BR112020026320A2

BR112020026320A2 - Células de fluxo, kits de sequenciamento e método

Info

Publication number: BR112020026320A2
Application number: BR112020026320-6A
Authority: BR
Inventors: Hayden Black; Brian D. Mather
Original assignee: Illumina, Inc.
Priority date: 2018-12-17
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2021-03-30
Also published as: WO2020131354A1; US11841310B2; CA3103525A1; CN212451364U; EP3899543A1; TWI760667B; AU2019406313A1; TW202035970A; US20200191699A1; SG11202012634UA; EP3899543A4; MX2020014066A; JP2022513547A; US20240183770A1; KR20210093749A; IL279670A; IL279670B1; CN111321054A; WO2020131354A9

Abstract

em um exemplo, uma célula de fluxo inclui um substrato, um eletrodo posicionado no substrato, e um material padronizado posicionado no eletrodo. nesse exemplo, o material padronizado inclui depressões separadas por regiões intersticiais, e uma superfície funcionalizada do eletrodo é exposta em cada uma das depressões. nesse exemplo, a célula de fluxo inclui adicionalmente um iniciador enxertado na superfície funcionalizada em cada uma das depressões. em outro exemplo, uma célula de fluxo inclui um substrato e um eletrodo padronizado posicionado no substrato. nesse outro exemplo, o eletrodo padronizado inclui depressões separadas por regiões intersticiais, e uma superfície funcionalizada do substrato exposta em cada uma das depressões. nesse outro exemplo, um iniciador é enxertado na superfície funcionalizada em cada uma das depressões.

Description

CÉLULAS DE FLUXO, KITS DE SEQUENCIAMENTO E MÉTODO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório sob Número de Série US 62/780.602, depositado em 17 de dezembro de 2018, cujo conteúdo é incorporado em sua totalidade a título de referência na presente invenção.

ANTECEDENTES

[002] Vários protocolos de pesquisa biológica ou química envolvem a realização de um grande número de reações controladas em superfícies de suporte locais ou dentro de câmaras de reação predefinidas. As reações designadas podem, então, ser observadas ou detectadas e a análise subsequente pode ajudar a identificar ou revelar as propriedades dos produtos químicos envolvidos na reação. Por exemplo, em alguns ensaios multiplex, um analito desconhecido tendo um marcador identificável (por exemplo, marcador fluorescente) pode ser exposto a milhares de sondas conhecidas em condições controladas. Cada sonda conhecida pode ser depositada em um poço correspondente de uma microplaca. Observar quaisquer reações químicas que ocorrem entre as sondas conhecidas e o analito desconhecido dentro dos poços pode ajudar a identificar ou revelar propriedades do analito. Outros exemplos de tais protocolos incluem processos de sequenciamento de DNA conhecidos, como sequenciamento por síntese (SBS) ou sequenciamento de arranjo cíclico. Com técnicas de sequenciamento de polinucleotídeo, a análise pode ajudar a identificar ou revelar propriedades do polinucleotídeo envolvido nas reações.

INTRODUÇÃO

[003] Um primeiro aspecto revelado na presente invenção é uma primeira célula de fluxo compreendendo um substrato; um eletrodo posicionado no substrato; um material padronizado posicionado no eletrodo, o material padronizado incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; uma superfície funcionalizada do eletrodo exposta em cada uma das depressões; e um iniciador enxertado na superfície funcionalizada em cada uma das depressões.

[004] Em um exemplo do primeiro aspecto, o eletrodo inclui ouro e a superfície funcionalizada inclui ligantes de tiol ou ligantes de amina; ou o eletrodo inclui óxido de índio-estanho e a superfície funcionalizada inclui um ligante de silano.

[005] Em um exemplo do primeiro aspecto, o eletrodo é transparente; o substrato é transparente; e a célula de fluxo compreende adicionalmente um dispositivo de detecção em contato com o substrato, o dispositivo de detecção incluindo um respectivo fotodiodo operativamente associado em cada uma das depressões e circuito de dispositivo eletricamente conectado ao respectivo fotodiodo.

[006] Deve ser entendido que quaisquer recursos da primeira célula de fluxo revelada na presente invenção podem ser combinados em conjunto de qualquer maneira e/ou configuração desejável.

[007] Um segundo aspecto revelado na presente invenção é um kit de sequenciamento compreendendo a célula de fluxo conforme definido no primeiro aspecto e nucleotídeos marcados a serem introduzidos na célula de fluxo, cada nucleotídeo marcado incluindo um nucleotídeo tendo um grupo de bloqueio 3’ OH, uma molécula de ligação ligada a uma base a um açúcar do nucleotídeo, e um marcador eletroquimioluminescente ligado à molécula de ligação.

[008] Em um exemplo do segundo aspecto, os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem um espectro de emissão distinto.

[009] Em um exemplo do segundo aspecto, os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem um potencial de oxidação ou redução distinto.

[010] Em um exemplo do segundo aspecto, os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem uma vida útil distinta para emissão eletroquimioluminescente.

[011] Em um exemplo do segundo aspecto, os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem uma intensidade de emissão eletroquimioluminescente distinta.

[012] Deve ser entendido que quaisquer recursos desse kit de sequenciamento podem ser combinados em conjunto de qualquer maneira desejada. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de recursos desse kit de sequenciamento e/ou da célula de fluxo pode ser usada em conjunto, e/ou combinada com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[013] Um terceiro aspecto revelado na presente invenção é uma outra célula de fluxo compreendendo um substrato, um eletrodo padronizado posicionado no substrato, o eletrodo padronizado incluindo depressões separadas por regiões intersticiais, uma superfície funcionalizada do substrato exposta em cada uma das depressões, e um iniciador enxertado na superfície funcionalizada em cada uma das depressões.

[014] Em um exemplo do terceiro aspecto, a superfície funcionalizada do substrato inclui uma camada polimérica ligada a grupos silano ligados ao substrato.

[015] Em um exemplo do terceiro aspecto, a superfície funcionalizada do substrato inclui grupos hidroxila ligados ao substrato.

[016] Em um exemplo do terceiro aspecto, o substrato é transparente; e a célula de fluxo compreende adicionalmente um dispositivo de detecção em contato com o substrato, o dispositivo de detecção incluindo um respectivo fotodiodo operativamente associado a cada uma das depressões; e o circuito de dispositivo eletricamente conectado ao respectivo fotodiodo.

[017] Deve ser entendido que quaisquer recursos dessa célula de fluxo podem ser combinados em conjunto de qualquer maneira desejada. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de recursos dessa célula de fluxo e/ou do kit de sequenciamento e/ou da outra célula de fluxo pode ser usada em conjunto, e/ou combinada com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[018] Um quarto aspecto revelado na presente invenção é um kit de sequenciamento, compreendendo a célula de fluxo conforme definido no terceiro aspecto, e nucleotídeos marcados a serem introduzidos na célula de fluxo, cada nucleotídeo marcado incluindo um nucleotídeo tendo um grupo de bloqueio 3’ OH, uma molécula de ligação ligada a uma base ou a um açúcar do nucleotídeo, e um marcador eletroquimioluminescente ligado à molécula de ligação.

[019] Em um exemplo do quarto aspecto, os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem um espectro de emissão distinto.

[020] Em um exemplo do quarto aspecto, os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que o marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem um potencial de oxidação ou redução distinto.

[021] Em um exemplo do quarto aspecto, os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem uma vida útil distinta para emissão eletroquimioluminescente.

[022] Em um exemplo do quarto aspecto, os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem uma intensidade de emissão eletroquimioluminescente distinta.

[023] Deve ser entendido que quaisquer recursos desse kit de sequenciamento podem ser combinados em conjunto de qualquer maneira desejada. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de recursos desse kit de sequenciamento e/ou de ambas as células de fluxo e/ou do outro kit de sequenciamento pode ser usada em conjunto, e/ou combinada com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[024] Um quinto aspecto revelado na presente invenção é um método compreendendo: introduzir um fluido incluindo uma polimerase e nucleotídeos em uma célula de fluxo incluindo um eletrodo que define parcialmente uma depressão incluindo uma cadeia de polinucleotídeo modelo ligada na depressão, em que pelo menos alguns dos nucleotídeos são nucleotídeos marcados, cada um dos pelo menos alguns nucleotídeos marcados incluindo um nucleotídeo tendo um grupo de bloqueio 3’ OH, uma molécula de ligação ligada a uma base ou a um açúcar do nucleotídeo, e um marcador eletroquimioluminescente ligado à molécula de ligação, pela qual um dos nucleotídeos incorpora em uma fita nascente complementar à cadeia de polinucleotídeo modelo; aplicar um potencial ao eletrodo; e detectar uma emissão óptica em resposta ao potencial aplicado.

[025] Em um exemplo do quinto aspecto, o nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos é um dos nucleotídeos marcados, e em que a aplicação do potencial inicia uma via de reação redox envolvendo marcador eletroquimioluminescente do nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos marcados. Em um exemplo, o fluido inclui pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem um espectro de emissão distinto, e o método compreende adicionalmente identificar o nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos marcados a partir de sua emissão óptica. Em um outro exemplo, o fluido inclui pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem um potencial de oxidação ou redução distinto, e o método compreende adicionalmente identificar o nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos marcados a partir do potencial aplicado. Ainda em um outro exemplo, antes de aplicar o potencial, o método compreende adicionalmente introduzir um correagente na célula de fluxo. Em mais um exemplo, a molécula de ligação e o marcador eletroquimioluminescente do nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos marcados são ligados durante a incorporação, aplicação de potencial e detecção óptica, e em que, após a detecção óptica, o método compreende adicionalmente introduzir um agente de desbloqueio para clivar a molécula de ligação e o marcador eletroquimioluminescente do nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos marcados e remover o grupo de bloqueio 3’ OH do nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos marcados, possibilitando, desse modo, a incorporação de um outro nucleotídeo ou um outro nucleotídeo marcado em uma fita nascente. Nesse exemplo particular, o método pode compreender adicionalmente introduzir um outro fluido, aplicar um outro potencial ao eletrodo, e detectar uma outra emissão óptica.

[026] Em um exemplo do quinto aspecto, um fotodiodo detecta a emissão óptica, e o método compreende adicionalmente detectar um sinal elétrico que corresponde à emissão óptica.

[027] Em um exemplo do quinto aspecto, o nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos é um dentre: um primeiro nucleotídeo marcado, em que a molécula de ligação é clivável; um segundo nucleotídeo marcado, em que a molécula de ligação é não clivável; um terceiro nucleotídeo não marcado tendo um grupo de bloqueio 3’ OH e incluindo uma molécula de ligação que é para se ligar ao marcador eletroquimioluminescente; ou quarto nucleotídeo não marcado tendo um grupo de bloqueio 3’ OH; e o método compreende adicionalmente introduzir um reagente que pode clivar o marcador eletroquimioluminescente do primeiro nucleotídeo marcado e pode adicionar o marcador eletroquimioluminescente ao terceiro nucleotídeo não marcado, aplicar um outro potencial ao eletrodo, detectar uma outra emissão óptica em resposta ao potencial aplicado, e usar a emissão óptica detectada e a outra emissão óptica detectada para identificar o nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos.

[028] Em um exemplo do quinto aspecto, a célula de fluxo inclui uma pluralidade de depressões, cada uma das quais inclui uma pluralidade de cadeias de polinucleotídeo modelo ligadas na depressão, um respectivo nucleotídeo dos nucleotídeos incorpora em uma respectiva fita nascente complementar à respectiva cadeia de polinucleotídeo modelo, e o método compreende adicionalmente detectar simultaneamente uma respectiva emissão óptica de cada uma da pluralidade de depressões.

[029] Deve ser entendido que quaisquer recursos do método podem ser combinados em conjunto de qualquer maneira desejada. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de recursos do método e/ou do primeiro kit de sequenciamento e/ou do segundo kit de sequenciamento pode ser usada em conjunto, e/ou combinada com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[030] Ainda adicionalmente, deve ser entendido que quaisquer recursos de qualquer um dos métodos e/ou de qualquer um dos kits de sequenciamento podem ser combinados em conjunto de qualquer maneira desejável, e/ou podem ser combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[031] Recursos de exemplos da presente revelação se tornarão evidentes por referência à descrição detalhada e desenhos a seguir, nos quais números de referência semelhantes correspondem a componentes similares, apesar de não serem talvez idênticos. A título de brevidade, números de referência ou recursos tendo uma função previamente descrita podem ser descritos ou não em conjunto com outros desenhos nos quais aparecem.

[032] A Figura 1A é uma vista de topo de um exemplo de uma célula de fluxo; A Figura 1B é uma vista em perspectiva ampliada de um exemplo de uma porção de uma das faixas de célula de fluxo da Figura 1A, ilustrando depressões definidas em uma superfície de eletrodo e iniciadores ligados na superfície de eletrodo na depressão;

A Figura 1C é uma vista em perspectiva ampliada de um outro exemplo de uma porção de uma das faixas de célula de fluxo da Figura 1A, ilustrando depressões definidas por um eletrodo padronizado em uma superfície de substrato e iniciadores ligados na superfície de substrato nas depressões; A Figura 2 retrata esquematicamente diferentes exemplos de um nucleotídeo marcado; A Figura 3 é uma vista em perspectiva semiesquemática de um exemplo de um arranjo de depressões de uma célula de fluxo para um kit de sequenciamento; As Figuras 4A a 4C retratam uma vista transversal de uma depressão do arranjo da Figura 3 conforme é exposta a um ciclo de sequenciamento; A Figura 5 é uma vista em perspectiva semiesquemática de um outro exemplo de um arranjo de depressões de uma célula de fluxo para um kit de sequenciamento; As Figuras 6A a 6C retratam uma vista transversal de uma depressão do arranjo da Figura 5 conforme é exposta a um ciclo de sequenciamento; A Figura 7 é uma vista transversal de um exemplo de uma célula de fluxo para um kit de sequenciamento, em que a célula de fluxo incorpora um dispositivo de detecção semicondutor de óxido metálico (CMOS) complementar; e A Figura 8 é uma vista transversal de um outro exemplo de uma célula de fluxo para um kit de sequenciamento, em que a célula de fluxo incorpora um dispositivo de detecção CMOS.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[033] Nos exemplos revelados na presente invenção, a chamada de base de nucleotídeo durante o sequenciamento é realizada através de detecção de sinais de fluorescência que são gerados eletroquimicamente. A geração eletroquímica dos sinais de fluorescência não envolve excitação de bases marcadas com corante através de iluminação com um laser, diodo emissor de luz ou outra fonte de iluminação. Sem a necessidade de uma fonte de excitação, o sistema óptico dos exemplos revelados na presente invenção é simplificado.

[034] O processo de eletroquimioluminescência (ECL) começa com a oxidação ou redução de uma molécula em uma superfície de eletrodo para formar um cátion ou ânion radical. Em alguns exemplos, o cátion ou ânion radical é, então, submetido à transferência de elétron com um correagente para formar um estado excitado emissivo. Em outros exemplos, o potencial do eletrodo é varrido de positivo para negativo, o que pode gerar diretamente o estado excitado emissivo. Em qualquer exemplo, o processo revelado na presente invenção produz luz sem ruído de fundo da fonte de excitação. Como tal, os exemplos revelados na presente invenção eliminam ruído devido à fonte de excitação, e aumentam, assim, a razão de sinal para ruído. Uma razão de sinal para ruído aumentada aprimora a precisão de sequenciamento, e também possibilita que um afastamento menor seja usado devido à densidade de dados superior.

[035] Adicionalmente, nos exemplos revelados na presente invenção, os estados excitados são formados exclusivamente na superfície de eletrodo ou dentro de uma depressão que é definida por paredes de eletrodo, o que facilita as áreas ativas de ECL espacialmente resolvidas.

[036] Ainda adicionalmente, o número de fótons que são emitidos depende da eficiência da reação de ECL e da duração do potencial aplicado. Em teoria, uma molécula ativa de ECL pode ser submetida a inúmeros ciclos de redox/reação/emissão e pode emitir fótons pela duração de potencial aplicado. Isso possibilita que o período de tempo para geração de sinal seja ajustado, o que pode levar a resultados de detecção mais precisos.

[037] Nos exemplos revelados na presente invenção, os sinais são gerados eletroquimicamente usando kits de sequenciamento. Um exemplo do kit de sequenciamento descrito na presente invenção é um kit de sequenciamento de eletroquimioluminescência. Apesar de os kits de sequenciamento de eletroquimioluminescência serem usados na presente invenção como um exemplo representativo de um kit de sequenciamento, um kit de sequenciamento na presente invenção não precisa ser um kit de eletroquimioluminescência. Cada kit de sequenciamento de eletroquimioluminescência inclui uma célula de fluxo específica que incorpora o eletrodo a ser usado no processo de ECL. Em alguns exemplos, as células de fluxo podem ser usadas com um dispositivo de detecção óptica. Em outros exemplos, as células de fluxo são integradas com um dispositivo de detecção semicondutor de óxido metálico (CMOS) complementar, e, assim, são usadas para detecção optoeletrônica.

[038] Um exemplo da célula de fluxo 10 é retratado na Figura 1A. Nesse exemplo, a célula de fluxo 10 inclui canais de fluxo 12. Embora vários canais de fluxo 12 sejam mostrados, deve ser entendido que qualquer número de canais 12 podem ser incluídos na célula de fluxo 10 (por exemplo, um canal único 12, quatro canais 12, etc.). Cada canal de fluxo 12 é uma área definida entre dois componentes ligados (por exemplo, um substrato e uma tampa ou dois substratos), que pode ter líquidos introduzidos na mesma e removidos da mesma. Cada canal de fluxo 12 pode ser isolado de cada outro canal de fluxo 12 de modo que o líquido introduzido em qualquer canal de fluxo 12 particular não flua para qualquer canal de fluxo adjacente. Conforme será discutido adicionalmente na presente invenção, os líquidos introduzidos nos canais de fluxo 12 podem introduzir componentes de reação (por exemplo, nucleotídeos marcados e/ou não marcados), soluções de lavagem, agentes de desbloqueio,

etc.

[039] Diferentes exemplos da arquitetura dentro dos canais de fluxo 12 da célula de fluxo 10 são mostrados nas Figuras 1B e 1C.

[040] No exemplo mostrado na Figura 1B, a célula de fluxo 10 inclui um substrato 14, um eletrodo 16 posicionado no substrato 14 e um material padronizado 18 posicionado no eletrodo 16. O material padronizado 18 define depressões 18 separadas por regiões intersticiais 22. Nesse exemplo, uma superfície funcionalizada S16 do eletrodo 16 é exposta em cada uma das depressões 18, e um iniciador 24 é enxertado na superfície funcionalizada S16.

[041] O substrato 14 na Figura 1B fornece suporte para outros componentes da célula de fluxo 10. O substrato 14 é, em geral, rígido e é insolúvel em líquido aquoso. Exemplos de substratos adequados 14 incluem epóxi-siloxano, vidro, vidro modificado, plásticos, náilon, cerâmicas/óxidos de cerâmica, sílica (óxido de silício (SiO2)), sílica fundida, materiais à base de sílica, silicato de alumínio, silício, silício modificado (por exemplo, p+ silício dopado com boro), nitreto de silício (Si3N4), pentóxido de tântalo (TaO5) ou outro(s) óxido(s) de tântalo (TaOx), óxido de háfnio (HaO2), vidro inorgânico ou similares. Alguns exemplos de plásticos adequados para o substrato 14 incluem acrílicos, poliestireno, copolímeros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, politetrafluoroetileno (como TEFLON® de Chemours), olefinas cíclicas/polímeros de ciclo-olefina (COP) (como ZEONOR® de Zeon), poli- imidas, etc. O suporte também pode ser vidro ou silício, com uma camada de revestimento de óxido de tântalo ou um outro óxido de cerâmica na superfície.

[042] A forma do substrato 14 pode ser uma pastilha, um painel, uma chapa retangular, um dado ou qualquer outra configuração adequada. Em um exemplo, o substrato 14 pode ser uma pastilha ou painel circular tendo um diâmetro que varia de cerca de 2 mm a cerca de 300 mm. Como um exemplo mais específico,

o substrato 14 é uma pastilha tendo um diâmetro que varia de cerca de 200 mm a cerca de 300 mm. Em um outro exemplo, o substrato 14 pode ser uma chapa ou painel retangular tendo sua maior dimensão de até 10 pés (~ 3 metros). Como um exemplo específico, o suporte 14 é um dado tendo uma largura que varia de cerca de 0,1 mm a cerca de 10 mm. Embora dimensões exemplificativas tenham ido fornecidas, deve ser entendido que um substrato 14 com quaisquer dimensões adequadas pode ser usado.

[043] Na Figura 1B, o eletrodo 16 é posicionado no substrato 12. O eletrodo 16 pode incluir qualquer material de eletrodo adequado como ouro (Au), prata (Ag), cloreto de prata (AgCl), platina (Pt), titânio (Ti), molibdênio (Mo), óxido de índio-estanho (ITO), óxido de zinco e índio (IZO), carbono (por exemplo, grafeno, chapa de nanotubo de carbono), polímeros condutores, etc. Em um exemplo, o eletrodo 16 é ouro. O eletrodo 16 pode ter qualquer espessura adequada que torna o eletrodo 16 mecânica e quimicamente estável. Como um exemplo, a espessura pode ser 200 nm ou mais.

[044] O eletrodo 16 pode ser uma chapa pré-formada que é ligada ao substrato 14, por exemplo, usando um adesivo, ou pode ser depositada no substrato 12 usando uma técnica de deposição adequada.

[045] No exemplo mostrado na Figura 1B, o material padronizado 18 é posicionado no eletrodo 16. Deve ser entendido que qualquer material que pode ser depositado seletivamente, ou depositado e padronizado para formar as depressões 18 e as regiões intersticiais 22 pode ser usado para o material padronizado 18. O material padronizado 18 pode ser condutor ou não condutor, e é selecionado de modo que não enxerte os iniciadores 24.

[046] Como um exemplo, um óxido inorgânico pode ser aplicado seletivamente ao eletrodo 16 através de deposição de vapor, impressão de aerossol ou impressão a jato de tinta. Exemplos de óxidos inorgânicos adequados incluem óxido de tântalo, óxido de alumínio, óxido de silício, óxido de háfnio, etc.

[047] Como um outro exemplo, uma resina pode ser aplicada ao eletrodo 16 e, então, padronizado. As técnicas de deposição adequadas incluem deposição de vapor químico, revestimento por imersão, revestimento por embebição, revestimento por rotação, revestimento por aspersão, dispensação por pudlagem, revestimento por aspersão ultrassônica, revestimento por lâmina raspadora, impressão por aerossol, impressão de tela, impressão por microcontato etc. Técnicas de padronização adequadas incluem fotolitografia, litografia de nanoimpressão (NIL), técnicas de estampagem, técnicas de gravação em relevo, técnicas de moldagem, técnicas de microgravura, técnicas de impressão, etc. Alguns exemplos de resinas adequadas incluem uma resina à base de resina de silsesquioxano oligomérica poliédrica (POSS), uma resina epóxi não POSS, uma resina de poli(etilenoglicol), uma resina de poliéter (por exemplo, epóxis de anel aberto), uma resina acrílica, uma resina de acrilato, uma resina de metacrilato, uma resina de fluoropolímero amorfa (por exemplo, CYTOP® da Bellex) e combinações dos mesmos.

[048] Conforme usado na presente invenção, o termo “silsesquioxano oligomérico poliédrico” (POSS) se refere a uma composição química que é um intermediário híbrido (por exemplo, RSiO1.5) entre a sílica (SiO2) e o silicone (R2SiO). Um exemplo de POSS pode ser esse descrito em Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), páginas 776 a 778, que é incorporado em sua totalidade a título de referência. Em um exemplo, a composição é um composto de organossilício com a fórmula química [RSiO3/2]n, em que os grupos R podem ser iguais ou diferentes. Grupos R exemplificativos para POSS incluem epóxi, azida/azido, um tiol, um poli(etilenoglicol), um norborneno, uma tetrazina, acrilatos e/ou metacrilatos ou, adicionalmente, por exemplo, grupos alquila, arila, alcóxi e/ou haloalquila. A composição de resina revelada na presente invenção pode compreender uma ou mais estruturas de grade ou núcleo diferentes como unidades monoméricas. A estrutura poliédrica pode ser uma estrutura de T8 tal como: e representada por: . Essa unidade monomérica tem tipicamente oito braços de grupos funcionais R1 a R8.

[049] A unidade monomérica pode ter uma estrutura em gaiola com 10 átomos de silício e 10 grupos R, chamada de T10 tal como: , ou pode ter uma estrutura em gaiola com 12 átomos de silício e 12 grupos R, chamada de T12 tal como: . O material à base de POSS pode incluir, alternativamente, estruturas em gaiola T6, T14 ou T16. O teor de gaiola médio pode ser ajustado durante a síntese, e/ou controlado por métodos de purificação, e uma distribuição de tamanhos de gaiolas da(s) unidade(s) monomérica(s) pode ser usada nos exemplos revelados na presente invenção.

[050] Conforme mostrado na Figura 1B, o material padronizado 18 inclui as depressões 20 definidas no mesmo, e as regiões intersticiais 22 que separam as depressões adjacentes 20. Muitos layouts diferentes das depressões 20 podem ser previstos, incluindo padrões regulares, de repetição e não regulares. Em um exemplo, as depressões 20 são dispostas em uma grade hexagonal para compactação e densidade aprimoradas. Outras disposições podem incluir, por exemplo, layouts retilíneos (isto é, retangulares), layouts triangulares e assim por diante. Em alguns exemplos, o layout ou padrão pode ser um formato x-y das depressões 20 que estão em fileiras e colunas. Em alguns outros exemplos, o layout ou padrão pode ser uma disposição de repetição das depressões 20 e/ou regiões intersticiais 22. Ainda em outros exemplos, o layout ou padrão pode ser uma disposição aleatória das depressões 20 e/ou regiões intersticiais 22. O padrão pode incluir pontos, blocos, poços, postes, listras, espirais, linhas, triângulos, retângulos, círculos, arcos, marcas, xadrez, diagonais, setas, quadrados e/ou hachuras cruzadas.

[051] O layout ou padrão das depressões 20 pode ser caracterizado em relação à densidade das depressões 20 (isto é, número de depressões 20) em uma área definida. Por exemplo, as depressões 20 podem estar presentes em uma densidade de aproximadamente 2 milhões por mm2. A densidade pode ser ajustada para diferentes densidades incluindo, por exemplo, uma densidade de cerca de 100 por mm2, cerca de 1.000 por mm2, cerca de 0,1 milhão por mm2, cerca de 1 milhão por mm2, cerca de 2 milhões por mm2, cerca de 5 milhões por mm2, cerca de 10 milhões por mm2, cerca de 50 milhões por mm2 ou mais ou menos. Deve ser entendido, adicionalmente, que a densidade das depressões 20 no material padronizado 18 pode estar entre um dos valores inferiores e um dos valores superiores selecionados a partir das faixas acima. Como exemplos, um arranjo de alta densidade pode ser caracterizado como tendo depressões 20 separadas por menos de cerca de 100 nm, um arranjo de densidade média pode ser caracterizado como tendo depressões 20 separadas por cerca de 400 nm a cerca de 1 µm, e um arranjo de densidade baixa pode ser caracterizado como tendo depressões 20 separadas por mais de cerca de 1 µm. Embora densidades exemplificativas tenham sido fornecidas, deve ser entendido que quaisquer densidades adequadas podem ser usadas.

[052] O layout ou padrão das depressões 20 também ou alternativamente pode ser caracterizado em termos de afastamento médio, isto é, o espaçamento do centro da depressão 20 ao centro de uma depressão adjacente 20 (espaçamento de centro a centro) ou da borda de uma depressão 20 à borda de uma depressão adjacente 20 (espaçamento de borda a borda). O padrão pode ser regular de modo que o coeficiente de variação ao redor do afastamento médio seja pequeno, ou o padrão pode ser não regular caso em que o coeficiente de variação pode ser relativamente grande. Em ambos os casos, o afastamento médio pode ser, por exemplo, cerca de 50 nm, cerca de 0,1 μm, cerca de 0,5 μm, cerca de 1 μm, cerca de 5 μm, cerca de 10 μm, cerca de 100 μm ou mais ou menos. O afastamento médio para um padrão particular das depressões 20 pode estar entre um dos valores inferiores e um dos valore superiores selecionados a partir das faixas acima. Em um exemplo, as depressões 20 têm um afastamento (espaçamento de centro a centro) de cerca de 1,5 μm. Embora os valores de afastamento médio exemplificativos tenham sido fornecidos, deve ser entendido que outros valores de afastamento médio podem ser usados.

[053] O tamanho de cada depressão 20 pode ser caracterizado por seu volume, área de abertura, profundidade e/ou diâmetro.

[054] Cada depressão 20 pode ter qualquer volume que tenha capacidade de confinar um líquido. O volume mínimo ou máximo pode ser selecionado, por exemplo, para acomodar a taxa de transferência (por exemplo, multiplexidade), resolução, composição de analito ou reatividade de analito esperado para usos a jusante da célula de fluxo 10. Por exemplo, o volume pode ser pelo menos cerca de 1×10−3 μm3, cerca de 1×10−2 μm3, cerca de 0.1 μm3, cerca de 1 μm3, cerca de 10 μm3, cerca de 100 μm3 ou mais. Alternativa ou adicionalmente, o volume pode ser no máximo cerca de 1×104 μm3, cerca de 1×103 μm3, cerca de 100 μm3, cerca de 10 μm3, cerca de 1 μm3, cerca de 0,1 μm3 ou menos.

[055] A área ocupada por cada abertura de depressão pode ser selecionada com base em critérios similares como aqueles apresentados acima para o volume. Por exemplo, a área de cada abertura de depressão pode ser pelo menos cerca de 1×10−3 μm2, cerca de 1×10−2 μm2, cerca de 0,1 μm2, cerca de 1 μm2, cerca de 10 μm2, cerca de 100 μm2 ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, a área pode ser no máximo cerca de 1×103 μm2, cerca de 100 μm2, cerca de 10 μm2, cerca de 1 μm2, cerca de 0,1 μm2, cerca de 1×10−2 μm2 ou menos. A área ocupada por cada abertura de depressão pode ser maior que, menor que ou entre os valores especificados acima.

[056] A profundidade de cada depressão 20 pode ser pelo menos cerca de 0,1 μm, pelo menos cerca de 0,5 μm, pelo menos cerca de 1 μm, pelo menos cerca de 10 μm, pelo menos cerca de 100 μm ou mais. Alternativa ou adicionalmente, a profundidade pode ser no máximo cerca de 1×103 μm, no máximo cerca de 100 μm, no máximo cerca de 10 μm, no máximo cerca de 1 μm, no máximo cerca de 0,1 μm ou menos. Em alguns exemplos, a profundidade é cerca de 0,4 μm. A profundidade de cada depressão 20 pode ser maior que, menor que ou entre os valores especificados acima.

[057] Em algumas instâncias, o diâmetro ou comprimento e largura de cada depressão 20 pode ser pelo menos cerca de 50 nm, cerca de 0,1 μm, cerca de 0,5 μm, cerca de 1 μm, cerca de 10 μm, cerca de 100 μm ou mais. Alternativa ou adicionalmente, o diâmetro ou comprimento e largura pode ser no máximo cerca de 1×103 μm, cerca de 100 μm, cerca de 10 μm, cerca de 1 μm, cerca de 0,5 μm, cerca de 0,1 μm ou menos (por exemplo, cerca de 50 nm). O diâmetro ou comprimento e largura também pode variar ao longo da profundidade (por exemplo, conforme mostrado nas Figuras 4A a 4C e 6A a 6C). O diâmetro ou comprimento e largura de cada depressão 20 pode ser maior que, menor que ou entre os valores especificados acima.

[058] No exemplo mostrado na Figura 1B, a superfície S16 do eletrodo 16 exposta nas depressões 20 é funcionalizada de modo que os iniciadores 24 possam se ligar à superfície S16 e não às regiões intersticiais 22. A funcionalização da superfície do eletrodo S16 dependerá do material do eletrodo e do iniciador 24 que deve ser ligado à mesma.

[059] Em alguns exemplos, o material de eletrodo pode ser funcionalizado inerentemente devido ao fato de que o iniciador 24 incluir um grupo funcional terminal que pode se ligar diretamente ao material de eletrodo não modificado. Por exemplo, um iniciador terminado em tiol pode se ligar quimicamente a uma superfície de eletrodo S16 de ouro.

[060] Em outros exemplos, a superfície de eletrodo S16 pode ser modificada para incorporar um grupo funcional (isto é, uma molécula de ligação) que pode se ligar ao iniciador 24. O grupo funcional é capaz de de se ligar quimicamente, em uma extremidade, à superfície de eletrodo S16, e, em outra extremidade, ao iniciador 24. Como exemplos, ligantes de tiol ou tiolato ou ligantes de amina podem se ligar a eletrodos de ouro, e ligantes de silano (por exemplo, azido silano) podem se ligar a eletrodos de ITO. Embora alguns exemplos tenham sido fornecidos, deve ser entendido que outras funcionalidades químicas podem ser usadas.

[061] Seja direto ou indireto (por exemplo, através de ligante), a ligação do iniciador 24 à superfície de eletrodo S16 pode ser através de ligação covalente, ligação por coordenação ou uma outra ligação química e física (como empilhamento pi-pi), dependendo do iniciador 24, qualquer ligante que é usado, e o material de eletrodo.

[062] Devido ao fato de que a superfície S16 é modificada com grupos funcionais ou é funcionalizada inerentemente e as regiões intersticiais 22 não incluem os grupos funcionais reativos de iniciadores, os iniciadores 24 se ligarão à superfície S16 e não se ligarão às regiões intersticiais 22.

[063] Deve ser entendido que a funcionalização de eletrodo pode ser realizada antes ou depois de o material padronizado 18 ser aplicado ao mesmo.

[064] Em outros exemplos, a superfície de eletrodo S16 pode ser funcionalizada com uma camada polimérica conforme descrito na presente invenção em referência à Figura 1C.

[065] Conforme mostrado na Figura 1B, o(s) iniciador(es) 24 é/são ligados à superfície de eletrodo S16 funcionalizada. O iniciador 24 pode ser qualquer iniciador de amplificação direta ou iniciador de amplificação inversa que inclui um grupo funcional que pode se ligar à superfície S16, diretamente ao eletrodo material ou a um grupo funcional ligado à mesma ou a uma camada polimérica ligada à mesma. Exemplos de iniciadores terminados em grupo funcional adequado incluem um iniciador terminado em alcino, um iniciador terminado em tetrazina, um iniciador terminado em azido, um iniciador terminado em amino, um iniciador terminado em epóxi ou glicidila, um iniciador terminado em tiofosfato, um iniciador terminado em tiol, um iniciador terminado em aldeído, um iniciador terminado em hidrazina e um iniciador terminado em triazolinodiona. Uma mistura de iniciadores também pode ser usada. Exemplos específicos de iniciadores adequados incluem iniciadores P5 e/ou P7, que são usados na superfície de células de fluxo comerciais vendidas por Illumina Inc. para sequenciamento em HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NEXTSEQ™, NEXTSEQDX™, NOVASEQ™, GENOME ANALYZER™ e outras plataformas de instrumento.

[066] Em um exemplo, os iniciadores 24 podem ser ligados usando um processo de enxerto tal como fluxo através de deposição (por exemplo, quando a célula de fluxo 10 tem uma tampa ligada aos mesmos), revestimento por embebição, revestimento por aspersão, dispensação por pudlagem ou por um outro método adequado que ligará o(s) iniciador(es) 24. Cada uma dessas técnicas exemplificadoras pode utilizar uma solução ou mistura de iniciador, que pode incluir o(s) iniciador(es), água, um tampão (por exemplo, uma solução salina) e um catalisador.

[067] Com referência agora à Figura 1C, a célula de fluxo 10 inclui um substrato 14 e um eletrodo padronizado 26 posicionado no substrato 14. Nesse exemplo, o eletrodo padronizado 26 define depressões 18 separadas por regiões intersticiais 22. Nesse exemplo, uma superfície funcionalizada S14 do substrato 14 é exposta em cada uma das depressões 18, e um iniciador 24 é enxertado na superfície funcionalizada S14.

[068] O substrato 14 na Figura 1C fornece suporte para outros componentes da célula de fluxo 10. O substrato 14 pode ser qualquer um dos exemplos descritos na presente invenção.

[069] Na Figura 1C, o eletrodo padronizado 26 é posicionado no substrato

12. O eletrodo padronizado 26 pode ser qualquer um dos materiais de eletrodo mencionados para o eletrodo 16. Nesse exemplo, o eletrodo padronizado 26 pode ser uma grade pré-formada que é ligada ao substrato 14, por exemplo, usando um adesivo, ou pode ser depositada no substrato 14 em um padrão desejável usando uma técnica de deposição adequada.

[070] No exemplo mostrado na Figura 1C, o eletrodo padronizado 26 inclui as depressões 20 definidas no mesmo, e as regiões intersticiais 22 que separam depressões adjacentes 20. Qualquer um dos padrões, layouts e dimensões apresentados na presente invenção para as depressões 20 na Figura 1B pode ser usado para as depressões 20 mostradas na Figura 1C.

[071] Também no exemplo mostrado na Figura 1C, a superfície S14 do substrato 14 exposta nas depressões 20 é funcionalizada de modo que os iniciadores 24 possam se ligar à superfície S14 e não às regiões intersticiais 22 do eletrodo padronizado 26.

[072] Em alguns exemplos, a funcionalização da superfície de substrato S14 envolve silanizar a superfície S14 exposta nas depressões 20 e formar uma camada polimérica na superfície silanizada. A silanização pode ser realizada usando qualquer silano ou derivado de silano. Silano ou derivados de silano exemplificativos incluem norborneno silano, um derivado de norborneno (por exemplo, [(5-biciclo[2.2.1]hept-2-enil)etil]trimetoxissilano), uma ciclo-octina, um derivado de ciclo-octina ou um outro silano adequado. O método usado para ligar silano ou derivado de silano pode variar dependendo do silano ou derivado de silano que está sendo usado. Exemplos de métodos de silanização incluem deposição de vapor (por exemplo, um método YES), revestimento por rotação ou outros métodos de deposição.

[073] Um polímero (não mostrado) pode, então, ser aplicado à superfície silanizada. O polímero pode ser um material polimérico semirrígido que é permeável a líquidos e gases. Um exemplo do polímero inclui um copolímero de acrilamida tal como poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida, PAZAM. PAZAM e algumas outras formas do copolímero de acrilamida são representados pela seguinte estrutura (I):

em que: RA é selecionado a partir do grupo que consiste em azido, amino opcionalmente substituído, alquenila opcionalmente substituída, hidrazona opcionalmente substituída, hidrazina opcionalmente substituída, carboxila, hidróxi, tetrazol opcionalmente substituído, tetrazina opcionalmente substituída, óxido de nitrila, nitrona e tiol; RB é H ou alquila opcionalmente substituída; RC, RD e RE são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H e alquila opcionalmente substituída; cada um do -(CH2)p- pode ser opcionalmente substituído; p é um número inteiro na faixa de 1 a 50; n é um número inteiro na faixa de 1 a 50.000; e m é um número inteiro na faixa de 1 a 100.000.

[074] Um elemento de habilidade comum no estado da técnica reconhecerá que a disposição dos recursos “n” e “m” recorrentes na estrutura (I) são representativos, e as subunidades monoméricas podem estar presentes em qualquer ordem na estrutura polimérica (por exemplo, aleatória, em bloco,

padronizada ou uma combinação dos mesmos).

[075] O peso molecular do PAZAM pode variar de cerca de 10 kDa a cerca de 1500 kDa, ou pode ser, em um exemplo específico, cerca de 312 kDa. Em alguns exemplos, PAZAM é um polímero linear. Em alguns outros exemplos, PAZAM é um polímero levemente reticulado.

[076] Em outros exemplos, o polímero pode ser uma variação da estrutura (I). Em um exemplo, a unidade de acrilamida pode ser substituída com N,N- dimetilacrilamida ( ). Nesse exemplo, a unidade de acrilamida na estrutura (I) pode ser substituída com , em que RD, RE e RF são, cada um, H ou uma C1-C6 alquila, e RG e RH são, cada um, uma C1-C6 alquila (em vez de H como é o caso com a acrilamida). Nesse exemplo, q pode ser um número inteiro na faixa de 1 a 100.000. Em um outro exemplo, a N,N- dimetilacrilamida pode ser usada além da unidade de acrilamida. Nesse exemplo, a estrutura (I) pode incluir além dos recursos “n” e “m” recorrentes, em que RD, RE e RF são, cada um, H ou uma C1-C6 alquila, e RG e RH são, cada um, uma C1-C6 alquila. Nesse exemplo, q pode ser um número inteiro na faixa de 1 a 100.000.

[077] Deve ser entendido que outras moléculas podem ser usadas para formar o polímero, desde que as mesmas sejam funcionalizadas para interagir com a superfície S14 ativada e, com o(s) iniciador(es) 24 subsequentemente aplicado. Outros exemplos de polímeros adequados incluem aqueles tendo uma estrutura coloidal como agarose; ou uma estrutura de malha polimérica tal como gelatina; ou uma estrutura polimérica reticulada tal como polímeros e copolímeros de poliacrilamida, acrilamida livre de silano (SFA) ou uma versão azidolizada de SFA. Exemplos de polímeros de poliacrilamida adequados podem ser sintetizados a partir de acrilamida e um ácido acrílico ou um grupo vinila contendo ácido acrílico, ou a partir de monômeros que formam reação de fotocicloadição [2+2]. Ainda outros exemplos de polímeros adequados 26 incluem copolímeros misturados de acrilamidas e acrilatos.

[078] O polímero (por exemplo, PAZAM) pode ser depositado usando revestimento por rotação, ou embebição ou revestimento por embebição, ou fluxo da molécula funcionalizada sob pressão positiva ou negativa, ou uma outra técnica adequada. O polímero pode estar presente em uma mistura. Em um exemplo, a mistura inclui PAZAM em água ou em uma mistura de água e etanol.

[079] Após ser revestida, a mistura incluindo o polímero também pode ser exposta a um processo de tratamento para formar o polímero através das regiões intersticiais 22 do eletrodo padronizado 26 e nas depressões 20. Em um exemplo, a cura pode ocorrer em uma temperatura que varia de temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 25 °C) a cerca de 95 °C por um tempo que varia de cerca de 1 milissegundo a cerca de vários dias. Em um outro exemplo, o tempo pode variar de 10 segundos a pelo menos 24 horas. Ainda em um outro exemplo, o tempo pode variar de cerca de 5 minutos a cerca de 2 horas.

[080] A ligação do polímero 20 às superfícies silanizadas S14 pode ocorrer através da ligação covalente. A ligação covalente é útil para manter pelo menos o(s) iniciador(es) 24 nas depressões 20 ao longo da vida útil da célula de fluxo 10 recentemente formada durante uma variedade de usos. A seguir estão alguns exemplos de reações que podem ocorrer entre as superfícies ativadas (por exemplo, silanizadas) e o polímero.

[081] Quando silano ou derivado de silano inclui norborneno ou derivado de norborneno como a porção insaturada, o norboreno ou um derivado de norboreno pode: i) ser submetido a uma reação de cicloadição 1,3-dipolar com um grupo azida/azido de PAZAM; ii) ser submetido a uma reação de acoplamento com um grupo tetrazina ligado ao PAZAM; ser submetidos a uma reação de cicloadição com um grupo hidrazona ligado ao PAZAM; ser submetido a uma reação de foto-clique com um grupo tetrazol ligado ao PAZAM; ou ser submetido a uma cicloadição com um grupo óxido de nitrila ligado ao PAZAM.

[082] Quando o silano ou derivado de silano inclui ciclo-octina ou um derivado de ciclo-octina como a porção insaturada, a ciclo-octina ou derivado de ciclo-octina pode: i) ser submetido a uma reação de cicloadição de azida-alcino- 1,3 (SPAAC) com uma azida/azido de PAZAM promovida por tensão, ou ii) ser submetido a uma reação de cicloadição de alcino-óxido de nitrila com um grupo óxido de nitrila ligado ao PAZAM promovida por tensão.

[083] Quando silano ou derivado de silano inclui uma biciclononina como a porção insaturada, a biciclononina pode ser submetida à cicloadição de alcino SPAAC similar com azidas ou óxidos de nitrila ligados ao PAZAM devido à tensão no sistema de anel bicíclico.

[084] Em outros exemplos, calcinação de plasma em vez de silanização pode ser usada para funcionalizar as superfícies expostas S14 do substrato 14 nas depressões 20. Após a calcinação de plasma, a mistura contendo o polímero pode ser revestida diretamente por rotação (ou, de outro modo, depositada) nas superfícies calcinadas com plasma e, então, curadas para formar o polímero. Nesse exemplo, a calcinação de plasma pode gerar agente(s) de ativação de superfície(s) (por exemplo, grupos -OH) que podem aderir o polímero às regiões intersticiais 22 e as superfícies expostas S14 do substrato 14 nas depressões 20. Nesses exemplos, o polímero é selecionado de modo que reaja com os grupos de superfície gerados por calcinação de plasma.

[085] Se a silanização ou calcinação de plasma for usada, o polimento pode, então, ser realizado a fim de remover o polímero das regiões intersticiais 22 do eletrodo padronizado 26. Em alguns exemplos, o polimento também pode remover ou não o silano ou derivado de silano adjacente às regiões intersticiais

22. Quando essas porções silanizadas são removidas completamente, deve ser entendido que o eletrodo padronizado subjacente 26 é exposto.

[086] O processo de polimento pode ser realizado com uma pasta química suave (incluindo, por exemplo, um abrasivo, um tampão, um agente quelante, um tensoativo e/ou um dispersante) que pode remover o polímero fino, e, em algumas instâncias, pelo menos parte do silano ou derivado de silano, das regiões intersticiais 22 sem afetar de modo prejudicial o eletrodo padronizado subjacente 26 nessas regiões. Alternativamente, o polimento pode ser realizado com uma solução que não inclui as partículas abrasivas.

[087] A pasta química pode ser usada em um sistema de polimento mecânico-químico para polir a superfície das regiões intersticiais 22. A(s) cabeça(s)/almofada(s) de polimento ou outra(s) ferramenta(s) de polimento é/são capazes de polir o polímero das regiões intersticiais 22 enquanto deixa(m) o polímero nas depressões 20. Como um exemplo, a cabeça de polimento pode ser uma cabeça de polimento Strasbaugh ViPRR II.

[088] Os processos de limpeza e secagem podem ser realizados após o polimento. O processo de limpeza pode utilizar banho de água e sonicação. O banho de água pode ser mantido em uma temperatura relativamente baixa que varia de cerca de 22°C a cerca de 30°C. O processo de secagem pode envolver secagem por rotação, ou secagem através de uma outra técnica adequada.

[089] Deve ser entendido que outras substâncias químicas e/ou processos também podem ser usados para funcionalizar a superfície de substrato S14 na preparação para ligação de iniciador 24.

[090] Conforme mostrado na Figura 1C, o(s) iniciador(es) 24 é/são ligado(s) à superfície de substrato S14 funcionalizada. Qualquer um dos iniciadores 24 e métodos para enxertar os iniciadores 24 revelados na presente invenção podem ser usados no exemplo mostrado na Figura 1C, desde que o(s) iniciador(es) 24 possa(m) ser ligado(s) aos grupos funcionais (por exemplo, grupos funcionais do polímero) na superfície de substrato S14.

[091] A célula de fluxo 10 inclui um arranjo de depressões 20, de acordo com a arquitetura descrita na Figura 1B ou com a arquitetura descrita na Figura 1C. Uma arranjo 52 correspondente à arquitetura mostrada na Figura 1B é retratada na Figura 3, e um arranjo 52’ correspondente à arquitetura mostrada na Figura 1C é retratada na Figura 5. A célula de fluxo 10 incluindo a arranjo 52 ou 52’ pode ser usada em um fluxo de trabalho de sequenciamento que gera,

através de eletroquimioluminescência, sinais de fluorescência que são detectados oticamente. Exemplos desses fluxos de trabalho serão descritos com referência à Figura 4A à Figura 4C e à Figura 6A à Figura 6C.

[092] Antes do sequenciamento, uma cadeia de polinucleotídeo modelo 40 que deve ser sequenciada pode ser formada na superfície de célula de fluxo usando os iniciadores 24. No início de formação de cadeia de polinucleotídeo modelo, modelos de biblioteca podem ser preparados a partir de qualquer amostra de ácido nucleico (por exemplo, uma amostra de DNA ou uma amostra de RNA). A amostra de ácido nucleico pode ser fragmentada em fragmentos de DNA ou RNA, similarmente conformados, de fita única (por exemplo, < 1000 bp). Durante a preparação, adaptadores podem ser adicionados nas extremidades desses fragmentos. Através de amplificação de ciclo reduzido, diferentes motivos podem ser introduzidos nos adaptadores tais como sítios, índices e regiões de ligação de sequenciamento que são complementares aos iniciadores 24 nas depressões 20. Os modelos de biblioteca finais incluem o fragmento de DNA ou RNA e adaptadores em ambas as extremidades. Em alguns exemplos, os fragmentos de uma única amostra de ácido nucleico têm os mesmos adaptadores adicionados ao mesmo.

[093] Uma pluralidade de modelos de biblioteca pode ser introduzida na célula de fluxo 10. Devido ao fato de que a célula de fluxo 10 inclui um arranjo 52 ou 52’ de depressões 20, múltiplos modelos de biblioteca são hibridizados, por exemplo, para um ou dois tipos de iniciadores 24 imobilizados na superfície de eletrodo S16 ou na superfície de substrato S14 em cada uma das depressões

20.

[094] A geração de grupamento pode, então, ser realizada. Em um exemplo de geração de grupamento, os modelos de biblioteca são copiados a partir dos iniciadores hibridizados 24 por extensão 3’ usando uma DNA polimerase de alta fidelidade. Os modelos de biblioteca originais são desnaturados, deixando as cópias imobilizadas nas depressões 20. Amplificação de ponte isotérmica ou alguma outra forma de amplificação pode ser usada para amplificar as cópias imobilizadas. Por exemplo, os modelos copiados fazem um ciclo para hibridizar para um iniciador complementar 24 adjacente , e uma polimerase copia os modelos copiados para formar pontes de fita dupla, que são desnaturadas para formar duas fitas simples. Essas duas fitas fazem um ciclo e hibridizam para iniciadores complementares 24 adjacentes e são estendidas novamente para formar dois novos ciclos de fita dupla. O processo é repetido em cada cópia de modelo por ciclos de desnaturação isotérmica e amplificação para criar grupamentos clonais densos. Cada grupamento de pontes de fita dupla é desnaturado. Em um exemplo, a fita inversa é removida por clivagem de base específica, deixando as fitas de polinucleotídeo de modelo adiante. Embora uma única cadeia de polinucleotídeo modelo 40 seja mostrada na depressão 20 na Figura 4A à Figura 4C e na Figura 6A à Figura 6C, deve ser entendido que o grupamento resulta na formação de várias cadeias de polinucleotídeo modelo 40 em cada depressão 20. Esse exemplo de grupamento é amplificação de ponte, e é um exemplo da amplificação que pode ser realizada. Deve ser entendido que outras técnicas de amplificação podem ser usadas tais como o fluxo de trabalho de amplificação de exclusão (Examp) (Illumina Inc.).

[095] Durante o sequenciamento, sinais de fluorescência são gerados usando eletroquimioluminescência. Como tal, pelo menos alguns dos nucleotídeos que são introduzidos na célula de fluxo 10 durante o sequenciamento são nucleotídeos marcados que incluem um marcador eletroquimioluminescente. Exemplos do nucleotídeo marcado 28A, 28B, 28C são mostrados na Figura 2. Cada um dos nucleotídeos marcados 28A, 28B, 28C inclui um nucleotídeo 30 tendo um grupo de bloqueio 3’ OH 32A, 32B, 32C, uma molécula de ligação 34 ligada a uma base ou a um açúcar do nucleotídeo 30, e um marcador eletroquimioluminescente 36 ligado à molécula de ligação 34.

[096] O nucleotídeo 30 inclui uma base heterocíclica contendo nitrogênio, um açúcar e um ou mais grupos fosfato. Os nucleotídeos 30 são unidades monoméricas de uma sequência de ácido nucleico. Em RNA, o açúcar é uma ribose, e, em DNA, o açúcar é uma desoxirribose, isto é, um açúcar sem um grupo hidroxila que está presente na posição 2' na ribose. A base heterocíclica contendo nitrogênio (isto é, base nitrogenada) pode ser uma base de purina ou uma base de pirimidina. As bases de purina incluem adenina (A) e guanina (G), e derivados modificados ou análogos das mesmas. As bases de pirimidina incluem citosina (C), timina (T) e uracila (U), de derivados modificados ou análogos das mesmas. O átomo C-1 de ribose ou desoxirribose é ligado a N-1 de uma pirimidina ou N-9 de uma purina. O nucleotídeo 30 pode ser um monofosfato, ou uma forma de polifosfato incluindo vários grupos de fosfato (por exemplo, trifosfato (isto é, gama fosfato), tetra-fosfato, penta-fosfato, hexa-fosfato, etc.). Um análogo de ácido nucleico pode ter qualquer um dentre a cadeia principal de fosfato, o açúcar ou a base nitrogenada alterada. Exemplos de análogos de ácido nucleico incluem, por exemplo, bases universais ou análogos de cadeia principal de fosfato-açúcar tais como ácido nucleico peptídico (PNA). Na Figura 2, a base do nucleotídeo 30 é citosina, o açúcar é desoxirribose, e o fosfato é um tri ou gama-fosfato.

[097] Nos exemplos revelados na presente invenção, o nucleotídeo 30 tem um grupo de bloqueio 3’ OH 32A, 32B, 32C ligado ao mesmo. O grupo de bloqueio 3’ OH 32A, 32B, 32C pode ser ligado a um átomo de oxigênio da molécula de açúcar no nucleotídeo 30. O grupo de bloqueio 3’ OH 32A, 32B, 32C pode ser um terminador reversível que permite que apenas uma incorporação de base única ocorra em cada ciclo de sequenciamento (conforme será discutido adicionalmente com referência à Figura 4A à Figura 4C e à Figura 6A à Figura 6C). O terminador reversível impede que bases adicionais sejam incorporadas em uma fita nascente que é complementar à cadeia de polinucleotídeo modelo 40. Isso possibilita a detecção e identificação de uma única base incorporada. O grupo de bloqueio 3’ OH 32A, 32B, 32C pode ser removido subsequentemente, possibilitando que ciclos de sequenciamento adicionais ocorram em cada cadeia de polinucleotídeo modelo 40. Exemplos de diferentes grupos de bloqueio 3’ OH 32A, 32B, 32C são mostrados na Figura 2, incluindo terminador reversível 3′- ONH2 (mostrado em 32A), um terminador reversível 3′-O-alila (isto é, — CH=CHCH2, mostrado em 32B), e um terminador reversível 3′-O-azidometila (isto é, —CH2N3, mostrado em 32C). Outros terminadores reversíveis adequados incluem éteres o-nitrobenzílicos, carbonato de alquil o-nitrobenzila, porções de éster, outras porções de alila, acetais (por exemplo, terc-butoxi-etóxi), porções de MOM (—CH2OCH3), 2,4- dinitrobenzeno sulfenila, éter tetra-hidrofuranila, 3' fosfato, éteres, -F, - H2 , -OCH3, -N3, -HCOCH3 e carbonato de 2-nitrobenzeno.

[098] Uma molécula de ligação 34 é ligada à base de purina ou a uma base de pirimidina do nucleotídeo 30. Em alguns exemplos, a molécula de ligação 34 inclui um sítio de clivagem, identificado pelas setas na Figura 2. Alguns exemplos de moléculas de ligação adequadas 34 são mostradas na Figura 2, embora deva ser entendido que pode ser usado qualquer ligante clivável adequado que pode ligar o marcador eletroquimioluminescente 36 à base ou ao açúcar do nucleotídeo. Em outros exemplos, a molécula de ligação 34 não é clivável. Esse tipo de molécula de ligação 34 pode ser desejável quando uma detecção de canal é usada e a química de clivagem do marcador de ECL 36 é usada para distinguir as bases de nucleotídeo incorporadas.

[099] Um marcador de eletroquimioluminescência (ECL) 36 é ligado à molécula de ligação 34. Qualquer composto que pode ser ligado à molécula de ligação 34 e que pode exibir eletroquimioluminescência em um fluido (por exemplo, uma solução aquosa) pode ser usado como o marcador de ECL 36.

[0100] Alguns marcadores de ECL 36 são submetidos à autoaniquilação, pela qual o marcador 36 gera diretamente um estado excitado em resposta a um potencial elétrico que é varrido de positivo para negativo. Um exemplo desse tipo de marcador é clorpromazina. Esse tipo de marcador 36 não precisa de um correagente para produzir emissão de ECL.

[0101] Outros marcadores de ECL 36 podem ser classificados como compostos de ECL anódico ou compostos de ECL catódico, dependendo de se os mesmos são ativados por oxidação ou redução, respectivamente.

[0102] Um nucleotídeo alvejado por ECL anódico é oxidado sob potencial positivo aplicado, o que gera um radical cátion que pode, então, ser submetido à transferência de elétron com um correagente (nesse exemplo, um agente de redução) para formar um estado excitado neutro, que é emissivo. Exemplos de marcadores de ECL anódico 36 incluem tris (2,2’-bipiridina)rutênio(II), ácido 2- tiantrenocarboxílico, sódio 9, 10-difenilantraceno-2-sulfonato (DPAS), cujas estruturas são mostradas respectivamente abaixo:

[0103] Correagentes de agente de redução adequados para marcadores de ECL anódico incluem aminas alifáticas tais como trialquilaminas (por exemplo, tri-n-propilamina) e oxalato.

[0104] Um nucleotídeo alvejado por ECL catódico é reduzido sob potencial negativo aplicado, o que gera um radical ânion que pode ser, então, submetido à reação de transferência de elétron com um correagente (nesse exemplo, um agente de oxidação) para formar um estado excitado neutro, que é emissivo. Exemplos de marcadores de ECL catódico 36 incluem dianidrido 3,4,9,10-

perilenotetracarboxílico e meso-tetra(4-sulfonatofenil)porfirina, cujas estruturas são mostradas respectivamente abaixo:

[0105] Um correagente adequado para marcadores de ECL catódico inclui peroxidissulfato (S2O82-) (por exemplo, peroxidissulfato de potássio). Sódio 9, 10- difenilantraceno-2-sulfonato (DPAS) (mostrados acima como um marcador de ECL anódico) também podem funcionar como marcador de ECL catódico 36, quando um potencial negativo apropriado é aplicado com peroxidissulfato de potássio como o correagente.

[0106] Embora vários marcadores de ECL 36 e correagentes exemplificativos tenham sido fornecidos, deve ser entendido que outros marcadores de ECL 36 e correagentes podem ser usados.

[0107] Métodos para sequenciamento usando os nucleotídeos marcados 28A, 28B, 28C e a detecção óptica serão agora descritos com referência à Figura 4A à Figura 4C e à Figura 6A à Figura 6C. A Figura 4A à Figura 4C retratam o método que usa a arquitetura de célula de fluxo da Figura 1B e a arranjo 52 da Figura 3, e a Figura 6A à Figura 6C retratam o método que usa a arquitetura de célula de fluxo da Figura 1C e a arranjo 52’ da Figura 5.

[0108] Antes de um ciclo de sequenciamento, as extremidades 3’ das cadeias/fitas de polinucleotídeo modelo 40 e quaisquer iniciadores de ligação à célula de fluxo 24 (não ligados a cadeias/fitas de polinucleotídeo modelo 40) podem ser bloqueadas para prevenir interferência com a reação de sequenciamento, e, em particular, para prevenir a aplicação de iniciador indesejável.

[0109] Conforme mostrado na Figura 4A e na Figura 6A, um iniciador de sequenciamento 53 pode ser introduzido na célula de fluxo 10, onde hibridizará para uma sequência complementar em um adaptador da cadeia de polinucleotídeo modelo 40. Isso torna a cadeia de polinucleotídeo modelo 40 pronta para sequenciamento.

[0110] O método de sequenciamento inclui introduzir um fluido (por exemplo, uma solução aquosa) incluindo uma polimerase 42 e nucleotídeos (por exemplo, nucleotídeo marcado 28) em uma célula de fluxo 10 incluindo um eletrodo 16 ou 26 que define parcialmente uma depressão 20 incluindo uma cadeia de polinucleotídeo modelo 40 ligada na depressão 20, em que pelo menos alguns dos nucleotídeos são nucleotídeos marcados 28 conforme descrito na presente invenção. Qualquer polimerase de alta ou baixa processabilidade 42 pode ser usada. Alguns exemplos incluem Phi29, Bacillus stearothermophilus (Bst) e fragmento de Klenow (KF), apesar de outros poderem ser usados. Além da(s) polimerase(s) 42 e o(s) nucleotídeo(s) marcado(s) 28, o fluido também pode incluir água, tampão, nucleotídeos não marcados etc. Tampões exemplificativos incluem tampão de Tris, tampão de citrato de sódio salino (SSC), tampão de sulfato de amônio, tampão de fosfato, etc. em alguns exemplos, o tampão pode ser um outro sal de cátion como potássio, magnésio, manganês ou outros.

[0111] Um dos nucleotídeos é incorporado, por uma respectiva polimerase 42, em uma fita nascente que estende o iniciador de sequenciamento 53 e que é complementar à cadeia de polinucleotídeo modelo 40. Em outras palavras, em cada cadeia de polinucleotídeo modelo 40 através da célula de fluxo 10, respectivas polimerases 42 estendem o iniciador de sequenciamento hibridizado 53 por um dos nucleotídeos (marcados ou não) na solução. Os nucleotídeos em solução estão presentes como moléculas separadas únicas, e, assim, a competição natural minimiza a tendência de incorporação. Nas Figuras 4B e 6B, o nucleotídeo incorporado é o nucleotídeo marcado por ECL 28.

[0112] Nos exemplos revelados na presente invenção, tanto os nucleotídeos marcados 28 quanto quaisquer nucleotídeos não marcados incluem um terminador reversível. Como tal, a incorporação de um nucleotídeo marcado 28 ou um nucleotídeo não marcado na fita nascente serve como um terminador para polimerização. Isso possibilita que a geração de sinal eletroquímico e detecção ocorra.

[0113] Após a incorporação, o fluido, que inclui quaisquer nucleotídeos incorporados, pode ser removido da célula de fluxo 10. Isso pode ser realizado usando uma solução de lavagem (por exemplo, água).

[0114] Após a incorporação e remoção de quaisquer nucleotídeos não incorporados, o método inclui aplicar um potencial ao eletrodo 16 (Figura 4B à Figura 4C) ou ao eletrodo padronizado 26 (Figura 6B à Figura 6C), e detectar uma emissão óptica 54 em resposta ao potencial aplicado (Figura 4C e Figura 6C). O potencial que é aplicado ao eletrodo 16 ou ao eletrodo padronizado 26 é suficiente para direcionar a reação de ECL de qualquer nucleotídeo marcado 28 tendo sua base incorporada na fita nascente. Em alguns exemplos, uma série de diferentes potenciais pode ser aplicada sequencialmente a fim de direcionar as reações de ECL de diferentes marcadores de ECL 36.

[0115] Em alguns exemplos, o potencial é varrido de positivo para negativo, o que gera diretamente o estado excitado dos marcadores de ECL 36, resultando na emissão óptica 54.

[0116] Em outros exemplos, o correagente é introduzido no fluido com a polimerase 42 e os nucleotídeos. Nesses exemplos, o potencial aplicado inicia uma via de reação redox que envolve o marcador 36 e o correagente. Como um exemplo, o potencial aplicado pode iniciar oxidação ou redução eletroquímica do marcador de ECL 36 para gerar um íon radical, que é, então, reduzido ou oxidado pelo correagente para formar um estado excitado. O estado excitado resulta na emissão óptica 54.

[0117] Ainda em outros exemplos, um transportador redox pode ser adicionado ao correagente. Um transportador redox pode mover carga através do fluido ou a partir de uma espécie ativa. O transportador redox pode se difundir no eletrodo superfície S16 ou nas paredes de depressão que são definidas pelo eletrodo padronizado 26, e se torna oxidado ou reduzido. O transportador redox oxidado ou reduzido pode, então, se difundir e reagir com o marcador de ECL 36 para formar o marcador de ECL oxidado ou reduzido. O marcador de ECL oxidado ou reduzido precisaria, então, reagir com correagente para formar estado emissivo. O transportador redox pode possibilitar que um marcador de ECL 36 seja submetido a um evento redox quando o marcador 36 não está em contato físico direto com o eletrodo 16 ou 26.

[0118] Nos exemplos mostrados na Figura 4C e na Figura 6C, a emissão óptica 54 é imageada usando uma câmera para capturar a cor de emissão.

[0119] Um agente de desbloqueio pode, então, ser introduzido na célula de fluxo 10. O agente de desbloqueio pode ter capacidade de i) clivar quaisquer moléculas de ligação cliváveis 34 do nucleotídeo marcado 28 incorporado (que também remove o marcador de ECL 36) e ii) remover o grupo de bloqueio 3’ OH 32A, 32B, 32C (ver a Figura 2) do nucleotídeo marcado 28 incorporado. Deve ser entendido que, quando um nucleotídeo não marcado (que não inclui o marcador de ECL 36 ligado ao mesmo) é incorporado à fita nascente, o agente de desbloqueio remove o grupo de bloqueio 3’ OH 32A, 32B, 32C do nucleotídeo não marcado. Em ambos os exemplos, a remoção do grupo de bloqueio 3’ OH 32A, 32B, 32C possibilita que um ciclo de sequenciamento subsequente seja realizado. Exemplos de grupos de bloqueio 3’ OH e agentes de desbloqueio adequados incluem: éteres o-nitrobenzílicos e carbonato de alquil o-nitrobenzila que podem ser removidos fotoliticamente; porções de éster que podem ser removidas por hidrólise de base; porções de alila que podem ser removidas com Nal, clorotrimetilsilano e Na2S2O3 ou com Hg(II) em acetona/água; azidometila que pode ser clivada com fosfinas tais como tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) ou tri(hidroxipropil)fosfina (THP); acetais tais como terc-butoxi-etóxi que podem ser clivados com condições ácidas; porções de MOM (—CH2OCH3) que podem ser clivadas com LiBF4 e CH3CN/H2O; 2,4-dinitrobenzeno sulfenila que pode ser clivada com nucleófilos tais como tiofenol e tiossulfato; éter tetra-hidrofuranílico que pode ser clivado com Ag(I) ou Hg(II); e 3' fosfato que pode ser clivado por enzimas fosfatase (por exemplo, quinase polinucleotídica). Outras porções reversíveis úteis incluem éteres, -F, -H2, -OCH3, -N3, -HCOCH3 e carbonato de 2- nitrobenzeno, e tratamentos de desbloqueio úteis incluem irradiação com luz (por exemplo, para induzir fotoclivagem), aquecimento, exposição a reagentes químicos, exposição a catalisadores, exposição à corrente elétrica (por exemplo,

para induzir eletrólise) ou similares.

[0120] Para facilidade de ilustração e entendimento, a Figura 4A à Figura 4C e a Figura 6A à Figura 6C ilustram um único ciclo de sequenciamento envolvendo uma única cadeia de polinucleotídeo modelo 40 e a incorporação de um único nucleotídeo marcado 28 em uma fita nascente formada complementarmente à cadeia de polinucleotídeo modelo 40. Deve ser entendido, entretanto, que cada depressão 20 inclui várias (por exemplo, até vários milhões) cadeias de polinucleotídeo modelo 40 (amplicons), e incorporação de base única ocorre em cada cadeia de polinucleotídeo modelo 40 em cada depressão 20. O imageamento capturará as emissões 54 resultantes dos vários eventos de incorporação e o(s) potencial (ou potenciais) aplicado(s), e as bases respectivamente incorporadas podem ser identificadas a partir da imagem. As imagens capturadas podem ser processadas com software de análise de imagem para determinar quais nucleotídeos foram incorporados em cada posição de grupamento através da célula de fluxo.

[0121] Nos exemplos revelados na presente invenção, o marcador de ECL 36 pode ter um espectro de emissão específico, um potencial de oxidação ou redução específico, uma vida útil de emissão específica, uma intensidade de emissão específica e/ou uma química de clivagem específica. Essas características exclusivas possibilitam que diferentes marcadores de ECL 36 sejam identificados, por exemplo, por suas respectivas (e distintas) emissões, por respectivos (e distintos) potenciais usados para iniciar oxidação ou redução, por suas respectivas (e distintas) vidas úteis de emissão e/ou pela presença ou ausência de atividade de clivagem particular. Em um exemplo, os respectivos e distintos emissão, potencial, vida útil de emissão e/ou atividade de clivagem de qualquer marcador de ECL 36 é diferente da emissão, potencial, vida útil de emissão e/ou atividade de clivagem de qualquer outro marcador de ECL 36 usado em uma pluralidade de nucleotídeos marcados 26. Como tal, um marcador de ECL 36 específico tendo uma ou mais dessas características pode ser acoplada a uma base de nucleotídeo particular (por exemplo, A, T, C e G). Quando o nucleotídeo marcado 28A, 28B, 28C é incorporado em uma fita nascente durante o sequenciamento, a característica exclusiva do marcador de ECL 36 pode ser detectada e, então, utilizada para identificar a base incorporada.

[0122] Para um exemplo, quatro marcadores de ECL diferentes com quatro espectros de emissão diferentes (isto é, emissão em quatro bandas de comprimentos de onda diferentes) podem ser ligadas respectivamente às quatro bases de nucleotídeo, A, T, C e G. Durante o imageamento em um ciclo de sequenciamento, quatro imagens distintas que usam as quatro bandas de comprimento onda diferentes podem ser capturadas e processadas para identificar quais nucleotídeos foram incorporados.

[0123] Para um outro exemplo, três marcadores de ECL diferentes com três espectros de emissão diferentes (isto é, emissão em três bandas de comprimento de onda diferentes) podem ser ligadas respectivamente às três bases de nucleotídeo, A, T e C, e a base de nucleotídeo G pode permanecer natural (isto é, não marcada). Durante o imageamento em um ciclo de sequenciamento, três imagens distintas que usam três bandas de comprimento de onda diferentes podem ser capturadas e processadas para identificar quais nucleotídeos foram incorporados. Nas imagens, nenhuma emissão (isto é, uma resposta escura) possibilita a identificação da quarta base de nucleotídeo.

[0124] Ainda para um outro exemplo, quatro marcadores de ECL diferentes 36 com quatro potenciais de oxidação ou redução diferentes podem ser ligadas respectivamente às quatro bases de nucleotídeo, A, T, C e G. Durante o ciclo de sequenciamento, o potencial de oxidação ou redução usado para iniciar uma emissão particular pode ser registrado com uma imagem particular. A identificação das quatro bases pode ser alcançada por correlação das emissões com os potenciais de oxidação ou redução aplicados iniciando as emissões. Nesse exemplo, a emissão pode ser no mesmo canal óptico devido ao fato de que o potencial de oxidação ou redução que causa a emissão será usado para distinguir sinais.

[0125] Em um exemplo adicional, quatro marcadores de ECL diferentes com quatro vidas úteis de emissão diferentes podem ser ligadas respectivamente à quatro bases de nucleotídeo, A, T, C e G. Durante o imageamento, as vidas úteis de emissão diferentes podem ser registradas. Esses dados possibilitam a identificação de quaisquer um ou mais das quatro bases de nucleotídeo diferentes.

[0126] Em mais um exemplo, quatro marcadores de ECL diferentes com quatro intensidades de emissão diferentes podem ser ligados respectivamente às quatro bases de nucleotídeo, A, T, C e G. Durante o imageamento, as diferentes intensidades de emissão podem ser registradas. Esses dados possibilitam a identificação de quaisquer um ou mais das quatro bases de nucleotídeo diferentes. Em um outro exemplo, três marcadores de ECL diferentes com três intensidades de emissão diferentes podem ser ligadas respectivamente às três bases de nucleotídeo, A, T e C, e a base de nucleotídeo G pode permanecer natural (por exemplo, não marcada).

[0127] Em mais um exemplo, o mesmo tipo de marcador de ECL 36 pode ser acoplado a moléculas de ligação 34 tendo química de clivagem diferente. Nesse exemplo, quatro nucleotídeos diferentes podem ser usados no fluido. Em um exemplo, o fluido inclui: um primeiro nucleotídeo marcado 28A, 28B, 28C incluindo uma molécula de ligação clivável 34 ligado ao marcador de ECL 36; um segundo nucleotídeo marcado 28A, 28B, 28C incluindo uma molécula de ligação não clivável 34 ligada ao marcador de ECL 36; um terceiro nucleotídeo não marcado tendo um grupo de bloqueio 3’ OH e incluindo uma molécula de ligação 34 tendo capacidade de se ligar ao marcador de ECL 36; e um quarto nucleotídeo não marcado tendo um grupo de bloqueio 3’ OH. Devido ao fato de que um marcador de ECL 36 (que é ativado no mesmo potencial e emite em um canal) é ligado ou é ligável a vários dos nucleotídeos em solução, duas etapas químicas, duas aplicações de potencial de eletrodo, e duas etapas de imageamento são utilizadas por ciclo de sequenciamento. Nesse exemplo, o primeiro ao quarto nucleotídeos diferentes são adicionados na primeira etapa química, o potencial de oxidação ou redução do marcador de ECL 36 é aplicado, e uma imagem é tomada; e, então, um novo reagente é adicionado na segunda etapa química que remove o marcador de ECL 36 do primeiro nucleotídeo marcado e adiciona o marcador de ECL 36 ao terceiro nucleotídeo não marcado, o potencial de oxidação ou redução do marcador de ECL 36 é aplicado novamente, e uma outra imagem é tomada. Nesse exemplo, o primeiro nucleotídeo marcado é imageado na primeira imagem apenas devido ao fato de que seu marcador de ECL 36 é removida antes da segunda imagem é tomada; o segundo nucleotídeo marcado é imageado tanto na primeira quanto na segunda imagens devido ao fato de que seu marcador de ECL 36 é ligada permanentemente; o terceiro nucleotídeo não marcado é imageado na segunda imagem apenas devido ao fato de que o marcador de ECL 36 é introduzida e ligada após a primeira imagem ser tomada; e o quarto nucleotídeo não marcado é permanentemente escuro devido ao fato de que não inclui o marcador de ECL 36 ou tem o marcador de ECL 36 introduzido no mesmo. Nesse exemplo, os diferentes nucleotídeos são identificados por análise dos diferentes padrões de emissão para cada base através das duas imagens.

[0128] Os ciclos de sequenciamento podem ser repetidos para determinar a sequência de bases na cadeia de polinucleotídeo modelo 40, uma base por vez.

[0129] Embora a detecção óptica dos sinais eletroquimicamente gerados tenha sido descrita, deve ser entendido que exemplos da arquitetura de célula de fluxo mostrada na Figura 1B e na Figura 1C também podem ser integrados com um semicondutor de óxido metálico complementar (CMOS), de modo que os sinais de fluorescência por ECL (emissões ópticas 54) são detectados eletricamente. A Figura 7 ilustra a arquitetura de célula de fluxo mostrada na Figura 1B integrada com um CMOS (dispositivo de detecção 44), e a Figura 8 ilustra a arquitetura de célula de fluxo mostrada na Figura 1C integrada com um CMOS (dispositivo de detecção 44).

[0130] Na célula de fluxo 10’ exemplificativa mostrada na Figura 7, o eletrodo 16 é transparente; o substrato 14 é transparente; e um dispositivo de detecção 44 (por exemplo, o CMOS) está em contato com o substrato 14. O dispositivo de detecção 44 inclui um respectivo fotodiodo 50 operativamente associado a cada uma das depressões 20; e circuito de dispositivo eletricamente conectado ao respectivo fotodiodo 50.

[0131] Na célula de fluxo 10’ exemplificativa mostrada na Figura 8, o substrato 14 é transparente; e um dispositivo de detecção 44 (por exemplo, o CMOS) está em contato com o substrato 14. O dispositivo de detecção 44 inclui um respectivo fotodiodo 50 operativamente associado a cada uma das depressões 20; e circuito de dispositivo eletricamente conectado ao respectivo fotodiodo 50.

[0132] Nos exemplos mostrados na Figura 7 e na Figura 8, o termo “transparente” significa que o eletrodo transparente e/ou o substrato transparente permite (ou permitem) que as emissões de luz passem pelo mesmo. Além disso, o substrato transparente pode ser similar a uma camada de passivação em um dispositivo CMOS.

[0133] Os dispositivos de detecção 44 nesses exemplos são dispositivos

CMOS que incluem uma pluralidade de camadas empilhadas incluindo, por exemplo, camada(s)de silício, camada(s) dielétrica(s), camada(s) metálica(s) dielétrica(s), camada(s) metálica(s) etc.). As camadas empilhadas constituem o circuito de detecção. O circuito de detecção 44 pode incluir elementos condutores interconectados (por exemplo, condutores, traços, vias, interconexões, etc.) que podem conduzir corrente elétrica. O circuito pode ser configurado para transmitir seletivamente sinais de dados que são baseados em fótons detectados. O circuito também pode ser configurado para amplificação, digitalização, armazenamento e/ou processamento de sinal. O circuito pode coletar e analisar as emissões de luz detectadas 54 e gera sinais de dados para comunicar os dados de detecção. O circuito também pode realizar processamento de sinal analógico e/ou digital adicional no dispositivo de detecção 44.

[0134] O dispositivo de detecção 44 também inclui componentes ópticos, tal como o fotodiodo 50 (ou outro sensor(es) óptico(s)) e um guia (ou guias) de onda óptico 48. Nos exemplos mostrados nas Figuras 7 e 8, os componentes ópticos são dispostos de modo que cada fotodiodo 50 se alinhe pelo menos substancialmente a, e, assim, seja operativamente associado a, um único guia de onda óptico 48 e única depressão 20.

[0135] Conforme usado na presente invenção, o fotodiodo 50 pode ser um sensor de luz que inclui um pixel ou mais de um pixel. Como um exemplo, cada fotodiodo 50 pode ter uma área de detecção que é menor que cerca de 50 µm2. Como um outro exemplo, a área de detecção pode ser menor que cerca de 10 µm2. Ainda como um outro exemplo, a área de detecção pode ser menor que cerca de 2 µm2. No último exemplo, o fotodiodo 50 pode constituir um único pixel. Um ruído de leitura médio de cada pixel do fotodiodo 50 pode ser, por exemplo, menor que cerca de 150 elétrons. Em outros exemplos, o ruído de leitura pode ser menor que cerca de 5 elétrons. A resolução do(s) sensor(es) óptico(s) 18 pode ser maior que cerca de 0,5 megapixels (Mpixels). Em outros exemplos, a resolução pode ser maior que cerca de 5 Mpixels, ou maior que cerca de 10 Mpixels.

[0136] Conforme também usado na presente invenção, o único guia de onda óptico 48 pode ser um guia de luz incluindo um material que permite que as emissões de luz 54 se propaguem através do mesmo em direção aos fotodiodos correspondentes 50. Devido ao fato de que os métodos revelados na presente invenção geram eletroquimicamente as emissões ópticas 54, o material no guia de onda óptico 48 não precisa ser um filtro para luz de excitação. Um exemplo de um material de guia de luz adequado é um óxido. O material de guia de luz pode ser circundado por um material dielétrico ou metálico que ajuda a formar a estrutura de guia de luz.

[0137] Para as células de fluxo 10’ mostradas na Figura 7 e na Figura 8, os métodos de sequenciamento podem ser realizados conforme descrito na presente invenção com referência à Figura 4A à Figura 4C e à Figura 6A à Figura 6B. O dispositivo de detecção 44 também é um imageador de estado sólido, e, assim, pode imagear a emissão óptica 54 de acordo com os exemplos revelados na presente invenção. Além disso, as emissões de luz 54 são detectadas pelos fotodiodos 50 do dispositivo de detecção 44. Os fotodiodos 50 podem detectar os fótons da emissão de luz 54, e converter esses sinais em sinais elétricos (por exemplo, corrente ou tensão elétrica). Os sinais elétricos se correlacionam com a emissão óptica dos vários marcadores de ECL 36 e, assim, podem ser usados para identificação de eventos de incorporação de base única.

[0138] Embora não sejam mostradas na Figura 7 e na Figura 8, deve ser entendido que as células de fluxo 10’ podem incluir dois controladores de modo que a geração eletroquímica da emissão óptica 54 seja ortogonal à captação de emissão óptica 54. Em outras palavras, o(s) potencial (ou potenciais) aplicado(s) ao eletrodo 16 ou ao eletrodo padronizado 26 pode ser controlado separadamente do circuito do dispositivo de detecção 44.

[0139] Também se observa que uma tampa 46 é mostrada na Figura 7 e na Figura 8. A tampa 46 pode ser usada em qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção para criar o(s) canal (ou canais) de fluxo 12 das células de fluxo 10, 10’. Nos exemplos mostrados na Figura 1A e na Figura 3 à Figura 6C, a tampa 46 pode ser um material transparente, de modo que a emissão óptica 54 possa ser recebida por um detector. Na Figura 7 e na Figura 8, a tampa 46 pode ser feita de qualquer material, uma vez que não há nenhuma fonte de excitação e a emissão óptica 54 é guiada através do dispositivo de detecção 44 para o fotodiodo 50.

[0140] Os exemplos revelados na presente invenção geram sinais eletroquimicamente exclusivos e distinguíveis, e, assim, eliminam a necessidades de uma fonte de excitação. Isso simplifica os sistemas de sequenciamento gerais que podem ser usados com as células de fluxo 10, 10’ reveladas na presente invenção.

[0141] A referência ao longo do relatório descritivo a “um exemplo”, “um outro exemplo”, “um exemplo” e assim por diante significa que um elemento particular (por exemplo, recurso, estrutura e/ou característica) descrito em conjunto com o exemplo é incluído em pelo menos um exemplo descrito na presente invenção, e pode ou pode não estar presente em outros exemplos. Além disso, deve ser entendido que os elementos descritos para qualquer exemplo podem ser combinados de qualquer maneira adequada nos vários exemplos salvo se o contexto ditar claramente de outro modo.

[0142] Os termos “substancialmente” e “cerca de” usados ao longo da presente invenção, incluindo as reivindicações, são usados para descrever e considerar pequenas flutuações tais como devido a variações no processamento. Por exemplo, os mesmos se referem a menor que ou igual a ±5%, tal como menor que ou igual a ±2%, tal como menor que ou igual a ±1%, tal como menor que ou igual a ±0,5%, tal como menor que ou igual a ±0,2%, tal como menor que ou igual a ±0,1%, tal como menor que ou igual a ±0,05%.

[0143] Adicionalmente, deve ser entendido que as faixas fornecidas na presente invenção incluem a faixa apresentada e qualquer valor ou subfaixa dentro da faixa apresentada, como se fossem citadas explicitamente. Por exemplo, uma faixa representada por cerca de 2 mm a cerca de 300 mm, deve ser interpretada como incluindo não apenas os limites explicitamente citados de cerca de 2 mm a cerca de 300 mm, mas também como incluindo valores individuais tais como cerca de 5 mm, 222,5 mm, 275 mm, etc., e subfaixas, tais como de cerca de 150 mm a cerca de 180 mm, etc.

[0144] Embora vários exemplos tenham sido descritos em detalhe, deve ser entendido que os exemplos revelados podem ser modificados. Portanto, a descrição supracitada deve ser considerada como não limitante.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula de fluxo, caracterizada pelo fato de que compreende: um substrato; um eletrodo posicionado no substrato; um material padronizado posicionado no eletrodo, o material padronizado incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; uma superfície funcionalizada do eletrodo exposta em cada uma das depressões; e um iniciador enxertado na superfície funcionalizada em cada uma das depressões.

2. Célula de fluxo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: o eletrodo inclui ouro e a superfície funcionalizada inclui ligantes de tiol ou ligantes de amina; ou o eletrodo inclui óxido de índio-estanho e a superfície funcionalizada inclui um ligante de silano.

3. Célula de fluxo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: o eletrodo é transparente; o substrato é transparente; e a célula de fluxo compreende adicionalmente: um dispositivo de detecção em contato com o substrato, o dispositivo de detecção incluindo: um respectivo fotodiodo operativamente associado a cada uma das depressões; e circuitos de dispositivo eletricamente conectado ao respectivo fotodiodo.

4. Kit de sequenciamento, caracterizado pelo fato de que compreende:

a célula de fluxo definida na reivindicação 1; e nucleotídeos marcados para serem introduzidos na célula de fluxo, cada nucleotídeo marcado incluindo: um nucleotídeo tendo um grupo de bloqueio 3’ OH; uma molécula de ligação ligada a uma base ou a um açúcar do nucleotídeo; e um marcador eletroquimioluminescente ligado à molécula de ligação.

5. Kit de sequenciamento de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem um espectro de emissão distinto.

6. Kit de sequenciamento de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem um potencial de oxidação ou redução distinto.

7. Kit de sequenciamento de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem uma vida útil distinta para emissão eletroquimioluminescente.

8. Kit de sequenciamento de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem uma intensidade de emissão eletroquimioluminescente distinta.

9. Célula de fluxo, caracterizada pelo fato de que compreende: um substrato; um eletrodo padronizado posicionado no substrato, o eletrodo padronizado incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; uma superfície funcionalizada do substrato exposta em cada uma das depressões; e um iniciador enxertado na superfície funcionalizada em cada uma das depressões.

10. Célula de fluxo de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a superfície funcionalizada do substrato inclui uma camada polimérica ligada a grupos silano ligados ao substrato.

11. Célula de fluxo de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a superfície funcionalizada do substrato inclui grupos hidroxila ligados ao substrato.

12. Célula de fluxo de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que: o substrato é transparente; e a célula de fluxo compreende adicionalmente: um dispositivo de detecção em contato com o substrato, o dispositivo de detecção incluindo: um respectivo fotodiodo operativamente associado com cada uma das depressões; e circuitos de dispositivo eletricamente conectados ao respectivo fotodiodo.

13. Kit de sequenciamento, caracterizado pelo fato de que compreende: a célula de fluxo definida na reivindicação 9; e nucleotídeos marcados a serem introduzidos na célula de fluxo, cada nucleotídeo marcado incluindo: um nucleotídeo tendo um grupo de bloqueio 3’ OH; uma molécula de ligação ligada a uma base ou a um açúcar do nucleotídeo; e um marcador eletroquimioluminescente ligado à molécula de ligação.

14. Kit de sequenciamento de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem um espectro de emissão distinto.

15. Kit de sequenciamento de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que o marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem um potencial de oxidação ou redução distinto.

16. Kit de sequenciamento de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem uma vida útil distinta para emissão eletroquimioluminescente.

17. Kit de sequenciamento de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos marcados incluem pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes, e em que um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem uma intensidade de emissão eletroquimioluminescente distinta.

18. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir um fluido incluindo uma polimerase e nucleotídeos em uma célula de fluxo incluindo um eletrodo que define parcialmente uma depressão incluindo uma cadeia de polinucleotídeo modelo ligada na depressão, em que pelo menos alguns dos nucleotídeos são nucleotídeos marcados, cada um dos pelo menos alguns nucleotídeos marcados incluindo: um nucleotídeo tendo um grupo de bloqueio 3’ OH; uma molécula de ligação ligada a uma base ou a um açúcar do nucleotídeo; e um marcador eletroquimioluminescente ligado à molécula de ligação; pelo qual um dos nucleotídeos incorpora em uma fita nascente complementar à cadeia de polinucleotídeo modelo; aplicar um potencial ao eletrodo; e detectar uma emissão óptica em resposta ao potencial aplicado.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos é um dos nucleotídeos marcados, e em que a aplicação do potencial inicia uma via de reação redox envolvendo o marcador eletroquimioluminescente do nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos marcados.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que: o fluido inclui pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes; um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem um espectro de emissão distinto; e o método compreende adicionalmente identificar o nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos marcados a partir de sua emissão óptica.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que: o fluido inclui pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes; um respectivo marcador eletroquimioluminescente de cada um dos pelo menos três nucleotídeos marcados diferentes tem um potencial de oxidação ou redução distinto; e o método compreende adicionalmente identificar o nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos marcados a partir do potencial aplicado.

22. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que antes de aplicar o potencial, o método compreende adicionalmente introduzir um correagente na célula de fluxo.

23. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação e o marcador eletroquimioluminescente do nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos marcados são ligados durante a incorporação, aplicação de potencial, e detecção óptica, e em que após a detecção óptica, o método compreende adicionalmente: introduzir um agente de desbloqueio para clivar a molécula de ligação e o marcador eletroquimioluminescente do nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos marcados e remover o grupo de bloqueio 3’ OH do nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos marcados, possibilitando, desse modo, a incorporação de um outro nucleotídeo ou de um outro nucleotídeo marcado em uma fita nascente.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: introduzir um outro fluido; aplicar um outro potencial ao eletrodo; e detectar uma outra emissão óptica.

25. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que: um fotodiodo detecta a emissão óptica; e o método compreende adicionalmente detectar um sinal elétrico que corresponde à emissão óptica.

26. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que: o nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos é um dentre: um primeiro nucleotídeo marcado, em que a molécula de ligação é clivável; um segundo nucleotídeo marcado, em que a molécula de ligação é não clivável; um terceiro nucleotídeo não marcado tendo um grupo de bloqueio 3’ OH e incluindo uma molécula de ligação que é para se ligar ao marcador eletroquimioluminescente; ou um quarto nucleotídeo não marcado tendo um grupo de bloqueio 3’ OH; e o método compreende adicionalmente: introduzir um reagente que pode clivar o marcador eletroquimioluminescente do primeiro nucleotídeo marcado e pode adicionar o marcador eletroquimioluminescente ao terceiro nucleotídeo não marcado; aplicar um outro potencial ao eletrodo; detectar uma outra emissão óptica em resposta ao potencial aplicado; e usar a emissão óptica detectada e a outra emissão óptica detectada para identificar o nucleotídeo incorporado dos nucleotídeos.

27. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que: a célula de fluxo inclui uma pluralidade de depressões, cada uma das quais inclui uma pluralidade de cadeias de polinucleotídeo modelo ligada na depressão; um respectivo nucleotídeo dos nucleotídeos incorpora em uma respectiva fita nascente complementar à respectiva cadeia de polinucleotídeo modelo; e o método compreende adicionalmente detectar simultaneamente uma respectiva emissão óptica de cada uma da pluralidade de depressões.