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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
allgemein Verfahren zur Identifizierung von Patienten, die eine
kardiovaskuläre
Erkrankung und ein erhöhtes
Risiko für
eine Entwicklung einer Arteriosklerose haben. Insbesondere betrifft
die Erfindung den Nachweis von IgG-Antikörpern gegen den Plättchen-aktivierenden
Faktor (PAF) in Körperflüssigkeiten
von Patienten. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt,
dass erhöhte Konzentrationen
an Antikörpern
gegen PAF in Körperflüssigkeiten
mit einer labilen Hypertonie und einem Stoffwechselsyndrom, d. h.
einer frühen
kardiovaskulären
Erkrankung korreliert ist, was mit einem erhöhten Risiko der Entwicklung
einer frühen
Arteriosklerose verbunden ist.
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Hintergrund der Erfindung
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Die Morbidität und Mortalität, die in
entwickelten Ländern
mit kardiovaskulären
Erkrankungen und Arteriosklerose verbunden ist, ist höher als
diejenige, welche mit irgendeiner anderen Krankheit verbunden ist. Bluthochdruck
ist zusammen mit Hyperlipidämie
der herausragendste Risikofaktor für Arteriosklerose. Individuen
mit einer labilen Hypertonie sind ein Beispiel für eine allgemeine frühe kardiovaskuläre Erkrankung,
mit einer endothelialen Funktionsstörung und einem erhöhten Risiko
einer arteriosklerotischen Erkrankung bei anscheinend gesunden Individuen.
Eine frühe
Arteriosklerose zeigt sich in Form von Cholesterinablagerungen in der
Arterienwand. Während
der letzten Jahre ist es in überzeugender
Art und Weise gezeigt worden, dass der arteriosklerotische Prozess
eine chronische Entzündung
ist, gekennzeichnet durch das Vorhandensein von aktivierten T-Zellen
und Monozyten/ Makrophagen. Viele dieser Makrophagen haben sich
in mit Cholesterin gefüllten
Xanthomzellen entwickelt. Die Ablagerung ist langsam und beginnt
in einem frühen
Alter. Klinische Symptome können
Jahre benötigen,
um sich zu manifestieren und sind sehr ernsthaft; sie schließen koronare
Herzerkrankungen und Schlaganfall ein. Im Allgemeinen wird der Krankheitsverlauf
begonnen haben, lange bevor diese klinischen Symptome auftreten.
Es ist eine Anzahl von genetischen Analysen-Screening-Test für Patienten
mit einer Neigung zu Arteriosklerose erhältlich. Aber es ist wünschenswert,
ein diagnostisches Verfahren verfügbar zu haben, welches eine
frühe Warnung
des Beginns der Ablagerung bereitstellt. Die Bedeutung eines frühen Nachweises
wird durch die Tatsache betont, dass eine wirksame Langzeitbehandlung
möglich
ist. Die vorliegenden Verfahren zur Diagnose von Arteriosklerose
hängen
von der Messung von Cholesterin- oder Triglyceridspiegeln im Serum
oder dem Nachweis von atheromatösen
Läsionen
ab, aber zum Zeitpunkt des Nachweises ist die am meisten effektive
Zeit für
eine Behandlung überschritten.
Das U.S.-Patent 5,731,208 offenbart einen Screening-Test für Arteriosklerose,
welcher die Bestimmung der Konzentration an p-Hydroxyphenylaldehyd-Lysin
im Serum oder Plasma umfasst.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung
haben gefunden, dass erhöhte
Konzentrationen an IgG-Antikörpern
gegen den Plättchen-aktivierenden
Faktor (PAF) in Patienten ein deutlicher Hinweis auf kardiovaskuläre Erkrankungen
sind, welche oft von einer frühen
Arteriosklerose begleitet werden. Insbesondere sind Antikörper gegen
PAF (aPAF) mit einer frühen
vaskulären
Erkrankung in Form einer labilen Hypertonie und dem Stoffwechselsyndrom
assoziiert, wobei beide starke Risikofaktoren für spätere Stadien der Arteriosklerose sind,
welche klinische Symptome verursachen.
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Diese Ergebnisse zeigen, dass Antikörper gegen
PAF eine neue Kategorie von Antiphospholipid-Antikörpern (aPL)
darstellen, welche für
eine frühe
vaskuläre Funktionsstörung und
Erkrankung empfindlich sind, insbesondere für eine frühe Arteriosklerose und Bluthochdruck.
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Es wurde gezeigt, dass aPL im Allgemeinen,
insbesondere gegen Cardiolipin, das Risiko einer kardiovaskulären Erkrankung
vorhersagen, auch bei Autoimmunerkrankungen wie systemischem Lupus
erythematodes (SLE), und unsere Daten zeigen somit, dass Antikörper gegen
PAF eine neue Kategorie von aPL ist, mit einem Potential als ein
Marker, auch bei anderen Autoimmunbedingungen neben kardiovaskulären Erkrankungen
und Arteriosklerose im Allgemeinen. aPL ist sowohl mit arterieller
als auch venöser
Thrombose in Verbindung gebracht worden, und auch mit Fehlgeburten.
Diese Daten zeigen, dass Antikörper
gegen PAF sehr viel stärker
mit einer Fehlgeburt assoziiert sind als aPL und außerdem,
dass Antikörper
gegen PAF ein neuer Marker für
eine Aktivität
der Erkrankung bei SLE waren.
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Antikörper gegen PAF sind deshalb
auch in diesen anderen Erkrankungen relevant, welche mit autoimmunen,
vaskulären
Erkrankungen in Beziehung stehen.
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In diesem Zusammenhang sind auch
Antikörper
gegen PAF-ähnliche
Lipide relevant, eines davon ist Lysophosphatidylcholin, wobei die
Ergebnisse ein vergleichbares Profil zeigen, wie dasjenige, welches
mit PAF-Antikörpern
erhalten wird.
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Entsprechend ist es eine Hauptaufgabe
der vorliegenden Erfindung, ein Diagnoseverfahren oder einen Screening-Test
für eine
frühe Arteriosklerose
oder kardiovaskuläre
Veränderungen,
die mit einer frühen Arteriosklerose
in Beziehung stehen, bereitzustellen. Es ist noch eine andere Aufgabe
der Erfindung, ein Kit zum Untersuchen der Konzentrationen eines
aPAF zum Diagnostizieren einer frühen Arteriosklerose oder kardiovaskuären Veränderungen
bereitzustellen.
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„Frühe Arteriosklerose", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf das aller erste Stadium einer Arteriosklerose,
vor dem klinischen Einsetzen der Symptome. Eine „frühe kardiovaskuläre Erkrankung", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf die ersten Stadien einer kardiovaskulären Erkrankung,
wie bei einer labilen Hypertonie und dem Stoffwechselsyndrom, wenn
eine Arteriosklerose durch andere Verfahren noch nicht leicht nachzuweisen
ist und noch keine Erkrankung verursacht hat.
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Der Plättchen-aktivierende Faktor
(PAF) ist ein inflammatorischer Phospholipid-Mediator, welcher von einer Vielzahl
von Zellen synthetisiert wird, einschließlich Monozyten und Endothelzellen.
Während
der Oxidation von LDL werden PAF-ähnliche Lipide produziert.
PAF kann deshalb bei pathologischen Prozessen, wie Arteriosklerose
und Bluthochdruck, in der Gefäßwand von
Bedeutung sein. In einem früheren
Bericht wurde die Existenz von Antikörpern gegen PAF (aPAF) in Individuen
mit einem Phospholipid-Antikörper-Syndrom
beschrieben, (Barquinero et al., 1994), aber es wurde nichts über mögliche klinische
Auswirkungen dieser Antikörper
und eine mutmaßliche
Rolle bei einer kardiovaskulären
Erkrankung berichtet.
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Offenbarung der Erfindung
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Wie oben erwähnt, haben wir überraschenderweise
gezeigt, dass die Konzentration der Antikörper gegen PAF (aPAF) ein effektiver
Indikator für
eine frühe
kardiovaskuläre
Erkrankung ist. Wir haben gefunden, dass Antikörper für dieses besondere Antigen
in Patienten lange vor dem klinischen Beginn einer Arteriosklerose
entwickelt werden.
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In unserer Studie fanden wir, dass
die Konzentration eines aPAF bei einem Mann mit einer labilen Hypertonie
49,3% höher
war als bei einem Mann mit normalem Blutdruck. Wenn eine aPAF-Konzentration
oberhalb der mittleren Konzentration einer Kontrolle plus zwei Standardabweichungen
(das heißt 0,144
+ (2 × 0,109)
= 0,362 OD 405) als positiv definiert wird, waren 15 von 73 Männern in
der Gruppe mit labiler Hypertonie positiv, wohingegen nur 3 von
73 Männern
in der Gruppe mit normalem Blutdruck positiv waren. Antikörper gegen
PAF als ein Marker für
eine frühe
Arteriosklerose können
mit zusätzlichen
und alternativen Markern für eine
frühe Arteriosklerose
kombiniert werden, um die Genauigkeit der Diagnose zu verbessern,
wie etwa durch Bestimmung der Konzentrationen von Cholesterin, Blutlipiden
oder p-Hydroxyphenylaldehyd-Lysin.
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Antikörper gegen PAF (aPAF) können nachgewiesen
werden unter Verwendung aller Verfahren und Techniken, die im Fachgebiet
für solch
einen Nachweis konventionell sind. Günstigerweise kann solch ein
Verfahren einen Immunoassay, z. B. ELISA oder RIA umfassen. Der
Immunoassay wird günstigerweise
ein Antigen (PAF) in immobilisierter Form verwenden, z. B. auf Mikrotiterplatten,
Membranen oder Kügelchen,
um den angestrebten aPAF zu isolieren. In einem Sandwich-Assay kann
das gebundene Antigen unter Verwendung eines zusätzlichen löslichen Antikörpers markiert
sein, welcher monoklonal oder polyklonal sein kann, und welcher
entweder eine Markierung tragen kann oder günstigerweise selbst nachfolgend
markiert werden kann durch eine Reaktion mit einem sekundären Antikörper, der
eine Markierung trägt.
Geeignete Markierungen schließen
Radionukleide, fluoreszierende Substanzen und Enzyme ein.
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Alternativ kann ein kompetitiver
Bindungsassay verwendet werden. Günstigerweise werden die zur Durchführung des
Immunoassays benötigten
Bestandteile in Form eines Kits bereitgestellt. Solch ein Kit würde umfassen:
- a) ein Antigen, das an aPAF binden kann, und
gegebenenfalls
eine markierte Probe eines Antigens für aPAF oder
ein Fragment davon; wobei das Antigen (a) in nicht immobilisierter
Form vorliegt;
einen markierten sekundären Antikörper, der für das Antigen (c) spezifisch
ist.
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Die Körperflüssigkeit, mit der die Bestimmung
durchgeführt
wird, kann jede Körperflüssigkeit
sein, in der aPAF lokalisiert sein kann, aber günstigerweise wird sie Serum
oder Plasma sein. In einigen Fällen
kann es günstig
sein, die Antikörper
zu extrahieren, oder anderenfalls die Probe vor der Bestimmung zu
behandeln.
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Die Erfindung wird nun ausführlicher
unter Bezugnahme auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele beschrieben
werden:
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Beispiel 1
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Bestimmung der Konzentration
von PAF-Antikörpern
von Patienten mit früher
Arteriosklerose und von normalen Patienten.
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Um die Rolle von aPAF in der labilen
Hypertonie (BHT) und frühen
Arteriosklerose zu untersuchen, untersuchten wir eine Gruppe von
146 Männer
mittleren Alters, welche labile Hypertonie aufwiesen, im Vergleich
zu passenden Alterskontrollen. Hier berichten wir, dass aPAF-Titer
im Serum bei Patienten mit labiler Hypertonie und Stoffwechselsyndrom
erhöht
sind.
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Die Patienten wurden aus einem Populations-Screeningprogramm,
wie zuvor beschrieben, rekrutiert (Lemne et al. 1995). BHT wurde
definiert als ein diastolischer Blutdruck (DBP) von 85 bis 94 mmHg,
und das Screening identifizierte 81 Männer, die während wiederholter Messungen über einen
Zeitraum von drei Jahren innerhalb des Bereichs für labile
Hypertonie blieben. Aus derselben Population wurden 80 passende
Alterskontrollen rekrutiert, deren Blutdruck bei zwei Gelegenheiten
im Abstand von ein paar Wochen gemessen wurde, und bei beiden Gelegenheiten < 80 mmHg betrug.
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Von den 81 Männern mit BHT und den 80 NT-Kontrollen,
welche der Teilnahme zustimmten, beendeten 73 in der BHT- und 75
in der NH-Gruppe alle Verfahren der vorliegenden Studie. Keine der
Versuchspersonen hatte andere Krankheiten oder verwendete regelmäßig irgendwelche
Arzneimittel, die bekanntermaßen den
Blutdruck, metabolische oder inflammatorische Variablen beeinflussen.
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Alle Versuchspersonen wurden nach
dem gleichen Plan untersucht. Sowohl BHT- als auch NT-Kontrollen
wurden, wenn möglich
gleichzeitig, und nicht mehr als 4 Wochen voneinander entfernt untersucht.
Blutproben für
Analysen von metabolischen oder inflammatorischen Variablen wurden
zwischen 8 und 9:30 Uhr am Morgen entnommen, nach 8 bis 12 Stunden
Fasten. Alle Proben wurden nach 15 Minuten Ruhezustand in Rückenlage
entnommen.
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Ein identisches Verfahren wurde bei
jeder Gelegenheit während
des gesamten Rekrutierungszeitraums befolgt. Alle Blutdruckmessungen
wurden mit einem Quecksilber-Sphygmomanometer durchgeführt. Die
Manschette wurde entsprechend des Armumfangs angepasst und in Höhe des Herzens
angelegt. Der Blutdruck wurde als der Mittelwert von zwei Messungen
aufgezeichnet, die nach 5 Minuten Ruhephase in Rückenlage durchgeführt wurden.
Messungen des systolischen und diastolischen Blutdrucks wurden definiert
gemäß Kortkoff
I und V. Bei allen Gelegenheiten führte dieselbe ausgebildete
Krankenschwester die Messungen durch.
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Die linken und rechten Karotisarterien
wurden mit einem Duplex-Scanner (Acuson 128XP/5, Mountain View,
CA, USA) unter Verwendung eines linear angeordneten Transducers
mit 7,0 MHz untersucht. Die Versuchspersonen wurden in Rückenlage
untersucht, und es wurde eine Dicke der mittleren Intima (I-M) in
der entfernten Wand als die Distanz zwischen der Vorderkante der
Lumen-Intima-Echos der Vorderkante des Echos der mittleren Adventitia
bestimmt. Plaque wurde definiert als eine lokalisierte I-M-Verdickung
mit einer Dicke > 1
mm und einer 100%igen Zunahme der Dicke im Vergleich mit normalen,
benachbarten Wandabschnitten. Das Auftreten von Plaque wurde als
vorhanden oder nicht vorhanden bewertet. Es wurde in der Karotis communis,
der Karotis interna und der Karotis interna auf beiden Seiten nach
Plaque gesucht, wie zuvor beschrieben (Lemne et al. 1995).
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Alle Patienten wurden nur mit Unterwäsche ohne
andere Kleidung gewogen, unter Verwendung derselben Skala (Delta
707, SECA, Deutschland). Die Länge
wurde mit einem speziellen Lineal gemessen, das an der Wand fixiert
war. Der Taillenumfang wurde auf Höhe des Nabels gemessen und
die Hüften
wurden auf Höhe
des größten Umfangs
gemessen. Nachfolgend wurde der Körper-Masse-Index (BMI, „body mass
Index") als Gewicht
in Kilogramm/(Höhe
in Meter)2 berechnet.
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IgG-Antikörper gegen PAF wurden gemäß Beispiel
2 nachgewiesen. PAF (1-0-Alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholin)
wurde von Sigma, St Louis, USA erhalten.
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Lipid- und Lipoproteinspiegel wurden
durch eine Kombination einer präparativen
Ultrazentrifugation, gefolgt von Lipidanalysen in den Lipoproteinfraktionen
bestimmt, wie zuvor beschrieben wurde (Lemne et al.).
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Es wurden verschiedene Blutproben
zur Bestimmung des Plasmainsulins (Radioimmunoassay, Kabi Pharmacia,
Schweden) entnommen.
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Die Serumimmunglobuline IgG, IgM
und IgA wurden bestimmt, wie es beschrieben wurde (Frostegård et al,
Hypertonie 1997).
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Die Variablen wurden hinsichtlich
der Schiefe untersucht. Für
schiefe Variablen wurden nicht parametrische Test zu Vergleichen
zwischen den Gruppen (U-Test nach Mann-Whitney) verwendet, wohingegen
für normal
verteilte Variablen der t-Test nach Student verwendet wurde. Die
Spearman'sche Rang-Korrelationskoeffizienten
wurden berechnet, um die gegenseitigen Beziehungen zwischen Antikörperspiegeln,
metabolischen Variablen und Blut druckspiegeln abzuschätzen. Das
Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05
gesetzt. Die Werte im Text werden, wie angezeigt, als Mittelwert ± Standardabweichung
(SD) angegeben.
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Ergebnisse
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Die wesentlichen Charakteristika
der zwei Studiengruppen werden in Tabelle 1 dargestellt. Das mittlere
Blutdruckniveau in der NT-Gruppe betrug 125/75 (±11/±5) mmHg im Vergleich zu 171/89
(±10/±2) mmHg
in der BHT-Gruppe.
Die zwei Gruppen waren bezüglich
des Alters gut angepasst. Die BHT-Männer besaßen ein signifikant verändertes
metabolisches Profil mit Fasten-Hyperinsulinämie und Dyslipoproteinämie, wie
zuvor dargestellt (Tabelle 1). In der BHT-Gruppe hatten 26% der
Versuchspersonen Plaque an einer oder an beiden Seiten, und die
entsprechende Figur für
die NT-Gruppe betrug 16% (19 gegenüber 10 Versuchspersonen, nicht
gezeigt).
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In dem Material als Ganzes waren
die aPAF-Spiegel in der BHT-Gruppe signifikant höher im Vergleich zu der NT-Gruppe
(Tabelle II). Es gab keinen Unterschied in den Lyso-PAF-Spiegeln
zwischen der BHT- und der NT-Gruppe.
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Es gab keine signifikanten Unterschiede
in den aPAF-Spiegeln zwischen Individuen mit Plaque (n = 29) im
Vergleich zu den Individuen ohne (n = 117; Daten nicht gezeigt).
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Wenn Werte oberhalb 2SD in der Kontrollgruppe
als positiv definiert wurden, besaßen 21% der BHT-Gruppe und
4% der NT-Gruppe erhöhte
aPAF-Spiegel. Das Alter korrelierte nicht mit den Antikörperspiegeln
(Daten nicht gezeigt).
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Um die Möglichkeit auszuschließen, dass
Unterschiede in den Antikörper-Spiegeln einfach
nur erhöhte
Gesamt-Antikörperspiegel
wiederspiegeln, wurde das Gesamt-IgG bestimmt. Es gab keinen Unterschied zwischen
der BHT-Gruppe und
den Kontrollen (Daten nicht gezeigt).
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In dem Material als Ganzes und in
den zwei Gruppen alleine gab es keine signifikanten Zusammenhänge zwischen
aPAF und BMI, Blutdruckspiegeln oder Rauchen (Daten nicht gezeigt).
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Aber Individuen mit dem Stoffwechselsyndrom
(Definiert als Individuen, die mindestens zwei der folgenden drei
Bedingungen aufweisen: BMI > 27
kg/m2, Insulinspiegel über der neunzigsten Perzentile
der normalen Bevölkerung,
Dyslipoproteinämie)
besaßen
höhere
aPAF-Spiegel als diejenigen ohne (0,222 ± 0,106 gegenüber 0,169 ± 0,106;
p = 0,0009).
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Zusammen genommen besaßen Individuen
mit einer frühen
kardiovaskulären
Erkrankung, wie bei labiler Hypertonie, ein 5-fach höheres Risiko,
hinsichtlich aPAF positiv zu sein, als diejenigen ohne.
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Die Werte sind als Mittelwert ± SD angegeben.
Die Unterschiede der Gruppen wurden durch den t-Test nach Student
oder den U-Test nach Mann-Whitney (schräge Variablen) bestimmt. HDL
= Lipoprotein mit hoher Dichte ("high density
lipoprotein"), VLDL
= Lipoprotein mit sehr geringer Dichte ("very low density lipoprotein").
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Tabelle
II. Antikörperspiegel
gegen PAF in Versuchspersonen mit oder ohne BHT oder Stoffwechselsyndrom.
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Die Werte sind als Mittelwert ± SD angegeben.
Die Unterschiede der Gruppen wurden durch den t-Test nach Student
bestimmt. APAF = Antikörperspiegel
gegen den Plättchen-aktivierenden
Faktor.
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Beispiel 2
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Verfahren zur Bestimmung
der Menge an Antikörpern
gegen PAF (aPAF) in einer Serumprobe.
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IgG-Antikörper gegen PAF und Lyso-PAF
wurden durch einen enzymgekoppelten Immunosorbensassay (ELISA) bestimmt,
im wesentlichen so, wie bei der Analyse von Phospholipid-Antikörpern einschließlich Cardiolipin
beschrieben (Harris 1986). Titertek 96-Well Polyvinylchlorid-Mikrotiterplatten
(Flow Laboratories, Costa Mesa, CA, USA) wurden beschichtet mit
50 μl/Well
50 μg/ml
PAF, gelöst
in Ethanol, und über
Nacht bei 4°C
getrocknet. Das Blocken wurde mit 20% ABS-PBS für zwei Stunden durchgeführt. 50 μl der Serumproben, 1
: 50 verdünnt
in 20% ABS-PBS, wurden zu jedem Well zugegeben. Kontrollversuche
wurden in Abwesenheit von PAF durchgeführt.
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Nach 3 Wäschen mit PBS wurden die Platten
für 2 Stunden
bei 37°C
inkubiert mit 50 μl/ml
eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziege-Anti-Mensch-IgG (Sigma
A-3150), das 1 : 9000 mit PBS verdünnt war. Nach 3 Wäschen wurden
100 μl des
Substrats (Phosphatasesubstrat-Tabletten, Sigma 104; 5 mg in 5 ml Diethanolaminpuffer,
pH 9,8) zugegeben. Die Platten wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert und in einem ELISA-Multiskan-Plus-Spektrophotometer
bei 405 nm gelesen. Jede Bestimmung wurde dreifach durchgeführt. Der
Variationskoeffizient zwischen dem dreifachen Test war kleiner als
5%.
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Zitierte Literaturhinweise
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Lemne C, Jogestrand T, de Faire U.
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Frostegård J, Huang YH, Rönnelid J
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Barquinero J, Ordi-Ros J, Selva A,
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Harris EN, Gharavi AE, Patel SP,
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an international workshop held 4 April 1986. Clip Exp Immunol 1986;
68: 215–222.
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U.S.-Patent 5,731,208
