MX2011011285A - Anticuerpos anti cxcr4 para el tratamiento del vih. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos aislados o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, capaces de ligar a CXCR4, pero también de inducir cambio conformacional de los homodímeros de CXCR4 y capaz de inhibir replicación de aislado primario de VIH-1 en células mononucleares de sangre periférica, CMSP (PBMC = Peripheral Blood Mononuclear Cells). Más particularmente, la presente invención se relaciona a los anticuerpos monoclonales 515H7 y 301aE5, específicos a la proteína CXCR4, así como a su uso para el tratamiento de infección de virus de inmunodefiencia humana (VIH). También se abarcan composiciones farmacéuticas compuestas de estos anticuerpos y un proceso para la selección de estos anticuerpos.

Description

ANTICUERPOS ANTI CXCR4 PARA EL TRATAMIENTO DEL VIH La presente invención se refiere a anticuerpos novedosos, en particular anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados, capaces de ligar específicamente a receptores de quimiocina (CXCR) así como las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos que codifican para estos anticuerpos. Desde un aspecto, la invención se refiere a anticuerpos novedosos, fragmentos funcionales o derivados, capaces de ligar específicamente a CXCR4 y que tienen fuerte actividad contra infección de virus de inmunodeficiencia humano VIH (HIV = Human Immunodeficiency Virus) . La invención también comprende el uso de estos anticuerpos, fragmentos funcionales o derivados, como un medicamento para el tratamiento preventivo y/o terapéutico de infección VIH (HIV) .

Las quimiocinas son péptidos pequeños, secretados, que controlan la migración de leucocitos sobre un gradiente químico de ligando, conocido como gradiente de quimiocina, en especial durante reacciones inmunes (Zlotnick A. et al., 2000). Se dividen en dos subfamilias principales, CC y CXC, con base en la posición de sus residuos cisteína NH2 terminales, y ligan a receptores acoplados a proteína G, cuyas dos subfamilias principales se designan CCR y CXCR. Más de 50 quimiocinas humanas y 18 receptores de quimiocinas se han descubierto hasta la fecha .

Varios miembros de la familia receptor de quimiocina funcionan como co-receptores con el receptor primario CD4 para permitir la entrada de diversas cepas de HIV tipo I en células, los principales co-receptores son CCR5 y CXCR4. X4 HIV-I trópico de célula T utiliza CD4 y CXCR4 para la entrada en las células, mientras que R5 HIV-I trópico de macrófago utiliza CD4 y CCR5. Cepas trópicas duales pueden utilizar ambos CXCR4 y CCR5 como co-receptores. CCR3, CCR2, CCR8, CXCR6, CXCR7, CX3CR1 entre otros receptores de quimiocina pueden funcionar como co-receptores por un subconjunto más restringido de cepas VIH (HIV).. SDF-1, el ligando natural de CXCR4 asi como los ligandos CCL3, CCL4, CCL4-L1, y CCL5 para CCR5 son capaces de inhibir la fusión celular e infección por diversas cepas de HIV-I. Estos hallazgos han estimulado el desarrollo de agentes terapéuticos anti-VIH que hacen blanco en receptores de quimiocina lo que llevó a la aprobación de maraviroc (CELSENTRI®) , un antagonista de molécula pequeña de CCR5 en combinación con otros agentes anti-VIH-1 en pacientes infectados por VIH-1 trópico CCR5. Sin embargo, maraviroc ni se utiliza en pacientes infectados por VIH-1 trópico dual ni en pacientes infectados por VIH-1 trópico CXCR4 (VIDAL 2009) . De manera tal que hay una necesidad médica clara para extender este tipo de terapia tanto en pacientes infectados con VIH de trópico X4 como trópico dual, al identificar antagonistas CXCR4 capaces de inhibir la replicacion VIH trópico X4.

El receptor de quimiocina 4 (también conocido como fusina, CD 184, LESTR o HU STR) existe como dos isoformas que comprenden 352 o 360 aminoácidos. El residuo Asnl I está glicosilado, el residuo Tyr21 está modificado por la adición de un grupo sulfato y Cys 109 y 186 se ligan con un puente disulfuro en la parte extracelular del receptor (Juárez J. et al, 2004).

Este receptor se expresa por diferentes tipos de tejidos normales, sin tratar, células T sin memoria, células T regulatorias , células B, neutrófilos, células endoteliales , monocitos primarios, células dendriticas, células de estructuras naturales, células madre hematopoyéticas CD34+ y a un bajo nivel en corazón, colon, hígado, ríñones y cerebro. CXCR4 juega un papel clave en tráfico de leucocitos, linfopoyesis de célula B y mielopoyesis .

El único ligando del receptor CXCR4 descrito hasta la fecha es el Factor-Derivado-de-Célula-Estromal-I (SDF-1 = Stromal-cell-Derived Factor-I) o CXCL12. SDF-1 es secretado en gran cantidad en nodos linfáticos, médula ósea, hígado, pulmón y en una proporción menor por los ríñones, cerebro y la piel. CXCR4 también se reconoce por una quimiocina antagonista, la proteína inflamatoria de macrófago viral II (vMIP-II = viral Macrophage Inflammatory Protein II) codificada por el virus herpes humano tipo III.

Como se mencionó con anterioridad, el receptor CXCR4 es el co-receptor principal para aislados de VIH-1 trópico-de-célula-T (virus X4). La interferencia con este receptor deberá inhibir replicación de virus X4 en una forma muy eficiente.

Un aspecto de la invención presente es generar anticuerpos monoclonales de ratón (Mabs) que inhiben replicación de VIH. La invención abarca CXCR4 Mab 515H7 (o sus fragmentos) capaces de ligar a homodímeros CXCR , y que tienen fuertes actividades contra infección VIH. . La invención también abarca un CXCR4 Mab 301aE5 (o sus fragmentos) capaz de ligar a homodímeros CXCR4 y que tiene fuertes actividades contra infección VIH.

De manera sorprendente, los inventores han logrado generar anticuerpos monoclonales capaces de ligar a CXCR4, pero también capaces de inducir cambios de conformación de los homodímeros CXCR4 y capaces de inhibir replicación de X4-HIV-I aislado primario en PBMC . De manera más particular, los anticuerpos de la invención también son capaces de inhibir replicación de X4/R5-HIV-I aislado primario en PBMC.

De preferencia, el compuesto CXCR4 es una de las dos isoformas CXCR4 humanas seleccionadas del grupo que consiste de: - la isoforma b del receptor de quimiocina (motivo C-X-C) 4 [Homo sapiens] que tiene la secuencia como se ilustra bajo el número de acceso Genbank NP 003458 SEQ ID No. 27: MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGN GLVILVMGYQKKLRS TDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVAN YFGNFL CKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWI PALLLTIPDFI FANVSEADDRYICDRFYPNDL WVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSC YCI I ISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFF AC LPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFE NTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKG KRGGHSSVSTESESSSFHSS.; - la isoforma a del receptor de quimiocina (motivo C-X-C) 4 [Homo sapiens] que tiene la secuencia ilustrada bajo el número de acceso Genbank NP 00 1008540 SEQ ID No. 28: SIPLPLLQIYTSDNYTEEMGSGD YDSMKEPCFREENA FNKIFLPTIYSII FLTGI VGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPF AVDAVANWYFG NFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVG V IP ALLLTIPDFIF ANVSEADDRYICDRFYPNDL WVVVFQFQHIMVGLILPGIVI LSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGC EFENTVHK ISITEALAFFHCCLNPILY AFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILS KGKRGGHSSVSTESESSSFHSS ; - una variante de empalme de transcripción alterna o su variante natural que tiene al menos 95% de identidad con una de estas isoformas b o a con la secuencia SEQ ID No. 27 o 28; y un fragmento de la misma capaz de ser reconocido específicamente por su factor derivado de célula estromal de ligando natural-I (SDF-1) y que tiene de preferencia al menos una longitud de 100, 150 y 200 aminoácidos.

CXCR2 se elige del grupo que consiste de: - el receptor interleucina 8 beta [Homo sapiens] que tiene la secuencia como se ilustra bajo el número de acceso Genbank NP 00 1548 SEQ ID No. 29: MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIY ALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKV NGWI FGTFLCKVVSLLKE VNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYL VKF ICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYED GNNT ANWRMLLRILPQSF GFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIF AVVLIFLLCWLPYNLVLL ADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKI LAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL; - una variante de empalme de transcripción alterna o su variante natural que tiene al menos 95% de identidad con su receptor de interleucina 8 beta que tiene SEQ ID No. 29; y - su fragmento capaz de ser reconocido específicamente por IL-8 y que tiene de preferencia una longitud de al menos 100, 150 y 200 aminoácidos.

La invención también comprende un método para seleccionar un compuesto que tiene actividad anti-VIH o que puede utilizarse para la preparación de una composición para el tratamiento de infección VIH, caracterizada porque el método comprende la etapa de: En un primer aspecto, un sujeto de la presente invención es un proceso para la generación y selección de anticuerpos de acuerdo con la invención.

Más particularmente, la invención se refiere a un proceso para la selección de un anticuerpo anti-CXCR4 o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, capaces de inhibir replicación VIH que comprende las siguientes etapas : i) detección de los anticuerpos generados y selección de anticuerpos capaces de ligar específicamente a CXCR4 ; ii) prueba de los anticuerpos seleccionados de la etapa i) y seleccionar anticuerpos capaces de ligar células mononucleares de sangre periférica (PBMC), iii) prueba de los anticuerpos selectos de la etapa ii) y seleccionar anticuerpos capaces de ligar al homodímero CXCR4 y después iv) prueba de los anticuerpos selectos de la etapa iii) y seleccionar anticuerpos capaces de inhibir replicación VIH-1 trópica-X4 de aislados primarios en PBMC.

En otra modalidad, la invención se refiere a un proceso para la selección de un anticuerpo anti-CXCR4 o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, capaz de inhibir replicación VIH que comprende las siguientes etapas: i) detección de los anticuerpos generados y selección de anticuerpos capaces de ligar específicamente a CXCR4 ; ii) prueba de los anticuerpos selectos de la etapa i) y seleccionar anticuerpos capaces de ligar células mononucleares de sangre periférica (PBMC), iii) prueba de los anticuerpos selectos de la etapa ii) y seleccionar anticuerpos capaces de ligar al homodimero CXCR4 y después iv) prueba de los anticuerpos selectos de la etapa iii) y seleccionar anticuerpos capaces de. inhibir replicación VIH-l-trópica-X4 de aislados primarios en PBMC y/o capaz de inhibir replicación VIH-l-trópica de X4/R5 de aislados primarios en PBMC.

La generación de los anticuerpos puede lograrse por cualquier método conocido por la persona con destreza en la técnica, tal como por ejemplo fusión de una célula de mieloma con células de bazo de ratones inmunizados u otras especies compatibles con las células de mieloma selectas [Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497], Los animales inmunizados pueden incluir ratones transgénicos con sitios de inmunoglobulina humana que después producen directamente anticuerpos humanos. Otra modalidad posible puede consistir de utilizar tecnologías de expresión en fago para detectar o evaluar bibliotecas.

Las etapas de detección i) y ii) pueden lograrse por cualquier método o proceso conocido por la persona con destreza en la técnica. Como ejemplos no limitantes, pueden mencionarse ELISA, BIAcore, inmunohistoquimica, análisis de transferencia Western utilizando extractos de membrana de células que expresan CXCR4 o CXCR4 purificado, análisis FACS y tamices funcionales. Un proceso preferido consiste en un tamiz por análisis FACS en transfectante CXCR4 (etapa 1) y en al menos PBMC (etapa 2), para asegurar que los anticuerpos producidos serán capaces de reconocer también la conformación del receptor CXCR4 nativo en la superficie de la célula diana. Este proceso se describirá en forma más precisa en los siguientes ejemplos.

La etapa de detección iii) puede lograrse por cualquier método o proceso conocido por la persona con destreza en la especialidad. Como un ejemplo no limitante pero preferido, pueden mencionarse técnicas de transferencia Western y/o inmunoprecipitacion utilizando anticuerpos de interés en extracto de membrana de células transfectadas CXCR4 o PBMC.

La etapa de detección iv) puede lograrse por cualquier método o proceso conocido por la persona con destreza en la técnica. Como un ejemplo no limitante pero preferido, puede mencionarse un proceso que consiste en detección de anticuerpos por su capacidad para inhibir replicación de aislados VIH-1 primarios X4 y/o VIH-1 primarios X4/R5 en PBMC, al utilizar un protocolo descrito por Holl et al. (J. Immunol. 2004, 173, 6274-83).

En una modalidad preferida de la etapa iii) de selección del proceso de la invención, la etapa iii) consiste en evaluar anticuerpos por análisis BRET en células que expresan CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP y seleccionar anticuerpos capaces de inhibir al menos 40%, de preferencia 45%, 50%, 55% y más preferiblemente 60% de la señal BRET. La tecnología BRET es una tecnología que se conoce representativa de la dimerización de proteínas [Angers et al, PNAS, 2000, 97:3684-89]. La tecnología BRET utilizada en la etapa iii) del proceso es bien conocida por la persona con destreza en la especialidad y será detallada en los siguientes ejemplos. De manera más particular, transferencia de energía por resonancia bioluminiscencia (BRET = Bioluminescence Resonance Energy Transfer) es una transferencia de energía no radiante que ocurre entre un donador bioluminiscente (Renilla Luciferase (Rluc) ) y un aceptor fluorescente, un mutante de la proteína fluorescente verde (GFP = Green Fluorescent Protein) o proteína fluorescente amarilla (YFP = Yellow Fluorescent Protein) . En el presente caso, la proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP = Enhanced Yellow Fluorescent Protein) se empleó. La eficacia de transferencia depende de la orientación y la distancia entre el donador y el aceptor. Después, la transferencia de energía puede ocurrir sólo si las dos moléculas están en proximidad inmediata (1-10 nm) . Esta propiedad se emplea para generar ensayos de interacción proteína-proteína. Sin duda, a fin de estudiar la interacción entre dos socios, el primero se fusiona genéticamente a la Renilla Luciferase y el segundo al mutante amarillo de GFP. Proteínas de fusión en general pero no en forma obligatoria se expresan en células de mamífero. En la presencia de su sustrato permeable a membrana (coelenterazina) , Rluc emite luz azul. Si el mutante GFP está más cerca que 10 nm de Rluc, puede ocurrir una transferencia de energía y puede detectarse una señal amarilla adicional. La señal BRET se mide como la proporción entre la luz emitida por el aceptor y la luz emitida por el donador. De manera tal que la señal BRET se incrementará a medida que las dos proteínas de fusión se ponen en proximidad o si un cambio de conformación lleva más cerca al mutante Rluc y GFP.

Si el análisis BRET consiste en una modalidad preferida, cualquier método conocido por la persona con destreza en la técnica puede emplearse para medir cambios conformacionales de dimeros CXCR4. Sin limitación, las siguientes tecnologías pueden mencionarse: transferencia de energía de resonancia-florescencia (FRET = Fluorescence Resonance Energy Transfer) , florescencia resuelta con tiempo homogéneo (HTRF = Homogenous Time Resolved Fluorescence), microscopía para formación de imagen de tiempo de vida de florescencia (FLI = Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) o espectroscopia de correlación cruzada-florescencia de una sola longitud de onda (SW-FCCS = Single avelength Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy) .

Otras tecnologías clásicas también pueden emplearse, tales como Co-inmunoprecipitación, Alpha screen, entrelazamiento Químico, Doble Híbrido, Cromatografía de Afinidad, ELISA o transferencia Far Western.

En un aspecto particular del proceso de acuerdo con la invención, la etapa iii) consiste en evaluar anticuerpos por análisis BRET en células que expresan tanto CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP como seleccionar anticuerpos capaces de inhibir al menos 40%, de la señal BRET. En un segundo aspecto, un objeto de la invención son anticuerpos aislados o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, que se obtienen por el proceso. Los anticuerpos o uno de sus fragmentos o derivados, son capaces de ligar específicamente a CXCR4 humano, los anticuerpos también son capaces de inducir cambios de conformación de homodimeros CXCR4. Se conoce de la literatura que CXCR4 Mabs como, por ejemplo el clon A120, son capaces de inhibir entrada de la cepa de laboratorio VIH-1 (X4HIV-1 NL4"3) en PBMC (Tanaka R. et al, J. Virol. 2001, 75, 11534-11543) . Además, también se conoce que Mabs CXCR4 son capaces de inhibir aislados primarios VIH-1 X4 en lineas celulares que expresan CXCR4. Por el contrario, nunca se ha descrito anticuerpo capaz de inhibir este virus en su ambiente natural, es decir no sólo en virus de laboratorio o lineas celulares. Sin embargo, es un aspecto novedoso y no evidente de la invención de Mabs CXCR4 son capaces de inhibir aislados primarios de VIH-1 X4 en PBMC.

Las expresiones "fragmentos y derivados funcionales" serán definidas en detalle posteriormente en la presente especificación.

Debe entenderse aquí que la invención no se refiere a los anticuerpos en forma natural, es decir no están en su ambiente natural sino que han sido capaces de ser aislados u obtenidos por purificación de fuentes naturales, o de otra forma obtenidos por recombinación genética o por síntesis química, y que pueden contener aminoácidos no naturales como se describirá adicionalmente .

De manera más particular, de acuerdo con otro aspecto de la invención, se reclaman anticuerpos aislados o unos de sus fragmentos o derivados funcionales, los anticuerpos se caracterizan porque comprenden al menos una región de determinación de complementariedad CDR seleccionadas de CDRs que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nos. 1 a 6 y 30 a 33 como se define por el sistema de numeración IMGT .

De acuerdo con un primer aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo aislado, o un fragmento o derivado funcional del mismo, que comprende al menos una CDR seleccionada de entre las CDRs de secuencias SEQ ID Nos. 1 a 6, como se define de acuerdo con el sistema de numeración IMGT o al menos una CDR cuya secuencia tiene al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad, después de alineamiento óptimo con . secuencias SEQ ID Nos. l a 6.

De acuerdo con un segundo aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo aislado, o un fragmento o derivado funcional del mismo, que comprende al menos una CDR seleccionada de entre las CDRs de las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 30 a 33, como se define de acuerdo con el sistema de numeración IMGT, o al menos una CDR cuya secuencia tiene al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 30 a 33.

Un "fragmento funcional" de un anticuerpo significa en particular un fragmento de anticuerpo tales como los fragmentos Fv, scFv (se = cadena sencilla), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc o diacuerpos, o cualquier fragmento cuya vida media se ha incrementado. Estos fragmentos funcionales se describirán en detalle posteriormente en la presente descripción.

Un "compuesto derivado" o "derivado" de un anticuerpo significa en particular una proteina de enlace compuesta de un andamio de péptido y al menos una de las CDRs del anticuerpo original a fin de conservar su capacidad para reconocer CXCR4. Estos compuestos derivados, bien conocidos por una persona con destreza en la técnica se describirán con más detalle posteriormente en la presente descripción.

Más. preferible,. la invención comprende los anticuerpos, sus compuestos derivados o sus fragmentos funcionales, de acuerdo con la presente invención, notablemente quiméricos o humanizados, que se obtienen por recombinación genética o síntesis química.

De acuerdo con una modalidad preferida, el anticuerpo de acuerdo con la invención o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracteriza porque consiste de un anticuerpo monoclonal.

"Anticuerpo monoclonal" se entiende que significa un anticuerpo que surge de una población de anticuerpos casi homogénea. Más particularmente, los anticuerpos individuales de una población son idénticos excepto por unas cuantas mutaciones de origen natural posibles, que pueden encontrarse en proporciones mínimas. En otras palabras, un anticuerpo monoclonal consiste de un anticuerpo homogéneo que surge del crecimiento de un solo clon celular (por ejemplo, un hibridoma, una célula hospedera eucariótica transfectada con una molécula de ADN que codifica el anticuerpo homogéneo, una célula hospedera procariótica transfectada con una molécula de ADN que codifica el anticuerpo homogéneo, etc.) y en general se caracteriza por cadenas pesadas de una y sólo una clase y subclase, y cadenas ligeras de solo un tipo. Anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un solo antígeno. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diversos anticuerpos dirigidos contra diversos determinantes o epítopos, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo epítopo del antígeno.

De manera más particular, de acuerdo con una primer modalidad preferida de la invención, el anticuerpo o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracteriza porque comprende una cadena ligera que comprende al menos una CDR seleccionada de CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3, en donde: - CDR-Ll comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1, - CDR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 2, - CDR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 3.

De acuerdo con otra modalidad, los anticuerpos de la invención o uno de sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracterizan porque comprenden una cadena ligera que comprende al menos una de las tres CDRs de las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 o 3, o al menos una secuencia con cuando menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 o 3.

El anticuerpo de la invención o uno " de sus fragmentos o derivados funcionales, también se caracteriza porque comprende una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, en donde CDR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1, CDR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 2 y CDR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 3.

En otra modalidad, el anticuerpo de la invención o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, se caracteriza porque comprende una cadena ligera de secuencias que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 7, o al menos una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID No. 7.

De acuerdo con una segunda modalidad preferida de la invención, el anticuerpo o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracteriza porque comprende una cadena ligera que comprende al menos una CDR seleccionada de CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3, en donde: - CDR-Ll comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1, - CDR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 2, - CDR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 30.

De acuerdo con . otra modalidad, los anticuerpos de la invención, o uno de sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracterizan porque comprenden una cadena ligera que comprende al menos una de las tres CDRs de las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 o 30, o al menos una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 o 30.

El anticuerpo de la invención o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, también se caracteriza porque comprende una cadena ligera que comprende CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3, en donde CDR-Ll comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1, CDR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 2 y CDR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 30.

En otra modalidad, el anticuerpo de la invención, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, se caracteriza porque comprende una cadena ligera de secuencias que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 34, o al menos una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID No. 34.

Más particularmente, los anticuerpos de la invención o uno de sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracterizan porque comprenden una cadena pesada que comprende cuando menos una CDR seleccionada de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, en donde: - CDR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 4, - CDR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 5, - CDR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 6.

De acuerdo con otra modalidad, los anticuerpos de la invención uno de sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracterizan porque comprenden una cadena pesada que comprende al menos una de las tres CDRs de las secuencias SEQ ID Nos. 4, 5 o 6, o al menos una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID Nos. 4, 5 ó 6.

De acuerdo con otra modalidad particular, anticuerpos o uno de sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracterizan porque comprenden una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, en donde CDR-Hl comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 4, CDR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 5 y la CDR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 6.

En otra modalidad, el anticuerpo de la invención o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, se caracteriza porque comprende una cadena pesada de secuencia que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 8, o al menos una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID No. 8.

En forma más particular, los anticuerpos de la invención o uno de sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracterizan porque comprenden una cadena pesada que comprende al menos una CDR seleccionada de CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3, en donde: - CDR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 31, - CDR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 32, - CDR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 33.

De acuerdo con otra modalidad, los anticuerpos de la invención o uno de sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracterizan porque comprenden una cadena pesada que comprende al menos una de las tres CDRs de las secuencias SEQ ID Nos. 31, 32 o 33, o al menos una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID Nos. 31, 32 o 33.

De acuerdo con otra modalidad particular, anticuerpos, o uno de. sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracterizan porque comprenden una cadena pesada que comprende CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3, en donde CDR-Hl comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 31, CDR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 32 y CDR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 33.

En otra modalidad, el anticuerpo de la invención o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, se caracterizan porque comprenden una cadena pesada de secuencias que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 35, o al menos una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID No. 35.

El anticuerpo de la invención o uno de sus fragmentos o derivados funcionales se caracteriza porque comprende una cadena ligera que comprende CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden respectivamente la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nos. 1, 2 y 3; y una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de comprenden respectivamente la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nos. 4, 5 y 6.

Finalmente, el anticuerpo de la invención o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, también puede caracterizarse porque comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 7 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 8.

El anticuerpo de la invención o uno de sus fragmentos o derivados funcionales se caracteriza porque comprende una cadena ligera que comprende CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3 que comprende respectivamente la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nos. 1, 2 y 30; y una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden respectivamente las secuencias de aminoácidos SEQ ID Nos. 31, 32 y 33.

Finalmente, el anticuerpo de la invención o uno de sus fragmentos o derivados funcionales también pueden caracterizarse porque comprenden una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 34 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 35.

En la presente descripción, los términos "polipéptidos", "secuencia polipéptido", "péptidos" y "o proteínas enlazadas a compuestos anticuerpo o sus secuencias" son intercambiables.

Debe entenderse aquí que la invención no se refiere a anticuerpos en forma natural, es decir no se toman de su ambiente natural sino que se aislan u obtienen por purificación de fuentes naturales u obtienen por recombinación genética o síntesis química y de esta manera pueden transportar aminoácidos no naturales como se describirá a continuación.

En una primer modalidad, la región de determinación de complementariedad o CDR, significa las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas como se define por Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, y posteriores ediciones) . Hay tres CDRs de cadena pesada y tres CDRs de cadena ligera. Aquí, los términos "CDR" y "CDRs" se emplean para indicar, dependiendo del caso, uno o más o incluso todas las regiones que contienen la mayoría de los residuos aminoácido responsables por la afinidad de enlace del anticuerpo para el antígeno o epítopo que reconoce.

En una segunda modalidad, por regiones CDR o CDR(s), se entiende que se indican las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas como se define por IMGT.

La numeración única de IMGT se ha definido que compara los dominios variables cualquiera que sea el receptor antígeno, el tipo de cadena o la especie [Lefranc M. -P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz., .M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]. En la numeración única IMGT los aminoácidos conservados siempre tienen la misma posición, por ejemplo cisteína 23 (lst-CYS) , triptofano 41 (CONSERVED-TRP) , aminoácido hidrofóbico 89, cisteína 104 (2nd-CYS) , fenilalanina o triptofano 118 (J-PHE o J-TRP) . La numeración única IMGT proporciona una delimitación estandarizada de las regiones marco (FR1-IMGT: posiciones 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones de determinación de complementariedad: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT: 105 a 117. Ya que los espacios representan posiciones no ocupadas, las longitudes CDR-IMGT (ilustradas entre paréntesis cuadrados y separadas por puntos, [8.8.13]) se vuelven información crucial. La numeración única de IMGT se emplea en representaciones gráficas 2D designadas como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics , 2, 21-30 (2007)], y en estructuras 3D en IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucí. Acids . Res., 32, D208-D210 (2004)].

Tres CDRs de cadenas pesadas y 3 CDRs de cadenas ligeras existen. El término CDR o CDRs se emplea aquí a fin- de indicar de acuerdo con el caso, una de estas regiones o varias, incluso todas estas regiones que contienen la mayoría de los residuos aminoácido responsables por el enlace por afinidad del anticuerpo para el antígeno o el epítopo que reconoce.

Para más claridad, debe entenderse que en la siguiente descripción y más particularmente en las tablas 2 y 3, las CDRs se definirán por el sistema de numeración IMGT y por el sistema de numeración Kabat .

El sistema de numeración IMGT define las CDRs de acuerdo con el sistema IMGT como se definió anteriormente, mientras que el sistema de numeración Kabat define las CDRs de acuerdo con el sistema Kabat definido anteriormente.

En forma más particular, referente al anticuerpo referido como 515H7, CDR-L1 consiste de SEQ ID No. 1 en el sistema de numeración I GT y de SEQ ID No. 9 en el sistema de numeración Kabat. Referente a CDR-L2, consiste de SEQ ID No. 2 en el sistema de numeración IMGT y de SEQ ID No. 10 sistema de numeración Kabat. CDR-L3 consiste de SEQ ID No. 3 por cada uno de los dos sistemas de numeración. Para la cadena pesada, CDR-H1 consiste de SEQ ID No. 4 en el sistema de numeración IMGT y de SEQ ID No. 11 en el sistema de numeración de Kabat. CDR-H2 consiste de SEQ ID No. 5 en el sistema de numeración IMGT y de SEQ ID No. 12 en el sistema de numeración Kabat. Finalmente, CDR-H3 consiste en SEQ ID No,. 6 en los sistemas -de numeración IMGT mientras que consiste de SEQ ID No. 13 en el sistema de numeración Kabat .

Después, referente al anticuerpo referido como 301aE5, CDR-L1 consiste de SEQ ID No. 1 en el sistema de numeración IMGT y de SEQ ID No. 9 en el sistema de numeración Kabat. Referente a CDR-L2, consiste de SEQ ID No. 2 en el sistema de numeración IMGT y de SEQ ID No. 36 sistema de numeración Kabat. CDR-L3 consiste de SEQ ID No. 30 en el sistema de numeración IMGT y de SEQ ID No. 37 en el sistema de numeración Kabat. Para la cadena pesada, CDR-H1 consiste de SEQ ID No. 31 en el sistema de numeración IMGT y de SEQ ID No. 38 en el sistema de numeración Kabat . CDR-H2 consiste de SEQ ID No. 32 en el sistema de numeración IMGT y de SEQ ID No. 39 en el sistema de numeración Kabat. Por fin, CDR-H3 consiste en SEQ ID No. 33 en el sistema de numeración IMGT mientras que consiste de SEQ ID No. 40 en el sistema de numeración Kabat.

En el sentido de la presente invención, el "por ciento de identidad" entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos, significa que el por ciento de nucleótidos o residuos aminoácido idénticos entre las dos secuencias a comparar, que se obtiene después de alineamiento óptimo, este porcentaje es puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen aleatoriamente sobre su longitud. La comparación de dos secuencias de ácido nucleico o aminoácido se lleva a cabo tradicionalmente al comparar las secuencias después de haberlas alineado en forma óptima, la comparación es capaz de realizarse por segmento o al utilizar una "ventana de alineamiento" . Alineamiento óptimo de las secuencias para comparación puede llevarse a cabo, además de comparación a mano, mediante el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], mediante el algoritmo de homología local de Neddleman and unsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], mediante el método de búsqueda de similaridad de Pearson and Lipman (1988) [Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444] o mediante soporte lógico de computadora utilizando estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o por el soporte lógico de comparación BLAST NR o BLAST P) .

El por ciento de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos se determina al comparar las dos secuencias alineadas en forma óptima en donde la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos para comparar pueden tener adiciones o deleciones comparadas con la secuencia de referencia para óptimo alineamiento entre las dos secuencias. El por ciento de identidad se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales el residuo o nucleótido aminoácido es idéntico entre las dos secuencias, de preferencia entre las dos secuencias completas, dividir el número de posiciones idénticas por el número total de posiciones en la ventana de alineamiento y multiplicar el resultado por 100, para obtener el por ciento de identidad entre las dos secuencias.

Por ejemplo, el programa BLAST, "secuencias BLAST 2" (Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS icrobiol, 1999, Lett . 174:247-250) disponible en el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, puede utilizarse con los parámetros predefinidos (notablemente para los parámetros "penalidad de espacio abierto (open gap penalty)": 5, y "penalidad de espacio de extensión (extensión gap penalty)": 2; la matriz selecta por ejemplo es la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa) ; el por ciento de identidad entre las dos secuencias a comparar se calcula directamente por el programa.

Para la secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia, ejemplos preferidos incluyen aquellos que contienen la secuencia de referencia, ciertas modificaciones, notablemente una deleción, adición o substitución de al menos un aminoácido, truncado o extensión. En el caso de substitución de uno o más aminoácidos consecutivos o no-consecutivos, se prefieren substituciones en donde los aminoácidos substituidos se reemplazan por aminoácidos "equivalentes". Aqui, la expresión "aminoácidos equivalentes" se pretende que indique cualesquiera aminoácidos que probablemente sean substituidos por uno de los aminoácidos estructurales sin modificar sin embargo las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y la de los ejemplos específicos definidos a continuación.

Aminoácidos equivalentes pueden ser determinados ya sea en su homología estructural con los aminoácidos para los cuales se substituyen o en los resultados de pruebas comparativas de actividad biológica entre los diversos anticuerpos que probablemente se generen. Como un ejemplo no limitante, la tabla 1 siguiente resume las posibles substituciones que probablemente se lleven a cabo sin resultar en una modificación significante de la actividad biológica del anticuerpo modificado correspondiente; substituciones inversas son naturalmente posibles bajo las mismas condiciones.

Tabla 1 Residuo original Substitución (es) Ala (A) Val, Gly, Pro Arg (R) Lys, His Asn (N) Gln ASP (D) Glu Cys (C) Ser Gln (Q) Asn Glu (G) Asp Gly (G) Ala His (H) Arg lie (I) Leu Leu (L) lie, Val, Met Lys (K) Arg Met (M) Leu Phe (F) Tyr Pro (P) Ala Ser (S) Thr, Cys Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Phe, Trp Val (V] Leu, Ala En una modalidad especifica, la presente invención se refiere a anticuerpos murinos o compuestos derivados o fragmentos funcionales de los mismos.

Como se vio con anterioridad, la invención también se refiere a cualquier compuesto derivado de anticuerpos como se describe en la invención.

De manera más particular, un anticuerpo de la invención, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracteriza porque el compuesto derivado consiste de una proteina de enlace que comprende un andamio péptido en el cual se injerta al menos una CDR de manera tal que conserve todo o parte de las propiedades de reconocimiento de parátopo del anticuerpo inicial.

Una o más secuencias entre las secuencias CDR descritas en la presente invención, también pueden estar presentes en los diversos andamios de proteina inmunoglobulina . En este caso, la secuencia de proteínas hace posible para recrear un esqueleto péptido favorable al plegamiento de las CDRs injertadas, permitiéndoles conservar sus propiedades de reconocimiento de antígeno parátopo .

En general, una persona con destreza en la técnica sabe como determinar el tipo de andamio de proteínas en la que se injerte al menos una de las CDRs que surjan del anticuerpo original. De manera más particular, se conoce que para seleccionar estos andamios deben cumplirse el número más grande de criterios como sigue (Skerra A., J. MolT Recogn.., 2000, .13: 167-187) : - buena conservación filogenética; - estructura tri-dimensional conocida (tal como por ejemplo, por cristalografía, espectroscopia RMN o cualquier otra técnica conocida con una persona con destreza en la especialidad) ; - tamaño pequeño; - pocas o ningunas modificaciones posttranscripción; y/o - facilidad de producción, expresión y purificación .

El origen de estos andamios de proteínas puede ser, pero no está limitado a las estructuras seleccionadas entre: fibronectina y preferencialmente dominio 10 tipo fibronectina III, lipocalina, anticalina (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74 ( 4 ) : 257-75 ) , proteina Z que surge del dominio B de proteina A de Staphylococcus aureus, tioredoxina A o proteínas con un motivo repetido tal como la "repetición anquirina" (Kohl et al, PNAS, 2003, vol . 100, No. 4, 1700-1705), la "repetición armadillo", la "repetición rica en leucina" y la "repetición tetratricopéptido" .

Andamios derivados de toxinas tales como, por ejemplo toxinas de. escorpiones, insectos, plantas, moluscos, etc., y los inhibidores de proteína de NO sintasa neuronal (PIN) también habrán de ser mencionados.

Un ejemplo, de ninguna manera limitante, de estas construcciones híbridas, es la inserción de la CDR-H1 (cadena pesada) de un anticuerpo anti-CD4, es decir 13B8.2, en uno de los bucles en PIN, la nueva proteína de enlace de esta manera obtenida conserva las mismas propiedades de enlace que el anticuerpo original (Bes et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. , 2006, 343(1), 334-344). En una base puramente ilustrativa, injertar la CDR-H3 (cadena pesada) de un anticuerpo anti-lisozima VHH en uno de los bucles de neocarzinostatina (Nicaise et al, Protein Science, 2004, 13 (7 ): 1882-1891) también puede mencionarse.

Finalmente como se describió con anterioridad, estos andamios péptido pueden comprender al menos una de las CDRs que surjan del anticuerpo original. De preferencia, pero no siendo un requerimiento, una persona con destreza en la técnica seleccionará al menos una CDR de la cadena pesada, esta última se conoce que es primordialmente responsable por la especificidad del anticuerpo. La selección de una o más CDRs relevantes es obvio a una persona con destreza en la técnica, quien seleccionará técnicas conocidas convenientes (Bes et al, FEBS letters 508, 2001, 67-74) .

Un aspecto especifico de la presente invención se refiere a un método para seleccionar un compuesto derivado de. un anticuerpo de acuerdo con- la invención, el compuesto derivado es capaz de inhibir entrada celular VIH in vitro y/o in vivo y el compuesto derivado comprende un andamio péptido en el cual se injerta al menos una CDR de anticuerpo, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) la colocación en contacto in vitro de un compuesto de un andamio péptido en el que se injerta al menos una CDR de anticuerpo con una muestra biológica que contiene VIH tipo 1 y PBMC; y b) selección del compuesto si el compuesto es capaz de inhibir la replicación VIH-1, y caracterizado porque la CDR injertada como mínimo se elige entre las siguientes CDRs de secuencias SEQ ID No. 1 a 6 y 30 a 33 o una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID Nos. 1 a 6 y 30 a 33.

De acuerdo con un modo preferido, el método puede incluir en la etapa a) la colocación en contacto in vitro de un compuesto que comprende un andamio péptido en el que se injertan al menos dos o tres CDRs de anticuerpo.

De acuerdo con un modo aún más preferido de este método, el andamio péptido se elige entre los andamios o proteínas de enlace cuyas estructuras se mencionaron anteriormente .

Evidentemente, estos ejemplos de ninguna manera son limitantes, y cualquier otra estructura conocida u obvia para una persona con destreza en la técnica deberá considerarse como cubierta por la protección conferida por la presente solicitud de patente.

La presente invención de esta manera se refiere a un anticuerpo, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, caracterizado porque el andamio péptido se elige entre proteínas que son a) filogenéticamente bien conservadas, b) de arquitectura robusta, c) con una organización molecular 3-D bien conocida, d) de tamaño pequeño y/o e) que comprende regiones que pueden ser modificadas por deleción y/o inserción sin modificar las propiedades de estabilidad.

De acuerdo con una modalidad preferida, el anticuerpo de la invención, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracterizan porque el andamio péptido se elige entre i) andamios que surgen de fibronectina, de preferencia dominio 10 de tipo fibronectina 3, lipocalina, anticalina, proteína Z que surge del dominio B de proteína A de Staphylococcus aureus, tioredoxina A o proteínas con un motivo repetido tal como "repetición anquirina" (Kohl et al, PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), la "repetición armadillo", la "repetición rica en leucina" y la "repetición tetratricopéptido" o iii) inhibidores de proteína de NO sintasa neuronal (PIN) .

Otro aspecto de la invención se refiere a los fragmentos funcionales del anticuerpo anteriormente descrito .

Más particularmente, la invención hace blanco en un anticuerpo, o sus compuestos o fragmentos funcionales derivados, caracterizado porque el fragmento funcional se elige entre los fragmentos Fv, Fab, (Fab')2í Fab ' , scFv, scFv-Fc y diacuerpos, o cualquier fragmento cuya vida media se ha incrementado tales como fragmentos PEGilados.

Estos fragmentos funcionales del anticuerpo de acuerdo con la invención consisten por ejemplo, de los fragmentos Fv, scFv (se = cadena sencilla), Fab, F(ab')2, Fab1, scFv-Fc o diacuerpos, o cualquier fragmento cuya vida media se ha incrementado por modificación química, tal como la adición de polialquilen glicol tal como polietilen glicol (PEGilación) (fragmentos PEGilados se refieren como Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab' )2-PEG y Fab'-PEG), o por incorporación en un liposoma, microesferas o PLGA, los fragmentos poseen al menos una de las CDRs características de la invención que notablemente es capaz de ejercer en una forma general actividad, incluso parcial, del anticuerpo del cual surge.

De preferencia, los fragmentos funcionales : comprenderán p . incluirán una secuencia parcial de la cadena pesada o ligera variable del anticuerpo del cual se derivan, la secuencia parcial es suficiente para retener la misma especificidad de enlace que el anticuerpo del cual surge y suficiente afinidad, de preferencia al menos igual a 1/100, más preferiblemente al menos 1/10 del anticuerpo del cual surge.

Este fragmento funcional contiene al menos cinco aminoácidos, de preferencia 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 o 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia de anticuerpo del cual surge.

De preferencia, estos fragmentos funcionales serán de los tipos Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc o diacuerpos, que generalmente tienen la misma especificidad de enlace que el anticuerpo resultan. De acuerdo con la presente invención, fragmentos del anticuerpo de la invención pueden obtenerse de los anticuerpos anteriormente descritos, por métodos tales como digestión de enzimas, incluyendo pepsina o papaina y/o por ruptura de los puentes disulfuro por reducción química. Los fragmentos de anticuerpo también pueden ser obtenidos por técnicas genéticas recombinantes también conocidas por una persona con destreza en la especialidad o por síntesis de péptidos mediante por ejemplo, sintetizadores péptido automáticos tales como aquellos vendidos por Applied BioSystems, etc.

Para más claridad, la tabla 2 a continuación resume las diversas secuencias de aminoácidos que corresponden a los anticuerpos de la invención.

Tabla 2 (en donde Mu. = murino) AntiNumeCadena Cadena SEQ ID cuerpo ración CDR Pesada Ligera NO.

CDR-L1 1 CDR-L2 2 IMGT CDR-L3 3 CDR-H1 4 CDR-H2 5 515H7 CDR-H3 6 CDR-L1 9 CDR-L2 10 Kabat CDR-L3 3 CDR-H1 11 CDR-H2 12 CDR-H3 13 Dominio variable Mu 7 Dominio variable 8 Mu CDR-H1 1 CDR-H2 2 IMGT CDR-H3 30 CDR-H1 31 CDR-H2 32 CDR-H3 33 301aE5 CDR-H1 9 CDR-H2 36 CDR-H3 37 Kabat CDR-H1 38 CDR-H2 39 CDR-H3 40 Dominio variable Mu 34 Dominio variable 35 Mu . Un aspecto adicional particular.. importante de los anticuerpos objeto de la presente invención, es que no exhiben funciones efectoras, tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) .

Más particularmente, como un ejemplo, los anticuerpos de la invención, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, no tienen afinidad para FCYR (I, II o III) o para Clq, o ambos de los mismos.

Estructuralmente, esto significa para la persona con destreza en la especialidad, que los anticuerpos de la invención, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, están carentes de la porción Fe o su porción Fe no presenta una glicosilación correcta capaz de conferir funciones efectoras. La consecuencia de esto es que los anticuerpos de la invención de preferencia se eligen de isotipos IgG4 o IgG2, más preferiblemente IgG4.

De manera similar, fragmentos preferidos son fragmentos carentes de ADCC tales como fragmentos Fv, scFv (se para cadena sencilla), Fab, F(ab' )2, Fab 1 , scFv-Fc o diacuerpos, o cualquier fragmento de los cuales el tiempo de vida media se hubiera incrementado por modificación química, tal como la adición de poli (alquilen) glicol tal como poli (etilen) glicol ( "PEGilación" ) (fragmentos pegilados denominados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab' )2~ PEG o Fab'-PEG) ("PEG" para Poli (Etilen) Glicol) , o por incorporación en un liposoma.

De manera más particular, un fragmento funcional preferido de la invención derivado del anticuerpo 515H7 es un scFv, a continuación referido como fragmento 515H7 scFv-Ck, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 54.

La secuencia de nucleótidos correspondiente a scFv comprende secuencias SEQ ID No. 55.

Otro aspecto específico de la presente invención se refiere a anticuerpos quiméricos, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, caracterizado porque los anticuerpos también comprenden regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivada de un anticuerpo de una especie heterologa con el ratón, notablemente humanos.

Todavía otro aspecto específico de la presente invención se refiere a anticuerpos humanizados, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, caracterizado porque las regiones constantes de la cadena ligera y la cadena pesada derivada de anticuerpos humanos, respectivamente son la región lambda o kappa y la región gamma-2 o de preferencia gamma-4.

El anticuerpo de la invención también comprende anticuerpos quiméricos o humanizados.

Un anticuerpo quimérico es aquel que contiene una región variable natural (cadena ligera y cadena pesada) derivada de un anticuerpo de una especie determinada, en combinación con regiones constantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de una especie heterologa a la especie determinada.

Los anticuerpos, o fragmentos quiméricos de los mismos, pueden prepararse al utilizar las técnicas de genética recombinante . Por ejemplo, el anticuerpo quimérico puede producirse al clonar ADN recombinante que contiene un promotor y una secuencia que codifica la región variable de un anticuerpo monoclonal no humano de la invención, notablemente murino y una secuencia que codifica la región constante de anticuerpo humano. Un anticuerpo quimérico de acuerdo con la invención codificado por dicho gen recombinante, puede por ejemplo ser una quimera de ratón-humano, la especificidad de este anticuerpo se determina por la región variable derivada del ADN murino y su isotipo determinado por la región constante derivada de ADN humano. Se hace referencia a Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988) para métodos de preparación de anticuerpos quiméricos.

La tabla 3 a continuación resume las secuencias de aminoácidos de las diversas cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo quimérico 515H7 (referido como c515H7 o C515H7) de acuerdo con la invención.

Tabla 3 (en donde c = quimérico) Anticuerpo Cadena Cadena SEQ ID NO. C515H7 pesada ligera Secuencias cHV (G4wt) - 56 completas cHV - 57 (sin péptido (G4PR0) de señal cHV (G2 - 58 wt) - cVL-Ck 59 La secuencia de nucleótidos correspondiente a las cadenas pesadas de Anticuerpo c515H7 SEQ ID Nos. 56 a 58 y cadena ligera SEQ ID No. 59, corresponden respectivamente a las secuencias SEQ ID Nos. 60 a 63 (cadenas pesadas) y SEQ ID No. 64 (cadena ligera).

En una modalidad preferida, las secuencias de cadenas pesadas se eliminan de su residuo lisina C-terminal (como se encuentra en la serie de vectores pConPlus originales de Lonza: pConPlusY4AK, pConPlusy4 PROAK & pConPlusY2AK) .

Aún más, la cadena pesada G4PRO corresponde a un isotipo IgG4 humano que transporta una mutación en la región bisagra para evitar formación de semi-anticuerpos . Esta mutación se encuentra en el pConPlusy PROAK precursor de Lonza [Angal. S, King DJ, Bodmer MW, Turner A, Lawson AD, Roberts G, Pedley B, Adair JR. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol Immunol. ( 1993) ; 30 (1) : 105-108] .

En forma más particular, la invención se refiere a una cadena pesada de anticuerpo quimérico caracterizada porque comprende CDRs homologas a CDRs correspondientes de un anticuerpo derivado de una especia de mamífero diferente, en donde las CDRs, de acuerdo con IMGT, consisten de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden respectivamente las secuencias SEQ ID Nos. 4, 5 y 6.

En forma más particular, la invención se refiere a una cadena ligera de anticuerpo quimérico caracterizada porque comprende CDRs homologas a las CDRs correspondientes de un anticuerpo derivado de una especie de mamífero diferente, en donde las CDRs, de acuerdo con IMGT, consisten de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden respectivamente las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3.

En forma más particular, la invención se refiere a un anticuerpo quimérico, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, caracterizado porque comprende cadenas pesadas y ligeras, cada una que tiene CDRs homologas a CDRs correspondientes de un anticuerpo derivado de una especie de mamífero diferente, en donde las CDRs, de acuerdo con. IMGT, consisten de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de la cadena pesada que comprenden respectivamente las secuencias SEQ ID Nos. 4, 5 y 6, y CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de la cadena ligera que comprende respectivamente las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3. En otra modalidad, la invención se refiere a un anticuerpo quimérico, o compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia que consiste de SEQ ID No. 8, y una región variable de cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 7.

Todavía en otra modalidad, la invención se refiere a un anticuerpo quimérico, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una cadena pesada de secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 56, 57 o 58, y una cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 59.

En una modalidad preferida, el anticuerpo quimérico c515H7 VH(G4 t) / VL-Ck, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención comprende una región variable de cadena pesada de secuencias SEQ ID No. 56, y una región variable de cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 59.

En una modalidad preferida, el anticuerpo quimérico C515H7 VH(G4PRO) / VL-Ck, o un compuesto derivado de fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención,, comprende una región variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID No. 57, y una región variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID No. 59.

En una modalidad preferida, el anticuerpo quimérico c515H7 VH(G2wt) / VL-Ck, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención, comprende una región variable de cadena pesada de secuencias SEQ ID No. 58, y una región variable de cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 59.

"Anticuerpos humanizados" significa un anticuerpo que contiene regiones CDR derivado de un anticuerpo de origen no humano, las otras partes de la molécula de anticuerpo se derivan de uno (o varios) anticuerpos humanos. Además, algunos de los residuos de segmento de esqueleto (denominado FR) pueden ser modificados para conservar afinidad de enlace (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988). Los anticuerpos humanizados de la invención o fragmentos de los mismos pueden prepararse por técnicas conocidas por una persona con destreza en la especialidad (tal como, por ejemplo, aquellas descritas en los documentos Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Re . , 10:1-142, 1992; y Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). Estos anticuerpos humanizados se prefieren por su uso en métodos que involucran diagnósticos in vitro o tratamiento preventivo y/o terapéutico in vivo. Otras técnicas de humanización, también conocidas por una persona con destreza en la especialidad, tales como por ejemplo la técnica "injerto de CDR" descrita por PDL en las patentes EP 0 451 216, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP 0 566 647 o US 5,530,101, US 6,180,370, US 5,585,089 y US 5,693,761. Las patentes de los E.U.A. Nos. 5,639,641 o 6,054,297, 5,886,152 y 5,877,293, también pueden citarse.

Además, la invención también se refiere a anticuerpos humanizados que surgen del anticuerpo murino anteriormente descrito.

En una forma preferida, regiones constantes de la cadena ligera y cadena pesada derivadas de anticuerpo humano, respectivamente son las lambda o kappa y gamma-2 o de preferencia la región gamma- .

En forma más particular, la invención se refiere a una cadena pesada de anticuerpo humanizada, caracterizada porque comprende i) una región marco homologa a la región marco correspondiente de una cadena pesada de anticuerpo humano, y ii) homologas a CDRs correspondientes de un anticuerpo derivado de una especie de mamífero diferente, en donde las CDRs, de acuerdo con IMGT, consisten de CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden respectivamente las secuencias SEQ ID Nos. 4, 5 y .6. En otra modalidad, la invención se refiere a una cadena pesada de anticuerpo humanizado que comprende una región variable de secuencias que consisten de la SEQ ID No. 64.

Todavía en otra modalidad, la invención se refiere a una cadena pesada de anticuerpo humanizado que comprende la secuencia completa seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 67, 68 y 69.

En forma más particular, la invención se refiere a una cadena ligera de anticuerpo humanizado caracterizada porque comprende i) una región marco homologa a región marco correspondiente de una cadena ligera de anticuerpo humano, y ii) CDRs homologas a CDRs correspondientes de un anticuerpo derivado de una especie de mamífero diferente, en donde las CDRs, de acuerdo con IMGT, consiste de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprende respectivamente las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3.

En otra modalidad, la invención se refiere a una cadena ligera de anticuerpo humanizado que comprende una región variable de secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 65, 66, 82 o 83.

Todavía en otra modalidad, la invención se refiere a una cadena ligera de anticuerpo humanizado que comprende la secuencia completa seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 70, 71, 84 o 85.

En forma más particular, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o compuesto derivado o fragmento fraccional del mismo, caracterizado porque comprende cadenas pesadas y ligeras cada una que tienen i) regiones marco homologas a regiones marco correspondientes de un anticuerpo humano, y ii) CDRs homologas a correspondientes CDRs de un anticuerpo derivado de una especie de mamífero diferente, en donde las CDRs, de acuerdo con IMGT, consisten de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de la cadena pesada comprende respectivamente las secuencias SEQ ID Nos. 4, 5 y 6, y CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3 de la cadena ligera que comprende respectivamente las secuencias de SEQ ID Nos. 1, 2 y 3.

En otra modalidad, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada de secuencias que consisten de SEQ ID No. 64, y una región variable de cadena ligera de secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 65, 66, 82 o 83.

Todavía en otra modalidad, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una cadena pesada de secuencia que se seleccionan del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 67, 68 o 69, y una cadena ligera de secuencias seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 70, 71, 84 o 85.

En una modalidad preferida, el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl D76N (G4wt) / VL2-Ck, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención, comprende una cadena pesada de secuencias SEQ ID No. 67, y una cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 70.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl D76N (G4PRO) / VL2-Ck, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención comprende una cadena pesada de secuencias SEQ ID No. 68, y una cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 70.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo humanizado Hz515H7 VH1 D76N (G2wt) / VL2-Ck, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención, comprende una cadena pesada de secuencias SEQ ID No. 69, y una cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 70.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo humanizado Hz515H7 VH1 D76N (G4wt) / VL2.1-Ck, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención, comprende una cadena pesada de secuencias SEQ ID No. 67, y una cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 71.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo humanizado Hz515H7 VH1 D76N. (G4PRO) / VL2.1-Ck, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, dé acuerdo con la invención comprende una cadena pesada de secuencias SEQ ID No. 68, y una cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 71.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo humanizado Hz515H7 VH1 D76N (G2wt) / VL2.1-Ck, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención comprende una cadena pesada de secuencias SEQ ID No. 69, y una cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 71.

En otras modalidad preferida, el anticuerpo humanizado Hz515H7 VH1 D76N (G4wt) / VL2.2-Ck, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención, comprende una cadena pesada de secuencias SEQ ID No. 67, y una cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 84.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl D76N (G4PR0) / VL2.2-Ck, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención, comprende una cadena pesada de secuencias SEQ ID No. 68, y una cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 84.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl D76N (G2wt) / VL2.2-Ck, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención, comprende una cadena pesada de secuencias SEQ ID No. 69, y una cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 84.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl D76N (G4wt) / VL2.3-Ck, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención comprende una cadena pesada de secuencias SEQ ID No. 67, y una cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 85. En otra modalidad preferida, el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl D76N (G4PRO) / VL2.3-Ck, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención, comprende una cadena pesada de secuencias SEQ ID No. 68, y una cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 85.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo humanizado Hz515H7 VH1 D76N (G2wt) / VL2.3-Ck, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención, comprende una cadena pesada de secuencias SEQ ID No. 69, y una cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 85.

La tabla 4 siguiente resume las secuencias de aminoácidos de los diversos dominios variables de cadenas pesadas y ligeras y longitud integra (o completa) , respectivamente, del anticuerpo humanizado 515H7 de acuerdo con la invención.

Tabla 4 (en donde Hz = humanizado) Anticuerpo Cadena Cadena SEQ ID NO. Hz515H7 pesada ligera Dominios VH1 D76N - 64 variables - VL2 54 - VL2.1 66 - VL2.2 82 VL2.3 83 - VH1 D76N - 67 (G4wt) VH1 D76N - 68 Secuencias (GPRO) completas VH1 D76N - 69 (sin péptido (G2 wt) de señal) VL2-Ck 70 VL2. l-Ck 71 VL2.2-Ck 84 VL2.3-Ck 85 En una modalidad preferida, las secuencias de cadenas pesadas se eliminan de su residuo lisina C-terminal (como se encuentra en las series de vector pConPlus original de Lonza: pConPlusY4AK, pConPlusY4PROAK & pConPlusY2AK) .

Aún más, la cadena pesada G4PRO corresponde a un isotipo IgG4 humano que transporta una mutación en la región bisagra para evitar formación de semi-anticuerpos . Esta mutación se encuentra en el pConPlusy4 PROAK precursor de Lonza [Angal S, King DJ, Bodmer MW, Turner A, Lawson AD, Roberts G, Pedley B, Adair JR. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol Immunol. ( 1993 ) ; 30 ( 1 ) : 105-108] .

Como un ejemplo, para evitar duda, la expresión "VH1" es similar a las expresiones "Variante VH 1", "variante VH 1", "VH Var 1" o "VH var 1) . Habrá de entenderse que las combinaciones VH / VL anteriormente ejemplificadas no son limitantes. La persona con destreza en la técnica por supuesto, puede sin carga indebida y sin aplicar destreza inventiva, rearreglar todas las VH y VL descritas en la presente especificación.

Un aspecto novedoso de la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado que se caracteriza porque se elige entre los siguientes ácidos nucleicos (incluyendo cualquier código genético degenerado): a) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, de acuerdo con la invención; b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo de secuencias que consisten de SEQ ID Nos. 14 a 19 y 41 a 45; c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo de secuencias que consisten de SEQ ID Nos. 20, 21, 46 y 47; d) los ácidos nucleicos de ARN correspondientes del ácido nucleico como se define en b) o c) ; e) los ácidos nucleicos complementarios de los ácidos nucleicos como se define en a), b) y c) ; y f) un ácido nucleico de al menos 18 nucleótidos capaces de hibridizar bajo condiciones de alta severidad con al menos una de las CDRs de una de las secuencias SEQ ID Nos. 14 a 19 y 41 a 45.

La Tabla 5 a continuación resume las diversas secuencias de nucleótidos referentes a anticuerpos de la invención .

Tabla 5 (en donde Mu. = murino) SEQ AntiNumeración Cadena Cadena ID cuerpo CDR pesada ligera NO.

CDR-L1 14 CDR-L2 15 CDR-L3 16 IMGT CDR-H1 17 CDR-H2 18 CDR-H3 19 515H7 CDR-L1 22 CDR-L2 23 CDR-L3 16 Kabat CDR-H1 24 CDR-H2 25 CDR-H3 26 Dominio Variable 20 Mu.

Dominio Variable 21 Mu.

CDR-L1 41 CDR-L2 15 CDR-L3 42 I GT CDR-H1 43 CDR-H2 44 CDR-H3 45 CDR-L1 48 CDR-L2 49 Kabat CDR-L3 50 301aE5 CDR-H1 51 CDR-H2 52 CDR-H3 53 Dominio Variable 46 Mu.

Dominio Variable 47 Mu.

Los términos "ácido nucleico", "secuencia nucleica", "secuencia de ácido nucleico", "polinucleótido", "oligonucleótido", "secuencia de polinucleótidos" y "secuencia de nucleótidos" empleadas en forma intercambiable en la presente descripción, significan una secuencia precisa de nucleótidos, modificada o no, que define un fragmento o una región de un ácido nucleico que contiene nucleótidos no naturales o no y que ya es un ADN de doble hebra, un ADN de una sola hebra o productos de transcripción de dichos ADNs.

Habría de incluirse aquí que la presente invención no se refiere a secuencias nucleótido en su ambiente cromosomal natural, es decir en un estado natural. Las secuencias de la presente invención se han aislado y/o purificado es decir se muestrearon en forma directa o indirecta, por ejemplo por una copia, su ambiente ha sido al menos parcialmente modificado. Ácidos nucleicos aislados que se obtienen por genética recombinante , por ejemplo mediante células hospederas, o que se obtienen por síntesis química, también habrán de mencionarse aquí.

"Secuencias nucleicas que exhiben un por ciento de identidad de al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98%, después de alineamiento óptimo con una secuencia preferida" significan secuencias nucleicas que exhiben con respecto a la secuencia nucleica de referencia, ciertas modificaciones tales como en particular una deleción, un truncado, una extensión, una fusión quimérica y/o una sustitución, notablemente puntual. De preferencia, éstas son secuencias que codifican para las mismas secuencias de aminoácidos que las secuencias de referencia, esto relacionado a la degeneración del código genético, o secuencias de complementariedad que probablemente hibridizan en forma especifica con las secuencias de referencia, de preferencia bajo condiciones altamente severas, notablemente aquellas definidas a continuación.

Hibridización bajo condiciones altamente severas significa aquellas condiciones relacionadas a temperatura y fuerza iónica que se eligen de manera tal que permiten que la hibridización se mantenga entre dos fragmentos de ADN complementarios. En una base puramente ilustrativa, las condiciones altamente severas de la etapa de hibridización para el propósito de definir los fragmentos polinucleótido anteriormente descritos, ventajosamente son como sigue.

Hibridización ADN-ADN o ADN-ARN se lleva a cabo en dos etapas: (1) prehibridización a 42°C por tres horas en amortiguador fosfato (20 m , pH 7.5) que contiene 5X SSC (IX SSC corresponde a una solución de NaCl 0.15 M + citrato de sodio 0.015 M) , formamida al 50%, dodecil sulfato de sodio al 7% (SDS) , Denhardt a 10X, dextran sulfato al 5% y ADN de esperma de salmón al 1%; (2) hibridización primaria por 20 horas a una temperatura que depende de la longitud de la sonda (es decir: 42°C para una sonda >100 nucleótidos de longitud) seguido por dos lavados de 20 minutos a 20 C en 2X SSC + 2% SDS, un lavado de 20 minutos a 20°C en 0. IX SSC + 0.1% SDS. El último lavado se lleva a cabo en 0. IX SSC + 0.1% SDS por 30 minutos a 60°C para una sonda de >100 nucleótidos de longitud. Las condiciones de hibridización altamente severas descritas anteriormente para un polinucleótido de tamaño definido, pueden adaptarse por una persona con destreza en la especialidad para oligonucleótidos más largos o más cortos, de acuerdo con los procedimientos descritos por Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition,. 2001) .

La invención también abarca una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque se elige entre los siguientes ácidos nucleicos: a) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica una cadena pesada de anticuerpo humanizado, o para un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invención; b) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica una cadena ligera de anticuerpo humanizado o para un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo de acuerdo con la invención; c) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo humanizado o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo de acuerdo con la invención; d) un ácido nucleico complementario a un ácido nucleico como se define en a) , b) o c) ; e) un ácido nucleico de al menos 18 nucleótidos capaces de hibridizar bajo condiciones altamente severas con al menos una cadena pesada que comprende las secuencias de ácido nucleico SEQ ID No. 72 o 75 a 77; f) un ácido nucleico de al menos 18 nucleótidos capaces de hibridizar bajo condiciones altamente severas con al menos una cadena ligera que comprende las secuencias de ácido nucleico SEQ ID No. 73, 74, 86, 87 ó 78, 79, 88, 89. . .

La tabla 6 posteriormente resume las secuencias de nucleótido de diversos dominios variables de cadena pesada y ligera y de longitud integra (o completa) respectivamente del anticuerpo humanizado 515H7 de acuerdo con la invención.

Tabla 6 (en donde Hz = humanizado) Anticuerpo Cadena Cadena SEQ ID Hz515H7 Pesada Ligera No.

Dominios VH1 D76N - 72 variables - VL2 73 - VL2.1 74 - VL2.2 86 - VL2.3 87 VH1 - 75 Secuencias D76N (G4wt ) Completas VH1 - 76 (sin péptido D76 (G4PRO) de señal) VH1 - 77 D76 (G2wt) - VL2-Ck 78 - VL2.1-Ck 79 - VL2.2-Ck 88 - VL2.3-Ck 89 La tabla 7 a continuación resume las secuencias de nucleótidos de las diversas cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo quimérico 515H7 de acuerdo con la invención.

Tabla 7 (en donde c = quimérico) Anticuerpo Cadena Cadena SEQ ID C515H7 Pesada ligera No. cVH (G4wt) - 60 Secuencias cVH (G4PRO) - 61 completas (sin cVH(G2 wt) - 62 péptido de señal) - cVL-Ck 63 En otras palabras, la invención trata con un ácido nucleico aislado, caracterizado porque se elige de los siguientes ácidos nucleicos: a) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica a un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales de acuerdo con la invención; b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo de secuencias CDRs que consisten de SEQ ID Nos. 14 a 19 y 41 a 45; c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que selecciona en el grupo de secuencias de dominios variables pesados y ligeros que consisten de SEQ ID Nos. 20, 21, 46, 47, 72, 73, 74, 86 y 87; d) un ácido nucleico, que comprende una secuencia de ADN que selecciona del grupo de secuencias de cadenas pesadas y ligeras que consisten de SEQ ID Nos. 60 a 63, 75 a 79, 88 y 89; e) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que consiste de SEQ ID No. 55; f) los ácidos nucleicos de ARN correspondientes de los ácidos nucleicos como se define en b) , c) , d) o e) ; g) los ácidos nucleicos complementarios de los ácidos nucleicos como se define en a) , b) , c) , d) y e) ; y h) un ácido nucleico de al menos 18 nucleótidos capaces de hibridizar bajo condiciones de alta severidad con al menos una de las CDRs de secuencias SEQ ID Nos. 14 a 19 y 41 a 45.

La invención también se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico como se describe en la invención.

La invención hace notablemente blanco en vectores de clonación y/o expresión que contienen esta secuencia de nucleótidos .

Los vectores de la invención de preferencia contienen elementos que permiten la expresión y/o secreción de secuencias nucleótido en una célula hospedera determinada. El vector de esta manera debe contener un promotor, señales de inicio y terminación de traducción, asi como regiones de . regulación de transcripción convenientes. Debe ser capaz de mantenerse en una forma estable en la célula hospedera y opcionalmente tener señales especificas que especifican la secreción de la proteina traducida. Estos diversos elementos se eligen y optimizan por una persona con destreza en la técnica de acuerdo con la célula hospedera empleada. Para este propósito, las secuencias de nucleótidos pueden insertarse en vectores autoreplicantes dentro del hospedero selecto o ser vectores integrativos del hospedero selecto.

Estos vectores se preparan por métodos típicamente empleados por una persona con destreza en la especialidad y los clones resultantes pueden introducirse en un hospedero conveniente por métodos convenientes tales como lipofección, electroporacion, choque térmico o métodos químicos .

Los vectores por ejemplo son vectores de origen plásmido o viral. Se emplean para transformar células hospederas a fin de clonar o expresar las secuencias de nucleótido de la invención.

La invención también comprende células hospederas transformadas por o que comprenden un vector como se describe en la presente invención.

La célula hospedera puede seleccionarse entre sistemas procarióticos o eucarióticos tales como células bacterianas por ejemplo pero también células de levadura o células de animales, notablemente células de mamíferos. También pueden emplearse células de insectos o plantas.

La invención también se refiere a animales, diferentes a los humanos, que tienen una célula transformada de acuerdo con la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para la producción de un anticuerpo de acuerdo con la invención o uno de sus fragmentos funcionales, caracterizado porque el método comprende las siguientes etapas : a) el cultivo en un medio de y las condiciones de cultivo convenientes de una célula hospedera de acuerdo con la invención; y b) la recuperación del anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, producidos de esta manera a partir del medio de cultivo o de las células cultivadas.

Las células transformadas de acuerdo con la invención son de uso en métodos para la preparación de polipéptidos recombinantes de acuerdo con la invención. Métodos para la preparación de polipéptidos de acuerdo con la invención en forma recombinante, caracterizados porque los métodos utilizan un vector y/o una célula transformada por un vector de acuerdo con la invención, también están comprendidos en la presente invención. De preferencia, una célula transformada por un- vector de acuerdo con ¦ la invención, se cultiva bajo condiciones que permite la expresión del polipéptido anteriormente mencionado y la recuperación del péptido recombinante.

Como ya se mencionó, la célula hospedera puede seleccionarse entre sistemas procarióticos o eucarióticos . En particular, es posible identificar las secuencias nucleótido de la invención que facilitan la secreción en este sistema procariótico o eucariótico. Un vector de acuerdo con la invención que transporta dicha secuencia puede de esta manera utilizarse en forma ventajosa para la producción de proteínas recombinantes a secretar. Sin duda, la purificación de estas proteínas recombinantes de interés se verá facilitada por el hecho de que están presentes en el sobrenadante del cultivo celular en vez de dentro de las células hospederas.

Los polipéptido de la invención también pueden prepararse por síntesis química. Un método de preparación semejante también es un objeto de la invención. Una persona con destreza en la técnica conoce métodos para síntesis química, tales como técnicas de fase sólida (ver en forma notable Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed. ) o técnicas de fase sólida parcial, por condensación de fragmentos o por síntesis convencional en solución. Polipéptidos que se obtienen por síntesis química y que son capaces de contener aminoácidos no naturales correspondientes, también están comprendidos en la invención .

Los anticuerpos o compuestos derivados o fragmentos funcionales de los mismos, probablemente que se obtengan por el método de la invención también están comprendidos en la presente invención.

De acuerdo con todavía otro aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos como se describió anteriormente, caracterizados porque además son capaces de ligar específicamente a un receptor de la familia quimiocina humana y/o capaces de inhibir específicamente la replicacion VIH trópica X4.

De acuerdo con todavía otro aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos como se describe anteriormente, caracterizado porque además son capaces de ligar específicamente a un receptor de familia quimiocina humana y/o capaces de inhibir específicamente replicacion VIH trópica X4/R5.

De acuerdo con una modalidad novedosa, la invención se refiere a anticuerpos o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales que consisten de anticuerpo que es biespecífico en el sentido de que comprende un segundo motivo capaz de interactuar con ¦..cualquier receptor implicado en la entrada de células VIH, tales como por ejemplo CCR5, CD4, CXCR4 (diferentes al anticuerpo de la presente invención, es decir que hacen diana en otro epítopo) o CCR3, CCR2, CCR8 , CXCR6, CXCR7 , CX3CR1.

Los anticuerpos biespecíficos o bifuncionales constituyen una segunda generación de anticuerpos monoclonales en donde dos regiones variables diferentes se combinan en la misma molécula (Hollinger and Bohlen, 1999, Cáncer and metástasis, rev. 18:411-419). Su utilidad se demostró en ambos dominios de diagnóstico y terapéutico respecto a su capacidad para hacer blanco en varias moléculas en la superficie de células; estos anticuerpos pueden obtenerse por métodos químicos (Glennie MJ et al., 1987, J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al., 1995, J. Hemat . , 377-382) o métodos somáticos (Staerz U.D. and Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457; Suresh .R. et al., 1986, Method Enzymol, 121 : 210-228) pero también de preferencia por técnicas de ingeniería genética que hacen posible forzar heterodimerización y de esta manera facilitar la purificación del anticuerpo buscado (Merchand et al., 1998, Nature Biotech., 16:677-681).

Estos anticuerpos biespecífieos pueden construirse como IgG entero, Fab ' 2 biespecificos , Fab 'PEG, diacuerpos o scFv biespecífieos pero también como anticuerpo biespecifico tetravalente en el que dos sitios de enlace están presentes por cada antígeno dirigido (Park et al, 2000, Mol. Immunol, 37(18): 1123-30) o los fragmentos de los mismos como se describió anteriormente.

Además de la ventaja económica dada que la producción y administración del anticuerpo biespecífico son más económicas que la producción de dos anticuerpos específicos, el uso de estos anticuerpos biespecífieos tiene la ventaja de reducir la toxicidad de tratamiento. Sin duda, el uso de un anticuerpo biespecífico hace posible el disminuir la cantidad total de anticuerpos en circulación y consecuentemente posible toxicidad.

En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos biespecificos son anticuerpos bivalentes o tetravalentes .

Finalmente, la presente invención se refiere a los anticuerpos anteriormente descritos, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, como un medicamento.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende como un ingrediente activo, un compuesto que comprende un anticuerpo de la invención, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales. De preferencia, el anticuerpo se suplementa por un excipiente y/o un portador farmacéutico aceptable.

La invención también se refiere a la composición como se describió . anteriormente como un medicamento.

En un aspecto particular de la invención, el anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, inhibe replicación de aislado primario VIH-1 KON en PBMC con una IC90 de al menos 5 µg/ml, de preferencia al menos 10 g/ml.

La presente invención también comprende el uso de un anticuerpo o la composición de acuerdo con la invención para la preparación de un fármaco y/o medicamento para la prevención o tratamiento de infección VIH.

Más particularmente, como un ejemplo no limitante, la infección VIH es una infección VIH trópica-X4.

En otra modalidad, como un ejemplo no limitante, la infección VIH es una infección VIH trópica X4/R5.

La presente invención también se refiere al uso de un anticuerpo, o un fragmento funcional o derivado del mismo de preferencia humanizado y/o de una composición de acuerdo con la invención, para la preparación de un fármaco para inhibir replicación de VIH. En general, la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo, o un fragmento funcional o derivado del mismo, de preferencia humanizado y/o de una composición, para la preparación de un fármaco para tratamiento o prevención de enfermedad VIH.

En la presente descripción "vehículo farmacéutico" significa un compuesto o una combinación de compuestos, que entran a una composición farmacéutica que no provoca reacciones secundarias y que por ejemplo facilita la administración de los compuestos activos, incrementa su vida útil y/o efectividad en el organismo, incrementa su solubilidad en solución o mejora su almacenamiento. Estos portadores farmacéuticos son bien conocidos y serán adaptados por una persona con destreza en la técnica de acuerdo con la naturaleza y la ruta de administración de los compuestos activos selectos.

De preferencia, estos compuestos se administrarán por ruta sistémica, en forma notable por ruta intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal , subcutánea, intravaginal u oral. Más preferible, la composición compuesta del anticuerpo de acuerdo con la invención será administrada en varias dosis separadas igualmente con el tiempo.

Sus rutas de administración, programas de dosis y formas galénicas óptimas pueden determinarse de acuerdo con los criterios generalmente tomados en consideración cuando se establece un tratamiento adecuado para un paciente, tal como por ejemplo la edad o peso corporal del paciente, la seriedad de su estado general, su tolerancia para el tratamiento y los efectos secundarios experimentados.

La invención también se refiere a una composición que comprende, además, como un . producto en combinación para utilizar en una forma simultánea separada o extendida, un anticuerpo anti-VIH o un anticuerpo de entrada de células anti-VIH o un anticuerpo de replicación anti-VIH diferente a un anticuerpo dirigido contra CXCR4.

De acuerdo con todavía otra modalidad, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica como se describió anteriormente, que comprende al menos un segundo compuesto anti-VIH seleccionado entre los compuestos capaces de inhibir específicamente entrada VIH y/o replicación tales como compuestos anti-CCR5, anti-CD4 y compuestos anti-CXCR4 diferentes a aquellos descritos en esta invención, o cualquier otro compuesto anti-VIH conocido por una persona con destreza en la especialidad.

Otra modalidad complementaria de la invención consiste de una composición como se describió anteriormente, que comprende de, además, como un producto de combinación o conjugación para uso simultáneo separado o extendido, un compuesto anti-VIH.

"Uso simultáneo" significa la administración de ambos compuestos de la composición comprendida en una forma de dosis sencilla.

"Uso separado" significa administración, al mismo tiempo, de ambos compuestos de la composición, comprendidos en formas de dosis distintas.

"Usó extendido" significa la administración sucesiva de ambos compuestos de la composición, cada uno comprendido en una forma de dosis distinta.

En general, la composición de acuerdo con la invención aumenta considerablemente la efectividad de tratamiento de VIH. En otras palabras, el efecto terapéutico del anticuerpo de la invención se mejora en una forma inesperada por la administración de un agente anti-VIH. Otra ventaja subsecuente mayor producida por una composición de la invención, se refiere a la posibilidad de utilizar dosis efectivas menores del ingrediente activo, haciendo de esta manera posible evitar o reducir los riesgos de la aparición de efectos secundarios, en particular el efecto del agente anti-VIH. Aún más, esta composición hace posible lograr el efecto terapéutico esperado en forma más rápida.

"Agente anti-VIH terapéutico" significa una sustancia que cuando se administra un paciente, trata o evita la replicación de VIH en el paciente. Ejemplos no limitantes de estos agentes incluyen "fármacos antiretrovirales tales como inhibidores de proteasa (PI = Protease Inhibitors) VIH, inhibidores de transcripción inversa de nucleósido/nucleótido VIH (NRTI/NtRTI = Nucleoside/Nucleotide HIV Reverse Transcriptase Inhibitors) , inhibidores de transcripción inversa de VIH no nucleósidos (NNRTI. = Non Nucleoside HIV Reverse Transcriptase Inhibitors), inhibidores de entrada de VIH, inhibidores de VIH integrasa".

Estos agentes por ejemplo se citan en VIDAL, en las páginas dedicadas a compuestos relacionados a "compuestos anti-VIH", los compuestos anti-VIH citados por referencia en este documento se citan aquí como agentes anti-VIH preferidos no limitantes.

Inhibidor de VIH proteasa se refiere a cualquier sustancia que pueda inhibir actividad de VIH proteasa. Ejemplos de estos inhibidores de VIH proteasa incluyen pero no están limitados a Saquinavir mesilato o SQV (Invirase®), Indinavir o IDV (Crixivan®) , Ritonavir o RTV (Norvir®) , Nelfinavir o NFV (Viracept®) , Amprenavir (Agenerase®, Prozei®) , Lopinavir/ritonavir o LPV/r (Kaletra®, Aluvia®) , Atazanavir o ATV (Reyataz®, Zrivada®) , Fosamprenavir o FPV (Lexiva®, Telzir®) , Tipranavir o TPV (Aptivus®) , Darunavir o DRV (Prezista®) .

Inhibidores de transcriptasa inversa de VIH nucleósido o nucleótido (NRTI) se refieren a una sustancia que es un análogo de nucleósido o nucleótido que bloquea la transcripción inversa de ARN VIH. Ejemplos de NRTI incluyen pero no están limitados a Zidovudine o AZT5ZDV (Retrovir/combivir/trixivir®) , Didanosine o ddi (Videx®) , Zalcitabine (HIVID®) , Stavudine o d4T (Zerit®) , Lamivudine o 3TC (Epivir/combivir/epzicom/trixivir®). , Abacavir o ABC ( Ziagen/trixivir/epzicom®) , Tenofovir disoproxil fumarato o TDF (Viread/atripla/truvada®) , Emtricitabina o FTC (Emtriva/atripla/truvada®) .

Inhibidor de transcriptasa inversa VIH no nucleósido (NNRTI) se refiere a una sustancia que no es un análogo nucleósido o nucleótido que bloquea la transcripción inversa de ARN VIH. Ejemplos de NNRTI incluyen pero no están limitados a Nevirapine o NVP (Viramune®) , Efavirenz o EFV ( Sustiva/atripla®, Stocrin®) , Delavirdine o DLV (Rescriptor®) y Etravirine o ETR (Intelence®) .

Inhibidor de entrada VIH se refiere a una sustancia que bloquea la entrada de células VIH. Ejemplos de inhibidores de entrada de VIH incluyen pero no están limitados a Enfuvirtide o T20 (Fuzeon®), Maraviroc o MVC (Celsentri®, Celzentry®) .

Inhibidor de VIH integrasa se refiere a una sustancia que inhibe la actividad VIH integrasa. Ejemplo de inhibidor integrasa incluye pero no está limitado a Raltegravir o RAL ( Isentress®) .

Estos agentes por ejemplo también son compuestos que pertenecen a las mismas clases de fármacos descritos por VIDAL, que actualmente están en pruebas clínicas tales como pero no limitados a Vicriviroc, PRO 140, TNX-355, AMD070, Racivir, Apricitabina, Elvucitabina, Flosalvudina, Rilpivirina, Elvitegravir .

Estos agentes por ejemplo también son compuestos que pertenecen a otras clases potenciales de fármacos, tales como pero no limitados a inhibidores de maduración (Bevirimat) , análogos de glicósido de ß-galactosil-ceramida, inhibidores de enlace carbohidrato, inhibidores de RNaseH, inhibidores de expresión de genes VIH, estimuladores de liberación de VIH de células T latentes (ácido valpróico... ) .

En una modalidad particularmente preferida, la composición de la invención como un producto de combinación se caracteriza porque el agente anti-VIH se liga químicamente al anticuerpo para uso simultáneo.

A fin de facilitar enlace entre el agente anti-VIH y el anticuerpo de acuerdo con la invención, pueden introducirse moléculas espadadoras entre los dos compuestos para ligar, tales como poli (alquilen) glicol polietilenglicol o los aminoácidos; o en otra modalidad, pueden ser utilizados los derivados activos de los agentes anti-VIH en los cuales se han introducido funciones capaces de reaccionar con el anticuerpo. Estas técnicas de enlace son bien conocidos por una persona con destreza en la especialidad y no se discutirán con mayor detalle en la presente descripción.

También . de preferencia, el anticuerpo de la invención que forma el conjugado se elige entre sus fragmentos funcionales, notablemente fragmentos que han perdido su componente Fe tales como fragmentos scFv.

La invención también se refiere a una composición como un producto de combinación o a un conjugado de fármaco anti-CXCR4 Mab/anti-VIH de acuerdo con la invención empleado como fármaco.

De preferencia, la composición como un producto de combinación o el conjugado será suplementado por un excipiente y/o un vehículo farmacéutico.

De esta manera, la invención se refiere al uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, para la preparación de un fármaco para blanco especifico de un compuesto que es biológicamente activo hacia replicación de VIH.

Como se demostró previamente, CXCR4 Mabs 515H7 y 301aE5 tienen fuertes actividades contra replicación VIH-1 en PBMC, de manera tal que estos anticuerpos pueden emplearse en ensayos de detección para identificar agentes antivirales antagonistas CXCR4 para tratar infección VIH-1. En la primera etapa de estos ensayos, células que expresan CXCR4 se incuban con Mabs 515H7 y/o 301aE5 y luego moléculas pueden ser evaluadas por su potencial para inhibir enlace de Mabs 515H7 y/o 301aE5. Células empleadas en este tipo de ensayos pueden ser lineas celulares transfectadas tales como lineas celulares humanas transfectadas CHO-CXCR4, NIH3T3-CXCR4 o CXCR4 tales como U373-MAGI-CXCR4 , lineas celulares humanas que expresan CXCR4 tales como NALM6 o células primarias tales como PBMC. El método empleado para detectar antagonistas de Mabs 515H7 que inhibe CXCR4 y/o enlace 301aE5 en células que expresan CXCR4, pueden ser ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay) competitivo basado en células como se describe por Zhao Q. et al. (AIDS Research And Human Retroviruses , 2003, 19, pp 947-955) o protocolos que utilizan clasificación de células fluorescentes activadas (FACS = Fluorescence-Activated Cell Sorting) tal como se describe por Juárez J. et al. (Leukemia 2003, 17, ppl294-1300 ) .

De esta manera, en un aspecto particular de la invención, se considera un proceso para la detección y/o identificación de moléculas como agentes antivirales antagonistas a CXCR4 que comprenden las etapas de: a) seleccionar células que expresan CXCR4 , b) incubar las células con un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, de la invención, y c) evaluar las moléculas probadas para su inhibición potencial del enlace entre el anticuerpo o uno de sus fragmentos o derivados funcionales a CXCR4, y d) seleccionar moléculas capaces de la inhibición.

En otra modalidad particular, la siguiente etapa e) puede agregarse: e) probar estas moléculas en un ensayo de replicación VIH-1.

Otras características y ventajas de la invención aparecen adicionalmente en la descripción con los ejemplos y figuras cuyas leyendas se presentan a continuación.

LEYENDAS DE FIGURAS La Figuras 1A y IB muestran la estrategia de activación para expresión de CXCR4 en monocitos y linfocitos .

La Figura 1A: tinción de células T con anticuerpo CD3-PE.

La Figura IB: tinción de monocitos con anticuerpo CD 14-PE.

Las Figuras 2A y 2B muestran el enlace de Mabs 515H7 anti-CXCR4 y 301aE5 en monocitos y linfocitos T.

Las Figuras 3A y 3B muestran la modulación de dimero receptor CXCR4 por SDF-1 y por Mabs 515H7 y 301aE5 anti-CXCR4 respectivamente mediante un enfoque de transferencia de energía por resonancia-bioluminiscencia (BRET) en células HEK293.

Las Figuras 4A y 4B y la Figura 5 muestran la capacidad de Mabs 515H7 y 301aE5 anti-CXCR4 para inhibir replicación de aislado KON VIH-1 (virus X ) en PBMC humanas .

Las Figuras 6A, 6B y 6C muestran la inhibición de liberación de calcio inducida por SDF-1 en células CHO-CXCR4 por Mabs 515H7 (Figura 6A) , 301aE5 (Figura 6B) y C515H7 (Figura 6C) .

Las Figuras 7 y 8 muestran la capacidad de Mabs 515H7, c515H7 y 301aE5 anti-CXCR4 para inhibir aislados primarios MN de virus X4 VIH-1 (Figura 7) y replicación de 92UG024 (Figura 8) en PBMC humanas.

La Figura 9 muestra la capacidad de Mabs 515H7, C515H7 y 301aE5 anti-CXCR4 para inhibir aislados KON primarios de virus X4 VIH-1, MN y replicación de 92UG024 en PBMC humanas.

Las Figuras 10 y 11 muestran la capacidad de Mabs 515H7, c515H7 y 301aE5 anti-CXCR4 para inhibir la replicación de aislado primario 89.6 de virus X4/R5 VIH-1 en PBMC humanas.

La Figura 12 muestra el efecto benéfico de combinar Mab c515H7 con Maraviroc para inhibir la replicación de aislado primario de 89.6 VIH-1 (virus X4/R5 dual) en PBMC humanas.

La Figura 13 muestra el efecto benéfico de combinar Mab c515H7 con Maraviroc para inhibir replicación de aislado primario UG93067 VIH-1 (virus X4/R5 dual) en PBMC humanas.

La Figura 14 muestra la capacidad de Mabs 515H7, c515H7 y 301aE5 anti-CXCR4 para inhibir replicación de aislado primario KON de virus X4 VIH-1 en PBMC.

La Figura 15 ilustra la especificidad de enlace de Mab c515H7 por análisis FACS .

La Figura 16 ilustra el efecto de Mab c515H7 en homodimero CXCR4 por el enfoque de transferencia de energía por resonancia-bioluminiscencia (BRET) .

La Figura 17: Alineamiento de secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada 515H7 con la linea germinal humana IGHV3-49*04 y IGHJ4*01. La secuencia de aminoácidos 515H7 VH se alinea con las secuencias marco aceptoras humanas selectas. Secuencias VH Vari (VH1) corresponden a las variantes humanizadas de los dominios 515H7 VH. La retro mutación sencilla en la posición 76 se ilustra con negritas.

La Figura 18: Alineamiento de secuencias de aminoácidos de cadena ligera 515H7 con la linea germinal humana IGKV4-1*01 y IGKJ 1*01. La secuencia de aminoácidos 515H7 VL se alinea con las secuencias marco aceptoras humanas selectas. Secuencias VL Var2.1, Var2.2 y Var2.3 corresponden a variantes humanizadas implementadas de 515H7 VL Var2 humanizado, con residuos mutados con negritas. Var2.1 y Var2.2 transportan 4 residuos humanizados, más mientras que Var2.3 contiene 5 residuos humanos más.

La Figura 19: Bloqueo cruzado del anticuerpo murino biotinilado 515H7 por el 515H7 quimérico y diferentes variantes de 515H7 humanizado. La actividad de las variantes humanizadas de 515H7 (hz515H7) para bloqueo cruzado del anticuerpo murino precursor 515H7 se evaluó por citometria de flujo utilizando células NIH3T3 transfectadas con CXCR4. La actividad de las variantes humanizadas se comparó con el 515H7 quimérico. La actividad de bloqueo cruzado de la VH1 variante combinada con VL (cVL) quimérico fue muy similar al del (A) quimérico. Sin reducción en la actividad de la variante VH 1 (VH1, la variante sin retro mutaciones) , se determinó cuando se combina con la variante 2 de VL (B) .

La Figura 20: Inhibición de enlace SDF-1 biotinilado por el 515H7 quimérico y variantes diferentes de 515H7 humanizado. La capacidad de la variante humanizada de 515H7 (hz515H7) para inhibir enlace SDF-1 se evalúa por citometria de flujo utilizando la linea celular RAMOS. La capacidad de inhibición de las variantes humanizadas se comparó con 515H7 quimérico. La variante humanizada hz515H7 VH1 D76N VL2 tiene capacidad similar para inhibir enlace de SDF-1 como el anticuerpo quimérico. El fragmento de anticuerpo humanizado hz515 VHl VL2 fue totalmente activo para inhibir el enlace SDF-1 con células RAMOS.

La Figura 21 muestra Mabs 515H7 humanizados (hz515H7 VHl D76N VL2 , hz515H7 VHl D76N VL2.1, hz515H7 VHl D76N VL2.2 y hz515H7 VHl D76N VL2.3) de enlace específico a CXCR4 en NIH3T3-CXCR4.

La Figura 22 muestra el efecto de Mabs 515H7 humanizados (hz515H7 VHl D76N VL2, hz515H7 VHl D76N VL2.1, hz515H7 VHl D76N VL2.2 y hz515H7 VHl D76N VL2.3) en homodímero CXCR4, por el enfoque de transferencia de energía de resonancia-bioluminiscencia (BRET) .

EJEMPLOS Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales (Mabs) contra CXCR4 humano.

Para generar anticuerpos monoclonales a CXCR4, ratones Balb/c se inmunizaron con células NIH3T3-CXCR4 recombinantes y/o péptidos que corresponden al término N extracelular CXCR4 y bucles. Ratones con 6-16 semanas de edad fueron inmunizados una vez con el antigeno en adyuvante completo de Freund subcutáneamente (s.c.) seguido por 2 a 6 inmunizaciones con antigeno en adyuvante incompleto de Freund s.c. La respuesta inmune se supervisó por sangrado retroorbitales . El suero se cribó por ELISA (como se describe a continuación) y los ratones con títulos más altos de anticuerpos . anti-CXCR4 se emplearon para fusiones. Ratones se reforzaron intravenosamente con antígeno dos días antes de sacrificio y eliminación del bazo .

- ELISA Para seleccionar los ratones que producen anticuerpos anti-CXCR4, sueros de ratones inmunizados se probaron por ELISA. Brevemente, placas de microtitulación se revistieron con péptido N-terminal [1-41] purificado conjugado a BSA a 5 g equivalentes de péptido/mL, 100 µL/pozo incubados a 4 grados C durante la noche, después bloqueados con 250 µL/pozo de gelatina al 0.5% en PBS.

Diluciones de plasma de ratones inmunizados CXCR4 se agregaron a cada pozo e incubaron por 2 horas a 37 grados C. Las placas se lavaron con PBS y después se incubaron con un anticuerpo IgG anti-ratón cabra conjugado a HRP (Jackson Laboratories) por 1 hora a 37 grados C. Después de lavar, las placas se revelaron con substrato TMB, la reacción se detuvo 5 minutos después por adición de 100 L/pozo de H2SO4 1M. Ratones que desarrollaron los títulos más altos de anticuerpos anti-CXCR4 se emplearon para generación de anticuerpos.

- Generación de hibridomas que producen Mabs a CXCR4 Los esplenocitos de ratón, aislados de ratones Balb/c que desarrollaron los más altos títulos de anticuerpos anti-CXCR4 se fusionaron con PEG a una línea celular de mieloma de ratón Sp2/0. Las células se revistieron a aproximadamente 1 x 105/pozo en placas de microtitulación seguido por incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene medio de ultra cultivo + L-glutamina 2 mM + piruvato de sodio 1 mM + HAT lx. Pozos fueron detectados por ELISA para anticuerpos IgG monoclonales anti-CXCR4. Los hibridomas que secretan anticuerpos fueron después subclonados al menos el doble por dilución limitante, se cultivaron in vitro para generar anticuerpo para mayor análisis.

* Ejemplo 2: Caracterización de especificidad de enlace de Mab 515H7 y 301aE5 anti-CXCR4 ( transfectante NIH3T3-CXCR4 ) por análisis FACS.

En este experimento, el enlace especifico a CXCR4 humano (hCXCR4) de Mabs 515H7 y 301aE5 anti-CXCR4 se examinó por análisis FACS.

Células transfectadas NIH3T3 y NIH3T3-hCXCR4 se incubaron con 10 µg/ l de anticuerpos monoclonales 515H7 y 301aE5. Las células después se lavaron con BSA al l%/PBS/NaN3 al 0.01%. A continuación, anticuerpos secundarios etiquetados Alexa se agregaron a las células y se dejó que incubaran a 4 grados C por 20 min. Las células después se lavaron de nuevo dos veces. Después del segundo lavado, se realizó análisis FACS. Resultados de estos estudios de enlace se proporcionan en la siguiente Tabla 8 que muestra [Intensidad Fluorescente Promedio (MFI = Mean Fluorescence Intensity) que se obtiene por FACS] que Mabs 515H7 y 301aE5 anti-CXCR4 liga específicamente a línea celular transfectada con CXCR4-NIH3T3 humano, mientras que no hubo reconocimiento en la célula NIH3T3 precursora.

Tabla 8 NH3T3 (MFI) NH3T3-CXCR4 (MFI) Clón 515H7 (10 16 2752 µg/ml) Clón 301aE5 (10 21 1367 Ug/ml) Ejemplo 3: Caracterización de enlace Mab 515H7 y 301aE5 antl-CXCR4 a células mononucleares de sangre periférica (PB C) por análisis FACS.

Se recolectó sangre como una capa leucocitaria de un donador sano. 100 µ? de sangre entera se incuba con anticuerpos CXCR4 anti-humanos (clones 515H7 y 301aE5) a la concentración indicada por 20 minutos a 4 grados C. La sangre se lavó tres veces en PBS-BSA l%-NaN3 0.01% e incubó con IgG Alexa 488 cabra anti-humano diluido 1:500 (Invitrogen) por 20 minutos a 4 grados C. Las células después se lavaron e incubaron con CD14-PE (Caltag) o CD3-PE (Caltag) por 10 minutos a 4 grados C y lavaron tres veces. Glóbulos rojos se lisaron con solución de lisis de Alto Rendimiento (Caltag) por 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se analizaron inmediatamente utilizando Facscalibur (Becton-Dickinson) . Expresión de CXCR4 en monocitos se realizó en células CD 14 positivas y la expresión CXCR4 en células T se realizó en células CD3 positivas (Figura 1) . Los resultados se expresan en Capacidad de Enlace de Antígeno (ABC = Antigen Binding Capacity) .

Como se muestra en las Figuras 2A y 2B, los ciónos 515H7 y 301aE5 CXCR4 anti-humanos tiñeron ambos linfocitos T (Figura 2A) y monocitos (Figura 2B) indicando que 515H7 y 301aE5 Mabs son capaces de reconocer la forma nativa de CXCR4 expresada en la superficie celular de monocitos y linfocitos T.

Ejemplo 4: Efecto de Mabs 515H7 y 301aE5 en homodimero CXCR4 , por enfoque de transferencia de energía de resonancia-bioluminiscencia (BRET) .

Este ensayo funcional permite evaluar los cambios de conformación inducidos sobre enlace Mab SDF-1 y/o 515H7 al receptor CXCR4 al nivel del homodimero CXCR4.

Vectores de expresión para los socios de interacción investigados se construyeron como proteínas de fusión con el colorante correspondiente (luciferasa de Renilla reniformis, Rluc y proteína fluorescente amarilla, YFP) al aplicar técnicas de biología molecular convencionales. Dos días antes de realizar los experimentos BRET, las células HEK293 fueron transfectadas en forma transitoria con vectores de expresión que codifican los socios BRRET correspondientes: [CXCR4/Rluc + CXCR4/YFP] para estudio de homodimerización CXCR4. El día después, las células se distribuyeron en placas de poli-lisina pre-revestidas blancas 96 MW en medio de cultivo completo [DMEM suplementado con FBS al 10%] . Las células primero se cultivaron a 37 grados C con C02 5%, a fin de permitir enlace celular a la placa. Las células después se privaron de alimento con 200 µ? de DMEM/pozo durante la noche. Inmediatamente antes del experimento BRET, DMEM se retiró y las células se lavaron rápidamente con PBS. Las células después se incubaron en PBS en la presencia o ausencia de anticuerpo, 10 min a 37 grados C antes de la adición de coelenterazina H 5 µ? con o sin SDF-1 300 nM en un volumen final de 50 µ? . Después de incubación por 10 minutos más a 37 grados C, la adquisición de emisión de luz a 485 nm y 530 nm se inició utilizando el lector de multi-etiquetas. Mithras LB940 (Berthold) (ls/longitud de onda/pozo repetido 15 veces a temperatura ambiente) .

El cálculo de la proporción BRET se realiza como se describió previamente (Angers et al., 2000): [ (emisión53o nm) - (emisión485 nm) X Cf ] / (emisión53o nm) , en donde Cf = (emisión53o nm) / (emisión485 nm) para células que expresan la proteina de fusión Rluc sola bajo las mismas condiciones experimentales. Simplificando esta ecuación se muestra que la proporción BRET corresponde a la proporción 530/485 nm que se obtiene cuando los dos socios BRET están presentes, corregida por la relación 530/485 nm que se obtiene bajo las mismas condiciones experimentales, cuando solo el socio fusionado a Rluc está presente en el ensayo. Por razones de legibilidad, los resultados se expresan en unidades milliBRET (mBU) ; mBU corresponde a la relación BRET multiplicada por 1000.

SDF1 (300 nM) aumentó en aproximadamente 20% la señal BRET resultante de la proximidad espacial de las proteínas adaptadoras y aceptoras fusionadas al receptor CXCR4, es probable que indique formación de homo-dímeros CXCR4/CXCR4 o cambios conformación de dímeros pre-existentes (Figuras 3A y B) . Mabs 515H7 y 301aE5 fueron capaces de modular cambios de conformación inducidos por SDF-1 paras los homo-dímeros CXCR4 (69% de inhibición de incremento de BRET inducido por SDF-1 para 515H7 y 301aE5, Figuras 3A y B) . Mabs 515H7 y 301aE5 también fueron capaces de modularse por sí mismos la proximidad espacial CXCR4/CXCR4, indicando una influencia de Mabs 515H7 y 301aE5 en conformación de homodimero CXCR4/CXCR4.

(Figuras 3A y 3B) .

Ejemplo 5: Inhibición de replicación de aislado primario HIV-1 KON (virus X4) en PBMC humano por Mabs 515H7 y 301aE5 anti-CXCR4.

PBMC de donadores normales seronegativos para HIV-1 se aislaron de la capa leucocitaria o citaféresis por configuración de gradiente Ficoll-Hypaque . PBMC se activaron en la presencia de PHA en medio de cultivo celular RPMI 1640 que contiene HEPES 25 mM, 5 mi de penicilina (10000 U/ml) - estreptomicina (10000 µ?/ta?) L-glutamina 2 mM, suplementado con FCS inactivado por calor al 10% y se emplearon como diana celulares en un ensayo de neutralización de ciclo sencillo. Replicación VIH-1 en PBMC humanas primarias se realizó al analizar tinción intracelular de antigeno p24 viral por análisis FACS . Brevemente, 25 µ? por pozo de diversas diluciones de Mabs 515H7, 301aE5 y 12G5 (R&D Systems) o medio de cultivo como control (RPMI 1640, 10% FCS, 0.1% IL-2), se incubaron por 1 h a 37 grados C con 25 µ? por pozo de dilución de aislado primario VIH-1 ON X4, en duplicado. PBMC humanas activadas con PHA (25 µ?/????) a 20 x 106 células/ml se agregaron a la mezcla Mab/virus en una placa de 96-pozos (fondo U, Costar 3599) y cultivaron por 24 a 36 horas a 37 grados C en RPMI 1640 10% FCS y 0.1% IL-2. Control que consiste de PBMC sin infectar en medio sin Mab se introdujo. Para detectar PBMC infectado con VIH, tinción intracelular de antigeno p24 viral se realizó y analizó por citometria de flujo. Se fijaron células y permeabilizaron utilizando el equipo Cytofix/Cytoperm (Becton Dickinson) de acuerdo con los protocolos del fabricante y tiñeron con Mab anti-p24 fluorescente (clon KC57 - Coulter Beckman) utilizado a una dilución 1/160 que se incuba por 10 min a 4 grados C en la oscuridad. Después de lavar en medio PBS-FCS al 3%, PBMC se diluye en PBS antes de análisis de citometria de flujo. El por ciento de células p24-positivas en las diferentes muestras se determina por activación de 20,000 eventos en una población de células vivas. Los sub-conjuntos de células vivas se analizaron para expresión p24 respecto a tinción de fondo de células no infectadas. El valor antigeno-positivo p24 se obtiene después de substracción de eventos de fondo en células de infección fingida. El porcentaje de neutralización se define como la reducción de células p24-positivas en comparación con células infectadas de control sin ab. El titulo neutralizante se define como la dilución de Mab que permite una disminución de 90% en el por ciento de células infectadas. Las Mabs 515H7 y 301aE5 anti-CXCR4 se compararon con Mab 12G5 que se conoce como Mab anti-CXCR4 de referencia para aplicación VIH. Como se ilustra en las Figuras 4A y B y 5, Mabs 515H7 y 301aE5 anti-CXCR4 son capaces de inhibir replicación de aislado primario VIH-1 KON en PBMC con una IC90 de 10 g/ml (66 nM) y 150 yg/ml (1 µ?) , respectivamente, mientras que 12G5 Mab falló en inhibir la replicación de aislado primario VIH-1 KON en PBMC (Figura 4A) .

Ejemplo 6: Movilización mediada por receptor CXCR4 de reservas de calcio intracelular Este ensayo funcional se diseñó para supervisar señalización de receptor CXCR4 mediante estimulo de la ruta fosfo lipasa C, induciendo liberación de calcio de reservas intracelulares del retículo endoplásmico .

Células CH0-K1, que expresan en forma estable y constitutiva receptor CXCR4 humano, se obtuvieron ante transfección de células CH0-K1 sin tratamiento previo (ATCC CCL-61) con un vector de expresión de mamífero que transporta toda la secuencia de codificación de receptor CXCR4 humano (RefSeq NM 003467) . Las células se propagaron en medio de cultivo completo [DMEM-Ham's F 12 suplementado con suero bovino fetal (FCS) al 5% y 500 //g/ml de geneticina] . Las células se revistieron en placas negras 96M a una densidad de 100,000 células/pozo en medio de ¦ cultivo apropiado. Las células se privaron de alimento durante la noche antes de conducir los experimentos. Las células se cargan con colorante fluorescente de calcio (Fluo-4 No Wash, Invitrogen US) en amortiguador de carga [HBSS Ix, HEPES 20 mM, ácido Probenecid 25 mM] por 30 min. a 37 grados C seguido por 30 min., a 25 grados C. El estímulo por SDF-1 se realizó por inyección directa en cada pozo. Para experimentos antagonistas, 10 µ 1 de solución Mab se agrega directamente en el amortiguador de carga al menos 10 minutos antes de SDF-1. Se realizan mediciones de fluorescencia cinética en un lector de microplacas de fluorescencia de múltiples modos Mithras LB940 (Berthold) utilizando los siguientes ajustes: excitación a 485 nm, emisión a 535 nm, energía de excitación a 10000 unidades arbitrarias. Fluorescencia en cada pozo se registra durante 0.1 segundo cada segundo y por un periodo de tiempo de 20 segundos antes de inyección de SDF-1 (señal basal) . Después 20 µ 1 de SDF-1 se inyectan y sigue el registro de datos por un periodo de tiempo de 2 minuto Cada condición experimental se realiza en duplicado. Valores por cada pozo primero se corrigen al subtraer la fluorescencia basal y la fluorescencia emitida por un pozo de control sin células. Datos relativos se expresan como un porcentaje del estímulo máximo obtenido por SDF-1 (100 nM) . SDF1 (100 nM) induce una liberación rápida y fuerte de calcio intracelular en CH0/CXCR4 recombinante, mientras que no se detecta señal de fluorescencia en células CHO-K1 sin tratamiento previo. La intensidad máxima alcanzó >140% sobre la fluorescencia basal y se observó a aproximadamente 40 segundos ante estimulo por SDF-1 (Figuras 6A, 6B y 6C) . abs 515H7 (133 nM) (Figura 6A) y C515H7 (133nM) (Figura 6C) dio por resultado una fuerte inhibición de la señal de calcio inducida por SDF-1 (100 nM) . Mab 301aE5 (133 nM) (Figura 6B) dio por resultado una inhibición parcial de la señal de calcio inducida por SDF-1 (100 nM) .

Ejemplo 7: Inhibición de replicacion de aislados primarios VIH-1 KON, MN y 92UG024 (X4 virus) en PBMC humanas por abs 515H7, c515H7 y 301aE5 anti-CXCR4.

Ensayo de neutralización de un solo ciclo Este ensayo se realiza en 36 horas utilizando aislados primarios KON, MN y 92UG024 concentrados y diluidos de conformidad, para permitir la detección de linfocitos T CD4 infectados al 2% después de 2 días de infección.

Veinticinco microlitros de diversas diluciones de Mabs 515H7, c515H7 y 301aE5 se incubaron por 1 h a 37 grados C con 25 µ 1 de virus. PBMC humanas (25 µ?) a 20 x 106 células/ml se agregaron a la mezcla Mab/virus en una placa de 96 pozos (U-bottom, Costar 3599) y cultivaron por 36 h en RPMI 1640 10% FCS y 20 U/ml de IL-2 (R&D System, Minneapolis, MN) .

Después de 2 días de cultivo, linfocitos infectados con VIH fueron detectados por tinción intracelular de p24 Ag Viral. Células se fijaron y permeabilizaron utilizando ambos equipos Cytofix/Cytoperm y Perm/Wash kits (BD Biosciences) de acuerdo con el fabricante y tiñeron con Mab anti-p24 fluorescente (FITC- o PE-anti-p24, clon KC57; Beckman Coulter/Immunotech, Hialeah, FL) empleado a una dilución de 1/160 en solución Perm/Wash agregada por 15 minutos a 4 grados C. Después de lavar en PBS con FBS al 3%, PBMC se diluyen en 300 µ? de PBS antes de análisis de citometría de flujo (LSRII; BD Biosciences) con soporte lógico DIVA (BD Biosciences) . El porcentaje de células p24-positivas en las diferentes muestras se determinó al activar 20,000 eventos en una población de células vivas identificada por parámetros de dispersión directa y lateral. Los subconjuntos de células vivas se analizaron con el equipo de solución live/dead (solution kit) (Invitrogen) . El valor Ag-positivo p24 se obtuvo después de sustracción de los eventos de fondo en células de infección simulada.

El por ciento de neutralización se definió como la reducción de células p24-positivas en comparación con células infectadas de control sin Mab. El titulo neutralizante se definió como la concentración de anticuerpo (interpolado entre diluciones sucesivas que se realizan en triplicado) permiten una disminución de 90% en el porcentaje de células infectadas.

Como se muestra en las Figuras 7, 8 y 9, los Mabs 515H7, c515H7 y 301aE5 anti-CXCR4 son capaces de inhibir replicación de aislados primarios HIV-I X4 N, KON y 92UG024 en PBMC . Resultados de ICs (en µq/ml) se resumen en la tabla 9.

Tabla 9 KON MN % de inhibición de % de inhibición de células infectadas células infectadas 90 80 50 90 80 50 301aE5 >150 >150 150 >150 150 1 515H7 15 8 1 10 1.5 <1.5 C515H7 20 10 1.5 15 1 <1.5 Cont . 92UG024 % de inhibición de células infectadas 90 80 50 301aE5 >150 150 50 515H7 10 3 0.5 C515H7 15 3 <1.5 Ejemplo 8: Inhibición de replicación de aislado primario VIH-1 89.6 (virus dual X4/R5) en PBMC humanas por Mabs 515H7, c515H7 y 301aE5 anti-CXCR4 Ensayo de neutralización de un solo ciclo Este ensayo se realiza en 36 horas utilizando aislado primario 89.6 concentrado y diluido de conformidad, para permitir la detección de linfocitos T CD4 infectado al 2% después de 2 días de infección.

Treinta y cinco microlitros de diversas diluciones de Mabs 515H7, c515H7 y 301aE5 se incubaron por 1 h a 37 grados C con 25 µ 1 de virus. PBMC humanas (25 µ 1) a 20 x 106 células/ml se agregaron a la mezcla Mab/virus en una placa de 96 pozos (U-bottom, Costar 3599) y cultivaron por 36 h en RPMI 1640 10% FCS y 20 U/ml IL-2 (R&D System, inneapolis, MN) . Después de 2 días de cultivo, se detectaron linfocitos infectados con VIH por tinción intracelular de p24 Ag viral. Las células se fijaron y permeabilizaron utilizando ambos equipos Cytofix/Cytoperm y Perm/Wash (BD Biosciences) de acuerdo con el fabricante y tiñeron con Mab anti-p24 fluorescente (FITC- o PE-anti-p24, clon KC57; Beckman Coulter/Immunotech, Hialeah, FL) empleado a una dilución 1/160 en solución Perm/Wash agregada por 15 minutos a 4 grados C. Después de lavar en PBS con FBS al 3%p PBMC se diluyeron en 300 µ 1 de PBS antes de análisis de citometria de flujo (LSRII; BD Biosciences) con el soporte lógico DIVA (BD Biosciences) . El porcentaje de células p24-positivas en las diferentes muestras se determinó al activar 20,000 eventos en una población de células vivas identificada por parámetros de dispersión directa y lateral. Los subconjuntos de células vivas se analizaron con el equipo live/dead solution (Invitrogen) . El valor Ag-positivo p24 se obtuvo después de sustracción de eventos de fondo en células con infección simulada.

El por ciento de neutralización se definió como la reducción de células p24-positivas en comparación con células infectadas de control sin Mab. El titulo de neutralización se define como la concentración de anticuerpo (interpolada entre diluciones sucesivas que se realizan en triplicado) que permiten una disminución del 90% en el porcentaje de células infectadas.

Como se muestra en las Figuras 10 y 11, los Mabs 515H7, C515H7 y 301aE5 anti-CXCR4 son capaces de inhibir replicación de aislado primario HIV-I 89.6 en PB C. Resultados de ICs (en µq/ l) se resumen en la tabla 10.

Tabla 10 89.6 % inhibición de células infectadas 90 80 50 301aE5 >150 150 20 515H7 15 1.5 <1.5 C515H7 10 1.5 <1.5 Ejemplo 9: Inhibición de replicación de aislado primarios VIH-1 89.6 y UG93067 (dual X4/R5 virus) en PBMC humanas por Mab c515H7 anti-CXCR4 combinado con la molécula anti-CCR5 Maraviroc Ensayo de neutralización, análisis de ronda múltiple de replicación de aislado primario VIH en PBMC primarias: Este ensayo que combina diluciones en serie de Mab c515H7 o Maraviroc o combinación de ambos con diluciones en serie de virus, analiza múltiples rondas de infección en células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Brevemente, alícuotas cuadruplicadas de 25- µ 1 de diluciones en serie (dobles) de Mabs C515H7 o Maraviroc o combinaciones de ambos cada una se incubaron con 25 µ 1 de diluciones en serie de virus en placas de filtro de 96 pozos prehidratadas (tamaño de poro 1.25-//m, Durapor Dv; Millipore, Molsheim, Francia) . Una titulación de control del virus (25 µ 1 de RPMI que reemplaza Mabs c515H7 o Maraviroc diluido) se realiza en la misma placa que en las titulaciones en la presencia de diluciones de Mabs c515H7 o Maraviroc o combinación de ambos. Después de 1 hora a 37 grados C, 25 µ? de PBMC simulado con PHA a una concentración de 4 x 106 células/ml (recolectado de PBMC activado por PHA de cinco donadores sanos) se agrega para lograr un volumen de cultivo final de 75- /l de RPMI, suero bovino fetal al 10% (FCS), y 20 IU de interleucina-2 (IL-2) por mi (R&D System). Después de 24 h a 37 grados C, 100 µ? del mismo medio de cultivo se agregaron. Dos lavados (200 µ 1 de RPMI cada uno) se realizaron por filtración el día 4 para retirar Mabs c515H7 y Maraviroc y 200 µ 1 de medio de cultivo fresco se agregaron. El día 7, la presencia de p24 en los sobrenadantes de cultivo se mide por ELISA y compara con los controles negativos (cultivos infectados con diluciones de virus y mantenidos en la presencia de 10~6 M zidovudine [AZT] ) para determinar células positivas. Pozos cuadruplicados se emplearon para determinar el titulo viral (dosis infectiva de cultivo de tejido al 50% [TCID50] ) en la ausencia de (Fo) y en la presencia (Vn) de cada dilución de Mabs c515H7 o Maraviroc o combinaciones de ambos. El titulo de neutralizante se define como la dilución de Mabs c515H7 o Maraviroc o combinaciones de ambos que resulta en una disminución de 90% del titulo viral (VJVo = 0.1).

Como se muestra en la Figura 12, la replicación del virus X4R5 89.6 trópico dual se inhibió por Mabs c515H7 con una ICgo de 2 g/ml (Figura 12). Maraviroc a 50 /g/ml no alcanzo la actividad inhibitoria de IC90 (Figura 12) . Aún más, la adición de Maraviroc a 2¿ug/ml al anticuerpo 515H7 aumento la actividad inhibitoria de los Mabs c515H7 con una IC9o de 0.2//g/ml (Figura 12).

El efecto benéfico de la combinación de Mabs c515H7 y Maraviroc se estimó utilizando diversas diluciones de las dos moléculas y otro virus trópico dual UG93067. Como se muestra en la Figura 13, la actividad inhibitoria de Mabs c515H7 y Maraviroc fue similar. Estos resultados sugieren que la capacidad de virus UG93067 para utilizar cualquier Receptor CCR5 o CXCR4 fue comparable. Utilizando el virus UG93067, pudo evidenciarse una mejor actividad, solo la combinación de estos inhibidores X4 (Mabs c515H7) y R5 (Maraviroc) (10 g/ml de cada uno) permite una reducción del 90% de titulo de virus (Figura 13) .

Ejemplo 10: Producción de Mab quimérico anti-CXCR4 C515H7 El formato quimérico de Mab 515H7 murino se diseñó: corresponde a los dominios variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo murino de interés, genéticamente fusionado a los dominios constantes Ckappa y IgGl/IgG2 /IgG4 humano. Mabs recombinantes se produjeron ante transfección transitoria al utilizar el sistema HEK293/EBNA con un vector de expresión pCEP4 (InVitrogen, US) . Se describieron secuencias de nucleótidos de aminoácidos respectivas anteriormente en la especificación. Aún más, como describe la tabla 3 anterior, las secuencias de los isotipos IgG2 y 4 (que son isotipos preferidos) , puede mencionarse aquí la secuencia de la cadena pesada del isotipo IgGl, es decir c515H7 VH (Glwt) que corresponde a la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 80 y la secuencia de nucleótidos SEQ ID No.81.

Todas las secuencias de nucleótidos correspondientes a los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas Mab 515H7 se sintetizaron por síntesis de gen global (Genecust, Luxemburgo) . Se sub-clonaron en un vector pCEP4 (InVitrogen, US), que transporta toda la secuencia de codificación del dominio constante de cualquiera de la cadena ligera [Ckappa] o pesada [CH1-bisagra-CH2-CH3] de una inmunoglobulina IgGll/IgG2/IgG4 humana. Todas las etapas de clonación se realizaron de acuerdo con las técnicas de biología molecular convencional como se describe en el manual de Laboratorio (Sambrook & Russel, 2001) o de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Cada construcción genética se validó por completo por secuenciado de nucleótidos utilizando el equipo de secuenciado Big Dye (Applied Biosistemas, US) y analizaron utilizando un analizador genético 3100 (Applied Biosystems, US) .

Células HEK293 EBNA adaptadas en suspensión (InVitrogen, US) se desarrollaron rutinariamente en matraces de 250 mi en 50 mi de medio libre de suero Excell 293 (SAFC Biosciences) suplementado con glutamina 6 mM en un agitador orbital (velocidad de rotación 110 rpm) . Transfección transitoria se realizó con 2.106 células/ml utilizando polietilenimina (PEI) de 25 kDa (Polysciences) preparada en agua a una concentración final de 1 mg/ml en mezcla y ADN plásmido (concentración final de 1.25 µg ml para una proporción de plásmido de cadena pesada a ligera de 1:1). 4 horas posteriores a la transíección, el cultivo se diluye con un volumen de medio de cultivo fresco para lograr una densidad celular final de 106 células/ml. El proceso de cultivos se supervisa en base a viabilidad celular y producción de Mab. Típicamente, se mantuvieron cultivos por 4 a 5 días. Mab se purificó utilizando un enfoque de cromatografía convencional en una resina Proteína A (GE Healthcare, US) . Mab se produjo a niveles adecuados con evaluaciones funcionales. Los niveles de productividad típicamente están en el intervalo entre 6 y 15 mg/1 de Mab purificado.

Ejemplo 11: Caracterización de especificidad de enlace de Mab c515H7 quimérico anti-CXCR4 por análisis FACS .

En este experimento, enlace específico a CXCR4 humano de Mab c515H7 quimérico anti-CXCR4, se examinó por análisis FACS.

Células transíectadas NIH3T3-hCXCR4 se incubaron con un intervalo de dosis de anticuerpo monoclonal c515H7 desde 0 g/ml a 10 g/ml. Las células después se lavaron con BSA al l%/PBS/NaN3 0.01%. A continuación, anticuerpos secundarios etiquetados Alexa se agregaron a las células y se dejó que incubaran a 4°C por 20 minutos. Las células después se lavaron de nuevo dos veces. Después del segundo lavado, se realizó análisis FACS. Resultados de este estudio de enlace se proporcionan en la Figura 15 que muestra que Mab C515H7 quimérico anti-CXCR4 ligó específicamente a línea celular transfectada CXCR4-NIH3T3 humana. No se detectó enlace a células NIH3T3 wt (datos no mostrados ) .

Ejemplo 12 : Efecto de Mab c515H7 en homodimero CXCR4 por el enfogue de transferencia de energía por resonancla-bioluminlscencia (BRET) . Éste ensayo funcional permite evaluar los cambios de conformación inducidos en Mab c515H7 y/o SDF-1 que liga a receptor CXCR4 a nivel del homodimero CXCR4.

Vectores de expresión para los socios de interacción investigados, se construyeron como proteínas de fusión con el" colorante .correspondiente (luciferasa de Renilla reniformis, Rluc y Proteína Fluorescente Amarilla, YFP) al aplicar técnicas de biología molecular convencionales. Dos días antes de realizar los experimentos BRET, células HEK293 se transíectaron de forma transitoria con vectores de expresión que codifican los socios BRET correspondientes: [CXCR4/Rluc + CXCR4/YFP] para estudiar la homodimerización CXCR . El día posterior, las células se distribuyeron en placas de 96 MW blancas previamente revestidas con poli-lisina en medio de cultivo completo [DMEM suplementado con FBS al 10%] . Las células primero se cultivaron a 37 °C con C02 al 5% a fin de permitir conexión celular a la placa. Células después fueron privadas de nutrientes con 200 µ? de DMEM/pozo durante la noche. Inmediatamente antes del experimento BRET, DMEM se retiró y las células se lavaron rápidamente con PBS. Las células después se incubaron en PBS en la presencia o ausencia de anticuerpo, 10 min a 37 °C antes de la adición de coelenterazina H 5 µ? con o sin SDF-1 100 nM en un volumen final de 50 µ? . Después de incubación por 10 minutos más a 37 °C, la adquisición de emisión de luz a 485 nm y 530 nm se inició utilizando el lector de múltiples etiquetas Mithras LB940 (Berthold) (ls/longitud de onda/pozo repetido 15 veces a temperatura ambiente) .

Cálculo de la relación BRET se realizó como se describió previamente (Angers et al, 2000) : [ (emisión53o nm) — (emisión485 nm) X Cf] / (emisión485 nm) , en donde Cf = (emisión53o nm) / (emisiones nm) para células que expresan la proteina de fusión Rluc sola bajo las mismas condiciones experimentales. Simplificando esta ecuación muestra que la relación BRET corresponde a la relación 530/485 nm que se obtiene cuando los dos socios BRET están presentes, corregidos por la proporción 530/485 nm que se obtiene bajo las mismas condiciones experimentales, cuando un solo socio fusionado con Rluc está presente en el ensayo. Por razones de legibilidad, los resultados se expresan en unidades milliBRET (mBU) ; mBU corresponde a la relación BRET multiplicada por 1000.

SDF1 (100 nM) aumenta en aproximadamente 10% la señal BRET que resulta de la proximidad espacial de las proteínas donadoras y aceptoras fusionadas al receptor CXCR4, es probablemente que indique formación de homodímeros CXCR4/CXCR4 o cambios de conformación de dimeros preexistentes (Figura 16) . Mab c515H7 fue capaz de modular cambios de conformación inducidos por SDF-1 para homodímeros CXCR4 (inhibición 96% de incremento BRET inducido por SDF-1, Figura 16) . Mab c515H7 también fue capaz de modular por sí mismo proximidad espacial CXCR4/CXCR4 indicando una influencia desde Mab en conformación de homodimero CXCR4/CXCR4 (Figura 16) .

Ejemplo 13: Evaluación in vitro de actividad Mab 515H7 anti-VIH-1 utilizando células de osteosarcoma humano con transducción GFP (GHOST) que expresan CD4 y CXCR4 o CCR5.

A fin de determinar la especificidad de Mab 515H7 CXCR4, evaluamos la actividad anti-VIH-l desde Mab utilizando células GHOST que expresan CD4 y CXCR4 o CCR5.

Este ensayo se realiza en 48 horas utilizando cualquiera del virus X4 VIH-1 LAI (con células Ghost que expresan CXCR4) o el virus R5 VIH-1 BaL (con células Ghost que expresan CCR5) . 500 µ? de células Ghost se revisten (2.5 105 células/ml) por 24 horas en medio de cultivo Dulbecco suplementado con FCS al 10%. Diversas diluciones de Mab 515H7 se incubaron por 1 hora a 37 °C y después virus VIH-1 LAI diluido (1/10) y virus VIH-1 BaL (1/7) se agregaron a las células por 48 horas. Las células se expusieron a tripsina y lavaron con PBS IX. 300 de paraformaldehido 1.5% se agregaron a los precipitados celulares por 2 horas a +4°C en la oscuridad, a fin de fijar las células e inactivar virus. Células GFP positivas se analizaron por citometria de flujo y se calculó la inhibición de infección VIH-1.

El por ciento de inhibición de células infectadas se definió como el comparado con los pozos infectados de control sin Mab. Resultados de ICs (en µg/ml) se resume en la tabla 11, Mab 515H7 anti-CXCR4 fue capaz de inhibir la infección de virus VIH-1 X4 Lai en células Ghost que expresan CXCR4 fue totalmente inactivo para inhibir infección de virus VIH-1 R5 BaL en células Ghost que expresan CCR5.

Virus GHOST Virus GHOST CXCR4/LA1 CCR5/BaL % de inhibición de % de inhibición de células infectadas células infectadas 90 80 90 80 50 50 515H7 0.5 0.1 >75 >75 >75 0.08 Tabla 11 Ejemplo 14: Humanización de anticuerpo murino 515H7 anti-CXCR4 y generación de un fragmento de h515H7 - Procedimiento general La humanización de anticuerpo 515H7 anti-CXCR4 se realizó al aplicar las reglas globales de injerto CDR. Análisis inmunogenético y definición de CDR y regiones marco (FR) se realizq al aplicar el esquema de numeración único IMGT asi como bibliotecas y herramientas IMGT (Lefranc, 1997 - www.imgt.org).

• El enlace, de variantes humanizadas de 515H7 se determina en una linea celular NIH3T3 transfectada en forma estable con CXCR4 humano. La actividad de enlace se evalúa por un ensayo de competencia con el anticuerpo de ratón biotinilado. En un segundo intento, se evaluaron anticuerpos humanizados por su capacidad para inhibir enlace de SDF-1 biotinilado a células RAMOS. Las células RAMOS se eligen debido a su alta expresión de CXCR4 y baja expresión de CXCR7 y SDF-1.

Estos ensayos se emplearon para caracterizar las versiones humanizadas recombinantes de anticuerpos anti-CXCR4. Dominios variables se formatearon con dominios constantes IgG 1/k humanos y clonaron en el vector de expresión de mamífero pCEP. Anticuerpos derivados de IgGi/? recombinante se expresaron en forma transitoria en células HEK293. Sobrenadantes de cultivo de expresión se filtraron y los anticuerpos se purificaron utilizando proteína A sefaróse. Anticuerpos purificados fueron amortiguados de nuevo en PBS y las concentraciones de anticuerpo se determinaron por ELISA.

Se generaron fragmentos de anticuerpo recombinantes por PCR utilizando oligonucleótidos específicos para los dominios variables del anticuerpo humanizado y subclonar estos en un sistema de E. coli. Purificación de fragmentos de anticuerpo se realizó por cromatografía, de afinidad de iones de metal inmovilizados (IMAC = Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography).

- Humanización de dominios variables 515H7 Los diferentes alineamientos de secuencia de los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras se ilustran en las Figuras 17 y 18.

En una primera serie de experimentos, las actividades de enlace anti-CXCR4 de las tres primeras variantes humanizadas se analizaron. La variante VH-1 (VH1) se combinó con VL murino y estas construcciones se evaluaron en su capacidad para inhibir el enlace de un anticuerpo precursor 515H7 murino biotinilado. La secuencia de aminoácidos del dominio variable de VHl comprende la SEQ ID No. 90 mientras que la secuencia de nucleótidos comprende la SEQ ID No. 91. La secuencia de aminoácidos de VHl de longitud integra comprende SEQ ID No. 92 mientras que la secuencia de nucleótidos comprende SEQ ID No. 93. Esta construcción mostró capacidad similar para competir con el anticuerpo murino como el anticuerpo quimérico (Figura 19A) . Esto indica que la variante VH más humana tiene la misma capacidad de enlace que la quimérica. Por lo tanto, VHl se combinó con la variante 2 de VL (Figura 19B) .

En experimentos adicionales, se ha determinado si variantes humanizadas del anticuerpo 515H7 inhibe el enlace de SDF-1 a células que expresan CXCR4 (Figura 20) . La capacidad inhibitoria de variantes humanizadas de hz515H7 se evaluó al detectar SDF-1 biotinilado en citometria de flujo. El anticuerpo humanizado hz515H7 VHl D76N VL2 tiene una capacidad similar para inhibir enlace de SDF-1 como el C515H7 quimérico. Un fragmento de anticuerpo de la variante humanizada hz515H7 VHl VL2 también se ha probado y se ha determinado que el fragmento de anticuerpo es capaz de inhibir completamente el enlace de SDF-1 (Figura 20) .

Ejemplo 15: Caracterización por análisis FACS de especificidad de enlace Mabs 515H7 humanizado anti-CXCR4.

En este experimento, enlace especifico a CXCR4 de Mabs 515H7 humanizados anti-CXCR4, se examinó por análisis FACS.

NIH3T3, NIH3T3-hCXCR4 transfectados se incubaron con 0 a 10 yg/mL de Mabs 515H7 humanizados (hz515H7 VH1 D76N VL2 , hz515H7 VH1 D76N VL2.1, hz515H7 VH1 D75N VL2.2, hz515H7 VH1 D76N VL2.3) por 20 minutos a 4°C en la oscuridad en amortiguador Facs 100 µ?. Después de 3 lavados en amortiguador Facs, se incubaron células con el anticuerpo secundario, una Alexa 488 cabra antihumano (dilución 1/500), por 20 minutos a 4°C en la oscuridad. Después de 3 lavados en amortiguador Facs, se agregó yoduro de propidio en cada pozo y sólo se analizaron células viables por Facs. Al menos 5000 células viables se estiman para evaluar el valor promedio de intensidad de fluorescencia por cada condición. " Resultados de estos estudios de enlace se proporcionan en la Figura 21 que muestra [intensidad de fluorescencia promedio (MFI = Mean Fluorescence Intensity) que se obtiene por FACS] que Mabs hz515H7 humanizados anti-CXCR4 ligan específicamente a las líneas celulares transfectada con CXCR -NIH3T3 humano (MFI= 2.2 con células precursoras NIH3T3) .

Ejemplo 16: Efecto de Mabs hz515H7 en homodímero CXCR4 por el enfoque de transferencia de energía de resonancia-bioluminlscencia (BRET) .

Este ensayo funcional permite evaluar los cambios de conformación inducidos sobre SDF-1 y/o hz515H7 VHl D76N VL2, hz515H7 VHl D76N VL2.1, hz515H7 VHl D76N VL2.2 , hz515H7 VHl D76N VL2.3 enlace a receptor CXCR4 a nivel del homodímero CXCR4.

Vectores de expresión para los socios de interacción investigados se construyeron como proteínas de fusión con el colorante correspondiente (luciferasa Renilla reniformis, Rluc y Proteína Fluorescente Amarilla, YFP) al aplicar técnicas de biología molecular convencionales. Dos días antes de realizar los experimentos BRET, células HEK293 se transíectaron en forma transitoria con vectores de expresión que codifican los socios BRET correspondientes: [CXCR4/Rluc + CXCR4/YFP] para estudiar la homodimerización CXCR4... El día después, las células se distribuyeron en placas 96 MW blancas previamente revestidas con poli-lisina en medio de cultivo completo [DMEM suplementado con FBS al 10%] . Células primero se cultivaron a 37 °C con CO2 5% a fin de permitir conexión celular con la placa. Células después se privaron de nutriente con 200 µ? de DMEM/pozo durante la noche.

Inmediatamente antes del experimento BRET, DMEM se retiró y las células se lavaron rápidamente con PBS. Las células después se incubaron en PBS en la presencia o ausencia de anticuerpo, 10 minutos a 37°C antes de la adición de coelenterazina H 5 µ? con o sin SDF-1 100 nM en un volumen final de 50 µ?. Después de incubación por 10 minutos más a 37°C, la adquisición de emisión de luz a 485 nm y 530 nm se inició utilizando el lector de múltiples etiquetas ithras LB940 (Berthold) (ls/longitud de onda/pozo repetido 15 veces a temperatura ambiente) .

Cálculo de la relación BRET se realizó como se describió previamente (Angers et al., 2000) : [ (emisión53o nm) (emisión485 nm) X Cf] / (emisión485 nm) , en donde Cf = (emisión53o nm) / (emisiones nm) para células que expresan la proteina de fusión Rluc sola bajo las mismas condiciones experimentales. Simplificando esta ecuación, se muestra que la relación BRET corresponde a la relación 530/485 nm obtenida cuando los dos socios BRET están presentes, corregida por la relación .530/485 nm que se obtiene bajo las mismas condiciones experimentales cuando sólo un socio fusionado a Rluc está presente en el ensayo. Por razones de legibilidad, los resultados se expresan en unidades milliBRET (mBU = milliBRET Units) ; mBU corresponde a la relación BRET multiplicado por 1000.

SDF-1 (100 n ) incrementa por aproximadamente 12% la señal BRET que resulta de proximidad espacial de las proteínas donadoras y aceptoras fusionadas al receptor CXCR4, es probable que indique formación de homodímeros CXCR4/CXCR4 o cambios conformacionales de dímeros previamente existentes (Figura 22) . Mabs humanizados 515H7 fueron capaces de modular cambios conformacionales inducidos por SDF-1 para homodimeros CXCR4 con un porcentaje de inhibición de aumento de BRET inducido por SDF-1 de aproximadamente 88% para Mab hz515H7 VH1D76N-VL2 , 65% para Mab hz515H7 VH1D76N-VL2.1 , 33% para hz515H7 VH1D76N-VL2.2 y 21% para Mab hz515H7 VH1D76N-VL2.3 (Figura 22) .

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, caracterizado porque comprende al menos una región de determinación de complementariedad CDR seleccionada de CDRs que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID Nos. 1 a 6 y 30 a 33 como se define por el sistema de numeración IMGT.

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, caracterizado porque comprende una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprende respectivamente la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nos. 1, 2 y 3; y una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprende respectivamente la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nos. 4, 5 y 6.

3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, caracterizado porque comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 7 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 8.

4. El anticuerpo de conformidad con la •reivindicación 2, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico y comprende una cadena pesada de secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 56, 57 o 58, y una cadena ligera de secuencias SEQ ID No. 59.

5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque es un anticuerpo humanizado y porque comprende una región variable de cadena pesada de secuencias que consisten de SEQ ID No. 64, y una región variable de cadena ligera de secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 65, 66, 82 o 83.

6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque es un anticuerpo humanizado y comprende un anticuerpo humanizado A, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una cadena pesada de., secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 67, 68 ó 69, y una cadena ligera de secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 70, 71, 84 ó 85.

7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el fragmento funcional consiste de los fragmentos Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab1, scFv-Fc, diacuerpos o cualquier fragmento cuya vida media se ha incrementado por modificación química .

8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque es un scFv que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 54.

9. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, caracterizado porque comprende una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprende respectivamente las secuencias de aminoácidos SEQ ID Nos. 1, 2 y 30; y una cadena pesada que comprende CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3 que comprende respectivamente las secuencias de aminoácidos SEQ ID Nos. 31, 32 y 33.

10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9 o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, caracterizado porque comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 34 y ' una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 35.

11. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque se elige de los siguientes ácidos nucleicos: a) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 10; b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo de secuencias de CDRs que consisten de SEQ ID Nos. 14 a 19 y 41 a 45; c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo de secuencias de dominios variables pesados y ligeros que consisten de SEQ ID Nos. 20, 21, 46, 47, 72, 73, 74, 86 y 87; d) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo de secuencias de cadenas pesadas y ligeras que consisten de SEQ ID Nos. 60 a 63, 75 a 79, 88 y 89; e) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que consiste de SEQ ID No. 55; f) los ácidos nucleicos de ARN correspondientes de los ácidos nucleicos como se definen en b) , c) , d) o e) ; g) los ácidos nucleicos complementarios de los ácidos nucleicos como se definen en a) , b) , c) , d) y e) ; y h) un ácido nucleico de al menos 18 nucleótidos, capaz de hibridizar bajo condiciones de alta severidad con al menos una de las CDRs de las secuencias SEQ ID Nos. 14 a 19 y 41 a 45.

12. Un vector que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 11.

13. Una célula hospedera que comprende un vector de conformidad con la reivindicación 12.

14. Un animal transgénico excepto humanos, que comprende al menos una célula transformada por un vector de conformidad con la reivindicación 12.

15. Un proceso para producir un anticuerpo o uno de sus fragmentos o derivados funcionales de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) cultivar en un medio y condiciones de cultivo apropiadas de una célula de conformidad con la reivindicación 13; y b) recuperar los anticuerpos o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, de esta manera producidos partiendo del medio de cultivo o las células cultivadas.

16. Un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, obtenible por un proceso de conformidad con la reivindicación 15.

17. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 10 y 16, como un medicamento.

18. El anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, de las reivindicaciones 1 a 10 o 16 a 17, caracterizado porque inhibe replicación de aislado primario VIH-1 KON en PBMC con una IC90 de al menos 5 g/ml, de preferencia al menos 10 g/ml.

19. Una composición que comprende a manera de principio activo, un compuesto que consiste de un anticuerpo o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 10 y 16 a 18.

20. La composición de conformidad con la reivindicación 19 como un medicamento.

21. La composición de conformidad con la reivindicación 19 y 20, para la prevención o para el tratamiento de infección VIH (HIV) .

22. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la infección VIH (HIV) es una infección VIH trópica X4.

23. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la infección VIH (HIV) es una infección VIH trópica X4/R5.

24. La composición de, conformidad con las reivindicaciones 19 a 23, caracterizada porque comprende al menos un segundo compuesto anti-VIH seleccionado entre los compuestos capaces de inhibir específicamente entrada y/o replicación de VIH.

25. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el segundo compuesto anti-VIH como mínimo se elige entre el grupo que consiste de fármacos antirretrovirales tales como inhibidores de proteasa (PI) VIH, inhibidores de transcriptasa inversa VIH nucleósido/nucleótido (NRTI/NtRTI) , inhibidores de transcriptasa inversa VIH no nucleósido (NNRTI), inhibidores de entrada de VIH e inhibidores de integrasa VIH.

26. La composición de conformidad con la reivindicación 24 ó 25, caracterizada porque al menos el segundo compuesto anti-VIH es Maraviroc.

27. Proceso para la detección y/o identificación de moléculas como agentes antivirales antagonistas CXCR4 , caracterizado porque comprende las etapas de: a) seleccionar células que expresan CXCR4 , b) incubar las células con un anticuerpo o uno de sus fragmentos o derivados funcionales de las reivindicaciones 1 a 10 o 16 a 18, y e) evaluar las moléculas probadas por su inhibición potencial del enlace entre el anticuerpo o uno de sus fragmentos o derivados funcionales a CXCR4, y d) seleccionar moléculas capaces de la inhibición.