DE68912165T2

DE68912165T2 - Monoklonaler Antikörper, der fähig ist, ein mit humaner Arteriosklerose assoziiertes Antigen zu erkennen und Verfahren zu seiner Herstellung.

Info

Publication number: DE68912165T2
Application number: DE68912165T
Authority: DE
Inventors: Tatsuya Takano; Keizo Takatoku
Original assignee: Kotobuki Seiyaku Co Ltd; Nihon Medi Physics Co Ltd; Fujifilm RI Pharma Co Ltd; Toyo Jozo KK
Current assignee: TAKANO, TATSUYA, HACHIOJI, TOKIO/TOKYO, JP DAIICHI
Priority date: 1988-02-04
Filing date: 1989-03-03
Publication date: 1994-07-21
Anticipated expiration: 2009-03-04
Also published as: ES2050171T3; EP0334076A3; DE68912165D1; EP0334076B1; CA1320461C; EP0334076A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen menschlichen Arteriosklerose erkennenden monoklonalen Antikörper, der ein mit menschlicher Arteriosklerose im Zusammenhang stehendes Antigen erkennt. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen monoklonalen Antikörpers. Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere einen monoklonalen Antikörper bereit, der fähig ist, ein mit menschlicher Arteriosklerose im Zusammenhang stehendes Antigen zu erkennen und der in Anwendungen wie z. B. der Bestimmung eines mit menschlicher Arteriosklerose im Zusammenhang stehenden Antigens, der Diagnose von darauf zurückzuführender Arteriosklerose sowie der bildgebenden Diagnose von menschlichen arteriosklerotischen Läsionen, nützlich ist.
Arteriosklerose ist eine lokalisierte Erkrankung, die sich hauptsächlich in großen oder mittelgroßen Arterien wie z. B. der Aorta, der koronaren Arterie und der zerebralen Arterie entwickelt, und sie ist eine Hauptursache von verschiedenen okklusiven Erkrankungen wie z. B. Angina pectoris, myokardialem Infarkt und zerebralem Infarkt.
Bis jetzt sind viele Phänomene als Ursachen der Arteriosklerose vorgeschlagen worden; diese umfassen erhöhte Plasma-Cholesterin-Spiegel, Schädigung des Endothels, Aggregation von Thrombozyten, Hyperplasie der Tunika intima und Bildung von Atherom. Allerdings sind nur wenig Untersuchungen über den genauen mechanismus dieser Phänomene durchgeführt worden.
Die normale Aorta hat eine dreischichtige Struktur, die aus einem Endothel, einer mittleren Tunika aus elastischen Geweben und einer äußeren Tunika aus elastischen Geweben besteht. Wenn sich aus bestimmten Gründen der Begrenzungsabschnitt zwischen dem Endothel und der mittleren Tunika ausdehnt und eine abnormale Zell-Poliferation und Nekrose auftreten, wird sich eine Krankheit entwickeln, die im allgemeinen als Arteriosklerose bezeichnet wird.
Hauptursachen für ernste Erkrankungen wie z. B. myokardialer Infarkt und zerebraler Infarkt sind:
(1) Bildung von Atherom aufgrund der Akkumulation von Cholesterin und anderen Lipiden in und zwischen arteriellen Wandzellen;
(2) Hyperpläsie der Tunika intima als Resultat einer abnormalen Zell-Proliferation; und
(3) Aggregation von Blut-Thrombozyten als Resultat einer Schädigung des Endothels und Hyperpläsie der Tunika intima.
Aus diesen Gründen werden arterielle Gefäße verschlossen, was wahrscheinlich die Entwicklung von Krankheiten wie Angina pectoris, myokardialer Infarkt und zerebraler Infarkt verursacht.
Es wird festgestellt, daß die folgenden Phänomene in dem erweiterten Teil der Tunika intima aufgetreten sind:
(a) das Auftreten von Schaumzellen, die eine große Menge an Lipiden aufnehmen;
(b) Akkumulation von Lipiden zwischen Zellen;
(c) Proliferation von glatten Muskelzellen in der Tunika intima;
(d) erhöhte Bildung von Bindegeweben und Ablagerung von Kalzium;
(e) Aggregation von Blut-Thrombozyten und Bildung von Thrombi.
Eine Diagnose menschlicher Arteriosklerose kann entweder direkt oder indirekt durchgeführt werden. Indirekte Verfahren beinhalten die Vorhersage des Risikogrades, die auf der Messung der Cholesterinspiegel im Blut, der Analyse der Lipoprotein-Zusammensetzung und der Suche nach Koagulationsfaktoren basiert. Direkte Verfahren sind Ultrasonographie-Techniken, bei denen die Progredienz von Arteriosklerose bestimmt wird, indem die Geschwindigkeit von Schall, der sich durch die Arterienwand fortpflanzt, gemessen wird, oder indem Echos verwendet werden, die durch Ultraschall-Schwingungen von der Arterienwand reflektiert werden; sowie Angiographie-Techniken, bei denen ein Angiogramm der Arterie, das durch injizieren eines bildgebenden Mediums in das arterielle Gefäß erhalten wird, direkt untersucht wird.
Die Bestimmung von Risikofaktoren im Blut, wie sie bei den indirekten Verfahren durchgeführt wird, beinhaltet nicht die Messung von direkten verursachenden Faktoren der Arteriosklerose und daher wird sie nicht als sehr zuverlässiges Diagnoseverfahren angesehen. Die direkten Verfahren, das Ultrasonographie-Verfahren wie auch die Angiographie beinhalten die Messung des Grades der Konstriktion von Blutgefäßen durch Arteriosklerose; sie sind nicht auf die Messung der Progredien der Krankheit selbst ausgerichtet. Darüber hinaus beinhaltet die Angiographie-Technik eine potentielle Gefahr wegen der Notwendigkeit, ein bildgebendes Mediums in die Arterien zu injizieren.
Die EP-A-0 236 637 offenbart einen monoklonalen Antikörper, der fähig ist, arteriosklerotische Läsionen spezifisch zu erkennen und der aus einer Hybridzelle erhalten wird, welche durch Verschmelzen von Myelomzellen und Zellen, die fähig sind, einen Antikörper gegen arteriosklerotische Läsionen zu produzieren, hergestellt wird.
Es besteht der Wunsch, ein Indexmaterial zu entwickeln, welches geeignet ist und eine hohe Spezifität für menschliche Arteriosklerose hat.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten ausgedehnte Untersuchungen über Faktoren durch, welche direkt auf die menschliche Arteriosklerose wirken. Als Ergebnis isolierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Seren arteriosklerotischer Patienten oder Stellen arteriosklerotischer Läsionen als Antigene einen monoklonalen Antikörper, der Zellen produziert, welche spezifische Antigene erkennen, die mit menschlichen arteriosklerotischen Erkrankungen z. B. mit familiärer Hypercholesterinämie, myokardialem Infarkt und zerebralem Infakrt im Zusammenhang stehen; sie erhielten au diesen Zellen mit Erfolg einen monoklonalen Antikörper, der fähig ist, menschliche Arteriosklerose zu erkennen.
Nach einem Merkmal der Erfindung bezieht sich die vorliegende Erfindung daher auf einen monoklonalen Antikörper, der als 125H oder 131B bezeichnet wird und der durch Hybridzellen der Linen FERM BP 1675 und 1676 erhältlich ist. Dieser monoklonale Antikörper ist fähig, ein mit menschlicher Arteriosklerose im Zusammenhang stehendes Antigen spezifisch zu erkennen.
Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der menschliche Arteriosklerose erkennt; dieses Verfahren wird in den Ansprüchen 4 bis 8 beansprucht.
In einem besonders geeigneten Verfahren kann der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung aus Hybridzellen gewonnen werden, welche durch Verschmelzen von Zellen, die einen Antikörper gegen menschliche Arteriosklerose produzieren, mit Myelomzellen hergestellt werden. Dieses Herstellungsverfahren kann mit einer Sensibilisierung eines nicht-menschlichen Arteriosklerose-Antigens beginnen. Beispielhafte menschliche Arteriosklerose-Antigene umfassen Seren, die von Patienten mit menschlichen arteriosklerotischen Erkrankungen wie z. B. familiärer Hypercholesterinämie, zerebralem Infarkt und myokardialem Infarkt isoliert wurden, sowie ein Homogenat von arteriosklerotischen Läsionsstellen (insbesondere einem schwellenden Teil der Tunika intima). Wenn die Seren als Antigene verwendet werden, können sie vorzugsweise mit Antiseren gegen normales Plasma vermischt werden, wie es im nachfolgenden Beispiel 1 erläutert ist, wodurch die folgende Sensibilisierung wirksam durchgeführt werden kann. Im nächsten Schritt des Verfahrens werden Lumphozyten, die fähig sind einen Antikörper gegen menschliche Arteriosklerose zu produzieren, aus der Milz des sensibilisierten Tiers, speziell dem Thymus, peripheren Lumphknoten oder peripherem Blut isoliert, wodurch Zellen erhalten werden, die fähig sind einen Antikörper gegen menschliche Arteriosklerose zu produzieren. Diese Zellen werden dann nach Standardtechniken mit Myelomzellen verschmolzen, um Antikörper-produzierende Hybridzellen zu erhalten. Die Hybridzellen werden auf eine Vielzahl von Löcher verteilt und kultiviert. Der Überstand der Kultur in jedem Loch wird durch eine geeignete Technik untersucht, beispielsweise durch Enzymimmunoassay (ELISA) oder eine indirekte fluoreszierende Antikörpertechnik, um Zellen zu isolieren, die einen monoklonalen Antikörper produzieren, der menschliche Arteriosklerose erkennt, und die sich speizifisch an das Serum eines menschlichen Arteriosklerose-Patienten oder eine menschliche arteriosklerotische Läsion binden und die normales menschliches Serum oder normale Arterienwand nicht erkennen. Die isolierten Zellen werden direkt einer Gewebekultivierung unterworfen. Alternativ können sie in die Bauchhöhle eines Säugetiers, beispielsweise einer Maus oder eines Meerschweinchens transplantiert werden, um einen Tumor zu erzeugen. Der gewünschte monoklonale Antikörper wird aus dem Aszites gewonnen und gereinigt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfidung haben auf diese Weise die Isolierung neuer monoklonaler Antikörper erreicht, die menschliche Arteriosklerose erkennen und die spezifisch Antigene, die mit menschlicher Arteriosklerose im Zusammenhang stehen, erkennen.
Von den monoklonalen Antikörpern, die in der vorliegenden Erfindung erhalten werden, ist der monoklonale Antikörper 131B, der unter Verwendung von Seren von Patienten mit Hypercholesterinämie, zerebralem Infarkt und myokardialem Infarkt als Antigene erhalten wird, fähig, die Antigene, die in Seren von menschlichen Patienten gefunden werden, spezifisch zu erkennen, er wird as IgG klassifiziert.
Der monoklonale Antikörper 125H konnte unter Verwendung von Homogenaten von Hyperplasie-Teilen der Tunika intima arteriosklerotischer Patienten als Antigene erhalten werden. Es wurde festgestellt, daß monoklonale Antikörper 125H, welcher als IgG klassifiziert ist, fähig ist, arteriosklerotische Läsionen spezifisch zu erkennen.
Fig. 1 ist eine Aufnahme, die die Ergebnisse der Immunoglobulin-Klassifizierung von monoklonalem Antikörper 131B nach dem Ouchterlony-Verfahren zeigt;
Fig. 2 ist eine tabellarische Aufzeichnung von antigen Aktivitäten des monoklonalen Antikörpers 131B bei Erkrankung, die auf den in Tabelle 1 angegebenen Daten basiert;
Fig. 3 ist ein Schaubild, das die Ergebnisse von Protein- und Immunofluoreszenz-Anfärbung von mit Arteriosklerose im Zusammenhang stehenden Substanzen, welche durch den monoklonalen Antikörper 131B erkannt werden, zeigt;
Fig. 4 ist ein Diagramm, das die antigenen Substanzen zeigt, die durch den monoklonalen Antikörper 131B erkannt werden;
Fig. 5 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen antigenen Substanzen, die durch den monoklonalen Antikörper 131B erkannt werden und den Cholesterinspiegeln bei Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie zeigt;
Fig. 6 ist eine tabellarische Aufzeichnung der antigenen Aktivität von monoklonalem Antikörper 125H bei Erkrankung, die auf dem in Tabelle 2 aufgeführten Daten basiert;
Fig. 7 ist eine Mikroaufnahme, die die Ergebnisse einer immunofluoreszierenden Anfärbung durch die indirekte Antikörpertechnik eines gefrorenen Teiles einer arteriosklerotischen Läsion bei einem Hasen, welche mit einem monoklonalen Antikörper 125H reagieren gelassen wurde, zeigt;
Fig. 8 ist eine Mikroaufnahme, die die Ergebnisse der Anfärbung mit Ölrot O bei einem gefrorenen Abschnitt einer arteriosklerotischen Läsion bei einem Hasen zeigt;
Fig. 9 ist eine Aufnahme, die den Zustand der Reaktion zwischen einer arteriosklerotischen Läsion eines Hasen und monoklonalem Antikörper 125H zeigt, wie sie durch indirekte Autoradiographie beobachtet wird;
Fig. 10 ist eine Mikroaufnahme, die den Zustand des normalen Abschnitts zeigt, welcher mit monoklonalem Antikörper 125H umgesetzt wurde, und welcher durch indirekte Autoradiographie beobachtet wurde; und
Fig. 11 ist eine Aufnahme, ie die Ergebnisse der Protein- und Immunofluoreszenz-Anfärbung von antigenen Substanzen zeigt, die durch den monoklonalen Antikörper 125H erkannt werden.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper 131B und 125H wurden durch Sensibilisierung unter Verwendung von Seren menschlicher Patienten oder Homogenaten von Arterienwand als Antigene erhalten; sie waren neu, weil sie sich von monoklonalen Antikörpern, die unter Verwendung von hasen-Seren und Homogenat der Arterienwand als Antigene hergestellt wurden, unterschieden.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können unmittelbar als Reagenzien zur Bestimmung der Progredienz menschlicher Arteriosklerose verwendet werden. Wenn gewünscht, können diese Antikörper mit proteolytischen Enzymen behandelt werden, und die entstehenden Zersetzungsprodukte, F(ab')&sub2; und Fab als Reagenzien zur Bestimmung der Progredienz menschlicher Arteriosklerose verwendet werden. Es ist interessant, anzumerken, daß die Antigene, die durch diese monoklonalen Antikörper erkannt werden, nicht nur in Stellen menschlicher arteriosklerotischer Läsion auftreten, sondern auch in Seren arteriosklerotischer Patienten. Daher können quantitative oder qualitative Analysen der in Probenseren vorliegenden Antigene unter Verwendung dieser monoklonalen Antikörper als Reaktionsreagenzien durchgeführt werden, wobei eine Vielzahl bekannter Techniken, z. B. Immunoassay-Techniken (z. B. kompetitiver und Sandwich-Verfahren), welche Marker wie Enzyme (beispielsweise alkalische Phosphatase, β-Galaktosidase und Peroxidase), Radioisotope und fluoreszierende Materialien einsetzen; Messungen, die von einer Agglutinationsreaktion oder einer Reaktion zur Verhinderung der Agglutination abhängen; oder Modifikationen dieser Verfahren eingesetzt werden können. Die Ergebnisse dieser Analysen können zur Bestimmung der Progredienz der interessierenden Arteriosklerose verwendet werden.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um die Anwesenheit einer Stelle menschlicher arteriosklerotischer Läsion nachzuweisen oder das Ausmaß ihrer Ausdehnung zu untersuchen. Bei Verwendung von Radioisotopen wie z. B. Na¹³¹I, Na¹²³I und Na¹²&sup5;I wird z. B. Jod an diese monoklonalen Antikörper oder an Fragmente davon wie z. B. F(ab')&sub2; und Fab durch Verfahren wie das Chloramin-T-Verfahren und das Enzymverfahren gebunden. Technetium kann durch Zugabe einer physiologischen Salzlösung von Na99mTcO&sub4; (Natriumpertechnetat) in Gegenwart eines geeigneten Reduktionsmittels, wie SnCl&sub2; gebunden werden. Alternativ kann Indium (¹¹¹In) mit Hilfe eines geeigneten Chelat-bildenden Agens [sogenannte bifunktionelle Chelate wie z. B. Diethylentriaminpentaessigsäureanhydrid (DTPA)] gebunden werden. Die monoklonalen Antikörper oder Fragmente davon, an welche Jod, Technitium order Indium gebunden sind, werden dann zu einem sterilen nicht-toxischen Medium gegeben und in Venen injiziert. Nach einer bestimmten Zeit wurden die Ergebnisse eine Assoziation der monoklonalen Antikörper oder von Fragmenten davon mit der arteriosklerotischen Läsion mit einer bildgebenden Vorrichtung, z. B. einer Gamma- Kamera untersucht, wobei ein Szintigramm erhalten wird, das auf der Radioaktivitätsverteilung im Körper des Patienten basiert. Das Szintigramm kann zum Nachweis des Vorliegens von Läsionen durch menschliche arteriosklerotische Erkrankungen wie zerebralem Infarkt und myokardialem Infarkt oder zur Untersuchung des Ausmaßes ihrer Ausdehnung verwendet werden.
Die folgenden Beispiele sollen der weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung dienen.

BEISPIEL 1: Monoklonaler Antikörper der Klasse IgG, hergestellt unter Verwendung von Seren hyperlipidemischer Patienten als antigene

(1) Herstellung monoklonaler Antikörper

Eine Portion (20 ul) Blutplasma, das einer Normalperson entnommen worden war, wurde mit 180 ul physiologischer Salzlösung auf das 10-fache verdünnt und intraperitoneal BALB/c-Mäusen verabreicht. Nacht dieser Injektion wurde die gleiche Verdünnung nach 3 Wochen und 2 Monaten intraperitoneal verabreicht, wodurch Anti-Seren gegen normales Plasma erhalten wurden. Seren, die von 19 Patienten mit familärer Hyperlipidämie entnommen worden waren, wurden mieinander vermischt, 20 ul der Mischung wurden mit 80 ul physiologischer Salzlösung auf das 5-fache verdünnt. Die Lösung wurde gründlich mit 100 ul Freund's-kompletten Adjuvans vermischt; die resultierende Emulsion wurde BALB/c-Mäusen subkutan verabreicht. Nach 2 Wochen wurden 10 ul der früher hergestellten Antiseren gegen normales Plasma und 10 ul eines gemischten Serums von 19 Patienten mit familiärer Hyperlipidämie mit 80 ul physioligscher Salzlösung verdünnt. Die Verdünnung wurde gündlich mit 100 ul Freud's kompletten Adjuvans vermischt und die resultierende Emulsion wurde den Tieren subkutan verabreicht. Nach 2 wochen wurden die Mäuse endgültig durch intraperitoneale Injektion einer Verdünnung von 10 ul Anti-Seren gegen Normalplasma und 10 ul eines gemischten Serums von 19 Patienten mit familiärer Hyperlipidämie in physiologischer Salzlösung (180 ul) imunisiert. Am dritten Tag wurde die Milz aus den sensibilisierten Tieren herausgenommen.
Die Milzzellen wurden gründlich mit HHBS (Hepes gepufferte Hanks-eingestellt Salzlösung) gewaschen, mit gründlich gewaschenen Maus-Myelom-Zellen (Stamm P3/U1) im Verhältnis 5:1 vermischt und 5 Minuten lang bei 1300 Upm zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 1 ml DMEM(-)-Medium, das 50 % Polyethylenglykol 4000 enthielt, suspendiert und 2 Minuten lang stehengelassen. Anschließend wurden 10 ml DMEM(-)-Medium langsam zugesetzt, um eine Verdünnung herzustellen, welche bei 800 Upm für 5 Minuten zentrifugiert wurde. Das Zellpellet wurde in 100 ml eines HAT-Mediums, das 20 % fetales Kälberserum enthält, resuspendiert; die Suspension wurde in 0,1 ml- Portionen auf 96 Bohrungen in einer Gewebekultur-Platte verteilt. Alle 2 bis 4 Tage wurde die Hälte des Mediums durch frisches Medium ersetzt. Eine Untersuchung des Antikörper-Titers, die mit den Überständen der Kultur nach 8 Tagen durchgeführt wurde, zeigte, daß eine starke antikörperaktivität in 21 von 1000 Bohrungslöchern gefunden wurde. Durch eine limitierende Verdünnungstechnik wurde ein Klonen durchgeführt, um Klone u selektieren, die keine Antikörperaktivität gegen eine gemischtes Plasma von 14 Normalpersonen oder ein gemischtes Serum von 14 Normalpersonen zeigen würden, welche aber Antigene, die mit Arteriosklerose im Zusammenhang stehen, in menschlichen Serien speizifsch erkennen würden. Als Ergebnis wurden insgesamt 9 Klone von Hybridzellen erhalten. Das endgültige Klonen wurde mit einer limitierenden Verdünnungstechnik durchgeführt, um insgesamt 6 Klone von Hybridzellen zu isolieren, welche gegen Normalplasma- und Seren inaktiver waren, welche aber speizifisch mit Seren von Patienten, die unter mit Arteriosklerose im Zusammenhang stehenden Erkrankungen leiden, reagierten. Diese Klone wurden pristan-behandelten BALB/c-Mäusen intraperitoneal injiziert und nach 10 bis 20 Tagen der Aszites aus jedem Tier entnommen, um monoklonale Antikörper zu erhalten.
Nach dem Ouchterlony-Verfahren (siehe Fig. 1) wurde festgestellt, daß von den monoklonalen Antikörpern, die von den 6 Klonen von Hybridzellen erhalten wurden, jene, die aus der Zell-Linie 131B erhalten wurden, zu der Immunoglobin-Unterklasse IgG&sub1; gehören und daß die Fähigkeit haben, in menschlichen Seren Antigene, die mit Arteriosklerose im Zusammenhang stehen, spezifisch zu erkennen. Die Zell-Linie 131B wurde nach dem Budapester Vertrag bei dem Fermentation Research Institute (FERM), im Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie, einer inter internationalen Hinterlegungsstelle, unter der Zugriffsnummer FERM BP-1676 hinterlegt.

(2) Untersuchung von Patienten-Seren mit monoklonalem Antikörper 131B

Die zu untersuchenden Seren waren wie folgt: Serum von einem Patienten mit familiärer Hyperlipidämie (FH); Serum eines Patienten mit Hyperlipidämie-Typ III (Typ III); Serum eines Patienten mit Hypo-beta-lipoproteinämie (Hypo β); Serum von einem Patienten mit myokardialem Infarkt (MI); Serum von einem Patienten mit zerebralem Infarkt (APO); Serum von einem Patienten mit Werner-Syndrom (Werner); Serum von einem Patienten mit Angina pectoris (Angina); Plasma von einer Normalperson (NP); sowie ein gemischtes Serum, das aus Blutproben von 14 Normalpersonen (NS) hergestellt wurde. Jedes dieser Seren wurde 1000-fach verdünnt; 100 ul jeder Verdünnung wurden auf eine Anti-Maus-IgG-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase markiert war, unterworfen. Nach der reaktion wurde die Reaktion in einer 0,75 M-Tris-HCl- Pufferlösung (pH 8,8), die 0,2 % Paratoluidinsalz von 5-Brom-4-chlor-3-indolyphosphorsäure enthielt, getaucht und über Nacht zur immunofluoreszierenden Färbund bei Raumtemperatur stehengelassen. Aus den Färbungsresultaten wurde festgestellt, daß die antigen Substanzen im menschlichen Serum, die mit Arteriosklerose im Zusammenhang stehen und die durch den monoklonalen Antikörper 131B spezifisch erkannt wurden, Molekulargewichte von annähernd 52000 hatten.
Die antigenen Substanzen, die durch den monoklonalen Antikörper 131B erkannt werden, haben eine Spezifität für Hyperlipidämie und unterscheiden sich von Lipoprotein-Bestandteilen wie z. B. Apo A-I, A-IV, B-100, B-48, E und D, von denen gesagt wird, daß die sie in einer nahen Beziehung zu Arteriosklerose stehen (siehe Fig. 3).
Wie aus Fig. 4 zu sehen ist, wurden die antigen Substanzen, die durch den monoklonalen Antikörper 131B erkannt wurden, in Fraktionen gefunden, die selbst nach 24-stündiger Zentrifugation bei 30000 Upm von 1 ml Serum eines Patienten mit familiären Hyperlipidämie, welches mit NaBr auf ein spezifisches Gewicht von 1,25 eingestellt worden war und danach mit 2 ml physiologischer Salzlösung mit einem spezifischen Gewicht von 1,153 und 1,6 ml physiologischer Salzlösung mit einem spezifischen Gewicht von 1,063 beschichtet worden war, nicht nach oben schwammen. Ferner zeigte der niedrige Grad der Korrelation (R = 0,104) mit dem Cholesterinspiegel von Patienten familiärer Hyperlipidämie, daß der monoklonale Antikörper 131B LDL oder Lipoproteine nicht als antigene Substanzen erkennt.
Aus diesen Ergebnissen wird geschlossen, daß der monoklonale Antikörper 131B spezifisch jene antigenen Substanzen erkennt, die für arteriosklerotische Erkrankungen charakteristisch sind und normalerweise in Seren des Patienten gefunden werden. Es wurde auch festgestellt, dß dieser monoklonale Antikörper auch zum spezifischen Erkennen von antigenen Substanzen in Blutplasma fähig ist. Tabelle 1 Cholesterin-Spiegel von Seren von Patienten, die an im Zusammenhang mit Arteriosklerose stehenden Erkrankungen leiden und ihre antigenen Aktivitäten für den monoklonalen Antikörper 131B Erkrankung Probe Nr. Patient Nr. T.C. ELISA Tabelle 1 (Fortsetzung) Erkrankung Probe Nr. Patient Nr. T.C. ELISA Tabelle 1 (Fortsetzung) Erkrankung Probe Nr. Patient Nr. T.C. ELISA
T.C. : Gesamtcholesterin (Total cholesterol)
FH : Familiäre hyperlippidämie
APO : Zerebraler Infarkt
MI : Myokardialer Infarkt
Hypo β : Hypo-β-Lipoproteinämie
Typ III : Hyperlipidämie-Typ III
Werner : Werner-Syndrom
Angina : Angina pectrois

BEISPIEL 2: Monoklonaler Antikörper der Klasse IgG, der arteriosklerotische Wand erkennt und der unter Verwendung arteriosklerotischer Läsionen als Antigene hergestellt wird.

(1) Antigenherstellung

Menschliche thorakale und abdominale arteriosklerotische Wände wurden an einem kalten Ort entfernt und Blutgefäße wurden herausgeschnitten. Danach wurde der Hyperplasie-Abschnitt der Tunika intima (arteriosklerotische Läsion) mit einer Pinzette abgeschält und mit einer Schere in quadratische Stücke (1 mm x 1 mm) geschnitten. Zu diesen Stücken wurde eine wäßrige Lösung (pH 7,4), die 1 mM EDTA und 0,1 % Ethanol enthielt in Mengen von 5 bis 10 ml pro Gramm, bezogen auf das Gewicht, zugesetzt, und es wurde mit Hilfe eines Polytron-Homogenisators ein Homogenat hergestellt.
Ein Mischung von Homogenaten, die von 3 Patienten stammten (entspricht 5 Proben) wurde durch 4 übereinanderliegende Gauze-Bögen filtriert; das Filtrat wurde als Antigene Lösung verwendet.

(2) Herstellung von monoklonalen Antikörpern

Zu 0,05 mg (200 ul) des Homogenats wurden 200 l Freud's komplettes Adjuvans gegeben und gut gemischt. Die resultierende Emulsion wurde BALB/c- Mäusen subkutan verabreicht. Nach 9 Wochen wurde die gleiche Emulsiuon subkutan verabreicht. Nach 18 Wochen wurde die endgültige Immunisierung durch intraperitoneale Injektion einer Mischung von 0,5 mg (200 ul) des Homogenats durchgeführt. Am dritten Tag wurde den sensibilisierten Tieren die Milz entnommen. Die Milzellen wurden gründlich mit DMEM(-)-Medium gewaschen und mit gründlich gewaschenen Maus-Myelomzellen (Stamm P3/U1) im Verhältnis 5:1 vermischt; die Mischung wurde 5 Minuten lang bei 1000 Upm zentrifugiert.
Das Zellpellet wurde in 1 ml DMEM(-)-Medium, das 45% Polyethylenglykol 4000 enthielt, suspendiert und 2 Minuten stehengelassen. Zur Herstellung einer Verdünnung wurden dann langsam 10 ml DMEM(-)-Medium zugestzt, welche dann 5 Minuten bei 1000 Upm zentrifugiert wurde. Das Zellpellet wurde in 127 ml DMEM-Medium, das 10 % fetales Kälberserum enthielt, resuspendiert; die Suspension wurde in 1 ml-Portionen auf 24 Löcher in einer Gewebekultur- Platte verteilt.
Am ersten Tag der Kultur wurde 1 ml HAT-Medium zugegeben; und alle 1 - 2 Tage wurde die Hälfte des Mediums durch ein frisches Medium ersetzt. Am 8. Tag wurden die Antikörper-Titer der Kultur-Überstände nach dem ELISA- Verfahren untersucht.
Das vorher hergestellte Homogenat des Hyperplasie-Teil der Tunika intima einer menschlichen arteriosklerotischen Läsion wurde zur Herstellung einer Lösung mit einer Proteinkonzentration von 10 ug/ml verdünnt. Eine 100 ul-Portion dieser antigen-Lösung wurde auf eine ELISA-Mikroplatte (Nunc) gegeben, die dann zur Adsorption über Nacht bei 4ºC stehengelassen wurde. Nach Behandlung der Mikroplatte mit einer 2 %igen BSA-Lösung, wurden 100 ul er Kulturüberstandflüssigkeiten von 127 Löchern zugegeben und die Reaktion 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Waschen der Mikroplatte wurden 100 ul 6000-fach verdünnter Anti-Maus-IgG-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase markiert war, zugesetzt und die Reaktion für 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Waschen der Mikroplatte wurden 100 ul einer 1 mM Diethanolamin-Pufferlösung (pH 9,8), die 1 mg/ml Paranitrophenylphosphorsäure-Dinatriumsalz und 0,01 MgCl&sub2; enthielt, zugegeben, die Reaktion wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Mit einem Mikroplatten-Kolorimeter (Bio-Tech) wurde die optische Extinktion (OD&sub4;&sub0;&sub5; nm) gemessen. 65 Löcher, die Extinktionswerte von 0,5 und höher hatten, wurden mittels Autoradiographie weiter untersucht.
Es wurden arteriosklerotische Läsionen von arterisklerotischen Modellhasen entnommen, welche 4 Monate lang mit einer Diät, die mit 1 % Cholesterin angereichert war, aufgewachsen waren; die Läsionen wurden in stücke geschnitten. Nach Behandlung dieser Stücke mit einer 5 %igen BSA-Lösung wurde ein 1 ml des Kultur-Überstands aus 65 Löchern zugegeben und die Reaktion für 5 Stunden bei 4ºC durchgeführt. nach dem Waschen wurde das Reaktionsgemisch mit 5 %igem normalem Milzserum behandelt und es wurden 200 ul (1,7 Ci/ml) Anti-Maus-IgG-Antikörper; der mit ¹²&sup5;I markiert war, (unmarkiert: Tago) zugesetzt; anschließend erfolgte eine reaktion bei 4ºC für 3 Stunden. Nach dem Waschen wurde das Reaktionsgemisch einer Autoradiographie mit Röntgenfilmen (Fuji Photo Film) unterworfen.
Von den getesteten 65 Löchern wurden 10 Löcher, die eine spezifische Reaktion erzeugten und hohe bindungswirksamkeit aufweisen, selektiert und dem Klonen durch limitierende Verdünnungstechnik unterworfen. Als Ergebnis wurden 2 Klone Hybridzellen isoliert. Diese Hybridzellen wurden pristan-behandelten BALB/C-Mäusen intraperitoneal injiziert; nach 10 - 16 Tagen wurden von jedem Tier der Aszites gesammelt, um monoklonale Antikörper zu erhalten. Einer dieser Klone war 125H, und es wurde durch das ELISA-Verfahren festgestellt, daß er zur Immunoglobulin-Unterklasse IgG&sub2;&sub6; gehört und die Fähigkeit hat, arteriosklerotische Plaque spezifisch zu erkennen. Die Zell- Linie 125H ist nach dem Budapester Vertrag mit FERM, einer internationalen Hinterlegungsstelle, unter der Zugriffs-Nr. FERM BP-1675 hinterlegt worden.

(3) Spezifität des monoklonalen Antikörpers 125H

Unter Verwendung von 100 ul von Homogenaten verschiedener menschlicher arteriosklerotischer Läsionen von Tunika intima normaler Arterien (jedes Homogenat war auf einen Proteingehalt von 10 ul/ml eingestellt worden) wurde die Reaktivität von monoklonalem Antikörper 125H nach dem ELISA-Verfahren untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und Fig. 6 dargestellt. Es wurde festgestellt, daß dieser monoklonale Antikörper starke Aktivität gegenüber menschlichen arteriosklerotischen Läsionen zeigt.
Die Messungen der Gesamtcholesterin (FC)-Spiegel wurden mit eienr Cholesterin-Bestimmungs-Ausrüstung (V-Cholestase "Nissui" von Nissui Seiyaku Co., Ltd.) durchgeführt.
Die Reaktivität von monoklonalem Antikörper 125H mit dem Hyperplasie- Teil einer arteriosklerotischen Tunika intima eines Hasen wurde ebenfalls untersucht. Die Ergebnisse einer immunofluoreszierenden Färbund (auch die indirekte Technik des fluoreszierenden Antikröpers), die an gefrorenen Teilen der arteriosklerotischen Läsionen von arteriosklerotischen Hasen, die mit Diäten aufwuchsen, die mit 1 % Cholesterin versetzt waren, durchgeführt wurde, sind in Fig. 7 dargestellt; die Ergebnisse der Färbung mit Ölrot O, die an gefrorenen Teilen der gleichen Läsion durchgeführt wurden, sind in Fig. 8 dargestellt.
Es wurden auch arteriosklerotische Läsionen von anderen arteriosklerotischen Modellhasen entfernt, die mit Diäten, die mit 1 % Cholesterin angereichert waren, aufgewachsen waren; die Reaktivität monoklanaler Antikörper gegenüber diesen Läsionen wurde durch Autoradiographie untersucht. Der normale Abschnitt wurde als Kontrolle verwendet. Die Reaktionsergebnisse durch indirekte Autoradiographie, den Zustand der Läsionen und des normalen Abschnitts nach der Reaktion sind in Fig. 9 bzw. 10 dargestellt. Aus diesen figuren wird klar, daß der monoklonale Antikörper 125H den Hyperplasie-Teil von arteriosklerotischer Hasen-Tunika intima spezifisch erkennt.
Aufgrund dieser Ergebnisse kann man zu Recht erwarten, daß monoklonaler Antikörper 125H nach Verabreichung invivo mit arteriosklerotischen Läsionen reagiert. Wenn man ein Reagens zur Bildanalyse, die als Zusatz bei der Diagnose menschlicher Arteriosklerose durchzuführen ist, herstellen möchte, kann man umfassende Vortests über Dosierung, Sicherheit und andere Faktoren unter Verwendung von Hasen durchführen, bevor dieses Reagens bei Menschen angewendet wird. Monoklonaler Antikörper 125H findet so potentielle Anwendung bei der Bildanalyse zur Identifizierung der Stelle einer menschlichen arteriosklerotischen Läsion und zur Untersuchung des Grades ihrer Ausdehnung.

(4) Antigene Substanzen in der arteriosklerotischen Wand, die fähig sind, mit monoklonalem Antikörper 125H zu reagieren.

Homogenate schwellender Tunika intima von arteriosklerotischen Läsionen und solche von normaler arterieller Wand wurden für 2 Stunden einer Elektrophorese an mit SDS-versetztem Polyacrylamidgel bei 20 mA unterworfen; und auf Nitrocellulose-Membran aufgetragen. Die Membran wurde gründlich mit einem Phosphatpuffer, der 0,05 % nichtionisches oberflächenaktives Mittel Tu.en ??20 enthielt, gewaschen und danach mit einer 2 %igen BSA-Lösung 6 Stunden lang behandelt. Nach dem Waschen wurde die Membran für 16 Stunden der Reaktion mit monoklonalem Antikörper 125H, dann mit Anti-Maus- IgG + IgM-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase markiert war, für 2 Stunden unterworfen. Nach der Reaktion wurde die Membran in eine 0,75 M Tri-HCl-Pufferlösung (pH 8,8), die 0,1 % Paratoluidinsalz von 5-Brom-4- chlor-3-indolylphosphorsäure enthielt, getaucht und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die antigenen Substanzen, die durch den monoklonalen Antikörper 125H erkannt wurden, Molekulargewichte von annähernd 44000 (siehe Fig. 11) hatten. Tabelle 2 Spezifität von monoklonalem Antikörper 125H für arteriosklerotische Läsionen Person Nr. Erkrankung Cholesterin?P. ELISA Beurteilung Thorax Case Abdomen normaler

Läsionen:

FP : fibröse Plaque
FS : fettige Streifen
AP : atheromatöse Plaque
CO : Verkalkung
N : normal
Kriterien der Bewertung
In ELISA (OD&sub4;&sub0;&sub5; nm)-Werten:
> 0,8 : 4+
0,6 - 0,8 : 3+
0,4 - 0,6 : 2+
0,2 - 0,4 : +
> 0,2 : -
Colesterin/p.
(Cholesterin/Protein) = (mg/dl)/(mg/ml)

Claims

1. Monoklonaler Antikörper, der als 125H oder 131B bezeichnet wird und aus Hybridzellen der Linien FERM BP 1675 bzw. 1676 erhältlich ist.

2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, wobei der monoklonale Antikörper mit einem Enzym oder einem Radioisotop markiert ist.

3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, wobei das Radioisotop ¹²&sup5;I ist.

4. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der als 125H oder 131B bezeichnet wird, welches die Schritte der Immunisierung eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einer Lösung, die ein Antigen, das mit menschlicherArteriosklerose im Zusammenhang steht, enthält; des Verschmelzens von Antikörper-produzierenden Lymphozyten von diesem Tier mit Myelomzellen; des Screening nach Hybridzelle FERM BP 1675 bzw. FERM BP 1676, das einen Antikörper gegen menschliche Arteriosklerose prouziert; des Kutivierens der Hybridzelle der Linie FERM BP 1675 bzw. 1676; sowie des Isolierens des Antikörpers, umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Lösung, die ein Antigen, das mit menschlicher Arteriosklerose im Zusammenhang steht, enthält, das Serum eines familiären hypercholesterinämischen Patienten ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Lösung, die ein Antigen, das mit menschlicher Arteriosklerose im Zusammenhang steht, enthält, das Serum eines Patienten ist, der an zerebralem Infarkt oder myokardialem Infarkt leidet.

7. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Lösung, die ein Antigen, das mit menschlicher Arteriosklerose im Zusammenhang steht, enthält, ein Homogenat einer arteriosklerotischen Läsion ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die arteriosklerotische Läsion ein schwellender Teil der Tunika intima ist.

9. Reagens zur Diagnose von menschlicher Arteriosklerose, das einen monoklonalen Antikörper, wie er in Anspruch 2 definiert ist, enthält.

10. Reagens zur bildgebenden Diagnose menschlicher Arteriosklerose, das einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 2 enthält, welcher mit einem Radioisotop markiert ist.

11. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 9 oder 10, bei dem die menschliche Arteriosklerose ein myokardialer Infarkt oder ein zerebraler Infarkt ist.

12. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 11, bei dem das Radioisotop ¹²³I, ¹²&sup5;I oder ¹³¹I ist.

13. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 11, bei dem das Radioisotop ¹¹¹In ist.

14. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 11, bei dem das Radioisotop 99mTc ist.