偽ウイルスのグローバルパネル)に対して試験することができる。好ましい実施態様では、結合剤は、陰性対照ウイルス(例えば、MLV偽ウイルス)を中和することなく、偽ウイルスパネルの成員(例えば、9、12、又は118の成員を含む)の大部分(すなわち、少なくとも約50%以上)を中和する能力を示す。結合剤は、このようなウイルスの大部分を中和する能力を示すことが好ましく(例えば、約60%、70%、80%、90%、95%、99%、又は100%のいずれかなど、約50%を超える中和)、IC50及び/又はIC80値が中和と見なされる(以下を参照)。例えば、幾つかの実施態様では、本開示の結合剤は、HIV-1偽ウイルスTRO.11(クレードB)、25710(クレードC)、CE1176、BJOX(CRF07_BC)、CH119(CRF07_BC)、246-F3(クレードAC)、X1632(クレードG)、CNE55(CRF01_AE)、及び/又はCD0217(クレードC)の中和を示すことができる。幾つかの実施態様では、HIV-1偽ウイルスの中和は、抗体濃度が10-2~100μg/ml(すなわち、10ng/ml~1μg/ml)、又は100~101μg/ml(すなわち、1~10μg/ml)の間である場合に、観察されうる。幾つかのこのような実施態様では、結合剤による中和率は少なくとも約50%である。幾つかの実施態様では、1つのHIV-1分離株の感染は、この分離株の少なくとも1つの分離株の感染が25μg/ml未満のIC50で中和される場合に、25μg/ml未満のIC50及び/又はIC80で結合剤(例えば、抗体)によって中和されたと見なされる。幾つかの実施態様では、結合剤は、記載されるHIV-1偽ウイルスが、25μg/ml未満、例えば、約10μg/ml、9μg/ml、8μg/ml、7μg/ml、6μg/ml、5μg/ml、4μg/ml、3μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.9μg/ml、0.8μg/ml、0.7μg/ml、0.6μg/ml、0.5μg/ml、0.4μg/ml、0.3μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.09μg/ml、0.08μg/ml、0.07μg/ml、0.06μg/ml、0.05μg/ml、0.04μg/ml、0.03μg/ml、0.02μg/ml、又は0.01μg/mlのIC50;及び/又は、約0.001~約10μg/mlの間のIC50で中和されると見なされる場合に、中和すると見なすことができる。好ましい実施態様では、結合剤は、HIV-1偽ウイルス株TRO.11(クレードB)、25710(クレードC)、CE1176、BJOX(CRF07_BC)、CH119(CRF07_BC)、246-F3(クレードAC)、X1632(クレードG)、CNE55(CRF01_AE)、及び/又はCD0217(クレードC);及び/又は、ID MS208.A1、Q23.17、Q769.d22、Q842.d12、Q259.d2.17、0260.v5.c36、191955_A11、191084 B7-19、TRO.11、6535.3、REJO4541.67、SC422661.8、QH0692.42、TRJO4551.58、RHPA4259.7、PVO.4、SC05 8C11 2344、CNE17、CNE19、CNE20、CNE21、Du422.1、CAP210.2.00.E8、ZM249M.PB6、HIV-001428-2.42、ZM214M.PL15、CAP45.2.00.G3、Ce704809221_1B3、Ce1176_A3、ZM247v1(Rev-)、Ce0682_E4、249M B10、246F C1G、及び/又はBF1266.431aを、例えば約1μg/ml以下のIC50又はIC80で中和することができる(図2~4、図9、表7A、7B、及び/又は表8Aから8M)。結合剤は、クレード依存性を示さないことがさらに好ましい。例えば、幾つかの実施態様では、結合剤は、クレードA(T/F)、クレードB、クレードB(T/F)、クレードBC、クレードC、クレードC(T/F)、クレードE(T/F)、及び/又はクレードGを含むがこれらに限定されないHIV-1クレードの偽ウイルスを中和する能力を示すことができる。幾つかの好ましい実施態様では、結合剤は、クレードA、A(T/F)、B、B(T/F)、BC、C、C(T/F)、及びGの各々の少なくとも1つの偽ウイルスを、約1μg/ml以下のIC50又はIC80で中和することができる。幾つかの好ましい実施態様では、結合剤は、クレードA、A(T/F)、B、B(T/F)、BC、C、C(T/F)の各々の少なくとも1つの偽ウイルスを、約0.5μg/ml以下のIC50又はIC80で中和することができる。幾つかの好ましい実施態様では、結合剤は、約1μg/ml以下のIC80において、クレードA、A(T/F)、B、B(T/F)、BC、C、及びC(T/F)の各々の少なくとも1つの偽ウイルスを中和することができる。幾つかの実施態様では、結合剤は、これらの特性のいずれか1つ以上、並びにLN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列のうちの1つ以上を含む。
幾つかの実施態様では、結合剤は、1つ以上のタイプのFc受容体を発現する細胞又は発現しない細胞(例えば、親TZM-bl細胞及び実施例のようなFc-γ受容体I(CD64)を発現するTZM-bl細胞;例えば、Perez, et al. Utilization of immunoglobulin G Fc receptors by human immunodeficiency virus type 1: a specific role for antibodies against the membrane-proximal external region of gp41.J Virol 83, 7397-7410 (2009); NIH AIDS Reagent Program Catalog No. 11798を参照)を使用して、HIV参照偽ウイルスに対する中和能力について試験することができる(例えば、9つのHIV-1参照偽ウイルスの上述のグローバルパネル)。Fc受容体を発現する細胞における中和活性の増強は、ウイルス阻害の速度論的利点を抗体に提供することができる。この速度論的利点は、抗体に特有であってよく、そのエピトープは、融合の初期段階において、Envタンパク質の中間体立体配座にアクセスするのが困難であるか、短時間しか晒されないと考えられている。Fc-γ受容体もまた、HIV-1の中和を促進することができ、これは食作用であり、それによって抗体の中和能力を高める。これまで、そこからTZM-bl細胞株が構築されたHeLa細胞は、非専門的食細胞の特性を示すことが知られている。したがって、TZM-bl細胞は、その表面にFc-γ受容体を導入することにより、専門的食細胞へと変換された可能性がある。HIV-1中和抗体に対するFc-γ受容体を介した抗ウイルス効果は、侵入阻害によるか食作用によるかにかかわらず、HIVの治療及びワクチンレジメンに有益でありうる。Fc-γ受容体がCD4+リンパ球で発現することはめったにないが、他の幾つかのHIV-1感受性細胞型は、複数のFc-γ受容体を発現し、性感染症並びに長寿命ウイルス貯留層の早期確立に関与している。特に、マクロファージは、粘膜への曝露後にウイルスが遭遇する最初の感染感受性細胞の1つであり、慢性感染症において長寿命のウイルス貯留層として機能すると考えられている。マクロファージ、並びに単球細胞及び樹状細胞の特定のサブセットは、複数のFc-γ受容体を発現することが知られている。Fc-γ受容体は、抗原の取り込み、抗原提示、細胞の活性化、及びB細胞の寛容を促進することにより、適応免疫及び末梢性寛容の調節において役割を果たすことに言及することもまた重要である。したがって、幾つかの実施態様では、本明細書に記載される結合剤は、本明細書に記載される結合剤による治療とともに、又はそれと組み合わせて、1つ以上のFc受容体をコードする核酸の導入を含む、Fc受容体発現を誘導及び/又は増強する薬剤と組み合わせて使用することができる。
本明細書に記載される結合剤の特異性は、当業者に利用可能な多くの技法のいずれかを使用して決定することができる。例えば、本明細書の実施例に示されるように、特定のエピトープに関する、結合剤(例えば、IgG1 LN02抗体)の特異性は、HIVエンベロープ遺伝子の突然変異をコードする偽ウイルス(例えば、CAP45)のパネルを使用して確認することができる。例えば、HIVエンベロープタンパク質(Env)を修飾して、修飾Envタンパク質(mEnv)を生成し、各結合剤(例えば、抗体)をさまざまなmEnvタンパク質に結合する能力について試験することができる。使用することができる例示的なHIV-1エンベロープアミノ酸配列は、以下に示すように、CAP45偽ウイルス(GenBankアクセッション番号EF203962;NCBI GenPeptアクセッション番号ABQ02701.1;配列番号237)、及び/又はHXB2 Env配列(配列番号238(GenBankアクセッション番号MF944225.1、protein_id=ATG88205.1))の配列である(太字及び下線で示されている修飾可能な例示的なアミノ酸を含む):
幾つかの実施態様では、本開示の結合剤は、上述した中和特性(すなわち、10-2~100μg/ml(すなわち、10ng/ml~1μg/ml)、又は100~101μg/ml(すなわち、1~10μg/ml)の間の濃度でのHIV-1偽ウイルスTRO.11(クレードB)、25710(クレードC)、CE1176、BJOX(CRF07_BC)、CH119(CRF07_BC)、246-F3(クレードAC)、X1632(クレードG)、CNE55(CRF01_AE)、CD0217(クレードC)の少なくとも約50%の中和(図3、図4、図9;表7A、7B、及び表8Aから8M)、並びに25μg/ml未満のIC50又はIC80でのHIV-1偽ウイルスの大部分の中和)とともに、これらの結合特異性を含みうる。
結合剤の特異性はまた、HIVタンパク質を代表する可溶性三量体(例えば、本明細書の実施例で用いられているサブタイプA感染/創始(founder)株であるBG505に基づく可溶性の切断されたSOSIP.664 gp140三量体)への結合についても試験することができる。好ましい三量体(本明細書の実施例で用いられるものなど)は、ネガティブ染色電子顕微鏡(EM)によって視覚化された場合に、非常に安定、均質、かつ天然のウイルススパイクによく似ているものである(Sanders, R. W. et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathog. 9, e1003618 (2013))。通常、HIV-1 Env上の複数の中和エピトープに対する広域中和抗体は、このような三量体との反応性が非常に高くなる。逆に、CD4結合部位、CD4誘導エピトープ、又はgp41エクトドメインに対する非中和抗体(NAb)は、それらのエピトープがより単純な形態のEnv(例えば、gp120単量体又は解離したgp41サブユニット)に存在する場合でも、三量体と反応しないであろう(実施例では反応しなかった)。実施例はまた、本明細書に記載される結合剤のいずれかを試験する際に使用することができる試験も含み、ここでは、三量体の溶解性を改善し、凝集体形成を低減するために、MPERも削除した。結合剤はまた、可溶性CD4(sCD4)の存在下又は非存在下で、このような三量体への結合について試験することもできる。本明細書の実施例は、LN02及びPGT151(表面プラズモン共鳴(SPR)で測定した、426c WT SOSIP Envタンパク質複合体に結合するためのgp120抗体及びgp41抗体との界面において部位に結合する(Dingens et al. Cell Host Microbe. 2017 Jun 14;21(6):777-787.e4. doi: 10.1016/j.chom.2017.05.003. Epub 2017 Jun 1))について説明している。実施例に示されるように、ビオチン化IgG1 LN02抗体は、426c WT SOSIP Envタンパク質に結合することが示されたが、非標識のLN02抗体とともに事前にインキュベートしたEnvタンパク質の結合は完全にブロックされた。同様の実験では、bNab PGT151に結合するビオチン化界面は、426cWT SOSIP Envタンパク質にはしっかりと結合したが、PGT151は、LN02+426c WT SOSIPEnvタンパク質複合体にはより弱く結合した。したがって、実施例に示されている結果は、IgG1 LN02抗体がHIV-1Envのgp120/gp41界面のエピトープを認識する可能性があることを示唆している。426c WT SOSIPへのPGT151の結合がLN02によって完全にはブロックされなかったことを所与とすると、LN02は、PGT151と比較して、同じ領域に結合するが、同一のエピトープには結合しない可能性がある。表面プラズモン共鳴を含む他のアッセイ系を使用して、本明細書で企図される結合剤を試験することができる。また、本明細書で企図される結合剤のいずれかに対して、同様の試験を実施することもできる。
「結合親和性」及び/又はKDという用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指す。KDは、解離速度(「オフ速度(kd)」)の結合速度(「オン速度(ka)」)に対する比である。したがって、KDは、kd/kaに等しく、モル濃度(M)として表される。よって、KDが小さくなるほど、結合の親和性が強くなる。例えば、1mMのKDは、1nMのKDと比較して、弱い結合を示す。抗体のKD値は、Biacore(登録商標)系を使用するなど、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。幾つかの実施態様では、本明細書に記載される結合剤は、それぞれのKD値をそれぞれ参照して、別の結合剤と比較することができる。これらの特性は、結合剤を互いに比較するために、中和能力及び/又はエピトープ特異性などの他の特性と組み合わせることができる。したがって、本明細書に記載されるものと同様のKDを有し、おそらくは本明細書に記載される中和能力及びエピトープ特異性も共有する結合剤(例えば、LN02Mによって示される)もまた、本開示の一部として企図されている。
LN02M可変領域のアミノ酸配列及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列のいずれか(及び/又は、それらの1つ以上の断片及び/又は誘導体)もまた、当業者に所望されるように、任意の他のアミノ酸で置換することができる。例えば、当業者は、下記表5に示されるように、特定のアミノ酸を他のアミノ酸で置き換えることによって保存的置換を行うことができる。選択される特定のアミノ酸置換は、選択される部位の位置に依存しうる。アミノ酸置換は、当業者が、置換されているアミノ酸を取り巻くアミノ酸配列間の有意な量の類似性を確認することができる場合に、「~に対応する」と言うことができる。例えば、特定のアミノ酸配列は、置換されているアミノ酸を取り巻く2つ、3つ、4つ、又はそれより多くのN末端及びC末端アミノ酸が比較されるポリペプチドにおいて同一であるか又は類似している(例えば、表5に記載されている)、別の配列に対応しうる。保存的アミノ酸置換は、その位置にあるアミノ酸残基のサイズ、極性、電荷、疎水性、又は親水性にほとんど又はまったく影響を及ぼさないように、特に、例えば、HIV中和能力の低下及び/又は異なるエピトープ特異性をもたらさないように、天然アミノ酸残基を非天然残基で置換することを包含しうる。
ある特定の実施態様では、本明細書に記載される1つ以上の結合剤をコードする核酸分子は、以下により詳細に論じられるように、1つ以上の発現ベクターに挿入することができる。このような実施態様では、結合剤は、アミノ酸配列に対応するヌクレオチドによってコードされうる。さまざまなアミノ酸(AA)をコードするヌクレオチドの特定の組合せ(コドン)は、当業者に使用されるさまざまな参考文献に記載されているように、当技術分野でよく知られている(例えば、Lewin, B. Genes V, Oxford University Press, 1994)。前記結合剤のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、例えば、表6を参照して確認することができる。核酸変異体は、結合剤をコードするヌクレオチドの任意の組合せを使用することができる。
当業者は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、LN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列、並びに表6に提示される情報から、容易に誘導することができることを理解している。例えば、アミノ酸配列YGSISRHFWG(配列番号1)及び表6に提示される情報から、アミノ酸配列がヌクレオチド配列TATGGCAGCATTAGCCGCCATTTTTGGGGC(配列番号34)によってコードされうることを推定することができる。当業者は、LN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を同じ方法で推定することができることを理解しており、このようなヌクレオチド配列が本明細書で企図されている。このような核酸配列を含む発現ベクターもまた、本開示によって企図されている。結合剤が抗体である場合、その可変領域をコードするヌクレオチド配列は、発現ベクターにクローン化されたものと同じものを発現するファージ及び/又はハイブリドーマ細胞から単離することもできる。このような調製物を製造する方法は、当技術分野でよく知られている。
1つ以上のHIV結合剤をコードする核酸分子は、ウイルスベクター及び/又は非ウイルスベクター内に含まれうる。一実施態様では、1つ以上のHIV結合剤をコードする核酸を患者に送達するために、DNAベクターが利用される。そうすることで、このような機構の効率を改善するために、さまざまな戦略を利用することができ、例えば、自己複製ウイルスレプリコンの使用(Caley, et al. 1999. Vaccine, 17: 3124-2135;Dubensky, et al.2000. Mol. Med. 6: 723-732;Leitner, et al.2000.Cancer Res.60: 51-55)、コドンの最適化(Liu, et al.2000.Mol.Ther., 1: 497-500;Dubensky, supra; Huang, et al.2001.J. Virol.75: 4947-4951)、インビボでのエレクトロポレーション(Widera, et al.2000. J. Immunol. 164: 4635-3640)、共刺激分子、サイトカイン、及び/又はケモカインをコードする核酸の組み込み(Xiang, et al.1995. Immunity, 2: 129-135;Kim, et al.1998. Eur. J. Immunol., 28: 1089-1103;Iwasaki, et al.1997.J. Immunol.158: 4591-3301;Sheerlinck, et al.2001.Vaccine, 19: 2647-2656)、CpGなどの刺激モチーフの組み込み(Gurunathan, supra; Leitner, supra)、エンドサイトーシス又はユビキチン処理経路の標的化のための配列(Thomson, et al.1998.J. Virol.72: 2246-2252;Velders, et al.2001.J. Immunol.166: 5366-5373)、プライムブーストレジメン(Gurunathan, supra; Sullivan, et al.2000.Nature, 408: 605-609;Hanke, et al.1998.Vaccine, 16: 439-445;Amara, et al.2001.Science, 292: 69-74)、プロテアソーム感受性切断部位、及びサルモネラ菌などの粘膜送達ベクターの使用(Darji, et al.1997.Cell, 91: 765-775;Woo, et al.2001.Vaccine, 19: 2945-2954)が挙げられる。他の方法が当技術分野で知られており、その幾つかを以下に説明する。核酸を宿主に導入するために首尾よく利用されてきたさまざまなウイルスベクターには、とりわけ、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、ヘルペスウイルス、及びポックスウイルスが含まれる。ベクターは、当技術分野で広く利用可能な標準的な組換え技法を使用して構築することができる。このような技法は、次のものなど、一般的な分子生物学の参考文献に見出すことができる:Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA)、及びPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990.Academic Press, San Diego, ca)。「非ウイルス性」プラスミドベクターもまた、ある特定の実施態様では適切でありうる。好ましいプラスミドベクターは、細菌、昆虫、及び/又は哺乳動物の宿主細胞と適合性がある。このようなベクターには、例えば、PCR-ii、PCR3、及びpcDNA3.1(Invitrogen社、米国カリフォルニア州サンディエゴ所在)、pBSii(Stratagene社、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在)、pet15(Novagen社、米国ウィスコンシン州マディソン所在)、pGEX(Pharmacia Biotech社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ所在)、pEGFp-n2(Clontech社、米国カリフォルニア州パロアルト所在)、pETl(Bluebacii、Invitrogen社)、pDSR-アルファ(国際公開第90/14363号)、及びpFASTBACdual(Gibco-BRL社、米国ニューヨーク州グランドアイランド所在)、並びにBluescript(登録商標)プラスミド誘導体(高コピー数COLe1ベースのファージミド、Stratagene Cloning Systems社、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在)、TAQ増幅PCR産物のクローニング用に設計されたPCRクローニングプラスミド(例えば、TOPO(商標)TAクローニング(登録商標)キット、PCR2.1(登録商標)プラスミド誘導体、Invitrogen社、米国カリフォルニア州カールスバッド所在)が含まれる。細菌ベクターも使用することができる。これらのベクターには、例えば、赤痢菌、サルモネラ菌、コレラ菌、乳酸桿菌、カルメット・ゲラン桿菌(BCG)、及び連鎖球菌が含まれる(例えば、国際公開第88/6626号;同第90/0594号;同第91/13157号;同第92/1796号;及び、同第92/21376号参照)。他の多くの非ウイルスプラスミド発現ベクター及び系が当技術分野で知られており、使用することができる。例えば、DNA-リガンド複合体、アデノウイルス-リガンド-DNA複合体、DNAの直接注入、CaPO4沈殿、遺伝子銃技法、エレクトロポレーション、及びコロイド分散系を含む他の送達技法もまた十分でありうる。コロイド分散系には、高分子錯体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含めた、脂質をベースとした系が含まれる。好ましいコロイド系は、インビトロ及びインビボでの送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞である、リポソームである。RNA、DNA、及び無傷のビリオンは、水性の内部にカプセル化され、生物学的に活性な形態で細胞に送達されうる(Fraley, R., et al., 1981, Trends Biochem.Sci., 6: 77)。リポソームの組成は、通常、リン脂質、特に高相転移温度のリン脂質の組合せであり、通常、ステロイド、とりわけコレステロールとの組合せである。他のリン脂質又は他の脂質も使用することができる。リポソームの物理的特性は、pH、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。リポソームの製造に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシドなどのホスファチジル化合物が含まれる。特に有用なものは、脂質部分が14~18個の炭素原子、特に16~18個の炭素原子を含み、かつ飽和している、ジアシルホスファチジルグリセロールである。例示的なリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。
ベクターを含む培養細胞も提供される。培養細胞は、該細胞が免疫原性ポリペプチドを発現する、細胞のベクター又は子孫を用いてトランスフェクトした培養細胞でありうる。適切な細胞株は当業者に知られており、例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)を通して市販されている。トランスフェクトされた細胞は、免疫原性ポリペプチドを産生する方法に使用することができる。該方法は、免疫原性ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、任意選択的に発現配列の制御下で、ベクターを含む細胞を培養することを含む。免疫原性ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製法を使用して、細胞又は培地から単離することができる。幾つかの実施態様では、本明細書に記載される結合剤は、活性剤にコンジュゲートして、HIVポリペプチドを発現する及び/又はHIV(及び/又は複数の特異性を有する結合剤の場合は別の抗原)の宿主となる細胞集団の機能を標的化及び阻害する、及び/又は細胞集団を排除することができる。例えば、複製能力のあるHIVを含むCD4+T-細胞集団を、結合剤/薬物複合体(例えば、抗体薬物複合体(ADC))を使用して標的化し、排除することができる。単一及び/又は二重特異性の候補結合剤は、1種類以上の薬物(例えば、DNAを損傷する薬物、微小管を標的とする薬物)とコンジュゲートさせることができる。本明細書に記載される結合剤及び/又はそれらの誘導体はまた、インビトロ及び/又はインビボでの使用のために機能性薬剤に接合及び/又はコンジュゲートさせることができる。例えば、結合剤を、細胞毒性薬又は毒素などの機能的部分、及び/又はそれらの活性断片、とりわけ、ジフテリアA鎖、外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンなどに接合及び/又はコンジュゲートさせることができる。適切な機能的部分はまた、放射性化学物質も含みうる。当技術分野の標準的な技法を使用して、抗体などの結合剤を、1つ以上の機能性薬剤に接合及び/又はコンジュゲートさせることができる。
幾つかの実施態様では、本開示は、LN02M結合剤によって結合されるエピトープ及び少なくとも1つの他の二次抗原(例えば、細胞表面タンパク質)が単一の結合剤によって結合されうるような複数の特異性を有する結合剤を提供する。幾つかの実施態様では、二次抗原は、感染性病原体に感染した細胞によって発現されるものでありうる。例えば、例示的な二次抗原は、gp41以外のHIV Env抗原でありうる。このような結合剤は、二次抗原に結合することができ、及び/又は本明細書に記載されるアッセイを使用して決定することができるように感染性病原体を中和するのに役立てることができる。本明細書に記載される1つ以上と当業者に利用可能な別のものなどとの結合剤の組合せもまた、本明細書で企図されている。例えば、幾つかの実施態様では、組合せは、他のものではなく、1つ以上の結合剤のみを使用して得られた結果(例えば、中和アッセイ)との統計的に有意な差を提供するために識別されうる。幾つかの実施態様では、組合せは、例えば、HIVの相加的、及び/又は、好ましくは相乗的な中和を示す。幾つかの実施態様では、組合せは、LN02M結合剤の特徴を有する(すなわち、LN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列を含む)第1の結合剤、及び/又はそれらの誘導体、並びに、次の1つ以上に記載される1つ以上の抗体を含みうる:米国特許第5,087,557号;同第5,298,419号;同第5,459,060号;同第5,693,752号;同第5,731,189号;同第5,753,503号;同第5,756,674号;同第5,777,074号;同第5,804,440号;同第5,831,034号;同第6,008,044号;同第7,774,887号(B2);米国特許出願公開第2003/0118985号(A1)、同第2007/0292390号(A1)、又は同第2014/0205612号(A1)の各明細書;国際公開第2002/032452号(A1)(例えば、gp41エピトープELDKWA、ELEKWA、ELNKWA、ELDEWAに結合);欧州特許第0335134号明細書 US176077(例えば、そこに記載されているマウスmAbのヒト化バージョン);ドイツ国特許出願公開第3932461号明細書(エピトープArg-Ile-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Leu-Lys-Try-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Serに対するmAb);Evans, et al. J. Immunol. 140(3): 941-3 (1988); Gorney, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1624-28 (1989); Teeuwsen, et al. (1990) AIDS Res. Hum. Retroviruses 6, 381-392; Earl, et al. J. Virol. 71(4): 2674-2684 (1997); Jiang, et al. J. Virol.72(12): 10213-17 (1998); Zwick, et al. J. Virol.75(22): 10892-10905 (2001); Eckert et al. PNAS USA, 98(20): 11187-11192 (2001); Louis, et al. J. Biol. Chem. 278(22): 20278-20285 (2003);及び/又は、Pietzsch, et al.J. Virol.84(10): 5032-42 (2010);これらはすべて、その全体が本明細書に組み込まれている。例えば、本明細書に記載される結合剤のいずれかは、とりわけ、2F5、4E10、及び/又はZ13e1、及び/又はそれらの誘導体として一般に知られている1つ以上の抗体と組み合わせる(すなわち、単一の組成物として、及び/又は組み合わせて使用する)ことができる。このような組成物の結合剤は、2つ以上の異なるモノクローナル抗体又はそれの誘導体などの異なる実体でありうるか、又は二官能性抗体(複数の結合特異性を含む単一の抗体又はその誘導体)などの同じ実体上に見出すことができる。本明細書に記載されるこのような組合せはまた、CTLA-4に対する抗体などの免疫細胞機能に影響を及ぼしうる1つ以上の他の薬剤と組み合わせることができる。当業者は、このような多くの組合せが本明細書に記載されるような使用に適しうることを認識するであろう。
上記のように、本明細書に記載されるHIV結合剤は、HIVによる感染の症状を治療及び/又は予防及び/又は改善するために使用することができる。当技術分野でよく知られているように、HIV分離株は現在、個別の遺伝子サブタイプに分類されている。HIV-1は、少なくとも10のサブタイプ(A1、A2、A3、A4、B、C、D、E、F1、F2、G、H、J、及びK)を含むことが知られている(Taylor et al, NEJM, 359(18):1965-1966 (2008))。HIV-2は、少なくとも5のサブタイプ(A、B、C、D、及びE)を含むことが知られている。サブタイプBは、世界中の同性愛者の男性及び静脈内薬物使用者におけるHIVの流行に関連している。ほとんどのHIV-1免疫原、実験室で適応された分離株、試薬、及びマッピングされたエピトープは、サブタイプBに属する。サハラ砂漠以南のアフリカ、インド、及び中国といった新しいHIV感染の発生率が高い地域では、HIV-1サブタイプBは感染のごく少数しか占めておらず、サブタイプHIV-1Cが最も一般的な感染サブタイプであるように思われる。これらのタイプの分離株のいずれも、本明細書に記載される結合剤を使用して対処することができる。1つ以上の結合剤はまた、例えば、プロテアーゼ阻害剤、HIV侵入阻害剤、逆転写酵素阻害剤、及び/又は抗レトロウイルスヌクレオシド類似体など、HIVを予防、治療、及び/又は改善するために用いられる1つ以上の薬剤と共に、又はそれらと併用して投与することができる。適切な化合物には、例えば、アゲネラーゼ(アンプレナビル)、コンビビル(レトロビル/エピビル)、クリキシバン(インジナビル)、エムトリバ(エムトリシタビン)、エピビル(3tc/ラミブジン)、エプジコム、フォートバーゼ/インビラーゼ(サキナビル)、フゼオン(エンフビルチド)、ハイビッド(ddc/ザルシタビン)、カレトラ(ロピナビル)、レクシヴァ(ホスアンプレナビル)、ノービア(リトナビル)、レスクリプタ(デラビルジン)、レトロビル/AZT(ジドブジン)、レイアタッツ(アタザナビル、BMS-232632)、サスティバ(エファビレンツ)、トリジビル(アバカビル/ジドブジン/ラミブジン)、トルバダ(エムトリシタビン/テノフォビルDF)、ビデックス(ddI/ジダノシン)、ビデックスEC(ddI、ジダノシン)、ビラセプト(ネビラピン)、ビレッド(テノホビルジソプロキシルフマル酸塩)、ゼリット(d4T/スタブジン)、及びザイアジェン(アバカビル)が含まれる。他の適切な薬剤は当業者に知られており、本明細書に記載される使用に適切でありうる。このような薬剤は、結合剤の投与前、投与中、又は投与後に、及び/又は本明細書に記載される方法の使用のいずれかで使用することができる。
当業者は、本明細書に記載される結合剤(例えば、抗体)を使用して、それに結合するタンパク質を含む生物学的サンプルを同定するための多くの適切な技法を有している。例えば、抗体は、例えば免疫沈降又は他の捕捉型アッセイを使用して、HIV又はHIVを含む細胞及び/又はHIV抗原を発現する細胞を単離するために利用することができる。このよく知られている技法は、固体支持体又はクロマトグラフィ材料(例えば、プロテインA、プロテインG、及び/又はプロテインLでコーティングされたビーズ)に抗体を付着させることによって行われる。次に、結合した抗体は、HIV抗原(例えば、HIV感染細胞)を含むか、又は含むと考えられる溶液に導入される。次に、(一又は複数の)HIV抗原は抗体に結合することができ、(一又は複数の)HIV抗原が抗体に結合したまま維持される条件下で、結合していない材料が洗い流される。次に、結合したタンパク質を抗体から分離し、必要に応じて分析することができる。抗体を使用してタンパク質を単離するための同様の方法は、当技術分野でよく知られている。結合剤(例えば、抗体)はまた、生物学的サンプル内のHIV又はHIV抗原を検出するために利用することもできる。例えば、抗体は、例えば、フローサイトメトリ分析、ELISA、イムノブロッティング(例えば、ウエスタンブロット)、インサイチュ検出、免疫細胞化学、及び/又は免疫組織化学などのアッセイに使用することができる。このようなアッセイを行う方法は、当技術分野でよく知られている。幾つかの実施態様では、結合剤は、1つ以上の検出可能な標識に接合及び/又はコンジュゲートされうる。例として、適切な検出可能な標識には、例えば、フルオレセイン(例えば、DyLight、Cy3、Cy5、FITC、HiLyte Fluor555、HiLyte Fluor647;5-カルボキシ-2,7-ジクロロフルオレセイン;5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM);5-HAT(ヒドロキシトリプタミン);5-ヒドロキシトリプタミン(HAT);6-JOE;6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM);FITC;6-カルボキシ-1,4-ジクロロ-2’,7’-ジクロロフルオレセイン(TET);6-カルボキシ-1,4-ジクロロ-2’,4’、5’、7’-テトラクロロフルオレセイン(HEX);6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’、7’-ジメトキシフルオレセイン(JOE);Alexa fluor(例えば、350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750);BODIPYフルオロフォア(例えば、492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-X、650/665-X、665/676、FL、FL ATP、FI-セラミド、R6G SE、TMR、TMR-Xコンジュゲート、TMR-X、SE、TR、TR ATP、TR-X SE))、ローダミン(例えば、110、123、B、B200、BB、BG、Bエクストラ、5-カルボキシテトラメチルローダミン(5-TAMRA)、5GLD、6-カルボキシローダミン6G、リサミン、リサミンローダミンB、ファリシジン、ファロイジン、レッド、Rhod-2、ROX(6-カルボキシ-X-ローダミン)、5-ROX(カルボキシ-X-ローダミン)、スルホローダミンB can C、スルホローダミンGエクストラ、TAMRA(6-カルボキシテトラメチルローダミン)、テトラメチルローダミン(TRITC)、WT)、テキサスレッド、及び/又はテキサスレッド-Xが含まれうる。当技術分野で知られている他の検出可能な標識もまた、使用に適している可能性がある。当技術分野の標準的な技法を使用して、抗体などの結合剤を、1つ以上の検出可能な標識に接合及び/又はコンジュゲートさせることができる。
本明細書に記載される結合剤はまた、患者における病状の存在を決定するため、予後を予測するため、若しくは化学療法又は他の治療レジメンの有効性を決定するために使用することもできる。本明細書に記載されるように、又は当技術分野で知られている他の方法のように実施される発現プロファイルアッセイを使用して、例えば、細胞におけるHIVの発現の相対レベルを決定することができる。次に、発現レベルをベース(例えば、対照)レベルと相関させて、特定の疾患が患者内に存在するかどうか、患者の予後、又は特定の治療レジメンが有効であるかどうかを決定することができる。例えば、患者が特定の抗感染症レジメンで治療されている場合、患者の組織(例えば、血漿)でのHIVの発現レベルの増加又は減少は、レジメンがその宿主でのHIVの負荷を悪化又は改善していることを示唆しうる。発現の増加又は減少は、レジメンが所望の効果を有する又は有しないことを示唆し、したがって、別の治療法を選択することができる。
本明細書に記載される結合剤を、例えば新薬候補を試験するための薬物スクリーニングアッセイにおける試薬として使用することも可能である。これらの試薬を使用して、細胞株、若しくは患者の細胞又は組織における免疫原性標的の発現に対する薬物候補の効果を確認することができる。発現プロファイリング技法をハイスループットスクリーニング技法と組み合わせて、有用な化合物の迅速な特定を可能にし、薬物候補による治療の有効性をモニタすることができる(例えば、Zlokarnik, et al., Science 279, 84-8 (1998)参照)。薬物候補は、天然に存在するか合成的に誘導されるかにかかわらず、化合物、核酸、タンパク質、抗体、又はそれらに由来する誘導体でありうる。このように特定された薬物候補は、とりわけ、患者への投与のための又はさらなるスクリーニングアッセイでの使用のための医薬組成物として利用することができる。
幾つかの実施態様では、結合剤は精製された形態である。「精製された」結合剤(例えば、抗体)は、それが最初に見出されるタンパク質及び/又は他の成分(例えば、モノクローナル抗体の場合、ハイブリドーマ上清又は腹水調製物の一部として)の少なくとも約50%から分離されたものでありうる。精製された結合剤(例えば、抗体)は、それが最初に見出されるタンパク質及び/又は他の成分の少なくとも約50%、60%、75%、90%、又は95%から分離されたものでありうる。
本明細書に記載される結合剤(例えば、ポリペプチド、抗体)及び核酸はまた、宿主に投与する前に、1つ以上の薬学的に許容される担体と組み合わせることができる。薬学的に許容される担体は、生物学的又は他の望ましくない材料ではなく、例えば、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、あるいはそれが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用することなく、材料を対象に投与することができる。当業者によく知られているように、担体は、有効成分の分解を最小限に抑え、かつ対象における有害な副作用を最小限に抑えるように自然に選択されるであろう。適切な医薬担体及びそれらの製剤は、例えば、Remington’s: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005)に記載されている。典型的には、製剤を等張にするために、適切な量の薬学的に許容される塩が製剤に使用される。薬学的に許容される担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リンゲル液などの緩衝液、及びデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のpHは、概して、約5~約8、又は約7~約7.5である。他の担体には、ポリペプチド又はそれらの断片を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスなどの徐放性調製物が含まれる。マトリクスは、成形品、例えば、膜、リポソーム、又は微粒子の形態でありうる。例えば投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、ある特定の担体がより好ましい可能性があることは、当業者にとって明らかであろう。担体は、ポリペプチド及び/又はそれらの断片をヒト又は他の対象に投与するのに適したものである。医薬組成物はまた、免疫原性ポリペプチドに加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、アジュバント、免疫刺激剤も含みうる。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、及び麻酔薬などの1つ以上の有効成分も含みうる。医薬組成物は、従来の薬学的に許容される担体、アジュバント、及びビヒクルを含む投薬単位製剤で、経口、非経口、吸入スプレーによって、直腸、節内、又は局所的に、投与することができる。本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」又は「生理学的に許容される担体」という用語は、医薬組成物としての核酸、ポリペプチド、又はペプチドの送達を達成又は増強するのに適した1つ以上の製剤材料を指す。「医薬組成物」は、治療的有効量の核酸又はポリペプチドを含む組成物である。「有効量」及び「治療的有効量」という用語はそれぞれ、所望の治療効果(例えば、HIVの排除)を観察するために用いられる結合剤、核酸などの量を指す。
少なくとも1つ以上の有効量の本明細書に記載される1つ以上の結合剤(及び/又はそれらの(一又は複数の)誘導体)を哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物宿主における1つ以上の病状(例えば、HIV又はがん)を治療するための方法もまた提供される。幾つかの実施態様では、結合剤は、LN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列のうちの1つ以上を含む、モノクローナル抗体若しくはそれらの断片又は誘導体である(すなわち、LN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列を含む)。1つ以上の結合剤は、約1~約50mg/kg、約1~約30mg/kg、又は約5~約30mg/kgの投与量(例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、又は40mg/kgのいずれか)で投与することができる。ある特定の実施態様では、1つ以上の結合剤は、哺乳動物(例えば、皮内、静脈内、経口、直腸)に約10mg/kgで1回以上投与することができる。複数回用量が投与される場合、用量は、各用量においてほぼ同じ又は異なる量の結合剤を含みうる。用量はまた、同じ又は異なる間隔で、互いに時間的に分離されてもよい。例えば、用量は、約6、12、24、36、48、60、72、84、又は96時間、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、1.5年、2年、3年、4年、5年、又はこれらの期間の前後及び/又は間の任意の期間によって分離されうる。幾つかの実施態様では、結合剤は、他の薬剤(例えば、抗感染剤及び/又は化学療法剤)と併用して投与することができる。このような他の薬剤は、結合剤とほぼ同時に、又は異なる時間及び/又は頻度で投与することができる。このような方法の他の実施態様もまた、当業者によって容易に決定することができるように適切でありうる。
本明細書に記載される抗体などの結合剤を使用する際に当業者を支援するために、同じものをキット形式で提供することができる。1つ以上のこのような結合剤、並びに任意選択的にそれを使用してHIVを発現する細胞を検出するために必要な他の成分を含むキットもまた提供される。キットの結合剤は、凍結、凍結乾燥、若しくはTBS又はPBSなどの薬学的に許容される緩衝液を含む、任意の適切な形態で提供されうる。キットには、緩衝液(例えば、TBS、PBS)、ブロッキング剤(脱脂粉乳、通常の血清、Tween-20洗剤、BSA、又はカゼインを含む溶液)、及び/又は検出試薬(例えば、ヤギ抗マウスIgGビオチン、ストレプトアビジン-HRPコンジュゲート、アロフィコシアニン、B-フィコエリトリン、R-フィコエリトリン、ペルオキシダーゼ、検出可能な標識、並びに他の標識及び/又は染色キット(例えば、ABC染色キット、Pierce))など、結合剤のインビトロ又はインビボでの利用に必要な他の試薬も含まれうる。キットはまた、例えば、フローサイトメトリ分析、ELISA、イムノブロッティング(例えば、ウエスタンブロット)、インサイチュ検出、免疫細胞化学、及び/又は免疫組織化学など、上述した一般的に利用されるアッセイで抗体を使用するための他の試薬及び/又は説明書も含みうる。一実施態様では、キットは、結合剤を精製された形態で提供する。別の実施態様では、結合剤は、単独で、又はアビジン-コンジュゲート検出試薬(例えば、抗体)と共に、ビオチン化された形態で提供されうる。別の実施態様では、キットには、HIVを直接検出するために使用することができる1つ以上の検出可能な標識を含む結合剤が含まれる。これらの系のいずれかを使用するために必要とされる緩衝液などは、当技術分野でよく知られており、及び/又はエンドユーザが調製することができるか、又はキットの構成要素として提供されうる。キットには、陽性対照及び陰性対照のタンパク質及び/又は組織サンプルを含有する固体支持体も含まれうる。例えば、スポッティング又はウエスタンブロットタイプのアッセイを実施するためのキットには、SDS-PAGEで使用するための対照細胞又は組織溶解物、若しくは実験サンプル用の追加スペースを備えた事前に固定された対照サンプルを含有するナイロン又は他の膜が含まれていてもよい。スライド上の細胞におけるHIVを視覚化するためのキットには、実験サンプル用の追加スペースを備えた対照細胞又は組織サンプルを含有する、事前にフォーマットされたスライドが含まれていてもよい。当業者に理解されるように、キットの他の実施態様も本明細書において企図されている。
したがって、本開示は、HIV(例えば、及び/又はそれらの抗原)に対する特異性を有するLN02抗体などの結合剤を提供する。幾つかの実施態様では、結合剤は、1つ以上のLN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。幾つかの実施態様では、結合剤は、LN02M可変領域及び/又はCDR及び/又は非CDRアミノ酸配列のうちの1つ以上の組合せを含む、ポリペプチドである。幾つかの実施態様では、結合剤は抗体である。幾つかの実施態様では、結合剤は、図1の結合剤(例えば、抗体又はそれらの誘導体)のいずれかに示される重鎖及び/又は軽鎖CDR及び/又は追加のアミノ酸配列;図6Aから6Eに示される可変領域;図7Aから7Dの重鎖突然変異体;図8Aから8Fの軽鎖突然変異体;配列番号3~92、95~233、248~482、又は491~699のいずれか1つ以上;及び/又は、それらの保存的に置換された変異体;及び/又は、本明細書に記載されるそれらの非保存的に置換された変異体を含む、抗体などのポリペプチドである。
幾つかの実施態様では、結合剤は、HIV-1Envのgp120/gp41界面の近くにあるアミノ酸残基(配列番号237で下線が引かれている、対応する残基)を含むエピトープに対して特異性を有する。幾つかの実施態様では、本開示の結合剤は、102~100μg/ml、又は100~101μg/mlの濃度で、少なくとも約50%に対する上述した中和特性(対照ウイルスにはない)、及び/又は25μg/ml未満のIC50又はIC80におけるHIV-1偽ウイルスを中和する能力とともに、これらの結合特性のいずれか1つ以上を含みうる。
幾つかの実施態様では、結合剤は、ヒト抗体、ヒトIgG、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG2a、ヒトIgG2b、ヒトIgG3、ヒトIgG4、ヒトIgM、ヒトIgA、ヒトIgA1、ヒトIgA2、ヒトIgD、ヒトIgE、イヌ抗体、イヌIgGA、イヌIgGB、イヌIgGC、イヌIgGD、ニワトリ抗体、ニワトリIgA、ニワトリIgD、ニワトリIgE、ニワトリIgG、ニワトリIgM、ニワトリIgY、ヤギ抗体、ヤギIgG、マウス抗体、マウスIgG、ブタ抗体、及び/又はラット抗体、及び/又はそれらの誘導体に由来するか、又はそれらに関連する(例えば、配列又は誘導によって)。幾つかの実施態様では、誘導体は、Fab、Fab2、Fab’一本鎖抗体、Fv、一本鎖、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三量体抗体、多重特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ-ヒトキメラ抗体、イヌ-マウスキメラ抗体、イヌFcを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化抗体、CDRグラフト化抗体、サメ抗体、ナノボディ、及び/又はラクダ抗体からなる群より選択されうる。幾つかの実施態様では、結合剤は、少なくとも第1及び第2の特異性を含み、第1の特異性はHIV gp41に対するものであり、第2の特異性は異なる抗原(例えば、HIV(例えば、env)などの感染性病原体の抗原及び/又は腫瘍抗原)に対するものである。幾つかの実施態様では、結合剤及び/又はその誘導体は、それに固定可能に取り付けられた検出可能な標識を含みうる。幾つかの実施態様では、結合剤のいずれか1つ及び/又はそれらの誘導体は、それに固定的に結合されたエフェクタ部分(例えば、細胞毒性薬、毒素、ジフテリアA鎖、外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン、及び放射性化学物質)を含む。幾つかの実施態様では、1つ以上の結合剤をコードするポリヌクレオチドも提供される(例えば、発現ベクターとして)。このようなポリヌクレオチドのポリペプチド産生物を含む及び/又は発現する宿主細胞もまた提供される。幾つかの実施態様では、少なくとも1つの結合剤又は誘導体;少なくとも1つの単離されたポリヌクレオチド;少なくとも1つの発現ベクター;及び/又は、少なくとも1つの宿主細胞;又はそれらの組合せ;及び、薬学的に許容される担体を含む組成物も提供される。
本開示はまた、細胞上のHIVを検出する方法も提供し、該方法は、試験する生物学的サンプルを本明細書に記載される結合剤又は誘導体と接触させるステップ、及び生物学的サンプル又はそれらの成分に結合した結合剤を検出するステップを含む。このような方法は、インビボの方法であってもインビトロの方法であってもよい。幾つかの実施態様では、該方法は、試験する生物学的サンプル又はそれらの成分に結合する量を対照の生物学的サンプル又はそれらの成分に結合する量と比較するステップを含むことができ、ここで、対照の生物学的サンプル又はそれらの成分と比較した、試験する生物学的サンプル又はそれらの成分への結合の増加は、試験する生物学的サンプル(例えば、哺乳動物の血液)におけるHIVポリペプチドを発現する細胞の存在を示唆する。幾つかの実施態様では、細胞内又は細胞上でのHIVの発現を検出するためのキットであって、該キットは、結合剤又はそれらの誘導体と使用説明書とを含む。幾つかの実施態様では、結合剤及び/又はその誘導体は、凍結乾燥形態である。幾つかの実施態様では、本開示は、結合剤又はそれらの誘導体を含む医薬組成物の少なくとも1つの有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における感染症、がん、及び/又は自己免疫を治療、予防、及び/又は緩和する方法を提供する。幾つかの実施態様では、感染症はヒト免疫不全ウイルス(HIV)である。幾つかの実施態様では、複数回用量が動物に投与される。幾つかの実施態様では、結合剤及び/又はその誘導体は、約1~50mg/kgの投与量で投与することができる。
幾つかの実施態様では、本開示は、図6Aから6Eに示される可変領域;図7Aから7D及び/又は図8Aから8Fのいずれかの突然変異体のアミノ酸配列、及びそれらのいずれかの有効な(例えば、HIVの中和)組合せ;配列番号3~92、95~233、248~482、又は491~699のいずれか1つ以上、及びそれらのいずれかの有効な(例えば、HIVの中和)組合せ;表9に示される軽鎖と重鎖との組合せ(すなわち、ML085、Mx152、MX067、MX129、MX130、ML126、Mx175、Mx176、及びMx181);表10Aから10C、表11、表12Aから12D、表13Aから13D、又は表14に示される軽鎖と重鎖との組合せ;並びに、それらの変異体を含む、(一又は複数の)結合剤を提供する。本開示は、結合剤(例えば、抗体などのポリペプチド)、又はそれらの組合せを提供し、該結合剤は、次のものを含む:a)図1に示される少なくとも1つのCDR(すなわち、本明細書に示されるアミノ酸置換の1つ以上、又はすべてを含む、本明細書に示されるLN02 bNab重鎖又はLN02 bNab軽鎖のCDR1、CDR2、及び/又はCDR3に対応するアミノ酸配列);b)好ましくはその1つ以上のCDR(図6Dの配列番号1のLN02_軽鎖アミノ酸配列の下線が引かれているCDR)を含む、配列番号3~92又は491~699からなる群より選択されるアミノ酸配列;c)好ましくはその1つ以上のCDR(図6Aの配列番号93のLN02_重鎖アミノ酸配列の下線が引かれているCDR)を含む、配列番号95~233又は248~482からなる群より選択されるアミノ酸配列;d)MH01(配列番号95)、MH16(配列番号110)、MH22(配列番号116)、MH26(配列番号120)、MH30(配列番号124)、MH32(配列番号126)、MH35(配列番号129)、MH36(配列番号130)、MH37(配列番号131)、MH43(配列番号136)、MH44(配列番号137)、MH48(配列番号141)、MH49(配列番号142)、MH50(配列番号143)、MH51(配列番号144)、MH53(配列番号146)、MH59(配列番号151)、MH61(配列番号153)、MH64(配列番号156)、MH68(配列番号159)、MH73(配列番号163)、MH84(配列番号174)、MH89(配列番号177)、MH91(配列番号178)、MH92(配列番号179)、MH106(配列番号193)、MH107(配列番号194)、MH108(配列番号195)、MH111(配列番号198)、MH112(配列番号199)、MH115(配列番号202)、MH119(配列番号206)、MH120(配列番号207)、MH124(配列番号211)、MH131(配列番号218)、MH135(配列番号222)、MH136(配列番号223)、MH138(配列番号225)、及び/又はMH146(配列番号232)を含む可変重鎖領域;e)ML01(配列番号3)、ML02(配列番号4)、ML05(配列番号7)、ML08(配列番号10)、ML10(配列番号12)、ML11(配列番号13)、ML12(配列番号14)、ML31(配列番号31)、ML32(配列番号32)、ML44(配列番号42)、ML49(配列番号47)、ML51(配列番号48)、ML52(配列番号49)、ML60(配列番号56)、ML71(配列番号66)、ML73(配列番号68)、ML74(配列番号69)、ML79(配列番号74)、ML84(配列番号79)、ML85(配列番号80)、ML92(配列番号87)、又はML94(配列番号89)を含む可変軽鎖領域;f)上記a)、b)、c)、d)、又はe)のCDR、アミノ酸配列、可変重鎖領域、及び/又は可変軽鎖領域の組合せ;g)表4、表9、表10Aから10C、表11、表12Aから12D、表13Aから13D、又は表14に記載されるLN02M可変軽鎖(「軽鎖突然変異体」)とLN02M可変重鎖(「重鎖突然変異体」)との組合せ;h)ML01(配列番号3)を含むLN02M可変軽鎖と、MH02(配列番号96)、MH04(配列番号98)、MH22(配列番号116)、MH23(配列番号117)、MH30(配列番号124)、MH31(配列番号125)、MH35(配列番号129)、MH36(配列番号130)、及び/又はMH37(配列番号131)を含むLN02M可変重鎖との組合せ;i)LN02M可変軽鎖のML12(配列番号14)と、MH02(配列番号96)、MH04(配列番号98)、MH22(配列番号116)、MH23(配列番号117)、MH30(配列番号124)、MH31(配列番号125)、MH35(配列番号129)、MH36(配列番号130)、及び/又はMH37(配列番号131)を含むLN02M可変重鎖との組合せ;j)LN02M可変軽鎖のML23(配列番号24)と、MH31(配列番号125)、MH43(配列番号136)、MH48(配列番号141)、及びMH51(配列番号144)を含むLN02M可変重鎖との組合せ;k)LN02M可変軽鎖のML30(配列番号30)と、MH31(配列番号125)、MH43(配列番号136)、MH48(配列番号141)、又はMH51(配列番号144)を含むLN02M可変重鎖との組合せ;l)LN02M可変軽鎖のML31(配列番号31)と、MH02(配列番号96)、MH04(配列番号98)、MH22(配列番号116)、MH23(配列番号117)、MH30(配列番号124)、MH31(配列番号125)、MH35(配列番号129)、MH36(配列番号130)、MH37(配列番号131)、MH43(配列番号136)、MH48(配列番号141)、又はMH51(配列番号144)を含むLN02M可変重鎖との組合せ;m)LN02M可変軽鎖のML32(配列番号32)とLN02M可変重鎖のMH31(配列番号125)との組合せ;n)LN02M可変軽鎖のML85(配列番号80)と、MH31(配列番号125)、MH35(配列番号129)、MH43(配列番号136)、MH49(配列番号142)、MH60(配列番号152)、MH76(配列番号166)、MH111(配列番号198)、又はMH112(配列番号199)を含むLN02M可変重鎖との組合せ;o)表9に示される軽鎖及び重鎖置換の組合せであって、任意選択的に、軽鎖のK93Y置換と野生型LN02重鎖とを含むML085;野生型LN02の軽鎖上のK93Y及びE95Q置換と野生型LN02の重鎖上のS19H置換とを含むMx152;野生型LN02の軽鎖上のK93Y置換と野生型LN02の重鎖上のS19H置換とを含むMX067;野生型LN02の軽鎖上のK93Y及びT29S置換と野生型LN02の重鎖上のS19H置換とを含むMX129;野生型LN02の軽鎖上のK93Y及びT29S置換と野生型LN02重鎖に対するT21Y置換とを含むMX130;野生型LN02の軽鎖上のK93Y及びE95Q置換と野生型LN02重鎖とを含むML126;野生型LN02の軽鎖上のK93Y及びI97V置換と野生型LN02の重鎖上のS40A、Q42R、及びT44G置換とを含むMx175;野生型LN02の軽鎖上のK93Y及びI97V置換と野生型LN02の重鎖上のS40P、Q42R、G43K、及びT44G置換とを含むMx176;並びに、野生型LN02の軽鎖上のK93Y及びI97V置換と野生型LN02の重鎖上のS40P、Q42R、G43K、及びT44G置換とを含むMx181の結合剤からなる群より選択される、組合せ;及び/又は、p)a)からo)のいずれかの保存的に置換された変異体;及び/又は、q)a)からp)のいずれかのCDRアミノ酸配列の外側の1つ以上のアミノ酸置換、又はa)からp)のいずれかのCDRアミノ酸配列内の1つから3つの置換を含む、非保存的に置換された変異体;LN02と比較して中和活性が少なくとも2倍向上し、ML085と比較して同等又は改善された効力を示す、上記a)からp)のいずれかを含む、結合剤、好ましくは抗体。好ましい実施態様では、このような結合剤は、インビトロのHIV中和アッセイ及び/又はインビボで、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)を中和する。幾つかの実施態様では、結合剤は、インビトロHIV中和アッセイにおいて、102から100μg/ml、又は100から101μg/mlの間の濃度で、HIV-1偽ウイルスBJOX(CRF07_BC)、CE1176、TRO.11(B)、X1632(G)、CH119(CRF07_BC)、CNE55(CRF01_AE)、25710(C)、CD0217(C)の中和を示す。幾つかの実施態様では、中和率は、少なくとも約50%以上である。幾つかの実施態様では、結合剤は、25μg/ml未満のIC50又はIC80で、試験されるHIV-1偽ウイルスの大部分を中和する。幾つかの実施態様では、結合剤は抗体であり、好ましい実施態様ではモノクローナル抗体であり、さらになお好ましい実施態様ではヒトモノクローナル抗体であるか、又はそれらの誘導体である。幾つかの実施態様では、抗体のアイソタイプはIgG1又はIgG3である。幾つかの好ましい実施態様では、結合剤は、図1に示される(すなわち、下線が引かれたLN02 bNab重鎖のCDR1、CDR2、又はCDR3、及びその中に示される、それらに対する置換に対応する)、及び/又は配列番号95~233のいずれかに記載される、少なくとも1つの重鎖CDRアミノ酸配列;及び/又はそれらの保存的に置換された変異体を含む。幾つかの好ましい実施態様では、結合剤は、図1(すなわち、下線が引かれたLN02 bNab軽鎖のCDR1、CDR2、又はCDR3、及びその中に示される、それらに対する置換に対応する)、及び/又は配列番号3~92のいずれかに記載される、少なくとも1つの軽鎖CDRアミノ酸配列;及び/又は、上に記載される、それらの保存的に置換された変異体;及び/又はそれらの非保存的に置換された変異体を含む。幾つかの好ましい実施態様では、結合剤は、配列番号3~92及び/又は95~233からなる群より選択される少なくとも1つの可変鎖アミノ酸配列;及び/又は、上に記載される、それらの保存的に置換された変異体;及び/又はそれらの非保存的に置換された変異体を含む。幾つかの実施態様では、結合剤は、ヒト抗体、ヒトIgG、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、ヒトIgG4、ヒトIgM、ヒトIgA、ヒトIgA1、ヒトIgA2、ヒトIgD、ヒトIgE、イヌ抗体、イヌIgGA、イヌIgGB、イヌIgGC、イヌIgGD、ニワトリ抗体、ニワトリIgA、ニワトリIgD、ニワトリIgE、ニワトリIgG、ニワトリIgM、ニワトリIgY、ヤギ抗体、ヤギIgG、マウス抗体、マウスIgG、ブタ抗体、ラット抗体、又はラクダ抗体に由来するか、あるいは、それらをベースとしている(例えば、それらのフレームワーク配列を含む)。幾つかの実施態様では、本開示は、このような結合剤の誘導体、例えば、Fab、Fab2、Fab’一本鎖抗体、Fv、一本鎖、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三量体抗体、多重特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ-ヒトキメラ抗体、イヌ-マウスキメラ抗体、イヌFcを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化抗体、CDRグラフト化抗体、サメ抗体、ナノボディ、及びラクダ抗体からなる群より選択されるものを提供する。幾つかの実施態様では、結合剤又はその誘導体は、少なくとも第1及び第2の特異性を含み、第1の特異性はgp41に対するものであり、第2の特異性は異なる抗原に対するものである。幾つかの実施態様では、結合剤又はそれらの誘導体は、それに固定的に結合された1つ以上の検出可能な標識を含む(例えば、フルオレセイン、DyLight、Cy3、Cy5、FITC、HiLyte Fluor555、HiLyt
e Fluor647、5-カルボキシ-2,7-ジクロロフルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン、5-FAM、ヒドロキシトリプタミン、5-ヒドロキシトリプタミン(5-HAT)、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)、FITC、6-カルボキシ-1,4-ジクロロ-2’,7’-ジクロロフルオレセイン(TET)、6-カルボキシ-1,4-ジクロロ-2’,4’,5’,7’-テトラクロロフルオレセイン(HEX)、6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン(6-JOE)、Alexa fluor、Alexa fluor350、Alexa fluor405、Alexa fluor430、Alexa fluor488、Alexa fluor500、Alexa fluor514、Alexa fluor532、Alexa fluor546、Alexa fluor555、Alexa fluor568、Alexa fluor594、Alexa fluor610、Alexa fluor633、Alexa fluor635、Alexa fluor647、Alexa fluor660、Alexa fluor680、Alexa fluor700、Alexa fluor750、BODIPYフルオロフォア、BODIPY492/515、BODIPY493/503、BODIPY500/510、BODIPY505/515、BODIPY530/550、BODIPY542/563、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODIPY581/591、BODIPY630/650-X、BODIPY650/665-X、BODIPY665/676、FL、FL ATP、FI-セラミド、R6G SE、TMR、TMR-Xコンジュゲート、TMR-X、SE、TR、TR ATP、TR-X SE、ローダミン、ローダミン110、ローダミン123、ローダミンB、ローダミンB200、ローダミンBB、ローダミンBG、ローダミンBエクストラ、5-カルボキシテトラメチルローダミン(5-TAMRA)、5GLD、6-カルボキシローダミン6G、リサミン、リサミンローダミンB、ファリシジン、ファロイジン、ローダミンレッド、Rhod-2、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、カルボキシ-X-ローダミン(5-ROX)、スルホローダミンB can C、スルホローダミンGエクストラ、6-カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミン(TRITC)、ローダミンWT、テキサスレッド、及びテキサスレッド-Xからなる群より選択される)。幾つかの実施態様では、結合剤又はその誘導体は、それに固定的に結合された1つ以上のエフェクタ部分(例えば、細胞毒性薬、毒素、ジフテリアA鎖、外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン、及び放射性化学物質からなる群より選択される)を含む。
e Fluor647、5-カルボキシ-2,7-ジクロロフルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン、5-FAM、ヒドロキシトリプタミン、5-ヒドロキシトリプタミン(5-HAT)、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)、FITC、6-カルボキシ-1,4-ジクロロ-2’,7’-ジクロロフルオレセイン(TET)、6-カルボキシ-1,4-ジクロロ-2’,4’,5’,7’-テトラクロロフルオレセイン(HEX)、6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン(6-JOE)、Alexa fluor、Alexa fluor350、Alexa fluor405、Alexa fluor430、Alexa fluor488、Alexa fluor500、Alexa fluor514、Alexa fluor532、Alexa fluor546、Alexa fluor555、Alexa fluor568、Alexa fluor594、Alexa fluor610、Alexa fluor633、Alexa fluor635、Alexa fluor647、Alexa fluor660、Alexa fluor680、Alexa fluor700、Alexa fluor750、BODIPYフルオロフォア、BODIPY492/515、BODIPY493/503、BODIPY500/510、BODIPY505/515、BODIPY530/550、BODIPY542/563、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODIPY581/591、BODIPY630/650-X、BODIPY650/665-X、BODIPY665/676、FL、FL ATP、FI-セラミド、R6G SE、TMR、TMR-Xコンジュゲート、TMR-X、SE、TR、TR ATP、TR-X SE、ローダミン、ローダミン110、ローダミン123、ローダミンB、ローダミンB200、ローダミンBB、ローダミンBG、ローダミンBエクストラ、5-カルボキシテトラメチルローダミン(5-TAMRA)、5GLD、6-カルボキシローダミン6G、リサミン、リサミンローダミンB、ファリシジン、ファロイジン、ローダミンレッド、Rhod-2、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、カルボキシ-X-ローダミン(5-ROX)、スルホローダミンB can C、スルホローダミンGエクストラ、6-カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミン(TRITC)、ローダミンWT、テキサスレッド、及びテキサスレッド-Xからなる群より選択される)。幾つかの実施態様では、結合剤又はその誘導体は、それに固定的に結合された1つ以上のエフェクタ部分(例えば、細胞毒性薬、毒素、ジフテリアA鎖、外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン、及び放射性化学物質からなる群より選択される)を含む。
幾つかの実施態様では、本開示は、このような(一又は複数の)結合剤のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチド、それを含む発現ベクター、及び/又はそれを含む宿主細胞を提供する。幾つかの実施態様では、本開示は、少なくとも1つのこのような結合剤及び/又はその誘導体、それをコードする少なくとも1つの単離されたポリヌクレオチド;それをコードする少なくとも1つの発現ベクター、及び/又は、それを産生することができる少なくとも1つの宿主細胞(例えば、少なくとも1つのこのようなポリヌクレオチド及び/又は発現ベクターを含む)、及び/又はそれらの組合せ;並びに、薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様では、本開示はまた、結合剤及び/又はその誘導体を製造する方法も提供する。幾つかの実施態様では、このような製造方法は、宿主細胞において本開示の結合剤及び/又はその誘導体をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを発現するステップ、及び標準的な技法を使用して、宿主細胞、その細胞培養上清などからそれを精製するステップ(例えば、標準的な技法を使用して当業者が決定して、90%、95%、99%、又は100%の純度まで)を含む。
幾つかの実施態様では、本開示は、試験する生物学的サンプルを本開示の結合剤又は誘導体と接触させるステップ、及び生物学的サンプル又はそれらの成分に結合した結合剤を検出するステップを含む、細胞上のHIVを検出する方法を提供する。幾つかの実施態様では、このような方法は、試験する生物学的サンプル又はそれらの成分に結合する量を対照の生物学的サンプル又はそれらの成分に結合する量と比較するステップを含み、ここで、対照の生物学的サンプル又はそれらの成分と比較した、試験する生物学的サンプル又はそれらの成分への結合の増加は、試験する生物学的サンプルにおけるHIVを発現する細胞の存在を示唆する。幾つかの実施態様では、試験する生物学的サンプルは、哺乳動物の血液又はその成分を含むか、哺乳動物の血液又はその成分であるか、あるいは、哺乳動物の血液又はその成分に由来する。幾つかの実施態様では、該方法はインビボでの方法であるか、あるいは、該方法はインビトロでの方法である。幾つかの実施態様では、本開示は、本開示の結合剤及び/又はその誘導体を含む医薬組成物の少なくとも1つの有効量を哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物におけるHIV感染及び/又はAIDSを治療、予防、及び/又は緩和する方法を提供する。幾つかの実施態様では、このような医薬組成物の複数回用量が、動物に投与される。幾つかの実施態様では、結合剤及び/又はその誘導体は、約1~50mg/kgの投与量で投与することができる。幾つかの実施態様では、本開示は、細胞内又は細胞上でのHIVの発現を検出するためのキットを提供し、該キットは、本開示の結合剤及び/又はその誘導体と、任意選択的に使用説明書とを含む。このような幾つかの実施態様では、結合剤、抗体、又は誘導体は、凍結乾燥形態でありうる。
「約」、「おおよそ」などの用語は、数値又は範囲のリストの前(後)に置かれる場合、そのリスト又は範囲の個々の値の直前(直後)に置かれているかのように、リスト又は範囲の個々の値を個別に指す。これらの用語は、同じものが参照する値が、正確である、それに近い、又はそれに類似していることを意味する。
本明細書で用いられる場合、対象又は宿主は、個体であることを意味する。対象には、猫及び犬などの愛玩動物、家畜(例えば、牛、馬、豚、羊、及び山羊)、実験動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット)、並びに鳥が含まれる。一態様では、対象は、霊長類又はヒトなどの哺乳動物である。
任意選択的な又は任意選択的にとは、後に説明する事象又は状況が発生してもしなくてもよく、その説明にはその事象又は状況が発生する場合と発生しない場合が含まれることを意味する。例えば、任意選択的に、組成物が組合せを含むことができるという句は、組成物が異なる分子の組合せを含むことができること、あるいは、説明が組合せ及び組合せの不存在の両方を含むような組合せを含まない場合があることを意味する(すなわち、組合せの個々の成員)。
本明細書では、範囲は、約1つの特定の値から、及び/又は約別の特定の値までとして表現することができる。このような範囲が表現される場合、別の態様は、その1つの特定の値から及び/又は他方の特定の値までを含む。同様に、例えば先行詞約又はおよその使用によって、値が近似値として表される場合、その特定の値は別の態様を形成することが理解されよう。さらには、範囲の各々の端点は、他の端点に関連して、及び他の端点とは独立してのいずれにおいても重要であることが理解されよう。範囲(例えば、90~100%)は、範囲自体と、各値が個別に記載されているかのように、範囲内の各独立値を含むことを意味する。
「組み合わせた」又は「組み合わせて」又は「併用して」という用語は、一緒に投与される薬剤の物理的組合せ、あるいは、特定の疾患を治療、予防、及び/又は改善するためのレジメンにおける2つ以上の薬剤の使用(例えば、別々に、物理的に、及び/又は時間内に投与される)を指しうる。
治療、予防、及び/又は改善という用語、若しくはそれらの派生語が、所与の状態に対する所与の治療に関連して本明細書で用いられる場合(例えば、HIVによるがん感染の予防)、治療を受けた患者が臨床的に観察可能なレベルの状態をまったく発症しないか、又は治療を行わなかった場合よりもゆっくり及び/又はより少ない程度で発症することを伝えることを意味する。これらの用語は、患者が状態のいかなる側面もまったく経験しない状況のみに限定されない。例えば、治療は、患者が状態の所与の兆候を引き起こすと予想されるであろう刺激に曝露されている間に行われた場合、その状態を予防したと言われ、その結果、患者は他の方法で予想されるよりも少ない及び/又は軽度の症状を経験する。例えば、治療は、患者が感染の軽度の明白な症状のみを示す結果となることにより、感染を「予防」することができる;感染微生物が細胞に侵入していなかったに違いないという意味ではない。
同様に、特定の治療による所与の状態の予防、治療、及び/又は改善に関連して本明細書で用いられる減少する(reduce、reducing)及び減少は、典型的には、治療(例えば、1つ以上のHIV 結合剤の投与)なしで感染を発症する対照又は基礎レベルと比較して、よりゆっくり又はより少ない程度で感染を発症する対象を指す。感染のリスクが減少すると、患者は、結果的に、感染の軽度の明白な症状又は感染の遅延症状のみを示しうる;感染微生物が細胞に侵入していなかったに違いないという意味ではない。
本開示内で引用されたすべての参照文献は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施態様が、以下の実施例でさらに説明される。これらの実施態様は、例としてのみ提供されているのであって、いかなる方法でも特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例1
リンパ節ドナー
広域中和抗体を単離するためのHIV-1リンパ節ドナーの選択。他の箇所でより詳細に説明されるように、抗レトロウイルス療法を受けていない慢性感染患者由来の107の血漿サンプル中のマルチクレードHIV-1分離株を幅広く中和することができるLN02抗体を単離するために、HIV-1基準株のグローバルパネル由来の9つのHIV-1偽ウイルスのパネルを中和することができる高力価の抗体の存在についてスクリーニングした(DeCamp, A. et al.Global panel of HIV-1 Env reference strains for standardized assessments of vaccine-elicited neutralizing antibodies.J Virol 88, 2489-2507 (2014))。この分析の結果、8人の患者(図1)をリンパ節ドナーとして特定し、その後に強力な広域中和抗体の単離及び特性評価を行った。特に、ドナーSA090は、ウイルス中和活性が高い(かつ、陰性対照MLV偽ウイルスに対するバックグラウンド活性を欠く)ことが特定された。ドナーSA090由来の胚中心及びメモリーIgG B細胞を、IgG(すなわち、IgA及びIgM陰性細胞)、CD19、及びCD38の発現に応じて別々に分類し(胚中心B細胞はCD38陽性であり、メモリーB細胞には存在しない)、HIV-1中和抗体の産生について調査した。特に、高純度のIgGメモリーB細胞及びIgG生殖細胞を、エプスタイン・バーウイルス(EBV)(これは、ポリクローナルにメモリーB細胞も刺激する)及びカクテル構成されたTLR9アゴニストCpG-2006、IL-2(1000IU/ml)、IL-6(10ng/ml)、IL-21(10ng/ml)、及び抗BCRヤギ抗体(BCRトリガ)の存在下、ヒトフィーダー細胞上での単一細胞マイクロ培養として別々のプレートに播種した。次に、14日目の培養物からの上清を、384ウェルベースのHIV-1偽ウイルス中和アッセイを使用した一次スクリーニングにおいて試験した(クレードC及びCRF07を代表する2つの株CE1176及びBJOX2000を並行して使用)。中和アッセイはTZM-bl細胞で行った。384ウェルプレートでは、3000のTZM-bl細胞を添加する前に、50~100×104の相対発光量(RLU)の出力をもたらしたHIV-1偽ウイルスを、37%(5%CO2)で1時間、B細胞培養上清とともにインキュベートした。これらをさらに72時間インキュベートした後、上清を除去し、15μlのSteadylite試薬(Perkin Elmer社)を添加した。ルシフェラーゼ活性は、Synergyマイクロプレートルミノメータ(BioTek社)でプレートを読み取ることにより、5分後に検出した。胚中心B細胞に由来する上清は、1つ以上のHIV株を交差中和する抗体を産生することがわかった。これらの2つの培養物に由来する上清をさらに採取し、偽ウイルスを中和する能力について試験した。これらの1つは、「LN02」と呼ばれる抗体を産生し、HIVを中和することがわかった。
リンパ節ドナー
広域中和抗体を単離するためのHIV-1リンパ節ドナーの選択。他の箇所でより詳細に説明されるように、抗レトロウイルス療法を受けていない慢性感染患者由来の107の血漿サンプル中のマルチクレードHIV-1分離株を幅広く中和することができるLN02抗体を単離するために、HIV-1基準株のグローバルパネル由来の9つのHIV-1偽ウイルスのパネルを中和することができる高力価の抗体の存在についてスクリーニングした(DeCamp, A. et al.Global panel of HIV-1 Env reference strains for standardized assessments of vaccine-elicited neutralizing antibodies.J Virol 88, 2489-2507 (2014))。この分析の結果、8人の患者(図1)をリンパ節ドナーとして特定し、その後に強力な広域中和抗体の単離及び特性評価を行った。特に、ドナーSA090は、ウイルス中和活性が高い(かつ、陰性対照MLV偽ウイルスに対するバックグラウンド活性を欠く)ことが特定された。ドナーSA090由来の胚中心及びメモリーIgG B細胞を、IgG(すなわち、IgA及びIgM陰性細胞)、CD19、及びCD38の発現に応じて別々に分類し(胚中心B細胞はCD38陽性であり、メモリーB細胞には存在しない)、HIV-1中和抗体の産生について調査した。特に、高純度のIgGメモリーB細胞及びIgG生殖細胞を、エプスタイン・バーウイルス(EBV)(これは、ポリクローナルにメモリーB細胞も刺激する)及びカクテル構成されたTLR9アゴニストCpG-2006、IL-2(1000IU/ml)、IL-6(10ng/ml)、IL-21(10ng/ml)、及び抗BCRヤギ抗体(BCRトリガ)の存在下、ヒトフィーダー細胞上での単一細胞マイクロ培養として別々のプレートに播種した。次に、14日目の培養物からの上清を、384ウェルベースのHIV-1偽ウイルス中和アッセイを使用した一次スクリーニングにおいて試験した(クレードC及びCRF07を代表する2つの株CE1176及びBJOX2000を並行して使用)。中和アッセイはTZM-bl細胞で行った。384ウェルプレートでは、3000のTZM-bl細胞を添加する前に、50~100×104の相対発光量(RLU)の出力をもたらしたHIV-1偽ウイルスを、37%(5%CO2)で1時間、B細胞培養上清とともにインキュベートした。これらをさらに72時間インキュベートした後、上清を除去し、15μlのSteadylite試薬(Perkin Elmer社)を添加した。ルシフェラーゼ活性は、Synergyマイクロプレートルミノメータ(BioTek社)でプレートを読み取ることにより、5分後に検出した。胚中心B細胞に由来する上清は、1つ以上のHIV株を交差中和する抗体を産生することがわかった。これらの2つの培養物に由来する上清をさらに採取し、偽ウイルスを中和する能力について試験した。これらの1つは、「LN02」と呼ばれる抗体を産生し、HIVを中和することがわかった。
LN02抗体を、その可変領域のアミノ酸及びヌクレオチド配列を決定し、相補性決定領域(CDR)を確認することによって特徴づけした。したがって、「LN02」と呼ばれる結合剤は、図5及び6に示されるCDR、VH、及びVL配列(例えば、配列番号1、93、234、及び235)を有するIgG1型完全ヒトモノクローナル抗体である。LN02抗体はまた、IGHV4-4*02及びIGLV3-21*01生殖細胞系遺伝子に由来しており、かつ、生殖細胞系と比較して重鎖(31.2%)及びカッパ軽鎖(31.6%)の両方の可変遺伝子において高度に体細胞突然変異しているものとして決定された。組換えLN02抗体を産生させ、TZM-bl細胞上での9つのHIV-1参照偽ウイルスのグローバルパネルに対して試験し、HIV-1偽ウイルスの大部分を中和することができることがわかった。
修飾されたCDR及び非CDRアミノ酸配列を含む、修飾LN02(LN02M)抗体についても、組換え技法を使用して産生させた。ウイルス中和特性が改善されたLN02M広域中和抗体を同定するために、LN02の単一又は複数のアミノ酸置換のパネルを、LN02抗体の重鎖又は軽鎖配列をコードする発現ベクターの部位特異的突然変異誘発によって生成した。LN02M抗体は、重鎖の突然変異ベクターの1つとコトランスフェクトされた軽鎖の野生型ベクター(表1、図6)、又は突然変異軽鎖発現ベクターの1つとコトランスフェクトされたLN02重鎖の野生型ベクター(表2、図6)による、CHO細胞の一過性トランスフェクションによって生成した。トランスフェクトされたCHO細胞の培養を6日間維持し、培地を回収し、標準的なプロトコルを使用してプロテインAアフィニティーカラムで細胞培養上清から突然変異LN02抗体を精製した。次に、得られたLN02M抗体の中和活性を、TZM-blルシフェラーゼレポーターアッセイでHIV-1 BaLウイルスを使用した抗体濃度応答阻害アッセイで評価した。中和活性に加えて、表1及び2の突然変異LN02変異体のタンパク質産生及び濃度を評価して、治療用抗体に必要とされる抗体産生及び抗体安定性の改善という点で利益をもたらす変異を特定した。この方法で産生され、試験された例示的なLN02M可変領域のアミノ酸配列が、図5、図6Aから6E、図7Aから7E、図8Aから8F、並びに配列番号3~92、95~233、248~482、及び491~699に示されている。
表1は、配列番号3~92のLN02M可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体の中和活性を記載している(LN02 MH01~MH147として表1及び図6に特定されている)。表2は、配列番号95~233のLN02M可変軽鎖アミノ酸配列を含む抗体の中和活性を記載している(LN02 ML01~ML94として表2及び図6に特定されている)。表1及び2は、IC50(mg/ml)をHIV偽ウイルスと比較し、LN02(すなわち、野生型(WT)LN02モノクローナル抗体)の中和活性に対する比率として比較している。BaLウイルスの50%中和(IC50)に必要とされる阻害濃度が、並行して試験した野生型LN02 bNabのIC50を突然変異LN02変異体のIC50で割った比率とともに、重鎖置換(表1)又は軽鎖置換(表2)を伴うLN02 bNabについて、示されている。後者の値は、異なる日に実施されるウイルス中和アッセイ間でのアッセイ間のばらつきを制限し、野生型LN02対照と比較してLN02Mに中和活性に関して小さいが重要な利点を与えるうる突然変異を特定するために用いられる。LN02M抗体の追加の中和データが、図9Aから9I、並びに表7A~7B、表8Aから8M、表10Aから10C、表11、表12Aから12D、表13Aから13D、及び表14に示されている。
驚くべきことに、LN02M抗体の幾つかは、LN02より高い中和活性を示した;これらには、例えば、LN02M可変重鎖領域MH01(1.59)、MH16(1.69)、MH22(1.18)、MH26(1.40)、MH30(3.37)、MH32(1.32)、MH35(1.91)、MH36(1.37)、MH37(1.75)、MH43(1.90)、MH44(1.38)、MH48(2.12)、MH49(1.71)、MH50(2.74)、MH51(2.46)、MH53(1.45)、MH59(1.31)、MH61(1.43)、MH64(1.52)、MH68(1.12)、MH73(1.83)、MH84(1.16)、MH89(2.26)、MH91(1.36)、MH92(1.45)、MH106(1.16)、MH107(2.19)、MH108(1.91)、MH111(3.34)、MH112(2.77)、MH115(1.41)、MH119(1.32)、MH120(1.55)、MH124(1.67)、MH131(1.55)、MH135(1.60)、MH136(1.84)、MH138(1.20)、及びMH146(1.65);並びに、LN02M可変軽鎖領域ML01(1.29)、ML02(1.93)、ML05(1.45)、ML08(2.31)、ML10(1.51)、ML11(1.25)、ML12(3.90)、ML31(5.74)、ML32(1.38)、ML44(1.57)、ML49(1.40)、ML51(1.10)、ML52(1.36)、ML60(1.17)、ML71(1.38)、ML73(1.20)、ML74(1.10)、ML79(1.46)、ML84(1.59)、ML85(9.94)、及びML94(6.42)が含まれる。注目すべきことに、表1及び2の突然変異体LN02 MH30、LN02 MH111、LN02 ML12、LN02 ML31、LN02 ML85、LN02 ML92、及びLN02 ML94を含むLN02H抗体はすべて、LN02野生型対照と比較してBaLウイルスに対して3倍以上改善された中和効力を実証している。図1は、中和活性の喪失を誘発する突然変異に対応する野生型LN02と比較して、約1.4倍を超える改善された中和効力、最小の効果(LN02 WTと比較して1.4~0.7倍の差)、又は0.7倍未満の差を与える、LN02の重鎖又は軽鎖のいずれかにおけるアミノ酸置換の概要を提供している。
実施例2
8つの偽型HIV-1ウイルス株のグローバルパネルに対するLN02 bNab及びLN02突然変異体の中和。LN02の重鎖及び/又は軽鎖に突然変異があるLN02 bNabs変異体の選択されたパネルの中和幅の予備評価を、8つの偽型HIV-1ウイルスのパネルを使用して行った。8つの偽型ウイルス(TRO.11、25710、CD1176、BJOX、CH119、246-F3、X1632、及びCNE55)の各々でのLN02突然変異体(重鎖突然変異のMH、軽鎖突然変異体のML、及び重鎖と軽鎖の両方の突然変異体のMX)の80%阻害濃度(IC80)の概要が図2~4に示されている。参照として、図4は、我々の偽型ウイルスのグローバルパネルに対する3BNC117、10-1074、及びVRC01のIC80値も示している。野生型LN02と比較して効力が大幅に改善され、かつ表3で並行して試験された10-1074及び3BNC117と比較して中和プロファイルが全体的に改善された、LN02 ML85、LN02 ML8542、及びLN02 MX48を含むLN02突然変異体の代表的な濃度応答ウイルス中和曲線が図5に示されている。図5のSVA-MLV偽型ウイルス対照に対するLN02Mのプロファイリングは、LN02M bNabが非特異的阻害を示さないことも実証している。
8つの偽型HIV-1ウイルス株のグローバルパネルに対するLN02 bNab及びLN02突然変異体の中和。LN02の重鎖及び/又は軽鎖に突然変異があるLN02 bNabs変異体の選択されたパネルの中和幅の予備評価を、8つの偽型HIV-1ウイルスのパネルを使用して行った。8つの偽型ウイルス(TRO.11、25710、CD1176、BJOX、CH119、246-F3、X1632、及びCNE55)の各々でのLN02突然変異体(重鎖突然変異のMH、軽鎖突然変異体のML、及び重鎖と軽鎖の両方の突然変異体のMX)の80%阻害濃度(IC80)の概要が図2~4に示されている。参照として、図4は、我々の偽型ウイルスのグローバルパネルに対する3BNC117、10-1074、及びVRC01のIC80値も示している。野生型LN02と比較して効力が大幅に改善され、かつ表3で並行して試験された10-1074及び3BNC117と比較して中和プロファイルが全体的に改善された、LN02 ML85、LN02 ML8542、及びLN02 MX48を含むLN02突然変異体の代表的な濃度応答ウイルス中和曲線が図5に示されている。図5のSVA-MLV偽型ウイルス対照に対するLN02Mのプロファイリングは、LN02M bNabが非特異的阻害を示さないことも実証している。
ある特定の実施態様について、好ましい実施態様に関して説明してきたが、変更及び修正が行われることが当業者に理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、以下の特許請求の範囲内に含まれる、このような同等の変形のすべてに及ぶことが意図されている。
Claims (34)
- 結合剤であって、
a)図1、図6Aから6E、図7A~7E、又は図8A~Fに示される少なくとも1つのCDR;
b)配列番号3~92又は491~699からなる群より選択されるアミノ酸配列;
c)配列番号95~233又は248~482からなる群より選択されるアミノ酸配列;
d)MH01(配列番号95)、MH16(配列番号110)、MH22(配列番号116)、MH26(配列番号120)、MH30(配列番号124)、MH32(配列番号126)、MH35(配列番号129)、MH36(配列番号130)、MH37(配列番号131)、MH43(配列番号136)、MH44(配列番号137)、MH48(配列番号141)、MH49(配列番号142)、MH50(配列番号143)、MH51(配列番号144)、MH53(配列番号146)、MH59(配列番号151)、MH61(配列番号153)、MH64(配列番号156)、MH68(配列番号159)、MH73(配列番号163)、MH84(配列番号174)、MH89(配列番号177)、MH91(配列番号178)、MH92(配列番号179)、MH106(配列番号193)、MH107(配列番号194)、MH108(配列番号195)、MH111(配列番号198)、MH112(配列番号199)、MH115(配列番号202)、MH119(配列番号206)、MH120(配列番号207)、MH124(配列番号211)、MH 131(配列番号218)、MH135(配列番号222)、MH136(配列番号223)、MH138(配列番号225)、及び/又はMH146(配列番号232)を含む可変重鎖領域;
e)ML01(配列番号3)、ML02(配列番号4)、ML05(配列番号7)、ML08(配列番号10)、ML10(配列番号12)、ML11(配列番号13)、ML12(配列番号14)、ML31(配列番号31)、ML32(配列番号32)、ML44(配列番号42)、ML49(配列番号47)、ML51(配列番号48)、ML52(配列番号49)、ML60(配列番号56)、ML71(配列番号66)、ML73(配列番号68)、ML74(配列番号69)、ML79(配列番号74)、ML84(配列番号79)、ML85(配列番号80)、ML92(配列番号87)、又はML94(配列番号89)を含む可変軽鎖領域;
f)a)、b)、c)、d)、又はe)のCDR、アミノ酸配列、可変重鎖領域、及び/又は可変軽鎖領域の組合せ;
g)表4、表9、表10Aから10C、表11、表12Aから12D、表13Aから13D、又は表14のいずれかに記載されるLN02M可変軽鎖とLN02M可変重鎖との組合せ;
h)ML01(配列番号3)を含むLN02M可変軽鎖と、MH02(配列番号96)、MH04(配列番号98)、MH22(配列番号116)、MH23(配列番号117)、MH30(配列番号124)、MH31(配列番号125)、MH35(配列番号129)、MH36(配列番号130)、及び/又はMH37(配列番号131)を含むLN02M可変重鎖との組合せ;
i)LN02M可変軽鎖のML12(配列番号14)と、MH02(配列番号96)、MH04(配列番号98)、MH22(配列番号116)、MH23(配列番号117) MH30(配列番号124)、MH31(配列番号125)、MH35(配列番号129)、MH36(配列番号130)、及び/又はMH37(配列番号131)を含むLN02M可変重鎖との組合せ;
j)LN02M可変軽鎖のML23(配列番号24)と、MH31(配列番号125)、MH43(配列番号136)、MH48(配列番号141)、及びMH51(配列番号144)を含むLN02M可変重鎖との組合せ;
k)LN02M可変軽鎖のML30(配列番号30)と、MH31(配列番号125)、MH43(配列番号136)、MH48(配列番号141)、又はMH51(配列番号144)を含むLN02M可変重鎖との組合せ;
l)LN02M可変軽鎖のML31(配列番号31)と、MH02(配列番号96)、MH04(配列番号98)、MH22(配列番号116)、MH23(配列番号117)、MH30(配列番号124)、MH31(配列番号125)、MH35(配列番号129)、MH36(配列番号130)、MH37(配列番号131)、MH43(配列番号136)、MH48(配列番号141)、又はMH51(配列番号144)を含むLN02M可変重鎖との組合せ;
m)LN02M可変軽鎖のML32(配列番号32)とLN02M可変重鎖のMH31(配列番号125)との組合せ;
n)LN02M可変軽鎖のML85(配列番号80)と、MH31(配列番号125)、MH35(配列番号129)、MH43(配列番号136)、MH49(配列番号142)、MH60(配列番号152)、MH76(配列番号166)、MH111(配列番号198)、又はMH112(配列番号199)を含むLN02M可変重鎖との組合せ;
O)軽鎖上のK93Y置換と野生型LN02重鎖を含むML085;野生型LN02の軽鎖上のK93Y及びE95Q置換と野生型LN02の重鎖上のS19H置換とを含むMx152;野生型LN02の軽鎖上のK93Y置換と野生型LN02の重鎖上のS19H置換とを含むMX067;野生型LN02の軽鎖上のK93Y及びT29S置換と野生型LN02の重鎖上のS19H置換とを含むMX129;野生型LN02の軽鎖上のK93Y及びT29S置換と野生型LN02重鎖に対するT21Y置換とを含むMX130;野生型LN02の軽鎖上のK93Y及びE95Q置換と野生型LN02重鎖を含むML126;野生型LN02の軽鎖上のK93Y及びI97V置換と野生型LN02の重鎖上のS40A、Q42R、及びT44G置換とを含むMx175;野生型LN02の軽鎖上のK93Y及びI97V置換と野生型LN02の重鎖上のS40P、Q42R、G43K、及びT44G置換とを含むMx176;並びに、野生型LN02の軽鎖上のK93Y及びI97V置換と野生型LN02の重鎖上のS40P、Q42R、G43K、及びT44G置換とを含むMx181の結合剤からなる群より任意選択的に選択される、表9に示される軽鎖及び重鎖置換の組合せ;並びに、
p)a)からo)の保存的に置換された変異体;
のいずれかを含む、結合剤、若しくは、
LN02と比較して中和活性が少なくとも2倍向上し、かつML085と比較して同等又は改善された効力を示す、上記a)からp)のいずれかを含む、結合剤。 - 前記結合剤が、インビトロHIV中和アッセイ及び/又はインビボにおいて、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)を中和する、請求項1に記載の結合剤。
- 前記結合剤が、102~100μg/ml、又は100~101μg/mlの間の濃度で、HIV-1偽ウイルスである、BJOX(CRF07_BC)、CE1176、TRO.11(B)、X1632(G)、CH119(CRF07_BC)、CNE55(CRF01_AE)、25710(C)、CD0217(C)の中和を示す、請求項1又は2に記載の結合剤。
- 中和率が少なくとも約50%である、請求項2又は3に記載の結合剤。
- 前記結合剤が、25μg/ml未満のIC50又はIC80で試験された前記HIV-1偽ウイルスの大部分を中和する、請求項1から4のいずれか一項に記載の結合剤。
- 抗体である、請求項1から5のいずれか一項に記載の結合剤。
- 単離されたモノクローナル抗体である、請求項6に記載の結合剤。
- 前記モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項6に記載の結合剤。
- 前記抗体のアイソタイプがIgG1又はIgG3である、請求項7又は8に記載の結合剤。
- 図1に示される、及び/又は配列番号95~233のいずれかに記載される、少なくとも1つの重鎖CDRアミノ酸配列;及び/又は、それらの保存的に置換された変異体を含む、請求項1に記載の結合剤。
- 図1、及び/又は配列番号3~92のいずれかに記載される、少なくとも1つの軽鎖CDRアミノ酸配列;及び/又は、それらの保存的に置換された変異体を含む、請求項1に記載の結合剤。
- 配列番号3~92及び/又は95~233からなる群より選択される少なくとも1つの可変鎖アミノ酸配列;及び/又は、それらの保存的に置換された変異体を含む、請求項1に記載の結合剤。
- ヒト抗体、ヒトIgG、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、ヒトIgG4、ヒトIgM、ヒトIgA、ヒトIgA1、ヒトIgA2、ヒトIgD、ヒトIgE、イヌ抗体、イヌIgGA、イヌIgGB、イヌIgGC、イヌIgGD、ニワトリ抗体、ニワトリIgA、ニワトリIgD、ニワトリIgE、ニワトリIgG、ニワトリIgM、ニワトリIgY、ヤギ抗体、ヤギIgG、マウス抗体、マウスIgG、ブタ抗体、及びラット抗体に由来する、請求項1から12のいずれか一項に記載の結合剤。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の結合剤の誘導体。
- Fab、Fab2、Fab’一本鎖抗体、Fv、一本鎖、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三量体抗体、多重特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ-ヒトキメラ抗体、イヌ-マウスキメラ抗体、イヌFcを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化抗体、CDRグラフト化抗体、サメ抗体、ナノボディ、及びラクダ抗体からなる群より選択される、請求項14に記載の誘導体。
- 少なくとも第1及び第2の特異性を含み、前記第1の特異性がgp41に対するものであり、前記第2の特異性が異なる抗原に対するものである、請求項1から15のいずれか一項に記載の結合剤又は誘導体。
- それに固定可能に取り付けられた検出可能な標識を含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の結合剤又は誘導体。
- 前記検出可能な標識が、フルオレセイン、DyLight、Cy3、Cy5、FITC、HiLyte Fluor555、HiLyte Fluor647、5-カルボキシ-2,7-ジクロロフルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン、5-FAM、ヒドロキシトリプタミン、5-ヒドロキシトリプタミン(5-HAT)、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)、FITC、6-カルボキシ-1,4-ジクロロ-2’,7’-ジクロロフルオレセイン(TET)、6-カルボキシ-1,4-ジクロロ-2’,4’,5’,7’-テトラクロロフルオレセイン(HEX)、6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン(6-JOE)、Alexa fluor、Alexa fluor350、Alexa fluor405、Alexa fluor430、Alexa fluor488、Alexa fluor500、Alexa fluor514、Alexa fluor532、Alexa fluor546、Alexa fluor555、Alexa fluor568、Alexa fluor594、Alexa fluor610、Alexa fluor633、Alexa fluor635、Alexa fluor647、Alexa fluor660、Alexa fluor680、Alexa fluor700、Alexa fluor750、BODIPYフルオロフォア、BODIPY492/515、BODIPY493/503、BODIPY500/510、BODIPY505/515、BODIPY530/550、BODIPY542/563、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODIPY581/591、BODIPY630/650-X、BODIPY650/665-X、BODIPY665/676、FL、FL ATP、FI-セラミド、R6G SE、TMR、TMR-Xコンジュゲート、TMR-X、SE、TR、TR ATP、TR-X Se、ローダミン、ローダミン110、ローダミン123、ローダミンB、ローダミンB200、ローダミンBB、ローダミンBG、ローダミンBエクストラ、5-カルボキシテトラメチルローダミン(5-TAMRA)、5GLD、6-カルボキシローダミン6G、リサミン、リサミンローダミンB、ファリシジン、ファロイジン、ローダミンレッド、Rhod-2、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、カルボキシ-X-ローダミン(5-ROX)、スルホローダミンB can C、スルホローダミンGエクストラ、6-カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミン(TRITC)、ローダミンWT、テキサスレッド、及びテキサスレッド-Xからなる群より選択される、請求項17に記載の結合剤又は誘導体。
- それに固定的に結合されたエフェクタ部分を含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の結合剤又は誘導体。
- 前記エフェクタ部分が、細胞毒性薬、毒素、ジフテリアA鎖、外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン、及び放射性化学物質からなる群より選択される、請求項19に記載の結合剤又は誘導体。
- 請求項1から15のいずれか一項に記載の結合剤をコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項21に記載の1つ以上のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- 請求項21に記載の単離されたポリヌクレオチド、及び/又は請求項22に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1から20のいずれか一項に記載の少なくとも1つの結合剤又は誘導体;請求項21に記載の少なくとも1つの単離されたポリヌクレオチド;又は、請求項23に記載の少なくとも1つの発現ベクター;及び/又は、請求項23に記載の少なくとも1つの宿主細胞;若しくはそれらの組合せ;並びに、薬学的に許容される担体を含む、組成物。
- 細胞上のHIVを検出する方法であって、試験する生物学的サンプルを請求項1から20のいずれか一項に記載の結合剤又は誘導体と接触させるステップ、及び前記生物学的サンプル又はそれらの成分に結合した前記結合剤を検出するステップを含む、方法。
- 前記試験する生物学的サンプル又はそれらの成分に結合する量を対照の生物学的サンプル又はそれらの成分に結合する量と比較するステップをさらに含み、前記対照の生物学的サンプル又はそれらの成分と比較した、前記試験する生物学的サンプル又はそれらの成分への結合の増加が、前記試験する生物学的サンプル中におけるHIVを発現する細胞の存在を示唆する、請求項25に記載の方法。
- 前記試験する生物学的サンプルが哺乳動物の血液である、請求項25又は26に記載の方法。
- 前記方法がインビボでの方法である、請求項25から27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法がインビトロでの方法である、請求項25から27のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から20のいずれか一項に記載の結合剤又は誘導体を含む医薬組成物の少なくとも1つの有効量を前記哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物におけるHIV感染及び/又はAIDSを治療、予防、及び/又は緩和する方法。
- 複数回用量が前記動物に投与される、請求項30に記載の方法。
- 前記結合剤が約1~50mg/kgの投与量で投与される、請求項30又は31に記載の方法。
- 細胞内又は細胞上でのHIVの発現を検出するためのキットであって、請求項1から20のいずれか一項に記載の結合剤又は誘導体と使用説明書とを含む、キット。
- 前記結合剤、抗体、又は誘導体が、凍結乾燥形態である、請求項33に記載のキット。
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