TWI760667B - 流動池、定序套組和用於偵測的方法 - Google Patents

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Abstract

在一個實例中，流動池包含基底、位於基底上的電極、和位於電極上的圖案化材料。在該實例中，圖案化材料包含由間隙區域分隔的凹陷部，並且電極的官能化表面在凹陷部中的每一個處被暴露。在該實例中，流動池還包含在凹陷部中的每一個中被接枝到官能化表面的引子。在另一個實例中，流動池包含基底和位於基底上的圖案化電極。在該其他實例中，圖案化電極包含由間隙區域分隔的凹陷部、以及在凹陷部中的每一個處被暴露的基底的官能化表面。在該其他實例中，引子在凹陷部中的每一個中被接枝到官能化表面。

Description

流動池、定序套組和用於偵測的方法
本發明關於流動池，其包含基底、位於基底上的電極、和位於電極上的圖案化材料，其中圖案化材料包含由間隙區域分隔的凹陷部，電極的官能化表面在凹陷部中的每一個處被暴露，且引子在凹陷部中的每一個中被接枝到官能化表面。本發明亦關於流動池，其包含基底和位於基底上的圖案化電極，其中圖案化電極包含由間隙區域分隔的凹陷部，基底的官能化表面在凹陷部中的每一個處被暴露且引子在凹陷部中的每一個中被接枝到官能化表面。本發明還關於相關定序套組與方法。
相關申請的交叉引用
本案主張於2018年12月17日提申的美國臨時申請序列號62/780,602的權益，該美國臨時申請的內容通過引用以其整體併入本文。
生物或化學研究中的各種方案涉及在局部支撐表面上或在預先界定的反應室內進行大量受控反應。然後可以觀察或偵測指定的反應，並且隨後的分析可以幫助識別或揭示參與反應的化學物質的性質。例如，在一些多重測定中，具有可識別標記物(例如螢光標記物)的未知分析物可以在受控條件下暴露於數以千計的已知的探針。每個已知的探針可以沉積到微孔板 (microplate)的對應孔中。觀察在孔中的已知的探針和未知分析物之間發生的任何化學反應可以幫助識別或揭示分析物的性質。這類方案的其他實例包含已知的DNA定序方法，例如合成定序(SBS)或循環陣列定序(cyclic-array sequencing)。利用多核苷酸定序技術，分析可以幫助識別或揭示參與反應的多核苷酸的性質。
本文揭露的第一方面是第一流動池(flow cell)，其包含：基底；電極，該電極位於基底上；圖案化材料，該圖案化材料位於電極上且包含由間隙區域分隔的凹陷部；電極的官能化表面，該官能化表面在凹陷部中的每一個處被暴露；和引子，該引子在凹陷部中的每一個中被接枝到官能化表面。
在第一方面的一個實例中，電極包含金，並且官能化表面包含硫醇連接子或胺連接子；或者電極包含氧化銦錫，並且官能化表面包含矽烷連接子。
在第一方面的一個實例中，電極是透明的；基底是透明的；並且流動池還包含與基底接觸的偵測裝置，偵測裝置包含與凹陷部中的每一個可操作地相關聯的相應的光二極體以及電連接到相應的光二極體的裝置電路。
應當理解，本文揭露的第一流動池的任何特徵可以以任何所欲的方式和/或配置組合在一起。
本文揭露的第二方面是定序套組，該定序套組包含如在第一方面中所定義的流動池和待引入流動池中的被標記的核苷酸，每個被標記的核苷酸包含具有3’OH保護基的核苷酸、附接到核苷酸的鹼基或糖的連接分子和附接到連接分子的電化學發光標記物。
在第二方面的一個實例中，被標記的核苷酸包含至少三種不同的 被標記的核苷酸，並且其中至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的發射光譜。
在第二方面的一個實例中，被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的氧化電位或還原電位。
在第二方面的一個實例中，被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的電化學發光發射壽命。
在第二方面的一個實例中，被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的電化學發光發射強度。
應當理解，此定序套組的任何特徵可以以任何所欲的方式組合在一起。此外，應當理解，此定序套組和/或流動池的特徵的任何組合可以一起使用，和/或與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第三方面是另一種流動池，其包含：基底；圖案化電極，該圖案化電極位於基底上且包含由間隙區域分隔的凹陷部；基底的官能化表面，該官能化表面在凹陷部中的每一個處被暴露；以及引子，該引子在凹陷部中的每一個中被接枝到官能化表面。
在第三方面的一個實例中，基底的官能化表面包含附接到矽烷基團的聚合物層，該矽烷基團附接到基底。
在第三方面的一個實例中，基底的官能化表面包含附接到基底的羥基基團。
在第三方面的一個實例中，基底是透明的；並且流動池還包含與基底接觸的偵測裝置，偵測裝置包含與凹陷部中的每一個可操作地相關聯的相 應的光二極體和電連接到相應的光二極體的裝置電路。
應當理解，此流動池的任何特徵可以以任何所欲的方式組合在一起。此外，應當理解，此流動池和/或定序套組和/或其他流動池的特徵的任何組合可以一起使用，和/或與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第四方面是定序套組，其包含：如在第三方面中所定義的流動池和待引入流動池中的被標記的核苷酸，每個被標記的核苷酸包含具有3’OH保護基的核苷酸、附接到核苷酸的鹼基或糖的連接分子和附接到連接分子的電化學發光標記物。
在第四方面的一個實例中，被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的發射光譜。
在第四方面的一個實例中，被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的氧化電位或還原電位。
在第四方面的一個實例中，被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的電化學發光發射壽命。
在第四方面的一個實例中，被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的電化學發光發射強度。
應當理解，此定序套組的任何特徵可以以任何所欲的方式組合在一起。此外，應當理解，此定序套組和/或流動池和/或其他定序套組中任一個的特徵的任何組合可以一起使用，和/或與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第五方面是一種方法，該方法包含：將包含聚合酶和 核苷酸的流體引入流動池，該流動池包含部分地界定凹陷部的電極，該凹陷部包含附接在凹陷部中的模板多核苷酸鏈，其中核苷酸中的至少一些是被標記的核苷酸，至少一些被標記的核苷酸中的每一個包含具有3’OH保護基的核苷酸、附接到核苷酸的鹼基或糖的連接分子和附接到連接分子的電化學發光標記物，從而核苷酸中的一個併入到與模板多核苷酸鏈互補的新生股中；向電極施加電位；以及偵測響應於所施加的電位的光學發射。
在第五方面的一個實例中，核苷酸中的被併入者是被標記的核苷酸中的一個，並且其中電位的施加引發氧化還原反應路徑，氧化還原反應路徑涉及被標記的核苷酸中的被併入者的電化學發光標記物。在一個實例中，流體包含至少三種不同的被標記的核苷酸，至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的發射光譜，並且該方法還包含從被標記的核苷酸中的被併入者的光學發射識別被標記的核苷酸中的被併入者。在另一個實例中，流體包含至少三種不同的被標記的核苷酸，至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的氧化電位或還原電位，並且該方法還包含從所施加的電位識別被標記的核苷酸中的被併入者。在又一個實例中，在施加電位之前，該方法還包含將共反應物引入流動池。在又一個實例中，被標記的核苷酸中的被併入者的連接分子和電化學發光標記物在併入、電位施加和光學偵測期間被附接，並且其中在光學偵測之後，該方法還包含引入去保護劑以從被標記的核苷酸中的被併入者切出連接分子和電化學發光標記物，並且從被標記的核苷酸中的被併入者除去3’OH保護基，從而能夠將另一種核苷酸或另一種被標記的核苷酸併入到新生股中。在此特定實例中，該方法還可以包含引入另一種流體，向電極施加另一電位，以及偵測另一光學發射。
在第五方面的一個實例中，光二極體偵測光學發射，並且該方法 還包含偵測對應於光學發射的電信號。
在第五方面的一個實例中，核苷酸中的被併入者是以下中的一個：第一被標記的核苷酸，其中連接分子是可切出的；第二被標記的核苷酸，其中連接分子是不可切出的；第三未被標記的核苷酸，其具有3’OH保護基並包含連接分子，該連接分子待附接到電化學發光標記物；或第四未被標記的核苷酸，其具有3’OH保護基；並且該方法還包含引入一種試劑，試劑能夠從第一被標記的核苷酸切出電化學發光標記物並且能夠將電化學發光標記物添加到第三未被標記的核苷酸；向電極施加另一電位；偵測響應於所施加的電位的另一光學發射；並且使用偵測到的光學發射和偵測到的其他光學發射來識別核苷酸中的被併入者。
在第五方面的一個實例中，流動池包含多個凹陷部，凹陷部中的每一個包含附接在凹陷部中的多個模板多核苷酸鏈，核苷酸中相應的一個併入到與相應的模板多核苷酸鏈互補的相應的新生股中，並且該方法還包含同時地偵測來自多個凹陷部中的每一個的相應的光學發射。
應當理解，該方法的任何特徵可以以任何所欲的方式組合在一起。此外，應當理解，該方法和/或第一定序套組和/或第二定序套組的特徵的任何組合可以一起使用，和/或與本文揭露的任何實例組合。
更進一步，應當理解，所述方法中的任何和/或所述定序套組中的任何的任何特徵可以以任何所欲的方式組合在一起，和/或可以與本文揭露的任何實例組合。
10:流動池
10’:流動池
12:流動通道
14:基底/撐體
16:電極
18:圖案化材料
20:凹陷部
22:間隙區域
24:引子
26:圖案化電極
28:被標記的核苷酸
28A:被標記的核苷酸
28B:被標記的核苷酸
28C:被標記的核苷酸
30:核苷酸
32A:3’OH保護基
32B:3’OH保護基
32C:3’OH保護基
34:連接分子
36:電化學發光標記物
38:切裂位置
40:模板多核苷酸鏈/股
42:聚合酶
44:偵測裝置/偵測電路
46:蓋子
48:光學波導
50:光二極體
52:陣列
52’:陣列
53:定序引子
54:光學發射/光發射
S14:表面
S16:表面
通過參考以下詳細描述和圖式，本文之揭露內容的實例的特徵將變得明顯，其中相同的元件符號對應於相似但可能不相同的部件。為了簡潔起 見，元件符號或具有先前已描述的功能的特徵可以結合或可以不結合它們在其中出現的其他圖式來描述。
[圖1A]是流動池的一個實例的俯視圖；[圖1B]是圖1A的流動池通路中的一個的一部分的一個實例的放大透視圖，示出了界定在電極表面上的凹陷部和在凹陷部中附接在電極表面上的引子；[圖1C]是圖1A的流動池通路中的一個的一部分的另一實例的放大透視圖，示出了由基底表面上的圖案化電極界定的凹陷部和在凹陷部中附接在基底表面上的引子；[圖2]示意性描繪了被標記的核苷酸的不同實例；[圖3]是用於定序套組的流動池的凹陷部的陣列的一個實例的半示意透視圖；[圖4A至圖4C]描繪了當圖3的陣列暴露於定序循環時該陣列的一個凹陷部的橫截面視圖；[圖5]是用於定序套組的流動池的凹陷部的陣列的另一實例的半示意透視圖；[圖6A至圖6C]描繪了當圖5的陣列暴露於定序循環時該陣列的一個凹陷部的橫截面視圖；[圖7]是用於定序套組的流動池的一個實例的橫截面視圖，其中流動池併入互補金屬氧化物半導體(CMOS)偵測裝置；以及[圖8]是用於定序套組的流動池的另一實例的橫截面視圖，其中流動池併入CMOS偵測裝置。
在本文揭露的實例中，定序期間的核苷酸鹼基調用(nucleotide base calling)經由偵測電化學地產生的螢光信號來進行。螢光信號的電化學產生不涉及通過用雷射、發光二極體或其他照明源進行照明來激發染料標記的鹼基。不需要激發源，本文揭露的實例的光學系統被簡化。
電化學發光(ECL)的過程開始於電極表面處分子的氧化或還原，以形成自由基陽離子或陰離子。在一些實例中，自由基陽離子或陰離子然後與共反應物進行電子轉移，以形成發射激發態。在其他實例中，電極的電位從正掃向負，這可以直接產生發射激發態。在任一實例中，本文揭露的過程從激發源產生沒有背景雜訊的光。因此，本文揭露的實例消除由於激發源引起的雜訊，並且從而增大信號雜訊比。增大的信號雜訊比改進定序準確度，並且還使得由於較高的數據密度而能夠使用較小的間距(pitch)。
此外，在本文揭露的實例中，激發態僅在電極表面處或由電極壁界定的凹陷部內形成，這有助於空間上分辨的ECL活性區域。
更進一步，發射的光子的數目取決於ECL反應的效率和所施加的電位的持續時間。理論上，ECL活性分子可以經歷許多氧化還原/反應/發射循環，並且可以在所施加的電位的持續時間內發射光子。這使得能夠調整用於信號產生的時段，這可以產生更準確的偵測結果。
在本文揭露的實例中，使用定序套組電化學地產生信號。本文所描述的定序套組的一個實例是電化學發光定序套組。儘管電化學發光定序套組在本文中被用作定序套組的代表性實例，但是本文中的定序套組不需要是電化學發光套組。每個電化學發光定序套組包含特定的流動池，該流動池併入待用於ECL過程的電極。在一些實例中，流動池可以與光學偵測裝置一起使用。在其他實例中，流動池與互補金屬氧化物半導體(CMOS)偵測裝置一起集成，並且從而用於光電偵測。
圖1A中描繪了流動池10的一個實例。在此實例中，流動池10包 含流動通道12。雖然示出了幾個流動通道12，但是應當理解，流動池10中可以包含任何數目的通道12(例如，單個通道12、四個通道12等)。每個流動通道12是界定在兩個結合部件(例如，基底和蓋子或兩個基底)之間的區域，該區域可以使液體引入其中以及從其中除去。每個流動通道12可以與每個其他的流動通道12隔離，使得引入任何特定流動通道12中的液體不流動到任何相鄰的流動通道中。如本文將進一步討論的，引入流動通道12中的液體可以引入反應組分(例如，被標記的核苷酸和/或未被標記的核苷酸)、洗滌溶液、去保護劑等。
圖1B和圖1C中示出了流動池10的流動通道12內的結構的不同實例。
在圖1B中示出的實例中，流動池10包含基底14、位於基底14上的電極16和位於電極16上的圖案化材料18。圖案化材料18界定由間隙區域22分隔的凹陷部18。在此實例中，電極16的官能化表面S16在凹陷部18中的每一個處被暴露，並且引子24被接枝到官能化表面S16。
圖1B中的基底14為流動池10的其他部件提供支撐。基底14通常是剛性的，並且在水性液體中是不溶性的。合適的基底14的實例包含環氧矽氧烷、玻璃、改性玻璃、塑料、尼龍、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化矽(氧化矽(SiO2))、熔融二氧化矽、矽基材料、矽酸鋁、矽、改性矽(例如硼摻雜的p+矽)、氮化矽(Si3N4)、五氧化鉭(TaO5)或其他鉭氧化物(TaOx)、氧化鉿(HaO2)、無機玻璃、或類似物。用於基底14的合適的塑料的一些實例包含丙烯酸類、聚苯乙烯、苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(例如來自Chemours的TEFLON®)、環烯烴類/環烯烴聚合物(COP)(例如來自Zeon的ZEONOR®)、聚醯亞胺等。支撐物也可以是玻璃或矽，在表面處具有鉭氧化物或另一種陶瓷氧化物的塗層。
基底14的形式可以是晶圓、面板、矩形片材、裸晶或任何其他合 適的配置。在一個實例中，基底14可以是具有在從約2mm至約300mm範圍內的直徑的圓形的晶圓或面板。作為一個更具體的實例，基底14是具有在從約200mm至約300mm範圍內的直徑的晶圓。在另一實例中，基底14可以是矩形的片材或面板，其最大尺寸至多達約10英尺(~3公尺)。作為一個具體實例，撐體14是具有在從約0.1mm至約10mm範圍內的寬度的裸晶。雖然已經提供了示例性尺寸，但是應當理解，可以使用具有任何合適尺寸的基底14。
在圖1B中，電極16位於基底12上。電極16可以包含任何合適的電極材料，例如金(Au)、銀(Ag)、氯化銀(AgCl)、鉑(Pt)、鈦(Ti)、鉬(Mo)、氧化銦錫(ITO)、氧化銦鋅(IZO)、碳(例如石墨烯、碳納米管片材)、導電聚合物等。在一個實例中，電極16是金。電極16可以具有致使電極16是機械上穩定和化學上穩定的任何合適厚度。作為實例，厚度可以是200nm或更大。
電極16可以是例如使用粘合劑附接到基底14的預成型片材，或可以使用合適的沉積技術沉積在基底12上。
在圖1B中示出的實例中，圖案化材料18位於電極16上。應當理解，可以選擇性地沉積或沉積且圖案化以形成凹陷部18和間隙區域22的任何材料可以被用於圖案化材料18。圖案化材料18可以是導電的或非導電的，並且被選擇成使得它不接枝引子24。
作為一個實例，無機氧化物可以經由氣相沉積、氣溶膠印刷或噴墨印刷選擇性地施加到電極16。合適的無機氧化物的實例包含氧化鉭、氧化鋁、氧化矽、氧化鉿等。
作為另一個實例，樹脂可以被施加到電極16，並且然後被圖案化。合適的沉積技術包含化學氣相沉積、浸塗、浸泡塗布、旋塗、噴塗、水坑分配(puddle dispensing)、超音波噴塗、刮刀塗布、氣溶膠印刷、網印、微接點印刷等。合適的圖案化技術包含光刻術、納米壓模微影術(NIL)、衝壓技術、壓 花技術、模製技術、微蝕刻技術、印刷技術等。合適的樹脂的一些實例包含基於多面體寡聚倍半矽氧烷樹脂(POSS)的樹脂、非POSS環氧樹脂、聚(乙二醇)樹脂、聚醚樹脂(例如開環環氧樹脂)、丙烯酸樹脂、丙烯酸酯樹脂、甲基丙烯酸酯樹脂、無定形的含氟聚合物樹脂(例如來自Bellex的CYTOP®)、及其等之組合。
如本文所使用的，術語“多面體寡聚倍半矽氧烷”(POSS)是指一種化學組合物，它是二氧化矽(SiO2)和矽酮(R2SiO)之間的混合中間體(例如RSiO1.5)。POSS的實例可以是Kehagias等人Microelectronic Engineering 86(2009)，第776-778頁中所描述的POSS，該文獻通過引用以其整體併入。在一個實例中，組合物是具有化學式[RSiO3/2]n的有機矽化合物，其中R基團可以是相同或不同的。POSS的示例性R基團包含環氧樹脂、疊氮化物/疊氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四
Figure 108145505-A0305-02-0013-13
、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯、或者進一步例如烷基基團、芳基基團、烷氧基基團和/或鹵代烷基基團。本文揭露的樹脂組合物可以包含作為單體單元的一種或更多種不同的籠結構或核心結構。多面體結構可以是T8結構例如：
Figure 108145505-A0305-02-0013-1
，並且由
Figure 108145505-A0305-02-0013-2
表示。此單體單元通常具有八個官能團臂R1至R8。
單體單元可以具有被稱為T10例如：
Figure 108145505-A0305-02-0013-3
的具有10個矽原 子和10個R基團的籠結構，或可以具有被稱為T12例如：
Figure 108145505-A0305-02-0013-5
的具有12個矽 原子和12個R基團的籠結構。基於POSS的材料可以可選擇地包含T6、T14或T16籠結構。平均籠含量(average cage content)可以在合成期間被調整，和/或通過純化方法來控制，並且單體單元的籠尺寸的分佈可以用於本文揭露的實例中。
如圖1B中所示，圖案化材料18包含界定在其中的凹陷部20和將相鄰凹陷部20分隔的間隙區域22。可以設想凹陷部20的許多不同的佈局，包含規則的、重複的和非規則的圖案。在一個實例中，凹陷部20被設置成六邊形網格以用於緊密充填和改進的密度。其他佈局可以包含，例如直線(即矩形)佈局、三角形佈局、等等。在一些實例中，佈局或圖案可以是以行和列的x-y格式的凹陷部20。在一些其他實例中，佈局或圖案可以是凹陷部20和/或間隙區域22的重複佈置。在還其他實例中，佈局或圖案可以是凹陷部20和/或間隙區域22的隨機佈置。圖案可以包含點、墊、孔、柱、條帶、漩渦、線、三角形、矩形、圓形、弧形、棋盤格、方格、對角線、箭頭、正方形和/或交叉影線。
凹陷部20的佈局或圖案可以關於界定區域中凹陷部20的密度(即凹陷部20的數目)來表徵。例如，凹陷部20可以以約200萬每mm2的密度存在。密度可以被調整為不同的密度，包含例如約100每mm2、約1,000每mm2、約10萬每mm2、約100萬每mm2、約200萬每mm2、約500萬每mm2、約1000萬每mm2、約5000萬每mm2或更多或更少的密度。還應理解的是，圖案化材料18中的凹陷部20的密度可以是在選自以上範圍的下限值中的一個和上限值中的一個之間。作為實例，高密度陣列可以被表徵為具有被分隔小於約100nm的凹陷部20，中等密度陣列可以被表徵為具有被分隔約400nm至約1μm的凹陷部20，並且低密度陣列可以被表徵為具有被分隔大於約1μm的凹陷部20。雖然已經提供了示例性密度，但是應當理解，可以使用任何合適的密度。
凹陷部20的佈局或圖案可以也或可選擇地以平均間距來表徵，平均間距即從凹陷部20的中心到相鄰凹陷部20的中心的間距(中心到中心的間 距)，或者從一個凹陷部20的邊緣到相鄰凹陷部20的邊緣的間距(邊緣到邊緣的間距)。圖案可以是規則的，使得圍繞平均間距的變化的係數小，或者圖案可以是非規則的，在這種情況下，變化的係數可以是相對大的。在任一情況下，平均間距可以是例如約50nm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約5μm、約10μm、約100μm、或更多或更少。特定圖案的凹陷部20的平均間距可以是在選自以上範圍的下限值中的一個和上限值中的一個之間。在一個實例中，凹陷部20具有約1.5μm的間距(中心到中心的間距)。雖然已經提供了示例性平均間距值，但是應當理解，可以使用其他平均間距值。
每個凹陷部20的尺寸可以通過其體積、開口面積、深度和/或直徑來表徵。
每個凹陷部20可以具有能夠限制液體的任何體積。最小體積或最大體積可以被選擇，例如以適應針對流動池10的下游使用所預計的吞吐量(例如，多重性)、解析度、分析物組成或分析物反應性。例如，體積可以是至少約1×10-3μm3、約1×10-2μm3、約0.1μm3、約1μm3、約10μm3、約100μm3或更大。可選擇地或另外地，體積可以是至多約1×104μm3、約1×103μm3、約100μm3、約10μm3、約1μm3、約0.1μm3、或更小。
由每個凹陷部開口佔據的面積可以基於與以上針對體積闡述的那些標準相似的標準來選擇。例如，每個凹陷部開口的面積可以是至少約1×10-3μm2、約1×10-2μm2、約0.1μm2、約1μm2、約10μm2、約100μm2、或更大。可選擇地或另外地，面積可以是至多約1×103μm2、約100μm2、約10μm2、約1μm2、約0.1μm2、約1×10-2μm2、或更小。由每個凹陷部開口佔據的面積可以大於以上指定的值、小於以上指定的值、或在以上指定的值之間。
每個凹陷部20的深度可以是至少約0.1μm、至少約0.5μm、至少約1μm、至少約10μm、至少約100μm、或更大。可選擇地或另外地，深度可以 是至多約1×103μm、至多約100μm、至多約10μm、至多約1μm、至多約0.1μm、或更小。在一些實例中，深度是約0.4μm。每個凹陷部20的深度可以大於以上指定的值、小於以上指定的值、或在以上指定的值之間。
在一些實例中，每個凹陷部20的直徑或長度和寬度可以是至少約50nm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約10μm、約100μm、或更大。可選擇地或另外地，直徑或長度和寬度可以是至多約1×103μm、約100μm、約10μm、約1μm、約0.5μm、約0.1μm、或更小(例如，約50nm)。直徑或長度和寬度還可以沿著深度而變化(例如，如圖4A-4C和圖6A-6C中所示)。每個凹陷部20的直徑或長度和寬度可以大於以上指定的值、小於以上指定的值、或在以上指定的值之間。
在圖1B中所示的實例中，在凹陷部20處被暴露的電極16的表面S16被官能化，使得引子24可以附接到表面S16而不是附接到間隙區域22。電極表面S16的官能化將取決於電極的材料和待被附接到其的引子24。
在一些實例中，電極材料可以被固有地官能化，因為引子24包含可以直接附接到未改性電極材料的末端官能團。例如，硫醇封端的引子可以化學地鍵結到金電極表面S16。
在其他實例中，電極表面S16可以被改性以併入能夠結合到引子24的官能團(即，連接分子)。官能團能夠在一端化學地附接到電極表面S16，並且在另一端化學地附接到引子24。例如，硫醇連接子或硫化酸酯連接子或胺連接子可以附接到金電極，並且矽烷連接子(例如疊氮基矽烷)可以附接到ITO電極。雖然已經提供了一些實例，但是應當理解，可以使用其他化學官能團。
無論是直接的還是間接的(例如，通過連接子)，將引子24附接到電極表面S16可以通過共價鍵結、配位鍵結或另一種化學鍵或物理鍵(例如π-π堆疊)，這取決於引子24、任何被使用的連接子、以及電極材料。
因為表面S16被官能團改性或被固有地官能化，並且間隙區域22 不包含引子反應性官能團，所以引子24將附接到表面S16，並且將不附接到間隙區域22。
應當理解，電極官能化可以在圖案化材料18被施加到其之前或之後進行。
在其他實例中，電極表面S16可以用聚合物層官能化，如本文參考圖1C所描述的。
如圖1B中所示，引子24被附接到官能化的電極表面S16。引子24可以是包含官能團的任何正向擴增引子或反向擴增引子，該官能團可以附接到表面S16，直接地附接到電極材料或附接到與其附接的官能團或附接到與其附接的聚合物層。合適的官能團封端的引子的實例包含炔烴封端引子、四
Figure 108145505-A0305-02-0017-14
封端引子、疊氮基封端引子、胺基封端引子、環氧基或縮水甘油基封端引子、硫代磷酸酯封端引子、硫醇封端引子、醛封端引子、肼封端引子、和三唑啉二酮封端引子。還可以使用引子的混合物。合適的引子的具體實例包含P5引子和/或P7引子，它們用於由Illumina Inc.出售的商業流動池的表面上，以用於在HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NEXTSEQTM、NEXTSEQDXTM、NOVASEQTM、GENOME ANALYZERTM、和其他儀器平臺上定序。
在一個實例中，引子24可以使用接枝程序來附接，例如流過沉積(例如，當流動池10具有與其結合的蓋子時)、浸泡塗布、噴塗、水坑分配，或係藉由會附接引子24的另一種合適的方法來附接。這些示例性技術中的每一種可以利用引子溶液或可以包含引子、水、緩衝液(例如鹽溶液)和催化劑的混合物。
現在參考圖1C，流動池10包含基底14和位於基底14上的圖案化電極26。在此實例中，圖案化電極26界定由間隙區域22分隔的凹陷部18。在此 實例中，基底14的官能化表面S14在凹陷部18中的每一個處被暴露，並且引子24被接枝到官能化表面S14。
圖1C中的基底14為流動池10的其他部件提供支撐。基底14可以是本文描述的任何實例。
在圖1C中，圖案化電極26位於基底12上。圖案化電極26可以是針對電極16提到的任何電極材料。在此實例中，圖案化電極26可以是例如使用粘合劑附接到基底14的預成型網格，或者可以使用合適的沉積技術以所欲的圖案沉積在基底14上。
在圖1C中所示的實例中，圖案化電極26包含界定在其中的凹陷部20和將相鄰凹陷部20分隔的間隙區域22。本文針對圖1B中的凹陷部20所闡述的任何圖案、佈局和尺寸可以用於圖1C中所示的凹陷部20。
同樣在圖1C中所示的實例中，在凹陷部20處被暴露的基底14的表面S14被官能化，使得引子24可以附接到表面S14而不是附接到圖案化電極26的間隙區域22。
在一些實例中，將基底表面S14官能化涉及將在凹陷部20處被暴露的表面S14矽烷化，並在矽烷化的表面上形成聚合物層。可以使用任何矽烷或矽烷衍生物來完成矽烷化。示例性矽烷或矽烷衍生物包含降冰片烯矽烷、降冰片烯衍生物(例如，[(5-雙環[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基矽烷)、環辛炔、環辛炔衍生物、或另一種合適的矽烷。用於附接矽烷或矽烷衍生物的方法可以取決於正被使用的矽烷或矽烷衍生物而變化。合適的矽烷化方法的實例包含氣相沉積(例如，YES方法)、旋塗、或其他沉積方法。
然後可以將聚合物(未示出)施加到矽烷化的表面。聚合物可以是對液體和氣體是可滲透的半剛性聚合物材料。聚合物的實例包含丙烯醯胺共聚物，例如聚(N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺-共-丙烯醯胺，PAZAM。 PAZAM和一些其它形式的丙烯醯胺共聚物由以下結構(I)表示：
Figure 108145505-A0305-02-0019-6
 其中：RA選自由以下組成的組：疊氮基、視需要被取代的胺基、視需要被取代的烯基、視需要被取代的腙、視需要被取代的肼、羧基、羥基、視需要被取代的四唑、視需要被取代的四
Figure 108145505-A0305-02-0019-15
、腈氧化物、硝酮和硫醇；RB是H或視需要被取代的烷基；RC、RD和RE各自獨立地選自由H和視需要被取代的烷基組成的組；-(CH2)p-中的每一個可以視需要被取代；p是在1至50的範圍內的整數；n是在1至50,000的範圍內的整數；並且m是在1至100,000的範圍內的整數。
所屬技術領域中具有通常知識者將認識到，結構(I)中重複出現的“n”和“m”特徵的佈置是代表性的，並且單體次單元可以以任何順序存在於聚合物結構中(例如，隨機的、嵌段的、圖案化的、或它們的組合)。
PAZAM的分子量可以在從約10kDa至約1500kDa的範圍內，或者在特定的實例中可以是約312kDa。在一些實例中，PAZAM是線性聚合物。在其他一些實例中，PAZAM是輕度交聯的聚合物。
在其他實例中，聚合物可以是結構(I)的變體。在一個實例中，丙 烯醯胺單元可以被N,N-二甲基丙烯醯胺(
Figure 108145505-A0305-02-0020-7
)代替。在該實例中，結構(I) 中的丙烯醯胺單元可以被
Figure 108145505-A0305-02-0020-8
代替，其中RD、RE和RF各自是H或C1-C6烷基，並且RG和RH各自是C1-C6烷基(而不是如丙烯醯胺情況下的H)。在此實例中，q可以是在1至100,000範圍內的整數。在另一個實例中，除了丙烯醯胺單元之外，還可以使用N,N-二甲基丙烯醯胺。在此實例中，除了重複的“n”和“m” 特徵之外，結構(I)可以包含
Figure 108145505-A0305-02-0020-10
，其中RD、RE和RF各自是H或C1-C6烷基，並且RG和RH各自是C1-C6烷基。在此實例中，q可以是在1至100,000範圍內的整數。
應當理解，可以使用其它分子來形成聚合物，只要它們被官能化以與活化表面S14和隨後施加的引子24相互作用。合適的聚合物的其他實例包含具有膠體結構的聚合物，例如瓊脂糖；或具有聚合物網狀結構的聚合物，例如明膠；或具有交聯的聚合物結構的聚合物，例如聚丙烯醯胺聚合物和共聚物、無矽烷丙烯醯胺(SFA)或疊氮化形式的SFA。合適的聚丙烯醯胺聚合物的實例可以從丙烯醯胺和丙烯酸或包含乙烯基基團的丙烯酸合成，或者從形成[2+2]光環加成反應的單體合成。合適的聚合物26的還其他實例包含丙烯醯胺和丙烯酸酯的混合共聚物。
聚合物(例如PAZAM)可以使用旋塗、或者浸塗(dipping coating)或浸塗(dip coating)、或者官能化分子在正壓或負壓下的流動、或者另一種合適的技術來沉積。聚合物可以存在於混合物中。在一個實例中，混合物包含水 中的PAZAM或在乙醇和水的混合物中的PAZAM。
在被塗布之後，包含聚合物的混合物還可以暴露於固化程序，以跨圖案化電極26的間隙區域22和在凹陷部20中形成聚合物。在一個實例中，固化可以在從室溫(例如，約25℃)至約95℃範圍內的溫度發生持續在從約1毫秒至約幾天範圍內的時間。在另一個實例中，時間可以在從10秒至至少24小時的範圍內。在又一個實例中，時間可以在從約5分鐘至約2小時的範圍內。
將聚合物20附接到矽烷化表面S14可以是通過共價鍵結。共價連接有助於在多種用途期間在最終形成的流動池10的整個壽命中將至少引子24保持在凹陷部20中。以下是可以在活化(例如矽烷化)表面和聚合物之間發生的反應的一些實例。
當矽烷或矽烷衍生物包含降冰片烯或降冰片烯衍生物作為不飽和部分時，降冰片烯或降冰片烯衍生物可以：i)與PAZAM的疊氮化物/疊氮基基團經歷1,3-偶極環加成反應；ii)與附接到PAZAM的四
Figure 108145505-A0305-02-0021-16
基團經歷偶聯反應；與附接到PAZAM的腙基團經歷環加成反應；與附接到PAZAM的四唑基團經歷光點擊反應(photo-click reaction)；或者與附接到PAZAM的腈氧化物基團經歷環加成。
當矽烷或矽烷衍生物包含環辛炔或環辛炔衍生物作為不飽和部分時，環辛炔或環辛炔衍生物可以：i)與PAZAM的疊氮化物/疊氮基經歷應變促進的疊氮化物-炔1,3-環加成(SPAAC)反應，或ii)與附接到PAZAM的腈氧化物基團經歷應變促進的炔-腈氧化物環加成反應。
當矽烷或矽烷衍生物包含雙環壬炔作為不飽和部分時，由於雙環體系的應變，雙環壬炔可以與附接到PAZAM的疊氮化合物或腈氧化物經歷類似的SPAAC炔環加成。
在其他實例中，電漿灰化而不是矽烷化可以用於在凹陷部20中將 基底14的暴露表面S14官能化。在電漿灰化之後，包含聚合物的混合物可以直接旋塗(或否則沉積)在電漿灰化的表面上，並且然後固化以形成聚合物。在此實例中，電漿灰化可以產生表面活化劑(例如-OH基團)，表面活化劑可以將聚合物粘附到間隙區域22和凹陷部20中基底14的暴露表面S14。在這些實例中，聚合物被選擇成使得其與由電漿灰化產生的表面基團反應。
無論是使用矽烷化還是電漿灰化，然後可以進行拋光，以便從圖案化電極26的間隙區域22中除去聚合物。在一些實例中，拋光可以除去或可以不亦除去鄰近間隙區域22的矽烷或矽烷衍生物。當這些矽烷化部分被完全除去時，應當理解，下面的圖案化電極26被暴露。
拋光程序可以用溫和的化學漿料(包含例如研磨劑、緩衝液、螯合劑、表面活性劑和/或分散劑)來進行，該漿料可以從間隙區域22中除去薄聚合物，並且在一些情況下除去矽烷或矽烷衍生物的至少一部分，而不有害地影響那些區域處的下面的圖案化電極26。可選擇地，拋光可以用不包含研磨顆粒的溶液來進行。
化學漿料可以用於化學機械拋光系統中，以拋光間隙區域22的表面。拋光頭/拋光墊或其他拋光工具能夠從間隙區域22中拋光聚合物，同時將聚合物留在凹陷部20中。作為實例，拋光頭可以是Strasbaugh ViPRR II拋光頭。
清潔和乾燥程序可以在拋光之後進行。清潔程序可以利用水浴和音波處理。水浴可以保持在從約22℃至約30℃範圍內的相對低的溫度。乾燥程序可以包含旋轉乾燥，或經由另一種合適的技術的乾燥。
應當理解，還可以使用其他化學品和/或程序來官能化基底表面S14，為引子24附接做準備。
如圖1C中所示，引子24被附接到官能化的基底表面S14。本文揭露的任何引子24和用於接枝引子24的任何方法可以用於圖1C中所示的實例中， 只要引子24可以附接到基底表面S14處的官能團(例如，聚合物的官能團)。
流動池10包含根據圖1B中描述的結構或者根據圖1C中描述的結構的凹陷部20的陣列。在圖3中描繪對應於圖1B中所示的結構的陣列52，並且在圖5中描繪對應於圖1C中所示的結構的陣列52’。包含陣列52或52’的流動池10可以用於通過電化學發光產生被光學地偵測的螢光信號的定序工作流程。將參照圖4A至圖4C和圖6A至圖6C描述這些工作流程的實例。
在定序之前，可以使用引子24在流動池表面上形成待被定序的模板多核苷酸鏈40。在模板多核苷酸鏈形成的開始，文庫模板可以由任何核酸樣品(例如，DNA樣品或RNA樣品)製備。核酸樣品可以被片段化為單股的、相似尺寸(例如，<1000bp)的DNA片段或RNA片段。在製備期間，轉接子可以被添加至這些片段的末端。通過減少的循環擴增，不同基序可以被引入轉接子中，諸如定序結合位點、索引(indice)和與凹陷部20中的引子24互補的區域。最終的文庫模板包含DNA片段或RNA片段和在兩個末端處的轉接子。在一些實例中，來自單個核酸樣品的片段具有添加至其的相同的轉接子。
多個文庫模板可以被引入流動池10。因為流動池10包含凹陷部20的陣列52或52’，所以多個文庫模板與例如固定在凹陷部20中的每一個中在電極表面S16或基底表面S14上的兩種類型的引子24中的一種雜交。
然後，可以進行簇生成(Cluster generation)。在簇生成的一個實例中，使用高保真的DNA聚合酶通過3’延伸從雜交引子24複製文庫模板。使原始文庫模板變性，留下副本固定在凹陷部20中。等溫橋擴增或一些其他形式的擴增可以用於擴增固定的副本。例如，複製的模板形成環以與相鄰的互補引子24雜交，並且聚合酶將複製的模板複製以形成雙股橋，雙股橋被變性以形成兩條單股。這兩條股形成環並且與相鄰的互補引子24雜交，並且再次延伸以形成兩條新的雙股環。通過等溫變性和擴增的循環在每個模板副本上重複該過程， 以產生密集的殖株簇。雙股橋的每個簇被變性。在一個實例中，反向股通過特定的鹼基切出被除去，留下正向模板多核苷酸股。雖然在圖4A-圖4C和圖6A-圖6C中凹陷部20中示出了單個模板多核苷酸鏈40，但是應當理解，聚簇導致在每個凹陷部20中形成幾個模板多核苷酸鏈40。聚簇的此實例是橋擴增，並且是可以進行的擴增的一個實例。應當理解，可以使用其他擴增技術，例如排除擴增(Examp)工作流程(Illumina Inc.)。
在定序期間，使用電化學發光產生螢光信號。因此，在定序期間引入流動池10的核苷酸中的至少一些是包含電化學發光標記物的被標記的核苷酸。被標記的核苷酸28A、28B、28C的實例在圖2中示出。被標記的核苷酸28A、28B、28C中的每一個包含具有3’OH保護基32A、32B、32C的核苷酸30；附接到核苷酸30的鹼基或糖的連接分子34；以及附接到連接分子34的電化學發光標記物36。
核苷酸30包含含氮雜環鹼基、糖和一個或更多個磷酸酯基團。核苷酸30是核酸序列的單體單元。在RNA中，糖是核糖，並且在DNA中，糖是脫氧核糖，即缺少存在於核糖中的2’位置處的羥基基團的糖。含氮雜環鹼基(即核鹼基)可以是嘌呤鹼基或嘧啶鹼基。嘌呤鹼基包含腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)及其等之修飾的衍生物或類似物。嘧啶鹼基包含胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)及其等之修飾的衍生物或類似物。核糖或脫氧核糖的C-1原子鍵結至嘧啶的N-1或嘌呤的N-9。核苷酸30可以是單磷酸酯或包含幾個磷酸酯基團的多磷酸酯形式(例如三磷酸酯(即γ磷酸酯)、四磷酸酯、五磷酸酯、六磷酸酯等)。核酸類似物可以具有改變的磷酸酯骨架、糖或核鹼基中的任一種。核酸類似物的實例包含例如通用鹼基或磷酸酯-糖骨架類似物，例如肽核酸(PNA)。在圖2中，核苷酸30的鹼基是胞嘧啶，糖是脫氧核糖，並且磷酸酯是三磷酸酯或γ磷酸酯。
在本文揭露的實例中，核苷酸30具有附接至其的3’OH保護基32A、32B、32C。3’OH保護基32A、32B、32C可以附接到核苷酸30中的糖分子的氧原子。3’OH保護基32A、32B、32C可以是僅允許在每個定序循環中發生單個鹼基併入的可逆終止子(如將參考圖4A-圖4C和圖6A-圖6C進一步討論)。可逆終止子阻止進一步的鹼基併入與模板多核苷酸鏈40互補的新生股中。這使得能夠偵測和識別單個併入的鹼基。3’OH保護基32A、32B、32C隨後可以被除去，使得能夠在每個模板多核苷酸鏈40處發生另外的定序循環。在圖2中示出不同的3’OH保護基32A、32B、32C的實例，其包含3’-ONH2可逆終止子(在32A處示出)、3’-O-烯丙基可逆終止子(即，-CH=CHCH2，在32B處示出)和3’-O-疊氮基甲基可逆終止子(即，-CH2N3，在32C處示出)。其他合適的可逆終止子包含鄰硝基苄基醚、鄰硝基苄基碳酸烷基酯、酯部分、其他烯丙基部分、縮醛(例如叔丁氧基乙氧基)、MOM(-CH2OCH3)部分、2,4-二硝基苯氧硫基(2,4-dinitrobenzene sulfenyl)、四氫呋喃醚、3’磷酸酯、醚、-F、-H2、-OCH3、-N3、-HCOCH3和2-硝基苯碳酸酯。
連接分子34附接到核苷酸30的嘌呤鹼基或嘧啶鹼基。在一些實例中，連接分子34包含由圖2中的箭頭(例如箭頭38)標識的切裂位點。合適的連接分子34的一些實例在圖2中示出，儘管應當理解，可以使用可以將電化學發光標記物36附接到核苷酸的鹼基或糖的任何合適的可切出的連接子。在其他實例中，連接分子34是不可切出的。當使用單通道偵測並且使用ECL標記物36的切裂化學來區分併入的核苷酸鹼基時，這種類型的連接分子34可以是所欲的。
電化學發光(ECL)標記物36被附接到連接分子34。可以附接到連接分子34並且可以在流體(例如水溶液)中呈現出電化學發光的任何化合物可以用作ECl標記物36。
一些ECL標記物36經歷自猝滅(self-annihilation)，由此標記物36 響應於從正掃到負的電位而直接產生激發態。這種類型的標記物的一個實例是氯丙
Figure 108145505-A0305-02-0026-17
。這種類型的標記物36不需要共反應物來產生ECL發射。
其他ECL標記物36可以被分類為陽極ECL化合物或陰極ECL化合物，這取決於它們分別是通過氧化還是通過還原被活化。
陽極ECL加標簽的核苷酸在所施加的正電位下被氧化，這產生自由基陽離子，自由基陽離子然後可以與共反應物(在此實例中，還原劑)進行電子轉移反應，以形成中性激發態，該激發態是發射性的。陽極ECL標記物36的實例包含三(2,2’-聯吡啶)釕(II)、2-噻蒽甲酸、9,10-二苯基蒽-2-磺酸鈉(DPAS)，它們的結構分別在以下示出：
Figure 108145505-A0305-02-0026-11
 陽極ECL標簽的合適的還原劑共反應物包含脂肪族胺，例如三烷基胺(例如三正丙胺)和草酸酯。
陰極ECL加標簽的核苷酸在所施加的負電位下被還原，這產生自由基陰離子，自由基陰離子然後可以與共反應物(在此實例中，氧化劑)進行電子轉移反應，以形成中性激發態，該激發態是發射性的。陰極ECL標記物36的實例包含3,4,9,10-苝四甲酸二酐和內消旋-四(4-磺酸根基苯基)卟啉 (meso-tetra(4-sulfonatophenyl)porphyrin)，它們的結構分別在以下示出：
Figure 108145505-A0305-02-0027-12
 陰極ECL標簽的合適的共反應物包含過氧二硫酸根(S2O8 2-)(例如，過氧二硫酸鉀)。當用過氧二硫酸鉀作為共反應物施加適當的負電位時，9,10-二苯基蒽-2-磺酸鈉(DPAS)(以上作為陽極ECL標記物示出)還可以用作陰極ECL標記物36。
雖然已經提供了幾種示例性ECL標記物36和共反應物，但是應當理解，可以使用其他ECL標記物36和共反應物。
現在將參照圖4A-圖4C和圖6A-圖6C來描述用於使用被標記的核苷酸28A、28B、28C和光學偵測進行定序的方法。圖4A-圖4C描繪了使用圖1B的流動池結構和圖3的陣列52的方法，並且圖6A-圖6C描繪了使用圖1C的流動池結構和圖5的陣列52’的方法。
在定序循環之前，可以封阻模板多核苷酸鏈/股40的3’-末端和任何流動池結合的引子24(未附接到模板多核苷酸鏈/股40)，以防止干擾定序反應，並且特別是防止非所欲的啟動(priming)。
如圖4A和圖6A中所示，可以將定序引子53引入流動池10，其中定序引子53將與模板多核苷酸鏈40的轉接子上的互補序列雜交。這致使模板多 核苷酸鏈40準備好用於定序。
定序方法包含將包含聚合酶42和核苷酸(例如被標記的核苷酸28)的流體(例如水溶液)引入流動池10，流動池10包含電極16或26，電極16或26部分地界定凹陷部20，凹陷部20包含附接在其中的模板多核苷酸鏈40，其中核苷酸中的至少一些是如本文所描述的被標記的核苷酸28。可以使用任何高持續力或低持續力的聚合酶42。一些實例包含Phi29、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)(Bst)和Klenow片段(KF)，儘管可以使用其它者。除了聚合酶42和被標記的核苷酸28之外，流體還可以包含水、緩衝液、未被標記的核苷酸、等等。示例性緩衝液包含Tris緩衝液、鹽水-檸檬酸鈉(SSC)緩衝液、硫酸銨緩衝液、磷酸鹽緩衝液、等等。在一些實例中，緩衝液可以是另一種鹽陽離子，例如鉀、鎂、錳、或其他。
核苷酸中的一個通過相應的聚合酶42併入延伸定序引子53並且與模板多核苷酸鏈40互補的新生股中。換句話說，在遍及流動池10的每個模板多核苷酸鏈40處，相應的聚合酶42通過溶液中的核苷酸中的一個(標記的或未標記的)延伸雜交的定序引子53。溶液中的核苷酸作為單個單獨的分子存在，並且因此自然競爭使併入偏差(incorporation bias)最小化。在圖4B和圖6B中，併入的核苷酸是ECL被標記的核苷酸28。
在本文揭露的實例中，被標記的核苷酸28和任何未被標記的核苷酸兩者均包含可逆終止子。因此，將被標記的核苷酸28或未被標記的核苷酸併入新生股中充當用於聚合的終止子。這使得能夠發生電化學信號產生和偵測。
在併入之後，包含任何未併入的核苷酸的流體可以從流動池10中除去。這可以使用洗滌溶液(例如水)來實現。
在併入和除去任何未併入的核苷酸之後，該方法包含向電極16(圖4B-圖4C)或向圖案化電極26(圖6B-圖6C)施加電位，並偵測響應於所施 加的電位的光學發射54(圖4C和圖6C)。施加到電極16或圖案化電極26的電位足以驅動任何鹼基被併入新生股的被標記的核苷酸28的ECL反應。在一些實例中，可以依次施加一系列不同的電位，以便驅動不同ECL標記物36的ECL反應。
在一些實例中，電位從正掃向負，這直接產生ECL標記物36的激發態，導致光學發射54。
在其他實例中，共反應物與聚合酶42和核苷酸一起被引入流體中。在這些實例中，所施加的電位引發氧化還原反應路徑，該氧化還原反應路徑涉及標記物36和共反應物。作為實例，所施加的電位可以引發ECL標記物36的電化學氧化或電化學還原以產生自由基離子，然後自由基離子被共反應物還原或氧化以形成激發態。激發態產生光學發射54。
在還其他的實例中，氧化還原梭(redox shuttle)可以與共反應物一起添加。氧化還原梭可以通過流體將電荷移動到活性物質或從活性物質移出電荷。氧化還原梭可以擴散到電極表面S16或由圖案化電極26界定的凹陷部壁，並且變得被氧化或還原。氧化或還原的氧化還原梭然後可以擴散到ECL標記物36並與ECL標記物36反應，以形成氧化或還原的ECL標記物。氧化或還原的ECL標記物然後將需要與共反應物反應以形成發射態。當標記物36不與電極16或26直接物理接觸時，氧化還原梭可以使ECL標記物36能夠經歷氧化還原事件。
在圖4C和圖6C中所示的實例中，使用照相機將光學發射54成像以捕獲發射顏色。
然後可以將去保護劑引入流動池10中。去保護劑可以能夠：i)從併入的被標記的核苷酸28中切出任何可切出的連接分子34(這也除去了ECL標記物36)，和ii)從併入的被標記的核苷酸28中除去3’OH保護基32A、32B、32C(參見圖2)。應當理解，當未被標記的核苷酸(其不包含附接至其的ECL標記物36)被併入新生股中時，去保護劑從未被標記的核苷酸中除去3’OH保護基32A、 32B、32C。在任一實例中，3’OH保護基32A、32B、32C的除去使得能夠進行隨後的定序循環。3’OH保護基和合適的去保護劑的實例包含：可以被光解地除去的鄰硝基苄基醚和鄰硝基苄基碳酸烷基酯；可以通過鹼水解除去的酯部分；可以用NaI、氯三甲基矽烷和Na2S2O3或用在丙酮/水中的Hg(II)除去的烯丙基部分；可以被膦裂解的疊氮基甲基，例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羥丙基)膦(THP)；可以用酸性條件裂解的縮醛，例如叔丁氧基乙氧基；可以被LiBF4和CH3CN/H2O裂解的MOM(-CH2OCH3)部分；可以被親核試劑例如苯硫酚和硫代硫酸鹽裂解的2,4-二硝基苯烴硫基；可以被Ag(I)或Hg(II)裂解的四氫呋喃醚；以及可以通過磷酸酶(例如多核苷酸激酶)裂解的3’磷酸酯。其他有用的可逆部分包含醚、-F、-H2、-OCH3、-N3、-HCOCH3和2-硝基苯碳酸酯，並且有用的去封阻處理包含用光輻照(例如，以誘導光裂解)、加熱、暴露於化學反應物、暴露於催化劑、暴露於電流(例如，以誘導電解)、或類似者。
為了便於說明和理解，圖4A-圖4C和圖6A-圖6C示出了涉及單個模板多核苷酸鏈40和將單個被標記的核苷酸28併入與模板多核苷酸鏈40互補形成的新生股中的單個定序循環。然而，應當理解，每個凹陷部20包含幾個(例如，至多達幾百萬個)模板多核苷酸鏈40(擴增子)，並且單個鹼基併入可以同時在每個凹陷部20中的每個模板多核苷酸鏈40處發生。成像將捕獲由各種併入事件和所施加的電位產生的光學發射54，並且可以從圖像中識別相應地併入的鹼基。捕獲的圖像可以用圖像分析軟體來處理，以確定哪些核苷酸被併入遍及流動池的每個簇位置處。
在本文揭露的實例中，ECL標記物36可以具有特定的發射光譜、特定的氧化電位或還原電位、特定的發射壽命、特定的發射強度、和/或特定的切裂化學。這些獨特的特性使得能夠例如通過它們相應的(和有區別的)發射、通過用於引發氧化或還原的相應的(和有區別的)電位、通過它們相應的(和 有區別的)發射壽命和/或通過特定切裂活性的存在或不存在來識別不同的ECL標記物36。在一個實例中，任何一個ECL標記物36的相應的且有區別的發射、電位、發射壽命、和/或切裂活性不同於用於多個被標記的核苷酸26的任何其他ECL標記物36的發射、電位、發射壽命、和/或切裂活性。因此，具有這些獨特特性中的一個或更多個的特定ECL標記物36可以偶聯到特定的核苷酸鹼基(例如，A、T、C和G)。當在定序期間將被標記的核苷酸28A、28B、28C併入新生股中時，ECL標記物36的獨特特性可以被偵測並且然後用於識別併入的鹼基。
對於一個實例，具有四種不同的發射光譜(即，四種不同的波長帶中的發射)的四種不同的ECL標記物可以分別附接到四種核苷酸鹼基(A、T、C和G)。在定序循環中進行成像期間，使用四種不同的波長帶的四種有區別的圖像可以被捕獲和處理，以識別哪些核苷酸已經被併入。
對於另一個實例，具有三種不同的發射光譜(即，在三種不同的波長帶中的發射)的三種不同的ECL標記物可以分別附接到三種核苷酸鹼基A、T、和C，並且核苷酸鹼基G可以保持天然(即，未標記)。在定序循環中進行成像期間，使用三種不同的波長帶的三種有區別的圖像可以被捕獲和處理，以識別哪些核苷酸已經被併入。在圖像中，無發射(即暗響應)使得能夠識別第四核苷酸鹼基。
對於又一個實例，具有四種不同的氧化電位或還原電位的四種不同的ECL標記物36可以分別附接到四種核苷酸鹼基A、T、C和G。在定序循環期間，用於引發特定發射的氧化電位或還原電位可以用特定圖像記錄。四種鹼基的識別可以通過將發射與引發發射的所施加的氧化電位或還原電位相關聯來實現。在此實例中，發射可以在相同的光學通道中，因為引起發射的氧化電位或還原電位將用於區分信號。
在另一個實例中，具有四種不同的發射壽命的四種不同的ECL 標記物可以分別附接到四種核苷酸鹼基A、T、C和G。在成像期間，可以記錄不同的發射壽命。該數據使得能夠識別四種不同的核苷酸鹼基中的任何一種或更多種。
在又另一個實例中，具有四種不同的發射強度的四種不同的ECL標記物可以分別附接到四種核苷酸鹼基A、T、C和G。在成像期間，可以記錄不同的發射強度。該數據使得能夠識別四種不同的核苷酸鹼基中的任何一種或更多種。在另一個實例中，具有三種不同的發射強度的三種不同的ECL標記物可以分別附接到三種核苷酸鹼基A、T和C，並且核苷酸鹼基G可以保持天然(例如，未標記)。
對於又一個實例，相同類型的ECL標記物36可以與具有不同的切裂化學的連接分子34偶聯。在此實例中，在流體中可以使用四種不同的核苷酸。在一個實例中，流體包含：第一被標記的核苷酸28A、28B、28C，第一被標記的核苷酸28A、28B、28C包含附接到ECL標記物36的可切裂的連接分子34；第二被標記的核苷酸28A、28B、28C，第二被標記的核苷酸28A、28B、28C包含附接到ECL標記物36的不可切裂的連接分子34；第三未被標記的核苷酸，其具有3’OH保護基並包含能夠附接到ECL標記物36的連接分子34；以及具有3’OH保護基的第四未被標記的核苷酸。因為一ECL標記物36(在相同的電位被活化並且在一個通道中發射)被附接到或可附接到溶液中的幾個核苷酸，所以每個定序循環使用兩個化學步驟、兩種電極電位施加和兩個成像步驟。在此實例中，在第一化學步驟中添加第一至第四不同的核苷酸，施加ECL標記物36的氧化電位或還原電位，並拍攝圖像；並且然後在第二化學步驟中添加新試劑，該步驟從第一被標記的核苷酸中除去ECL標記物36並且將ECL標記物36添加到第三未被標記的核苷酸，再次施加ECL標記物36的氧化電位或還原電位，並拍攝另一圖像。在此實例中，第一被標記的核苷酸只在第一圖像中成像，因為其ECL標記物36在拍 攝第二圖像之前被除去；第二被標記的核苷酸在第一圖像和第二圖像兩者中均成像，這是因為其ECL標記物36被永久地附接；第三未被標記的核苷酸只在第二圖像中成像，因為ECL標記物36在拍攝第一圖像之後引入並附接；並且第四未被標記的核苷酸是永久暗的，因為它不包含ECL標記物36或不具有引入其的ECL標記物36。在此實例中，通過分析兩個圖像中每個鹼基的不同發射模式來識別不同的核苷酸。
可以重複定序循環以確定模板多核苷酸鏈40中的鹼基序列，一次一個鹼基。
雖然已經描述了電化學地產生的信號的光學偵測，但是應當理解，圖1B和圖1C中所示的流動池結構的實例也可以與互補金屬氧化物半導體(CMOS)集成，使得ECL產生的螢光信號(光學發射54)被電偵測。圖7示出了集成有CMOS(偵測裝置44)的圖1B中所示的流動池結構，並且圖8示出了集成有CMOS(偵測裝置44)的圖1C中所示的流動池結構。
在圖7中所示的示例性流動池10’中，電極16是透明的；基底14是透明的；並且偵測裝置44(例如，CMOS)與基底14接觸。偵測裝置44包含與凹陷部20中的每一個可操作地相關聯的相應的光二極體50；和電連接到相應的光二極體50的裝置電路。
在圖8中所示的示例性流動池10’中，基底14是透明的；並且偵測裝置44(例如，CMOS)與基底14接觸。偵測裝置44包含與凹陷部20中的每一個可操作地相關聯的相應的光二極體50；和電連接到相應的光二極體50的裝置電路。
在圖7和圖8中所示的實例中，術語“透明”意指透明電極和/或透明基底允許光學發射54從其穿過。此外，透明基底可以類似於CMOS裝置中的鈍化層。
這些實例中的偵測裝置44是包含多個堆疊層的CMOS裝置，這些堆疊層包含例如矽層、介電層、金屬介電層、金屬層等。堆疊層構成偵測電路。偵測裝置44可以包含可以傳導電流的互連的導電元件(例如，導體、跡線、通孔、互連件等)。該電路可以被配置成用於選擇性地傳輸基於偵測到的光子的數據信號。該電路還可以被配置成用於信號擴增、數位化、存儲和/或處理。該電路可以收集並分析偵測到的光學發射54，並且產生用於通信偵測數據的數據信號。該電路還可以在偵測裝置44中進行另外的類比信號處理和/或數位信號處理。
偵測裝置44還包含光學部件，例如光二極體50(或其他光學感測器)和光學波導48。在圖7和圖8中所示的實例中，光學部件被佈置成使得每個光二極體50至少實質上與單個光學波導48和單個凹陷部20對準，並且因此與單個光學波導48和單個凹陷部20可操作地相關聯。
如本文所使用的，光二極體50可以是包含一像素或多於一像素的光感測器。作為實例，每個光二極體50可以具有小於約50μm2的偵測面積。作為另一個實例，偵測面積可以小於約10μm2。作為又一個實例，偵測面積可以小於約2μm2。在後一實例中，光二極體50可以構成單一像素。光二極體50的每像素的平均讀取雜訊可以例如小於約150個電子。在其他實例中，讀取雜訊可以小於約5個電子。光學傳測器18的解析度可以大於約0.5百萬像素(Mpixels)。在其他實例中，解析度可以大於約5百萬像素，或大於約1千萬像素。
此外，如本文所使用的，單個光學波導48可以是光導，光導包含允許光學發射54從其穿過朝向對應的光二極體50傳播的材料。因為本文揭露的方法電化學地產生光學發射54，所以光學波導48中的材料不需要是激發光的濾光器。合適的光導材料的實例是氧化物。光導材料可以被有助於形成光導結構的介電材料或金屬材料包圍。
對於圖7和圖8中所示的流動池10’，定序方法可以如本文參考圖 4A-圖4C和圖6A-圖6B所描述來進行。偵測裝置44也是固態成像器，並且因此可以根據本文揭露的實例成像光學發射54。此外，光學發射54由偵測裝置44的光二極體50偵測。光二極體50可以偵測光學發射54的光子，並將這些信號轉換成電信號(例如，電流或電壓)。電信號與各種ECL標記物36的光學發射相關，並且因此可以用於識別單個鹼基併入事件。
雖然在圖7和圖8中未示出，但是應當理解，流動池10’可以包含兩個控制器，使得光學發射54的電化學產生與光學發射54的感測正交。換句話說，施加到電極16或圖案化電極26的電位可以與偵測裝置44的電路分開地控制。
還應注意，圖7和圖8中示出了蓋子46。蓋子46可以用於本文揭露的任何實例中，以產生流動池10、10’的流動通道12。在圖1A和圖3至圖6C中所示的實例中，蓋子46可以是透明材料，使得光學發射54可以被偵測器接收。在圖7和圖8中，蓋子46可以由任何材料製成，因為沒有激發源，並且光學發射54通過偵測裝置44被引導到光二極體50。
本文揭露的實例電化學地產生獨特且可區分的信號，並且從而消除了對激發源的需求。這簡化了可以與本文揭露的流動池10、10’一起使用的整個定序系統。
在整個說明書中對“一個實例”、“另一個實例”、“實例”、等等的提及意指關於該實例描述的特定要素(例如，特徵、結構、和/或特性)被包含在本文描述的至少一個實例中，並且可以存在於其他實例中或可以不存在於其他實例中。此外，應該理解，用於任何實例的所描述的要素可以在各種實例中以任何合適的方式組合，除非上下文清楚地另有規定。
在包含申請專利範圍的整個本文之揭露內容中使用的術語“實質上”和“約”用於描述並考慮到諸如由於處理中的變化而引起的小波動。例如，它們可以是指小於或等於±5%，諸如小於或等於±2%，諸如小於或等於±1%，諸如 小於或等於±0.5%，諸如小於或等於±0.2%，諸如小於或等於±0.1%，諸如小於或等於±0.05%。
此外，應該理解的是，本文提供的範圍包含所陳述的範圍和所陳述的範圍內的任何值或子範圍，如同它們被明確地敘述一樣。例如，由從約2mm至約300mm表示的範圍應被解釋為不僅包含明確敘述的從約2mm至約300mm的限值，還包含單個值例如約5mm、222.5mm、275mm等，以及子範圍例如從約150mm至約180mm等。
雖然已經詳細地描述了幾個實例，但是應該理解，可以修改所揭露的實例。因此，前述描述應被認為是非限制性的。
10:流動池
12:流動通道
14:基底/撐體
16:電極
18:圖案化材料
20:凹陷部
22:間隙區域
24:引子
26:圖案化電極
S14:表面
S16:表面

Claims (27)

  1. 一種流動池，其包含：基底；電極，所述電極位於所述基底上；圖案化材料，所述圖案化材料位於所述電極上且包含由間隙區域分隔的凹陷部；所述電極的官能化表面，所述官能化表面在所述凹陷部中的每一個處被暴露；以及引子，所述引子在所述凹陷部中的每一個中被接枝到所述官能化表面。
  2. 如請求項1所述的流動池，其中：所述電極包含金，並且所述官能化表面包含硫醇連接子或胺連接子；或者所述電極包含氧化銦錫，並且所述官能化表面包含矽烷連接子。
  3. 如請求項1所述的流動池，其中：所述電極是透明的；所述基底是透明的；並且所述流動池還包含：與所述基底接觸的偵測裝置，所述偵測裝置包含：與所述凹陷部中的每一個可操作地相關聯的相應的光二極體；以及電連接到所述相應的光二極體的裝置電路。
  4. 一種定序套組，其包含：如請求項1所述的流動池；以及待引入所述流動池中的被標記的核苷酸，每個被標記的核苷酸包含：具有3’OH保護基的核苷酸；附接到所述核苷酸的鹼基或糖的連接分子；以及附接到所述連接分子的電化學發光標記物。
  5. 如請求項4所述的定序套組，其中所述被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中所述至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的發射光譜。
  6. 如請求項4所述的定序套組，其中所述被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中所述至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的氧化電位或還原電位。
  7. 如請求項4所述的定序套組，其中所述被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中所述至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的電化學發光發射壽命。
  8. 如請求項4所述的定序套組，其中所述被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中所述至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的電化學發光發射強度。
  9. 一種流動池，其包含：基底；圖案化電極，所述圖案化電極位於所述基底上且包含由間隙區域分隔的凹陷部；所述基底的官能化表面，所述官能化表面在所述凹陷部中的每一個處被暴露；以及引子，所述引子在所述凹陷部中的每一個中被接枝到所述官能化表面。
  10. 如請求項9所述的流動池，其中所述基底的所述官能化表面包含附接到矽烷基團的聚合物層，所述矽烷基團附接到所述基底。
  11. 如請求項9所述的流動池，其中所述基底的所述官能化表面包含附接到所述基底的羥基基團。
  12. 如請求項9所述的流動池，其中：所述基底是透明的；並且 所述流動池還包含：與所述基底接觸的偵測裝置，所述偵測裝置包含：與所述凹陷部中的每一個可操作地相關聯的相應的光二極體；以及電連接到所述相應的光二極體的裝置電路。
  13. 一種定序套組，其包含：如請求項9所述的流動池；以及待引入所述流動池中的被標記的核苷酸，每個被標記的核苷酸包含：具有3’OH保護基的核苷酸；附接到所述核苷酸的鹼基或糖的連接分子；以及附接到所述連接分子的電化學發光標記物。
  14. 如請求項13所述的定序套組，其中所述被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中所述至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的發射光譜。
  15. 如請求項13所述的定序套組，其中所述被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中所述至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的電化學發光標記物具有有區別的氧化電位或還原電位。
  16. 如請求項13所述的定序套組，其中所述被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中所述至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的電化學發光發射壽命。
  17. 如請求項13所述的定序套組，其中所述被標記的核苷酸包含至少三種不同的被標記的核苷酸，並且其中所述至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的電化學發光發射強度。
  18. 一種用於偵測的方法，其包含：將包含聚合酶和核苷酸的流體引入流動池，所述流動池包含部分地界定凹陷部 的電極，所述凹陷部包含附接在所述凹陷部中的模板多核苷酸鏈，其中所述核苷酸中的至少一些是被標記的核苷酸，所述至少一些被標記的核苷酸中的每一個包含：具有3’OH保護基的核苷酸；附接到所述核苷酸的鹼基或糖的連接分子；和附接到所述連接分子的電化學發光標記物；從而所述核苷酸中的一個併入與所述模板多核苷酸鏈互補的新生股中；向所述電極施加電位；以及偵測響應於所施加的電位的光學發射。
  19. 如請求項18所述的方法，其中所述核苷酸中的被併入者是所述被標記的核苷酸中的一個，並且其中所述電位的施加引發氧化還原反應路徑，所述氧化還原反應路徑涉及所述被標記的核苷酸中的所述被併入者的電化學發光標記物。
  20. 如請求項19所述的方法，其中：所述流體包含至少三種不同的被標記的核苷酸；所述至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的發射光譜；並且所述方法還包含從所述被標記的核苷酸中的所述被併入者的光學發射識別所述被標記的核苷酸中的所述被併入者。
  21. 如請求項19所述的方法，其中：所述流體包含至少三種不同的被標記的核苷酸；所述至少三種不同的被標記的核苷酸中的每一種的相應的電化學發光標記物具有有區別的氧化電位或還原電位；並且所述方法還包含從所施加的電位識別所述被標記的核苷酸中的所述被併入者。
  22. 如請求項19所述的方法，其中在施加所述電位之前，所述方法還包含將共反應物引入所述流動池。
  23. 如請求項19所述的方法，其中所述被標記的核苷酸中的所述被併入者的所述連接分子和電化學發光標記物在併入、電位施加和光學偵測期間被附接，並且其中在所述光學偵測之後，所述方法還包含：引入去保護劑以從所述被標記的核苷酸中的所述被併入者切出所述連接分子和所述電化學發光標記物，並且從所述被標記的核苷酸中的所述被併入者除去所述3’OH保護基，從而能夠將另一個核苷酸或另一個被標記的核苷酸併入新生股中。
  24. 如請求項23所述的方法，其還包含：引入另一流體；向所述電極施加另一電位；以及偵測另一光學發射。
  25. 如請求項18所述的方法，其中：光二極體偵測所述光學發射；並且所述方法還包含偵測對應於所述光學發射的電信號。
  26. 如請求項18所述的方法，其中：所述核苷酸中的被併入者是以下中的一個：第一被標記的核苷酸，其中所述連接分子是可切出的；第二被標記的核苷酸，其中所述連接分子是不可切出的；第三未被標記的核苷酸，其具有3’OH保護基並包含連接分子，所述連接分子待附接到所述電化學發光標記物；或第四未被標記的核苷酸，其具有3’OH保護基；並且所述方法還包含： 引入一種試劑，所述試劑能夠從所述第一被標記的核苷酸切出所述電化學發光標記物並且能夠將所述電化學發光標記物添加到所述第三未被標記的核苷酸；向所述電極施加另一電位；偵測響應於所施加的電位的另一光學發射；以及使用偵測到的光學發射和偵測到的其他光學發射來識別所述核苷酸中的被併入者。
  27. 如請求項18所述的方法，其中：所述流動池包含多個凹陷部，所述多個凹陷部中的每一個包含附接在所述凹陷部中的多個模板多核苷酸鏈；所述核苷酸中相應的一個併入到與相應的模板多核苷酸鏈互補的相應的新生股中；並且所述方法還包含同時地偵測來自所述多個凹陷部中的每一個的相應的光學發射。
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