KR20210093749A - 유동 셀 및 시퀀싱 키트 - Google Patents

유동 셀 및 시퀀싱 키트 Download PDF

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KR20210093749A
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헤이든 블랙
브라이언 디. 매더
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일루미나, 인코포레이티드
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Abstract

일례에서, 유동 셀은 기판, 기판 상에 위치한 전극, 및 전극 상에 위치한 패턴화된 물질을 포함한다. 이러한 예에서, 패턴화된 물질은 틈새 영역에 의해 분리된 함몰부를 포함하고, 전극의 작용성화된 표면은 각각의 함몰부에서 노출된다. 이러한 예에서, 유동 셀은 추가로 각각의 함몰부에서 작용성화된 표면에 그라프팅된 프라이머를 포함한다. 또 다른 예에서, 유동 셀은 기판 및 기판 상에 위치한 패턴화된 전극을 포함한다. 이러한 다른 예에서, 패턴화된 전극은 틈새 영역에 의해 분리된 함몰부, 및 각각의 함몰부에서 노출된 기판의 작용성화된 표면을 포함한다. 이러한 다른 예에서, 프라이머는 각각의 함몰부에서 작용성화된 표면에 그라프팅된다.

Description

유동 셀 및 시퀀싱 키트
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2018년 12월 17일자 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/780,602호의 우선권을 주장하며; 상기 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
생물학적 또는 화학적 연구의 다양한 프로토콜은 국소 지지체 표면 상에서 또는 소정 반응 챔버 내에서 다수의 제어 반응을 수행하는 것을 수반한다. 그 후에, 지정된 반응이 관찰되거나 검출될 수 있으며, 후속 분석이 반응에 관여하는 화학 물질의 특성을 확인하거나 밝히는 데 도움을 줄 수 있다. 예를 들어, 일부 복합적인 분석에서, 식별 가능한 표지(예를 들어, 형광 표지)를 갖는 미지의 분석물은 제어된 조건 하에서 수천 개의 알려진 프로브에 노출될 수 있다. 각각의 알려진 프로브는 마이크로플레이트의 상응하는 웰에 증착될 수 있다. 알려진 프로브와 웰 내의 미지 분석물 사이에서 발생하는 임의의 화학 반응을 관찰하는 것은 분석물의 특성을 확인하거나 밝히는 데 도움을 줄 수 있다. 이러한 프로토콜의 다른 예에는 합성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-synthesis: SBS) 또는 사이클릭-어레이 시퀀싱(cyclic-array sequencing)과 같은 알려진 DNA 시퀀싱 공정이 포함된다. 폴리뉴클레오티드 시퀀싱 기법으로, 분석은 반응에 관여하는 폴리뉴클레오티드의 특성을 확인하거나 밝히는 데 도움을 줄 수 있다.
서문
본원에 개시된 첫 번째 양태는 기판; 기판 상에 위치한 전극; 전극 상에 위치한 패턴화된 물질로서, 틈새 영역(interstitial region)에 의해 분리된 함몰부(depression)를 포함하는, 패턴화된 물질; 각각의 함몰부에서 노출된 전극의 작용성화된 표면; 및 각각의 함몰부에서 기능성 표면으로 그라프팅된(grafted) 프라이머를 포함하는, 제1 유동 셀이다.
첫 번째 양태의 일례에서, 전극은 금을 포함하고, 작용성화된 표면은 티올 링커 또는 아민 링커를 포함하거나; 전극은 인듐 주석 옥사이드를 포함하고, 작용성화된 표면은 실란 링커를 포함한다.
첫 번째 양태의 일례에서, 전극은 투명하고; 기판은 투명하고; 유동 셀은 추가로 기판과 접촉된 검출 디바이스를 포함하며, 여기서 검출 디바이스는 각각의 함몰부와 작동적으로 결합된 각 포토다이오드 및 각 포토다이오드에 전기적으로 연결된 디바이스 회로를 포함한다.
본원에 개시된 제1 유동 셀의 임의의 특징은 임의의 요망되는 방식 및/또는 구성으로 함께 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본원에 개시된 두 번째 양태는 첫 번째 양태에 정의된 바와 같은 유동 셀 및 유동 셀에 도입될 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 시퀀싱 키트로서, 각 표지된 뉴클레오티드가 3' OH 차단기를 갖는 뉴클레오티드를 포함하고, 링킹 분자가 뉴클레오티드의 염기 또는 당에 부착되고, 전기화학발광 표지가 링킹 분자에 부착되는, 시퀀싱 키트이다.
두 번째 양태의 일례에서, 표지된 뉴클레오티드는 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 각각의 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지는 별개의 방출 스펙트럼을 갖는다.
두 번째 양태의 일례에서, 표지된 뉴클레오티드는 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 각각의 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지는 별개의 산화 또는 환원 전위를 갖는다.
두 번째 양태의 일례에서, 표지된 뉴클레오티드는 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 각각의 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지는 별개의 전기화학발광 방출 수명을 갖는다.
두 번째 양태의 일례에서, 표지된 뉴클레오티드는 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 각각의 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지는 별개의 전기화학발광 방출 세기를 갖는다.
이러한 시퀀싱 키트의 임의의 특징은 임의의 요망되는 방식으로 함께 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 더욱이, 이러한 시퀀싱 키트 및/또는 유동 셀의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고/거나 본원에 개시된 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본원에 개시된 세 번째 양태는 기판, 기판 상에 위치한 패턴화된 전극으로서, 틈새 영역에 의해 분리된 함몰부를 포함하는, 패턴화된 전극, 각각의 함몰부에서 노출된 기판의 작용성화된 표면, 및 각각의 함몰부에서 작용성화된 표면에 그라프팅된 프라이머를 포함하는 또 다른 유동 셀이다.
세 번째 양태의 일례에서, 기판의 작용성화된 표면은 기판에 부착된 실란 기에 부착된 폴리머 층을 포함한다.
세 번째 양태의 일례에서, 기판의 작용성화된 표면은 기판에 부착된 하이드록실 기를 포함한다.
세 번째 양태의 일례에서, 기판은 투명하고; 유동 셀은 추가로 기판과 접촉된 검출 디바이스를 포함하고, 검출 디바이스는 각각의 함몰부와 작동적으로 결합된 각 포토다이오드 및 각 포토다이오드에 전기적으로 연결된 디바이스 회로를 포함한다.
이러한 유동 셀의 임의의 특징은 임의의 요망되는 방식으로 함께 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 더욱이, 이러한 유동 셀 및/또는 시퀀싱 키트 및/또는 다른 유동 셀의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고/거나 본원에 개시된 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본원에 개시된 네 번째 양태는 세 번째 양태에 정의된 바와 같은 유동 셀 및 유동 셀에 도입될 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 시퀀싱 키트로서, 각 표지된 뉴클레오티드가 3' OH 차단기를 갖는 뉴클레오티드를 포함하고, 링킹 분자가 뉴클레오티드의 염기 또는 당에 부착되고, 전기화학발광 표지가 링킹 분자에 부착되는, 시퀀싱 키트이다.
네 번째 양태의 일례에서, 표지된 뉴클레오티드는 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 각각의 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지는 별개의 방출 스펙트럼을 갖는다.
네 번째 양태의 일례에서, 표지된 뉴클레오티드는 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 각각의 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 전기화학발광 표지는 별개의 산화 또는 환원 전위를 갖는다.
네 번째 양태의 일례에서, 표지된 뉴클레오티드는 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 각각의 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지는 별개의 전기화학발광 방출 수명을 갖는다.
네 번째 양태의 일례에서, 표지된 뉴클레오티드는 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 각각의 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지는 별개의 전기화학발광 방출 세기를 갖는다.
이러한 시퀀싱 키트의 임의의 특징은 임의의 요망되는 방식으로 함께 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 더욱이, 이러한 시퀀싱 키트 및/또는 유동 셀 및/또는 다른 시퀀싱 키트의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고/거나 본원에 개시된 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본원에 개시된 다섯 번째 양태는 함몰부에 부착된 주형 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하는 함몰부를 부분적으로 한정하는 전극을 포함하는 유동 셀에 폴리머라제 및 뉴클레오티드를 포함하는 유체를 도입하고, 이에 의해 뉴클레오티드 중 하나가 주형 폴리뉴클레오티드 사슬에 상보적인 신생 가닥으로 혼입되고, 뉴클레오티드의 적어도 일부가 표지된 뉴클레오티드이고, 각각의 적어도 일부 표지된 뉴클레오티드가 3' OH 차단기를 갖는 뉴클레오티드를 포함하고, 링킹 분자가 뉴클레오티드의 염기 또는 당에 부착되고, 전기화학발광 표지가 링킹 분자에 부착되고; 전극에 전위를 인가하고; 인가된 전위에 반응하여 광학적 방출을 검출함을 포함하는 방법이다.
다섯 번째 양태의 일례에서, 뉴클레오티드 중 혼입된 하나는 표지된 뉴클레오티드 중 하나이고, 여기서 전위의 인가는 표지된 뉴클레오티드 중 혼입된 하나의 전기화학발광 표지를 수반하는 레독스 반응 경로를 개시한다. 일례에서, 유체는 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지는 별개의 방출 스펙트럼을 갖고, 방법은 추가로 이의 광학적 방출로부터 표지된 뉴클레오티드 중 혼입된 하나를 식별하는 것을 포함한다. 또 다른 예에서, 유체는 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지는 별개의 산화 또는 환원 전위를 갖고, 방법은 추가로 인가된 전위로부터 표지된 뉴클레오티드 중 혼입된 하나를 식별하는 것을 포함한다. 추가의 또 다른 예에서, 전위를 인가하기 전, 방법은 추가로 공반응물을 유동 셀에 도입하는 것을 포함한다. 또 다른 추가의 예에서, 링킹 분자 및 표지된 뉴클레오티드 중 혼입된 하나의 전기화학발광 표지는 혼입, 전위 인가, 및 광학적 검출 동안 부착되고, 여기서 광학적 검출 후, 방법은 추가로 탈차단제를 도입하여 링킹 분자 및 표지된 뉴클레오티드 중 혼입된 하나로부터의 전기화학발광 표지를 절단하고 표지된 뉴클레오티드 중 혼입된 하나로부터 3' OH 차단기를 제거하고, 이에 의해 신생 가닥으로 또 다른 뉴클레오티드 또는 또 다른 표지된 뉴클레오티드의 혼입이 가능하다. 이러한 특정 예에서, 방법은 추가로 또 다른 유체를 도입하고, 또 다른 전위를 전극에 인가하고, 또 다른 광학적 방출을 검출하는 것을 포함할 수 있다.
다섯 번째 양태의 일례에서, 포토다이오드는 광학적 방출을 검출하고, 방법은 추가로 광학적 방출에 상응하는 전기 신호를 검출하는 것을 포함한다.
다섯 번째 양태의 일례에서, 뉴클레오티드 중 혼입된 하나는 링킹 분자가 절단성인, 제1 표지된 뉴클레오티드; 링킹 분자가 비-절단성인, 제2 표지된 뉴클레오티드; 3' OH 차단기를 포함하고 전기화학발광 표지에 부착될 링킹 분자를 포함하는, 제3 비-표지된 뉴클레오티드; 또는 3' OH 차단기를 갖는, 제4 비-표지된 뉴클레오티드 중 하나이고; 방법은 추가로 제1 표지된 뉴클레오티드로부터 전기화학발광 표지를 절단할 수 있고 제3 비-표지된 뉴클레오티드에 전기화학발광 표지를 첨가할 수 있는 시약을 도입하고, 또 다른 전위를 전극에 인가하고, 인가된 전위에 반응하여 또 다른 광학적 방출을 검출하고, 검출된 광학적 방출 및 검출된 다른 광학적 방출을 이용하여 뉴클레오티드 중 혼입된 하나를 식별하는 것을 포함한다.
다섯 번째 양태의 일례에서, 유동 셀은 복수의 함몰부를 포함하고, 이들 각각은 함몰부에 부착된 복수의 주형 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하고, 뉴클레오티드 중 각 하나는 각 주형 폴리뉴클레오티드 사슬에 상보적인 각 신생 가닥으로 혼입되고, 방법은 추가로 각각의 복수의 함몰부로부터 각 광학적 방출을 동시에 검출하는 것을 포함한다.
방법의 임의의 특징은 임의의 요망되는 방식으로 함께 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 더욱이, 이러한 방법 및/또는 제1 시퀀싱 키트 및/또는 제2 시퀀싱 키트의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고/거나 본원에 개시된 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
또한 추가로, 임의의 방법 및/또는 임의의 시퀀싱 키트의 임의의 특징은 임의의 요망되는 방식으로 함께 조합될 수 있고/거나, 임의의 본원에 개시된 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 개시의 예의 특징은 하기 상세한 설명 및 도면을 참조로 하여 명백해질 것이고, 여기서 유사한 참조 부호는 유사하지만 아마도 동일하지 않은 구성요소에 해당한다. 간결함을 위해, 이전에 기재된 기능을 갖는 참조 부호 또는 특징은 이들이 나타나는 다른 도면과 연관하여 기술되거나 기술되지 않을 수 있다.
도 1의 A는 유동 셀의 일례의 상면도이다.
도 1의 B는 전극 표면 상에 한정된 함몰부 및 함몰부에서 전극 표면 상에 부착된 프라이머를 예시하는, 도 1의 A는 유동 셀 레인 중 하나의 일부에 대한 일례의 확대 사시도이다.
도 1의 C는 기판 표면 상에 패턴화된 전극에 의해 한정된 함몰부 및 함몰부에서 기판 표면 상에 부착된 프라이머를 예시하는, 도 1의 A는 유동 셀 레인 중 하나의 일부에 대한 또 다른 예의 확대 사시도이다.
도 2는 표지된 뉴클레오티드의 상이한 예를 계략적으로 도시한 것이다.
도 3은 시퀀싱 키트에 대한 유동 셀의 함몰부의 어레이에 대한 일례의 반개략적 사시도이다.
도 4의 A 내지 도 4의 C는 시퀀싱 사이클에 노출됨에 따른 도 3의 어레이의 하나의 함몰부에 대한 단면도를 도시한 것이다.
도 5는 시퀀싱 키트에 대한 유동 셀의 함몰부의 어레이에 대한 또 다른 예의 반개략적 사시도이다.
도 6의 A 내지 도 6의 C는 시퀀싱 사이클에 노출됨에 따른 도 5의 어레이의 하나의 함몰부에 대한 단면도를 도시한 것이다.
도 7은 시퀀싱 키트를 위한 유동 셀의 일례에 대한 단면도이고, 여기서 유동 셀에는 상보적 금속-산화물 반도체(CMOS) 검출 디바이스가 혼입된다.
도 8은 시퀀싱 키트를 위한 유동 셀의 또 다른 예에 대한 단면도이고, 여기서 유동 셀에는 CMOS 검출 디바이스가 혼입된다.
상세한 설명
본원에 개시된 예에서, 시퀀싱 동안 뉴클레오티드 염기 호출은 전기화학적으로 발생된 형광 신호의 검출을 통해 수행된다. 형광 신호의 전기화학적 발생은 레이저, 발광 다이오드, 또는 다른 조명원으로의 발광을 통한 염료-표지 염기의 여기를 수반하지 않는다. 여기원에 대한 필요 없이, 본원에 개시된 예들의 광학 시스템은 단순화된다.
전기화학발광(ECL)의 공정은 라디칼 양이온 또는 음이온을 형성시키는 전극 표면에서 분자의 산화 또는 환원으로 시작한다. 일부 예에서, 라디칼 양이온 또는 음이온은 이후 공반응물과 전자 전달을 거쳐 방출 여기 상태를 형성시킨다. 다른 예에서, 전극의 전위는 양에서 음으로 바뀌는데, 이는 방출 여기 상태를 직접적으로 발생시킬 수 있다. 어느 한 예에서, 본원에 개시된 공정은 여기원으로부터 배경 잡음 없이 광을 생성시킨다. 이와 같이, 본원에 개시된 예는 여기원으로 인한 잡음을 없애고, 이에 따라 신호 대 잡음 비를 증가시킨다. 신호 대 잡음 비가 증가하면 시퀀싱 정밀도가 향상되고, 또한 데이터 밀도가 높아져 더 작은 피치를 사용할 수 있다.
추가로, 본원에 개시된 예에서, 여기 상태는 오로지 전극 표면에서 또는 전극 벽에 의해 한정된 함몰부 내에서만 형성되는데, 이는 공간적으로 분해된 ECL 활성 영역을 가능하게 한다.
또한 추가로, 방출되는 광자의 수는 ECL 반응의 효율 및 인가 전위의 기간에 좌우된다. 이론 상, ECL 활성 분자는 다수 레독스/반응/방출 사이클을 거칠 수 있고, 인가 전위의 기간 동안 광자를 방출할 수 있다. 이는 신호 발생의 기간이 조절될 수 있게 하는데, 이에 의해 보다 정밀한 검출 결과가 얻어질 수 있다.
본원에 개시된 예에서, 신호는 시퀀싱 키트를 사용하여 전기화학적으로 발생된다. 본원에 기재된 시퀀싱 키트의 일례는 전기화학발광 시퀀싱 키트이다. 전기화학발광 시퀀싱 키트는 시퀀싱 키트의 대표예로서 본원에서 사용되지만, 본원의 시퀀싱 키트는 전기화학발광 키트일 필요가 없다. 각각의 전기화학발광 시퀀싱 키트는 ECL 공정에서 사용되도록 전극을 혼입하는 특정 유동 셀을 포함하낟. 일부 예에서, 유동 셀은 광학적 검출 디바이스와 사용될 수 있다. 다른 예에서, 유동 셀은 상보적 금속-산화물 반도체(CMOS) 검출 디바이스와 통합되고, 이에 따라 광전자 검출을 위해 사용된다.
유동 셀(10)의 일례는 도 1의 A에 도시되어 있다. 이러한 예에서, 유동 셀(10)은 유동 채널(12)을 포함한다. 여러 유동 채널(12)이 나타나 있지만, 임의 수의 채널(12)이 유동 셀(10)에 포함될 수 있다는 것이 이해되어야 한다(예를 들어, 단일 채널(12), 네 개의 채널(12) 등). 각 유동 채널(12)은 두 개의 결합된 구성요소(예를 들어, 한 개의 기판 및 한 개의 뚜껑 또는 두 개의 기판) 사이에 한정된 영역인데, 이에 도입되고 이로부터 제거되는 액체를 가질 수 있다. 각 유동 채널(12)은 임의의 특정 유동 채널(12)에 도입된 액체가 임의의 인접 유동 채널로 흐르지 않도록 유동 채널(12) 간에 분리될 수 있다. 본원에서 추가로 논의될 바와 같이, 유동 채널(12)에 도입된 액체는 반응 성분(예를 들어, 표지된 및/또는 비-표지된 뉴클레오티드), 세척 용액, 탈차단제 등을 도입할 수 있다.
유동 셀 (10)의 유동 채널(12) 내 구조의 상이한 예가 도 1의 B 및 도 1의 C에 나타나 있다.
도 1의 B에 나타나 있는 예에서, 유동 셀(10)은 기판(14), 기판(14) 상에 위치한 전극(16), 및 전극(16) 상에 위치한 패턴화된 물질(18)을 포함한다. 패턴화된 물질(18)은 틈새 영역(22)에 의해 분리된 함몰부(18)를 한정한다. 이러한 예에서, 전극(16)의 작용성화된 표면(S16)은 각각의 함몰부(18)에서 노출되고, 프라이머(24)는 작용성화된 표면(S16)에 그라프팅된다.
도 1의 B에서 기판(14)은 유동 셀(10)의 다른 구성요소를 위한 지지체를 제공한다. 기판(14)은 일반적으로 강성이고, 수성 액체에서 불용성이다. 적합한 기판(14)의 예는 에폭시 실란, 유리, 변형 유리, 플라스틱, 나일론, 세라믹/세라믹 옥사이드, 실리카(실리콘 옥사이드(SiO2)), 융합 실리카, 실리카계 물질, 알루미늄 실리케이트, 실리콘, 변형 실리콘(예를 들어, 붕소 도핑된 p+ 실리콘), 실리콘 니트라이드(Si3N4), 탄탈럼 펜톡사이드(TaO5) 또는 다른 탄탈럼 옥사이드(들)(TaOx), 하프늄 옥사이드(HaO2), 또는 무기 유리 등을 포함한다. 기판(14)에 적합한 플라스틱의 일부 예는 아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 물질의 코폴리머, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 폴리테트라플루오로에틸렌(예컨대, Chemours로부터의 TEFLON®), 사이클릭 올레핀/사이클로-올레핀 폴리머(COP)(예컨대, Zeon으로부터의 ZEONOR®), 폴리이미드 등을 포함한다. 지지체는 또한 표면에 탄탈럼 옥사이드 또는 또 다른 세라믹 옥사이드의 코팅층이 있는 유리 또는 실리콘일 수 있다.
기판(14)의 형태는 웨이퍼, 패널, 직사각형 시트, 다이, 또는 임의의 다른 적합한 구성일 수 있다. 일례에서, 기판(14)은 약 2 mm 내지 약 300 mm 범위의 직경을 갖는 원형 웨이퍼 또는 패널일 수 있다. 보다 특정의 예로서, 기판(14)은 약 200 mm 내지 약 300 mm 범위의 직경을 갖는 웨이퍼이다. 또 다른 예에서, 기판(14)은 약 10 피트(약 3 미터) 이하의 이의 최대 직경을 갖는 직사각형 시트 또는 패널일 수 있다. 특정 예로서, 지지체(14)는 약 0.1 mm 내지 약 10 mm 범위의 폭을 갖는 다이이다. 예시적인 치수가 제공되었지만, 임의의 적합한 치수를 갖는 기판(14)이 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
도 1의 B에서, 전극(16)은 기판(12) 상에 위치한다. 전극(16)은 임의의 적합한 전극 물질, 예컨대, 금(Au), 은(Ag), 실버 클로라이드(AgCl), 백금(Pt), 티탄(Ti), 몰리브덴(Mo), 인듐 주석 옥사이드(ITO), 인듐 아연 옥사이드(IZO), 탄소(예를 들어, 그래핀, 탄소 나노튜브 시트), 전도성 폴리머 등을 포함할 수 있다. 일례에서, 전극(16)은 금이다. 전극(16)은 전극(16)을 기계적으로 그리고 화학적으로 안정하게 만드는 임의의 적합한 두께를 가질 수 있다. 일례로서, 두께는 200 nm 이상일 수 있다.
전극(16)은, 예를 들어, 접착제를 사용하여 기판(14)에 부착되는 예비성형된 시트일 수 있거나, 적합한 증착 기술을 이용하여 기판(12) 상에 증착될 수 있다.
도 1의 B에 나타나 있는 예에서, 패턴화된 물질(18)은 전극(16) 상에 위치한다. 선택적으로 증착되거나, 증착되고 패턴화되어 함몰부(18) 및 틈새 영역(22)을 형성시킬 수 있는 임의의 물질은 패턴화된 물질(18)에 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 패턴화된 물질(18)은 전도성 또는 비전도성일 수 있고, 프라이머(24)를 그라프팅하지 않도록 선택된다.
일례로서, 무기 옥사이드는 기상 증착, 에어로졸 프린팅, 또는 잉크젯 프린팅을 통해 전극(16)에 선택적으로 적용될 수 있다. 적합한 무기 옥사이드의 예는 탄탈럼 옥사이드, 알루미늄 옥사이드, 실리콘 옥사이드, 하프늄 옥사이드 등을 포함한다.
또 다른 예로서, 수지가 전극(16)에 적용된 후 패턴화될 수 있다. 적합한 증착 기술은 화학적 기상 증착, 딥 코팅, 덩크 코팅, 스핀 코팅, 스프레이 코팅, 퍼들 디스펜싱, 초음파 스프레이 코팅, 닥터 블레이드 코팅, 에어로졸 프린팅, 스크린 프린팅, 미세접촉 프린팅 등을 포함한다. 적합한 패턴화 기술은 포토리소그래피, 나노임프린트 리소그래피(NIL), 스탬핑 기술, 엠보싱 기술, 몰딩 기술, 마이크로에칭 기술, 프린팅 기술 등을 포함한다. 적합한 수지의 일부 예는 다면체 올리고머 실세스퀴옥산 수지(POSS)-기반 수지, 비-POSS 에폭시 수지, 폴리(에틸렌 글리콜) 수지, 폴리에테르 수지(예를 들어, 개환 에폭시), 아크릴 수지, 아크릴레이트 수지, 메타크릴레이트 수지, 비정질 플루오로폴리머 수지(예를 들어, Bellex로부터의 CYTOP®), 및 이들의 조합물을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "다면체 올리고머 실세스퀴옥산"(POSS)은 실리카(SiO2)와 실리콘(R2SiO) 사이의 혼성 중간체(예를 들어, RSiO1.5)인 화학적 조성물을 지칭한다. POSS의 일례는 그 전체가 참조로 포함되는 문헌[Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778]에 기재된 것일 수 있다. 일례에서, 조성물은 화학식 [RSiO3/2]n(여기서, R 기는 동일하거나 상이할 수 있음)을 갖는 유기규소 화합물이다. POSS에 대한 예시적인 R 기는 에폭시, 아자이드/아자이도, 티올, 폴리(에틸렌 글리콜), 노르보르넨, 테트라진, 아크릴레이트, 및/또는 메타크릴레이트, 또는 추가로, 예를 들어, 알킬, 아릴, 알콕시, 및/또는 할로알킬 기를 포함한다. 본원에 개시된 수지 조성물은 모노머 단위로서 하나 이상의 상이한 케이지 또는 코어 구조를 포함할 수 있다. 다면체 구조는 T8 구조, 예컨대,
Figure pct00001
이고,
Figure pct00002
로 표현될 수 있다. 이러한 모노머 단위는 전형적으로 작용기 R1 내지 R8의 8 개의 아암을 갖는다.
모노머 단위는
Figure pct00003
와 같이 T10으로 지칭되는, 10 개의 규소 원자 및 10 개의 R 기로 되어 있는 케이지 구조를 가질 수 있거나,
Figure pct00004
와 같이 T12로서 지칭되는, 12 개의 규소 원자 및 12 개의 R 기로 되어 있는 케이지 구조를 가질 수 있다. POSS-기반 물질은 대안적으로 T6, T14, 또는 T16 케이지 구조를 포함할 수 있다. 평균 케이지 함량은 합성 동안 조절되고/거나, 정제 방법에 의해 제어될 수 있고, 모노머 단위(들)의 케이지 크기 분포는 본원에 개시된 예에서 사용될 수 있다.
도 1의 B에 나타나 있는 바와 같이, 패턴화된 물질(18)은 이에 한정된 함몰부(20), 및 인접 함몰부(20)를 분리하는 틈새 영역(22)을 포함한다. 규칙적, 반복적 및 비규칙적 패턴을 포함하여 함몰부(20)의 다수 상이한 레이아웃이 고려될 수 있다. 일례로서, 함몰부(20)는 최밀 패킹 및 향상된 밀도를 위해 육각형 격자로 배치된다. 다른 레이아웃은, 예를 들어, 직선(즉, 직사각형) 레이아웃, 및 삼각형 레이아웃 등을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 행 및 열로 되어 있는 함몰부(20)의 x-y 형식일 수 있다. 일부 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 함몰부(20) 및/또는 틈새 영역(22)의 반복 배열일 수 있다. 추가의 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 함몰부(20) 및/또는 틈새 영역(22)의 무작위 배열일 수 있다. 패턴은 점, 패드, 웰, 기둥, 줄무늬, 소용돌이, 선, 삼각형, 직사각형, 원, 아크, 체크, 격자 무늬, 대각선, 화살표, 정사각형, 및/또는 교차-해치를 포함할 수 있다.
함몰부(20)의 레이아웃 또는 패턴은 규정된 면적에서 함몰부(20)의 밀도(즉, 함몰부(20)의 수)와 관련하여 특징화될 수 있다. 예를 들어, 함몰부(20)는 mm2 당 대략 200만의 밀도로 존재할 수 있다. 밀도는, 예를 들어, 약 100/mm2, 약 1,000/mm2, 약 100,000/mm2, 약 1,000,000/mm2, 약 2,000,000/mm2, 약 5,000,000/mm2, 약 10,000,000/mm2, 약 50,000,000/mm2, 또는 그 초과, 또는 그 미만을 포함하여 상이한 밀도로 조정될 수 있다. 추가로, 패턴화된 물질(18)에서 함몰부(20)의 밀도는 상기 범위로부터 선택된 더 낮은 값 중 하나와 더 높은 값 중 하나 사이에 있을 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예로서, 고밀도 어레이는 약 100 nm 미만으로 분리된 함몰부(20)를 갖는 것으로 특징화될 수 있고, 중간 밀도 어레이는 약 400 nm 내지 약 1 μm로 분리된 함몰부(20)를 갖는 것으로 특징화될 수 있고, 저밀도 어레이는 약 1 μm로 초과 분리된 함몰부(20)를 갖는 것으로 특징화될 수 있다. 예시적인 밀도가 제공되지만, 임의의 적합한 밀도가 이용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
함몰부(20)의 레이아웃 또는 패턴은 또한 또는 대안적으로 평균 피치의 측면에서, 즉, 함몰부(20)의 중앙에서 인접 함몰부(20)의 중앙까지의 간격(중앙-대-중앙 간격) 또는 어느 한 함몰부(20)의 에지에서 인접 함몰부(20)의 에지까지의 간격(에지-대-에지 간격)으로 특징화될 수 있다. 패턴은 평균 피치 주변의 변동 계수가 작도록 규칙적일 수 있거나, 패턴은 불규칙적일 수 있으며, 이 경우 변동 계수는 비교적 클 수 있다. 어느 경우든, 평균 피치는, 예를 들어, 약 50 nm, 약 0.1 μm, 약 0.5 μm, 약 1 μm, 약 5 μm, 약 10 μm, 약 100 μm, 또는 그 초과 또는 미만일 수 있다. 함몰부(20)의 특정 패턴에 대한 패턴 피치는 상기 범위로부터 선택된 더 낮은 값 중 하나와 더 높은 값 중 하나 사이에 있을 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 일례에서, 함몰부(20)는 약 1.5 μm의 피치(중앙-대-중앙 간격)를 갖는다. 예시적인 평균 피치 값이 제공되었지만, 다른 평균 피치 값이 이용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
각 함몰부(20)의 크기는 이의 부피, 개구 면적, 깊이, 및/또는 직경에 의해 특징화될 수 있다.
각 함몰부(20)는 액체를 가둘 수 있는 임의의 부피를 가질 수 있다. 최소 또는 최대 부피는, 예를 들어, 유동 셀(10)의 다운스트림 사용에 대해 예상되는 처리량(예를 들어, 다중화), 분해능, 분석물 조성, 또는 분석물 반응성을 수용하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 부피는 적어도 약 1×10-3 μm3, 약 1×10-2 μm3, 약 0.1 μm3, 약 1 μm3, 약 10 μm3, 약 100 μm3, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 부피는 최대 약 1×104 μm3, 약 1×103 μm3, 약 100 μm3, 약 10 μm3, 약 1 μm3, 약 0.1 μm3, 또는 그 미만일 수 있다.
각 함몰부 개구에 의해 점유된 영역은 부피에 대해 상기 기재된 것과 유사한 기준을 기초로 하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 각 함몰부 개구에 대한 면적은 적어도 약 1×10-3 μm2, 약 1×10-2 μm2, 약 0.1 μm2, 약 1 μm2, 약 10 μm2, 약 100 μm2, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 면적은 최대 약 1×103 μm2, 약 100 μm2, 약 10 μm2, 약 1 μm2, 약 0.1 μm2, 약 1×10-2 μm2, 또는 그 초과일 수 있다. 각 함몰부 개구에 의해 점유된 면적은 상기 명시된 값보다 크거나, 작거나, 그 사이일 수 있다.
각 함몰부(20)의 깊이는 적어도 약 0.1 μm, 적어도 약 0.5 μm, 적어도 약 1 μm, 적어도 약 10 μm, 적어도 약 100 μm, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 깊이는 최대 약 1×103 μm, 최대 약 100 μm, 최대 약 10 μm, 최대 약 1 μm, 최대 약 0.1 μm, 또는 그 미만일 수 있다. 일부 예에서, 깊이는 약 0.4 μm이다. 각 함몰부(20)의 깊이는 상기 명시된 값보다 크거나, 작거나, 그 사이일 수 있다.
일부 예에서, 각 함몰부(20)의 직경 또는 길이 및 폭은 적어도 약 50 nm, 약 0.1 μm, 약 0.5 μm, 약 1 μm, 약 10 μm, 약 100 μm, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 직경 또는 길이 및 폭은 최대 약 1×103 μm, 약 100 μm, 약 10 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 약 0.1 μm, 또는 그 미만(예를 들어, 약 50 nm)일 수 있다. 직경 또는 길이 및 폭은 또한 깊이에 따라 다를 수 있다(예를 들어, 도 4의 A 내지 도 4의 C 및 도 6의 A 내지 도 6의 C에 나타나 있는 바와 같은). 각 함몰부(20)의 직경 또는 길이 및 폭은 상기 명시된 값보다 크거나, 작거나, 그 사이일 수 있다.
도 1의 B에 나타나 있는 예에서, 함몰부(20)에서 노출된 전극(16)의 표면(S16)은 프라이머(24)가 틈새 영역(22)이 아니라 표면(S16)에 부착될 수 있도록 작용성화된다. 전극 표면(S16)의 작용성화는 전극 및 이에 부착된 프라이머(24)의 물질에 좌우될 것이다.
일부 예에서, 전극 물질은 프라이머(24)가 비변형 전극 물질에 직접적으로 부착될 수 있는 말단 작용기를 포함하기 때문에 본질적으로 작용성화될 수 있다. 예를 들어, 티올 말단 프라이머는 금 전극 표면(S16)에 화학적으로 결합할 수 있다.
다른 예에서, 전극 표면(S16)은 프라이머(24)에 결합할 수 있는 작용기(즉, 링킹 분자)를 혼입하도록 변형될 수 있다. 작용기는 어느 한 단부에서 전극 표면(S16)에, 그리고 다른 단부에서 프라이머(24)에 화학적으로 부착할 수 있다. 예로서, 티올 또는 티올레이트 링커 또는 아민 링커는 금 전극에 부착될 수 있고, 실란 링커(예를 들어, 아자이도 실란)은 ITO 전극에 부착될 수 있다. 일부 예가 제공되었지만, 다른 화학적 작용기가 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
직접적이든 간접적이든(예를 들어, 링커를 통해), 전극 표면(S16)에 대한 프라이머(24)의 부착은 프라이머(24), 사용되는 임의의 링커, 및 전극 물질에 좌우하여 공유 결합, 배위 결합 또는 또 다른 화학적 또는 물리적 결합(예컨대, pi-pi 적층)을 통해 이루어질 수 있습니다.
표면(S16)이 작용기로 변형되거나 본질적으로 작용성화되고 틈새 영역(22)이 프라이머-반응성 작용기를 포함하지 않기 때문에, 프라이머(24)는 표면(S16)에 부착될 것이고 틈새 영역(22)에 부착되지 않을 것이다.
전극 작용성화는 패턴화된 물질(18)가 이에 적용되기 전 또는 그 후에 수행될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
다른 예에서, 전극 표면(S16)은 도 1의 C를 참조로 본원에 기재된 바와 같이 폴리머 층으로 작용성화될 수 있다.
도 1의 B에 나타나 있는 바와 같이, 프라이머(들)(24)는 작용성화된 전극 표면(S16)에 부착된다. 프라이머(24)는 표면(S16)에, 직접적으로 전극 물질에 또는 이에 부착된 작용기에 또는 이에 부착된 폴리머 층에 부착될 수 있는 작용기를 포함하는 임의의 순방향 증폭 프라이머 또는 역방향 증폭 프라이머일 수 있다. 적합한 작용기 말단 프라이머의 예는 알킨 말단 프라이머, 테트라진 말단 프라이머, 아자이도 말단 프라이머, 아미노 말단 프라이머, 에폭시 또는 글리시딜 말단 프라이머, 티오포스페이트 말단 프라이머, 티올 말단 프라이머, 알데하이드 말단 프라이머, 하이드라진 말단 프라이머, 및 트리아졸린디온 말단 프라이머를 포함한다. 프라이머들의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 적합한 프라이머의 특정 예는 HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NEXTSEQ™, NEXTSEQDX™, NOVASEQ™, GENOME ANALYZER™, 및 다른 기기 플랫폼에서 시퀀싱을 위해 Illumina Inc.에 의해 시판되는 상업적 유동 셀의 표면 상에서 사용되는 P5 및/또는 P7 프라이머를 포함한다.
일례에서, 프라이머(24)는 그라프팅 공정, 예컨대, 유동형 증착(예를 들어, 유동 셀(10)이 이에 결합되는 뚜껑을 구비한 경우), 덩크 코팅, 스프레이 코팅, 퍼들 디스펜싱을 이용하여, 또는 프라이머(들)(24)을 부착할 또 다른 적합한 방법에 의해 부착될 수 있다. 각각의 이러한 예시적인 기술은 프라이머 용액 또는 혼합물을 이용할 수 있으며, 이들은 프라이머(들), 물, 완충액(예를 들어, 염 용액), 및 촉매를 포함할 수 있다.
이제 도 1의 C를 참조하면, 유동 셀(10)은 기판(14) 및 기판(14) 상에 위치한 패턴화된 전극(26)을 포함한다. 이러한 예에서, 패턴화된 전극(26)은 틈새 영역(22)에 의해 분리된 함몰부(18)를 한정한다. 이러한 예에서, 기판(14)의 작용성화된 표면(S14)은 각각의 함몰부(18)에서 노출되고, 프라이머(24)는 작용성화된 표면(S14)에 그라프팅된다.
도 1의 C에서 기판(14)은 유동 셀(10)의 다른 구성요소를 위한 지지체를 제공한다. 기판(14)은 본원에 기재된 임의의 예일 수 있다.
도 1의 C에서, 패턴화된 전극(26)은 기판(12) 상에 위치한다. 패턴화된 전극(26)은 전극(16)에 대하여 언급된 임의의 전극 물질일 수 있다. 이러한 예에서, 패턴화된 전극(26)은, 예를 들어, 접착제를 사용하여 기판(14)에 부착되는 예비성형된 시트일 수 있거나, 적합한 증착 기술을 이용하여 요망되는 패턴으로 기판(14) 상에 증착될 수 있다.
도 1의 C에 나타나 있는 예에서, 전극(26)은 이에 한정된 함몰부(20) 및 인접 함몰부(20)를 분리하는 틈새 영역(22)을 포함한다. 도 1의 B에서 함몰부(20)에 대하여 본원에 기재된 임의의 패턴, 레이아웃, 및 치수는 도 1의 C에 나타나 있는 함몰부(20)에 사용될 수 있다.
또한, 도 1의 C에 나타나 있는 예에서, 함몰부(20)에서 노출된 기판(14)의 표면(S14)은 프라이머(24)가 패턴화된 전극(26)의 틈새 영역(22)이 아니라 표면(S14)에 부착될 수 있도록 작용성화된다.
일부 예에서, 기판 표면(S14)을 작용성화하는 것은 함몰부(20)에서 노출된 표면(S14)을 실란화하고, 실란화된 표면 상에 폴리머 층을 형성시키는 것을 포함한다. 실란화는 임의의 실란 또는 실란 유도체를 사용하여 달성될 수 있다. 실란 또는 실란 유도체의 예는 노르보르넨 실란, 노르보르넨 유도체(예를 들어, 5-바이사이클로[2.2.1]헵트-2-에닐)에틸]트리메톡시실란), 사이클로옥틴, 사이클로옥틴 유도체, 또는 또 다른 적합한 실란을 포함한다. 실란 또는 실란 유도체를 부착하기 위해 이용되는 방법은 사용되는 실란 또는 실란 유도체에 좌우하여 다를 수 있다. 적합한 실란화 방법의 예는 기상 증착(예를 들어, YES 방법), 스핀 코팅, 또는 다른 증착 방법을 포함한다.
폴리머(미도시)는 이후 실란화된 표면에 적용될 수 있다. 폴리머는 액체 및 기체에 투과성인 반강성 폴리머 물질일 수 있다. 폴리머의 예는 아크릴아미드 코폴리머, 예컨대, 폴리(N-(5-아자이도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드, PAZAM을 포함한다. PAZAM 및 일부 다른 형태의 아크릴아미드 코폴리머는 하기 구조식 (I)으로 표현된다:
Figure pct00005
상기 식에서,
RA는 아자이도, 임의로 치환된 아미노, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 하이드라존, 임의로 치환된 하이드라진, 카르복실, 하이드록시, 임의로 치환된 테트라졸, 임의로 치환된 테트라진, 니트릴 옥사이드, 니트론, 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되고;
RB는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
RC, RD, 및 RE는 각각 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 -(CH2)p-는 임의로 치환될 수 있고;
p는 1 내지 50 범위의 정수이고;
n은 1 내지 50,000 범위의 정수이고;
m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다.
당업자는 구조식 (I)에서 반복적인 "n" 및 "m" 특징의 배열이 나타나고, 모노머 서브유닛은 폴리머 구조에서 임의의 순서로 존재할 수 있다(예를 들어, 무작위, 블록, 패턴화, 또는 이들의 조합)는 것을 알 것이다.
PAZAM의 분자량은 약 10 kDa 내지 약 1500 kDa의 범위일 수 있거나, 특정 예에서 약 312 kDa일 수 있다. 일부 예에서, PAZAM은 선형 폴리머이다. 일부 다른 예에서, PAZAM은 약간 가교된 폴리머이다.
다른 예에서, 폴리머는 구조식 (I)의 변형일 수 있다. 일례에서, 아크릴아미드 단위는 N,N-디메틸아크릴아미드(
Figure pct00006
)로 치환될 수 있다. 이러한 예에서, 구조식 (I)에서 아크릴아미드 단위는
Figure pct00007
로 치환될 수 있고, 여기서 RD, RE, 및 RF는 각각 H 또는 C1-C6 알킬이고, RG 및 RH는 각각 C1-C6 알킬이다(아크릴아미드로의 경우에서와 같이 H 대신). 이러한 예에서, q는 1 내지 100,000 범위의 정수일 수 있다. 또 다른 예에서, 아크릴아미드 단위 외에 N,N-디메틸아크릴아미드가 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 구조식 (I)은 반복되는 "n" 및 "m" 특징 외에
Figure pct00008
을 포함할 수 있으며, 여기서 RD, RE, 및 RF는 각각 H 또는 C1-C6 알킬이고, RG 및 RH는 각각 C1-C6 알킬이다. 이러한 예에서, q는 1 내지 100,000 범위의 정수일 수 있다.
활성화된 표면(S14)과 상호작용하도록 작용성화되고 후속적으로 프라이머(들)(24)에 적용되는 한, 폴리머를 형성시키기 위해 다른 분자가 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 적합한 폴리머의 다른 예는 콜로이드 구조를 갖는 것들, 예컨대, 아가로스; 또는 폴리머 메쉬 구조, 예컨대, 젤라틴; 또는 가교된 폴리머 구조, 예컨대, 폴리아크릴아미드 폴리머 및 코폴리머, 실란 비함유 아크릴아미드(SFA), 또는 SFA의 아자이도 분해된 버전을 포함한다. 적합한 폴리아크릴아미드 폴리머의 예는 아크릴아미드 및 아크릴산 또는 비닐 기를 함유하는 아크릴산으로부터, 또는 [2+2] 광-첨가환화 반응을 형성시키는 모노머로부터 합성될 수 있다. 적합한 폴리머(26)의 추가의 다른 예는 아크릴아미드와 아크릴레이트의 혼합된 코폴리머를 포함한다.
폴리머(예를 들어, PAZAM)는 스핀 코팅, 또는 디핑 또는 딥 코팅, 또는 양압 또는 음압 하에서의 작용성화된 분자의 유동, 또는 또 다른 적합한 기술을 이용하여 증착될 수 있다. 폴리머는 혼합물로 존재할 수 있다. 일례에서, 혼합물은 물 중 또는 에탄올과 물 혼합물 중 PAZAM을 포함한다.
코팅된 후, 폴리머를 포함하는 혼합물은 또한 패턴화된 전극(26)의 틈새 영역(22)에 걸쳐 그리고 함몰부(20)에 폴리머를 형성시키기 위해 경화 공정에 노출될 수 있다. 일례에서, 경화는 실온(예를 들어, 약 25℃) 내지 약 95℃ 범위의 온도에서 약 1 밀리초 내지 약 수일 범위의 시간 동안 이루어질 수 있다. 또 다른 예에서, 시간은 10 초 내지 적어도 24 시간의 범위일 수 있다. 추가의 또 다른 예에서, 시간은 약 5 분 내지 약 2 시간의 범위일 수 있다.
실란화된 표면(S14)에 대한 폴리머(20)의 부착은 공유 결합을 통해 이루어질 수 있다. 공유 연결은 다양한 사용 동안 최종적으로 형성된 유동 셀(10)의 수명 전체에 걸쳐 함몰부(20)에서 적어도 프라이머(들)(24)를 유지시키는 데 도움이 된다. 하기는 활성화된(예를 들어, 실란화된) 표면과 폴리머 사이에 일어날 수 있는 반응의 일부 예이다.
실란 또는 실란 유도체가 불포화 모이어티로서 노르보르넨 또는 노르보르넨 유도체를 포함하는 경우, 노르보르넨 또는 노르보르넨 유도체는 i) PAZAM의 아자이드/아자이도 기와 1,3-양극성 첨가환화 반응을 겪거나; ii) PAZAM에 부착된 테트라진 기와 커플링 반응을 겪거나; PAZAM에 부착된 하이드라존 기와 첨가환화 반응을 겪거나; PAZAM에 부착된 테트라졸 기와 광-클릭 반응을 겪거나; PAZAM에 부착된 니트릴 옥사이드기와 첨가환화를 겪을 수 있다.
실란 또는 실란 유도체가 불포화 모이어티로서 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴 유도체를 포함하는 경우, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴 유도체는 i) PAZAM의 아자이드/아자이도와 변형-촉진된 아자이드-알킨 1,3-첨가환화 (SPAAC) 반응을 겪거나, ii) PAZAM에 부착된 니트릴 옥사이드 기와 변형-촉진된 알킨-니트릴 옥사이드 첨가환화 반응을 겪을 수 있다.
실란 또는 실란 유도체가 불포화 모이어티로서 바이사이클로노닌을 포함하는 경우, 바이사이클로노닌은 바이사이클릭 고리 시스템에서의 변형으로 인해 PAZAM에 부착된 아자이드 또는 니트릴 옥사이드와 유사한 SPAAC 알킨 첨가환화를 겪을 수 있다.
다른 예에서, 실란화보다는 플라즈마 애싱이 함몰부(20)에서 기판(14)의 노출된 표면(S14)을 작용성화시키는 데 사용될 수 있다. 플라즈마 애싱 후, 폴리머를 함유하는 혼합물은 플라즈마 애싱된 표면 상에 직접적으로 스핀 코팅된(또는 달리 증착된) 후 경화되어 폴리머를 형성시킬 수 있다. 이러한 예에서, 플라즈마 애싱은 틈새 영역(22) 및 함몰부(20)에서 기판(14)의 노출된 표면(S14)에 폴리머를 접착시킬 수 있는 표면-활성화제(들)(예를 들어, -OH 기)를 생성시킬 수 있다. 이러한 예에서, 폴리머는 플라즈마 애싱에 의해 발생된 표면 기와 반응하도록 선택된다.
실란화 또는 플라즈마 애싱이 이용되는 지에 상관없이, 패턴화된 전극(26)의 틈새 영역(22)으로부터 폴리머를 제거하기 위해 연마가 이후 수행될 수 있다. 일부 예에서, 연마는 틈새 영역(22)에 인접한 실란 또는 실란 유도체를 제거할 수 있거나 또한 제거하지 않을 수 있다. 이러한 실란화된 부분이 완전히 제거되지 않는 경우, 아래의 패턴화된 전극(26)이 노출된다는 것이 이해되어야 한다.
연마 공정은 이러한 영역들에서 아래의 패턴화된 전극(26)에 유해하게 영향을 주지 않으면서 틈새 영역(22)으로부터 얇은 폴리머, 및 일부 예에서, 실란 또는 실란 유도체의 적어도 일부를 제거할 수 있는 온화한 화학적 슬러리(예를 들어, 마모제, 완충제, 킬레이팅제, 계면활성제, 및/또는 분산제 포함)로 수행될 수 있다. 대안적으로, 연마는 마모제 입자를 포함하지 않는 용액으로 수행될 수 있다.
화학적 슬러리는 틈새 영역(22)의 표면을 연마하기 위해 화학적 기계적 연마 시스템에서 사용될 수 있다. 연마 헤드(들)/패드(들) 또는 다른 연마 툴(들)은 함몰부(20)에 폴리머를 남기면서 틈새 영역(22)으로부터 폴리머를 연마할 수 있다. 일례로서, 연마 헤드는 Strasbaugh ViPRR II 연마 헤드일 수 있다.
세정 및 건조 공정이 연마 후에 수행될 수 있다. 세정 공정은 워터 배쓰 및 소니케이션을 이용할 수 있다. 워터 배쓰는 약 22℃ 내지 약 30℃ 범위의 비교적 낮은 온도에서 유지될 수 있다. 건조 공정은 또 다른 적합한 기술을 통해 스핀 건조, 또는 건조를 수반할 수 있다.
다른 화학물질 및/또는 공정이 또한 프라이머(24) 부착을 위한 제조에서 기판 표면(S14)을 작용성화시키는 데 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
도 1의 C에 나타나 있는 바와 같이, 프라이머(들)(24)는 작용성화된 기판 표면(S14)에 부착된다. 본원에 개시된 임의의 프라이머(24) 및 프라이머(24)를 그라프팅시키는 방법은, 프라이머(들)(24)가 기판 표면(S14)에서 작용기(예를 들어, 폴리머의 작용기)에 부착될 수 있는 한, 도 1의 C에 나타나 있는 예에서 사용될 수 있다.
유동 셀(10)은 도 1의 B에 기재된 구조 또는 도 1의 C에 기재된 구조에 따라 함몰부(20)의 어레이를 포함한다. 도 1의 B에 나타나 있는 구조에 상응하는 어레이(52)는 도 3에 도시되어 있고, 도 1의 C에 나타나 있는 구조에 상응하는 어레이(52')는 도 5에 도시되어 있다. 어레이(52 또는 52')를 포함하는 유동 셀(10)은 전기화학발광을 통해 광학적으로 검출되는 형광 신호를 발생시키는 시퀀싱 작업흐름에서 사용될 수 있다. 이러한 작업흐름들의 예는 도 4의 A 내지 도 4의 C 및 도 6의 A 내지 도 6의 C를 참조로 기재될 것이다.
시퀀싱 전에, 시퀀싱될 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40)은 프라이머(24)를 사용하여 유동 셀 표면 상에 형성될 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드 사슬 형성의 개시 시, 라이브러리 주형은 임의의 핵산 샘플(예를 들어, DNA 샘플 또는 RNA 샘플)로부터 제조될 수 있다. 핵산 샘플은 단일 가닥의 유사한 크기(예를 들어, < 1000 bp) DNA 또는 RNA로 단편화될 수 있다. 제조 동안, 어댑터가 이러한 단편들의 말단에 부가될 수 있다. 감소된 사이클 증폭을 통해, 상이한 모티프가 함몰부(20)에서 프라이머(24)에 상보적인 시퀀싱 결합 부위, 인덱스, 및 영역과 같은 어댑터에 도입될 수 있다. 최종 라이브러리 주형은 DNA 또는 RNA 단편 및 양 말단의 어댑터를 포함한다. 일부 예에서, 단일 핵산 샘플로부터의 단편은 이에 부가된 동일한 어댑터를 갖는다.
복수의 라이브러리 주형이 유동 셀(10)에 도입될 수 있다. 유동 셀(10)은 함몰부(20)의 어레이(52 또는 52')를 포함하기 때문에, 다중 라이브러리 주형이, 예를 들어, 각각의 함몰부(20)에서 전극 표면(S16) 또는 기판 표면(S14) 상에 고정된 두 유형의 프라이머(24) 중 하나에 혼성화된다.
클러스터 생성이 이후 수행될 수 있다. 클러스터 생성의 일례에서, 라이브러리 주형은 고-충실도 DNA 폴리머라제를 사용하여 3' 연장까지 혼성화된 프라이머(24)로부터 복제된다. 원래의 라이브러리 주형은 변성되어 함몰부(20)에서 고정된 사본을 남긴다. 등온 브릿지 증폭 또는 일부 다른 형태의 증폭이 고정된 사본을 증폭시키는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 복사된 주형은 인접한 상보적 프라이머(24)에 혼성화하기 위해 반복되며, 폴리머라제는 복사된 주형을 복사하여 이중 가닥 브릿지를 형성시키는데, 이는 변성되어 두 개의 단일 가닥된 가닥을 형성시킨다. 이러한 두 개의 가닥은 인접한 상보적 프라이머(24)에 반복되고 혼성화되고, 다시 연장되어 두 개의 새로운 이중 가닥 루프를 형성시킨다. 공정은 등온 변성 및 증폭의 사이클에 의해 각 주형 사본에서 반복되어 조밀한 클론 클러스터를 형성시킨다. 이중 가닥 브릿지의 각 클러스터는 변성된다. 일례에서, 역방향 가닥은 특정 염기 절단에 의해 제거되어 순방향 주형 폴리뉴클레오티드 가닥을 남긴다. 도 4의 A 내지 도 4의 C 및 도 6의 A 내지 도 6의 C에서 함몰부(20)에 단일 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40)이 나타나 있지만, 클러스터링은 각 함몰부(20)에서 여러 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40)의 형성을 야기한다는 것이 이해되어야 한다. 클러스터링의 이러한 예는 브릿지 증폭이고, 수행될 수 있는 증폭의 일례이다. 배제 증폭(Examp) 작업흐름(Illumina Inc.)과 같은 다른 증폭 기술이 이용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
시퀀싱 동안, 형광 신호는 전기화학발광을 이용하여 발생된다. 이와 같이, 시퀀싱 동안 유동 셀(10)에 도입된 뉴클레오티드의 적어도 일부가 전기화학발광 표지를 포함하는 표지된 뉴클레오티드이다. 표지된 뉴클레오티드(28A, 28B, 28C)의 예는 도 2에 나타나 있다. 각각의 표지된 뉴클레오티드(28A, 28B, 28C)는 3' OH 차단기(32A, 32B, 32C)를 갖는 뉴클레오티드(30), 뉴클레오티드(30)의 염기 또는 당에 부착된 링킹 분자(34), 및 링킹 분자(34)에 부착된 전기화학발광 표지(36)를 포함한다.
뉴클레오티드(30)는 질소 함유 헤테로사이클릭 염기, 당, 및 하나 이상의 포스페이트 기를 포함한다. 뉴클레오티드(30)는 핵산 서열의 모노머 단위이다. RNA에서 당은 리보스이고, DNA에서 당은 데옥시리보스, 즉, 리보스에서 2' 위치에 존재하는 하이드록실 기가 결여된 당이다. 질소 함유 헤테로사이클릭 염기(즉, 뉴클레오베이스)는 푸린 염기 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 푸린 염기는 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 이의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 피리미딘 염기는 시토신(C), 티민(T), 및 우라실(U), 및 이의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 리보스 또는 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 푸린의 N-9에 결합된다. 뉴클레오티드(30)는 모노포스페이트, 또는 여러 포스페이트 기(예를 들어, 트리-포스페이트(즉, 감마 포스페이트), 테트라-포스페이트, 펜타-포스페이트, 헥사-포스페이트 등)를 포함하는 폴리포스페이트 형태일 수 있다. 핵산 유사체는 변형된 임의의 포스페이트 골격, 당, 또는 뉴클레오베이스를 가질 수 있다. 핵산 유사체의 예는, 예를 들어, 보편적인 염기 또는 포스페이트-당 골격 유사체, 예컨대, 펩티드 핵산(PNA)을 포함한다. 도 2에서, 뉴클레오티드(30)의 염기는 시토신이고, 당은 데옥시리보스이고, 포스페이트는 트리- 또는 감마-포스페이트이다.
본원에 개시된 예에서, 뉴클레오티드(30)는 이에 부착된 3' OH 차단기(32A, 32B, 32C)를 갖는다. 3' OH 차단기(32A, 32B, 32C)는 뉴클레오티드(30)에서 당 분자의 산소 원자에 링킹될 수 있다. 3' OH 차단기(32A, 32B, 32C)는 각 시퀀싱 사이클에서 오로지 단일-염기 도입이 발생되게 하는 가역적 종결자일 수 있다(도 4의 A 내지 도 4의 C 및 도 6의 A 내지 도 6의 C를 참조로 추가로 논의될 바와 같음). 가역적 종결자는 추가 염기가 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40)에 상보적인 신생 가닥으로 혼입되는 것을 중단시킨다. 이는 단일 혼입 염기의 검출 및 식별을 가능하게 한다. 3' OH 차단기(32A, 32B, 32C)는 각 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40)에서 추가 시퀀싱 사이클이 일어날 수 있도록 후속적으로 제거될 수 있다. 3'-ONH2 가역적 종결자(32A에 나타나 있음), 3'-O-알릴 가역적 종결자(즉, -CH=CHCH2, 32B에 나타나 있음), 및 3'-O-아자이도메틸 가역적 종결자(즉, -CH2N3, 32C에 나타나 있음)를 포함하여 여러 3' OH 차단기(32A, 32B, 32C)의 예가 도 2에 나타나 있다. 다른 적합한 가역적 종결자는 o-니트로벤질 에테르, 알킬 o-니트로벤질 카르보네이트, 에스테르 모이어티, 다른 알릴-모이어티, 아세탈(예를 들어, 3차-부톡시-에톡시), MOM(-CH2OCH3) 모이어티, 2,4-디니트로벤젠 설페닐, 테트라하이드로푸라닐 에테르, 3' 포스페이트, 에테르, -F, -H2, -OCH3, -N3, -HCOCH3, 및 2-니트로벤젠 카르보네이트를 포함한다.
링킹 분자(34)는 뉴클레오티드(30)의 푸린 염기 또는 피리미딘 염기에 부착된다. 일부 예에서, 링킹 분자(34)는 도 2에서 화살표로 확인되는 절단 부위를 포함한다. 적합한 링킹 분자(34)의 일부 예가 도 2에 나타나 있지만, 뉴클레오티드의 염기 또는 당에 전기화학발광 표지(36)를 부착할 수 있는 임의의 적합한 절단성 링커가 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 다른 예에서, 링킹 분자(34)는 절단성이 아니다. 이러한 유형의 링킹 분자(34)는 1-채널 검출이 이용될 때 바람직할 수 있으며, ECL 표지(36)의 절단 화학이 혼입된 뉴클레오티드 염기를 구별하기 위해 이용된다.
전기화학발광(ECL) 표지(36)는 링킹 분자(34)에 부착된다. 링킹 분자(34)에 부착할 수 있고 유체(예를 들어, 수용액)에서 전기화학발광을 나타낼 수 있는 임의의 화합물이 ECl 표지(36)로서 사용될 수 있다.
일부 ECL 표지(36)는 자기-소멸을 겪고, 이에 의해 표지(36)는 양에서 음으로 바뀌는 전위에 반응하여 직접적으로 여기 상태를 생성시킨다. 이러한 유형의 표지의 일례는 클로르프로마진이다. 이러한 유형의 표지(36)는 ECL 방출을 야기하는 공-반응물을 필요로 하지 않는다.
다른 ECL 표지(36)는 각각 산화 또는 환원에 의해 활성화되는 지의 여부에 좌우하여 애노드성 ECL 화합물 또는 캐소드성 ECL 화합물로서 분류될 수 있다.
애노드성 ECL 태깅된 뉴클레오티드는 인가된 양전위 하에 산화되는데, 이는 라디칼 양이온을 생성시키고, 라디칼 양이온은 이후 공반응물(이러한 예에서, 환원제)과 전자 전달 반응을 거쳐 방출성인 중성 여기 상태를 형성시킬 수 있다. 애노드성 ECL 표지(36)의 예는 트리스(2,2'-바이피리딘)루테늄(II), 2-티안트렌카르복실산, 소듐 9,10-디페닐안트라센-2-설포네이트(DPAS)를 포함하고, 이들의 구조는 각각 하기에 나타나 있다:
Figure pct00009
애노드성 ECL 태그에 적합한 환원제 공반응물은 지방족 아민, 예컨대, 트리알킬아민(예를 들어, 트리-n-프로필아민), 및 옥살레이트를 포함한다.
캐소드성 ECL 태깅된 뉴클레오티드는 인가된 음전위 하에 환원되는데, 이는 라디칼 음이온을 생성시키고, 라디칼 음이온은 이후 공반응물(이러한 예에서, 산화제)과 전자 전달 반응을 거쳐 방출성인 중성 여기 상태를 형성시킬 수 있다. 캐소드성 ECL 표지(36)의 예는 3,4,9,10-페릴렌테트라카르복실산 디안하이드라이드 및 메조-테트라(4-설폰아토페닐)포르피린을 포함하고, 이들의 구조는 각각 하기에 나타나 있다:
Figure pct00010
캐소드성 ECL 태그에 적합한 공반응물은 퍼옥시디설페이트(S2O8 2-)(예를 들어, 포타슘 퍼옥시디설페이트)를 포함한다. 소듐 9,10-디페닐안트라센-2-설포네이트(DPAS)(애노드성 ECL 표지로서 상기에 나타나 있음)는 또한 적절한 음전위가 공반응물로서 포타슘 퍼옥시디설페이트로 인가될 때 캐소드성 ECL 표지(36)로서 기능할 수 있다.
여러 예시적인 ECL 표지(36) 및 공반응물이 제공되었지만, 다른 ECL 표지(36) 및 공반응물이 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
표지된 뉴클레오티드(28A, 28B, 28C)를 이용한 시퀀싱 및 광학적 검출을 위한 방법이 이제 도 4의 A 내지 도 4의 C 및 도 6의 A 내지 도 6의 C를 참조로 기재될 것이다. 도 4의 A 내지 도 4의 C는 도 1의 B의 유동 셀 구조 및 도 3의 어레이(52)를 사용하는 방법을 도시한 것이고, 도 6의 A 내지 도 6의 C의 어레이(52)는 도 1의 C의 유동 셀 구조 및 도 5의 어레이(52')를 사용하는 방법을 도시한 것이다.
시퀀싱 사이클 전, 주형 폴리뉴클레오티드 사슬/가닥(40) 및 임의의 유동 셀-결합 프라이머(24)(주형 폴리뉴클레오티드 사슬/가닥(40)에 부착되지 않음)의 3'-말단은 시퀀싱 반응의 간섭을 방지하고, 특히, 요망되지 않는 프라이밍을 방지하기 위해 차단될 수 있다.
도 4의 A 및 도 6의 A에 나타나 있는 바와 같이, 시퀀싱 프라이머(53)는 유동 셀(10)에 도입될 수 있고, 여기서 이는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40)의 어댑터에서 상보적 서열로 혼성화될 것이다. 이는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40)로 하여금 시퀀싱 준비가 되게 한다.
시퀀싱 방법은 함몰부(20)에 부착된 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40)을 포함하는 함몰부(20)를 부분적으로 한정하는 전극(16 또는 26)을 포함하는 유동 셀(10)에 폴리머라제(42) 및 뉴클레오티드(예를 들어, 표지된 뉴클레오티드(28)를 포함하는 유체(예를 들어, 수용액)를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드의 적어도 일부는 본원에 기재된 바와 같은 표지된 뉴클레오티드(28)이다. 임의의 높거나 낮은 지속성의 폴리머라제(42)가 사용될 수 있다. 일부 예는 Phi29, 바실러스 스테아로써모필러스(Bst), 및 Klenow 단편(KF)을 포함하지만, 다른 것들이 사용될 수 있다. 폴리머라제(들)(42) 및 표지된 뉴클레오티드(들)(28) 외에, 유체가 또한 물, 완충액, 비-표지된 뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다. 예시적인 완충액은 Tris 완충액, 염류-소듐 시트레이트(SSC) 완충액, 암모늄 설페이트 완충액, 포스페이트 완충액 등을 포함한다. 일부 예에서, 완충액은 또 다른 염 양이온, 예컨대, 나트륨, 마그네슘, 망간 등일 수 있다.
시퀀싱 프라이머(53')를 연장하고 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40)에 상보적인 신생 가닥으로 뉴클레오티드 중 하나가 각 폴리머라제(42)에 의해 혼입된다. 다시 말해서, 유동 셀(10)에 걸친 각 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40)에서, 각 폴리머라제(42)는 용액 중 뉴클레오티드(표지 또는 표지되지 않음) 중 하나에 의해 혼성화된 시퀀싱 프라이머(53)를 연장한다. 용액 중 뉴클레오티드는 단일의 별개 분자로 존재하고, 이에 따라 자연 경쟁이 혼입 편향을 최소화한다. 도 4의 B 및 도 6의 B에서, 혼입된 뉴클레오티드는 ECL 표지된 뉴클레오티드(28)이다.
본원에 개시된 예에서, 표지된 뉴클레오티드(28)와 임의의 비-표지된 뉴클레오티드 둘 모두는 가역적 종결자를 포함한다. 이와 같이, 표지된 뉴클레오티드(28) 또는 비-표지된 뉴클레오티드의 신생 가닥으로의 혼입은 중합을 위한 종결자로서 작용한다. 이는 전기화학적 신호 발생 및 검출이 일어날 수 있게 한다.
혼입 후, 임의의 비-혼입된 뉴클레오티드를 포함하는 유체는 유동 셀(10)로부터 제거될 수 있다. 이는 세척액(예를 들어, 물)을 사용하여 달성될 수 있다.
임의의 비-혼입된 뉴클레오티드의 혼입 및 제거 후, 방법은 전극(16)(도 4의 B 내지 도 4의 C) 또는 패턴화된 전극(26)(도 6의 B 내지 도 6의 C)에 전위를 인가하고, 인가된 전위에 반응하여 광학적 방출(54)를 검출(도 4의 C 및 도 6의 C)하는 것을 포함한다. 전극(16)에 또는 패턴화된 전극(26)에 인가된 전위는 신생 가닥에 혼입된 이의 염기를 갖는 임의의 표지된 뉴클레오티드(28)의 ECL 반응을 유도하기에 충분하다. 일부 예에서, 일련의 상이한 전위가 상이한 ECL 표지(36)의 ECL 반응을 유도하기 위해 순차적으로 인가될 수 있다.
일부 예에서, 전위는 양에서 음으로 바뀌는데, 이는 ECL 표지(36)의 여기 상태를 직접적으로 발생시켜 광학적 방출(54)을 일으킨다.
다른 예에서, 공반응물은 폴리머라제(42) 및 뉴클레오티드가 있는 유체에 도입된다. 이러한 예들에서, 인가된 전위는 표지(36) 및 공반응물을 수반하는 레독스 반응 경로를 개시한다. 일례로서, 인가된 전위는 라이칼 이온을 발생시키는 ECL 표지(36)의 전기화학적 산화 또는 환원을 개시할 수 있는데, 이는 이후 공반응물에 의해 환원되거나 산화되어 여기 상태를 형성시킨다. 여기 상태는 광학적 방출(54)을 일으킨다.
추가의 다른 예에서, 레독스 셔틀은 공반응물과 함께 첨가된다. 레독스 셔틀은 유체를 통해 활성 종으로 또는 이로부터 전하를 이동시킬 수 있다. 레독스 셔틀은 전극 표면(S16) 또는 패턴화된 전극(26)에 의해 한정된 함몰부 벽으로 확산되고, 산화되거나 환원될 수 있다. 산화되거나 환원된 레독스 셔틀은 이후 ECL 표지(36)로 확산되거나 이와 반응하여 산화되거나 환원된 ECL 표지를 형성시킬 수 있다. 산화되거나 환원된 ECL 표지는 이후 공반응물과 반응하여 방출 상태를 형성시킬 필요가 있을 것이다. 레독스 셔틀은 표지(36)가 전극(16 또는 26)과 직접적인 물리적 접촉이 없을 때 ECL 표지(36)가 레독스 이벤트를 거치게 할 수 있다.
도 4의 C 및 도 6의 C에 나타나 있는 예에서, 광학적 방출(54)은 방출색을 캡쳐하기 위해 카메라를 이용하여 영상화된다.
탈차단제가 이후 유동 셀(10)에 도입될 수 있다. 탈차단제는 i) 혼입되는 표지된 뉴클레오티드(28)로부터 임의의 절단성 링킹 분자(34)를 절단하고(ECL 표지(36)를 또한 제거함), ii) 혼입되는 표지된 뉴클레오티드(28)로부터 3' OH 차단기(32A, 32B, 32C)(도 2 참조)를 제거하는 것이 가능할 수 있다. 비-표지된 뉴클레오티드(이에 부착된 ECL 표지(36)를 포함하지 않음)가 신생 가닥에 혼입되는 경우, 탈차단제는 비-표지된 뉴클레오티드로부터 3' OH 차단기(32A, 32B, 32C)를 제거한다는 것이 이해되어야 한다. 어느 한 예에서, 3' OH 차단기(32A, 32B, 32C)의 제거는 후속 시퀀싱 사이클이 수행될 수 있게 한다. 3' OH 차단기 및 적합한 탈차단제의 예는 다음을 포함한다: 광분해로 제거될 수 있는 o-니트로벤질 에테르 및 알킬 o-니트로벤질 카르보네이트; 염기 가수분해에 의해 제거될 수 있는 에스테르 모이어티; Nal, 클로로트리메틸실란 및 Na2S2O3로 또는 아세톤/물 중 Hg(II)로 제거될 수 있는 알릴-모이어티; 포스핀, 예컨대, 트리스(2-카르복실에틸)포스핀(TCEP) 또는 트리(하이드록시프로필)포스핀(THP)으로 절단될 수 있는 아자이도메틸; 산성 조건으로 절단될 수 있는 3차-부톡시-에톡시와 같은 아세탈; LiBF4 및 CH3CN/H2O로 절단될 수 있는 MOM(-CH2OCH3) 모이어티; 티오페놀 및 티오설페이트와 같은 친핵체로 절단될 수 있는 2,4-디니트로벤젠 설페닐; Ag(I) 또는 Hg(II)로 절단될 수 있는 테트라하이드로푸라닐 에테르; 및 포스파타제 효소(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 키나제)에 의해 절단될 수 있는 3' 포스페이트. 그 밖의 유용한 가역적 모이어티는 에테르, -F, -H2, -OCH3, -N3, -HCOCH3, 및 2-니트로벤젠 카르보네이트를 포함하고, 유용한 탈차단 처리는 광으로의 조사(예를 들어, 광분해 유발), 가열, 화학적 반응물에 대한 노출, 촉매에 대한 노출, 또는 전류에 대한 노출(예를 들어, 전기분해 유발) 등을 포함한다.
예시 및 이해의 용이함을 위해, 도 4의 A 내지 도 4의 C 및 도 6의 A 내지 도 6의 C는 단일 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40), 및 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40)에 상보적으로 형성된 신생 가닥으로의 단일 표지된 뉴클레오티드(28) 혼입을 수반하는 단일 시퀀싱 사이클을 예시하는 것이다. 그러나, 각 함몰부(20)는 여러 개(예를 들어, 최대 수백만 개)의 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40)(앰플리콘)을 포함하고, 단일 염기 혼입은 각 함몰부(20)의 각 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40)에서 동시에 일어날 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 영상화는 다양한 혼입 이벤트로부터 일어나는 방출(54) 및 인가 전위(들)를 캡쳐할 것이고, 각각 혼입된 염기가 이미지로부터 확인될 수 있다. 캡쳐된 이미지는 뉴클레오티드가 유동 셀에 걸쳐 각 클러스터 위치에서 혼입되었는지를 결정하기 위해 이미지 분석 소프트웨어로 처리될 수 있다.
본원에 개시된 예에서, ECL 표지(36)는 특정 방출 스펙트럼, 특정 산화 또는 환원 전위, 특정 방출 수명, 특정 방출 세기, 및/또는 특정 절단 화학을 가질 수 있다. 이러한 독특한 특징들은 상이한 ECL 표지(36)가, 예를 들어, 이들의 각(및 별개) 방출에 의해, 산화 또는 환원을 개시하는 데 사용되는 각(및 별개) 전위에 의해, 이들의 각(및 별개) 방출 수명에 의해, 및/또는 특정 절단 활성의 존재 또는 부재에 의해 확인될 수 있게 한다. 일례에서, 임의의 하나의 ECL 표지(36)의 각 및 별개 방출, 전위, 방출 수명, 및/또는 절단 활성은 복수의 표지된 뉴클레오티드(26)에서 사용되는 임의의 다른 ECL 표지(36)의 방출, 전위, 방출 수명, 및/또는 절단 활성과 상이하다. 이와 같이, 하나 이상의 이러한 독특한 특징들을 갖는 특정 ECL 표지(36)는 특정 뉴클레오티드 염기(예를 들어, A, T, C, 및 G)에 커플링될 수 있다. 표지된 뉴클레오티드(28A, 28B, 28C)가 시퀀싱 동안 신생 가닥에 혼입될 때, ECL 표지(36)의 독특한 특징이 검출된 후 혼입된 염기를 식별하는 데 사용될 수 있다.
일례로서, 네 개의 상이한 방출 스펙트럼(즉, 네 개의 상이한 파장 밴드에서의 방출)을 갖는 네 개의 상이한 ECL 표지는 네 개의 뉴클레오티드 염기 A, T, C, 및 G에 각각 부착될 수 있다. 시퀀싱 사이클에서 영상화 동안, 네 개의 상이한 파장 밴드를 이용한 네 개의 별개 이미지가 캡쳐되고 처리되어 뉴클레오티드가 혼입되었는 지를 확인할 수 있다.
또 다른 예로서, 세 개의 상이한 방출 스펙트럼(즉, 세 개의 상이한 파장 밴드에서의 방출)을 갖는 세 개의 상이한 ECL 표지는 세 개의 뉴클레오티드 염기 A, T, 및 C에 각각 부착될 수 있고, 뉴클레오티드 염기 G는 천연으로 존재할 수 있다(즉, 표지되지 않음). 시퀀싱 사이클에서 영상화 동안, 세 개의 상이한 파장 밴드를 이용한 세 개의 별개 이미지가 캡쳐되고 처리되어 뉴클레오티드가 혼입되었는 지를 확인할 수 있다. 이미지에서, 비방출(즉, 어두운 반응)은 네 번째 뉴클레오티드 염기의 확인을 가능하게 한다.
추가의 또 다른 예로서, 네 개의 상이한 산화 또는 환원 전위를 갖는 네 개의 상이한 ECL 표지(36)는 네 개의 뉴클레오티드 염기 A, T, C, 및 G에 각각 부착될 수 있다. 시퀀싱 사이클 동안, 특정 방출을 개시하는 데 사용되는 산화 또는 환원 전위는 특정 이미지로 기록될 수 있다. 네 개의 염기의 확인은 방출을 개시하는 인가된 산화 또는 환원 전위와 방출을 연관시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 예에서, 방출을 일으키는 산화 또는 환원 전위가 신호를 구별하기 위해 사용될 때 방출이 동일한 광학적 채널에 있을 수 있다.
추가의 예에서, 네 개의 상이한 방출 수명을 갖는 네 개의 상이한 ECL 표지는 네 개의 뉴클레오티드 염기 A, T, C, 및 G에 각각 부착될 수 있다. 영상화 동안, 상이한 방출 수명이 기록될 수 있다. 이러한 데이터는 네 개의 상이한 뉴클레오티드 염기 중 어느 하나 이상의 확인을 가능하게 한다.
또 다른 추가 예에서, 네 개의 상이한 방출 세기를 갖는 네 개의 상이한 ECL 표지는 네 개의 뉴클레오티드 염기 A, T, C, 및 G에 각각 부착될 수 있다. 영상화 동안, 상이한 방출 세기가 기록될 수 있다. 이러한 데이터는 네 개의 상이한 뉴클레오티드 염기 중 어느 하나 이상의 확인을 가능하게 한다. 또 다른 예로서, 세 개의 상이한 방출 세기를 갖는 세 개의 상이한 ECL 표지는 세 개의 뉴클레오티드 염기 A, T, 및 C에 각각 부착될 수 있고, 뉴클레오티드 염기 G는 천연으로 존재할 수 있다(즉, 표지되지 않음).
또 다른 추가 예로서, 동일한 유형의 ECL 표지(36)는 상이한 절단 화학을 갖는 링킹 분자(34)와 커플링될 수 있다. 이러한 예에서, 네 개의 상이한 뉴클레오티드가 유체에서 사용될 수 있다. 일례에서, 유체는 다음을 포함한다: ECL 표지(36)에 부착된 절단성 링킹 분자(34)를 포함하는, 제1 표지된 뉴클레오티드(28A, 28B, 28C); ECL 표지(36)에 부착된 비-절단성 링킹 분자(34)를 포함하는, 제2 표지된 뉴클레오티드(28A, 28B, 28C); 3' OH 차단기를 갖고 ECL 표지(36)에 부착 가능한 링킹 분자(34)를 포함하는, 제3 비-표지된 뉴클레오티드; 및 3' OH 차단기를 갖는, 제4 비-표지된 뉴클레오티드. 하나의 ECL 표지(36)(동일한 전위에서 활성화되고 하나의 채널에서 방출됨)는 용액 중 여러 뉴클레오티드에 부착되거나 이에 부착 가능하기 때문에, 두 개의 화학 단계, 두 개의 전극 전위 인가, 및 두 개의 영상화 단계가 시퀀싱 사이클에 따라 사용된다. 이러한 예에서, 제1 내지 제4 상이한 뉴클레오티드가 제1 화학 단계에서 첨가되고, ECL 표지(36)의 산화 또는 환원 전위가 인가되고, 이미지가 얻어지고; 이후 새로운 시약이 제2 화학 단계에서 첨가되고, 이 단계에서 제1 표지된 뉴클레오티드로부터 ECL 표지(36)가 제거되고 ECL 표지(36)가 제3 비-표지된 뉴클레오티드에 첨가되고, ECL 표지(36)의 산화 또는 환원 전위가 다시 인가되고, 또 다른 이미지가 얻어진다. 이러한 예에서, 제1 표지된 뉴클레오티드는 이의 ECL 표지(36)가 제2 이미지를 얻기 전에 제거되기 때문에 제1 이미지에서만 영상화되고; 제2 표지된 뉴클레오티드는 이의 ECL 표지(36)가 영구 부착되기 때문에 제1 이미지와 제2 이미지 둘 모두에서 영상화되고; 제3 비-표지된 뉴클레오티드는 ECL 표지(36)가 제1 이미지를 얻은 후에 도입되고 부착되기 때문에 제2 이미지에서만 영상화되고; 제4 비-표지된 뉴클레오티드는 ECL 표지(36)를 포함하거나 이에 도입되는 ECL 표지(36)를 갖지 않기 때문에 영구적으로 어둡다. 이러한 예에서, 두 개의 이미지에 걸쳐 각 염기에 대한 상이한 방출 패턴의 분석에 의해 상이한 뉴클레오티드가 확인된다.
시퀀싱 사이클은 한 번에 하나의 염기로 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(40)에서 염기의 서열을 결정하기 위해 반복될 수 있다.
전기화학적으로 발생된 신호의 광학적 검출이 기재되었지만, 도 1의 B 및 도 1의 C에 나타나 있는 유동 셀 구조의 예는 또한 ECL 발생 형광 신호(광학적 방출(54))가 전기적으로 검출되도록 상보적 금속-산화물 반도체(CMOS)와 통합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 도 7은 CMOS(검출 디바이스(44))와 통합된 도 1의 B에 나타나 있는 유동 셀 구조를 예시한 것이고, 도 8은 CMOS(검출 디바이스(44))와 통합된 도 1의 C에 나타나 있는 유동 셀 구조를 예시한 것이다.
도 7에 나타나 있는 예시적인 유동 셀(10')에서, 전극(16)은 투명하고; 기판(14)은 투명하고; 검출 디바이스(44)(예를 들어, CMOS)는 기판(14)과 접촉된다. 검출 디바이스(44)는 각각의 함몰부(20)와 작동적으로 결합된 각 포토다이오드(50); 및 각 포토다이오드(50)에 전기적으로 연결된 디바이스 회로를 포함한다.
도 8에 나타나 있는 예시적인 유동 셀(10')에서, 기판(14)은 투명하고; 검출 디바이스(44)(예를 들어, CMOS)는 기판(14)과 접촉된다. 검출 디바이스(44)는 각각의 함몰부(20)와 작동적으로 결합된 각 포토다이오드(50); 및 각 포토다이오드(50)에 전기적으로 연결된 디바이스 회로를 포함한다.
도 7 및 도 8에 나타나 있는 예에서, 용어 "투명한"은 투명 전극 및/또는 투명 기판(들)이 이를 통해 광학적 방출(54)이 지나갈 수 있게 한다는 것을 의미한다. 더욱이, 투명 기판은 CMOS 디바이스에서 패시베이션 층과 유사할 수 있다.
이러한 예들에서 검출 디바이스(44)는, 예를 들어, 규소 층(들), 유전체 층(들), 금속-유전체 층(들), 금속 층(들) 등을 포함하는 복수의 적층된 층을 포함하는 CMOS 디바이스이다. 적층된 층은 검출 회로를 구성한다. 검출 회로(44)는 전류를 전도할 수 있는 상호연결된 전도성 부재(예를 들어, 전도체, 트레이스, 바이어스, 상호연결부 등)를 포함할 수 있다. 회로는 검출된 광자를 기초로 데이터 신호를 선택적으로 전송하도록 구성될 수 있다. 회로는 또한 신호 증폭, 디지털화, 저장, 및/또는 처리를 위해 구성될 수 있다. 회로는 검출된 광 방출(54)을 수집하고 분석하고, 검출 데이터를 통신하기 위한 데이터 신호를 발생시킬 수 있다. 회로는 또한 검출 디바이스(44)에서 추가 아날로그 및/또는 디지털 신호 처리를 수행할 수 있다.
검출 디바이스(44)는 또한 광학적 구성요소, 예컨대, 포토다이오드(50)(또는 다른 광학적 센서(들)) 및 광도파관(들)(48)을 포함한다. 도 7 및 도 8에 나타나 있는 예에서, 광학적 구성요소는 각 포토다이오드(50)가 적어도 실질적으로 단일 광도파관(48) 및 단일 함몰부(20)로 정렬되고 이에 따라 이들과 작동적으로 결합되도록 배열된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 포토다이오드(50)는 하나의 픽셀 또는 하나보다 많은 픽셀을 포함하는 광 센서일 수 있다. 일례로서, 각 포토다이오드(50)는 약 50 μm2 미만인 검출 면적을 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 검출 면적은 약 10 μm2 미만일 수 있다. 추가의 또 다른 예로서, 검출 면적은 약 2 μm2 미만일 수 있다. 후자의 예에서, 포토다이오드(50)는 단일 픽셀을 구성할 수 있다. 포토다이오드(50)의 각 픽셀의 평균 판독 잡음은, 예를 들어, 약 150 개 미만의 전자일 수 있다. 다른 예에서, 판독 잡음은 약 5 개 미만의 전자일 수 있다. 광학적 센서(들)(18)의 해상도는 약 0.5 메가픽셀(Mpixel) 초과일 수 있다. 다른 예에서, 해상도는 약 5 Mpixel 초과, 또는 약 10 Mpixel 초과일 수 있다.
또한 본원에서 사용되는 바와 같이, 단일 광도파관(48)은 광학적 방출(54)이 상응하는 포토다이오드(50)를 향해 전파될 수 있게 하는 물질을 포함하는 광도체일 수 있다. 본원에 개시된 방법은 광학적 방출(54)을 전기화학적으로 생성시키기 때문에, 광도파관(48)에서의 물질은 여기 광을 위한 필터일 필요가 없다. 적합한 광도체 물질의 예는 산화물이다. 광도체 물질은 광도체 구조의 형성을 돕는 유전체 또는 금속 물질에 의해 둘러싸일 수 있다.
도 7 및 도 8에 나타나 있는 유동 셀(10')의 경우, 시퀀싱 방법은 도 4의 A 내지 도 4의 C 및 도 6의 A 내지 도 6의 B를 참조로 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 검출 디바이스(44)는 또한 고체 상태 영상화기이고, 이에 따라 본원에 개시된 예에 따른 광학적 방출(54)을 영상화할 수 있다. 또한, 광 방출(54)은 검출 디바이스(44)의 포토다이오드(50)에 의해 검출된다. 포토다이오드(50)는 광 방출(54)의 광자를 검출하고, 이러한 신호들을 전기 신호(예를 들어, 전류 또는 전압)로 변환시킬 수 있다. 전기 신호는 다양한 ECL 표지(36)의 광학적 방출과 상관관계가 있으며, 이에 따라 단일 염기 혼입 이벤트의 확인을 위해 사용될 수 있다.
도 7 및 도 8에 나타나 있지는 않지만, 유동 셀(10')은 광학적 방출(54)의 전기화학적 발생이 광학적 방출(54)의 센싱에 직교하도록 두 개의 제어기를 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 다시 말해서, 전극(16) 또는 패턴화된 전극(26)에 인가된 전위(들)는 검출 디바이스(44)의 회로로부터 개별적으로 제어될 수 있다.
또한, 도 7 및 도 8에 나타나 있는 뚜껑(46)이 주지된다. 뚜껑(46)은 유동 셀(10, 10')의 유동 채널(들)(12)을 형성시키기 위해 본원에 개시된 임의의 예에서 사용될 수 있다. 도 1의 A 및 도 3 내지 도 6의 C에 나타나 있는 예에서, 뚜껑(46)은 광학적 방출(54)이 검출기에 의해 수신될 수 있도록 투명한 물질일 수 있다. 도 7 및 도 8에서, 뚜껑(46)은 여기원 및 광학적 방출(54)이 검출 디바이스(44)를 통해 포토다이오드(50)로 유도되지 않기 때문에 어떠한 물질로도 제조될 수 있다.
본원에 개시된 예는 전기화학적으로 독특하고 구별 가능한 신호를 발생시키고, 그에 따라 여기원에 대한 필요를 없앤다. 이는 본원에 개시된 유동 셀(10, 10')과 사용될 수 있는 전체 시퀀싱 시스템을 단순화한다.
"일례", "또 다른 예", "예" 등에 대한 본 명세서 전반에 걸친 언급은 상기 예와 관련하여 기재된 특정 요소(예를 들어, 특징, 구조, 및/또는 특성)가 본원에 기재된 적어도 하나의 예에 포함되고, 다른 예에 존재하거나 존재하지 않을 수 있음을 의미한다. 또한, 임의의 예에 대한 기재된 요소는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 다양한 예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있음이 이해되어야 한다.
청구범위를 포함하여 본 개시 전반에 걸쳐 사용된 용어 "실질적으로" 및 "약"은, 예컨대, 처리시 변동과 같은 것들로 인한 작은 변동들을 설명하고 감안하는 데 사용된다. 예를 들어, 이 용어들은 ±5 %보다 적거나 같은 것을, 예컨대 ±2 %보다 적거나 같은, 예컨대 ±1 %보다 적거나 같은, 예컨대 ±0.5 %보다 적거나 같은, 예컨대, ±0.2 %보다 적거나 같은, 예컨대 ±0.1 %보다 적거나 같은, 예컨대 ±0.05 %보다 적거나 같은 것으로 지칭할 수 있다.
또한, 본원에 제공된 범위는 이들의 분명히 언급된 바와 같이 명시된 범위 및 명시된 범위 내의 임의의 값 또는 하위-범위를 포함한다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 약 2 mm 내지 약 300 mm로 표현된 범위는 약 2 mm 내지 약 300 mm의 분명히 언급된 제한치를 포함할 뿐만 아니라 개별 값, 예컨대, 약 5 mm, 222.5 mm, 275 mm 등, 및 하위-범위, 예컨대, 약 150 mm 내지 약 180 mm 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
여러 예들이 구체적으로 기재되었지만, 개시된 예가 변형될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 상기 설명은 비-제한적으로 여겨져야 한다.

Claims (27)

  1. 유동 셀(flow cell)로서,
    기판;
    상기 기판 상에 위치한 전극;
    상기 전극 상에 위치한 패턴화된 물질로서, 틈새 영역(interstitial region)에 의해 분리된 함몰부(depression)를 포함하는, 패턴화된 물질;
    각각의 상기 함몰부에서 노출된 상기 전극의 작용성화된 표면; 및
    각각의 상기 함몰부에서 상기 작용성화된 표면에 그라프팅된(grafted) 프라이머
    를 포함하는, 유동 셀.
  2. 제1항에 있어서,
    전극이 금을 포함하고, 작용성화된 표면이 티올 링커 또는 아민 링커를 포함하거나;
    전극이 인듐 주석 옥사이드를 포함하고, 작용성화된 표면이 실란 링커를 포함하는, 유동 셀.
  3. 제1항에 있어서,
    전극이 투명하고;
    기판이 투명하고;
    유동 셀이 상기 기판과 접촉된 검출 디바이스를 추가로 포함하고,
    상기 검출 디바이스가
    각각의 함몰부와 작동적으로 결합된 각 포토다이오드; 및
    상기 각 포토다이오드에 전기적으로 연결된 디바이스 회로를 포함하는, 유동 셀.
  4. 시퀀싱 키트로서,
    제1항에 정의된 바와 같은 유동 셀; 및
    상기 유동 셀에 도입될 표지된 뉴클레오티드를 포함하고,
    각 표지된 뉴클레오티드가
    3' OH 차단기를 갖는 뉴클레오티드;
    상기 뉴클레오티드의 염기 또는 당에 부착된 링킹 분자; 및
    상기 링킹 분자에 부착된 전기화학발광 표지를 포함하는, 시퀀싱 키트.
  5. 제4항에 있어서, 표지된 뉴클레오티드가 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 상기 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지가 별개의 방출 스펙트럼을 갖는, 시퀀싱 키트.
  6. 제4항에 있어서, 표지된 뉴클레오티드가 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 상기 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지가 별개의 산화 또는 환원 전위를 갖는, 시퀀싱 키트.
  7. 제4항에 있어서, 표지된 뉴클레오티드가 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 상기 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지가 별개의 전기화학발광 방출 수명을 갖는, 시퀀싱 키트.
  8. 제4항에 있어서, 표지된 뉴클레오티드가 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 상기 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지가 별개의 전기화학발광 방출 세기를 갖는, 시퀀싱 키트.
  9. 유동 셀로서,
    기판;
    상기 기판 상에 위치한 패턴화된 전극으로서, 틈새 영역에 의해 분리된 함몰부를 포함하는, 패턴화된 전극;
    각각의 상기 함몰부에서 노출된 상기 기판의 작용성화된 표면; 및
    각각의 상기 함몰부에서 상기 작용성화된 표면에 접촉된 프라이머
    를 포함하는, 유동 셀.
  10. 제9항에 있어서, 기판의 작용성화된 표면이 상기 기판에 부착된 실란 기에 부착된 폴리머 층을 포함하는, 유동 셀.
  11. 제9항에 있어서, 기판의 작용성화된 표면이 상기 기판에 부착된 하이드록실 기를 포함하는, 유동 셀.
  12. 제9항에 있어서,
    기판이 투명하고;
    유동 셀이 상기 기판과 접촉된 검출 디바이스를 추가로 포함하고, 상기 검출 디바이스가
    각각의 함몰부와 작동적으로 결합된 각 포토다이오드; 및
    상기 각 포토다이오드에 전기적으로 연결된 디바이스 회로를 포함하는, 유동 셀.
  13. 시퀀싱 키트로서,
    제9항에 정의된 바와 같은 유동 셀; 및
    상기 유동 셀에 도입될 표지된 뉴클레오티드를 포함하고,
    각 표지된 뉴클레오티드가
    3' OH 차단기를 갖는 뉴클레오티드;
    상기 뉴클레오티드의 염기 또는 당에 부착된 링킹 분자; 및
    상기 링킹 분자에 부착된 전기화학발광 표지를 포함하는, 시퀀싱 키트.
  14. 제13항에 있어서, 표지된 뉴클레오티드가 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 상기 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지가 별개의 방출 스펙트럼을 갖는, 시퀀싱 키트.
  15. 제13항에 있어서, 표지된 뉴클레오티드가 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 상기 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지가 별개의 산화 또는 환원 전위를 갖는, 시퀀싱 키트.
  16. 제13항에 있어서, 표지된 뉴클레오티드가 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 상기 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지가 별개의 전기화학발광 방출 수명을 갖는, 시퀀싱 키트.
  17. 제13항에 있어서, 표지된 뉴클레오티드가 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지가 별개의 전기화학발광 방출 세기를 갖는, 시퀀싱 키트.
  18. 함몰부에 부착된 주형 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하는 함몰부를 부분적으로 한정하는 전극을 포함하는 유동 셀에 폴리머라제 및 뉴클레오티드를 포함하는 유체를 도입하고, 이에 의해 상기 뉴클레오티드 중 하나가 상기 주형 폴리뉴클레오티드 사슬에 상보적인 신생 가닥으로 도입되고;
    상기 전극에 전위를 인가하고;
    상기 인가된 전위에 반응하여 광학적 방출을 검출하는 것을 포함하는 방법으로서,
    상기 뉴클레오티드 중 적어도 일부가 표지된 뉴클레오티드이고, 각각의 상기 적어도 일부 표지된 뉴클레오티드가
    3' OH 차단기를 갖는 뉴클레오티드;
    상기 뉴클레오티드의 염기 또는 당에 부착된 링킹 분자; 및
    상기 링킹 분자에 부착된 전기화학발광 표지를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 뉴클레오티드 중 혼입된 하나가 표지된 뉴클레오티드 중 하나이고, 전위의 인가가 상기 표지된 뉴클레오티드 중 혼입된 하나의 전기화학발광 표지를 수반하는 레독스 반응 경로를 개시하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    유체가 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고;
    각각의 상기 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지가 별개의 방출 스펙트럼을 갖고;
    상기 방법이 이의 광학적 방출로부터 상기 표지된 뉴클레오티드 중 혼입된 하나를 확인하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제19항에 있어서,
    유체가 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함하고;
    각각의 상기 적어도 세 개의 상이한 표지된 뉴클레오티드의 각 전기화학발광 표지가 별개의 산화 또는 환원 전위를 갖고;
    상기 방법이 인가된 전위로부터 상기 표지된 뉴클레오티드 중 혼입된 하나를 확인하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제19항에 있어서, 전위를 인가하기 전, 방법이 유동 셀에 공반응물을 도입하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  23. 제19항에 있어서, 링킹 분자 및 표지된 뉴클레오티드 중 혼입된 하나의 전기화학발광 표지가 혼입, 전위 인가, 및 광학적 검출 동안 부착되고,
    상기 광학적 검출 후, 방법이
    탈차단제를 도입하여 상기 링킹 분자 및 상기 표지된 뉴클레오티드 중 혼입된 하나로부터의 상기 전기화학발광 표지를 절단하고 상기 표지된 뉴클레오티드 중 혼입된 하나로부터 3' OH 차단기를 제거하고, 이에 의해 신생 가닥으로 다른 뉴클레오티드 또는 다른 표지된 뉴클레오티드의 혼입을 가능하게 함을 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    다른 유체를 도입하고;
    다른 전위를 전극에 인가하고;
    다른 광학적 방출을 검출함을 추가로 포함하는, 방법.
  25. 제18항에 있어서,
    포토다이오드가 광학적 방출을 검출하고;
    방법이 상기 광학적 방출에 상응하는 전기 신호를 검출함을 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제18항에 있어서,
    뉴클레오티드 중 혼입된 하나가
    링킹 분자가 절단성인, 제1 표지된 뉴클레오티드;
    링킹 분자가 비-절단성인, 제2 표지된 뉴클레오티드;
    3' OH 차단기를 갖고 전기화학발광 표지에 부착될 링킹 분자를 포함하는, 제3 비-표지된 뉴클레오티드; 또는
    3' OH 차단기를 갖는, 제4 비-표지된 뉴클레오티드 중 하나이고;
    방법이
    상기 제1 표지된 뉴클레오티드로부터 상기 전기화학발광 표지를 절단할 수 있고 상기 전기화학발광 표지를 상기 제3 비-표지된 뉴클레오티드에 첨가할 수 있는, 시약을 도입하고;
    다른 전위를 전극에 인가하고;
    상기 인가된 전위에 반응하여 다른 광학적 방출을 검출하고;
    상기 검출된 광학적 방출 및 상기 검출된 다른 광학적 방출을 이용하여 뉴클레오티드 중 혼입된 하나를 확인함을 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제18항에 있어서,
    유동 셀이 복수의 함몰부를 포함하고, 이들 각각이 상기 함몰부에 부착된 복수의 주형 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하고;
    상기 뉴클레오티드 중 각 하나가 상기 각 주형 폴리뉴클레오티드 사슬에 상보적인 각 신생 가닥으로 혼입되고;
    방법이 각각의 상기 복수의 함몰부로부터 각 광학적 방출을 동시에 검출함을 추가로 포함하는, 방법.
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