JP2021526358A - Lag−3に特異的に結合する単クローン抗体及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
LAG-3遺伝子をなくしたマウスに葡萄状球菌で分泌する腸内毒素、staphylococcal enterotoxin B(SEB)あるいは卵白アルブミン(ovalbumin)を処理したとき、調節されないT細胞の増殖と脾臓肥大症を示す。LAG-3の発現は、T細胞が活性化された後、CD4+、CD8+ T細胞といくつかの自然殺害(natural killer)細胞において増加し、自然調節T細胞(natural Treg cells)と誘導されたCD4+FoxP3+調節T細胞(iTreg cells)にさらに多量のLAG-3が発現されると報告された。MHC class II以外に、LAG-3の結合タンパク質(ligand)としては、LSECtin(liver and lymph node sinusoidal endothelial cell C-type lectin)とGalectin-3が知られており、LSECtinは癌細胞に、Galectin-3は、腫瘍浸透(tumor-infiltrating)CD8+ T細胞にそれぞれ発現され、T細胞に存在するLAG-3と結合することで、T細胞の活性を抑制するものと知られている。
(a)前記形質転換体を培養して培養液を製造する段階と、
(b)前記(a)段階の培養液から本発明の単クローン抗体またはその抗原結合断片を精製する段階と、を含む、LAG-3(Lymphocyte-activation gene 3)に特異的に結合する単クローン抗体またはその抗原結合断片を製造する方法を提供する。
前記製造方法において、形質転換体の培養は、当業界に知られた適当な培地と、培養条件によってなされる。そのような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株または動物細胞によって容易く調整して使用することができる。
1-1.LAG-3抗原タンパク質発現ベクターの作製
LAG-3タンパク質のクローニングは、LAG-3 gene cDNA cloneプラスミド(#HG16498-G、Sino Biological Inc, China)を用いて細胞外ドメイン(29-450番目アミノ酸配列)のみを得るために、5'末端と3'末端に制限酵素SfiI位が含まれたLAG-3に対するプライマー(表1)を用いて重合酵素連鎖反応(polymerase chain reaction, PCR)によって増幅させた。増幅されたPCR産物は、発現ベクターを用いてカルボキシ末端にマウスFc(mFc)を融合させて作製した(図1A)。
作製したLAG-3プラスミドは、HEK293F細胞(Invitrogen、USA)にPEI(Polyethylenimine:#23966、Polysciences、USA)を使用して形質感染(transfection)させた後、無血清培地であるフリースタイル293発現培地(FreeStyle 293 Expression Medium: #AG100009, Thermo Fisher Scientific, USA)で7日間培養した。LAG-3タンパク質を含む細胞培養液を回収して10分間5,000rpmで遠心分離し、0.22μm Top-フィルタ(Millipore、USA)を通じて残っている細胞と浮遊物質を除去した。LAG-3タンパク質の精製は、タンパク質Aアガロースレジン(protein A agarose resin)を用いた親和性クロマトグラフィー(affinity chromatography)を利用し、1次精製されたタンパク質は、superdex 200(1.5cm x 100cm)ゲルろ過クロマトグラフィー(gel filtration chromatography)を用いて2次精製を進めた。
精製したLAG-3-mFcタンパク質活性は、LAG-3レセプタであるMHC class IIを発現しているDaudi(human B cell line)細胞に結合可能な否かを通じて確認した。5x105のDaudi細胞(# 10213, Korean Cell Line Bank, Korea)は、10μg/mlのLAG-3-mFcまたはMHC class II抗体(blocking antibody)である200μg/mlの抗ヒトHLA-DR、DP、DQ(#555556、BD、USA)抗体と共に、4℃で45分間反応させた。その後、細胞は、2%ウシ胎児血清(fetal bovine serum, FBS)(#26140-079, Thermo Fisher Scientific)が含まれたPBS(phosphate buffered saline: #LB001-02, Welgene, Korea)で3回水洗し、細胞表面に結合したLAG-3確認のためにPE(phycoerythrin)蛍光物質が結合された抗ヒトLAG-3抗体(#565616, BD Biosciences, USA)を4℃で30分間処理した後、同じ水洗過程を経て、以後0.2mlの2% FBSが含まれたPBSで懸濁させた後、フローサイトメトリー(flow cytometry)であるFACSCanto II (BD Biosciences)を使用して分析した。
2-1.バイオパンニング
実施例1で作製したLAG-3-mFc及びSino Biological Inc.で購入したLAG-3-his(#16498-H08H)タンパク質抗原50ugを免疫吸着(immunosorb)チューブにコーティングした後、ブロッキングを行った。
実施例2-1の各ラウンドのパンニング過程を通じて収得した陽性ポリscFv-ファージ抗体プールに対する抗原との特異性を調べるために、ポリファージELISA(enzyme linked immunoassay)を行った。
抗原に対して特異的な単一scFvファージクローンを選別するために、結合能に優れた3次パンニング多クローンファージ抗体群から得たコロニーを選択して2 x YTCM 、2%グルコース、5mM MgCl2培地1mlが含まれた96ディップウェルプレート(#90030、Bioneer、Korea)において37℃条件で16時間培養した。培養後、1mlの2 x YTCM、2%グルコース、5 mM MgCl2培地にOD600で値が0.1になるように100〜200μlを取って入れた後、37℃で2〜3時間(OD600=0.5〜0.7)培養し、M1ヘルパーファージをMOI(multiplicity of infection)値が1:20になるように感染させた後、前記実施例2-2と同様の方法で進めて、単一scFvファージに対してファージ-ELISAを行った。
選別されたLAG-3に特異的に結合する単一クローン1E09に対してDNA精製キット(Qiagen、Germany)を用いてDNA-prepを行い、配列分析を依頼した(Solgent、Korea)。配列分析結果から、選別された抗体のVH(variable region of heavy chain)と、VL(variable region of light chain)のCDR(complementarity determining region)部位を確認し、それら抗体と生殖系列(germ line)抗体群の類似性をNCBIのウェブページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/のIg BLASTプログラムを用いて調査した。LAG-3に特異的に結合する単一クローン1E09の特性を表3に整理して提示した。
3-1.scFv形態をIgG形態に転換(conversion)
選別されたLAG-3に対する単一クローンファージ抗体1E09を完全(fully)IgG形態に転換するために、重鎖と軽鎖とのDNA塩基配列に対してそれぞれSfiI/NheIとSfiI/BglII制限酵素部位の塩基配列を有するプライマーを用いてPCR(iCycler iQ, Bio-Rad, USA)を行った。重鎖と軽鎖PCR産物は、それぞれ一致する制限酵素部位を有するそれぞれの発現ベクターと共に切断して、DNA-gel extractionキット(Qiagen)でDNAを溶出した。ライゲーション(ligation)は、ベクター1μl(10ng)、重鎖または軽鎖15μl(100〜200ng)、10xバッファ2 μl, ligase(1U/μl) 1μl、蒸溜水を混合して室温で1〜2時間放置した後、形質転換細胞(competent cell, XL1-blue)に入れて氷に5分間載置し、42℃で90秒間熱衝撃(heat shock)を加えた。
準備された重鎖と軽鎖とを含む発現ベクターは、6:4の比率でHEK-293F細胞に同時形質感染(co-transfection)して7日目上澄み液を収去して遠心分離と0.22μm Top-フィルタを通じて細胞と浮遊物質とを除去した後、上澄み液を集めてタンパク質A親和性クロマトグラフィー(protein A affinity chromatography)を行い、IgG抗体を精製した。精製後、グリシン緩衝溶液(glycine buffer)で抗体を溶出し、最終PBS緩衝溶液に交換した。精製された抗体は、抗体のモル吸光係数(molar extinction coefficient)を用いて分光光度計(SpectraMX M5, Molecular Devices, USA)を使用して吸光度(absorbance)280nmで定量され、使用前まで-70℃に保管した。精製された抗体は、還元、非還元条件で各5μgずつローディングし、SDS-PAGE分析して精製タンパク質の純度及び移動度(mobility)状態を確認した。
4-1.LAG-3抗原に対する抗体特異性
ヒトLAG-3を過剰発現する形質転換細胞プールは、ヒトLAG-3(NCBI accession number NM_002286.5)を含んでいるpcDNA3.1プラスミドをHEK293Eに形質感染させた後、100 μg/ml Zeocin(#R25001, Thermo Fisher Scientific)が入っている選択的培養培地で選別過程を行った。選別過程後、細胞プールは、PE(phycoerythrin)蛍光物質が結合された抗ヒトLAG-3抗体(#565616、BD、USA)を用いたFACS(fluorescence activated cell sorting)分析を通じて発現状態を確認して分離し、抗原に対する抗体の特性分析評価のために使用された。
実施例4-1のヒトLAG-3過剰発現形質転換細胞プール作製と同じ方法でサル(Rhesus monkey) LAG-3(NCBI accession number XM_001108923.2)またはマウスLAG-3(NCBI accession number NM_008479)を含んでいるpcDNA3.1プラスミドをHEK293E細胞にそれぞれ形質転換して細胞プールを作製し、抗原に対する1E09抗体の特性分析評価のために使用した。
LAG-3ヒト単一抗体1E09の抗原に対する結合親和度は、カルボキシ末端にマウスFc(mFc)が融合された組み換え融合タンパク質であるヒトLAG-3(hLAG-3-mFc)、サルLAG-3(MrhLAG-3-mFc)、マウスLAG-3(mLAG-Fc)抗原を用いてOctet(登録商標) QKe(Fortebio Inc. USA)分析装備を通じて測定した。
LAG-3ヒト単一抗体1E09の抗原に対する結合部位を調べるために、図8AのようにLAG-3の細胞外領域でIg-Vドメイン(29-167番目アミノ酸配列)を切断(△Ig-V)するか、Ig-Vドメイン内特定または不特定アミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異体(M1-M7)とwild-type(WT)をmFcまたはHisタッグと融合して作製した組み換えLAG-3タンパク質を前記実施例1のように、生産、精製した(図8A及び図8B)。但し、LAG-3-His(WT)は、Sino Biological Inc.(#16498-H08H)で購入して使用し、生産した組み換えLAG-3-Hisタンパク質は、Ni Sepharose 6 Fast Flow resin (#17531803, GE Healthcare)を用いた親和性クロマグレピ(affinity chromatography)を通じて精製した。精製または購買した組み換えLAG-3タンパク質は、SDS-PAGEを通じて純度を確認した後(図8B)、LAG-3ヒト単一抗体1E09の結合特異性確認のためにELISA分析に使用した(図8C)。
5-1.LAG-3抗体によるLAG-3/MHC class II複合体形成抑制確認
LAG-3-1E09抗体がLAG-3/MHC class II複合体形成を、抑制可能か否かを確認するために、細胞表面にMHC class IIを発現しているRaji細胞株(Burkittリンパ腫由来のヒト白血病細胞)をそれぞれ試料当り0.2 x 106個準備し、200nm (14.4μg/ml)のLAG-3-mFcタンパク質に抗体を400nmから1/2希釈倍数で連続希釈して4℃で30分間反応(pre-incubation)させた後、抗原-抗体混合物を準備した細胞と4℃で30分間反応させた。その後、細胞は、2% FBSが含まれたPBSで3回水洗し、LAG-3-mFcを検出することができるFITC蛍光物質が結合された抗マウスIgG抗体(#FI-2000、Vectorlabs)を使用して4℃で30分間反応させてから、同じ水洗過程を経た後、0.2mlの2% FBSが含まれたPBSで懸濁させた後、フローサイトメトリーであるCytoFLEX (Beckman coulter, USA)を使用して分析した。
LAG-3に結合するヒト単一抗体1E09の活性評価実験は、LAG-3/MHC class II遮断バイオアッセイキット(blockade bioassay kit: #CS194822, Promega)を使用して進行した。MHC class IIが過剰発現されているAPC細胞株を96ウェルプレートに16時間以上培養した後、10μg/mlの抗体濃度から1/2.5希釈倍数で連続希釈した各抗体を処理し、ヒトLAG-3が過剰発現される作用細胞株(Jurakat T 細胞株)を6時間、共に培養した。抗体の阻害回復程度は、ルシフェラーゼ(luciferase)が基質を分解して出る発光強度によって分かり、分光光度計(GloMax(登録商標) Discover System, Model # GM3000, Promega)で測定した。アイソタイプコントロール抗体(reference)を含んでLAG-3-1E09抗体は、LAG-3/MHC II複合体形成によって減少していた作用細胞株であるJurkat T細胞のシグナルを濃度勾配依存的に回復させる活性を示した(図10)。その回復程度は、抗体による最大効果の50%に達するのに必要な試料の量(EC50)で示し、GraphPad Prismソフトウェアを用いて分析した結果、LAG-3-1E09抗体の阻害回復能力であるEC50値は、0.05784μg/ml、アイソタイプコントロール抗体(reference)は、0.16811μg/mlと確認され、本発明の1E09抗体は、アイソタイプコントロール抗体対比で約2.9倍優れた活性度を示した。
6-1.1E09抗体の最適化のためのライブラリ作製
抗体最適化は、重鎖は、固定し、(株)Yバイオロジックスで保有している105-106軽鎖(light chain, LC)プール(pool)を入れて新たなLCシャッフリングライブラリ(LC shuffling library)を作製し、1)LCシャッフリング、2)重鎖の疎水性コア(hydrophobic core)、露出残基(exposed residue)、電荷クラスタ(charge cluster)、塩ブリッジ(salt bridge)のように構造的に重要な部位の残基と比較分析を行って保存された残基(conserved residue)に変異させた後、LCシャッフリングを進めるコアパッキング(core packing)+LCシャッフリング、3)抗体可変領域(variable region)のDNAは、in vivo親和度成熟(affinity maturation)過程で頻繁に変異される変異ホットスポット(mutational hot spot)をランダムに変異させた後、LCシャッフリングを進めるCDRホットスポット+LCシャッフリングの3つの方法で進めた。
7-1.バイオパンニング
1E09抗体の変異体選別のためのバイオパンニングは、実施例6-1において、抗体最適化のために作製したヒト抗体ライブラリをバクテリアに感染させた後、実施例2-1と同じ方法で進行し、LAG-3抗原に特異的に結合するscFv-ファージを溶出した。溶出されたファージを再び大膓菌に感染させて増幅させるパンニング過程を通じて陽性ファージのプール(pool)を得て、抗体変異体を得るためのパンニングは、最初ラウンドのみ進めた。その結果、表6のように最適化ヒト抗体ライブラリを用いたパンニングにおけるファージ流入数と抗原に対する結合数を確認した。
LAG-3抗原に対して特異的な単一scFvファージクローンを選別するために作製した最適化ヒト抗体ライブラリを用いたパンニングで得たコロニーを、実施例2-3と同じ方法で進めて単一scFvファージに対してファージ-ELISAを行った。
選別された単一クローンに対する塩基配列分析は、実施例2-4と同様の方法で遂行及び調査した。その結果、親抗体1E09と類似性において差がある22種の新たなファージ抗体を確認し、表7にまとめた。
8-1.scFv形態をIgG形態に転換(conversion)
選別された22種のLAG-3に対する単一クローンファージ抗体をファージから完全ヒトIgG形態に転換するために、実施例3-1と同じ方法を行い、重鎖と軽鎖DNA塩基配列を含むそれぞれのプラスミドDNAを得て配列分析を依頼した(Solgent、Korea)。
選別された1E09抗体変異体である22種の抗体生産は、実施例3-2の記述と同様の過程によって行われた。クローニングされた重鎖と軽鎖とを含むそれぞれのベクターは、動物臨時発現細胞HEK-293Fに同時形質感染させて発現させた後、タンパク質A親和性クロマトグラフィーで精製して生産量を確認し、還元、非還元条件でSDS-PAGE分析を通じてタンパク質純度及び移動度状態を確認した。
9-1.選別されたLAG-3ヒト抗体変異体の交差反応性(cross-reactivity)
LAG-3ヒト単一抗体の変異体である22種抗体のヒトLAG-3抗原に対する結合及び他の種間交差反応性は、実施例4-1、4-2に記述した方法でヒト、サル、またはマウスLAG-3が過剰発現されたHEK293E細胞でフローサイトメトリーであるCytoFLEXを使用して抗体結合を示すMFI値を測定して確認した。LAG-3-1E09親抗体(parent)を含めてその変異抗体のヒトLAG-3抗原に対する結合とサル、マウス種間交差反応性如何は、それぞれ2μg/mlの抗体濃度で測定した値を使用して下記表14に示した。
LAG-3ヒト単一抗体1E09変異体である22種抗体の活性評価実験は、実施例5-2のような方法でLAG-3/MHC class II遮断バイオアッセイキットを使用して進行した。MHC IIが過剰発現されているAPC細胞株を96ウェルプレートに16時間以上培養した後、抗体濃度は、25μg/ml(図14A)または10μg/ml(図14B)から1/2.5希釈倍数で連続希釈された各抗体を処理し、ヒトLAG-3が過剰発現される作用細胞株を6時間、共に培養した。抗体の阻害回復程度は、ルシフェラーゼが基質を分解して出る発光強度を分光光度計(GloMax(登録商標) Discover System, Model # GM3000, Promega)で測定して確認した。LAG-3-1E09親抗体(parent)を含めて22種の抗体のうち、例えば、15種抗体の場合、LAG-3/MHC class II複合体形成によって減少していた作用細胞株(Jurkat T細胞)のシグナルを濃度勾配依存的に回復させる活性を示した(図14)。アイソタイプコントロール抗体(reference)と比較したとき、本発明の12種の抗体が優れた活性を示すということを確認することができ、各抗体の阻害回復能力を示すEC50値は、表15に示した。
選別されたLAG-3ヒト単一抗体変異体の抗原に対する親和度は、実施例4-3のように組み換え融合タンパク質であるヒトLAG-3(hLAG-3-mFc)、サルLAG-3(MrhLAG-3-mFc)、マウスLAG-3(mLAG-Fc)抗原を用いてOctet(登録商標) QKe (Fortebio Inc. USA)分析装備を通じて同じ方法で平衡解離定数KDを求めて確認した。
LAG-3ヒト単一抗体1E09変異体の抗原に対する結合部位の確認は、実施例4-4のようにLAG-3の細胞外領域において、Ig-Vドメインが切断(ΔIg-V)されるか、特定または不特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸に置換(M1-M7)した組み換えLAG-3突然変異体とWTを用いてELISA分析によって確認した(図16)
Claims (24)
- 配列番号1または配列番号27と記載された重鎖CDR1;配列番号2と記載された重鎖CDR2;及び配列番号3と記載された重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、
配列番号8、配列番号53または配列番号57と記載された軽鎖CDR1;配列番号9と記載された軽鎖CDR2;及び配列番号10、配列番号33または配列番号60と記載された軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域と、を含む、LAG-3(Lymphocyte-activation gene 3)に特異的に結合する単クローン抗体またはその抗原結合断片。 - 前記単クローン抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号1と記載された重鎖CDR1;配列番号2と記載された重鎖CDR2;及び配列番号3と記載された重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、
配列番号8と記載された軽鎖CDR1;配列番号9と記載された軽鎖CDR2;及び配列番号10と記載された軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項1に記載の単クローン抗体またはその抗原結合断片。 - 前記単クローン抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号27と記載された重鎖CDR1;配列番号2と記載された重鎖CDR2;及び配列番号3と記載された重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、
配列番号53と記載された軽鎖CDR1;配列番号9と記載された軽鎖CDR2;及び配列番号33と記載された軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項1に記載の単クローン抗体またはその抗原結合断片。 - 前記単クローン抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号1と記載された重鎖CDR1;配列番号2と記載された重鎖CDR2;及び配列番号3と記載された重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、
配列番号57と記載された軽鎖CDR1;配列番号9と記載された軽鎖CDR2;及び配列番号60と記載された軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項1に記載の単クローン抗体またはその抗原結合断片。 - 前記単クローン抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号114のアミノ酸配列と記載された重鎖可変領域、及び配列番号115のアミノ酸配列と記載された軽鎖可変領域を含む、請求項2に記載のLAG-3に特異的に結合する単クローン抗体またはその抗原結合断片。 - 前記単クローン抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号116のアミノ酸配列と記載された重鎖可変領域、及び配列番号117のアミノ酸配列と記載された軽鎖可変領域を含む、請求項3に記載のLAG-3に特異的に結合する単クローン抗体またはその抗原結合断片。 - 前記単クローン抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号118のアミノ酸配列と記載された重鎖可変領域、及び配列番号119のアミノ酸配列と記載された軽鎖可変領域を含む、請求項4に記載のLAG-3に特異的に結合する単クローン抗体またはその抗原結合断片。 - 前記単クローン抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメリック抗体及び組換え抗体からなる群から選択されることを特徴とする請求項1ないし7のうちいずれか1項に記載の単クローン抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合断片は、LAG-3と結合するscFv(single chain variable fragment)、dsFv、Fab、F(ab')及びF(ab')2からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1ないし7のうちいずれか1項に記載の単クローン抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項1ないし7のうちいずれか1項に記載の単クローン抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコーディングするポリヌクレオチド。
- 請求項10に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- 請求項11に記載の発現ベクターによって形質転換された形質転換体。
- (a)請求項12に記載の形質転換体を培養して培養液を製造する段階と、
(b)前記(a)段階の培養液から請求項1ないし7のうち、いずれか1項に記載の単クローン抗体またはその抗原結合断片を精製する段階と、を含む、LAG-3(Lymphocyte-activation gene 3)に特異的に結合する単クローン抗体またはその抗原結合断片を製造する方法。 - 請求項1ないし7のうち、いずれか1項に記載の単クローン抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、免疫反応を刺激するための組成物。
- 請求項1ないし7のうち、いずれか1項に記載の単クローン抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、癌治療用薬学組成物。
- 前記組成物は、免疫刺激性抗体をさらに含むことを特徴とする請求項15に記載の癌治療用薬学組成物。
- 前記免疫刺激性抗体は、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体及び抗CTLA-4抗体からなる群から選択される1つ以上であることを特徴とする請求項16に記載の癌治療用薬学組成物。
- 前記癌は、肝癌、乳房癌、腎臓癌、脳腫瘍、胆道癌、食道癌、胃癌、大膓癌、直膓癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、骨癌、黒色腫、中皮腫、膵膓癌、卵巣癌、前立腺癌、肉腫、皮膚癌、精巣腫、白血病、ホジキン(Hodgkin)疾患、リンパ腫及び多発性骨髄腫(血液癌)で構成される群から選択されることを特徴とする請求項15に記載の癌治療用薬学組成物。
- 請求項15に記載の癌治療用薬学組成物を個体に投与する段階を含む、癌を治療する方法。
- 請求項1ないし7のうち、いずれか1項に記載の単クローン抗体またはその抗原結合断片を含む癌診断用組成物。
- 請求項20に記載の組成物を含む、癌診断用キット。
- 請求項1ないし7のうち、いずれか1項に記載の単クローン抗体またはその抗原結合断片に薬物が結合された、薬物結合体。
- i)請求項1ないし7のうち、いずれか1項に記載の抗体;
ii)膜透過性ドメイン(transmembrane domain);及び
iii)前記i)の抗体が抗原に結合されれば、T細胞活性化を招くことが特徴である細胞内信号伝逹ドメイン(intracellular signlaing domain)を含む、CAR(chimeric antigen receptor)タンパク質。 - 請求項1ないし7のうち、いずれか1項に記載のLAG-3(Lymphocyte-activation gene 3)に特異的に結合する単クローン抗体またはその抗原結合断片を含む、多重特異的抗体(multi-specific antibody)。
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012500006A (ja) * | 2008-08-11 | 2012-01-05 | メダレックス インコーポレーティッド | リンパ球活性化遺伝子−3(lag−3)へ結合するヒト抗体およびその使用 |
JP2017516489A (ja) * | 2014-03-14 | 2017-06-22 | ノバルティス アーゲー | Lag−3に対する抗体分子およびその使用 |
JP2018505674A (ja) * | 2015-02-03 | 2018-03-01 | アナプティスバイオ インコーポレイティッド | 抗リンパ球活性化遺伝子3(lag−3)抗体 |
JP2018536392A (ja) * | 2015-10-09 | 2018-12-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | 抗lag3抗体およびその使用 |
JP2019513009A (ja) * | 2016-02-25 | 2019-05-23 | セル メディカ スイッツァランド アーゲー | 免疫療法用改変細胞 |
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---|---|---|---|---|
JP2012500006A (ja) * | 2008-08-11 | 2012-01-05 | メダレックス インコーポレーティッド | リンパ球活性化遺伝子−3(lag−3)へ結合するヒト抗体およびその使用 |
JP2017516489A (ja) * | 2014-03-14 | 2017-06-22 | ノバルティス アーゲー | Lag−3に対する抗体分子およびその使用 |
JP2018505674A (ja) * | 2015-02-03 | 2018-03-01 | アナプティスバイオ インコーポレイティッド | 抗リンパ球活性化遺伝子3(lag−3)抗体 |
JP2018536392A (ja) * | 2015-10-09 | 2018-12-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | 抗lag3抗体およびその使用 |
JP2019513009A (ja) * | 2016-02-25 | 2019-05-23 | セル メディカ スイッツァランド アーゲー | 免疫療法用改変細胞 |
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