CN212451364U - 流动池和测序试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及流动池和测序试剂盒。在一个示例中，流动池包括基底、定位于基底上的电极和定位于电极上的图案化材料。在该示例中，图案化材料包括由间隙区域分隔的凹陷部，并且电极的官能化表面在凹陷部中的每一个处被暴露。在该示例中，流动池还包括在凹陷部中的每一个中被接枝到官能化表面的引物。在另一个示例中，流动池包括基底和定位于基底上的图案化电极。在该其他示例中，图案化电极包括由间隙区域分隔的凹陷部，以及在凹陷部中的每一个处被暴露的基底的官能化表面。在该其他示例中，引物在凹陷部中的每一个中被接枝到官能化表面。

Description

流动池和测序试剂盒
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年12月17日提交的美国临时申请序列号 62/780,602的权益，该美国临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本申请总体上涉及流动池和测序试剂盒。
背景技术
生物或化学研究中的各种方案涉及在局部支撑表面上或在预先界定的反应室内进行大量受控反应。然后可以观察或检测指定的反应，并且随后的分析可以帮助识别或揭示参与反应的化学物质的性质。例如，在一些多重测定中，具有可识别标记物(例如荧光标记物)的未知分析物可以在受控条件下暴露于数以千计的已知的探针。每个已知的探针可以沉积到微孔板(microplate)的对应孔中。观察在孔中的已知的探针和未知分析物之间发生的任何化学反应可以帮助识别或揭示分析物的性质。这类方案的其他示例包括已知的DNA测序方法，例如合成测序(SBS)或循环阵列测序 (cyclic-array sequencing)。利用多核苷酸测序技术，分析可以帮助识别或揭示参与反应的多核苷酸的性质。
实用新型内容
本文公开的第一方面是第一流动池(flow cell)，第一流动池包括基底；电极，该电极定位于基底上；图案化材料，该图案化材料定位于电极上，该图案化材料包括由间隙区域分隔的凹陷部；电极的官能化表面(functionalized surface)，该官能化表面在凹陷部中的每一个处被暴露；和引物(primer)，该引物在凹陷部中的每一个中被接枝到官能化表面。
在第一方面的示例中，电极包括金，并且官能化表面包括硫醇接头 (thiollinker)或胺接头；或者电极包括氧化铟锡，并且官能化表面包括硅烷接头。
在第一方面的示例中，电极是透明的；基底是透明的；并且流动池还包括与基底接触的检测装置，检测装置包括与凹陷部中的每一个可操作地相关联的相应的光电二极管以及电连接到相应的光电二极管的装置电路。
应当理解，本文公开的第一流动池的任何特征可以以任何合意的方式和/或配置组合在一起。
本文公开的第二方面是测序试剂盒，该测序试剂盒包括如在第一方面中所定义的流动池和待引入流动池中的被标记的核苷酸，每个被标记的核苷酸包括具有3’OH封闭基团的核苷酸、附接到核苷酸的碱基或糖的连接分子和附接到连接分子的电化学发光标记物(electrochemiluminescent label)。
在第二方面的示例中，被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的发射光谱。
在第二方面的示例中，被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的氧化电势或还原电势。
在第二方面的示例中，被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的电化学发光发射寿命。
在第二方面的示例中，被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的电化学发光发射强度。
应当理解，此测序试剂盒的任何特征可以以任何合意的方式组合在一起。此外，应当理解，此测序试剂盒和/或流动池的特征的任何组合可以一起使用，和/或与本文公开的任何示例组合。
本文公开的第三方面是另一种流动池，该流动池包括基底；图案化电极，该图案化电极定位于基底上，该图案化电极包括由间隙区域分隔的凹陷部；基底的官能化表面，该官能化表面在凹陷部中的每一个处被暴露；以及引物，该引物在凹陷部中的每一个中被接枝到官能化表面。
在第三方面的示例中，基底的官能化表面包括附接到硅烷基团的聚合物层，该硅烷基团附接到基底。
在第三方面的示例中，基底的官能化表面包括附接到基底的羟基基团。
在第三方面的示例中，基底是透明的；并且流动池还包括与基底接触的检测装置，检测装置包括与凹陷部中的每一个可操作地相关联的相应的光电二极管和电连接到相应的光电二极管的装置电路。
应当理解，此流动池的任何特征可以以任何合意的方式组合在一起。此外，应当理解，此流动池和/或测序试剂盒和/或其他流动池的特征的任何组合可以一起使用，和/或与本文公开的任何示例组合。
本文公开的第四方面是测序试剂盒，测序试剂盒包括如在第三方面中所定义的流动池和待引入流动池中的被标记的核苷酸，每个被标记的核苷酸包括具有3’OH封闭基团的核苷酸、附接到核苷酸的碱基或糖的连接分子和附接到连接分子的电化学发光标记物。
在第四方面的示例中，被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的发射光谱。
在第四方面的示例中，被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的氧化电势或还原电势。
在第四方面的示例中，被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的电化学发光发射寿命。
在第四方面的示例中，被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的电化学发光发射强度。
应当理解，此测序试剂盒的任何特征可以以任何合意的方式组合在一起。此外，应当理解，此测序试剂盒和/或流动池和/或其他测序试剂盒中任一个的特征的任何组合可以一起使用，和/或与本文公开的任何示例组合。
本文公开的第五方面是一种方法，该方法包括：将包含聚合酶和核苷酸的流体引入流动池，该流动池包括部分地界定凹陷部的电极，该凹陷部包括附接在凹陷部中的模板多核苷酸链，其中核苷酸中的至少一些是被标记的核苷酸，至少一些被标记的核苷酸中的每一个包括具有3’OH封闭基团的核苷酸、附接到核苷酸的碱基或糖的连接分子和附接到连接分子的电化学发光标记物，在其中核苷酸中的一个并入到与模板多核苷酸链互补的新生链中；向电极施加电势；以及检测响应于所施加的电势的光学发射。
在第五方面的示例中，核苷酸中的并入的一个核苷酸是被标记的核苷酸中的一个，并且其中电势的施加引发氧化还原反应路径，氧化还原反应路径涉及被标记的核苷酸中的并入的一个被标记的核苷酸的电化学发光标记物。在一个示例中，流体包括至少三种不同的被标记的核苷酸，至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的发射光谱，并且该方法还包括从被标记的核苷酸中的并入的一个被标记的核苷酸的光学发射识别被标记的核苷酸中的并入的一个被标记的核苷酸。在另一个示例中，流体包括至少三种不同的被标记的核苷酸，至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的氧化电势或还原电势，并且该方法还包括从所施加的电势识别被标记的核苷酸中的并入的一个被标记的核苷酸。在又一个示例中，在施加电势之前，该方法还包括将共反应物引入流动池。在又一个示例中，被标记的核苷酸中的并入的一个被标记的核苷酸的连接分子和电化学发光标记物在并入、电势施加和光学检测期间被附接，并且其中在光学检测之后，该方法还包括引入去封闭剂(de-blockingagent)以从被标记的核苷酸中的并入的一个被标记的核苷酸裂解连接分子和电化学发光标记物，并且从被标记的核苷酸中的并入的一个被标记的核苷酸除去3’OH封闭基团，从而能够将另一种核苷酸或另一种被标记的核苷酸并入到新生链中。在此特定示例中，该方法还可以包括引入另一种流体，向电极施加另一电势，以及检测另一光学发射。
在第五方面的示例中，光电二极管检测光学发射，并且该方法还包括检测对应于光学发射的电信号。
在第五方面的示例中，核苷酸中的并入的一个核苷酸是以下中的一个：第一被标记的核苷酸，其中连接分子是可裂解的；第二被标记的核苷酸，其中连接分子是不可裂解的；第三未被标记的核苷酸，其具有3’OH封闭基团并包括连接分子，该连接分子待附接到电化学发光标记物；或第四未被标记的核苷酸，其具有3’OH封闭基团；并且该方法还包括引入一种试剂，试剂能够从第一被标记的核苷酸裂解电化学发光标记物并且能够将电化学发光标记物添加到第三未被标记的核苷酸；向电极施加另一电势；检测响应于所施加的电势的另一光学发射；并且使用检测到的光学发射和检测到的其他光学发射来识别核苷酸中的并入的一个核苷酸。
在第五方面的示例中，流动池包括多个凹陷部，凹陷部中的每一个包括附接在凹陷部中的多个模板多核苷酸链，核苷酸中相应的一个并入到与相应的模板多核苷酸链互补的相应的新生链中，并且该方法还包括同时地检测来自多个凹陷部中的每一个的相应的光学发射。
应当理解，该方法的任何特征可以以任何合意的方式组合在一起。此外，应当理解，该方法和/或第一测序试剂盒和/或第二测序试剂盒的特征的任何组合可以一起使用，和/或与本文公开的任何示例组合。
更进一步，应当理解，所述方法中的任何和/或所述测序试剂盒中的任何的任何特征可以以任何合意的方式组合在一起，和/或可以与本文公开的任何示例组合。
附图说明
通过参考以下详细描述和附图，本公开内容的示例的特征将变得明显，其中相同的参考数字对应于相似的尽管可能不相同的部件。为了简洁起见，参考数字或具有先前描述的功能的特征可以结合或可以不结合它们在其中出现的其他附图来描述。
图1是流动池的示例的图；
图1A是流动池的示例的俯视图；
图1B是图1A的流动池通路中的一个的一部分的示例的放大透视图，示出了界定在电极表面上的凹陷部和在凹陷部中附接在电极表面上的引物；
图1C是图1A的流动池通路中的一个的一部分的另一示例的放大透视图，示出了由基底表面上的图案化电极界定的凹陷部和在凹陷部中附接在基底表面上的引物；
图2示意性描绘了被标记的核苷酸的不同示例；
图3是用于测序试剂盒的流动池的凹陷部的阵列的一个示例的半示意透视图；
图4A至图4C描绘了当图3的阵列暴露于测序循环时该阵列的一个凹陷部的横截面视图；
图5是用于测序试剂盒的流动池的凹陷部的阵列的另一示例的半示意透视图；
图6A至图6C描绘了当图5的阵列暴露于测序循环时该阵列的一个凹陷部的横截面视图；
图7是用于测序试剂盒的流动池的示例的横截面视图，其中流动池并入互补金属氧化物半导体(CMOS)检测装置；以及
图8是用于测序试剂盒的流动池的另一示例的横截面视图，其中流动池并入CMOS检测装置。
具体实施方式
在本文公开的示例中，测序期间的核苷酸碱基调用(nucleotide base calling)经由检测电化学地产生的荧光信号来进行。荧光信号的电化学产生不涉及通过用激光、发光二极管或其他照明源进行照明来激发染料标记的碱基。不需要激发源，本文公开的示例的光学系统被简化。
电化学发光(ECL)的过程开始于电极表面处分子的氧化或还原，以形成自由基阳离子或阴离子。在一些示例中，自由基阳离子或阴离子然后与共反应物进行电子转移，以形成发射激发态。在其他示例中，电极的电势从正扫向负，这可以直接产生发射激发态。在任一示例中，本文公开的过程从激发源产生没有背景噪声的光。因此，本文公开的示例消除由于激发源引起的噪声，并且从而增大信噪比。增大的信噪比改进测序准确度，并且还使得由于较高的数据密度而能够使用较小的间距(pitch)。
此外，在本文公开的示例中，激发态排他地在电极表面处或由电极壁界定的凹陷部内形成，这有助于空间上分辨的ECL活性区域。
更进一步，发射的光子的数目取决于ECL反应的效率和所施加的电势的持续时间。理论上，ECL活性分子可以经历许多氧化还原/反应/发射循环，并且可以在所施加的电势的持续时间内发射光子。这使得能够调整用于信号产生的时间范围，这可以产生更准确的检测结果。
在本文公开的示例中，使用测序试剂盒电化学地产生信号。本文所描述的测序试剂盒的示例是电化学发光测序试剂盒。尽管电化学发光测序试剂盒在本文中被用作测序试剂盒的代表性示例，但是本文中的测序试剂盒不需要是电化学发光试剂盒。每个电化学发光测序试剂盒包括特定的流动池，该流动池并入待用于ECL过程的电极。在一些示例中，流动池可以与光学检测装置一起使用。在其他示例中，流动池与互补金属氧化物半导体(CMOS)检测装置一起集成，并且从而用于光电检测。
图1A中描绘了流动池10的示例。在此示例中，流动池10包括流动通道12。虽然示出了几个流动通道12，但是应当理解，流动池10中可以包括任何数目的通道12(例如，单个通道12、四个通道12等)。每个流动通道12是界定在两个结合部件(例如，基底和盖子或两个基底)之间的区域，该区域可以使液体引入其中以及从其中除去。每个流动通道12 可以与每个其他的流动通道12隔离，使得引入任何特定流动通道12中的液体不流动到任何相邻的流动通道中。如本文将进一步讨论的，引入流动通道12中的液体可以引入反应组分(例如，被标记的核苷酸和/或未被标记的核苷酸)、洗涤溶液、去封闭剂等。
图1B和图1C中示出了流动池10的流动通道12内的结构的不同示例。
在图1B中示出的示例中，流动池10包括基底14、定位于基底14上的电极16和定位于电极16上的图案化材料18。图案化材料18界定由间隙区域22分隔的凹陷部20。在此示例中，电极16的官能化表面S16在凹陷部20中的每一个处被暴露，并且引物24被接枝到官能化表面S16。
图1B中的基底14为流动池10的其他部件提供支撑。基底14通常是刚性的，并且在水性液体中是不溶性的。合适的基底14的示例包括环氧硅氧烷、玻璃、改性玻璃、塑料、尼龙、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅(氧化硅(SiO2))、熔融二氧化硅、硅基材料、硅酸铝、硅、改性硅(例如硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si3N4)、五氧化钽(TaO5)或其他氧化钽(TaOx)、氧化铪(HaO2)、无机玻璃或类似物。用于基底14的合适的塑料的一些示例包括丙烯酸类、聚苯乙烯、苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(例如来自Chemours的
Figure DEST_PATH_GDA0002731836670000081
)、环烯烃类/环烯烃聚合物(COP)(例如来自Zeon的
Figure DEST_PATH_GDA0002731836670000082
)、聚酰亚胺等。支撑物也可以是玻璃或硅，在表面处具有氧化钽或另一种陶瓷氧化物的涂层。
基底14的形式可以是晶片、面板、矩形片材、压模(die)或任何其他合适的配置。在示例中，基底14可以是具有在从约2mm至约300mm 范围内的直径的圆形的晶片或面板。作为更具体的示例，基底14是具有在从约200mm至约300mm范围内的直径的晶片。在另一示例中，基底14 可以是矩形的片材或面板，其最大尺寸多达约10英尺(～3米)。作为具体示例，基底14是具有在从约0.1mm至约10mm范围内的宽度的压模。虽然已经提供了示例性尺寸，但是应当理解，可以使用具有任何合适尺寸的基底14。
在图1B中，电极16定位于基底14上。电极16可以包括任何合适的电极材料，例如金(Au)、银(Ag)、氯化银(AgCl)、铂(Pt)、钛(Ti)、钼(Mo)、氧化铟锡(ITO)、氧化铟锌(IZO)、碳(例如石墨烯、碳纳米管片材)、导电聚合物等。在示例中，电极16是金。电极16可以具有致使电极16是机械上稳定和化学上稳定的任何合适厚度。作为示例，厚度可以是200nm或更大。
电极16可以是例如使用粘合剂附接到基底14的预成型片材，或可以使用合适的沉积技术沉积在基底14上。
在图1B中示出的示例中，图案化材料18定位于电极16上。应当理解，可以选择性地沉积或沉积且图案化以形成凹陷部20和间隙区域22的任何材料可以被用于图案化材料18。图案化材料18可以是导电的或非导电的，并且被选择成使得它不接枝引物24。
作为一个示例，无机氧化物可以经由气相沉积、气溶胶印刷或喷墨印刷选择性地施加到电极16。合适的无机氧化物的示例包括氧化钽、氧化铝、氧化硅、氧化铪等。
作为另一个示例，树脂可以被施加到电极16，并且然后被图案化。合适的沉积技术包括化学气相沉积、浸涂、浸泡涂布、旋涂、喷涂、水坑分配(puddle dispensing)、超声喷涂、刮刀涂布、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷等。合适的图案化技术包括光刻术、纳米压印光刻术(NIL)、冲压技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术、印刷技术等。合适的树脂的一些示例包括基于多面体低聚倍半硅氧烷树脂(POSS)的树脂、非POSS 环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂(例如开环环氧树脂)、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂、无定形的含氟聚合物树脂(例如来自 Bellex的
Figure DEST_PATH_GDA0002731836670000091
)及其组合。
如本文所使用的，术语“多面体低聚倍半硅氧烷”(POSS)是指一种化学组合物，它是二氧化硅(SiO2)和硅酮(R2SiO)之间的混合中间体(例如RSiO1.5)。POSS的示例可以是Kehagias等人Microelectronic Engineering 86(2009)，第776-778页中所描述的POSS，该文献通过引用以其整体并入。在示例中，组合物是具有化学式[RSiO3/2]n的有机硅化合物，其中R基团可以是相同或不同的。POSS的示例性R基团包括环氧树脂、叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯，或者进一步例如烷基基团、芳基基团、烷氧基基团和/或卤代烷基基团。本文公开的树脂组合物可以包含作为单体单元的一种或更多种不同的笼结构或芯结构。多面体结构可以是T8结构例如：
Figure DEST_PATH_GDA0002731836670000101
并且由
Figure DEST_PATH_GDA0002731836670000102
表示。此单体单元通常具有八个官能团臂R1至R8。
单体单元可以具有被称为T10例如：
Figure DEST_PATH_GDA0002731836670000103
的具有10个硅原子和10个R基团的笼结构，或可以具有被称为T12例如：
Figure DEST_PATH_GDA0002731836670000104
的具有 12个硅原子和12个R基团的笼结构。基于POSS的材料可以可选择地包括T6、T14或T16笼结构。平均笼含量(average cagecontent)可以在合成期间被调节，和/或通过纯化方法来控制，并且单体单元的笼尺寸的分布可以用于本文公开的示例中。
如图1B中所示，图案化材料18包括界定在其中的凹陷部20和将相邻凹陷部20分隔的间隙区域22。可以设想凹陷部20的许多不同的布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在示例中，凹陷部20被设置成六边形网格以用于紧密充填和改进的密度。其他布局可以包括，例如直线(即矩形)布局、三角形布局等等。在一些示例中，布局或图案可以是以行和列的x-y格式的凹陷部20。在一些其他示例中，布局或图案可以是凹陷部 20和/或间隙区域22的重复布置。在还其他示例中，布局或图案可以是凹陷部20和/或间隙区域22的随机布置。图案可以包括斑点、垫、孔、柱、条带、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、棋盘格、方格、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。
凹陷部20的布局或图案可以关于界定区域中凹陷部20的密度(即凹陷部20的数目)来表征。例如，凹陷部20可以以约200万每mm2的密度存在。密度可以被调整为不同的密度，包括例如约100每mm2、约1,000 每mm2、约10万每mm2、约100万每mm2、约200万每mm2、约500万每mm2、约1000万每mm2、约5000万每mm2或更多或更少的密度。还应理解的是，图案化材料18中的凹陷部20的密度可以是在选自以上范围的下限值中的一个和上限值中的一个之间。作为示例，高密度阵列可以被表征为具有被分隔小于约100nm的凹陷部20，中等密度阵列可以被表征为具有被分隔约400nm至约1μm的凹陷部20，并且低密度阵列可以被表征为具有被分隔大于约1μm的凹陷部20。虽然已经提供了示例性密度，但是应当理解，可以使用任何合适的密度。
凹陷部20的布局或图案可以也或可选择地以平均间距来表征，平均间距即从凹陷部20的中心到相邻凹陷部20的中心的间距(中心到中心的间距)，或者从一个凹陷部20的边缘到相邻凹陷部20的边缘的间距(边缘到边缘的间距)。图案可以是规则的，使得围绕平均间距的变化的系数小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下，变化的系数可以是相对大的。在任一情况下，平均间距可以是例如约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更多或更少。特定图案的凹陷部20的平均间距可以是在选自以上范围的下限值中的一个和上限值中的一个之间。在示例中，凹陷部20具有约1.5μm的间距(中心到中心的间距)。虽然已经提供了示例性平均间距值，但是应当理解，可以使用其他平均间距值。
每个凹陷部20的尺寸可以通过其体积、开口面积、深度和/或直径来表征。
每个凹陷部20可以具有能够限制液体的任何体积。最小体积或最大体积可以被选择，例如以适应针对流动池10的下游使用所预计的吞吐量 (例如，多重性)、分辨率、分析物组成或分析物反应性。例如，体积可以是至少约1×10-3μm3、约1×10-2μm3、约0.1μm3、约1μm3、约10μm3、约100μm3或更大。可选择地或另外地，体积可以是至多约1×104μm3、约1×103μm3、约100μm3、约10μm3、约1μm3、约0.1μm3或更小。
由每个凹陷部开口占据的面积可以基于与以上针对体积阐述的那些标准相似的标准来选择。例如，每个凹陷部开口的面积可以是至少约1× 10-3μm2、约1×10-2μm2、约0.1μm2、约1μm2、约10μm2、约100μ m2或更大。可选择地或另外地，面积可以是至多约1×103μm2、约100μ m2、约10μm2、约1μm2、约0.1μm2、约1×10-2μm2或更小。由每个凹陷部开口占据的面积可以大于以上指定的值、小于以上指定的值或在以上指定的值之间。
每个凹陷部20的深度可以是至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约 1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。可选择地或另外地，深度可以是至多约1×103μm、至多约100μm、至多约10μm、至多约1μm、至多约0.1μm或更小。在一些示例中，深度是约0.4μm。每个凹陷部20的深度可以大于以上指定的值、小于以上指定的值或在以上指定的值之间。
在一些情况下，每个凹陷部20的直径或长度和宽度可以是至少约 50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。可选择地或另外地，直径或长度和宽度可以是至多约1×103μm、约100 μm、约10μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm或更小(例如，约50nm)。直径或长度和宽度还可以沿着深度而变化(例如，如图4A-4C和图6A-6C 中所示)。每个凹陷部20的直径或长度和宽度可以大于以上指定的值、小于以上指定的值或在以上指定的值之间。
在图1B中所示的示例中，在凹陷部20处被暴露的电极16的表面S16被官能化，使得引物24可以附接到表面S16而不是附接到间隙区域22。电极表面S16的官能化将取决于电极的材料和待被附接到其的引物24。
在一些示例中，电极材料可以被固有地官能化，因为引物24包括可以直接附接到未改性电极材料的末端官能团。例如，硫醇封端的引物可以化学地键合到金电极表面S16。
在其他示例中，电极表面S16可以被改性以并入能够结合到引物24的官能团(即，连接分子)。官能团能够在一端化学地附接到电极表面S16，并且在另一端化学地附接到引物24。例如，硫醇接头或硫醇盐接头或胺接头可以附接到金电极，并且硅烷接头(例如叠氮基硅烷)可以附接到ITO 电极。虽然已经提供了一些示例，但是应当理解，可以使用其他化学官能团。
无论是直接的还是间接的(例如，通过接头)，将引物24附接到电极表面S16可以通过共价键合、配位键合或另一种化学键或物理键(例如π- π堆叠)，这取决于引物24、被使用的任何接头、以及电极材料。
因为表面S16被官能团改性或被固有地官能化，并且间隙区域22不包括引物反应性官能团，所以引物24将附接到表面S16，并且将不附接到间隙区域22。
应当理解，电极官能化可以在图案化材料18被施加到其之前或之后进行。
在其他示例中，电极表面S16可以用聚合物层官能化，如本文参考图1C所描述的。
如图1B中所示，引物24被附接到官能化的电极表面S16。引物24可以是包含官能团的任何正向扩增引物(forward amplification primer)或反向扩增引物(reverseamplification primer)，该官能团可以附接到表面S16，直接地附接到电极材料或附接到与其附接的官能团或附接到与其附接的聚合物层。合适的官能团封端的引物的示例包括炔烃封端引物、四嗪封端引物、叠氮基封端引物、氨基封端引物、环氧基或缩水甘油基封端引物、硫代磷酸酯封端引物、硫醇封端引物、醛封端引物、肼封端引物和三唑啉二酮封端引物。还可以使用引物的混合物。合适的引物的具体示例包括P5 引物和/或P7引物，它们用于由Illumina Inc.出售的商业流动池的表面上，以用于在HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、 NEXTSEQTM、NEXTSEQDXTM、NOVASEQTM、GENOME ANALYZERTM和其他仪器平台上测序。
在示例中，引物24可以使用接枝工艺来附接，例如流过沉积(例如，当流动池10具有与其结合的盖子时)、浸泡涂布、喷涂、水坑分配或通过附接引物24的另一种合适的方法。这些示例性技术中的每一种可以利用可以包括引物、水、缓冲液(例如盐溶液)和催化剂的引物溶液或混合物。
现在参考图1C，流动池10包括基底14和定位于基底14上的图案化电极26。在此示例中，图案化电极26界定由间隙区域22分隔的凹陷部 20。在此示例中，基底14的官能化表面S14在凹陷部20中的每一个处被暴露，并且引物24被接枝到官能化表面S14。
图1C中的基底14为流动池10的其他部件提供支撑。基底14可以是本文描述的任何示例。
在图1C中，图案化电极26定位于基底14上。图案化电极26可以是针对电极16提到的任何电极材料。在此示例中，图案化电极26可以是例如使用粘合剂附接到基底14的预成型网格，或者可以使用合适的沉积技术以合意的图案沉积在基底14上。
在图1C中所示的示例中，图案化电极26包括界定在其中的凹陷部20 和将相邻凹陷部20分隔的间隙区域22。本文针对图1B中的凹陷部20所阐述的任何图案、布局和尺寸可以用于图1C中所示的凹陷部20。
同样在图1C中所示的示例中，在凹陷部20处被暴露的基底14的表面S14被官能化，使得引物24可以附接到表面S14而不是附接到图案化电极26的间隙区域22。
在一些示例中，将基底表面S14官能化涉及将在凹陷部20处被暴露的表面S14硅烷化，并在硅烷化的表面上形成聚合物层。可以使用任何硅烷或硅烷衍生物来完成硅烷化。示例性硅烷或硅烷衍生物包括降冰片烯硅烷、降冰片烯衍生物(例如，[(5-双环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷)、环辛炔、环辛炔衍生物或另一种合适的硅烷。用于附接硅烷或硅烷衍生物的方法可以取决于正被使用的硅烷或硅烷衍生物而变化。合适的硅烷化方法的示例包括气相沉积(例如，YES方法)、旋涂或其他沉积方法。
然后可以将聚合物(未示出)施加到硅烷化的表面。聚合物可以是对液体和气体可渗透的半刚性聚合物材料。聚合物的示例包括丙烯酰胺共聚物，例如聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺，PAZAM。 PAZAM和一些其它形式的丙烯酰胺共聚物由以下结构(I)表示：
Figure DEST_PATH_GDA0002731836670000151
其中：
RA选自由以下组成的组：叠氮基、任选地被取代的氨基、任选地被取代的烯基、任选地被取代的腙、任选地被取代的肼、羧基、羟基、任选地被取代的四唑、任选地被取代的四嗪、腈氧化物(nitrile oxide)、硝酮和硫醇；
RB是氢或任选地被取代的烷基；
RC、RD和RE各自独立地选自由氢和任选地被取代的烷基组成的组；
-(CH2)p-中的每一个可以任选地被取代；
p是在1至50的范围内的整数；
n是在1至50,000的范围内的整数；并且
m是在1至100,000的范围内的整数。
本领域普通技术人员将认识到，结构(I)中重复的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚基(monomeric subunit)可以以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，随机的、嵌段的、图案化的或它们的组合)。
PAZAM的分子量可以在从约10kDa至约1500kDa的范围内，或者在特定的示例中可以是约312kDa。在一些示例中，PAZAM是线性聚合物。在其他一些示例中，PAZAM是轻度交联的聚合物。
在其他示例中，聚合物可以是结构(I)的变体。在一个示例中，丙烯酰胺单元可以被N,N-二甲基丙烯酰胺
Figure DEST_PATH_GDA0002731836670000161
代替。在该示例中，结构(I) 中的丙烯酰胺单元可以被
Figure DEST_PATH_GDA0002731836670000162
代替，其中RD、RE和RF各自是氢或 C1-C6烷基，并且RG和RH各自是C1-C6烷基(而不是如丙烯酰胺情况下的氢)。在此示例中，q可以是在1至100,000范围内的整数。在另一个示例中，除了丙烯酰胺单元之外，还可以使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在此示例中，除了重复的“n”和“m”特征之外，结构(I)可以包括
Figure DEST_PATH_GDA0002731836670000163
其中RD、RE和RF各自是氢或C1-C6烷基，并且RG和RH各自是C1-C6 烷基。在此示例中，q可以是在1至100,000范围内的整数。
应当理解，可以使用其它分子来形成聚合物，只要它们被官能化以与活化表面S14和随后施加的引物24相互作用。合适的聚合物的其他示例包括具有胶体结构的聚合物，例如琼脂糖；或具有聚合物网状结构的聚合物，例如明胶；或具有交联的聚合物结构的聚合物，例如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、无硅烷丙烯酰胺(SFA)或叠氮化形式的SFA。合适的聚丙烯酰胺聚合物的示例可以从丙烯酰胺和丙烯酸或包含乙烯基基团的丙烯酸合成，或者从形成[2+2]光环加成反应的单体合成。合适的聚合物26的还其他示例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。
聚合物(例如PAZAM)可以使用旋涂、或者浸涂(dipping coating) 或浸涂(dipcoating)、或者官能化分子在正压或负压下的流动、或者另一种合适的技术来沉积。聚合物可以存在于混合物中。在示例中，混合物包括水中的PAZAM或在乙醇和水的混合物中的PAZAM。
在被涂布之后，包括聚合物的混合物还可以暴露于固化工艺，以跨过图案化电极26的间隙区域22和在凹陷部20中形成聚合物。在示例中，固化可以在从室温(例如，约25℃)至约95℃范围内的温度发生持续在从约1毫秒至约几天范围内的时间。在另一个示例中，时间可以在从10 秒至至少24小时的范围内。在又一个示例中，时间可以在从约5分钟至约2小时的范围内。
将聚合物附接到硅烷化表面S14可以是通过共价键合。共价连接有助于在多种用途期间在最终形成的流动池10的整个寿命中将至少引物24保持在凹陷部20中。以下是可以在活化(例如硅烷化)表面和聚合物之间发生的反应的一些示例。
当硅烷或硅烷衍生物包括降冰片烯或降冰片烯衍生物作为不饱和部分时，降冰片烯或降冰片烯衍生物可以：i)与PAZAM的叠氮化物/叠氮基基团经历1,3-偶极环加成反应；ii)与附接到PAZAM的四嗪基团经历偶联反应；与附接到PAZAM的腙基团经历环加成反应；与附接到PAZAM的四唑基团经历光点击反应(photo-click reaction)；或者与附接到PAZAM的腈氧化物基团经历环加成。
当硅烷或硅烷衍生物包括环辛炔或环辛炔衍生物作为不饱和部分时，环辛炔或环辛炔衍生物可以：i)与PAZAM的叠氮化物/叠氮基经历应变促进的叠氮化物-炔1,3-环加成(SPAAC)反应，或ii)与附接到PAZAM的腈氧化物基团经历应变促进的炔-腈氧化物环加成反应。
当硅烷或硅烷衍生物包括双环壬炔作为不饱和部分时，由于双环体系的应变，双环壬炔可以与附接到PAZAM的叠氮化合物或腈氧化物经历类似的SPAAC炔环加成。
在其他示例中，等离子体灰化而不是硅烷化可以用于在凹陷部20中将基底14的暴露表面S14官能化。在等离子体灰化之后，包含聚合物的混合物可以直接旋涂(或以其他方式沉积)在等离子体灰化的表面上，并且然后固化以形成聚合物。在此示例中，等离子体灰化可以产生表面活化剂 (例如-OH基团)，表面活化剂可以将聚合物粘附到间隙区域22和凹陷部 20中基底14的暴露表面S14。在这些示例中，聚合物被选择成使得其与由等离子体灰化产生的表面基团反应。
无论是使用硅烷化还是等离子体灰化，然后可以进行抛光，以便从图案化电极26的间隙区域22中除去聚合物。在一些示例中，抛光可以除去或可以不除去邻近间隙区域22的硅烷或硅烷衍生物。当这些硅烷化部分被完全除去时，应当理解，下面的图案化电极26被暴露。
抛光工艺可以用温和的化学浆料(包括例如研磨剂、缓冲液、螯合剂、表面活性剂和/或分散剂)来进行，该浆料可以从间隙区域22中除去薄聚合物，并且在一些情况下除去硅烷或硅烷衍生物的至少一部分，而不有害地影响那些区域处的下面的图案化电极26。可选择地，抛光可以用不包括研磨颗粒的溶液来进行。
化学浆料可以用于化学机械抛光系统中，以抛光间隙区域22的表面。抛光头/抛光垫或其他抛光工具能够从间隙区域22中抛光聚合物，同时将聚合物留在凹陷部20中。作为示例，抛光头可以是Strasbaugh ViPRR II 抛光头。
清洁和干燥工艺可以在抛光之后进行。清洁工艺可以利用水浴和声处理。水浴可以保持在从约22℃至约30℃范围内的相对低的温度。干燥工艺可以包括旋转干燥，或经由另一种合适的技术的干燥。
应当理解，还可以使用其他化学品和/或工艺来官能化基底表面S14，为引物24附接做准备。
如图1C中所示，引物24被附接到官能化的基底表面S14。本文公开的任何引物24和用于接枝引物24的任何方法可以用于图1C中所示的示例中，只要引物24可以附接到基底表面S14处的官能团(例如，聚合物的官能团)。
流动池10包括根据图1B中描述的结构或者根据图1C中描述的结构的凹陷部20的阵列。在图3中描绘对应于图1B中所示的结构的阵列52，并且在图5中描绘对应于图1C中所示的结构的阵列52’。包括阵列52或 52’的流动池10可以用于通过电化学发光产生被光学地检测的荧光信号的测序工作流程。将参照图4A至图4C和图6A至图6C描述这些工作流程的示例。
在测序之前，可以使用引物24在流动池表面上形成待被测序的模板多核苷酸链40。在模板多核苷酸链形成的开始，文库模板可以由任何核酸样品(例如，DNA样品或RNA样品)制备。核酸样品可以被片段化为单链的、相似尺寸(例如，<1000bp)的DNA片段或RNA片段。在制备期间，衔接子(adapters)可以被添加至这些片段的末端。通过减少循环扩增，不同基序可以被引入衔接子中，诸如测序结合位点、索引(indice)和与凹陷部20中的引物24互补的区域。最终的文库模板包括DNA片段或RNA片段和在两个末端处的衔接子。在一些示例中，来自单个核酸样品的片段具有添加至其的相同的衔接子。
多个文库模板可以被引入流动池10。因为流动池10包括凹陷部20的阵列52或52’，所以多个文库模板与例如固定在凹陷部20中的每一个中在电极表面S16或基底表面S14上的两种类型的引物24中的一种杂交。
然后，可以进行簇生成(Cluster generation)。在簇生成的一个示例中，使用高保真的DNA聚合酶通过3’延伸从杂交引物24拷贝文库模板。使原始文库模板变性，留下拷贝固定在凹陷部20中。等温桥扩增或一些其他形式的扩增可以用于扩增固定的拷贝。例如，拷贝的模板形成环并且与相邻的互补引物24杂交，并且聚合酶将拷贝的模板拷贝以形成双链桥，双链桥被变性以形成两条单链。这两条链形成桥并且与相邻的互补引物24 杂交，并且再次延伸以形成两条新的双链环。通过等温变性和扩增的循环在每个模板拷贝上重复该过程，以产生密集的克隆簇。双链桥的每个簇被变性。在示例中，反向链通过特定的碱基裂解被除去，留下正向模板多核苷酸链。虽然在图4A-图4C和图6A-图6C中凹陷部20中示出了单个模板多核苷酸链40，但是应当理解，聚簇导致在每个凹陷部20中形成几个模板多核苷酸链40。聚簇的此示例是桥扩增，并且是可以进行的扩增的一个示例。应当理解，可以使用其他扩增技术，例如排除扩增(Examp)工作流程(Illumina Inc.)。
在测序期间，使用电化学发光产生荧光信号。因此，在测序期间引入流动池10的核苷酸中的至少一些是包括电化学发光标记物的被标记的核苷酸。被标记的核苷酸28A、28B、28C的示例在图2中示出。被标记的核苷酸28A、28B、28C中的每一个包括具有3’OH封闭基团32A、32B、 32C的核苷酸30；附接到核苷酸30的碱基或糖的连接分子34；以及附接到连接分子34的电化学发光标记物36。
核苷酸30包括含氮杂环碱基、糖和一个或更多个磷酸酯基团。核苷酸30是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，并且在DNA中，糖是脱氧核糖，即缺少存在于核糖中的2’位置处的羟基基团的糖。含氮杂环碱基(即核碱基)可以是嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A) 和鸟嘌呤(G)及其修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)及其修饰的衍生物或类似物。核糖或脱氧核糖的C-1原子键合至嘧啶的N-1或嘌呤的N-9。核苷酸30可以是单磷酸酯或包含几个磷酸酯基团的多磷酸酯形式(例如三磷酸酯(即γ磷酸酯)、四磷酸酯、五磷酸酯、六磷酸酯等)。核酸类似物可以具有改变的磷酸酯骨架、糖或核碱基中的任一种。核酸类似物的示例包括例如通用碱基或磷酸酯-糖骨架类似物，例如肽核酸(PNA)。在图2中，核苷酸30的碱基是胞嘧啶，糖是脱氧核糖，并且磷酸酯是三磷酸酯或γ磷酸酯。
在本文公开的示例中，核苷酸30具有附接至其的3’OH封闭基团32A、 32B、32C。3’OH封闭基团32A、32B、32C可以附接到核苷酸30中的糖分子的氧原子。3’OH封闭基团32A、32B、32C可以是仅允许在每个测序循环中发生单个碱基并入(single-baseincorporation)的可逆终止子 (terminator)(如将参考图4A-图4C和图6A-图6C进一步讨论)。可逆终止子阻止另外的碱基并入与模板多核苷酸链40互补的新生链中。这使得能够检测和识别单个并入的碱基。3’OH封闭基团32A、32B、32C随后可以被除去，使得能够在每个模板多核苷酸链40处发生另外的测序循环。在图2中示出不同的3’OH封闭基团32A、32B、32C的示例，包括3’-ONH2可逆终止子(在32A处示出)、3’-O-烯丙基可逆终止子(即，-CH＝CHCH2，在32B处示出)和3’-O-叠氮基甲基可逆终止子(即，-CH2N3，在32C处示出)。其他合适的可逆终止子包括邻硝基苄基醚、邻硝基苄基碳酸烷基酯、酯部分、其他烯丙基部分、缩醛(例如叔丁氧基乙氧基)、MOM (-CH2OCH3)部分、2,4-二硝基苯氧硫基(2,4-dinitrobenzenesulfenyl)、四氢呋喃醚、3’磷酸酯、醚、-F、-H2、-OCH3、-N3、-HCOCH3和2-硝基苯碳酸酯。
连接分子34附接到核苷酸30的嘌呤碱基或嘧啶碱基。在一些示例中，连接分子34包括由图2中的箭头(例如箭头38)标识的裂解位点。合适的连接分子34的一些示例在图2中示出，尽管应当理解，可以使用可以将电化学发光标记物36附接到核苷酸的碱基或糖的任何合适的可裂解的接头。在其他示例中，连接分子34是不可裂解的。当使用单通道检测并且使用ECL标记物36的裂解化学来区分并入的核苷酸碱基时，这种类型的连接分子34可以是合意的。
电化学发光(ECL)标记物36被附接到连接分子34。可以附接到连接分子34并且可以在流体(例如水溶液)中呈现出电化学发光的任何化合物可以用作ECl标记物36。
一些ECL标记物36经历自猝灭(self-annihilation)，由此标记物36 响应于从正扫到负的电势而直接产生激发态。这种类型的标记物的一个示例是氯丙嗪。这种类型的标记物36不需要共反应物来产生ECL发射。
其他ECL标记物36可以被分类为阳极ECL化合物或阴极ECL化合物，这取决于它们分别是通过氧化还是通过还原被活化。
阳极ECL加标签的核苷酸在所施加的正电势下被氧化，这产生自由基阳离子，自由基阳离子然后可以与共反应物(在此示例中，还原剂)进行电子转移反应，以形成中性激发态，该激发态是发射性的。阳极ECL标记物36的示例包括三(2,2’-联吡啶)钌(II)、2-噻蒽甲酸、9,10-二苯基蒽-2-磺酸钠(DPAS)，它们的结构分别在以下示出：
Figure DEST_PATH_GDA0002731836670000221
阳极ECL标签的合适的还原剂共反应物包括脂肪族胺，例如三烷基胺(例如三正丙胺)和草酸酯。
阴极ECL加标签的核苷酸在所施加的负电势下被还原，这产生自由基阴离子，自由基阴离子然后可以与共反应物(在此示例中，氧化剂)进行电子转移反应，以形成中性激发态，该激发态是发射性的。阴极ECL标记物36的示例包括3,4,9,10-苝四甲酸二酐和内消旋-四(4-磺酸根基苯基)卟啉 (meso-tetra(4-sulfonatophenyl)porphyrin)，它们的结构分别在以下示出：
Figure DEST_PATH_GDA0002731836670000231
阴极ECL标签的合适的共反应物包括过氧二硫酸根(S2O8 2-)(例如，过氧二硫酸钾)。当用过氧二硫酸钾作为共反应物施加适当的负电势时，9,10- 二苯基蒽-2-磺酸钠(DPAS)(以上作为阳极ECL标记物示出)还可以用作阴极ECL标记物36。
虽然已经提供了几种示例性ECL标记物36和共反应物，但是应当理解，可以使用其他ECL标记物36和共反应物。
现在将参照图4A-图4C和图6A-图6C来描述用于使用被标记的核苷酸28A、28B、28C和光学检测进行测序的方法。图4A-图4C描绘了使用图1B的流动池结构和图3的阵列52的方法，并且图6A-图6C描绘了使用图1C的流动池结构和图5的阵列52’的方法。
在测序循环之前，可以阻断模板多核苷酸链/链(template polynucleotidechains/strands)40的3’-末端和任何流动池结合的引物24(未附接到模板多核苷酸链/链40)，以防止干扰测序反应，并且特别是防止不合意的启动 (priming)。
如图4A和图6A中所示，可以将测序引物53引入流动池10，其中测序引物53将与模板多核苷酸链40的衔接子上的互补序列杂交。这致使模板多核苷酸链40准备用于测序。
测序方法包括将包含聚合酶42和核苷酸(例如被标记的核苷酸28) 的流体(例如水溶液)引入流动池10，流动池10包括电极16或26，电极16或26部分地界定凹陷部20，凹陷部20包括附接在凹陷部20中的模板多核苷酸链40，其中核苷酸中的至少一些是如本文所描述的被标记的核苷酸28。可以使用任何高持续合成能力或低持续合成能力的聚合酶42。一些示例包括Phi29、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(Bst) 和Klenow片段(KF)，尽管可以使用其它示例。除了聚合酶42和被标记的核苷酸28之外，流体还可以包括水、缓冲液、未被标记的核苷酸等。示例性缓冲液包括Tris缓冲液、盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液、硫酸铵缓冲液、磷酸盐缓冲液等。在一些示例中，缓冲液可以是另一种盐阳离子，例如钾、镁、锰或其他。
核苷酸中的一个通过相应的聚合酶42并入延伸测序引物53并且与模板多核苷酸链40互补的新生链中。换句话说，在遍及流动池10的每个模板多核苷酸链40处，相应的聚合酶42通过溶液中的核苷酸中的一个(标记的或未标记的)延伸杂交的测序引物53。溶液中的核苷酸作为单个单独的分子存在，并且因此自然竞争使并入偏差(incorporation bias)最小化。在图4B和图6B中，并入的核苷酸是ECL被标记的核苷酸28。
在本文公开的示例中，被标记的核苷酸28和任何未被标记的核苷酸两者均包括可逆终止子。因此，将被标记的核苷酸28或未被标记的核苷酸并入新生链中充当用于聚合的终止子。这使得能够发生电化学信号产生和检测。
在并入之后，包括任何未并入的核苷酸的流体可以从流动池10中除去。这可以使用洗涤溶液(例如水)来实现。
在并入和除去任何未并入的核苷酸之后，该方法包括向电极16(图 4B-图4C)或向图案化电极26(图6B-图6C)施加电势，并检测响应于所施加的电势的光学发射54(图4C和图6C)。施加到电极16或图案化电极 26的电势足以驱动任何碱基被并入新生链的被标记的核苷酸28的ECL反应。在一些示例中，可以依次施加一系列不同的电势，以便驱动不同ECL 标记物36的ECL反应。
在一些示例中，电势从正扫向负，这直接产生ECL标记物36的激发态，导致光学发射54。
在其他示例中，共反应物与聚合酶42和核苷酸一起被引入流体中。在这些示例中，所施加的电势引发氧化还原反应路径，该氧化还原反应路径涉及标记物36和共反应物。作为示例，所施加的电势可以引发ECL标记物36的电化学氧化或电化学还原以产生自由基离子，然后自由基离子被共反应物还原或氧化以形成激发态。激发态产生光学发射54。
在还其他的示例中，氧化还原梭(redox shuttle)可以与共反应物一起添加。氧化还原梭可以通过流体将电荷移动到活性物质或从活性物质移动电荷。氧化还原梭可以扩散到电极表面S16或由图案化电极26界定的凹陷部壁，并且变得被氧化或还原。氧化或还原的氧化还原梭然后可以扩散到 ECL标记物36并与ECL标记物36反应，以形成氧化或还原的ECL标记物。氧化或还原的ECL标记物然后将需要与共反应物反应以形成发射态。当标记物36不与电极16或26直接物理接触时，氧化还原梭可以使ECL 标记物36能够经历氧化还原事件。
在图4C和图6C中所示的示例中，使用照相机将光学发射54成像以捕获发射颜色。
然后可以将去封闭剂引入流动池10中。去封闭剂可以能够：i)从并入的被标记的核苷酸28中裂解任何可裂解的连接分子34(这也除去了ECL 标记物36)，和ii)从并入的被标记的核苷酸28中除去3’OH封闭基团32A、 32B、32C(参见图2)。应当理解，当未被标记的核苷酸(其不包括附接至其的ECL标记物36)被并入新生链中时，去封闭剂从未被标记的核苷酸中除去3’OH封闭基团32A、32B、32C。在任一示例中，3’OH封闭基团32A、32B、32C的除去使得能够进行随后的测序循环。3’OH封闭基团和合适的去封闭剂的示例包括：可以被光解地除去的邻硝基苄基醚和邻硝基苄基碳酸烷基酯；可以通过碱水解除去的酯部分；可以用NaI、氯三甲基硅烷和Na2S2O3或用在丙酮/水中的Hg(II)除去的烯丙基部分；可以被膦裂解的叠氮基甲基，例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP)；可以用酸性条件裂解的缩醛，例如叔丁氧基乙氧基；可以被LiBF4和CH3CN/H2O裂解的MOM(-CH2OCH3)部分；可以被亲核试剂例如苯硫酚和硫代硫酸盐裂解的2,4-二硝基苯氧硫基；可以被Ag(I)或Hg(II)裂解的四氢呋喃醚；以及可以通过磷酸酶(例如多核苷酸激酶)裂解的3’磷酸酯。其他有用的可逆部分包括醚、-F、-H2、-OCH3、-N3、-HCOCH3和2- 硝基苯碳酸酯，并且有用的去封闭处理包括用光辐照(例如，以诱导光裂解)、加热、暴露于化学反应物、暴露于催化剂、暴露于电流(例如，以诱导电解)或类似处理。
为了便于说明和理解，图4A-图4C和图6A-图6C示出了涉及单个模板多核苷酸链40和将单个被标记的核苷酸28并入与模板多核苷酸链40 互补形成的新生链中的单个测序循环。然而，应当理解，每个凹陷部20 包括几个(例如，多达几百万个)模板多核苷酸链40(扩增子)，并且单个碱基并入可以同时在每个凹陷部20中的每个模板多核苷酸链40处发生。成像将捕获由各种并入事件和所施加的电势产生的光学发射54，并且可以从图像中识别相应地并入的碱基。捕获的图像可以用图像分析软件来处理，以确定哪些核苷酸被并入遍及流动池的每个簇位置处。
在本文公开的示例中，ECL标记物36可以具有特定的发射光谱、特定的氧化电势或还原电势、特定的发射寿命、特定的发射强度和/或特定的裂解化学。这些独特的特性使得能够例如通过它们相应的(和有区别的) 发射、通过用于引发氧化或还原的相应的(和有区别的)电势、通过它们相应的(和有区别的)发射寿命和/或通过特定裂解活性的存在或不存在来识别不同的ECL标记物36。在示例中，任何一个ECL标记物36的相应的且有区别的发射、电势、发射寿命和/或裂解活性不同于用于多个被标记的核苷酸28的任何其他ECL标记物36的发射、电势、发射寿命和/或裂解活性。因此，具有这些独特特性中的一个或更多个的特定ECL标记物 36可以偶联到特定的核苷酸碱基(例如，A、T、C和G)。当在测序期间将被标记的核苷酸28A、28B、28C并入新生链中时，ECL标记物36的独特特性可以被检测并且然后用于识别并入的碱基。
对于一个示例，具有四种不同的发射光谱(即，四种不同的波长带中的发射)的四种不同的ECL标记物可以分别附接到四种核苷酸碱基(A、T、C和G)。在测序循环中进行成像期间，使用四种不同的波长带的四种有区别的图像可以被捕获和处理，以识别哪些核苷酸已经被并入。
对于另一个示例，具有三种不同的发射光谱(即，在三种不同的波长带中的发射)的三种不同的ECL标记物可以分别附接到三种核苷酸碱基A、 T、和C，并且核苷酸碱基G可以保持天然(即，未标记)。在测序循环中进行成像期间，使用三种不同的波长带的三种有区别的图像可以被捕获和处理，以识别哪些核苷酸已经被并入。在图像中，无发射(即暗响应)使得能够识别第四核苷酸碱基。
对于又一个示例，具有四种不同的氧化电势或还原电势的四种不同的 ECL标记物36可以分别附接到四种核苷酸碱基A、T、C和G。在测序循环期间，用于引发特定发射的氧化电势或还原电势可以用特定图像记录。四种碱基的识别可以通过将发射与引发发射的所施加的氧化电势或还原电势相关联来实现。在此示例中，发射可以在相同的光学通道中，因为引起发射的氧化电势或还原电势将用于区分信号。
在另一个示例中，具有四种不同的发射寿命的四种不同的ECL标记物可以分别附接到四种核苷酸碱基A、T、C和G。在成像期间，可以记录不同的发射寿命。该数据使得能够识别四种不同的核苷酸碱基中的任何一种或更多种。
在又另一个示例中，具有四种不同的发射强度的四种不同的ECL标记物可以分别附接到四种核苷酸碱基A、T、C和G。在成像期间，可以记录不同的发射强度。该数据使得能够识别四种不同的核苷酸碱基中的任何一种或更多种。在另一个示例中，具有三种不同的发射强度的三种不同的 ECL标记物可以分别附接到三种核苷酸碱基A、T和C，并且核苷酸碱基G可以保持天然(例如，未标记)。
对于又一个示例，相同类型的ECL标记物36可以与具有不同的裂解化学的连接分子34偶联。在此示例中，在流体中可以使用四种不同的核苷酸。在示例中，流体包括：第一被标记的核苷酸28A、28B、28C，第一被标记的核苷酸28A、28B、28C包括附接到ECL标记物36的可裂解的连接分子34；第二被标记的核苷酸28A、28B、28C，第二被标记的核苷酸28A、28B、28C包括附接到ECL标记物36的不可裂解的连接分子34；第三未被标记的核苷酸，其具有3’OH封闭基团并包含能够附接到ECL标记物36的连接分子34；以及具有3’OH封闭基团的第四未被标记的核苷酸。因为一种ECL标记物36(在相同的电势被活化并且在一个通道中发射)被附接到或可附接到溶液中的几个核苷酸，所以每个测序循环使用两个化学步骤、两种电极电势施加和两个成像步骤。在此示例中，在第一化学步骤中添加第一至第四不同的核苷酸，施加ECL标记物36的氧化电势或还原电势，并拍摄图像；并且然后在第二化学步骤中添加新试剂，该步骤从第一被标记的核苷酸中除去ECL标记物36并且将ECL标记物36添加到第三未被标记的核苷酸，再次施加ECL标记物36的氧化电势或还原电势，并拍摄另一图像。在此示例中，第一被标记的核苷酸在第一图像中成像，仅仅是因为其ECL标记物36在拍摄第二图像之前被除去；第二被标记的核苷酸在第一图像和第二图像两者中均成像，这是因为其ECL标记物36 被永久地附接；第三未被标记的核苷酸在第二图像中成像，仅仅是因为在拍摄第一图像之后引入并附接ECL标记物36；并且第四未被标记的核苷酸是永久暗的，因为它不包括ECL标记物36或不具有引入其的ECL标记物36。在此示例中，通过分析两个图像中每个碱基的不同发射模式来识别不同的核苷酸。
可以重复测序循环以确定模板多核苷酸链40中的碱基序列，一次一个碱基。
虽然已经描述了电化学地产生的信号的光学检测，但是应当理解，图1B和图1C中所示的流动池结构的示例也可以与互补金属氧化物半导体 (CMOS)集成，使得电检测ECL产生的荧光信号(光学发射54)。图7 示出了集成有CMOS(检测装置44)的图1B中所示的流动池结构，并且图8示出了集成有CMOS(检测装置44)的图1C中所示的流动池结构。
在图7中所示的示例性流动池10’中，电极16是透明的；基底14是透明的；并且检测装置44(例如，CMOS)与基底14接触。检测装置44 包括与凹陷部20中的每一个可操作地相关联的相应的光电二极管50；和电连接到相应的光电二极管50的装置电路。
在图8中所示的示例性流动池10’中，基底14是透明的；并且检测装置44(例如，CMOS)与基底14接触。检测装置44包括与凹陷部20中的每一个可操作地相关联的相应的光电二极管50；和电连接到相应的光电二极管50的装置电路。
在图7和图8中所示的示例中，术语“透明”意指，透明电极和/或透明基底允许光学发射54从其穿过。此外，透明基底可以类似于CMOS装置中的钝化层。
这些示例中的检测装置44是包括多个堆叠层的CMOS装置，这些堆叠层包括例如硅层、介电层、金属介电层、金属层等。堆叠层构成检测电路。检测装置44可以包括可以传导电流的互连的导电元件(例如，导体、迹线、通孔、互连件等)。该电路可以被配置成用于选择性地传输基于检测到的光子的数据信号。该电路还可以被配置成用于信号扩增、数字化、存储和/或处理。该电路可以收集并分析检测到的光学发射54，并且产生用于通信检测数据的数据信号。该电路还可以在检测装置44中进行另外的模拟信号处理和/或数字信号处理。
检测装置44还包括光学部件，例如光电二极管50(或其他光学传感器)和光学波导48。在图7和图8中所示的示例中，光学部件被布置成使得每个光电二极管50至少大体上与单个光学波导48和单个凹陷部20对准，并且因此与单个光学波导48和单个凹陷部20可操作地相关联。
如本文所使用的，光电二极管50可以是包括一种像素或多于一种像素的光传感器。作为示例，每个光电二极管50可以具有小于约50μm2的检测面积。作为另一个示例，检测面积可以小于约10μm2。作为又一个示例，检测面积可以小于约2μm2。在后一示例中，光电二极管50可以构成单一像素。光电二极管50的每种像素的平均读取噪声可以例如小于约150个电子。在其他示例中，读取噪声可以小于约5个电子。光学传感器18 的分辨率可以大于约50万像素(Mpixels)。在其他示例中，分辨率可以大于约5百万像素，或大于约1千万像素。
此外，如本文所使用的，单个光学波导48可以是光导，光导包括允许光学发射54从其穿过朝向对应的光电二极管50传播的材料。因为本文公开的方法电化学地产生光学发射54，所以光学波导48中的材料不需要是激发光的滤光器。合适的光导材料的示例是氧化物。光导材料可以被有助于形成光导结构的介电材料或金属材料包围。
对于图7和图8中所示的流动池10’，测序方法可以如本文参考图4A- 图4C和图6A-图6B所描述来进行。检测装置44也是固态成像器，并且因此可以根据本文公开的示例对光学发射54成像。此外，光学发射54由检测装置44的光电二极管50检测。光电二极管50可以检测光学发射54 的光子，并将这些信号转换成电信号(例如，电流或电压)。电信号与各种ECL标记物36的光学发射相关，并且因此可以用于识别单个碱基并入事件。
虽然在图7和图8中未示出，但是应当理解，流动池10’可以包括两个控制器，使得光学发射54的电化学产生与光学发射54的感测正交。换句话说，施加到电极16或图案化电极26的电势可以与检测装置44的电路分开地控制。
还应注意，图7和图8中示出了盖子46。盖子46可以用于本文公开的任何示例中，以产生流动池10、10’的流动通道12。在图1A和图3至图6C中所示的示例中，盖子46可以是透明材料，使得光学发射54可以被检测器接收。在图7和图8中，盖子46可以由任何材料制成，因为没有激发源，并且光学发射54通过检测装置44被引导到光电二极管50。
本文公开的示例电化学地产生独特且可区分的信号，并且从而消除了对激发源的需求。这简化了可以与本文公开的流动池10、10’一起使用的整个测序系统。
在整个说明书中对“一个示例”、“另一个示例”、“示例”等的提及意指关于该示例描述的特定要素(例如，特征、结构和/或特性)被包括在本文描述的至少一个示例中，并且可以存在于其他示例中或可以不存在于其他示例中。此外，应该理解，用于任何示例的所描述的要素可以在各种示例中以任何合适的方式组合，除非上下文清楚地另有规定。
在包括权利要求的整个本公开内容中使用的术语“大体上”和“约”用于描述并考虑到诸如由于处理中的变化而引起的小波动。例如，它们可以是指小于或等于±5％，诸如小于或等于±2％，诸如小于或等于±1％，诸如小于或等于±0.5％，诸如小于或等于±0.2％，诸如小于或等于±0.1％，诸如小于或等于±0.05％。
此外，应该理解的是，本文提供的范围包括所陈述的范围和所陈述的范围内的任何值或子范围，如同它们被明确地叙述一样。例如，由从约2mm 至约300mm表示的范围应被解释为不仅包括明确叙述的从约2mm至约 300mm的限值，还包括单个值例如约5mm、222.5mm、275mm等，以及子范围例如从约150mm至约180mm等。
虽然已经详细地描述了几个示例，但是应该理解，可以修改所公开的示例。因此，前述描述被认为是非限制性的。

Claims (17)

1.一种流动池，包括：
基底；
电极，所述电极定位于所述基底上；
图案化材料，所述图案化材料定位于所述电极上，所述图案化材料包括由间隙区域分隔的凹陷部；
所述电极的官能化表面，所述官能化表面在所述凹陷部中的每一个处被暴露；以及
引物，所述引物在所述凹陷部中的每一个中被接枝到所述官能化表面。
2.如权利要求1所述的流动池，其中：
所述电极包括金，并且所述官能化表面包括硫醇接头或胺接头；或者
所述电极包括氧化铟锡，并且所述官能化表面包括硅烷接头。
3.如权利要求1所述的流动池，其中：
所述电极是透明的；
所述基底是透明的；并且
所述流动池还包括：
与所述基底接触的检测装置，所述检测装置包括：
与所述凹陷部中的每一个可操作地相关联的相应的光电二极管；以及
电连接到所述相应的光电二极管的装置电路。
4.一种测序试剂盒，包括：
如权利要求1所述的流动池；以及
待引入所述流动池中的被标记的核苷酸，每个被标记的核苷酸包括：
具有3’OH封闭基团的核苷酸；
附接到所述核苷酸的碱基或糖的连接分子；以及
附接到所述连接分子的电化学发光标记物。
5.如权利要求4所述的测序试剂盒，其中所述被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中所述至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的发射光谱。
6.如权利要求4所述的测序试剂盒，其中所述被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中所述至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的氧化电势或还原电势。
7.如权利要求4所述的测序试剂盒，其中所述被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中所述至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的电化学发光发射寿命。
8.如权利要求4所述的测序试剂盒，其中所述被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中所述至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的电化学发光发射强度。
9.一种流动池，包括：
基底；
图案化电极，所述图案化电极定位于所述基底上，所述图案化电极包括由间隙区域分隔的凹陷部；
所述基底的官能化表面，所述官能化表面在所述凹陷部中的每一个处被暴露；以及
引物，所述引物在所述凹陷部中的每一个中被接枝到所述官能化表面。
10.如权利要求9所述的流动池，其中所述基底的所述官能化表面包括附接到硅烷基团的聚合物层，所述硅烷基团附接到所述基底。
11.如权利要求9所述的流动池，其中所述基底的所述官能化表面包括附接到所述基底的羟基基团。
12.如权利要求9所述的流动池，其中：
所述基底是透明的；并且
所述流动池还包括：
与所述基底接触的检测装置，所述检测装置包括：
与所述凹陷部中的每一个可操作地相关联的相应的光电二极管；以及
电连接到所述相应的光电二极管的装置电路。
13.一种测序试剂盒，包括：
如权利要求9所述的流动池；以及
待引入所述流动池中的被标记的核苷酸，每个被标记的核苷酸包括：
具有3’OH封闭基团的核苷酸；
附接到所述核苷酸的碱基或糖的连接分子；以及
附接到所述连接分子的电化学发光标记物。
14.如权利要求13所述的测序试剂盒，其中所述被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中所述至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的发射光谱。
15.如权利要求13所述的测序试剂盒，其中所述被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中所述至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的氧化电势或还原电势。
16.如权利要求13所述的测序试剂盒，其中所述被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中所述至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的电化学发光发射寿命。
17.如权利要求13所述的测序试剂盒，其中所述被标记的核苷酸包括至少三种不同的被标记的核苷酸，并且其中所述至少三种不同的被标记的核苷酸中的每一种的相应的电化学发光标记物具有有区别的电化学发光发射强度。
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