CN117229385A - Pd-1变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及PD‑1变体及其用途。具体而言，本发明的PD‑1变体能够以高亲和力结合PD‑L1，但与一种或多种抗PD‑1单克隆抗体不结合，优选与至少两种抗PD‑1单克隆抗体不结合。本发明还涉及包含所述PD‑1变体的融合蛋白。本发明还涉及所述PD‑1变体和融合蛋白的编码核酸分子以及用途。

Description

PD-1变体及其用途
技术领域
本发明涉及免疫治疗领域。具体而言，本发明提供PD-1变体。本发明还提供编码所述PD-1变体的核酸分子，包含所述PD-1变体的融合蛋白或组合物，以及所述PD-1变体的用途。
背景技术
程序性死亡蛋白1，即PD-1，是主要表达于活化淋巴细胞表面的一种蛋白。PD-1是一种免疫检查点蛋白，具有免疫刹车的能力。相应地，抑制PD-1能够解除针对免疫系统的抑制来攻击肿瘤，使得PD-1成为近年来热门的免疫靶标。多种针对PD-1的抗体已经获批并上市。
PD-1与其配体PD-L1结合，产生免疫抑制信号。肿瘤细胞通过表达PD-L1，从而借助PD-1/PD-L1通路来实现免疫逃逸。已有研究通过开发能够结合PD-L1的PD-1类似物来阻止PD-1和PD-L1的相互作用，从而实现对PD-1的抑制。另外，也可以利用这些与PD-L1具有结合特异性的PD-1类似物来识别并结合肿瘤细胞。
例如，斯坦福大学的PCT专利公开WO2016/023001中描述了多种PD-1变体序列。这些变体相对于人的野生型PD-1与其配体PD-L1具有提高的亲和力，并且缺少跨膜区。然而，该申请中的变体相对于野生型均具有多个氨基酸的差异。该申请并没有研究PD-1变体与抗PD-1抗体的亲和力。
在将PD-1变体用于治疗用途时，有时会涉及到与抗PD-1抗体的联用。在这样的情况下，如果抗PD-1抗体能够识别并结合PD-1变体，那么这两种治疗途径会彼此影响，降低二者的功效。
因此，本领域仍然需要改进的PD-1多肽变体以适用于更广泛的应用场景。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的发明人构建了PD-1突变质粒文库，并通过流式分选，筛选出一系列PD-1变体，它们既保留了与其配体PD-L1的高亲和力，同时不与多种市售的抗PD-1单克隆抗体结合，由此完成了本发明。
因此，第一方面，本发明提供PD-1变体，其与野生型人PD-1多肽具有不同的氨基酸序列，并且以高亲和力，例如高于野生型人PD-1多肽的亲和力，结合PD-L1，同时基本上不结合多种抗PD-1单克隆抗体。
第二方面，本发明提供包含第一方面的PD-1变体的融合蛋白。在一个实施方案中，所述融合蛋白可以是以所述PD-1变体为胞外段的跨膜融合蛋白。在一个实施方案中，所述融合蛋白是包含免疫球蛋白Fc的融合蛋白。
第三方面，本发明提供编码第一方面的PD-1变体或第二方面的融合蛋白的核酸分子。
第四方面，本发明提供包含第三方面的所述核酸分子的表达载体。
第五方面，本发明提供包含第三方面所述核酸分子或第四方面的表达载体的宿主细胞。
第六方面，本发明提供包含第一方面的PD-1变体或第二方面的融合蛋白的药物组合物。
第七方面，本发明提供第一方面的PD-1变体或第二方面的融合蛋白在制备药物中的用途。在具体的实施方案中，所述药物用于癌症治疗。
第八方面，本发明提供一种药物组合，其包含(1)第一方面的PD-1变体或第二方面的融合蛋白，和(2)抗PD-1抗体。
附图说明
图1的质粒图显示了实施例1中用于构建PD-1突变体文库所使用的质粒载体的结构。
图2显示了实施例3中通过流式细胞术分选与PD-L1结合但不与抗PD-1抗体结合的细胞的示意图。
图3为实施例5中表达野生型PD-1或PD-1变体与兔IgG Fc融合蛋白的SDS-PAGE结果。(A)非还原条件；(B)还原条件。泳道1为野生型PD-1，泳道2-7为SEQ ID Nos：2-7所示的PD-1变体，泳道8为分子量标志物。
图4显示了实施例7中测试的PD-1变体Fc融合蛋白对T细胞IL-2释放的阻断作用。
图5显示了实施例8中用PD-1变体构建的PD-1-CD28增强受体(108-CD28)武装T细胞，可被表达PD-L1靶细胞刺激，分泌细胞因子IL-2。
图6显示了实施例9中PD-1变体构建的PD-1-CD28增强受体(108-CD28)可增强T细胞杀伤相应靶细胞。
发明详述
定义
除非另有说明，否则本文所公开的一些方法的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，它们在本领域的技术范围之内。参见例如Sambrook和Green，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，第4版(2012)。
术语“约”或“大约”意指在特定值的可接受误差范围内，并且所述误差范围是本领域普通技术人员能够确定的。在一些情况中，所述可接受的误差范围部分取决于如何测量或确定所述值，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1个或超过1个标准偏差内。可替代地，“约”可以意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指在值的一个数量级内、优选地在值的5倍内、更优选地在值的2倍内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意指在所述特定值的可接受误差范围内。
如本文所用，术语“核苷酸”通常是指碱基-糖-磷酸组合。核苷酸可以包含合成核苷酸。核苷酸可以包含合成核苷酸类似物。核苷酸可以是核酸序列(例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))的单体单元。术语核苷酸可以包括核糖核苷三磷酸腺苷三磷酸(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞嘧啶三磷酸(CTP)、鸟苷三磷酸(GTP)；以及脱氧核糖核苷三磷酸，如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP；或其衍生物。此类衍生物可以包括例如[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP，以及对含有它们的核酸分子赋予核酸酶抗性的核苷酸衍生物。如本文所用的术语核苷酸可以是指双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核糖核苷三磷酸的说明性例子可以包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。核苷酸可以是未标记的，或者可以通过熟知的技术可检测地标记。标记也可以用量子点进行。可检测的标记可以包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是呈单链、双链或多链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸对于细胞而言可以是外源的或内源的。多核苷酸可以存在于无细胞环境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸可以包含一种或多种类似物(例如，改变的骨架、糖或核碱基)。类似物的一些非限制性例子包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸、吗啉代、锁核酸、乙二醇核酸、苏阿糖核酸、双脱氧核苷酸、虫草素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如罗丹明或与糖连接的荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷和怀俄苷。多核苷酸的非限制性例子包括基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座(loci/locus)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、无细胞多核苷酸(包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA))、核酸探针和引物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。
术语“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的一个或多个过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指通过一个或多个肽键连接的至少两个氨基酸残基的聚合物。这一术语并不意味着聚合物的特定长度，也不旨在暗示或区分肽是使用重组技术、化学或酶促合成产生的还是天然存在的。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及包含至少一种经修饰的氨基酸的氨基酸聚合物。在一些情况下，聚合物可以被非氨基酸中断。所述术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，以及具有或不具有二级和/或三级结构(例如，结构域)的蛋白质。所述术语还涵盖已经例如通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、氧化和任何其他操作(如与标记组分缀合)被修饰的氨基酸聚合物。如本文所用，术语“氨基酸”通常是指天然和非天然氨基酸，包括但不限于经修饰的氨基酸和氨基酸类似物。经修饰的氨基酸可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸，它们已经被化学修饰以包括非天然存在于氨基酸上的基团或化学部分。氨基酸类似物可以是指氨基酸衍生物。术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸两者。
当涉及多肽时，术语“变体”或“片段”是指例如通过氨基酸序列、结构(例如，二级和/或三级)、活性(例如，酶促活性)和/或功能而与野生型多肽相关的多肽。与野生型多肽相比，多肽的变体和片段可以包含一种或多种氨基酸变化(例如，突变、插入和缺失)、截短、修饰或其组合。
术语“融合蛋白”指通过连接两个或更多个原本相互独立的基因或其片段而产生的蛋白质。融合蛋白可以包含一个或多个非天然的氨基酸序列。融合蛋白可以是嵌合蛋白。融合蛋白可以包含肽亲和标签。
如本文所用，术语“抗原”是指能够被选择性结合剂结合的分子或其片段。例如，抗原可以是可以被选择性结合剂(如受体)结合的配体。又如，抗原可以是可以被选择性结合剂(如免疫蛋白(例如，抗体)结合的抗原分子。抗原也可以是指能够被用于动物中以产生能够与所述抗原结合的抗体的分子或其片段。
如本文所用，术语“抗体”是指具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子。术语抗体包括抗体(例如，单克隆和多克隆抗体)，以及其衍生物、变体和片段。抗体包括但不限于不同类别(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(如IgGl、IgG2等)的免疫球蛋白(Ig)。抗体的衍生物、变体或片段可以是指保留对应抗体的结合特异性(例如，完全和/或部分)的功能性衍生物、变体或片段。抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、小抗体、双抗体和单结构域抗体(“sdAb”或“纳米抗体”或“骆驼抗体(camelids)”)。术语抗体包括已经被优化、被工程化或被化学偶联的抗体和抗体的抗原结合片段。已经被优化的抗体的例子包括亲和力成熟的抗体。已经被工程化的抗体的例子包括Fc优化的抗体(例如，在片段可结晶区域中优化的抗体)和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
“Sintilimab”或“信迪利单抗”是由信达生物和礼来制药联合开发的PD-1单抗注射剂。
“Nivolumab”或“纳武单抗”是由小野制药和Medarex公司(后者已被百时美施贵宝收购)联合开发的抗PD-1单抗。纳武单抗以商品名Opdivo销售，也因此被称为“O药”。Opdivo是世界上最早获批，也是最具代表性的抗PD-1单抗。
“Tilelizumab”或“替雷利珠单抗”是百济神州开发的抗PD-1抗体。
“Camrelizumab”或“卡瑞利珠单抗”是江苏恒瑞开发的抗PD-1抗体。
“Pemrolizumab”或“帕博利珠单抗”是默沙东开发的抗PD-1抗体。帕博利珠单抗以Keytruda为商品名销售，也因此被称为“K药”。
“Toripalimab”或“特瑞普利单抗”是君实生物开发的抗PD-1抗体，也是中国首个获批的本国研发的抗PD-1抗体。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指脊椎动物，优选地哺乳动物，如人。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿猴、人类、农场动物、运动动物和宠物。
如本文所用，术语“治疗”是指用于获得有益或所需的结果的方法，所述有益或所需的结果包括但不限于治疗益处和/或预防益处。治疗益处意指对治疗中的一种或多种疾病、病症或症状的任何治疗相关的改进或作用。对于预防益处，可以将组合物给予有发生特定疾病、病症或症状的风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状(即使疾病、病症或症状可能尚未表现)的受试者。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以在给予有需要的受试者后产生所需的活性的作用剂(例如本发明的变体、融合蛋白或包含它们的组合物)的量。在本公开文本的上下文中，术语“治疗有效量”可以指足以延迟待治疗病症的表现、阻止待治疗病症的进展、缓解或减轻待治疗病症的至少一种症状的作用剂的量。
“协同作用”指两种或多种药物共同施用时，产生了加合或增效作用，优选增效作用，即共同施用时的效果优于各种药物单独施用时的效果之和。
突变的命名规则
在本发明的上下文中描述PD-1变体中所含的突变时，如果没有特殊说明，则均以如SEQ ID NO：1所示的人PD-1序列作为基础。在SEQ ID NO：1所示的人PD-1的氨基酸序列中，第1-20位的氨基酸为信号肽，第21-170位的氨基酸为PD-1胞外区，第171-191位的氨基酸为跨膜区，第192-288位的氨基酸为胞内区。根据该编号体系，在如SEQ ID NO：1所示的人PD-1中，胞外区是从第21位的脯氨酸到第170位的缬氨酸组成的共150个氨基酸的序列，且跨膜区是从第171位的缬氨酸到第191位的异亮氨酸组成的共21个氨基酸的序列。
在本发明中描述氨基酸突变位置时，以被突变的氨基酸在SEQ ID NO：1中的位置来记录。在描述氨基酸突变的类型时，将SEQ ID NO：1中对应氨基酸位置的氨基酸类型作为突变前的氨基酸，放在位置号之前(左侧)，而将突变后的PD-1变体中存在的氨基酸放在位置号之后(右侧)。当同一位置可以突变为不同的氨基酸时，以“/”隔开多种可选的氨基酸。
基于上述规则，以A129S突变为例，其指代参考SEQ ID NO：1在第129位的丙氨酸突变为丝氨酸。另外，A129S/H则指代第129位的丙氨酸可以突变为丝氨酸或组氨酸。
PD-1变体
本发明的“PD-1变体”指与SEQ ID NO：1中所示的野生型人PD-1的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸差异的多肽序列。在具体的实施方案中，本发明的PD-1变体是人PD-1野生型的截短片段的变体，例如不合胞内结构域的截短片段的变体，或不合胞内结构域和跨膜结构域的变体。
本发明的PD-1变体相对于野生型人PD-1而言，具有如下一种或多种特征：
(1)改进的与PD-L1配体的亲和力，
(2)改进的与PD-L2配体的亲和力，
(3)与两种或更多种市售抗PD-1抗体不结合。
在本发明的上下文中，在本发明的上下文中，“PD-1变体不与抗PD-1抗体结合”可以指PD-1变体与特定抗PD-1抗体的结合亲和力低于所用仪器的检测限，或在以KD值表示亲和力时高于所用仪器的检测限。例如，在使用BIACORE T200仪器测定亲和力时，可以测得的KD值应在10-12M至10-3M的范围。当KD值高于10-3M，该仪器检测不到结合曲线，也就是本文中所指的PD-1变体不与抗PD-1抗体结合。
由于本发明的PD-1变体最重要的性质是结合亲和力的改变，因此其突变主要集中在胞外段。具体而言，本发明的PD-1变体相对于野生型PD-1多肽而言，在选自E84至G90以及A129至Q133这两个区域内的一个或多个氨基酸位置处包含突变。优选地，至少有一个突变选自E84至G90组成的区域，且至少有一个突变选自A129至Q133组成的区域。优选地，所述PD-1变体相对于野生型PD-1多肽而言，在M70至K78组成的区域内不包含任何突变，且具有与如SEQ ID NO：1所示的野生型PD-1多肽在对应位置相同的氨基酸残基。
在优选的实施方案中，本发明的PD-1变体与SEQ ID NO：1所示的野生型人PD-1多肽相比，具有一种或多种选自下组的氨基酸突变：E84W、E84F；D85L、D85M；R86F；S87N、S87C、S87R、S87F、S87I；Q88L、Q88F、Q88N、Q88T；P89C、P89V、P89R；G90T、G90S；A129S、A129G、A129Q、A129Y；P130T；K131P；A132V、A132G；Q133W。
本发明的PD-1变体包含具有SEQ ID NOs：2-26中任一所示的氨基酸序列的变体中所含的突变组合。具体来说，这些突变组合为：
(1)A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(2)E84F、D85L、R86F、S87N、Q88L、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(3)E84W、D85M、R86F、S87C、Q88F、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(4)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(5)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(6)S87I、Q88N、P89R、G90S、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(7)E84F、D85L、R86F、S87N、Q88L、P130T、K131P和Q133W；
(8)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、A129G、P130T、K131P和Q133W；
(9)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、P130T、K131P、A132G和Q133W；
(10)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、A129Q、P130T、K131P和Q133W；或
(11)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129Y、P130T、K131P和Q133W；
(12)A129H、P130F、K131R、A132F和Q133N；
(13)A129S、P130E、K131P、A132I和Q133V；
(14)S87L、Q88C、P89V、G90F、A129H、P130F、K131R、A132F和Q133N；
(15)R86S、S87F、Q88E、P89V、G90R、A129H、P130F、K131R、A132F和Q133N；
(16)R86L、S87Y、Q88L、P89K、G90Y、A129S、P130E、K131P、A132I和Q133V；
(17)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、A129W、P130T、K131P、A132M和Q133W；
(18)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129H、P130T、K131P、A132F和Q133W；
(19)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129G、P130T、K131P、A132F和Q133W；
(20)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129I、P130T、K131P、A132G和Q133W；
(21)S87I、Q88N、P89R、G90S、A129T、P130T、K131P、A132F和Q133W；
(22)S87I、Q88N、P89R、G90S、A129V、P130T、K131P和Q133W；
(23)S87I、Q88N、P89R、G90S、P130T、K131P和Q133W；
(24)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、P130T、K131P和Q133W；
(25)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、P130T、K131P和Q133W。
在优选的实施方案中，本发明的PD-1变体包含如SEQ ID NOs：2-26中任一所示的氨基酸序列，或者由如SEQ ID NOs：2-26中任一所示的氨基酸序列组成。在优选的实施方案中，本发明的PD-1变体是如SEQ ID NO：1所示的野生型人PD-1的胞外结构域的变体，其包含如SEQ ID NOs：2-26中任一所示的氨基酸序列，或者由如SEQ ID NOs：2-26中任一所示的氨基酸序列组成；并且不合野生型PD-1的胞内结构域，或不合野生型PD-1的胞内结构域和跨膜结构域。
在如上限定的具体突变和/或突变组合存在或不存在的基础上，应该理解可以允许在所述PD-1变体的一个或几个氨基酸位置包含保守氨基酸取代，而包含这些保守氨基酸取代的PD-1变体仍然保留本发明期望的活性和结合特异性。保守氨基酸取代的替代规则是本领域技术人员已知的。例如，在满足包含如上(1)至(25)中任一氨基酸组合，且在M70至K78组成的区域内具有与野生型相同的氨基酸的前提下，可以允许所述PD-1变体在其他位置相对于野生型人PD-1而言包含一个或几个保守氨基酸取代，如1-20个保守氨基酸取代，优选1-15个保守氨基酸取代，更优选1-10个保守氨基酸取代，还更优选1-5个保守氨基酸取代。
在另一个实施方案中，在如上限定的具体突变和/或突变组合存在或不存在的基础上，本发明的PD-1变体包含与SEQ ID NO：2-26中任一所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的胞外区，优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，例如至少96％，至少97％，至少98％，至少99％序列同一性。两个氨基酸序列之间序列同一性的确定方法是本领域技术人员熟知的。例如，可以通过NCBI的BLAST程序来比对氨基酸序列，其中使用BLOSUM62评分矩阵。
在本发明的上下文中，“胞外区”和“胞外结构域”可以互换使用并具有相同含义，其通常用于描述PD-1变体源自野生型人PD-1的胞外结构域。在以上任何一种突变方式中，本发明的PD-1变体都可以只是对应于野生型PD-1的全部或部分胞外区的多肽片段，即“胞外区变体”。换言之，在这种情况下，可以将本发明的PD-1变体视作是将野生型PD-1的跨膜区和胞内区去除，并进一步包含如上所述的突变的变体多肽。例如，所述PD-1变体可以不合任何对应于野生型PD-1的胞内区和跨膜区的氨基酸。例如，所述PD-1变体可以包含野生型PD-1中位于胞外的信号肽，例如SEQ ID NO：1的氨基酸1至20所示的信号肽。例如，本发明的示例性PD-1变体均为长度为155个氨基酸的多肽，其对应于如SEQ ID NO：1所示的野生型人PD-1的第1-155位氨基酸。然而，需要理解的是，这并不意味着本发明的PD-1变体只能或必需具有155个氨基酸的长度，也不意味着其不能含有跨膜区、胞内区。例如，在希望利用本发明的PD-1变体的结合特性，并利用它来制备融合蛋白特别是跨膜蛋白时，仍然可以包括更多的对应于PD-1多肽的氨基酸，例如将野生型PD-1的跨膜区的氨基酸纳入作为融合蛋白的跨膜区。
包含PD-1变体的融合蛋白
由于具有独特的结合特性，本发明的PD-1变体，特别是PD-1胞外区变体具有广泛的应用前景。例如，可以利用所述PD-1变体的结合特性，将其作为融合蛋白的一部分，如胞外结合结构域，用于靶向PD-L1和/或PD-L2，如靶向表达PD-L1和/或PD-L2的细胞。
在一个实施方案中，可以将PD-1变体构建成抗体样分子。例如，可以将所述PD-1变体直接与免疫球蛋白的Fc区构建成融合蛋白，形成类似于抗PD-L1抗体的特异性结合PD-L1的功能性多肽。所述Fc区优选哺乳动物例如人的免疫球蛋白的Fc区，例如人IgG1的Fc区。
在另一个实施方案中，包含所述PD-1变体的融合蛋白是嵌合刺激分子，其也可成称作增强受体、转换分子(switch molecule)或转换受体。所述嵌合刺激分子包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域为本发明的PD-1变体，特别是PD-1胞外区变体，其能够结合PD-L1和/或PD-L2，并且胞内结构域是介导免疫细胞如T细胞激活的共刺激分子的胞内结构域。所述共刺激分子可以选自白细胞介素2受体(IL-2R)、白细胞介素12受体(IL-12R)、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C或OX40。在优选的实施方案中，所述共刺激分子选自OX40、4-1BB、CD28、ICOS、CD27。在特别优选的实施方案中，所述共刺激分子为CD28。
所述融合蛋白的跨膜结构域可以来自野生型PD-1或其变体，例如可以是野生型PD-1或其变体的跨膜结构域本身，或者是所述跨膜结构域的片段。在一个实施方案中，所述跨膜结构域来自野生型PD-1，例如包含如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第171-191位氨基酸或其片段，或由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第171-191位氨基酸或其片段组成。在一个实施方案中，所述跨膜结构域包含与如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第171-191位氨基酸具有至少70％同源性，至少80％同源性，或90％同源性的序列。
所述融合蛋白的跨膜结构域也可以来自其他来源例如来自共刺激分子的跨膜结构域。可以修饰免疫细胞以使其表达所述嵌合刺激分子。包含所述嵌合刺激分子的免疫细胞在与PD-L1的结合时，在所述免疫细胞中会产生免疫细胞激活信号，而非通常由PD1/PD-L1结合带来的免疫细胞失活信号。如此一来，将免疫抑制信号转换为激活信号，从而激活免疫细胞的功能。
制备方法
本发明的PD-1变体可以通过分子生物学方法制备。
例如，可以通过重组技术来制备本发明的PD-1变体或融合多肽。可以在体外合成编码PD-1变体或融合多肽的核苷酸片段，例如DNA或RNA，然后将其构建到合适的表达载体中，并在合适的宿主细胞中进行表达。例如，可以通过病毒载体如慢病毒载体将需要表达的序列递送到宿主细胞中。通过收获宿主细胞表达的蛋白并任选地进行纯化，由此获得希望的多肽。
纯化多肽的方法是本领域已知的，例如可以通过层析技术，例如柱层析、HPLC、亲和层析、大小排阻层析等。也可以通过磁珠对蛋白进行纯化。
例如，可以通过无细胞的多肽合成体系来制备PD-1变体或融合多肽。可用于进行无细胞多肽合成的设备是本领域已知的。
用途
如上所述，本发明的PD-1变体由于其独特的结合特性，具有多种潜在的用途。
本发明的PD-1变体保留了与配体PD-L1、PD-L2的结合能力，因此可以用于在多种应用中替代野生型人PD-1或其胞外结构域的功能，特别是那些利用PD-1与PD-L1、PD-L2的结合功能的应用。由于本发明的PD-1变体在与配体的结合能力上有所改进，甚至会产生比野生型PD-1更好的效果。
在一个实施方案中，包含本发明的PD-1变体的嵌合刺激分子在表达于免疫细胞时，可以起到将抑制性PD-1/PD-L1信号转变为刺激性信号的作用，由此增强免疫细胞如T细胞的功能。因此，其可以在使用免疫细胞的细胞治疗中用于修饰用作治疗的免疫细胞。这样的治疗性免疫细胞可以是受试者自体的免疫细胞，也可以来自与受试者半相合的供者。所述免疫细胞可以来自受试者的外周血，例如通过分选外周血单个核细胞获得。所述免疫细胞可以来自肿瘤组织，例如可以是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。另外，表达所述嵌合刺激分子的T细胞在与表达PD-L1的肿瘤细胞接触时，会增加T细胞的白介素-2(IL-2)分泌，白介素-2反过来可以与T细胞上的受体结合，进一步刺激T细胞。
在一个实施方案中，包含本发明的PD-1变体的抗体类似物具有与PD-1单抗类似的作用。例如，本发明的PD-1变体与Fc形成的融合蛋白可以阻断PD-1/PD-L1信号通路，从而抑制IL-2的释放。因此，PD-1突变体的Fc融合蛋白可以起到与PD-1或PD-L1单抗相同的解除“免疫刹车”的作用。
此外，本发明的PD-1变体不与多种市售PD-1单抗结合，这使其可以和这些PD-1单抗联用而不影响各自的效力，为联用提供了可能。这是使用野生型人PD-1或其胞外区时无法实现的。同时，本发明的PD-1变体也保留了与特定PD-1单抗结合的能力，使其能够利用该单抗进行纯化等操作。
基于上述用途，本发明的PD-1变体或包含该变体的融合蛋白特别适合于治疗癌症。“癌症”在本发明的上下文中包括发生在不同器官、组织和细胞类型中的恶性肿瘤，包括实体肿瘤和血液癌症。
本发明至少还包括如下各项：
1.一种PD-1变体，其特征在于：
(1)所述PD-1变体能够与如SEQ ID NO：28所示的人PD-L1多肽结合；并且
(2)所述PD-1变体不与一种或多种选自下组的抗PD-1抗体结合：信迪利单抗(Sintilimab)、纳武单抗(Nivolumab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)、帕博利珠单抗(Pemrolizumab)和特瑞普利单抗(Toripalimab)。
2.根据项1所述的PD-1变体，其中与SEQ ID NO：1所示的野生型人PD-1多肽相比，所述PD-1变体在如下氨基酸位置中的一个或多个处具有突变：E84、D85、R86、S87、Q88、P89、G90、A129、P130、K131、A132和Q133，所述氨基酸位置以SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列进行编号。
3.根据项1或2所述的PD-1变体，其中与SEQ ID NO：1所示的野生型人PD-1多肽相比，所述PD-1变体具有一种或多种选自下组的氨基酸突变：E84W、E84F；D85L、D85M；R86F；S87N、S87C、S87R、S87F、S87I、S87L、S87Y；Q88L、Q88F、Q88N、Q88T、Q88C、Q88E；P89C、P89V、P89R、P89K；G90T、G90S、G90F、G90R、G90Y；A129S、A129G、A129Q、A129Y、A129H、A129W、A129V、A129T、A129I；P130T、P130F、P130E；K131P、K131R；A132V、A132G、A132F、A132I、A132M；Q133W、Q133N、Q133V。
4.根据项3所述的PD-1变体，其中与SEQ ID NO：1所示的野生型人PD-1多肽相比，所述PD-1变体具有一种或多种选自下组的氨基酸突变：E84W、E84F；D85L、D85M：R86F；S87N、S87C、S87R、S87F、S87I；Q88L、Q88F、Q88N、Q88T；P89C、P89V、P89R；G90T、G90S；A129S、A129G、A129Q、A129Y；P130T；K131P；A132V、A132G；Q133W。
5.根据项2至4中任一项所述的PD-1变体，其中与SEQ ID NO：1所示的野生型人PD-1多肽相比，所述PD-1变体在选自E84、D85、R86、S87、Q88、P89、G90的一个或多个氨基酸位置处具有突变，并且在选自A129、P130、K131、A132和Q133的一个或多个氨基酸位置处具有突变。
6.根据项1至5中任一项所述的PD-1变体，其中与SEQ ID NO：1所示的野生型人PD-1多肽相比，所述PD-1变体包含或仅包含选自如下(1)至(25)中任一组的氨基酸突变组合：
(1)A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(2)E84F、D85L、R86F、S87N、Q88L、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(3)E84W、D85M、R86F、S87C、Q88F、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(4)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(5)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(6)S87I、Q88N、P89R、G90S、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(7)E84F、D85L、R86F、S87N、Q88L、P130T、K131P和Q133W；
(8)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、A129G、P130T、K131P和Q133W；
(9)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、P130T、K13 1P、A132G和Q133W；
(10)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、A129Q、P130T、K131P和Q133W；或
(11)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129Y、P130T、K131P和Q133W；
(12)A129H、P130F、K131R、A132F和Q133N；
(13)A129S、P130E、K131P、A132I和Q133V；
(14)S87L、Q88C、P89V、G90F、A129H、P130F、K131R、A132F和Q133N；
(15)R86S、S87F、Q88E、P89V、G90R、A129H、P130F、K131R、A132F和Q133N；
(16)R86L、S87Y、Q88L、P89K、G90Y、A129S、P130E、K131P、A132I和Q133V；
(17)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、A129W、P130T、K131P、A132M和Q133W；
(18)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129H、P130T、K131P、A132F和Q133W；
(19)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129G、P130T、K131P、A132F和Q133W；
(20)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129I、P130T、K131P、A132G和Q133W；
(21)S87I、Q88N、P89R、G90S、A129T、P130T、K131P、A132F和Q133W；
(22)S87I、Q88N、P89R、G90S、A129V、P130T、K131P和Q133W；
(23)S87I、Q88N、P89R、G90S、P130T、K131P和Q133W；
(24)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、P130T、K131P和Q133W；
(25)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、P130T、K131P和Q133W。
7.根据项6所述的PD-1变体，其中与SEQ ID NO：1所示的野生型人PD-1多肽相比，所述PD-1变体包含或仅包含如(1)至(11)中任一组的氨基酸突变组合。
8.根据项7所述的PD-1变体，其中与SEQ ID NO：1所示的野生型人PD-1多肽相比，所述PD-1变体包含或仅包含如(1)至(6)中任一组的氨基酸突变组合。
9.根据项1至8中任一项所述的PD-1变体，其中所述PD-1变体不合胞内区，或不包含跨膜区和胞内区。
10.根据项1至9中任一项所述的PD-1变体，其中所述变体包含如SEQ ID NOs：2至26中任一所示的氨基酸序列或与之具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，或由如SEQ IDNOs：2至26中任一所示的氨基酸序列或与之具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
11.根据项10所述的PD-1变体，其中所述变体包含如SEQ ID NOs：2至12中任一所示的氨基酸序列或与之具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，或由如SEQ ID NOs：2至12中任一所示的氨基酸序列或与之具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
12.根据项11所述的PD-1变体，其中所述变体包含如SEQ ID NOs：2至7中任一所示的氨基酸序列或与之具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，或由如SEQ ID NOs：2至7中任一所示的氨基酸序列或与之具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
13.根据项1至12中任一项所述的PD-1变体，其中所述PD-1变体在如下位置与SEQID NO：1所示的野生型人PD-1多肽具有相同的氨基酸：M70、S71、P72、S73、N74、Q75、T76、D77和K78。
14.根据项1至13中任一项所述的PD-1变体，所述PD-1变体具有如SEQ ID NO：1中第1至20位氨基酸所示的信号肽。
15.根据项1至14中任一项所述的PD-1变体，其中与野生型人PD-1多肽相比，所述PD-1变体以更高的亲和力与所述PD-L1多肽结合。
16.根据项1至15中任一项所述的PD-1变体，其中所述PD-1变体以低于10-7M的KD值与所述PD-L1多肽结合。
17.根据项1至16中任一项所述的PD-1变体，其中所述PD-1变体以低于10-6M的KD值与人PD-L2多肽结合。
18.根据项1至17中任一项所述的PD-1变体，其中与野生型人PD-1多肽相比，所述PD-1变体以更高的亲和力与所述PD-L2多肽结合。
19.根据项1至18中任一项所述的PD-1变体，其中所述PD-1变体与至少两种，优选至少三种，选自下组的抗PD-1抗体不结合：信迪利单抗(Sintilimab)、纳武单抗(Nivolumab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)、帕博利珠单抗(Pemrolizumab)和特瑞普利单抗(Toripalimab)。
20.根据项19所述的PD-1变体，其中所述PD-1变体与如下抗PD-1抗体不结合：信迪利单抗(Sintilimab)、纳武单抗(Nivolumab)和帕博利珠单抗(Pemrolizumab)。
21.根据项20所述的PD-1变体，其中所述PD-1变体与信迪利单抗(Sintilimab)、纳武单抗(Nivolumab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)、帕博利珠单抗(Pemrolizumab)和特瑞普利单抗(Toripalimab)中的每一个均不结合。
22.根据项1至21中任一项所述的PD-1变体，其中所述PD-1变体与替雷利珠单抗(Tilelizumab)结合。
23.根据项22所述的PD-1变体，其中所述PD-1变体与替雷利珠单抗(Tilelizumab)的结合亲和力以低于10-9M的KD值表示。
24.一种融合蛋白，其包含根据项1至23中任一项所述的PD-1变体。
25.根据项24所述的融合蛋白，其进一步包含免疫球蛋白Fc片段。
26.根据项25所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc片段来源于哺乳动物，优选人。
27.根据项24所述的融合蛋白，其包含所述PD-1变体作为胞外结构域，所述PD-1变体不包含胞内区，并进一步包含源自共刺激分子的胞内信号传递结构域。
28.根据项27所述的融合蛋白，所述共刺激分子选自下组：OX40、4-1BB、CD28、ICOS、CD27。
29.根据项27或28所述的融合蛋白，其进一步包含PD-1的跨膜区。
30.一种分离的核酸分子，其编码如项1至23中任一项所述的PD-1变体。
31.根据项30所述的核酸分子，其包含如SEQ ID NOs：56-61中任一项所示的核苷酸序列，或与如SEQ ID NOs：56-61中任一项所示的核苷酸序列具有至少85％同源性的核苷酸序列。
32.一种分离的核酸分子，其编码如项24至29中任一项所述的融合多肽。
33.一种表达载体，其包含如项30至32中任一项所述的分离的核酸分子。
34.一种宿主细胞，其包含如项30-32中任一项所述的分离的核酸分子，或如项33所述的表达载体。
35.一种药物组合物，其包含根据项1至23中任一项所述的PD-1变体，和药学上可接受的载体。
36.一种药物组合物，其包含根据项24至29中任一项所述的融合蛋白，和药学上可接受的载体。
37.根据项1至23中任一项的PD-1变体或根据项24至29中任一项的融合蛋白在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
38.一种药物组合，其包含(1)根据项1至23中任一项的PD-1变体或根据项24至29中任一项的融合蛋白，和(2)抗PD-1抗体。
39.根据项38所述的药物组合，其中所述抗PD-1变体不与所述抗PD-1抗体结合。
40.根据项39所述的药物组合，其中所述抗PD-1抗体选自下组：信迪利单抗(Sintilimab)、纳武单抗(Nivolumab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)、帕博利珠单抗(Pemrolizumab)和特瑞普利单抗(Toripalimab)。
41.根据项38至40中任一项所述的药物组合，其用于治疗癌症。
42.一种细胞，其经修饰而表达如项24至29所述的融合蛋白。
43.项42所述的细胞，其为免疫细胞。
44.项43所述的细胞，其中所述免疫细胞在经修饰之前源自外周血单个核细胞或为肿瘤浸润淋巴细胞。
45.项44所述的细胞，所述免疫细胞是T细胞。
46.项42至45中任一项的细胞，其经修饰后用于治疗癌症。
实施例
为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的项具体限定。
实施例1.PD-1突变体文库构建
本实施例描述PD-1突变体文库的构建过程。
概括而言，对PD-1(SEQ ID NO：1)中参与了PD-1和PD-L1，或PD-1和PD-L2的相互作用的位点进行随机突变，因为这些区域通常也是抗体结合表位所在的区域。由此构建了突变体质粒文库，并转入293T细胞中用于后续分析。
具体而言，对SEQ ID NO：1中的三个区域进行了随机突变，第一个区域为第70-78号氨基酸，第二个区域为第84-90号氨基酸，第三个区域为第127-133号氨基酸。为了实现随机突变，设计了六组随机突变引物，每对引物能够随机突变属于上述区域的5个连续氨基酸的相应密码子。具体来说，6组引物分别包含用于随机突变第70-74号氨基酸(7074-For/Rev)、第74-78号氨基酸(7478-For/Rev)、第84-88号氨基酸(8488-For/Rev)、第86-90号氨基酸(8690-For/Rev)、第127-131号氨基酸(12731-For/Rev)、第129-133号氨基酸的密码子(12933-For/Rev)。在用于随机突变的六组引物中，在上游引物中包含对应于这些氨基酸的密码子，并且将这些密码子设计为5个连续的NNK密码子，其中N代表A、T、C、G中任意一种碱基，K代表G或T中的任意一种碱基。具体的六组引物序列(SEQ ID NOs：27-40)如下表1所示。还设计了另外两条引物P1-For和P1-Rev(SEQ ID NOs：35和36)，其序列也列于表1。P1-For和P1-Rev与其它六对突变引物配合用于扩增非突变区和突变区，并通过重叠PCR扩增完整PD-1的DNA序列使用。
表1.用于随机突变的引物设计
使用表1中的7组引物对，以PrimeStar DNA聚合酶(Takara，R045B)进行聚合酶链式反应，分别扩增包含PD-1突变区域和不包含PD-1突变区域的片段。以突变第70-74号氨基酸为例，使用的引物分别为7074-For+P1-Rev和P1-For+7074-Rev。扩增条件为：98℃10秒、58℃5秒、72℃5秒，共30个循环。
接下来进行重叠PCR。以突变第70-74号氨基酸为例，以上述两个PCR扩增的产物的等摩尔比混合物为模板，使用P1-For和P1-Rev引物扩增包含第70-74号氨基酸随机突变的PD-1全长序列。扩增条件为：98℃10秒、58℃5秒、72℃5秒，共30个循环。使用Sal I和Xba I限制性内切酶分别消化所述全长序列的PCR产物和慢病毒载体pLV2-PDl-CD28(质粒图如图1所示；质粒的完整序列如SEQ ID NO：63所示，共8417bp，其中1368-1877为PD1胞外区，1878-1940为PD1跨膜区，1941-2063为CD28胞内区)。使用T4 DNA连接酶将经过消化的包含随机突变的全长序列和载体连接，由此制备PD-1随机突变质粒文库。
使用各个连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1菌株(北京全式金生物，货号CD501-03)。具体而言，将连接产物添加至冰上解冻的大肠杆菌Transl-T1化学转化感受态细胞中，并在冰上放置30分钟。然后于42℃孵育45秒，之后在冰上放置2分钟，并加入LB培养基，在37℃摇床上培养45分钟。培养之后，将菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，并在37℃培养过夜。培养之后，计算文库克隆总数并提取文库质粒。
实施例2.使用PD-1随机突变文库质粒瞬时转染哺乳动物293T细胞
本实施例描述用实施例1中构建的PD-1随机突变文库质粒来转染293T细胞，以便构建表达PD-1突变体的293T细胞系。
将293T细胞按照如下方法培养。将低于20代次的人胚肾293T细胞系细胞从液氮中取出，并迅速置于37℃水浴锅中至完全融化。将融化后的细胞加入到10ml D10完全培养基(含10％胎牛血清的DMEM)培养基中。在混匀之后，以400g离心5min并弃去培养基。以适量培养基重悬，并加入至T25或T75细胞培养瓶进行培养。细胞起始密度约为2x105/ml。将细胞置于37℃，在5％二氧化碳的培养箱中培养72h，之后吸弃培养基。以磷酸盐缓冲液清洗贴壁细胞，并吸弃缓冲液。以0.5％胰酶-EDTA溶液静置消化细胞3-5min，至大部分细胞从培养瓶底部脱落。加入2mLD10完全培养基并混合。以400g离心5分钟，吸弃培养基并以1mL D10完全培养基重悬。取适量细胞进行流式反应或传代培养。
将构建的包含PD-1随机突变的变体质粒文库通过PEI (Poly(ethylenimine)，聚乙烯亚胺)转染法转入293T细胞中。将各文库质粒与PEI以质量比1∶3混合，瞬时转染293T细胞。由此获得了包含随机突变的PD-1变体文库质粒的293T细胞。
实施例3.流式细胞术筛选与PD-L1结合但不与抗PD-1抗体结合的细胞
本实施例描述了通过流式细胞术分选具有期望的结合能力的细胞群体的过程。
瞬时转染48小时后，以胰酶-EDTA溶液消化细胞。以400g离心5分钟，吸弃培养基并以磷酸盐缓冲液重悬。取一部分细胞悬液与PD-L1-Fc(R&D Systems，156-B7-100)、Dylight650标记的山羊抗人IgG Fc二抗(Abcam，ab97006)在4℃孵育30分钟。再取一部分细胞悬液与生物素标记的抗PD-1抗体(包括信迪利单抗、纳武单抗、替雷利珠单抗、卡瑞利珠单抗、帕博利珠单抗、特瑞普利单抗中的一种)、PE标记的链霉亲和素(BD Bioscience，554061)孵育。
以流式细胞分选仪分析并收集与PD-L1结合且与抗PD-1抗体不结合的细胞群体。首先使用帕博利珠单抗(pemrolizumab)通过流式细胞术进行了分选，参见图2。具体而言，分选出如图2流式细胞图中红色方框区域的细胞。再将这些细胞分别与其它五种抗体进行结合实验，选择与4种或5种抗体不结合的细胞群体。作为初步筛选的结果，总共收集了5000个细胞。
实施例4.分离和鉴定通过分选获得的细胞中的质粒
本实施例描述了对实施例3中获得的细胞中所含PD-1变体质粒的分离和鉴定过程。
测序
取实施例3中通过流式细胞术分选并收集的5000个细胞，以质粒小量提取试剂盒(全式金生物，EM101-02)进行质粒提取。
按照与实施例1中相同的方法，用提取的质粒转化大肠杆菌Trans1-T1菌株。培养之后，挑取单克隆大肠杆菌，并以EF-1α寡核苷酸引物进行测序，以获得克隆中所含PD-1变体的核苷酸序列，并基于此得出对应的氨基酸序列。在使用的5000个细胞中，获得并测序了约300个克隆。在测序的克隆中，共有约60个克隆(约占20％)测序结果为无关序列，约30个克隆(约占10％)中所含PD-1突变成功但是包含终止密码子，突变成功且能有效表达的克隆约为210个(约占70％)。
在表2中示出了筛选出的PD-1变体相对于野生型PD-1的突变氨基酸位置和氨基酸类型(未示出所有测序克隆的序列)。在表2中，SEQ ID NO：1为野生型PD-1，而SEQ ID NOs：2-26为获得的代表性PD-1变体的序列。
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从表2中可知，本发明的变体的突变位点集中在E84、D85、R86、S87、Q88、P89、G90、A129、P130、K131、A132和Q133这12个位点上。与最初设计时(参见实施例1)进行随机突变的三个区域进行比对，可以发现这些突变都集中在后两个区域，即从E84至G90的第二个区域，和从S127至Q133的第三个区域(更具体为A129至Q133)。在各个代表性变体中，无一在M70至K78的区域内包含氨基酸突变，也没有在S127和L128发生突变。
基于293T细胞的流式细胞分析验证各种突变体与PD-L1、PD-L2及各种抗体的结合 能力
基于测序结果，选择如上所述在预期引入突变的三个区域内的相应位点突变成功且未突变为终止密码子的克隆。提取这些克隆的质粒，并分别用于瞬时转染293T细胞。转染方法如实施例2中所述。
转染48小时后消化细胞，并取部分细胞与人IgG1来源的Fc融合表达的PD-L1(R&DBiosystems)和Dylight650标记的山羊抗人IgG Fc二抗(Abcam)在4℃孵育30分钟。然后在400g离心5分钟，并以PBS磷酸盐缓冲液重悬、洗涤细胞。重复离心和洗涤一次。同时取部分细胞与人IgG1来源的Fc融合表达的PD-L2(R&D Biosystems，PD2-H5251)和Dylight650标记的山羊抗人IgG Fc二抗(Abcam，ab97006)孵育，然后以磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次。同时，还取部分细胞与生物素标记的各个抗PD-1抗体和PE标记的链霉亲和素孵育。
以流式细胞术分析各个变体以及与野生型PD-1与PD-L1、PD-L2和抗PD-1抗体的结合情况，并将结果示于表2(原始数据图未显示)。表2中的“+”代表可以结合，“-”代表不能结合(即低于检出值)。使用的野生型PD-1是长度与变体PD-1相同且氨基酸位置对应的野生型PD-1的片段，其序列对应于如SEQ ID NO：1所示的野生型人PD-1氨基酸序列的第1至155位。
在210个PD-1的目标序列成功突变且不包含终止密码子的克隆中，无法与PD-L1结合的约为60个(约占20％)，能够结合PD-L1但结合4-6种测试抗体的约为120个(约占40％)，而同时满足能够结合PD-L1且仅和1-3种测试抗体结合的克隆仅有约30个(约占10％)。最终确定了具有如表2所示的25种序列的变体。
如表2所示，基于流式细胞术分析，野生型的人PD-1能够与PD-L1和PD-L2结合，并且也能够与全部6种检测的抗PD-1抗体结合。与之相比，本发明的25种代表性PD-1变体均能与PD-L1结合；大多数变体同时也能够结合PD-L2(PD1_49#_93和56#-2AA除外)。全部变体均可与Tilelizumab结合，且至少与三种以上的抗PD1单抗不结合。值得注意的是，仅第三个区域中包含突变的变体(PD1_56#，PD1_49#和PD1_110#)保留了对三种抗体(包括Tilelizumab)的结合能力，而其它变体在第二和第三这两个区域中都包含突变并且仅保留了对一种抗体(即Tilelizumab)的结合能力。
基于人T细胞的流式细胞分析验证各种突变体与PD-L1、PD-L2及各种抗体的结合 能力
虽然上文在293T表达了各种突变体并测试了各种突变体与PD-L1、PD-L2及各种抗体的结合能力，鉴于各种突变体主要通过T细胞实现其效应功能，还将各种突变体通过慢病毒表达于人T细胞，用流式细胞术对筛选出的变体与PD-L1、PD-L2及各种抗体的结合能力进行了验证，并将结果示于表3(原始数据图未显示)。
人T细胞分离、病毒感染与培养过程如下进行。取1×108个液氮冻存的外周血单个核细胞(PBMC)。在37℃水浴中快速解冻之后，加入到5倍体积的、预热的T细胞培养基(X-VIVO15+0.5％HSA+300U/m1 IL-2)中，并混匀。然后以400g，5min离心，并弃去上清。以20m1所述T细胞培养基重悬细胞，并置于T175培养瓶中在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养。
1天后，将3倍细胞数量的CD3/CD28磁珠(Thermo)加入到细胞悬液中，并继续培养。
1天后，向T细胞培养物中加入MOI＝3数量的慢病毒，并继续培养。慢病毒的制备过程如下。在管1中加0.75mL的DMEM培养基(Biol0gical Industries，06-1055-57-1A)和质粒溶液(VSVG 2.5μg+dR8.917.5μg+PLV2-PD1-CD28 10μg，总量为20μg)。在管2中加0.75mL的DMEM培养基和聚乙烯亚胺(PEI)溶液60μ1。将管1与管2溶液混合后静置30分钟，之后加入到生长293T细胞的T75培养瓶中。24小时后收集病毒上清，以100000g离心2小时，弃上清。以500u1 X-VIVO15培养基重悬病毒，用于感染T细胞。
5天后，将细胞与磁珠复合物吹打均匀，尽量使磁珠与细胞分离，然后将离心管置于磁力架上进行吸附。1分钟后，将细胞悬液转移至新的离心管，并重复上述吹打和吸附步骤3次。细胞以T细胞培养基重悬后继续培养。
取培养7-14天的T细胞，与人IgG1来源的Fc融合表达的PD-L1(R&D Biosystems)、Dylight650标记的山羊抗人IgG Fc二抗(Abcam)孵育。同时取部分细胞与人IgG1来源的Fc融合表达的PD-L2(R&D Biosystems，PD2-H5251-100ug)和Dylight650标记的山羊抗人IgGFc二抗(Abcam，ab97006)孵育，以磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次。同时，还取部分细胞与生物素标记的抗PD-1抗体、PE标记的链霉亲和素孵育。
以流式细胞术分析与PD-L1和抗PD-1抗体的结合情况，并将结果示于表3。表3中的“+”代表可以结合，“-”代表不能结合(即低于检出值)。发现在结合特性上的结果与在293T细胞中获得的完全一致。
实施例5.制备PD-1变体-兔IgGFc融合蛋白
将部分PD-1变体(SEQ ID NOs：2-7的PD-1变体)与兔IgG Fc进行融合表达和纯化，并以野生型PD-1(SEQ ID NO：1)作为对照。具体步骤如下。
使用PCR扩增对应于表2中所示的野生型(SEQ ID NO：1)和6种变体(氨基酸序列为SEQ ID NOs：2-7的变体)的核苷酸序列(序列如SEQ ID NOs：55-61所示)。引物为如下所示的P32-For和P32-Rev(SEQ ID NO：43和44)，使用实施例1中构建的含有PD-1野生型和变体的pLV2-PD1-CD28载体作为模板。扩增试剂、体系、扩增条件同实施例1中的PCR条件。
P32-For：TCAGTAGCTAGCGGTACCGCCGCCACCatgcagatcccacagg
P32-Rev：GTTGAGGATCCgtgggctgtgggcacttctg
以Nhe I和BamH I限制性内切酶分别消化PCR产物和蛋白表达载体pcDNA3.4-RFc(包含兔IgGFc(RFc)基因的pcDNA3.4载体(Thermo))中。使用T4 DNA连接酶将经过消化的PD-1编码序列和载体连接，由此制备pcDNA3.4-PD1-RFc表达载体，用于转染细胞。
在转染之前，将HEK293细胞(珠海凯瑞)在37℃、5％CO2、120rpm条件下培养至1×106个细胞/ml的密度。将构建的pcDNA3.4-PD1-RFc载体使用5mL/L的转染试剂TA-293(珠海凯瑞)转染到所述HEK293细胞中，转染质粒浓度为1.5mg/L。转染后在37℃、8％CO2、120rpm条件下培养7天。培养结束后在4000rpm离心培养物，收集上清液。用Protein A珠纯化蛋白，用500uL pH2.6-3.0的0.1M Gly-HCL洗脱液洗脱，并收集洗脱液以获得纯化的融合蛋白。
对纯化的融合蛋白在还原和非还原条件下进行了SDS-PAGE。蛋白质电泳图如图3所示。在图3中，泳道1-7分别为包含野生型PD-1和PD-1变体1-6的融合蛋白，泳道8为蛋白分子量标准。图3A为非还原条件下电泳，图3B为还原条件下电泳。融合蛋白的预期分子量约为43KDa。在还原条件下，条带大小与预期较为接近。在非还原条件下，融合蛋白形成了二聚体，并有糖基化等修饰，因此分子量高于86KDa。在非还原条件下，第3、4、6泳道有明显的多条带，且条带分子量较高，这可能表明分子量更高的条带有不同形式的聚合，如多聚体的产生，或者存在不同程度、不同类型的蛋白质修饰。
实施例6.通过BiacoreT200测定亲和力
通过Biacore T200测定了野生型PD-1以及本发明的代表性PD-1变体(SEQ IDNOs：2-7的变体)与PD-L1、PD-L2以及实施例3中所述6种PD-1单抗的亲和力。
亲和力统计结果见表4A-B所示。在表4A中以“不结合”表示测定结果低于BiacoreT200仪器检测下限，即表示亲和力的KD值高于10-3M。
表4A.PD-1突变体与PD-L1、PD-L2和6种PD-1单抗的亲和力测定
表4B.表4A的原始数据
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从表4的结果可知，Biacore实验结果验证了前述实施例中通过流式细胞术确定的各种结合特性，并提供了具体的结合亲和力数值。全部6种变体与PD-L1和PD-L2以及Tilelizumab均具有较高的结合亲和力，KD值均小于10-6。全部6种变体均具有至少比野生型PD-1低两个数量级的KD值，意味着显著更高的与PD-L1的结合亲和力。变体2(SEQ ID NO：3)、变体5(SEQ ID NO：6)和变体6(SEQ ID NO：7)还具有比野生型PD-1高的PD-L2结合亲和力。变体1、变体3和变体4与PD-L2的结合亲和力则低于野生型PD-1。在与抗PD-1抗体Tilelizumab的结合亲和力方面，变体1(SEQ ID NO：2)和变体6(SEQ ID NO：7)与野生型PD-1相当。
实施例7. 108-CD28 Fe阻断细胞因子分泌的功能实验
将PD1-CD28表达T细胞(PD1-CD28-T)与PD-L1阳性肿瘤细胞(J82-PD-L1)共培养时，T细胞会释放IL-2。在加入抗PD-1抗体时，抗PD-1抗体会结合PD-1，从而阻断T细胞通过PD-1与肿瘤细胞结合，进而抑制IL-2的释放。同样，加入PD-1突变体Fc融合蛋白时，其与靶细胞上的PD-L1结合，使PD-L1不能和T细胞膜上的PD-1结合，也具有和抗-PD-1抗体类似的阻断IL-2释放的效果。
PD1-CD28-T细胞制备过程
将实施例1中所述的pLV2-PD1-CD28质粒(PD-1为人野生型PD-1)如实施例4所述制备成慢病毒载体并用于感染人T细胞，以获得PD1-CD28-T细胞。T细胞培养方法如实施例4所述。
J82-PDL1细胞制备过程
将pLV2-PDL1质粒(PD-L1为人野生型PD-L1)如实施例4所述制备成慢病毒载体并用于感染人膀胱癌细胞系(购自中国医学科学院，货号1101HUM-PUMC000346)，以获得J82-PDL1细胞系。
PD-1变体Fc融合蛋白阻断IL-2分泌实验
1.用0.05％胰酶消化、清洗并重悬J82-PDL1细胞，方法如实施例2中所述，密度调整为1×105/mL。取PD1-CD28-T细胞，清洗、重悬，如实施例4所述，调整密度为1×106/mL，添加6ng/mL的PMA(佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯，Sigma，货号P8139-1MG)。
2.向96孔板中分别加入100ulJ82-PDL1细胞和100ul PD1-CD28-T细胞，并分别加入终浓度为0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2nM的Anti-IgG4-RFc(阴性对照，不与PD-1或PD-L1结合)、替雷利珠单抗(阳性对照)、实施例5中制备的2种PD1-RFc(变体56#-16、56#-108)融合蛋白，37℃培养16小时。
3.取96孔板，500g×3min离心，取50μL上清用IL-2 ELISA试剂盒(达科为，货号1110203)检测IL-2浓度。
表5为不同浓度抗体或融合蛋白加入后，T细胞分泌IL-2浓度的测定值，图5为表5数据的趋势图。表5中的数据说明，替雷利珠单抗在浓度低于6.4nM情况下，IL-2分泌无明显变化，当浓度≥6.4nM时，IL-2分泌被显著抑制；56#-16融合蛋白随着浓度提高，IL-2分泌呈下降趋势，但IL-2分泌没有被完全抑制；56#-108融合蛋白随着浓度提高，IL-2分泌呈下降趋势，趋势较56#-16融合蛋白组明显，不如替雷利珠单抗组明显，但在浓度≥25.6nM时，IL-2分泌抑制效果较替雷利珠单抗组强。该结果说明PD-1突变体融合蛋白具有与PD-1单抗类似的阻断PD-1/PD-L1信号传递的作用。
表5
实施例8.细胞因子分泌实验
本实施例通过IL-2分泌实验测试了基于本发明PD1变体的增强受体对T细胞功能的作用。
将表达PD1-CD28的T细胞(PD1-CD28-T)与PD-L1阳性肿瘤细胞共培养时，T细胞会通过PD-1与PD-L1的相互作用而释放细胞因子IL-2。因此，通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测共培养的培养液中IL-2的含量，可以判定PD1-CD28促进IL-2分泌的效果。
如图5所示，在96孔板中，将过表达人PD-L1的Malme-3M肿瘤细胞(3M-PDL1-OE)和敲除了人PD-L1的Malme-3M肿瘤细胞(3M-PDL1-KO)作为靶细胞，并分别以表达PD1变体(56#-108突变体)和CD28构成的增强受体的T细胞(图5中显示为108T，也可称为108-CD28-T)和无基因修饰的T细胞(T)作为效应细胞，按照靶细胞∶108T＝10∶1的比例，即靶细胞1×105/孔，108T细胞1×104/孔，在添加3ng/ml PMA(佛波酯)的培养基中共培养。将过夜培养的上清作为待检测样品，与检测标准品一起进行IL-2ELISA分析。
使用人IL-2检测试剂盒(ELISA法)(达科为，货号1110203)，按照如下流程进行ELISA。预先用抗人IL-2捕获抗体包被微孔板。将标准品或待检样品和检测抗体(生物素标记的抗人IL-2抗体)同时加入微孔板，然后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(SA-HRP)，其特异性结合免疫复合物中的生物素。加入酶底物四甲基联苯胺(TMB)，出现蓝色，颜色的深浅与标准品或样本中IL-2浓度相关，显色5-10分钟后加入终止液终止反应，通过多功能酶标仪读取450nm处光吸收值(OD)。在一定范围内人IL-2浓度与OD值成正比，使用IL-2标准品进行ELISA检测并得到了标准曲线。使用该标准曲线计算出了每种共培养物中的IL-2浓度。
如图5所示，在靶细胞的PD-L1被敲除的情况下，无论是对照T细胞还是武装有PD-1变体增强受体的T细胞(108T，即108-CD28-T)，因没有第二信号刺激源，均没有IL-2分泌(红色柱图)；而与高表达PD-L1靶细胞共培养时，108T增强受体武装的T细胞在受到刺激时释放了大量IL-2，表明PD1变体108与CD28的融合蛋白(108-CD28)具有传递刺激T细胞的信号的功能。
实施例9.肿瘤细胞杀伤实验
本实施例涉及细胞杀伤实验。通过使T细胞表达包含本发明的PD-1变体的PD1-C28增强受体，证实了该PD-1变体增强受体可增强T细胞PD-L1表达肿瘤细胞的杀伤能力。
肿瘤细胞表面会表达HLA-肽复合抗原，而T细胞会表达靶向该抗原的T细胞受体(TCR)。将这样的肿瘤细胞和与之对应的T细胞进行共同孵育，T细胞上的TCR与肿瘤细胞上的复合抗原的接触就会介导一系列T细胞的杀伤反应，将肿瘤细胞裂解。
在本实验中，肿瘤细胞为表达Eso1抗原和PD-L1的J82细胞(J82Eso1PDL1)。为了制备J82Eso1PDL1肿瘤细胞系，按照实施例4中的方法分别制备了表达人PD-L1和ESO1基因的慢病毒载体，分别命名为pLV2-PDL1和pLV2-ESO1。如实施例4中所述，使用所述pLV2-PDL1慢病毒感染人膀胱癌细胞系(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号1101HUM-PUMC000346)，获得表达人PD-L1的J82-PDL1细胞。然后，再用如上所述制备的pLV2-ESO1慢病毒感染所述J82-PDL1细胞。该细胞的ESO1抗原在胞内表达并被加工后，以ESO1peptide的形式递呈到胞外并与J82细胞表面表达的HLA*A0201蛋白形成抗原复合物，该复合物能被特异性的T细胞受体(T cell receptor，TCR)所识别。
制备了三种不同的T细胞，包括：(1)表达靶向HLA-Eso1肽的TCR的T细胞(TCR-T)；(2)表达PD1变体(56#-108突变体，即变体6)和CD28构成的增强受体以及靶向HLA-Eso1肽的TCR的T细胞(108-TCRT)；和(3)作为对照的表达GFP绿色荧光蛋白的T细胞(GFP-T)。
首先制备了PD1+T细胞。取冻存的健康捐献者的全血细胞于37℃快速水浴复苏，加入到5倍体积预热的T细胞培养基中，所述培养基为包含0.5％人血清白蛋白(欣吉尔，双鹭药业)的X-VIVO15(Lonza；BE02-053Q)。混合均匀后，以400g离心5min，去除上清。以PBS-0.5％HSA重悬，使密度为108总细胞/ml。加入生物素标记的抗PD1抗体Biotin-anti-PD1(Biolegend，货号329934)，在4℃孵育20分钟，以PBS-0.5％HSA清洗两次。加入抗生物素微珠(Anti-BiotinMicrobeads)(关天旎，货号130-090-485)，混匀，并在4℃孵育20分钟。以PBS-0.5％HSA清洗两次。使用LS分选柱(关天旎，货号130-042-401)分选PD1+的T细胞。将获得的PD1+T细胞参照实施例4所述的方式培养。
为了制备TCR-T细胞，如实施例4中所述制备包含TCR编码序列的慢病毒载体pLV2-TCR。所述TCR为特异性识别HLA*A0201/ESO1peptide复合物的T细胞受体，编码序列如SEQID NO：41所示。然后按照实施例4所述的方法使用所述慢病毒感染上述PD1+T细胞，以获得TCR-T细胞。
为了制备表达增强受体的T细胞，按照实施例4所述的方法制备包含PD1变体增强受体PD1-CD28(简称108-CD28)和TCR编码序列的慢病毒载体。再使用该慢病毒感染上述PD1+T细胞，感染方式如实施例4所述，获得108-TCRT细胞。108-TCR的基因序列如SEQ ID NO：42所示。增强受体中的跨膜区为源自PD1的跨膜区。
杀伤实验利用实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)进行，以检测靶细胞的存活。具体而言，先将J82Eso1PDL1靶细胞置于培养板的96孔板中培养(每孔100ul，靶细胞浓度8x104/ml)。在18小时的时间点，将TCR-T细胞或经增强受体修饰的TCR-T细胞(108-TCR-T)分别加入到对应的孔中，观察并记录靶细胞的生长情况，结果示于图6。
在图6中，纵坐标的细胞指数反映的是细胞的贴壁情况，数值越高表明贴壁的细胞越多，也意味着活细胞多且生长情况良好。横坐标为时间，并以小时表示。
从图6中可见，表达增强受体的TCR-T细胞均比单独的TCR-T展现出对肿瘤细胞更强的抑制。与不带TCR的对照细胞GFP-T共培养的J82Eso1PDL1虽然有些非特异杀伤作用，但仍保持生长状态(图6蓝色曲线)；而和Eso1-TCR-T共培养的82Eso1PDL1，则可见生长明显受到抑制(绿色曲线)。而与表达本发明的增强受体的TCR-T(108-TCRT)共培养的靶细胞数量显著下降，说明靶细胞被杀灭(图6红色曲线)，表明表达增强受体的TCR-T的杀伤效果更强。
关键序列信息
SEQ ID NO：1(PD1-wt)
SEQ ID NO：2(Mut1/56#)
SEQ ID NO：3(Mut2/56#-2)
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SEQ ID NO：10(Mut9/56#-15-61)
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SEQ ID NO：2656#-16AA
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序列表
<110> 北京卡替医疗技术有限公司
<120> PD-1变体及其用途
<130> PT13035CMT33CN
<160> 63
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 288
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
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<210> 2
<211> 155
<212> PRT
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<220>
<223> 变体PD1_56#
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体PD1_56#-2
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Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 变体PD1_56#-3
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Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 变体PD1_56#-15
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Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
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<223> 变体PD1_56#-16
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Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 变体PD1_56#-108
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体56#-2AA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体56#-15-38
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Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体56#-15-61
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体56#-15-69
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体56#-15-68
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1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体PD1_49#
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Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
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<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体PD1_110#
<400> 14
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Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体PD1_49#_93
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<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体PD1_49#_260
<400> 16
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Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
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<210> 17
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体PD1_110#_48
<400> 17
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
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Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
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Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
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145 150 155
<210> 18
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体56#-15-7
<400> 18
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体56#-16-12
<400> 19
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Phe Phe Thr Val Ser Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Thr Pro Phe Trp Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His
145 150 155
<210> 20
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体56#-16-13
<400> 20
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Phe Phe Thr Val Ser Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Gly Thr Pro Phe Trp Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His
145 150 155
<210> 21
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体56#-16-50
<400> 21
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Phe Phe Thr Val Ser Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ile Thr Pro Gly Trp Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His
145 150 155
<210> 22
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体56#-108-51
<400> 22
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ile Asn Arg Ser Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
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100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Thr Thr Pro Phe Trp Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His
145 150 155
<210> 23
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体56#-108-60
<400> 23
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ile Asn Arg Ser Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Val Thr Pro Ala Trp Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His
145 150 155
<210> 24
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体56#-108AA
<400> 24
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ile Asn Arg Ser Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Thr Pro Ala Trp Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His
145 150 155
<210> 25
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体56#-15AA
<400> 25
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Phe Arg Asn Cys Thr Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Thr Pro Ala Trp Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His
145 150 155
<210> 26
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体56#-16AA
<400> 26
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Phe Phe Thr Val Ser Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Thr Pro Ala Trp Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His
145 150 155
<210> 27
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 27
gtgctaaact ggtaccgcnn knnknnknnk nnkcagacgg acaagctggc cgccttc 57
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gcggtaccag tttagcacga ag 22
<210> 29
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 29
taccgcatga gccccagcnn knnknnknnk nnkctggccg ccttccccga g 51
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gctggggctc atgcggtac 19
<210> 31
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 31
tacctctgtg gggccatcnn knnknnknnk nnkgcgcaga tcaaagagag cctg 54
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gatggcccca cagaggtagg tg 22
<210> 33
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 33
tgtggggcca tctccctgnn knnknnknnk nnkatcaaag agagcctgcg ggcag 55
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cagggagatg gccccacaga g 21
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tagctctaga ccaccatgca gatcccacag 30
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gattgtcgac ttaggagcga taggctg 27
<210> 37
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 37
caagctggcc gccttccccn nknnknnknn knnkcccggc caggactgcc gcttc 55
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ggggaaggcg gccagcttgt c 21
<210> 39
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 39
tggccgcctt ccccgaggac nnknnknnkn nknnkcagga ctgccgcttc cgtgtc 56
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gtcctcgggg aaggcggcca g 21
<210> 41
<211> 1812
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ESO1-TCR构建体
<400> 41
atggagaccc tcttgggcct gcttatcctt tggctgcagc tgcaatgggt gagcagcaaa 60
caggaggtga cgcagattcc tgcagctctg agtgtcccag aaggagaaaa cttggttctc 120
aactgcagtt tcactgatag cgctatttac aacctccagt ggtttaggca ggaccctggg 180
aaaggtctca catctctgtt gcttattcag tcaagtcaga gagagcaaac aagtggaaga 240
cttaatgcct cgctggataa atcatcagga cgtagtactt tatacattgc agcttctcag 300
cctggtgact cagccaccta cctctgtgct gtgaggccct tatacggagg aagctacata 360
cctacatttg gaagaggaac cagccttatt gttcatccgt acatccagaa ccctgaccct 420
gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 480
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 540
actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 600
aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 660
ttccccagcc cagaaagttc ctgtgatgtc aagctggtcg agaaaagctt tgaaacagat 720
acgaacctaa actttcaaaa cctgtcagtg attgggttcc gaatcctcct cctgaaagtg 780
gccgggttta atctgctcat gacgctgcgg ctgtggtcca gccaatgtac taactacgct 840
ttgttgaaac tcgctggcga tgttgaaagt aaccccggtc ctatgagcat cggcctcctg 900
tgctgtgcag ccttgtctct cctgtgggca ggtccagtga atgctggtgt cactcagacc 960
ccaaaattcc aggtcctgaa gacaggacag agcatgacac tgcagtgtgc ccaggatatg 1020
aaccatgaat acatgtcctg gtatcgacaa gacccaggca tggggctgag gctgattcat 1080
tactcagttg gtgctggtat cactgaccaa ggagaagtcc ccaatggcta caatgtctcc 1140
agatcaacca cagaggattt cccgctcagg ctgctgtcgg ctgctccctc ccagacatct 1200
gtgtacttct gtgccagcag ttacgtcggg aacaccgggg agctgttttt tggagaaggc 1260
tctaggctga ccgtactgga ggacctgaag aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt 1320
gagccatcag aagcagagat ctcccacacc caaaaggcca cactggtgtg cctggccaca 1380
ggcttcttcc ctgaccacgt ggagctgagc tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt 1440
ggggtcagca cggacccgca gcccctcaag gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac 1500
tgcctgagca gccgcctgag ggtctcggcc accttctggc agaacccccg caaccacttc 1560
cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc 1620
aaacccgtca cccagatcgt cagcgccgag gcctggggta gagcagactg tggctttacc 1680
tcggtgtcct accagcaagg ggtcctgtct gccaccatcc tctatgagat cctgctaggg 1740
aaggccaccc tgtatgctgt gctggtcagc gcccttgtgt tgatggccat ggtcaagaga 1800
aaggatttct aa 1812
<210> 42
<211> 2559
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 108-CD28-TCR构建体
<400> 42
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgtat taataggagt caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctgtctact ccggtgtgga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg gttggtgtcg tgggcggcct gctgggcagc 540
ctggtgctgc tagtctgggt cctggccgtc atcaggagta agaggagcag gctcctgcac 600
agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc 660
tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctccgagg gcagaggaag tcttctaaca 720
tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct atggagaccc tcttgggcct gcttatcctt 780
tggctgcagc tgcaatgggt gagcagcaaa caggaggtga cgcagattcc tgcagctctg 840
agtgtcccag aaggagaaaa cttggttctc aactgcagtt tcactgatag cgctatttac 900
aacctccagt ggtttaggca ggaccctggg aaaggtctca catctctgtt gcttattcag 960
tcaagtcaga gagagcaaac aagtggaaga cttaatgcct cgctggataa atcatcagga 1020
cgtagtactt tatacattgc agcttctcag cctggtgact cagccaccta cctctgtgct 1080
gtgaggccct tatacggagg aagctacata cctacatttg gaagaggaac cagccttatt 1140
gttcatccgt acatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc 1200
agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt 1260
aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa actgtgctag acatgaggtc tatggacttc 1320
aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc 1380
aacaacagca ttattccaga agacaccttc ttccccagcc cagaaagttc ctgtgatgtc 1440
aagctggtcg agaaaagctt tgaaacagat acgaacctaa actttcaaaa cctgtcagtg 1500
attgggttcc gaatcctcct cctgaaagtg gccgggttta atctgctcat gacgctgcgg 1560
ctgtggtcca gccaatgtac taactacgct ttgttgaaac tcgctggcga tgttgaaagt 1620
aaccccggtc ctatgagcat cggcctcctg tgctgtgcag ccttgtctct cctgtgggca 1680
ggtccagtga atgctggtgt cactcagacc ccaaaattcc aggtcctgaa gacaggacag 1740
agcatgacac tgcagtgtgc ccaggatatg aaccatgaat acatgtcctg gtatcgacaa 1800
gacccaggca tggggctgag gctgattcat tactcagttg gtgctggtat cactgaccaa 1860
ggagaagtcc ccaatggcta caatgtctcc agatcaacca cagaggattt cccgctcagg 1920
ctgctgtcgg ctgctccctc ccagacatct gtgtacttct gtgccagcag ttacgtcggg 1980
aacaccgggg agctgttttt tggagaaggc tctaggctga ccgtactgga ggacctgaag 2040
aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 2100
caaaaggcca cactggtgtg cctggccaca ggcttcttcc ctgaccacgt ggagctgagc 2160
tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca cggacccgca gcccctcaag 2220
gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac tgcctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 2280
accttctggc agaacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 2340
gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacccgtca cccagatcgt cagcgccgag 2400
gcctggggta gagcagactg tggctttacc tcggtgtcct accagcaagg ggtcctgtct 2460
gccaccatcc tctatgagat cctgctaggg aaggccaccc tgtatgctgt gctggtcagc 2520
gcccttgtgt tgatggccat ggtcaagaga aaggatttc 2559
<210> 43
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P32-For引物
<400> 43
tcagtagcta gcggtaccgc cgccaccatg cagatcccac agg 43
<210> 44
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P32-Rev引物
<400> 44
gttgaggatc cgtgggctgt gggcacttct g 31
<210> 45
<211> 1986
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD1-CD3-Fc构建体
<400> 45
aagcttgccg ccaccatgca gatcccacag gcgccctggc cagtcgtctg ggcggtgcta 60
caactgggct ggcggccagg atggttctta gactccccag acaggccctg gaaccccccc 120
accttctccc cagccctgct cgtggtgacc gaaggggaca acgccacctt cacctgcagc 180
ttctccaaca catcggagag cttcgtgcta aactggtacc gcatgagccc cagcaaccag 240
acggacaagc tggccgcctt ccccgaggac cgtattaata ggagtcagga ctgccgcttc 300
cgtgtcacac aactgcccaa cgggcgtgac ttccacatga gcgtggtcag ggcccggcgc 360
aatgacagcg gcacctacct ctgtggggcc atctccctgt ctactccggt gtggatcaaa 420
gagagcctgc gggcagagct cagggtgaca gagagaaggg cagaagtgcc cacagcccac 480
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatctgacat ccagatgacc 540
cagtccccga gctccctgtc cgctagcgtg ggcgataggg tcaccatcac ctgtcgtgcc 600
agtcaggaca tccgtaatta tctcaactgg tatcaacaga aaccaggaaa agctccgaaa 660
ctactgattt actatacctc ccgcctggag tctggagtcc cttctcgctt ctctggttct 720
ggttctggga cggattacac tctgaccatc agcagtctgc aaccggagga cttcgcaact 780
tattactgtc agcaaggtaa tactctgccg tggacgttcg gacagggcac caaggtggag 840
atcaaaggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc ggaggttcag 900
ctggtggagt ctggcggtgg cctggtgcag ccagggggct cactccgttt gtcctgtgca 960
gcttctggct actcctttac cggctacact atgaactggg tgcgtcaggc cccaggtaag 1020
ggcctggaat gggttgcact gattaatcct tataaaggtg tttccaccta taaccagaaa 1080
ttcaaggatc gtttcacgat atccgtagat aaatccaaaa acacagccta cctgcaaatg 1140
aacagcctgc gtgctgagga cactgccgtc tattattgtg ctagaagcgg atactacggc 1200
gatagcgact ggtattttga cgtctggggt caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcgggc 1260
ggaggcggaa gcggaggagg cggctccggc ggaggcgaga gcaagtacgg ccccccttgt 1320
cctagctgtc ccgctcccga gttcctgggc ggccctagcg tgttcctgtt ccctcccaag 1380
cccaaggaca ccctgatgat cagcagaacc cccgaggtga cctgcgtggt cgtggacgtg 1440
agccaagagg accccgaggt gcagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac 1500
gccaagacca agcctagaga ggagcagttc aacagcacct acagagtggt gagcgtgctg 1560
accgtgctgc accaagactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt gagcaacaag 1620
ggcctgccta gcagcatcga gaagaccatc agcaaggcca aggggcagcc tagagagccc 1680
caagtgtaca ccctgccccc tagccaagag gagatgacca agaaccaagt gagcctgacc 1740
tgcctggtga agggcttcta ccctagcgac atcgccgtgg agtgggagag caacgggcag 1800
cccgagaaca actacaagac cacccccccc gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg 1860
tacagcagac tgaccgtgga caagagcaga tggcaagagg gcaacgtgtt cagctgcagc 1920
gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acacagaaga gcctgagcct gagcctgggc 1980
aagtaa 1986
<210> 46
<211> 1626
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Luc编码序列
<400> 46
atggtaaagc gtgagaaaaa tgtcatctat ggccctgagc ctctccatcc tttggaggat 60
ttgactgccg gcgaaatgct gtttcgtgct ctccgcaagc actctcattt gcctcaagcc 120
ttggtcgatg tggtcggcga tgaatctttg agctacaagg agttttttga ggcaaccgtc 180
ttgctggctc agtccctcca caattgtggc tacaagatga acgacgtcgt tagtatctgt 240
gctgaaaaca atacccgttt cttcattcca gtcatcgccg catggtatat cggtatgatc 300
gtggctccag tcaacgagag ctacattccc gacgaactgt gtaaagtcat gggtatctct 360
aagccacaga ttgtcttcac cactaagaat attctgaaca aagtcctgga agtccaaagc 420
cgcaccaact ttattaagcg tatcatcatc ttggacactg tggagaatat tcacggttgc 480
gaatctttgc ctaatttcat ctctcgctat tcagacggca acatcgcaaa ctttaaacca 540
ctccacttcg accctgtgga acaagttgca gccattctgt gtagcagcgg tactactgga 600
ctcccaaagg gagtcatgca gacccatcaa aacatttgcg tgcgtctgat ccatgctctc 660
gatccacgcg tgggcactca gctgattcct ggtgtcaccg tcttggtcta cttgcctttc 720
ttccatgctt tcggctttag cattactttg ggttacttta tggtcggtct ccgcgtgatt 780
atgttccgcc gttttgatca ggaggctttc ttgaaagcca tccaagatta tgaagtccgc 840
agtgtcatca acgtgcctag cgtgatcctg tttttgtcta agagcccact cgtggacaag 900
tacgacttgt cttcactgcg tgaattgtgt tgcggtgccg ctccactggc taaggaggtc 960
gctgaagtgg ccgccaaacg cttgaatctt ccagggattc gttgtggctt cggcctcacc 1020
gaatctacca gcgctaacat tcactctctc ggggatgagt ttaagagcgg ctctttgggc 1080
cgtgtcactc cactcatggc tgctaagatc gctgatcgcg aaactggtaa ggctttgggc 1140
ccgaaccaag tgggcgagct gtgtatcaaa ggccctatgg tgagcaaggg ttatgtcaat 1200
aacgttgaag ctaccaagga ggccatcgac gacgacggct ggttgcattc tggtgatttt 1260
ggatattacg acgaagatga gcatttttac gtcgtggatc gttacaagga gctgatcaaa 1320
tacaagggta gccaggttgc tccagctgag ttggaggaga ttctgttgaa aaatccatgc 1380
attcgcgatg tcgctgtggt cggcattcct gatctggagg ccggcgaact gccttctgct 1440
ttcgttgtca agcagcctgg taaagaaatt accgccaaag aagtgtatga ttacctggct 1500
gaacgtgtga gccatactaa gtacttgcgt ggcggcgtgc gttttgttga ctccatccct 1560
cgtaacgtaa caggcaaaat tacccgcaag gagctgttga aacaattgtt ggagaaggcc 1620
ggcggt 1626
<210> 47
<211> 870
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD-L1DNA构建体
<400> 47
atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60
gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120
aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180
gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240
tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300
atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360
gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420
attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480
cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540
accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600
acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660
acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720
ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt 780
ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840
aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg 870
<210> 48
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD-L1AA19-238构建体
<400> 48
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145 150 155 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
165 170 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
180 185 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205
Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg
210 215 220
<210> 49
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28TM-ICD构建体
<400> 49
Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu
1 5 10 15
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
20 25 30
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
35 40 45
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
50 55 60
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
65 70 75 80
<210> 50
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 4-1BBICD构建体
<400> 50
Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser
1 5 10 15
Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val
20 25 30
Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
35 40 45
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
50 55 60
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
65 70 75
<210> 51
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OX40ICD构建体
<400> 51
Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu
1 5 10 15
Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln
20 25 30
Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg
35 40 45
Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys
50 55 60
Ile
65
<210> 52
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ICOSICD构建体
<400> 52
Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
1 5 10 15
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp
20 25 30
Val Thr Leu
35
<210> 53
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD27ICD构建体
<400> 53
His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu
1 5 10 15
Pro Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser
20 25 30
Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser
35 40 45
Pro
<210> 54
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RFc构建体
<400> 54
Gly Ser Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn
50 55 60
Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn
65 70 75 80
Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro
100 105 110
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu
115 120 125
Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg
130 135 140
Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys
195 200 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
210 215 220
Ser Arg Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 55
<211> 465
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 55
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccac 465
<210> 56
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体PD1_56#编码序列
<400> 56
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctgtctact ccggtgtgga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccac 465
<210> 57
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD1_56#-2变体
<400> 57
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttcccct ttttgtttaa tcttcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctgtctact ccggtgtgga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccac 465
<210> 58
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD1_56#-3变体
<400> 58
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttcccct ggatgttttg ttttcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctgtctact ccggtgtgga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccac 465
<210> 59
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD1_56#-15变体
<400> 59
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggactttag gaattgtacg caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctgtctact ccggtgtgga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccac 465
<210> 60
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD1_56#-16变体
<400> 60
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggacttttt tacggttagt caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctgtctact ccggtgtgga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccac 465
<210> 61
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD1_56#-108变体
<400> 61
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgtat taataggagt caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctgtctact ccggtgtgga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccac 465
<210> 62
<211> 1184
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> EF1构建体
<400> 62
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360
ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccactgagta ccgggcgccg tccaggcacc 960
tcgattagtt ctcgtgcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184
<210> 63
<211> 8417
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pLV2-PD1-CD28构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1368)..(1877)
<223> PD1胞外区
<220>
<221> misc_feature
<222> (1878)..(1940)
<223> PD1跨膜区
<220>
<221> misc_feature
<222> (1941)..(2063)
<223> CD28胞内区
<400> 63
ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60
agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttcg 120
ggtttattac agggacagca gagatccagt ttggctgcat acgcgtcgtg aggctccggt 180
gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc 240
ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg 300
tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc 360
gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt 420
tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc 480
tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg 540
aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc 600
tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag 660
tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt 720
cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc 780
gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca 840
ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg 900
ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga 960
gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc 1020
tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc 1080
gtcgcttcat gtgactccac tgagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg 1140
tgcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc 1200
cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg 1260
gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa 1320
agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga gctagctcta gaccaccatg cagatcccac 1380
aggcgccctg gccagtcgtc tgggcggtgc tacaactggg ctggcggcca ggatggttct 1440
tagactcccc agacaggccc tggaaccccc ccaccttctc cccagccctg ctcgtggtga 1500
ccgaagggga caacgccacc ttcacctgca gcttctccaa cacatcggag agcttcgtgc 1560
taaactggta ccgcatgagc cccagcaacc agacggacaa gctggccgcc ttccccgagg 1620
accgcagcca gcccggccag gactgccgct tccgtgtcac acaactgccc aacgggcgtg 1680
acttccacat gagcgtggtc agggcccggc gcaatgacag cggcacctac ctctgtgggg 1740
ccatctccct ggcccccaag gcgcagatca aagagagcct gcgggcagag ctcagggtga 1800
cagagagaag ggcagaagtg cccacagccc accccagccc ctcacccagg ccagccggcc 1860
agttccaaac cctggtggtt ggtgtcgtgg gcggcctgct gggcagcctg gtgctgctag 1920
tctgggtcct ggccgtcatc aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga 1980
acatgactcc ccgccgcccc gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac 2040
gcgacttcgc agcctatcgc tcctaagtcg acaatcaacc tctggattac aaaatttgtg 2100
aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt 2160
taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata 2220
aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg 2280
tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc 2340
tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct 2400
gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt 2460
cggggaagct gacgtccttt ccatggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg 2520
ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc 2580
tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct 2640
ccctttgggc cgcctccccg cctggaattc gagctcggta cctttaagac caatgactta 2700
caaggcagct gtagatctta gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat 2760
tcactcccaa cgaagacaag atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca 2820
gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag 2880
cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag 2940
atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct 3000
tattattcag tatttataac ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggaacttgtt 3060
tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 3120
atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 3180
ctggctctag ctatcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc 3240
gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc 3300
tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct agggacgtac 3360
ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattacg cgcgctcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 3420
gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 3480
ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc 3540
tgaatggcga atgggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta 3600
cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc 3660
cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt 3720
tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg 3780
gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca 3840
cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct 3900
attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga 3960
tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt taggtggcac 4020
ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat 4080
gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag 4140
tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc 4200
tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc 4260
acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc 4320
cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc 4380
ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt 4440
ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt 4500
atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat 4560
cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct 4620
tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat 4680
gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc 4740
ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg 4800
ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc 4860
tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta 4920
cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc 4980
ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga 5040
tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 5100
gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 5160
caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 5220
accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 5280
ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt 5340
aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 5400
accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 5460
gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 5520
ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 5580
gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 5640
gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 5700
ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 5760
aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 5820
gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 5880
tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 5940
agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 6000
gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 6060
gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 6120
aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg 6180
cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat 6240
gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga 6300
gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta 6360
ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga 6420
gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc 6480
tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg 6540
ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc 6600
ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga 6660
aagcgaaagg gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca 6720
cggcaagagg cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct 6780
agaaggagag agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat 6840
gggaaaaaat tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat 6900
gggcaagcag ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag 6960
gctgtagaca aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta 7020
gatcattata taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag 7080
acaccaagga agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac 7140
agcaagcggc cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt 7200
gaattatata aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca 7260
aagagaagag tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg 7320
ttcttgggag cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc 7380
agacaattat tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg 7440
caacagcatc tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg 7500
gctgtggaaa gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa 7560
ctcatttgca ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag 7620
atttggaatc acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta 7680
atacactcct taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg 7740
gaattagata aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat 7800
ataaaattat tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta 7860
ctttctatag tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc 7920
ccaaccccga ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac 7980
agagacagat ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcgattaga ctgtagccca 8040
ggaatatggc agctagattg tacacattta gaaggaaaag ttatcttggt agcagttcat 8100
gtagccagtg gatatataga agcagaagta attccagcag agacagggca agaaacagca 8160
tacttcctct taaaattagc aggaagatgg ccagtaaaaa cagtacatac agacaatggc 8220
agcaatttca ccagtactac agttaaggcc gcctgttggt gggcggggat caagcaggaa 8280
tttggcattc cctacaatcc ccaaagtcaa ggagtaatag aatctatgaa taaagaatta 8340
aagaaaatta taggacaggt aagagatcag gctgaacatc ttaagacagc agtacaaatg 8400
gcagtattca tccacaa 8417

Claims (20)

1.一种PD-1变体，其特征在于：
(1)所述PD-1变体能够与如SEQ ID NO:28所示的人PD-L1多肽结合；并且
(2)所述PD-1变体不与一种或多种选自下组的抗PD-1抗体结合：信迪利单抗(Sintilimab)、纳武单抗(Nivolumab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)、帕博利珠单抗(Pemrolizumab)和特瑞普利单抗(Toripalimab)。
2.根据权利要求1所述的PD-1变体，其中与SEQ ID NO:1所示的野生型人PD-1多肽相比，所述PD-1变体在如下氨基酸位置中的一个或多个处具有突变：E84、D85、R86、S87、Q88、P89、G90、A129、P130、K131、A132和Q133，所述氨基酸位置以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列进行编号。
3.根据权利要求1或2所述的PD-1变体，其中与SEQ ID NO:1所示的野生型人PD-1多肽相比，所述PD-1变体具有一种或多种选自下组的氨基酸突变：E84W、E84F；D85L、D85M；R86F；S87N、S87C、S87R、S87F、S87I、S87L、S87Y；Q88L、Q88F、Q88N、Q88T、Q88C、Q88E；P89C、P89V、P89R、P89K；G90T、G90S、G90F、G90R、G90Y；A129S、A129G、A129Q、A129Y、A129H、A129W、A129V、A129T、A129I；P130T、P130F、P130E；K131P、K131R；A132V、A132G、A132F、A132I、A132M；Q133W、Q133N、Q133V。
4.根据权利要求2或3所述的PD-1变体，其中与SEQ ID NO:1所示的野生型人PD-1多肽相比，所述PD-1变体在选自E84、D85、R86、S87、Q88、P89、G90的一个或多个氨基酸位置处具有突变，并且在选自A129、P130、K131、A132和Q133的一个或多个氨基酸位置处具有突变。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的PD-1变体，其中与SEQ ID NO:1所示的野生型人PD-1多肽相比，所述PD-1变体包含或仅包含选自如下(1)至(25)中任一组的氨基酸突变组合：
(1)A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(2)E84F、D85L、R86F、S87N、Q88L、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(3)E84W、D85M、R86F、S87C、Q88F、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(4)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(5)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(6)S87I、Q88N、P89R、G90S、A129S、P130T、K131P、A132V和Q133W；
(7)E84F、D85L、R86F、S87N、Q88L、P130T、K131P和Q133W；
(8)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、A129G、P130T、K131P和Q133W；
(9)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、P130T、K131P、A132G和Q133W；
(10)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、A129Q、P130T、K131P和Q133W；或
(11)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129Y、P130T、K131P和Q133W；
(12)A129H、P130F、K131R、A132F和Q133N；
(13)A129S、P130E、K131P、A132I和Q133V；
(14)S87L、Q88C、P89V、G90F、A129H、P130F、K131R、A132F和Q133N；
(15)R86S、S87F、Q88E、P89V、G90R、A129H、P130F、K131R、A132F和Q133N；
(16)R86L、S87Y、Q88L、P89K、G90Y、A129S、P130E、K131P、A132I和Q133V；
(17)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、A129W、P130T、K131P、A132M和Q133W；
(18)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129H、P130T、K131P、A132F和Q133W；
(19)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129G、P130T、K131P、A132F和Q133W；
(20)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、A129I、P130T、K131P、A132G和Q133W；
(21)S87I、Q88N、P89R、G90S、A129T、P130T、K131P、A132F和Q133W；
(22)S87I、Q88N、P89R、G90S、A129V、P130T、K131P和Q133W；
(23)S87I、Q88N、P89R、G90S、P130T、K131P和Q133W；
(24)R86F、S87R、Q88N、P89C、G90T、P130T、K131P和Q133W；
(25)R86F、S87F、Q88T、P89V、G90S、P130T、K131P和Q133W。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的PD-1变体，其中所述PD-1变体不含胞内区，或不包含跨膜区和胞内区。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的PD-1变体，其中所述变体包含如SEQ ID NOs:2至26中任一所示的氨基酸序列或与之具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，或由如SEQ IDNOs:2至26中任一所示的氨基酸序列或与之具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的PD-1变体，其中所述PD-1变体与至少两种，优选至少三种，选自下组的抗PD-1抗体不结合：信迪利单抗(Sintilimab)、纳武单抗(Nivolumab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)、帕博利珠单抗(Pemrolizumab)和特瑞普利单抗(Toripalimab)。
9.一种融合蛋白，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的PD-1变体。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其进一步包含免疫球蛋白Fc片段，优选所述免疫球蛋白Fc片段来源于哺乳动物，优选人。
11.根据权利要求9所述的融合蛋白，其包含所述PD-1变体作为胞外结构域，所述PD-1变体不包含胞内区，并进一步包含源自共刺激分子的胞内信号传递结构域，并且所述融合蛋白任选地包含PD-1的跨膜区。
12.一种分离的核酸分子，其编码如权利要求1至8中任一项所述的PD-1变体或根据权利要求9至11中任一项所述的融合蛋白。
13.根据权利要求12所述的核酸分子，其包含如SEQ ID NOs:56-61中任一项所示的核苷酸序列，或与如SEQ ID NOs:56-61中任一项所示的核苷酸序列具有至少85％同源性的核苷酸序列。
14.一种表达载体，其包含如权利要求12或13所述的分离的核酸分子。
15.一种宿主细胞，其包含如权利要求12或13所述的分离的核酸分子，或如权利要求14所述的表达载体。
16.一种药物组合物，其包含(1)根据权利要求1至8中任一项所述的PD-1变体或根据权利要求9至11中任一项所述的融合蛋白，和(2)药学上可接受的载体。
17.根据权利要求1至8中任一项的PD-1变体或根据权利要求9至11中任一项的融合蛋白在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
18.一种药物组合，其包含(1)根据权利要求1至8中任一项的PD-1变体或根据权利要求9至11中任一项的融合蛋白，和(2)抗PD-1抗体；其中所述抗PD-1变体不与所述抗PD-1抗体结合。
19.一种细胞，其经修饰而表达如权利要求9至11中任一项所述的融合蛋白。
20.权利要求9所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞，并且在经修饰之前源自外周血单个核细胞或为肿瘤浸润淋巴细胞。
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