ES2628134T3 - Procedimiento para diagnosticar y monitorizar la isquemia cardíaca en pacientes con dolor torácico agudo y sin infarto de miocardio - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para diagnosticar un estado isquémico de un sujeto que muestra signos y síntomas de síndrome coronario agudo pero que no cumple los criterios diagnósticos de un infarto de miocardio por tener una cantidad de troponina T determinada en una muestra del sujeto menor de 0,1 ng/ml, que comprende (a) determinar la cantidad de tirosina quinasa-1 similar a fms soluble (sFLT-1) en una muestra de dicho sujeto, (b) comparar la cantidad de sFLT-1 determinada en la etapa a) con al menos una cantidad de referencia, y (c) diagnosticar el estado isquémico basándose en la información obtenida en la etapa b), en el que una cantidad de sFLT-1 por debajo de la cantidad de referencia es indicativa de un estado no isquémico no asociado o que conduce a una disfunción cardíaca reversible o una lesión cardíaca no reversible, y una cantidad de sFLT-1 igual a o mayor que la cantidad de referencia es indicativa de un estado isquémico asociado o que conduce a una disfunción cardíaca reversible o una lesión cardíaca no reversible.

Description

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Procedimiento para diagnosticar y monitorizar la isquemia cardiaca en pacientes con dolor toracico agudo y sin infarto de miocardio

La presente invencion se refiere a un procedimiento para diagnosticar el estado isquemico y un procedimiento para monitorizar la evolucion de la gravedad del estado isquemico de un sujeto que muestra signos y sintomas de dolor toracico agudo general o sindrome coronario agudo pero que no cumple los criterios diagnosticos de un infarto de miocardio (sin elevacion de ST). Ademas, la presente invencion se refiere a un procedimiento para identificar un sujeto susceptible de intervencion cardiaca y un procedimiento de decision sobre la intervencion. Los procedimientos de la presente invencion se basan en la determinacion de la tirosina quinasa-1 similar a fms soluble (sFLT-1) y opcionalmente del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) en una muestra de dicho sujeto y comparacion de la cantidad de sFLT-1 y, opcionalmente, HGF con al menos una cantidad de referencia.

Un objetivo de la medicina moderna es proporcionar regimenes de tratamiento personalizados o individualizados. Se trata de regimenes de tratamiento que tienen en cuenta las necesidades o riesgos individuales del paciente. Un riesgo particularmente importante es la presencia de complicaciones cardiovasculares, especialmente en episodios cardiovasculares agudos. Las complicaciones cardiovasculares son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo occidental. Para el tratamiento individual de la persona que sufre una complicacion cardiovascular, un diagnostico fiable tiene un impacto significativo en el exito del tratamiento de dicha persona. Esto es particularmente importante en el caso de pacientes que muestran signos y sintomas de sindrome coronario agudo (SCA).

Se cree que los sintomas clinicos del sindrome coronario agudo estan provocados por isquemia miocardica aguda. Los pacientes con dolor toracico o signos y sintomas de angina inestable o sindrome coronario agudo (SCA) frecuentemente acuden a su medico como una emergencia o acuden a los servicios de urgencias. La evaluacion clinica de estos pacientes incluye una historia clinica dirigida especificamente a evidencias de enfermedad cardiovascular existente o sus factores de riesgo, analisis del tipo de sintomas descritos, asi como signos clinicos asociados a sindrome coronario agudo tales como evidencia de edema pulmonar, hipotension y/o taqui o bradicardia (Circulaction 106: 1893, 2002 / Grupo de trabajo sobre directrices practicas de la American Heart Association). Ademas, se realizan ensayos de laboratorio y ECG.

El dolor toracico agudo es el sintoma principal de SCA. Sin embargo, el dolor toracico no es especifico de la enfermedad cardiovascular o SCA. Los sintomas de dolor toracico pueden provenir de trastornos vasculares tales como embolia pulmonar, diseccion aortica o hipertension pulmonar o de enfermedades pulmonares tales como pleuritis, neumonia, traqueobronquitis y neumotorax espontaneo. Los sintomas de dolor toracico agudo tambien pueden provenir de una enfermedad gastrointestinal tal como reflujo esofagico, ulcera peptica, enfermedad de la vesicula biliar y pancreatitis, causas musculoesqueleticas de dolor agudo incluyen costocondritis, enfermedad de disco cervical, traumatismo o distension. El herpes zoster tambien causa dolor toracico agudo. Ademas, es necesario considerar el trastorno de panico como diagnostico diferencial.

El dolor toracico agudo clinicamente cardiaco se puede identificar por caracteristicas clinicas tales como presion toracica retroesternal o quemazon o pesadez que se propaga ocasionalmente al cuello, mandibula, epigastrio, hombros o brazo izquierdo. La gravedad del dolor toracico agudo aumenta con frecuencia de angina a angina inestable e infarto de miocardio. Las causas desencadenantes incluyen estres fisico y emocional o el frio. La gravedad tambien se asocia a la duracion del dolor toracico que varia desde menos de 2 minutos en la angina a mas de 30 minutos en el infarto de miocardio. Aunque estos sintomas son bastante caracteristicos en casos graves, los casos leves de dolor toracico cardiaco pueden ser dificiles de separar de las causas no cardiacas. (Braunwald Heart Disease, capitulo 49, pagina 1196).

Los pacientes con signos de sindrome coronario agudo tienen un riesgo significativamente mayor de sufrir una lesion cardiaca no reversible o incluso muerte cardiaca y, por lo tanto, es preciso identificarlos entre los pacientes con sintomas toracicos no traumaticos (Morrow et al., National academy of clinical biochemistry guidelines: Clinical characteristics and utilization of biochemical markers in acute coronary syndrome, 2007, Circulation 115; 356-375). Un sindrome coronario agudo esta provocado por un bloqueo repentino en una arteria coronaria, que reduce significativamente o interrumpe el suministro de sangre a las areas conectadas del miocardio (musculo cardiaco) y tiene como resultado isquemia (falta de suministro de sangre).

El tejido del corazon se vuelve necrotico en caso de isquemia significativa y/o persistente. El infarto de miocardio (IM), tambien denominado ataque cardiaco, se conoce como necrosis celular en el miocardio (tejido cardiaco) por isquemia, segun lo descrito por el Grupo de Trabajo Conjunto ESC/ACCF/AHA/WHF para la Redefinicion del Infarto de Miocardio (The Joint European Society of Cardiology / American College of Cardiology Committee: Universal definition of myocardial infarction, European Heart Journal (2007), 28, 2525 - 2538).

Un trombo es la causa mas comun de bloqueo de arteria coronaria que, en general, ya se encuentra parcialmente estrechada por ateromas. Un ateroma se puede romper o desgarrar, liberando sustancias que hacen las plaquetas

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mas adherentes y favoreciendo la formacion de trombos. En muchos casos, el trombo se disuelve por si solo, tipicamente en aproximadamente un dia. Sin embargo, en ese momento, ya se pueden haber producido algunos danos en el corazon.

La evaluacion de la historia clinica (antecedentes de enfermedad de las arterias coronarias (EAC)) es un criterio para el diagnostico de pacientes que presentan sintomas de SCA (p. ej., dolor toracico durante mas de 20 min). Estos pacientes tambien son diagnosticados mediante electrocardiograma (ECG) y ensayos de troponina. En los casos de un ECG inicialmente no diagnostico en el momento de la presentacion y de un resultado de ensayo de troponina que no cumple los criterios diagnosticos de infarto de miocardio sin elevacion de ST, este procedimiento se repite despues de 4 - 8 horas. En caso de que el ECG y la determinacion de troponina sigan sin cumplir los criterios diagnosticos de infarto de miocardio, el paciente es dado de alta con el diagnostico de exclusion de infarto de miocardio.

El electrocardiograma (ECG) proporciona informacion importante para el diagnostico. Particularmente, si el ECG muestra segmentos ST elevados, se diagnostica un infarto de miocardio con elevacion de ST (IMEST). Si el ECG no muestra segmentos ST elevados, se diagnostica un IM sin elevacion de ST (IMSEST) cuando se detecta troponina cardiaca en una muestra del paciente correspondiente. Se sospecha que los pacientes sin ECG de diagnostico y con un nivel de troponina cardiaca inferior a la cantidad que es indicativa de infarto de miocardio presentan angina de pecho inestable (API). La angina inestable y el IMSEST se consideran afecciones estrechamente relacionadas, que comparten una presentacion clinica similar. No obstante, difieren en su gravedad. El IMSEST se distingue de la angina inestable por la isquemia que causa dano miocardico irreversible que es detectable por medio de biomarcadores de necrosis miocardica (Morrow et al., loc. cit.). En todos los casos descritos, es decir, IMEST, IMSEST y API, el paciente se trata de acuerdo con el diagnostico.

En caso de que el ECG (electrocardiograma) muestre elevacion de ST, se diagnostica un infarto de miocardio con elevacion de ST y se considera al paciente para una evaluacion de la terapia de reperfusion. Si el ECG sigue siendo no-diagnostico, lo que incluye cambios en la onda ST o T en el ECG, un resultado de troponina T o I que sea diagnostico de infarto de miocardio sin elevacion de ST revela el diagnostico final. La mayoria de los pacientes con dolor toracico o signos y sintomas de sindrome coronario agudo presentan un ECG no diagnostico y un resultado de troponina que no cumplen los criterios de IMSEST de acuerdo con las recomendaciones actuales (The Joint European Society of Cardiology/American College of Cardiology Committee: Universal definition of myocardial infarction, European Heart Journal (2007), 28, 2525 - 2538). Estos pacientes pueden tener infarto de miocardio, pero frecuentemente se presentan dentro de las primeras 4 - 6 horas tras la aparicion de los signos/sintomas, es decir, antes de que el marcador de necrosis cardiaca especifico comience a liberarse del miocardio y circule en cantidades mayores en el suero o plasma. Otro grupo de pacientes puede tener dolor toracico completamente no relacionado con un trastorno cardiaco y, por lo tanto, no desarrollara cambios caracteristicos en el ECG ni necrosis cardiaca, como lo indican las cantidades mayores de troponina. Estos pacientes seran finalmente diagnosticados de dolor toracico no cardiaco. Un subgrupo de pacientes sometidos a ensayos con mioglobina (mioglobulina) y/o proteina cardiaca de union a acidos grasos (H-FABP) presentara evidencias de un infarto de miocardio diagnosticado posteriormente por aumento de troponina posiblemente asociado a cambios en el ECG.

Tal como se ha indicado, los esfuerzos actuales en pacientes con dolor toracico o que presentan sintomas se dirigen a la identificacion de infarto de miocardio o a su exclusion. Hasta el momento, el electrocardiograma y las troponinas han sido los puntos clave del diagnostico positivo de infarto de miocardio o de su exclusion.

La troponina es una proteina estructural del miocardio y se libera durante la necrosis o apoptosis del tejido miocardico. Ademas, las troponinas se consideran especificas del tejido miocardico y, por lo tanto, un aumento de los niveles de troponina en la circulacion se considera un indicador de infarto de miocardio. Desafortunadamente, los niveles de troponina aumentan solo 4 a 6 horas despues de que se haya producido un infarto de miocardio y, por lo tanto, dan lugar a un retardo diagnostico. Este retardo en el reconocimiento del infarto de miocardio puede provocar un retardo en el tratamiento, por ejemplo, por ICP y, en consecuencia, el miocardio se puede volver necrotico, algo que se podria haber evitado mediante una intervencion mas temprana.

Los intentos de superar este retardo en el reconocimiento del infarto de miocardio han incluido el uso de mioglobina o proteina cardiaca de union a acidos grasos. La proteina cardiaca de union a acidos grasos (H-FABP) es una proteina citoplasmatica de bajo peso molecular con abundante presencia en el miocardio. Se ha reconocido que el miocardio ya ha liberado la H-FABP cuando pierde su funcion, algo que sucede mucho antes de que se vuelva necrotico. Se ha demostrado claramente que niveles de H-FABP superiores a 5700 pg/ml son indicativos de un aumento futuro del nivel de troponina y de infarto de miocardio y se ha encontrado que un nivel de H-FABP por debajo de 2500 pg/ml no estaba asociado a IM, vease el documento WO 2008/145689.

De forma similar, la mioglobina representa otra molecula que entra en la circulacion poco despues de un infarto de miocardio. Se ha demostrado que una concentracion de mioglobina superior a 77 ng/ml es indicativa de un aumento futuro del nivel de troponina y, por tanto, de infarto de miocardio. Por el contrario, una concentracion de mioglobina por debajo de 55 ng/ml hace improbable el desarrollo de un futuro aumento del nivel de troponina y, por tanto, del infarto, vease el documento WO 2009/033831.

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En consecuencia, la determinacion del nivel de mioglobina y/o H-FABP en suero o plasma es util para compensar parte de las limitaciones de la determinacion de troponina, es decir, la aparicion tardia de las troponinas en la circulacion (despues de 4 - 6 horas), y representa una ayuda para un diagnostico precoz de IM y, por lo tanto, permite la intervencion si la mioglobina o la proteina cardiaca de union a acidos grasos predicen el desarrollo de troponina.

Ademas, el documento US 2007/218498 divulga procedimientos para evaluar pacientes que sufren de sindrome coronario agudo basandose en la determinacion del nivel de FLT-1 soluble solo o en combinacion con uno o mas marcadores tales como mioglobina, troponina I/T, H-FABP y ANP. Tambien se mencionan procedimientos para diagnosticar una afeccion cardiovascular o para asignar un riesgo pronostico de uno o mas resultados clinicos futuros.

El documento US 2009/155827 ensena procedimientos para diagnosticar diferentes enfermedades tales como enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad cerebrovascular y el sindrome coronario agudo incluyendo infarto de miocardio, basandose en la determinacion de FLT-1 soluble y PlGF. Los procedimientos engloban tambien la determinacion de marcadores adicionales tales como mioglobina, peptidos natriureticos (por ejemplo, ANP), H-FABP y troponina.

El documento WO 2008/074781 ensena un procedimiento para diagnosticar el estado angiogenico de un sujeto que sufre enfermedad cardiaca coronaria basandose en la determinacion de las cantidades de PlGF, endoglobina y FLT- 1 soluble. El proposito de dicho procedimiento es, por ejemplo, seleccionar una terapia adecuada y decidir si se pueden evitar intervenciones cardiacas complicadas tales como la implantacion de endoprotesis vasculares y la cirugia de derivacion.

Los pacientes que presentan dolor toracico o sintomas de sindrome coronario agudo son regularmente dados de alta si los sintomas remiten y si no cumplen con los criterios de IM. Dichos pacientes pueden, sin embargo, presentar todavia mayor riesgo de infarto de miocardio, tal como se demostro recientemente mediante registros continuos de ECG (Tvivoni et al. J. Am Coll Cardiol 53, 2009, 1422 - 24, Scirica Am Coll Cardiol 53, 2009, 1411 - 1421). En este estudio, una depresion de ST de tan solo 1 minuto y tan solo 1/2 mm indico isquemia temporal y un resultado pobre. Este procedimiento, sin embargo, no es facilmente aplicable y requiere tecnologia asistida por ordenador y solo se puede hacer de forma prospectiva. Esto subraya la importancia del reconocimiento de la isquemia, un episodio que precede a la necrosis y a las anomalias miocardicas metabolicas.

Resumiendo lo anterior, existe una necesidad urgente de un procedimiento para identificar la isquemia en pacientes con dolor toracico o signos o sintomas de sindrome coronario agudo, para determinar el grado de isquemia, su duracion, asi como anomalias funcionales asociadas a la isquemia. Estos procedimientos tambien deben permitir la exclusion de la isquemia y la clasificacion posterior de los pacientes que presentan dolor toracico o sintomas de sindrome coronario agudo, con el fin de proporcionar un mejor diagnostico y un mejor tratamiento terapeutico.

Por lo tanto, existe una clara necesidad de medios y procedimientos diagnosticos y pronosticos que permitan un diagnostico fiable y rapido de la isquemia en un sujeto que muestra signos y sintomas de un sindrome coronario agudo y que tiene una cantidad de una troponina cardiaca inferior al nivel indicativo de un infarto de miocardio. Preferentemente, el individuo tambien tendra un ECG no-diagnostico, preferentemente un ECG que no muestra elevacion de ST. Los medios y procedimientos deben permitir un diagnostico no solo de la isquemia, sino tambien permitir una valoracion del grado de isquemia y sus cambios, y ayudar en la discriminacion de las causas cardiacas y no cardiacas del dolor toracico. Ademas, el procedimiento debe ayudar a identificar un subgrupo de pacientes con dolor toracico cardiaco que muestren niveles de otros biomarcadores cardiacos como troponina, pero tambien, en su caso, mioglobina o H-FABP por debajo de la cantidad de referencia diagnostica caracteristica de la isquemia. Ademas, sera posible una cuantificacion de la isquemia en el caso de periodos de isquemia duradera o continua y en el caso de episodios isquemicos recurrentes. El procedimiento y los medios deben permitir ademas identificar un sujeto que sea susceptible de intervencion cardiaca, para decidir si una intervencion cardiaca es apropiada para el sujeto y, en caso afirmativo, que terapia hay que escoger. El procedimiento y los medios deben evitar al menos algunos de los inconvenientes de las tecnicas actuales, tal como se han expuesto con anterioridad.

Por lo tanto, el problema tecnico subyacente a la presente invencion debe interpretarse como la provision de medios y procedimientos para satisfacer las necesidades anteriormente mencionadas.

El problema tecnico se resuelve mediante los modos de realizacion caracterizados en las reivindicaciones y en el presente documento.

La presente invencion proporciona un procedimiento para diagnosticar un estado isquemico de un sujeto que muestra signos y sintomas de sindrome coronario agudo pero que no cumple los criterios diagnosticos de un infarto de miocardio, por tener una cantidad de troponina T determinada en una muestra del sujeto menor de 0,1 ng/ml, que comprende

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(a) determinar la cantidad de tirosina quinasa-1 similar a fms soluble (sFLT-1) o una variante de la misma en una muestra de dicho sujeto,

(b) comparar la cantidad de sFLT-1 o una variante de la misma determinada en la etapa a) con al menos una cantidad de referencia, y

(c) diagnosticar el estado isquemico basandose en la informacion obtenida en la etapa b) y preferentemente basandose en la informacion obtenida en a) y b), en el que una cantidad de sFLT-1 por debajo de la cantidad de referencia es indicativa de un estado no isquemico no asociado a o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible, y una cantidad de sFLT-1 igual o mayor que la cantidad de referencia es indicativa de un estado isquemico asociado a o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible.

La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para monitorizar el estado isquemico de un sujeto que muestra signos y sintomas de sindrome coronario agudo pero que no cumple los criterios diagnosticos de un infarto de miocardio, por tener una cantidad de troponina T determinada en una muestra del sujeto menor de 0,1 ng/ml, que comprende las etapas de

(a) determinar las cantidades de tirosina quinasa-1 similar a fms soluble (sFLT-1) o una variante de la misma en una muestra de dicho sujeto en al menos en dos momentos temporales diferentes, y

(b) comparar las cantidades de sFLT-1 o una variante de la misma determinada de la etapa a) con al menos una cantidad de referencia, y

(c) diagnosticar el estado isquemico en al menos en dos momentos temporales diferentes, basandose en la informacion obtenida en la etapa b) y preferentemente basandose en la informacion obtenida en a) y b) para monitorizar el estado isquemico, en el que una cantidad de sFLT-1 por debajo de la cantidad de referencia es indicativa de un estado no isquemico no asociado a o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible, y una cantidad de sFLT-1 igual o mayor que la cantidad de referencia es indicativa de un estado isquemico asociado a o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible.

En un modo de realizacion de los procedimientos anteriormente mencionados de la presente invencion, se determina ademas la cantidad de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) o una variante del mismo en una etapa aa) adicional en una muestra de dicho sujeto y se compara con al menos una cantidad de referencia para HGF en la etapa bb). Por consiguiente, en la etapa c), el estado isquemico se diagnostica basandose en las cantidades determinadas de sFLT-1 o una variante de la misma y de hGf o una variante del mismo y en la comparacion de la cantidad de sFLT-1 con al menos una cantidad de referencia para sFLT-1 y la comparacion de la cantidad de HGF con al menos una cantidad de referencia para HGF. Preferentemente, primero se determina la cantidad de sFLT-1 y despues la cantidad de HGF, sin embargo, tambien se contempla que las cantidades de sFLT-1 y HGF se determinen en cualquier orden, es decir, simultaneamente, o primero sFLT-1 y luego HGF, o primero HGf y luego sFLT-1.

El estado isquemico del individuo se determina despues de la determinacion de troponina, determinando las cantidades de sFLT-1 y/o HGF u, opcionalmente, del marcador adicional. Por consiguiente, la cantidad de troponina cardiaca se determina antes de la determinacion de sFLT-1 y/o HGF; y la cantidad de sFLT-1 y/o HGF solo se

determinara en el caso de que la cantidad de troponina sea inferior a la cantidad que se reconoce generalmente en

la tecnica como indicativa de un infarto de miocardio (IM), en particular de un IMSEST. La cantidad de troponina cardiaca puede incluso ser cero, es decir, no detectable con los ensayos actualmente disponibles.

En otro modo de realizacion preferido, un ECG del sujeto respectivo se determina simultaneamente a la determinacion de sFLT-1 y/o a la determinacion de HGF; la medicion de ECG tambien puede preceder a la

determinacion de sFLT-1 y/o a la determinacion de HGF. El estado isquemico del individuo, por lo tanto, se

determina preferentemente de forma simultanea o despues de la medicion de ECG, determinando las cantidades de sFLT-1 y, opcionalmente, de HGF. Por consiguiente, si la medicion de ECG se lleva a cabo antes de la determinacion de sFLT-1 y/o HGF, la determinacion de las cantidades de sFLT-1 y/o HGF se puede aplazar hasta que se registre el ECG. Preferentemente, la cantidad de sFLT-1 y/o HGF solo se determinara en el caso de que el ECG del sujeto no muestre una elevacion de ST. Preferentemente, en el caso de que ECG muestre una elevacion de ST, se considerara que el sujeto ha sufrido un IMEST, lo que significa que en general los procedimientos de la presente invencion- dirigidos al diagnostico de un estado isquemico anterior al IM - no se llevaran a cabo.

En el contexto de lo anterior, ademas, la determinacion de las cantidades de una troponina cardiaca y/o la medicion de ECG se pueden llevar a cabo simultanea o secuencialmente, incluyendo la determinacion de sFLT-1 y/o HGF como se ha expuesto con anterioridad.

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La evaluacion de la historia clinica (antecedentes de enfermedad arterial coronaria (EAC)) es un criterio para el diagnostico de pacientes que presentan sintomas de SCA (p. ej., dolor toracico durante mas de 20 min). Estos pacientes se diagnostican ademas para saber si cumplen otros criterios, concretamente mediante el uso de electrocardiograma (ECG), por un lado, y de ensayos de troponina, por otro lado. En los casos de un ECG que no cumple los criterios diagnosticos de infarto de miocardio sin elevacion de ST en el momento de la presentacion y de un resultado en el ensayo de troponina que no cumple los criterios diagnosticos de infarto de miocardio, este procedimiento se repite despues de 4 - 8 horas. En caso de que el ECG y la determinacion de troponina sigan sin cumplir los criterios diagnosticos de infarto de miocardio, el paciente es dado de alta con el diagnostico de exclusion de infarto de miocardio. Los ultimos criterios para el diagnostico del infarto de miocardio (IM) han sido descritos por el Grupo de Trabajo Conjunto ESC/ACCF/AHA/WHF para la Redefinicion del Infarto de Miocardio (The Joint European Society of Cardiology / American College of Cardiology Committee: Universal definition of myocardial infarction, loc. cit.).

El procedimiento de la presente invencion es un procedimiento in vitro. Ademas, puede comprender etapas adicionales de las mencionadas explicitamente con anterioridad. Por ejemplo, otras etapas pueden estar relacionadas con pretratamientos de muestras o evaluacion de los resultados obtenidos por el procedimiento. El procedimiento de la presente invencion se puede usar tambien para monitorizacion, confirmacion y subclasificacion de un diagnostico. El procedimiento se puede llevar a cabo manualmente o asistido por automatizacion. Preferentemente, la etapa (a), (b) y/o (c) pueden estar total o parcialmente asistidas por automatizacion, por ejemplo, mediante un equipo robotico y sensorial adecuado para la determinacion en la etapa (a) o para una comparacion implementada por ordenador en la etapa (b).

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion "signos y sintomas de sindrome coronario agudo" se refiere, por una parte, a aquellos signos que pueden indicar SCA, pero que tambien que pueden aparecer en enfermedades distintas de SCA. Por consiguiente, esta expresion incluye aquellos signos que no se pueden relacionar inequivocamente con la existencia de SCA, pero que indican una probabilidad de existencia de SCA tal que es obligatorio un examen adicional para confirmacion (confirmar/descartar). Un ejemplo del citado signo es el dolor toracico. Por supuesto, el dolor toracico tambien puede provenir de trastornos vasculares tales como embolia pulmonar, diseccion aortica o hipertension pulmonar o enfermedades pulmonares tales como pleuritis, neumonia, traqueobronquitis y neumotorax espontaneo; enfermedades gastrointestinales tales como reflujo esofagico, ulcera peptica, enfermedad de la vesicula biliar y pancreatitis, causas musculoesqueleticas de dolor agudo incluyen costocondritis, enfermedad de disco cervical, traumatismo o distension. El herpes zoster tambien causa dolor toracico agudo. Estas formas de dolor toracico se refieren a menudo como "dolor toracico no cardiaco". Por otra parte, la expresion se refiere a dolor toracico agudo de origen cardiaco que da lugar a sintomas como presion toracica retroesternal o quemazon o pesadez que se propaga ocasionalmente al cuello, mandibula, epigastrio, hombros o brazo izquierdo. La gravedad del dolor toracico agudo aumenta con frecuencia desde la angina a la angina inestable e infarto de miocardio. Las causas desencadenantes incluyen estres fisico y emocional o el frio. La gravedad tambien se asocia a la duracion del dolor toracico que varia desde menos de 2 minutos en la angina a mas de 30 minutos en el infarto de miocardio. Aunque estos sintomas son bastante caracteristicos de casos graves, los casos leves de dolor toracico cardiaco pueden ser dificiles de separar de las causas no cardiacas. Otros sintomas conocidos de SCA son molestias o dolor epigastrico, en el brazo, muneca o mandibula, nauseas o vomitos inexplicables, dificultad respiratoria persistente, debilidad, mareos, aturdimiento o sincope, asi como cualquier combinacion de los mismos.

Sin embargo, en muchos casos los sintomas citados anteriormente no parecen suficientemente especificos como para permitir un diagnostico seguro y correcto (o para evitar un falso diagnostico) de SCA. Por ejemplo, es posible que el dolor toracico no se pueda localizar de forma inequivoca. Otro grupo de pacientes puede tener dolor toracico no relacionado en absoluto con un trastorno cardiaco y, por lo tanto, no desarrollar cambios caracteristicos en ECG ni necrosis cardiaca, como lo indican las cantidades mayores de troponina. Estos pacientes seran finalmente diagnosticados de dolor toracico no cardiaco. Un cardiologo puede ser capaz de confirmar o descartar la existencia de SCA basandose en la identificacion de sintomas tipicos de SCA y haciendo caso omiso de aquellos sintomas que no son tipicos de SCA. Sin embargo, este procedimiento es propenso a errores, y la cardiologia moderna requiere la determinacion de troponinas cardiacas y de ECG, ademas de la interpretacion de los sintomas del individuo respectivo (y la evaluacion de la historia clinica). Por lo tanto, el procedimiento de la presente invencion incluye aquellos individuos que tienen signos y sintomas de SCA, en particular dolor toracico, en los que los signos/sintomas, en particular dolor toracico, no permiten un diagnostico inequivoco de SCA debido a que posiblemente esten relacionados con SCA, pero posiblemente tambien esten relacionados con trastornos distintos de SCA; sin embargo, los sintomas, en particular el dolor toracico, requieren un diagnostico/evaluacion adicional de las enfermedades subyacentes, con el fin de confirmar o descartar el SCA. En su caso, tambien es posible que el individuo al que se aplica el procedimiento de la presente invencion muestre sintomas que sean inequivocos de SCA, por ejemplo, un fuerte dolor toracico que se propaga al brazo o al hombro.

El termino "diagnosticar", tal como se usa en el presente documento, significa valorar, identificar, evaluar o clasificar el estado isquemico de un sujeto que muestra los signos y sintomas de sindrome coronario agudo y que tiene una cantidad de una troponina cardiaca inferior a la cantidad que es indicativa de un IM, en particular si el sujeto sufre un estado isquemico que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o a una lesion cardiaca no reversible. El termino

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"diagnostical"" tambien se refiere a distinguir, en sujetos que muestran los signos y sintomas de sindrome coronario agudo y preferentemente tienen una cantidad de troponina cardiaca inferior a la cantidad que es indicativa de un IM, entre un sujeto fisiologicamente sano y un sujeto que sufre isquemia que, segun el caso, conducira a una disfuncion cardiaca reversible o a una lesion cardiaca no reversible.

El diagnostico y los criterios aplicados para el diagnostico de SCA son generalmente conocidos en la tecnica e incluyen, entre otros, la evaluacion de la historia clinica (antecedentes de enfermedad arterial coronaria (EAC)) y dolor toracico durante mas de 20 min.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion "un sujeto que muestra signos y sintomas de sindrome coronario agudo pero que no cumple los criterios diagnosticos de un infarto de miocardio" abarca un sujeto que muestra signos y sintomas de sindrome coronario agudo que pueden o no estar asociados a la existencia o diagnostico de un infarto de miocardio, siempre y cuando los signos y sintomas mostrados no sean suficientes para diagnosticar el infarto de miocardio sin dejar dudas sobre el resultado diagnostico. Los criterios para el diagnostico del infarto de miocardio han sido descritos por el Grupo de Trabajo Conjunto ESC/ACCF/AHA/WHF para la Redefinicion del Infarto de Miocardio (The Joint European Society of Cardiology / American College of Cardiology Committee: Universal definition of myocardial infarction, loc. cit.), que ya se han resumido con caracter previo.

Se determinar la cantidad de troponina cardiaca y el sujeto muestra una cantidad de una troponina cardiaca inferior a la cantidad que es indicativa de un infarto de miocardio. Alternativamente, se registra un electrocardiograma (ECG) del sujeto y el ECG no cumple con los criterios de infarto de miocardio, preferentemente el paciente no cumple los criterios de IM sin elevacion de ST. Aun mas preferentemente, se determina el nivel de una troponina cardiaca y se registra un ECG y estos dos parametros no cumplen los criterios de infarto de miocardio, es decir, la cantidad determinada de troponina es menor que la cantidad que es indicativa de un infarto de miocardio y/o el ECG. En los casos de un ECG que no cumple los criterios de infarto de miocardio en el momento de la presentacion y de un resultado en el ensayo de troponina que no cumple los criterios diagnosticos de infarto de miocardio (sin elevacion de ST), preferentemente este procedimiento se repite, preferentemente despues de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 horas. En caso de que el ECG y la determinacion de troponina sigan sin cumplir los criterios diagnosticos de infarto de miocardio, el paciente puede ser dado de alta con el diagnostico de exclusion de infarto de miocardio.

El termino "isquemia" o la expresion "estado isquemico", tal como se usan en el presente documento, se refieren al estado de un suministro reducido de sangre no suficiente para las necesidades metabolicas, en particular no suficiente para el suministro de oxigeno al tejido afectado. La isquemia se puede asociar a, conducir a o causar una alteracion de la funcion miocardica dependiendo del alcance del miocardio isquemico y la duracion de la isquemia. La funcion miocardica se normaliza rapidamente despues de un unico episodio de isquemia que dure menos de 2 minutos. A medida que aumenta la duracion y/o gravedad de la isquemia, se produce un retraso temporal en la recuperacion de la funcion, a pesar de que el flujo sanguineo se haya restablecido. Una oclusion de un vaso de 15 minutos tiene como resultado, por ejemplo, una funcion miocardica alterada de 6 h, aunque se restablezca el flujo sanguineo. Este episodio reversible no esta asociado a la necrosis miocardica, preferentemente el termino "isquemia" o la expresion "estado isquemico" abarcan una disfuncion cardiaca reversible y lesion cardiaca no reversible, asi como un proceso que conduce a, esta asociado a o causa una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible. El termino "isquemia" o la expresion "estado isquemico" tambien abarcan una lesion cardiaca que esta asociada a, conduce a o causa un infarto de miocardio.

La expresion "disfuncion cardiaca reversible" se refiere a una capacidad o actividad de bombeo deteriorada del corazon, que es completamente reversible y que preferentemente se produce sin dejar ningun deterioro estructural significativo en el corazon, incluyendo necrosis de un numero significativo de cardiomiocitos. Preferentemente, la capacidad o actividad de bombeo deteriorada no causa ninguna lesion significativa al cuerpo del sujeto. Una disfuncion cardiaca reversible puede ser inmediatamente reversible, es decir, en unos pocos segundos o minutos, como en los casos de periodos isquemicos muy cortos. Otros ejemplos de disfunciones cardiacas reversibles incluyen el aturdimiento cardiaco. En estos casos, la reversibilidad se puede demorar durante horas o dias.

Si una proporcion significativa del miocardio es isquemico, esto puede tener como resultado un estiramiento de las paredes y el rapido aumento de los niveles de peptidos natriureticos.

En otro modo de realizacion preferido de la presente invencion, se determina la cantidad de un peptido natriuretico, es decir, un peptido de tipo BNP del grupo BNP y NT-proBNP o un peptido de tipo ANP del grupo ANP y NT- proANP. Preferentemente, se determina un peptido de tipo ANP, aun mas preferentemente NT-proANP, con el fin de diagnosticar un posible deterioro de la circulacion del sujeto.

En consecuencia, aunque no esta causalmente relacionada con la isquemia, un aumento de las cantidades de los peptidos natriureticos de tipo ANP con respecto a una cantidad de referencia indica un estado isquemico en ciertas regiones del miocardio, lo que conduce a una mayor necesidad de bombeo para el miocardio no isquemico y, en consecuencia, a un deterioro de la circulacion.

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En la presente invencion, se prefiere la determinacion de peptidos natriureticos de tipo ANP, preferentemente NT- proANP, sobre la determinacion de peptidos natriureticos de tipo BNP, como NT-proBNP. Esto es una consecuencia de la rapida liberacion de peptidos de tipo ANP. Despues de un aumento de la presion cardiaca y volumen cardiaco (estiramiento de las paredes), la cantidad de NT-proANP aumenta en un periodo de tiempo de 15 a 60 minutos, lo que permite un diagnostico rapido de una disfuncion circulatoria. Esto es obligatorio en el contexto de la presente invencion, con el fin de poder iniciar tratamientos que permitan salvar el miocardio afectado por isquemia, pero que aun no es necrotico.

Por el contrario, los peptidos natriureticos de tipo BNP, en particular NT-proBNP solo aumentan en un periodo de tiempo de 4 a 6 horas despues de un aumento de la presion cardiaca y del volumen cardiaco (estiramiento de las paredes), que en muchos casos no es suficiente para el proposito de la presente invencion.

En la presente invencion se supone que el deterioro de la circulacion esta asociado a o causado por la formacion de regiones isquemicas en el miocardio que han conservado su metabolismo o por regiones de miocardio aturdidas (que tienen un metabolismo y bombeo reducidos con un rendimiento inferior al del miocardio completamente funcional, sin exceder el rendimiento de bombeo a largo plazo del miocardio aturdido). Como consecuencia de la reducida capacidad o actividad de bombeo del miocardio isquemico y/o aturdido, el miocardio restante no afectado tiene que garantizar las necesidades de suministro de sangre del cuerpo y puede tener que aumentar su rendimiento.

En un modo de realizacion preferido de la presente invencion, los sujetos que tienen miocardio aturdido y/o que han sufrido un IMEST se pueden descartar determinando la cantidad de H-FABP y/o mioglobina. En general, este modo de realizacion comprende la determinacion de H-FABP y/o mioglobina, despues de determinar una troponina cardiaca y/o registrar un ECG, y antes de determinar las cantidades de sFLT-1 y, opcionalmente, de HGF en las etapas a) y b) del procedimiento de la presente invencion, con el fin de determinar si el sujeto ha sufrido un infarto de miocardio, en particular un IMSEST.

En un miocardio aturdido, la funcion miocardica se reduce en reposo pero los miocitos siguen siendo viables. La disfuncion de VI puede ser reversible en caso de aturdimiento. El miocardio aturdido se observa mas comunmente despues de un periodo transitorio de isquemia seguido por reperfusion (funcion reducida en reposo pero preservada en cuanto a perfusion). Los episodios isquemicos pueden ser individuales o multiples, breves o prolongados, pero nunca lo suficientemente graves como para provocar lesiones.

La expresion "lesion cardiaca no reversible" se conoce generalmente en el campo y se refiere preferentemente a una lesion cardiaca asociada a muerte celular, preferentemente necrosis de cardiomiocitos, por ejemplo, mediante un proceso necrotico.

Una cantidad de H-FABP y/o mioglobina en una muestra de un sujeto, tal como se define en la presente invencion, que es mayor que la cantidad de referencia para confirmar la existencia de IM es indicativa de la existencia reciente de IM en dicho sujeto. Una cantidad de mioglobina y, opcionalmente, H-FABP en un sujeto, tal como se define en la presente invencion, que es inferior a la cantidad de referencia para descartar la existencia de IM sera un indicador de que no se ha producido recientemente un IM; en este ultimo caso, el sujeto podria sufrir una API. Se debe entender en el contexto de la presente invencion que los sujetos, tal como se definen en la presente invencion, cuya cantidad de mioglobina se encuentre entre los valores de referencia mencionados anteriormente (la cantidad de referencia para confirmar la existencia reciente de IM y la cantidad de referencia para descartar la existencia reciente de IM) pueden requerir un nuevo diagnostico. Preferentemente, esto tambien se puede hacer en sujetos para los que se determinan tanto la cantidad de mioglobina como de H-FABP, en los que ambas cantidades no se corresponden, por ejemplo, una cantidad es mayor (o menor) que la respectiva cantidad de referencia, mientras que la otra cantidad no es mayor (o menor) que la respectiva cantidad de referencia . Particularmente, una cantidad de mioglobina en un sujeto, tal como se define en la presente invencion, superior a aproximadamente 77 ng/ml indica una existencia reciente de IM (confirmacion), mientras que una cantidad inferior a aproximadamente 55 ng/ml indica que no se ha producido recientemente un IM (descarte). Ademas, la sensibilidad y especificidad del diagnostico basado en la determinacion de mioglobina en una muestra de un sujeto, tal como se define en la presente invencion, es aun mayor cuando, ademas de la cantidad de mioglobina, se determina la cantidad de H-FABP en una muestra de dicho sujeto y se compara con al menos una cantidad de referencia para H-FABP. Particularmente, una cantidad de H-FABP en un sujeto, tal como se define en la presente invencion, superior a aproximadamente 5700 pg/ml indica una existencia reciente de IM (confirmacion), mientras que una cantidad inferior a aproximadamente 2500 pg/ml indica que no se ha producido recientemente un IM (descarte).

La expresion "diagnosticar una deficiencia circulatoria" se refiere a valorar si se ha producido o no deficiencia circulatoria en un sujeto, tal como se define en la presente invencion, es decir un sujeto que no sufre SCA y que tiene una cantidad de peptidos de tipo ANP, preferentemente NT-proANP, mayor que la cantidad que se considera indicativa de un sujeto sano. La expresion "deficiencia circulatoria" se refiere a la capacidad o actividad disminuida del corazon (miocardio) o de una region del mismo, para bombear a traves de la circulacion la cantidad de sangre que se requiere para garantizar un suministro de sangre al tejido suficiente para satisfacer las necesidades metabolicas. Con el fin de compensar la capacidad disminuida, el miocardio tiene que aumentar su rendimiento, lo

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que tiene como resultado un mayor estres en las paredes (y la liberacion de NT-proANP). Por ejemplo, una determinada region del miocardio se ve afectada por isquemia, lo que tiene como resultado una capacidad de bombeo deteriorada de la region afectada. Para garantizar un suministro de sangre suficiente, se aumenta el rendimiento de bombeo, en particular de aquellas regiones del miocardio que no han resultado afectadas y que han mantenido su capacidad de bombeo completa. Sin embargo, este aumento del rendimiento estimula la expresion de NT-proANP.

Con el fin de compensar la falta de suministro de sangre, el corazon tiene que trabajar mas duro de lo habitual, lo que tiene como resultado, en general, un aumento del estres sobre las paredes del corazon (ya que el corazon tiene que aumentar su capacidad de bombeo). Dicha deficiencia no es perjudicial siempre que la causa subyacente se elimine antes de que se produzca una lesion cardiaca irreversible. Existen varias razones para la deficiencia circulatoria.

El termino "sujeto", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a animales, preferentemente mamiferos, y mas preferentemente seres humanos.

El termino "simultaneamente", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la realizacion de una actividad, preferentemente la determinacion de un marcador usado en el contexto de la presente invencion, en el mismo momento temporal Esto incluye preferentemente mediciones en las que la determinacion de un marcador se retrasa ligeramente con respecto a la determinacion de otro marcador, por ejemplo, durante segundos o unos pocos minutos, por ejemplo 1 minuto, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 minutos. Es esencial que la determinacion del ultimo marcador no se retrase tanto que sus cantidades puedan cambiar en un grado tal que resulte un diagnostico diferente. "Determinar un marcador" se refiere a la toma de la muestra de fluido corporal en la que se determina la cantidad del marcador, o a la determinacion y percepcion de la cantidad de marcador, o ambas cosas.

La expresion "determinar (la cantidad de un marcador) en al menos en dos momentos temporales diferentes", tal como se utiliza en el presente documento, pretende abarcar la determinacion de la cantidad de marcador en intervalos, en el que la segunda muestra y cada muestra posterior se tomaran en un intervalo que garantice una monitorizacion eficaz del estado isquemico. En general, el intervalo entre cada muestra es de aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 90 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3, 4, 5 o 6 horas. Por ejemplo, la muestra inicial se toma aproximadamente 1 hora despues de la aparicion de los sintomas de sindrome coronario agudo o inmediatamente despues de la presentacion del sujeto ante el medico, y cada muestra adicional se toma aproximadamente 1 hora despues de las muestras iniciales. El numero de muestras tomadas dependera de la evaluacion de la isquemia.

La expresion "sindrome coronario agudo" (SCA) y los criterios para diagnosticar SCA se conocen y entienden por parte del experto en la tecnica. La expresion se refiere a una gran variedad de sintomas clinicos causados por isquemia miocardica aguda. La propia isquemia resulta de la perturbacion de una placa aterosclerotica en una arteria coronaria. Se sabe en la tecnica que SCA puede ir acompanado de sintomas tales como molestias o dolor epigastrico, en el brazo, muneca o mandibula, en particular dolor toracico, en la cual, en particular, el dolor toracico dura mas de 20 minutos y se puede propagar al brazo, espalda u hombro. Otros sintomas de un episodio cardiovascular agudo pueden ser nauseas o vomitos inexplicables, dificultad para respirar, debilidad, mareos, aturdimiento, sudoracion o sincope, asi como cualquier combinacion de los mismos. Generalmente, estos sintomas clinicos, especialmente dolor toracico, ocurren repentinamente; pueden aparecer en reposo o despues de un esfuerzo minimo. Ademas, en el contexto de la presente invencion, la expresion "sindrome coronario agudo" tambien puede estar relacionada con SCA sospechado, asumido o posible, ya que estas expresiones se usan frecuentemente para pacientes que presentan signos y sintomas propios de SCA y en los que el diagnostico no se ha establecido de forma concluyente (vease Morrow, loc. cit.). Los pacientes con SCA pueden mostrar angina de pecho inestable (API) o estos individuos pueden sufrir un infarto de miocardio (IM). El IM puede ser un infarto de miocardio con elevacion de ST (IMEST) o un infarto de miocardio sin elevacion de ST (IMSEST). El IM se clasifica como perteneciente a enfermedades cardiacas coronarias (ECC) y esta precedido por otros episodios clasificados tambien como pertenecientes a ECC, como la angina de pecho inestable (API). Sintomatico de la API es el dolor toracico que se alivia por la administracion sublingual de nitroglicerina. La API esta provocada por una oclusion parcial de los vasos coronarios que conduce a hipoxemia e isquemia miocardica. En caso de que la oclusion sea demasiado grave o total, se produce necrosis miocardica irreversible (que es el estado patologico subyacente al infarto de miocardio). Generalmente, el IMEST se diagnostica por electrocardiografia, en caso de que el electrocardiograma (ECG) muestre elevacion del segmento ST. La determinacion de la cantidad de troponina cardiaca al menos seis horas despues de la aparicion de los sintomas de SCA permite diferenciar API e IMSEST. Si la cantidad de troponina es elevada (indicando dano miocardico), se asume un IMSEST. El IM puede ocurrir sin sintomas evidentes, es decir, el sujeto no muestra ninguna molestia, y el IM no esta precedido de angina de pecho estable o inestable. La existencia de un IM puede ir seguida de una disfuncion ventricular izquierda (DVI).

La expresion "troponina cardiaca" se refiere a todas las isoformas de troponinas expresadas en celulas del corazon y, preferentemente, a las celulas subendocardicas. Estas isoformas estan bien caracterizadas en la tecnica como se describe, por ejemplo, en Anderson 1995, Circulation Research, vol. 76, n.° 4: 681-686 y Ferrieres 1998, Clinical

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Chemistry, 44: 487-493. Preferentemente, troponina cardiaca se refiere a troponina T y/o a troponina I y, lo mas preferentemente, a troponina T. Se debe entender que las isoformas de troponinas se pueden determinar en el procedimiento de la presente invencion de manera conjunta, es decir, simultanea o secuencialmente, o de forma individual, es decir, sin determinar la otra isoforma en absoluto. Las secuencias de aminoacidos para la troponina T humana y la troponina I humana se divulgan en Anderson, loc. cit. y Ferrieres 1998, Clinical Chemistry, 44: 487-493.

La expresion "troponina cardiaca" abarca tambien variantes de las troponinas especificas mencionadas anteriormente, es decir, preferentemente, troponina I y mas preferentemente, troponina T. Dichas variantes tienen al menos las mismas propiedades biologicas e inmunologicas esenciales que las troponinas cardiacas especificas. En particular, comparten las mismas propiedades biologicas e inmunologicas esenciales si se pueden detectar en los mismos ensayos especificos a los que se hace referencia en la presente memoria descriptiva, por ejemplo, mediante ensayos ELISA que utilizan anticuerpos policlonales o monoclonales que reconocen especificamente dichas troponinas cardiacas. Ademas, se debe entender que una variante, tal como se hace referencia de acuerdo con la presente invencion, debera tener una secuencia de aminoacidos que difiera debido a al menos una sustitucion, eliminacion y/o adicion de aminoacidos, en la que la secuencia de aminoacidos de la variante sigue siendo al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos

aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos

aproximadamente un 92 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos

aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % identica a la secuencia amino de la troponina

especifica, preferentemente sobre toda la longitud de la troponina especifica. Las variantes pueden ser variantes alelicas o cualquier otro homologo, paralogo u ortologo especifico de la especie. Ademas, las variantes a las que se hace referencia en el presente documento incluyen fragmentos de las troponinas cardiacas especificas o los tipos de variantes antes mencionados, siempre que estos fragmentos tengan las propiedades inmunologicas y biologicas esenciales como se ha mencionado con anterioridad. Preferentemente, las variantes de troponina cardiaca tienen propiedades inmunologicas (es decir, composicion de epitopos) comparables a las de la troponina T o troponina I humana. De este modo, las variantes seran reconocibles por los medios o ligandos antes mencionados usados para la determinacion de la cantidad de las troponinas cardiacas. Dichos fragmentos pueden ser, por ejemplo, productos de degradacion de las troponinas. Se incluyen ademas variantes que difieren debido a modificaciones pos- traduccionales tales como fosforilacion o miristilacion. Preferentemente, la propiedad biologica de la troponina I y su variante es la capacidad para inhibir la actomiosina ATPasa o para inhibir la angiogenesis in vivo e in vitro, que puede por ejemplo detectarse en base al ensayo descrito por Moses et al. 1999 PNAS USA 96 (6): 2645-2650). Preferentemente, la propiedad biologica de la troponina T y su variante es la capacidad para formar un complejo con troponina C e I, para unirse a iones calcio o para unirse a tropomiosina, preferentemente si esta presente como un complejo de troponina C, I y T o un complejo formado por troponina C, troponina I y una variante de troponina T.

La expresion "cantidad de troponina cardiaca", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la concentracion de una troponina cardiaca, preferentemente de TnT. Preferentemente, la expresion se refiere a la concentracion de una troponina cardiaca en una muestra de plasma o suero de un sujeto. La expresion "cantidad de troponina cardiaca inferior a la cantidad que es indicativa de infarto de miocardio" se puede referir a cualquier cantidad de troponina cardiaca a partir de, e incluyendo, cero y que sea detectable por medios y procedimientos conocidos de la tecnica, por ejemplo, mediante ensayos de troponina cardiaca comercialmente disponibles. Preferentemente, la "cantidad de troponina cardiaca que sea detectable" se refiere a una concentracion que es igual a o mayor que el limite de deteccion mas bajo del ensayo utilizado para determinar la cantidad de troponina. Preferentemente, la cantidad de troponina que sea detectable se puede referir como cualquier concentracion que sea igual o mayor que 0,001 ng/ml, 0,002 ng/ml, 0,005 ng/ml, 0,0075 ng/ml o 0,01 ng/ml. Mas preferentemente, la cantidad de troponina cardiaca que sea detectable se refiere a cualquier concentracion que sea igual o mayor que 0,002 ng/ml. La expresion "cantidad de troponina que es indicativa de infarto de miocardio" se refiere a una concentracion de troponina comunmente aceptada que indica un infarto de miocardio.

La troponina T se sometio al ensayo de troponina T de alta sensibilidad utilizando el analizador ELECSYS 2010 (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). El ensayo se realizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ensayo tiene un intervalo de medicion de 3 - 10 000 ng/ml o pg/ml. Se encontro que la precision del ensayo estaba entre 0,8 y 2,6 por ciento, dependiendo de la concentracion de troponina en la muestra.

Preferentemente, la cantidad del biomarcador determinado en la muestra, preferentemente la cantidad de troponina cardiaca, considerada como indicativa de infarto de miocardio, se refiere a una concentracion que esta por encima de la concentracion del percentil 95, preferentemente por encima del percentil 99, de una poblacion de referencia adecuada (puntuacion de discriminacion). Esta cantidad se basa en una recomendacion formulada por el Grupo de Trabajo Conjunto ESC/ACCF/AHA/WHF para la Redefinicion del Infarto de Miocardio (The Joint European Society of Cardiology / American College of Cardiology Committee: Universal definition of myocardial infarction, Ioc. cit.) El experto en la tecnica sabe como seleccionar una poblacion de referencia adecuada y como determinar la concentracion del percentil 95 y 99. Se debe entender que esta concentracion puede diferir segun el ensayo usado para determinar la concentracion de troponina cardiaca y segun la poblacion de referencia seleccionada. Las cantidades de troponina cardiaca preferentes indicativas de IM en el contexto de la presente invencion pueden ser, pero no estan limitadas a, una cantidad de al menos aproximadamente 0,05 ng/ml, de al menos aproximadamente 0,075 ng/ml, de al menos aproximadamente 0,099 ng/ml, de al menos aproximadamente 0,1 ng/ml, de al menos

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aproximadamente 0,2 ng/ml y de al menos aproximadamente 0,3 ng/ml.

En un modo de realizacion preferido de los procedimientos de la presente invencion, la cantidad de troponina, particularmente la cantidad de troponina T, en un sujeto que muestra los signos y sintomas de sindrome coronario agudo y que tiene una cantidad de una troponina cardiaca inferior a la cantidad que se considera indicativa de infarto de miocardio (como se define en la presente solicitud) es igual a o mayor que aproximadamente 0,002 y menor que aproximadamente 0,1 ng/ml. El percentil 99 calculado de acuerdo con los requisitos del Grupo de Trabajo Conjunto ESC/ACCF/AHA/WHF para la Redefinicion del Infarto de Miocardio, loc. cit., fue de 0,14 ng/ml, que es la cantidad mas preferida indicativa de IM.

La expresion ""FLT1 soluble", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido que es una forma soluble del receptor FLT1de VEGF. Se identifico en medio de cultivo acondicionado de celulas endoteliales de vena umbilical humana. El receptor FLT-1 soluble (sFLT-1) endogeno es cromatografica e inmunologicamente similar a sFLT-1 recombinante humana y se une al [125I] VEGF con una afinidad elevada comparable. Se muestra que sFLT1 humana forma un complejo estabilizado con VEGF con el dominio extracelular de KDR/Flk-1 in vitro. Preferentemente, sFLT-1 se refiere a sFLT-1 humana. Mas preferentemente, la sFLT-1 humana se puede deducir de la secuencia de aminoacidos de FLT-1 como se muestra en el numero de acceso GenBank P17948, GI: 125361. Una secuencia de aminoacidos para sFLT-1 de raton se muestra en el numero de acceso GenBank BAA24499.1, GI: 2809071. Ademas, se debe entender que una variante, tal como se hace referencia de acuerdo con la presente divulgacion, tendra una secuencia de aminoacidos que difiere debido a al menos una sustitucion, eliminacion y/o adicion de aminoacidos, en la que la secuencia de aminoacidos de la variante sigue siendo, preferentemente, al menos un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % identica a la secuencia amino de la sFLT-1 especifica. Las variantes pueden ser variantes alelicas, variantes de empalme o cualquier otro homologo, paralogo u ortologo especifico de la especie. Ademas, las variantes a las que se hace referencia en el presente documento incluyen fragmentos de la sFLT-1 especifica o de los tipos de variantes antes mencionados, siempre que estos fragmentos tengan las propiedades inmunologicas y biologicas esenciales como se ha mencionado con anterioridad. Preferentemente, las variantes de sFLT-1 tienen propiedades inmunologicas (es decir, composicion de epitopo) y/o propiedades biologicas comparables a las de sFLT-1 humana. De este modo, las variantes seran reconocibles por los medios o ligandos antes mencionados usados para la determinacion de la cantidad de sFLT-1. Dichos fragmentos pueden ser, por ejemplo, productos de degradacion de sFLT1. Se incluyen ademas variantes que difieren debido a modificaciones pos-traduccionales tales como glicosilacion, fosforilacion o miristilacion. Preferentemente, la propiedad biologica de sFLT-1 es la capacidad de unirse a VEGF con alta afinidad y/o formar un complejo estabilizado con VEGF con el dominio extracelular de KDR/Flk-1.

El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) se identifico por primera vez en 1984 y 1985 y se purifico como un mitogeno potente de hepatocitos de cultivo primario. El HGF es una forma precursora de cadena sencilla, y el procesamiento adicional por proteasas de serina en la forma bicatenaria se acopla a su activacion. Las proteasas de serina responsables de la activacion de HGF incluyen activador de HGF o enzima de conversion de HGF y activador de plasminogeno de tipo urocinasa (uPA). El receptor para HGF se identifico como un producto de proto-oncogen c- Met. El receptor c-Met esta compuesto por una cadena a de 50 kDa y una cadena h de 145 kDa. La union del HGF al receptor c-Met induce la activacion de la tirosina quinasa, dando como resultado una fosforilacion posterior de los residuos de tirosina agrupados en el extremo C-terminal. El HGF tiene un papel organotrofico en la regeneracion y proteccion de varios organos, incluyendo el higado, el pulmon, el estomago, el pancreas, el corazon, el cerebro y el rinon. El factor de crecimiento de los hepatocitos regula el crecimiento celular, la motilidad celular y la morfogenesis mediante activacion de una cascada de senalizacion de tirosina quinasa despues de la union al receptor proto oncogenico c-Met. El factor de crecimiento de los hepatocitos es segregado por celulas mesenquimales y actua como citoquina multifuncional sobre celulas de origen principalmente epitelial. Su capacidad para estimular la mitogenesis, la motilidad celular y la invasion de la matriz le confieren un papel central en la angiogenesis, la tumorogenesis y la regeneracion de los tejidos. Se segrega como un unico polipeptido inactivo y se escinde por medio de proteasas de serina en una cadena alfa de 69 kDa y una cadena beta de 34 kDa. Un enlace disulfuro entre las cadenas alfa y beta produce la molecula heterodimerica activa. La proteina pertenece a la subfamilia de plasminogeno de las peptidasas S1, pero no tiene actividad de proteasa detectable. El empalme alternativo de este gen produce multiples variantes de transcripcion que codifican diferentes isoformas. Una secuencia de aminoacidos para HGF de raton se muestra en el numero de acceso GenBank NP034557.2, GI: 46048249. Una secuencia de aminoacidos para HGF humano se muestra en el numero de acceso GenBank NP000592.3 GI: 33859835. Preferentemente, HGF se refiere a HGF humano. Ademas, se debe entender que una variante, tal como se hace referencia de acuerdo con la presente invencion, tendra una secuencia de aminoacidos que difiere debido a al menos una sustitucion, eliminacion y/o adicion de aminoacidos, en la que la secuencia de aminoacidos de la variante sigue siendo, preferentemente, al menos un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % identica a la secuencia amino del HGF especifica. Las variantes pueden ser variantes alelicas, variantes de empalme o cualquier otro homologo, paralogo u ortologo especifico de la especie. Ademas, las variantes a las que se hace referencia en el presente documento incluyen fragmentos del HGF especifica o de los tipos de variantes antes mencionados, siempre que estos fragmentos tengan las propiedades inmunologicas y biologicas esenciales que se han mencionado con anterioridad. Preferentemente, las variantes de HGF tienen propiedades inmunologicas (es decir, composicion de epitopo) y/o propiedades biologicas comparables a las de

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HGF humana. De este modo, las variantes seran reconocibles por los medios o ligandos antes mencionados usados para la determinacion de la cantidad de las troponinas cardiacas. Dichos fragmentos pueden ser, por ejemplo, productos de degradacion de HGF. Se incluyen ademas variantes que difieren debido a modificaciones pos- traduccionales tales como glicosilacion, fosforilacion o miristilacion. Preferentemente, la propiedad biologica de HGF es la capacidad de unirse al receptor proto-oncogenico c-Met.

La expresion "peptidos de tipo ANP" comprende pre-pro ANP, pro ANP, NT-proANP y variantes ANP de los mismos (vease, por ejemplo, Bonow, 1996, Circulation 93: 1946-1950). El pre-pro peptido comprende un peptido de senal corto, que se escinde enzimaticamente para liberar el pro peptido. El pro peptido se escinde adicionalmente para dar lugar a un pro peptido N-terminal (NT-proANP) y la hormona activa ANP con 28 aminoacidos. El ANP tiene un efecto vasodilatador y provoca la excrecion de agua y sodio a traves del tracto urinario.

El ANP tiene una semivida mas corta que su contraparte inactiva NT-proANP. El ANP se produce y se libera exclusivamente a partir del atrio. Por lo tanto, la cantidad de ANP puede reflejar predominantemente la funcion auricular. El termino "variantes" en este contexto se refiere a peptidos sustancialmente similares a ANP y NT- proANP. La expresion "sustancialmente similar" se comprende bien por parte del experto en la tecnica. En particular, una variante puede ser una isoforma o alelo que muestre intercambios de aminoacidos en comparacion con la secuencia de aminoacidos de la isoforma peptidica mas prevalente en la poblacion humana. Ademas, se debe entender que una variante, tal como se hace referencia de acuerdo con la presente invencion, tendra una secuencia de aminoacidos que difiere debido a al menos una sustitucion, eliminacion y/o adicion de aminoacidos, en la que la secuencia de aminoacidos de la variante sigue siendo, preferentemente, al menos un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % identica a la secuencia amino del ANP o NT-proANP. Las variantes pueden ser variantes alelicas, variantes de empalme o cualquier otro homologo, paralogo u ortologo especifico de la especie. Tambien son sustancialmente similares los productos de degradacion proteolitica que todavia son reconocidos por los medios diagnosticos o por ligandos dirigidos contra el peptido de longitud completa respectivo, siempre que estos fragmentos tengan las propiedades inmunologicas y biologicas esenciales, tal como se ha mencionado con anterioridad. Preferentemente, las variantes de peptido de tipo ANP tienen propiedades inmunologicas (es decir, composicion de epitopo) y propiedades biologicas comparables a las del peptido de tipo ANP humano respectivo. De este modo, las variantes seran reconocibles por los medios o ligandos antes mencionados usados para la determinacion de la cantidad del peptido de tipo ANP. Dichos fragmentos pueden ser, por ejemplo, productos de degradacion de NT-proANP. Se incluyen ademas variantes que difieren debido a modificaciones pos-traduccionales tales como glicosilacion, fosforilacion o miristilacion. Preferentemente, la propiedad biologica del ANP es la capacidad vasodilatadora y/o la capacidad de excrecion de sodio y agua.

El termino "variante" tambien se refiere a un peptido modificado por via pos-traduccional, tal como un peptido glicosilado. Una "variante" es tambien un peptido que ha sido modificado despues de la recogida de la muestra, por ejemplo, mediante union covalente o no covalente de un marcador, particularmente un marcador radiactivo o fluorescente, al peptido. La medicion de la cantidad de un peptido modificado despues de la recogida de muestra se entiende como la medicion de cantidad de peptido originalmente no modificado.

En el contexto de la presente invencion, el peptido de tipo ANP es preferentemente NT-proANP.

El termino "muestra" se refiere a una muestra de un fluido corporal, a una muestra de celulas separadas o a una muestra de un tejido o un organo. Las muestras de fluidos corporales se pueden obtener por tecnicas bien conocidas e incluyen preferentemente muestras de sangre, plasma, suero u orina, mas preferentemente, muestras de sangre, plasma o suero. Se pueden obtener muestras de tejidos u organos a partir de cualquier tejido u organo mediante, por ejemplo, biopsia. Las celulas separadas se pueden obtener a partir de los fluidos corporales o tejidos u organos mediante tecnicas de separacion tales como centrifugacion o clasificacion celular. Preferentemente, las muestras de celulas, tejidos u organos se obtienen a partir de dichas celulas, tejidos u organos que expresan o producen los peptidos a los que se hace referencia en el presente documento. Preferentemente, el termino "muestra" se refiere a una muestra de plasma o suero, mas preferentemente una muestra de suero.

En la presente invencion, la muestra se obtiene en un momento temporal apropiado que es conocido por el experto en la materia. Se debe tener en cuenta que el sujeto en estudio sufre un estado fisiopatologico agudo (SCA), lo que requiere un diagnostico rapido y una decision rapida sobre un tratamiento adecuado. Preferentemente, la muestra se obtiene a partir de un sujeto de acuerdo con la presente invencion de forma breve, por ejemplo, despues de aproximadamente 1 hora, no mas de aproximadamente 2 horas, no mas de aproximadamente 3 horas, no mas de aproximadamente 4 horas, no mas de aproximadamente 5 horas o no mas de aproximadamente 6 horas despues de la aparicion de los sintomas de sindrome coronario agudo. Preferentemente, la muestra se toma inmediatamente (es decir, unos pocos minutos, es decir, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 30, aproximadamente 45 o aproximadamente 1 hora) despues de la presentacion del sujeto ante el medico.

En el caso de que las cantidades de sFLT-1 y/u, opcionalmente, HGF y/u, opcionalmente, un peptido de tipo ANP se determinen de forma repetida, preferentemente al menos dos veces, para monitorizar la gravedad de la isquemia, la

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segunda muestra y cada muestra posterior se tomara en un intervalo de tiempo que garantice una monitorizacion eficaz del estado isquemico. En general, el intervalo entre cada muestra es de aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 90 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3, 4, 5 o 6 horas. Por ejemplo, la muestra inicial se toma aproximadamente 1 hora despues de la aparicion de los signos y/o sintomas de sindrome coronario agudo o inmediatamente despues de la presentacion del sujeto ante el medico, y cada muestra adicional se toma aproximadamente 1 hora despues de las muestras iniciales. El numero de muestras tomadas dependera de la evaluacion de la isquemia.

La determinacion de la cantidad de una troponina cardiaca, preferentemente troponina T, o la cantidad de sFLT-1, o la cantidad de HGF, o cualquier otro peptido o polipeptido o proteina a los que se hace referencia en la presente memoria descriptiva se refiere a la medicion de la cantidad o concentracion, preferentemente de forma semi- cuantitativa o cuantitativa. Los terminos polipeptido y proteina se usan de manera intercambiable a lo largo de la presente solicitud. La medicion se puede realizar de forma directa o indirecta. La medicion directa se refiere a la medicion de la cantidad o concentracion del peptido o polipeptido basandose en una senal que se obtiene a partir del propio peptido o polipeptido y cuya intensidad se correlaciona directamente con el numero de moleculas del peptido presentes en la muestra. Dicha senal -, en ocasiones referida en el presente documento como senal de intensidad, se puede obtener, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad fisica o quimica especifica del peptido o polipeptido. La medicion indirecta incluye la medicion de una senal obtenida a partir de un componente secundario (es decir, un componente que no es el propio peptido o polipeptido) o un sistema de lectura biologica, por ejemplo, respuestas celulares mesurables, ligandos, marcadores o productos de reaccion enzimaticos.

De acuerdo con la presente invencion, la determinacion de la cantidad de un peptido o polipeptido se puede lograr por todos los medios conocidos para determinar la cantidad de un peptido en una muestra. Dichos medios comprenden dispositivos y procedimientos de inmunoensayo que pueden utilizar moleculas marcadas en diversos formatos de ensayo en sandwich, de competicion u otros. Dichos ensayos desarrollaran una senal que es indicativa de la presencia o ausencia del peptido o polipeptido. Ademas, la intensidad de la senal se puede correlacionar, preferentemente, de forma directa o indirecta (por ejemplo, de forma inversamente proporcional) con la cantidad de polipeptido presente en una muestra. Otros procedimientos adecuados comprenden medir una propiedad fisica o quimica especifica para el peptido o polipeptido, tal como su masa molecular precisa o su espectro de RMN. Dichos procedimientos comprenden, preferentemente, biosensores, dispositivos opticos acoplados a inmunoensayos, biochips, dispositivos analiticos tales como espectrometros de masas, analizadores de RMN o dispositivos de cromatografia. Ademas, los procedimientos incluyen procedimientos basados en ELISA de microplacas, inmunoensayos totalmente automatizados o roboticos (disponibles, por ejemplo, en analizadores Elecsys™), CBA (un ensayo enzimatico de union a cobalto, disponible por ejemplo en analizadores Roche-Hitachi™) y ensayos de aglutinacion de latex (disponibles, por ejemplo, en analizadores Roche-Hitachi™).

Preferentemente, la determinacion de la cantidad de un peptido o polipeptido comprende las etapas de (a) poner en contacto una celula capaz de provocar una respuesta celular cuya intensidad es indicativa de la cantidad del peptido o polipeptido con dicho peptido o polipeptido durante un periodo de tiempo adecuado, (b) medir la respuesta celular. Para medir las respuestas celulares, la muestra o muestra procesada se anade, preferentemente, a un cultivo celular y se mide una respuesta celular interna o externa. La respuesta celular puede incluir la expresion cuantificable de un gen indicador o la secrecion de una sustancia, por ejemplo, un peptido, un polipeptido o una molecula pequena. La expresion o sustancia generara una senal de intensidad que se correlaciona con la cantidad del peptido o polipeptido.

Tambien preferentemente, la determinacion de la cantidad de un peptido o polipeptido comprende la etapa de medir una senal de intensidad especifica que se puede obtener a partir del peptido o polipeptido en la muestra. Tal como se ha descrito anteriormente, dicha senal puede ser la intensidad de senal observada en una variable m/z especifica para el peptido o polipeptido, observada en espectros de masas o un espectro de RMN especifico para el peptido o polipeptido.

La determinacion de la cantidad de un peptido o polipeptido puede comprender, preferentemente, las etapas de (a) poner en contacto el peptido con un ligando especifico, (b) eliminar (opcionalmente) el ligando no unido, (c) medir la cantidad de ligando unido. El ligando unido generara una senal de intensidad. La union, de acuerdo con la presente invencion, incluye tanto la union covalente como la no covalente. Un ligando, de acuerdo con la presente invencion, puede ser cualquier compuesto, por ejemplo, un peptido, polipeptido, acido nucleico o molecula pequena, que se une al peptido o polipeptido descrito en el presente documento. Los ligandos preferentes incluyen anticuerpos, acidos nucleicos, peptidos o polipeptidos tales como receptores o socios de union para el peptido o polipeptido y fragmentos de los mismos que comprenden los dominios de union para los peptidos y aptameros, por ejemplo, aptameros de acidos nucleicos o peptidos. Los procedimientos para preparar dichos ligandos se conocen bien en la tecnica. Por ejemplo, la identificacion y produccion de anticuerpos o aptameros adecuados tambien se ofrecen por parte de los proveedores comerciales. El experto en la tecnica esta familiarizado con procedimientos para desarrollar derivados de tales ligandos con mayor afinidad o especificidad. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones aleatorias en los acidos nucleicos, peptidos o polipeptidos. Estos derivados se pueden entonces someter a ensayo para su union de acuerdo con procedimientos de cribado conocidos en la tecnica, por ejemplo, visualizacion de

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fagos. Los anticuerpos a los que se hace referenda en el presente documento incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, asf como fragmentos de los mismos, tales como fragmentos Fv, Fab y F(ab)2 que son capaces de unirse a antfgeno o hapteno. La presente invencion tambien incluye anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos hfbridos humanizados en los que las secuencias de aminoacidos de un anticuerpo donante no humano que exhiben una especificidad de antfgeno deseada se combinan con secuencias de un anticuerpo aceptor humano. Las secuencias donantes incluiran normalmente al menos los residuos de aminoacidos de union al antfgeno del donante, pero tambien pueden comprender otros residuos de aminoacidos estructural y/o funcionalmente relevantes del anticuerpo donante. Dichos hfbridos se pueden preparar por diversos procedimientos bien conocidos en la tecnica. Preferentemente, el ligando o agente se une especfficamente al peptido o polipeptido. De acuerdo con la presente invencion, union especffica significa que el ligando o agente no debe unirse sustancialmente a ("reaccionar de forma cruzada" con) otro peptido, polipeptido o sustancia presente en la muestra que se va a analizar. Preferentemente, el peptido o polipeptido unido especfficamente se debe unir con una afinidad al menos 3 veces mayor, mas preferentemente al menos 10 veces mayor e incluso mas preferentemente al menos 50 veces mayor que cualquier otro peptido o polipeptido relevante. La union no especffica puede ser tolerable, si todavfa se puede distinguir y medir inequfvocamente, por ejemplo, de acuerdo con su tamano en ensayo de inmunotransferencia, o por su abundancia relativamente mayor en la muestra. La union del ligando se puede medir mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica. Preferentemente, dicho procedimiento es semicuantitativo o cuantitativo. Los procedimientos adecuados se describen a continuacion.

En primer lugar, la union de un ligando se puede medir directamente, por ejemplo, por RMN o resonancia de plasmon superficial.

En segundo lugar, si el ligando tambien sirve como sustrato de una actividad enzimatica del peptido o polipeptido de interes, se puede medir un producto de reaccion enzimatica (por ejemplo, la cantidad de una proteasa se puede medir midiendo la cantidad de sustrato escindido, por ejemplo, en un ensayo de inmunotransferencia). Alternativamente, el ligando puede presentar propiedades enzimaticas por sf mismo y el complejo "ligando/peptido o ligando/polipeptido" o el ligando que estaba unido por el peptido o polipeptido, respectivamente, se puede poner en contacto con un sustrato adecuado que permita la deteccion mediante la generacion de una senal de intensidad. Para la medicion de productos de reaccion enzimatica, la cantidad de sustrato es preferentemente saturante. El sustrato tambien se puede marcar con un marcador detectable antes de la reaccion. Preferentemente, la muestra se pone en contacto con el sustrato durante un periodo de tiempo adecuado. Un periodo de tiempo adecuado se refiere al tiempo necesario para producir una cantidad detectable, preferentemente mesurable, del producto que se va a producir. En lugar de medir la cantidad de producto, se puede medir el tiempo necesario para la aparicion de una cantidad dada (por ejemplo, detectable) de producto.

En tercer lugar, el ligando se puede acoplar de forma covalente o no covalente a un marcador que permita la deteccion y medicion del ligando. El marcaje se puede realizar mediante procedimientos directos o indirectos. El marcaje directo implica el acoplamiento del marcador de forma directa (covalente o no covalentemente) al ligando. El marcaje indirecto implica la union (covalente o no covalentemente) de un ligando secundario al primer ligando. El ligando secundario se deber unir especfficamente al primer ligando. Dicho ligando secundario se puede acoplar a un marcador adecuado y/o ser el objetivo (receptor) del ligando terciario que se une al ligando secundario. El uso de ligandos secundarios, terciarios o incluso de orden superior se utiliza a menudo para aumentar la senal. Los ligandos secundarios y de orden superior adecuados pueden incluir anticuerpos, anticuerpos secundarios y el sistema bien conocido de estreptavidina-biotina (Vector Laboratories, Inc.). El ligando o sustrato tambien se puede "marcar" con uno o mas marcadores conocidos en la tecnica. Dichos marcadores pueden entonces ser dianas para ligandos de orden superior. Los marcadores adecuados incluyen biotina, digoxigenina, His-Tag, glutation-S-transferasa, FLAG, GFP, marcador myc, hemaglutinina (HA) del virus de la gripe A, protefna de union a maltosa y similares. En el caso de un peptido o polipeptido, el marcador esta preferentemente en el extremo N-terminal y/o en el extremo C-terminal. Los marcadores adecuados son todos los marcadores detectables por un procedimiento de deteccion apropiado. Los marcadores tfpicos incluyen partfculas de oro, perlas de latex, ester de acridano, luminol, rutenio, marcadores enzimaticamente activos, marcadores radiactivos, marcadores magneticos ("por ejemplo, perlas magneticas", incluyendo marcadores paramagneticos y superparamagneticos) y marcadores fluorescentes. Los marcadores enzimaticamente activos incluyen, por ejemplo, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, luciferasa y derivados de los mismos. Los sustratos adecuados para la deteccion incluyen di-amino-bencidina (DAB), 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, NBT-BCIP (cloruro de 4-nitroazul de tetrazolio y 5-bromo-4 cloro-3-indolil-fosfato, disponible como solucion de reserva preparada de Roche Diagnostics), CDP-Star™ (Amersham Biosciences), ECF™ (Amersham Biosciences). Una combinacion enzima-sustrato adecuada puede dar como resultado un producto de reaccion coloreado, fluorescencia o quimioluminiscencia, que se puede medir de acuerdo con procedimientos conocidos en la tecnica (por ejemplo, usando una pelfcula sensible a la luz o un sistema de camara adecuado). En cuanto a la medicion de la reaccion enzimatica, los criterios dados anteriormente se aplican de manera analoga. Los marcadores fluorescentes tfpicos incluyen protefnas fluorescentes (tales como GFP y sus derivados), Cy3, Cy5, rojo Texas, fluorescefna y los tintes Alexa (por ejemplo, Alexa 568). Otros marcadores fluorescentes estan disponibles, por ejemplo, en Molecular Probes (Oregon). Tambien se contempla el uso de puntos de cuanto como marcadores fluorescentes. Los marcadores radiactivos tfpicos incluyen 35S, 25I, 32P, 33P y similares. Un marcador radiactivo se puede detectar por cualquier procedimiento conocido y apropiado, por ejemplo, una pelfcula sensible a la luz o un dispositivo de formacion de imagenes de fosforo. Los procedimientos de medicion

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adecuados de acuerdo con la presente invencion incluyen tambien precipitacion (particularmente inmunoprecipitacion), electroquimioluminiscencia (quimioluminiscencia generada por vfa electrica), RIA (radioinmunoensayo), ELISA (ensayo de inmunoabsorcion enzimatica), inmunoensayos enzimaticos de tipo intercalado, inmunoensayos de electroquimioluminiscencia de tipo intercalado(ECLIA), fluoroinmunoensayo de lantanidos con disociacion mejorada (DELFIA), ensayo de proximidad de centelleo (SPA), turbidimetrfa, nefelometna, turbidimetna o nefelometna mejorada con latex, o inmunoensayos en fase solida. Otros procedimientos conocidos en la tecnica (tales como electroforesis de gel, electroforesis de gel 2D, electroforesis de gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE), inmunotransferencia y espectrometna de masas) se pueden usar solos o en combinacion con marcaje u otros procedimientos de deteccion, tal como se describio con anterioridad.

La cantidad de un peptido o polipeptido se puede determinar, tambien preferentemente, como sigue: (a) poner en contacto un soporte solido que comprende un ligando para el peptido o polipeptido tal como se especifico anteriormente con una muestra que comprende el peptido o polipeptido y (b) medir la cantidad de peptido o polipeptido que esta unido al soporte. El ligando, elegido preferentemente del grupo que consiste en acidos nucleicos, peptidos, polipeptidos, anticuerpos y aptameros, esta preferentemente presente sobre un soporte solido en forma inmovilizada. Los materiales para la fabricacion de soportes solidos se conocen bien en la tecnica e incluyen, entre otros, materiales de columna comercialmente disponibles, perlas de poliestireno, perlas de latex, perlas magneticas, partfculas metalicas coloidales, chips y superficies de vidrio y/o silicio, tiras de nitrocelulosa, membranas, laminas, duracitos, pocillos y paredes de bandejas de reaccion, tubos de plastico, etc. El ligando o agente puede estar unido a muchos vehfculos diferentes. Ejemplos de vehfculos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nailon, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehfculo puede ser soluble o insoluble para los propositos de la invencion. Los procedimientos adecuados para fijar/inmovilizar dicho ligando se conocen bien e incluyen, pero no se limitan a, interacciones ionicas, hidrofobas, covalentes y similares. Tambien se contempla el uso de "matrices de suspension" como matrices de acuerdo con la presente invencion (Nolan 2002, Trends Biotechnol. 20(1 ):9-12). En dichas matrices de suspension, el vehfculo, por ejemplo, una microperla o microesfera, esta presente en suspension. La matriz consiste en diferentes microperlas o microesferas, posiblemente marcadas, que portan diferentes ligandos. Se conocen generalmente procedimientos para producir dichas matrices, por ejemplo, basados en qufmica en fase solida y grupos protectores fotolabiles (Patente de EE. UU. 5.744.305).

Preferentemente, la cantidad de sFLT-1 y la cantidad de HGF (si se mide HGF) y la cantidad de los peptidos de tipo ANP y, segun el caso, las cantidades de otros peptidos medidas en el contexto de la presente invencion se determinan en una muestra de sangre, por ejemplo, una muestra de suero o plasma, obtenida a partir de un sujeto tal como se define en la presente invencion. Preferentemente, dicha determinacion se realiza mediante ELISA. Dicha determinacion por ELISA se puede realizar, por ejemplo, utilizando el inmunoensayo Quantikine Human HGF, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU., y/o el inmunoensayo Quantikine Human Soluble VEGF R1/Flt-1 (para sFLT-1), R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU., y el inmunoensayo NT-proANP de Biomedica Medizinprodukte, Viena, Austria. Segun el caso, las cantidades respectivas de sFLT-1 y/o de HGF, tal como se especifica en otra parte de la presente solicitud, se pueden determinar, respectivamente, usando el estuche de ensayo HBT ELISA para la protefna de union a acidos grasos de tipo corazon humano (HyCult Biotechnology, Uden, Pafses Bajos) para la determinacion de la cantidad de H-FABP y utilizando el sistema de ensayo de mioglobina Tina- Quant® (Roche Diagnostics) para la determinacion de la cantidad de mioglobina. .

El termino "cantidad", tal como se utiliza en el presente documento, abarca la cantidad absoluta (por ejemplo, de sFLT-1 o HGF), la cantidad o concentracion relativa (por ejemplo, de sFLT-1 o HGF), asf como cualquier valor o parametro que se correlacione con la misma. Dichos valores o parametros comprenden valores de senal de intensidad de todas las propiedades ffsicas o qufmicas especfficas obtenidas a partir de dichos peptidos mediante mediciones directas, por ejemplo, valores de intensidad en espectros de masas o espectros de rMn. Ademas, se incluyen todos los valores o parametros que se obtienen mediante mediciones indirectas especificadas en otra parte de la presente descripcion, por ejemplo, cantidades de expresion determinadas a partir de sistemas de lectura biologica en respuesta a los peptidos o senales de intensidad obtenidos a partir de ligandos unidos de forma especffica. Se debe entender que los valores que se correlacionan con las cantidades o parametros anteriormente mencionados tambien se pueden obtener por medio de todas las operaciones matematicas convencionales.

El termino "comparacion", tal como se utiliza en el presente documento, abarca la comparacion de la cantidad del peptido, polipeptido, protefna comprendida en la muestra a analizar con una cantidad de una fuente de referencia adecuada especificada en otra parte de la presente descripcion. Se debe entender que comparacion, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una comparacion de parametros o valores correspondientes, por ejemplo, una cantidad absoluta se compara con una cantidad de referencia absoluta mientras que una concentracion se compara con una concentracion de referencia o una senal de intensidad obtenida a partir de una muestra de ensayo se compara con el mismo tipo de senal de intensidad de una muestra de referencia. La comparacion mencionada en la etapa (b) del procedimiento de la presente invencion se puede llevar a cabo manualmente o asistida por ordenador. Para una comparacion asistida por ordenador, el valor de la cantidad determinada se puede comparar con valores correspondientes a referencias adecuadas que se almacenan en una base de datos mediante un programa informatico. El programa informatico puede evaluar adicionalmente el resultado de la comparacion, es

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decir, proporcionar automaticamente la valoracion deseada en un formato de salida adecuado. Basandose en la comparacion de la cantidad o cantidades determinadas en la etapa a) con la cantidad o cantidades de referencia adecuadas, es posible diagnosticar el IM en dicho sujeto. Se debe entender que una cantidad de sFLT-1 determinada en la etapa (a) de los procedimientos de la presente invencion se compara en la etapa (b) con una cantidad de referencia para sFLT-1 tal como se especifica en otra parte de la presente solicitud y que una cantidad de HGF se compara con una cantidad de referencia para HGF.

Por consiguiente, la expresion "cantidad de referencia", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una cantidad que permite determinar el estado isquemico (que tambien se puede denominar "grado de isquemia" en el contexto de la presente invencion) en un sujeto que muestra los signos y sintomas de sindrome coronario agudo y que tiene una cantidad de una troponina cardiaca que es inferior a la cantidad que se considera indicativa de un infarto de miocardio (por lo tanto, en un sujeto tal como se define en la presente invencion). La comparacion con cantidades de referencia permite diagnosticar si la isquemia conducira a una disfuncion cardiaca / lesion cardiaca. La aparicion de los sintomas de SCA ha tenido lugar de forma reciente. "Existencia reciente" en este contexto significa que la aparicion se ha producido, preferentemente, dentro de un periodo de 6 horas, mas preferentemente dentro de un periodo de 4 horas, y del modo mas preferido dentro de un periodo de 2 horas antes de que la muestra fuera obtenida a partir de dicho sujeto. Preferentemente, las cantidades de referencia para la gravedad del grado de isquemia pueden proceder de sujetos tal como se definen en la presente invencion a los que se les ha diagnosticado sintomas de SCA que han aparecido preferentemente dentro de un periodo de 6 horas, mas preferentemente dentro de un periodo de 4 horas y del modo mas preferido dentro de un periodo de 2 horas antes de que se obtuviera la muestra, y en los que el resultado del sujeto, concretamente, la existencia de IM, en particular, IMSEST, API, aturdimiento miocardico, disfuncion circulatoria o EAC, se determino sin signos de SCA.

La expresion "cantidades de referencia", tal como se utiliza en el presente modo de realizacion de la presente invencion, se refiere a cantidades de los polipeptidos que permiten diagnosticar el estado isquemico en un individuo como es un sujeto fisiologicamente sano o un sujeto que tiene un estado isquemico que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible.

Por lo tanto, las cantidades de referencia proceden en general de un sujeto conocido como un sujeto fisiologicamente sano, o un sujeto que tiene un estado isquemico que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o a una lesion cardiaca no reversible.

En todos los modos de realizacion de la presente invencion, la cantidad/cantidades de los respectivos marcadores utilizados en la misma (una troponina cardiaca, en particular, la troponina T; sFLT-1; HGF y, en algunos modos de realizacion, NT-proANP) que indican el estado isquemico de un individuo, se determinan por procedimientos conocidos por el experto en la tecnica.

En general, para determinar la cantidad/cantidades o relaciones entre cantidades que permiten establecer el diagnostico deseado de acuerdo con el modo de realizacion respectivo de la presente invencion, ("umbral", "cantidad de referencia"), la cantidad/cantidades o relaciones entre cantidades del peptido o peptidos respectivos se determinan en grupos de pacientes apropiados. De acuerdo con el diagnostico que se va a establecer, el grupo de pacientes puede comprender, por ejemplo, solo individuos sanos, o puede comprender individuos sanos e individuos que padecen el estado fisiopatologico que se va a determinar, o puede comprender solo individuos que padecen el estado fisiopatologico que se va a determinar, o puede comprender individuos que sufren los diversos estados fisiopatologicos entre los que hay que distinguir mediante el marcador o marcadores respectivos usando procedimientos analiticos validados. Los resultados que se obtienen se recogen y analizan por procedimientos estadisticos conocidos por el experto en la tecnica. Los valores umbral obtenidos se establecen entonces de acuerdo con la probabilidad deseada de padecer la enfermedad y se vinculan al valor umbral particular. Por ejemplo, puede ser util elegir el valor de mediana, el percentil 60, 70, 80, 90, 95 o incluso 99 del colectivo de pacientes sanos y/o no sanos, para establecer el valor o los valores umbral, el valor o los valores de referencia o las relaciones entre cantidades.

Se puede establecer un valor de referencia de un marcador de diagnostico y la cantidad del marcador en una muestra de paciente se puede comparar de forma sencilla con el valor de referencia. La sensibilidad y especificidad de un ensayo diagnostico y/o pronostico depende de algo mas que de la "calidad" analitica del ensayo, tambien depende de la definicion de lo que constituye un resultado anormal. En la practica, las curvas caracteristicas operativas del receptor o curvas "ROC" se calculan tipicamente representando el valor de una variable frente a su frecuencia relativa en poblaciones "normales" y "con enfermedad". Para cualquier marcador particular de la invencion, las distribuciones de cantidades de marcadores para sujetos con y sin una enfermedad probablemente se solapan. En tales condiciones, un ensayo no distingue absolutamente entre lo normal y la enfermedad con un 100 % de precision, y el area de solapamiento indica la zona en la que el ensayo no puede distinguir entre lo normal y la enfermedad. Se selecciona un umbral por encima del cual (o por debajo del cual, dependiendo de como cambie el marcador con la enfermedad) se considera que el ensayo es anormal y por debajo del cual el ensayo se considera normal. El area bajo la curva ROC es una medida de la probabilidad de que la medicion percibida permita la identificacion correcta de una enfermedad. Las curvas ROC se pueden utilizar incluso cuando los resultados de los ensayos no dan necesariamente un numero exacto. Siempre que los resultados se puedan clasificar, se puede crear

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una curva ROC. Por ejemplo, los resultados de un ensayo en muestras de "enfermedad" se podrian clasificar segun el grado (es decir 1 = bajo, 2 = normal y 3 = alto). Esta clasificacion se puede correlacionar con los resultados en la poblacion "normal", y se crea una curva ROC. Estos procedimientos se conocen bien en la tecnica. Vease, por ejemplo, Hanley et al., Radiology 143: 29-36(1982).

En ciertos modos de realizacion, se seleccionan marcadores y/o paneles de marcadores que exhiben al menos aproximadamente un 70 % de sensibilidad, mas preferentemente al menos aproximadamente un 80 % de sensibilidad, aun mas preferentemente al menos aproximadamente un 85 % de sensibilidad, aun mas preferentemente al menos aproximadamente un 90 % de sensibilidad, y del modo mas preferido al menos aproximadamente un 95 % de sensibilidad, combinada con al menos aproximadamente un 70 % de especificidad, mas preferentemente al menos aproximadamente un 80 % de especificidad, aun mas preferentemente al menos aproximadamente un 85 % de especificidad, todavia mas preferentemente al menos aproximadamente un 90 % de especificidad y del modo mas preferido al menos aproximadamente un 95 % de especificidad. En modos de realizacion particularmente preferentes, tanto la sensibilidad como la especificidad son al menos aproximadamente un 75 %, mas preferentemente al menos aproximadamente un 80 %, incluso mas preferentemente al menos aproximadamente un 85 %, aun mas preferentemente al menos aproximadamente un 90 % y del modo mas preferido al menos aproximadamente un 95 %. El termino "aproximadamente" en este contexto se refiere a +/- 5 % de una medida dada.

En otros modos de realizacion, se usa una razon de probabilidad positiva, razon de probabilidad negativa, razon de momios (odds ratio) o cociente de riesgos (hazard ratio) como una medida de la capacidad de un ensayo para predecir el riesgo de padecer una enfermedad o diagnosticar una enfermedad. En el caso de una razon de probabilidad positiva, un valor de 1 indica que un resultado positivo es igualmente probable entre los sujetos de los grupos de "enfermos" que entre los de los grupos de "control"; un valor mayor que 1 indica que un resultado positivo es mas probable en el grupo de enfermos; y un valor menor que 1 indica que un resultado positivo es mas probable en el grupo de control. En el caso de una razon de probabilidad negativa, un valor de 1 indica que un resultado negativo es igualmente probable entre los sujetos de los grupos de "enfermos" que entre los de los grupos de "control"; un valor mayor que 1 indica que un resultado negativo es mas probable en el grupo de ensayo; y un valor menor que 1 indica que un resultado negativo es mas probable en el grupo de control. En ciertos modos de realizacion preferentes, los marcadores y/o paneles de marcadores se seleccionan preferentemente para presentar una razon de probabilidad positiva o negativa de al menos aproximadamente 1,5 o mas o aproximadamente 0,67 o menos, mas preferentemente de al menos aproximadamente 2 o mas o aproximadamente 0,5 o menos, aun mas preferentemente de al menos aproximadamente 5 o mas o aproximadamente 0,2 o menos, incluso mas preferentemente de al menos aproximadamente 10 o mas o aproximadamente 0,1 o menos y del modo mas preferido de al menos aproximadamente 20 o mas o aproximadamente 0,05 o menos. El termino "aproximadamente" en este contexto se refiere a +/- 5 % de una medida dada.

En el caso de una razon de momios, un valor de 1 indica que un resultado positivo es igualmente probable entre los sujetos de los grupos de "enfermos" que entre los de los grupos de "control"; un valor mayor que 1 indica que un resultado positivo es mas probable en el grupo de enfermos; y un valor menor que 1 indica que un resultado positivo es mas probable en el grupo de control. En ciertos modos de realizacion preferentes, los marcadores y/o paneles de marcadores se seleccionan preferentemente para presentar una razon de momios de al menos aproximadamente 2 o mas o aproximadamente 0,5 o menos, mas preferentemente de al menos aproximadamente 3 o mas o aproximadamente 0,33 o menos, aun mas preferentemente de al menos aproximadamente 4 o mas o aproximadamente 0,25 o menos, incluso mas preferentemente de al menos aproximadamente 5 o mas o aproximadamente 0,2 o menos y del modo mas preferido de al menos aproximadamente 10 o mas o aproximadamente 0,1 o menos. El termino "aproximadamente" en este contexto se refiere a +/- 5 % de una medida dada.

En el caso de una razon de riesgos, un valor de 1 indica que el riesgo relativo de un punto final (por ejemplo, muerte) es igual en ambos grupos "enfermo" y "control"; un valor mayor que 1 indica que el riesgo es mayor en el grupo de enfermos; y un valor menor que 1 indica que el riesgo es mayor en el grupo de control. En ciertos modos de realizacion preferentes, los marcadores y/o paneles de marcadores se seleccionan preferentemente para presentar una razon de riesgos de al menos aproximadamente 1,1 o mas o aproximadamente 0,91 o menos, mas preferentemente de al menos aproximadamente 1,25 o mas o aproximadamente 0,8 o menos, aun mas preferentemente de al menos aproximadamente 1,5 o mas o aproximadamente 0,67 o menos, incluso mas preferentemente de al menos aproximadamente 2 o mas o aproximadamente 0,5 o menos y del modo mas preferido de al menos aproximadamente 2,5 o mas o aproximadamente 0,4 o menos. El termino "aproximadamente" en este contexto se refiere a +/- 5 % de una medida dada.

Aunque en el presente documento se describen paneles ejemplares, se pueden reemplazar, anadir o eliminar uno o mas marcadores de estos paneles ejemplares siempre que sigan proporcionando resultados clinicamente utiles. Los paneles pueden comprender tanto marcadores especificos de una enfermedad (por ejemplo, marcadores que aumentan o disminuyen en caso de infeccion bacteriana, pero no en otros estados de enfermedad) y/o marcadores no especificos (por ejemplo, marcadores que aumentan o disminuyen debido a inflamacion, independientemente de la causa; marcadores que aumentan o disminuyen debido a cambios en la hemostasia, independientemente de la

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causa, etc.). Aunque ciertos marcadores no pueden ser individualmente definitivos en los procedimientos descritos en el presente documento, un patron particular de "huella dactilar" de cambios puede, en efecto, actuar como un indicador especifico del estado de enfermedad. Tal como se analizo anteriormente, ese patron de cambios se puede obtener a partir de una unica muestra, o puede considerar opcionalmente cambios temporales en uno o mas miembros del panel (o cambios temporales en un valor de respuesta del panel).

Con el fin de comprobar si un valor de referencia elegido proporciona un diagnostico suficientemente seguro en pacientes que padecen la enfermedad de interes, se puede determinar, por ejemplo, la eficacia (E) de los procedimientos de la invencion para un valor de referencia dado utilizando la siguiente formula:

E = (TP/TO) x 100;

en la que TP = verdaderos positivos y TO = numero total de ensayos = TP + FP + FN + TN, en el que FP = falsos positivos; FN = falsos negativos y TN = verdaderos negativos. E tiene el siguiente intervalo de valores: 0 < E < 100. Preferentemente, un valor de referencia sometido a ensayo proporciona un diagnostico suficientemente seguro siempre que el valor de E sea de al menos aproximadamente 50, mas preferentemente de al menos aproximadamente 60, mas preferentemente de al menos aproximadamente 70, mas preferentemente de al menos aproximadamente 80, mas preferentemente de al menos aproximadamente 90, mas preferentemente de al menos aproximadamente 95, mas preferentemente de al menos aproximadamente 98.

Si los individuos estan sanos o sufren un cierto estado fisiopatologico, el diagnostico se realiza por procedimientos establecidos conocidos por el experto en la tecnica. Los procedimientos difieren en cuanto al estado fisiopatologico individual.

Los algoritmos para establecer el diagnostico deseado se exponen en la presente solicitud, en los pasajes referidos al respectivo modo de realizacion, al que se hace referencia.

Por consiguiente, la presente invencion tambien comprende un procedimiento para determinar la cantidad umbral indicativa de un estado fisiologico y/o patologico y/o un cierto estado patologico, que comprende las etapas de determinar en grupos de pacientes apropiados las cantidades del marcador o marcadores apropiados, recopilar los datos y analizarlos mediante procedimientos estadisticos y establecer los valores umbral.

El termino "aproximadamente", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a +/- 20 %, preferentemente +/- 10 %, preferentemente +/- 5 % de una medida o valor dado.

Las cantidades de referencia para sFLT-1 que indican estados isquemicos, tal como se definen en la presente invencion (cantidades umbral), son las siguientes: aproximadamente 92 pg/ml, mas preferentemente alrededor de 109 pg/ml. Las cantidades de sFLT-1 por debajo de los valores citados anteriormente son indicativas de un estado no isquemico no asociado o que no conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible. Las cantidades de sFLT-1 iguales o mayores que las cantidades de referencia citadas anteriormente son indicativas de un estado isquemico asociado o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible.

Una cantidad de referencia para HGF para estados isquemicos, tal como se define en la presente invencion (cantidades umbral), es la siguiente: aproximadamente 0,62 pg/ml, mas preferentemente aproximadamente 0,73 pg/ml. Las cantidades de HGF por debajo de los valores citados anteriormente son indicativas de un estado no isquemico no asociado o que no conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible. Las cantidades de HGF iguales o mayores que las cantidades de referencia citadas anteriormente son indicativas de un estado isquemico asociado o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible.

Preferentemente, en el caso de que los valores determinados de sFLT-1 y, opcionalmente, de HGF no indiquen un estado isquemico, el individuo no requiere ningun examen adicional en cuanto a enfermedades cardiacas. En general, ese individuo puede ser enviado a casa.

En caso de que se diagnostique un estado isquemico, el individuo respectivo puede requerir un examen adicional en cuanto a enfermedades cardiacas o cardiovasculares. En un modo de realizacion preferido, por consiguiente, la presente invencion comprende etapas de diagnostico adicional del individuo en el que se han determinado las cantidades de sFLT-1 y/o HGF. Otros procedimientos de diagnostico adecuados en el contexto de la presente invencion incluyen ensayos de esfuerzo de diversos tipos, por ejemplo, ECG de esfuerzo fisico, ecocardiografia de esfuerzo fisico, tomografia computerizada de esfuerzo fisico, exploracion con talio de esfuerzo fisico y angiografia (invasiva o virtual, por ejemplo, mediante tomografia computerizada en espiral).

Preferentemente, las cantidades de referencia para NT-proANP para deficiencia circulatoria, tal como se define en la presente invencion (cantidades umbral), son las siguientes: aproximadamente 1320 pg/ml, mas preferentemente aproximadamente 1674 pg/ml. Las cantidades de NT-proANP iguales o mayores que los valores citados

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anteriormente son indicativas de deficiencia circulatoria.

Se debe observar que los valores de HGF y NT-proANP pueden cambiar debido a la existencia de enfermedades cronicas en un individuo, por ejemplo, insuficiencia cardiaca, insuficiencia o fallo renal y -, en el caso de HGF, - enfermedad hepatica aguda o cronica. En el caso de una enfermedad cronica, los valores citados anteriormente pueden ser significativamente mas elevados (por ejemplo 2, 5, 7, 8 o 10 veces mayores) que los valores citados anteriormente que son aplicables a individuos que no tienen una enfermedad cronica, en particular que no tienen una enfermedad cardiaca cronica, mas alla del sindrome coronario agudo.

La expresion "al menos una cantidad de referenda" significa una o mas de una cantidad de referencia, por ejemplo, dos cantidades de referencia.

En un modo de realizacion preferido de la presente invencion, la determinacion de los marcadores citados anteriormente se lleva a cabo en intervalos, con el fin de determinar la evaluacion de la cantidad de marcador. Esto puede ser util en la valoracion de si tiene lugar o no un episodio agudo.

Se asume un episodio agudo si la cantidad determinada de al menos uno de los marcadores sFLT-1, HGF y/o NT- proANP es mayor que las cantidades de referencia citadas con caracter previo. Preferentemente, la desviacion es de, al menos aproximadamente un 20 %, o al menos aproximadamente un 30 %, o al menos aproximadamente un 50 %, o al menos aproximadamente un 100 %, mas preferentemente al menos aproximadamente un 200 %, incluso mas preferentemente al menos aproximadamente un 500 %, en particular al menos aproximadamente un 1000 %.

El intervalo de tiempo entre dos determinaciones de un marcador concreto(o los marcadores) es de al menos aproximadamente 15 minutos, al menos aproximadamente 30 minutos, al menos aproximadamente 45 minutos, al menos aproximadamente 1 hora, al menos aproximadamente 90 minutos, al menos aproximadamente 2 horas, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5 o al menos aproximadamente 6 horas. El experto en la tecnica es consciente de que el intervalo de tiempo y la desviacion pueden variar de acuerdo con el estado del individuo, la tendencia de la cantidad del marcador respectivo a modificar (es decir, el desarrollo de isquemia y/o deficiencia circulatoria), etc.

Otro modo de realizacion de la presente invencion comprende la determinacion de H-FABP y/o mioglobina, despues de determinar una troponina cardiaca y/o medir un ECG, y antes de determinar las cantidades de sFLT-1 y, opcionalmente, de HGF en las etapas a) y b) del procedimiento de la presente invencion, con el fin de determinar si el sujeto ha sufrido un infarto de miocardio, en particular un IMSEST.

Una cantidad de mioglobina y, opcionalmente, H-FABP, en un sujeto, tal como se define en la presente invencion, que es superior a la cantidad de referencia para confirmar la existencia de IM sera indicativa de una existencia reciente de IM en dicho sujeto. Una cantidad de mioglobina y, opcionalmente, H-FABP en un sujeto, tal como se define en la presente invencion, que es inferior a la cantidad de referencia para descartar la existencia de IM sera un indicador de que no se ha producido recientemente un IM; por lo que dicho sujeto podria sufrir una API. Se debe entender en el contexto de la presente invencion que los sujetos, tal como se definen en la presente invencion, cuya cantidad de mioglobina se encuentre entre los valores de referencia mencionados anteriormente (la cantidad de referencia para confirmar la existencia reciente de IM y la cantidad de referencia para descartar la existencia reciente de IM) pueden requerir un nuevo diagnostico.

Preferentemente, esto tambien se puede hacer en sujetos para los que se determinan tanto la cantidad de mioglobina como de H-FABP, en los que ambas cantidades no se corresponden, por ejemplo, una cantidad es mayor (o menor) que la respectiva cantidad de referencia, mientras que la otra cantidad es no mayor (o menor) que la respectiva cantidad de referencia. Particularmente, una cantidad de mioglobina en un sujeto, tal como se define en la presente invencion, superior a 77 ng/ml indica una existencia reciente de IM (confirmacion), mientras que una cantidad inferior a 55 ng/ml indica que no se ha producido recientemente un IM (descarte). Ademas, la sensibilidad y especificidad del diagnostico basado en la determinacion de mioglobina en una muestra de un sujeto, tal como se define en la presente invencion, es aun mayor cuando, ademas de la cantidad de mioglobina, se determina la cantidad de H-FABP en una muestra de dicho sujeto y se compara con al menos una cantidad de referencia para H- FABP. Particularmente, una cantidad de H-FABP en un sujeto, tal como se define en la presente invencion, superior a 5700 pg/ml indica una existencia reciente de IM (confirmacion), mientras que una cantidad inferior a 2500 pg/ml indica que no se ha producido recientemente un IM (descarte).

La mioglobina es una hemoproteina citoplasmatica que consiste en una unica cadena polipeptidica de 154 aminoacidos y que se expresa casi exclusivamente en miocitos cardiacos y fibras musculares esqueleticas oxidativas. Al igual que la hemoglobina, la mioglobina se une de forma reversible al oxigeno y, por lo tanto, puede facilitar el transporte de oxigeno desde los globulos rojos hasta las mitocondrias durante periodos de mayor actividad metabolica o servir como deposito de oxigeno en condiciones hipoxicas o anoxicas. Ordway G. y Garry D. J., Myoglobin: an essential hemoprotein in striated muscle. 2004. Journal of Experimental Biology 207, 3441-3446 (2004).

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La protefna de union a acidos grasos de tipo cardiaco, denominada tambien en el presente documento H-FABP o protefna cardiaca de union a acidos grasos, es una pequena protefna citosolica que funciona como el transportador principal de acidos grasos de cadena larga en el cardiomiocito, desde la membrana celular a sus sitios intracelulares de metabolismo en las mitocondrias, donde entran en el ciclo del acido citrico. La H-FABP esta presente en el miocardio y generalmente se cree que se libera rapidamente en la circulacion en respuesta a una lesion miocardica. Diversos estudios muestran que H-FABP es un marcador bioquimico temprano de infarto de miocardio, por ejemplo, Okamoto et al., Clin Chem Lab Med 38(3):231-8 (2000) Human heart-type cytoplasmic fatty acid-binding protein (H- FABP) for the diagnosis of acute myocardial infarction. Clinical evaluation of II-FABP in comparison with myoglobin and creatine kinase isoenzyme MB; O’Donoghue et al., Circulation, 114;550-557 (2006) Prognostic Utility of Heart- Type Fatty Acid Binding Protein in patients with acute coronary syndromes o Ruzgar et al., Heart Vessels, 21;209- 314 (2006) The use of human heart-type fatty acid-binding protein as an early diagnostic marker of myocardial necrosis in patients with acute coronary syndrome, and its comparison with troponin T and its creatine kinase- myocardial band).

La mioglobina y H-FABP, tal como se usan en la presente invencion, abarcan tambien respectivamente variantes de polipeptidos de mioglobina y H-FABP. Dichas variantes tienen al menos las mismas propiedades biologicas e inmunologicas esenciales que los polipeptidos especificos de mioglobina y H-FABP. En particular, comparten las mismas propiedades biologicas e inmunologicas esenciales si se pueden detectar en los mismos ensayos especificos a los que se hace referencia en la presente memoria descriptiva, por ejemplo, mediante ensayos ELISA que utilizan anticuerpos policlonales o monoclonales que reconocen respectivamente de forma especifica dichos polipeptidos de mioglobina y H-FABP. Ademas, se debe entender que una variante, tal como se hace referencia de acuerdo con la presente invencion, tendra una secuencia de aminoacidos que difiere debido a al menos una sustitucion, eliminacion y/o adicion de aminoacidos, en la que la secuencia de aminoacidos de la variante sigue siendo, preferentemente, al menos un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % identica, respectivamente, a la secuencia amino de los dichos polipeptidos especificos de mioglobina y H-FABP. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se puede determinar mediante algoritmos que se conocen bien en la tecnica. Preferentemente, el grado de identidad se determina comparando dos secuencias alineadas de forma optimca sobre una ventana de comparacion, en la que el fragmento de la secuencia de aminoacidos de la ventana de comparacion puede comprender adiciones o eliminaciones(es decir, huecos o salientes) en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineacion optima. El porcentaje se calcula determinando el numero de posiciones en las que se produce el residuo de aminoacidos identico en ambas secuencias para producir el numero de posiciones emparejadas, dividiendo el numero de posiciones emparejadas entre el numero total de posiciones en la ventana de comparacion y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Se puede llevar a cabo la alineacion optima de secuencias para comparacion, por ejemplo, mediante el algoritmo de homologia local de Smith y Waterman (Adv. APL. Math. 2:482 (1981)), mediante el algoritmo de alineacion de homologia de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), mediante la busqueda del procedimiento de similitud de Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444 (1988)), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, pAsTA y TFASTA en el Paquete de Software de Genetica de Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspeccion visual. Dado que se han identificado dos secuencias para comparacion, GAP y BESTFIT se emplean preferentemente para determinar su alineacion optima y, por lo tanto, el grado de identidad. Preferentemente, se usan los valores por defecto de 5,00 para el peso de huecos y de 0,30 para la longitud del peso de huecos. Las variantes a las que se ha hecho referencia anteriormente pueden ser variantes alelicas o cualquier otro homologo, paralogo u ortologo especifico de la especie. Ademas, las variantes a las que se hace referencia en el presente documento incluyen fragmentos de los polipeptidos especificos de mioglobina y H-FABP o los tipos de variantes antes mencionados, siempre que estos fragmentos tengan las propiedades inmunologicas y biologicas esenciales que se han mencionado con anterioridad. Dichos fragmentos pueden ser, por ejemplo, productos de degradacion de los polipeptidos de mioglobina y H-FABP. Se incluyen ademas variantes que difieren debido a modificaciones pos-traduccionales tales como fosforilacion o miristilacion. Preferentemente, la propiedad biologica de la mioglobina es la capacidad de unirse de forma reversible a oxigeno. Preferentemente, la propiedad biologica de H-FABP es el transporte de acidos grasos de cadena larga desde la membrana celular hasta sus sitios intracelulares de metabolismo en las mitocondrias, donde entran en el ciclo del acido citrico.

Se debe entender que, de acuerdo con el procedimiento de la presente invencion descrito en el presente documento anteriormente y a continuacion, se pueden usar los anticuerpos para sFLT-1 y, preferentemente ademas, HGF o medios para la determinacion de los mismos para la preparacion de una composicion diagnostica destinada a diagnosticar la isquemia y la evolucion de la gravedad de la misma en un sujeto que muestra los signos y sintomas de sindrome coronario agudo y que tiene una cantidad de una troponina cardiaca inferior a la cantidad considerada como indicativa de un infarto de miocardio.

Por consiguiente, la presente invencion se refiere ademas a un procedimiento para identificar un sujeto susceptible de intervencion cardiaca, en el que el sujeto muestra signos y sintomas de sindrome coronario agudo pero que no cumple los criterios diagnosticos de un infarto de miocardio por tener una cantidad de troponina T determinada en una muestra del sujeto menor de 0,1 ng/ml, que comprende

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(a) determinar la cantidad de sFLT-1 o una variante de la misma en una muestra de dicho sujeto, y

(b) comparar la cantidad de sFLT-1 o una variante de la misma determinada en la etapa a) con al menos una cantidad de referencia,

(c) diagnosticar el estado isquemico basandose en la informacion obtenida en la etapa b), preferentemente en las etapas a) y b), e

(d) identificar el sujeto, basandose en la informacion obtenida en la etapa c), en el que una cantidad de sFLT-1 por debajo de la cantidad de referencia es indicativa de un estado no isquemico no asociado o que no conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible, y una cantidad de sFLT-1 igual a o mayor que la cantidad de referencia es indicativa de un estado isquemico asociado o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible, y en caso de que el valor de sFLT-1 no indique un estado isquemico, el individuo no requiere ningun examen adicional en cuanto a enfermedades cardiacas, y en caso de que se diagnostique una enfermedad isquemica por la cantidad de sFLT-1, el individuo respectivo se somete a una intervencion cardiaca.

Ademas, la presente invencion se refiere tambien a un procedimiento para recomendar o decidir sobre una posible intervencion cardiaca o iniciar una posible intervencion cardiaca en un sujeto que muestra los signos y sintomas de sindrome coronario agudo (SCA) pero que no cumple los criterios diagnosticos de un infarto de miocardio, basandose en la comparacion de las cantidades de tirosina quinasa-1 similar a fms soluble (sFLT-1) o de una variante del mismo en una muestra de dicho sujeto, con respecto a al menos una cantidad de referencia. El procedimiento puede comprender al menos una de las siguientes etapas: a) determinar la cantidad de sFLT-1 o una variante de la misma en una muestra de dicho sujeto, b) comparar la cantidad de sFLT-1 o una variante de la misma determinada en la etapa a) con al menos una cantidad de referencia, c) recomendar o decidir sobre el inicio de una intervencion cardiaca, iniciar la intervencion cardiaca o abstenerse de la intervencion cardiaca, basandose en la informacion obtenida en la etapa c).

Por consiguiente, la presente invencion se refiere a un procedimiento para recomendar o decidir sobre una posible intervencion cardiaca o iniciar una posible intervencion cardiaca en un sujeto que muestra signos y sintomas de sindrome coronario agudo pero que no cumple los criterios diagnosticos de un infarto de miocardio por tener una cantidad de troponina T determinada en una muestra del sujeto menor de 0,1 ng/ml, que comprende

(a) determinar la cantidad de sFLT-1 o una variante de la misma en una muestra de dicho sujeto, y

(b) comparar la cantidad de sFLT-1 o una variante de la misma determinada en la etapa a) con al menos una cantidad de referencia,

(c) diagnosticar el estado isquemico basandose en la informacion obtenida en la etapa b), preferentemente en las etapas a) y b), y

(d) recomendar o decidir sobre el inicio de una intervencion cardiaca, iniciar la intervencion cardiaca o abstenerse de la intervencion cardiaca, basandose en la informacion obtenida en la etapa c), en el que una cantidad de sFLT-1 por debajo de la cantidad de referencia es indicativa de un estado no isquemico no asociado o que no conduce a una disfuncion cardiaca reversible o a una lesion cardiaca no reversible, y una cantidad de sFLT-1 igual a o mayor que la cantidad de referencia es indicativa de un estado isquemico asociado o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible, y en caso de que el valor de sFLT-1 no indique un estado isquemico, el individuo no requiere ningun examen adicional en cuanto a enfermedades cardiacas, y en caso de que se diagnostique una enfermedad isquemica por la cantidad de sFLT-1, el individuo respectivo se somete a una intervencion cardiaca.

En un modo de realizacion del procedimiento anteriormente mencionado de la presente invencion, se determina ademas la cantidad de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) o una variante del mismo en una etapa aa) adicional en una muestra de dicho sujeto y se compara con al menos una cantidad de referencia para HGF en la etapa bb). En consecuencia, en la etapa c), el estado isquemico se diagnostica basandose en las cantidades determinadas de sFLT-1 y de HGF o una variante de los mismos y en la comparacion de la cantidad de sFLT-1 con al menos una cantidad de referencia para sFLT-1 y la comparacion de la cantidad de HGF con al menos una cantidad de referencia para HGF. Preferentemente, primero se determina la cantidad de sFLT-1 y despues la cantidad de HGF, sin embargo, tambien se contempla que las cantidades de sFLT-1 y HGF se determinan en cualquier orden, es decir, simultaneamente, o primero sFLT-1 y luego HGF, o primero HGF y luego sFLT-1.

El estado isquemico del individuo se determina despues de la determinacion de troponina, determinando las cantidades de sFLT-1 y/o HGF u, opcionalmente, del marcador adicional. Por consiguiente, la cantidad de troponina cardiaca se determina antes de la determinacion de sFLT-1 y/o HGF; y la cantidad de sFLT-1 y/o HGF solo se determinara en el caso de que la cantidad de troponina sea inferior a la cantidad que se reconoce generalmente en la tecnica como indicativa de un infarto de miocardio (IM), en particular de un IMSEST. La cantidad de troponina

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cardiaca puede incluso ser cero, es decir, no detectable con los ensayos actualmente disponibles.

En otro modo de realizacion preferido, un ECG del sujeto respectivo se determina simultaneamente a la determinacion de sFLT-1 y/o a la determinacion de HGF; pudiendo preceder la medida de ECG a la determinacion de sFLT-1 y/o a la determinacion de HGF. El estado isquemico del individuo, por lo tanto, se determina preferentemente de forma simultanea o despues del registro de un ECG, determinando las cantidades de sFLT-1 y, opcionalmente, de HGF. Por consiguiente, si el registro del ECG se lleva a cabo antes de la determinacion de sFLT- 1 y/o HGF, la determinacion de las cantidades de sFLT-1 y/o HGF se puede aplazar hasta que se registre el ECG. Preferentemente, la cantidad de sFLT-1 y/o HGF solo se determinara en el caso de que el ECG del sujeto no muestre una elevacion de ST. Preferentemente, en el caso de que ECG muestre una elevacion de ST, se considerara que el sujeto ha sufrido un IMEST, lo que significa que en general no se llevaran a cabo los procedimientos de la presente invencion- dirigidos al diagnostico de un estado isquemico anterior al IM -.

Los modos de realizacion preferidos antes mencionados del procedimiento de la presente invencion se pueden llevar a cabo de manera que solo se determine el nivel de una troponina cardiaca o se registre un ECG; o el procedimiento de la presente invencion incluya tanto la determinacion del nivel de una troponina cardiaca como el registro de un ECG.

Las cantidades de referencia de sFLT-1 y HGF son las citadas previamente para indicar un estado isquemico en un individuo.

Las cantidades de referencia para sFLT-1 que indican estados isquemicos, tal como se definen en la presente invencion (cantidades umbral), son las siguientes: aproximadamente 92 pg/ml, mas preferentemente aproximadamente 109 pg/ml. Las cantidades de sFLT-1 por debajo de los valores citados anteriormente son indicativas de un estado no isquemico no asociado a o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible. Las cantidades de sFLT-1 iguales o mayores que las cantidades de referencia citadas anteriormente son indicativas de un estado isquemico asociado a o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible.

Una cantidad de referencia para HGF para estados isquemicos, tal como se define en la presente invencion (cantidades umbral), son las siguientes: aproximadamente 0,62 pg/ml, mas preferentemente aproximadamente 0,73 pg/ml. Las cantidades de HGF por debajo de los valores citados anteriormente son indicativas de un estado no isquemico no asociado o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible. Las cantidades de HGF iguales o mayores que las cantidades de referencia citadas anteriormente son indicativas de un estado isquemico asociado a o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible.

En el caso de que los valores de sFLT-1 y, opcionalmente, de HGF no indiquen un estado isquemico, el individuo no requiere ningun examen adicional en cuanto a enfermedades cardiacas. En general, el individuo puede ser enviado a casa.

En el caso de que se diagnostique una enfermedad isquemica por las cantidades de sFLT-1 y opcionalmente HGF, el individuo respectivo, en un modo de realizacion preferido de la presente invencion, recibira un regimen de tratamiento como se especifica a continuacion, tambien denominado "intervencion cardiaca".

En el caso de que se diagnostique una enfermedad isquemica por las cantidades de sFLT-1 y opcionalmente HGF, el individuo respectivo puede requerir un examen adicional en cuanto a enfermedades cardiacas o cardiovasculares. En un modo de realizacion preferido, estos procedimientos de diagnostico adicionales en el contexto de la presente invencion incluyen ensayos de esfuerzo de diversos tipos, por ejemplo, p. ej. esfuerzo fisico, ecocardiografia de esfuerzo fisico, tomografia computarizada de esfuerzo fisico, exploracion con talio de esfuerzo fisico y angiografia (invasiva o virtual, por ejemplo, mediante tomografia computarizada en espiral). Dependiendo de los resultados del examen adicional, el individuo respectivo recibira un regimen de tratamiento tal como se especifica a continuacion, tambien denominado "intervencion cardiaca".

En un modo de realizacion preferido adicional de la presente invencion, se determina la cantidad de NT-proANP con el fin de diagnosticar una posible deficiencia circulatoria del sujeto.

Las cantidades de referencia para el peptido de tipo ANP, en particular NT-proANP, son las citadas previamente en relacion con la deficiencia circulatoria. Las cantidades de referencia para NT-proANP para deficiencia circulatoria, tal como se define en la presente invencion (cantidades umbral), son las siguientes: aproximadamente 1320 pg/ml, mas preferentemente aproximadamente 1674 pg/ml. Las cantidades de NT-proANP iguales o mayores que los valores citados anteriormente son indicativas de deficiencia circulatoria.

Otro modo de realizacion de la presente invencion comprende la determinacion de H-FABP y/o mioglobina, despues de determinar una troponina cardiaca y/o registrar un ECG, y antes de determinar los niveles de sFLT-1 y, opcionalmente, de HGF en las etapas a) y b) del procedimiento de la presente invencion, con el fin de determinar si

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el sujeto ha sufrido ya un infarto de miocardio, en particular un IMSEST.

Una cantidad de mioglobina y, opcionalmente, H-FABP, en un sujeto, tal como se define en la presente invencion, que es superior a la cantidad de referencia para confirmar la existencia de IM sera indicativa de una existencia reciente de IM en dicho sujeto. Una cantidad de mioglobina y, opcionalmente, H-FABP en un sujeto, tal como se define en la presente invencion, que es inferior a la cantidad de referencia para descartar la existencia de IM sera un indicador de que no se ha producido recientemente un IM; por lo que dicho sujeto podria sufrir una API. Se debe entender en el contexto de la presente invencion que los sujetos, tal como se definen en la presente invencion, cuya cantidad de mioglobina se encuentre entre los valores de referencia mencionados anteriormente (la cantidad de referencia para confirmar la existencia reciente de IM y la cantidad de referencia para descartar la existencia reciente de IM) pueden requerir un nuevo diagnostico. Preferentemente, esto tambien se puede hacer en sujetos para los que se determinan tanto la cantidad de mioglobina como de H-FABP, en los que ambas cantidades no se corresponden, por ejemplo, una cantidad es mayor (o menor) que la cantidad de referencia respectiva, mientras que la otra cantidad no es mayor (o menor) que la cantidad de referencia respectiva.

Gracias al procedimiento anteriormente mencionado, se puede realizar facilmente una estratificacion de riesgo/exito antes de someter a un paciente a una intervencion cardiaca. En caso de que el paciente resulte no ser susceptible de una intervencion cardiaca, dicho tratamiento peligroso, lento y/o costoso se puede evitar. De esta forma, ademas de evitar que un sujeto sufra los efectos secundarios adversos y graves que acompanan a una intervencion cardiaca, el procedimiento de la presente invencion sera beneficioso para el sistema de salud en el que se ahorraran recursos.

Se debe entender, en el contexto del procedimiento anteriormente mencionado de la presente invencion, que un sujeto al que se le ha diagnosticado que no ha sufrido IM, pero que presenta un estado isquemico o un desarrollo de su estado isquemico que se supone que dara lugar a una disfuncion cardiaca reversible o lesion cardiaca no reversible, es susceptible de intervencion cardiaca.

El termino "identificacion", tal como se usa en el presente documento, significa valorar si un sujeto es susceptible o no de una intervencion cardiaca. Tal como comprenderan los expertos en la tecnica, tal valoracion no suele pretender ser correcta para todos (es decir, 100 %) los sujetos a identificar. El termino, sin embargo, requiere que se pueda identificar una parte estadisticamente significativa de sujetos (por ejemplo, una cohorte en un estudio de cohortes). El experto en la tecnica puede determinar sin mayor problema si una parte estadisticamente significativa utilizando diversas herramientas de evaluacion estadistica bien conocidas, por ejemplo, determinacion de intervalos de confianza, determinacion del valor de p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York, 1983. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %. Los valores de p son, preferentemente, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001. Mas preferentemente, el procedimiento de la presente invencion puede identificar apropiadamente al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de los sujetos de una poblacion.

La expresion "intervencion cardiaca" abarca los regimenes de tratamiento que el experto en la tecnica considere adecuados. La expresion comprende intervenciones quirurgicas, microcirugia, otras terapias invasivas que afectan al sistema cardiovascular y, preferentemente, al corazon, asi como procedimientos conservadores (no quirurgicos) de tratamiento. Los procedimientos conservadores se conocen en la tecnica e incluyen procedimientos no farmacologicos y procedimientos farmacologicos. Los procedimientos farmacologicos se refieren a la administracion de productos farmaceuticos. Los farmacos apropiados incluyen inhibidores de la enzima de conversion de la angiotensina (ECA), en particular Enalapril, Captopril, Ramipril, Trandolapril; antagonistas del receptor de angiotensina y antagonistas de aldosterona, en particular Losartan, Valsartan, Irbesartan, Candesartan, Telmisartan, Eprosartan, Espironolactona; estatinas, en particular Atorvastatina, Fluvastatina, Lovastatina, Pravastatina, Rosuvastatina, Simvastatina; betabloqueantes, tales como proprenolol, metoprolol, bisoprolol, carvedilol, bucindolol, nebivolol; nitratos; agonistas adrenergicos, tales como dobutamina, dopamina, epinefrina, isoprotenerol, norepinefrina, fenilefrina; agentes antiplaquetarios, en particular aspirina y clopidrogel; anticoagulantes, en particular warfarina, heparina, inhibidores de trombina, farmacos trombinoliticos. Preferentemente, las intervenciones cardiacas, tal como se utilizan en el presente documento, son regimenes de tratamiento que tienen como objetivo restablecer el suministro de oxigeno adecuado del corazon. Esto se consigue, preferentemente, restableciendo el flujo sanguineo a traves de los vasos sanguineos que soportan el corazon, es decir, los vasos sanguineos coronarios. Esos vasos sanguineos pueden presentar deficiencias debido, por ejemplo, a placas tromboticas o ateroscleroticas. Por consiguiente, las intervenciones cardiacas comprenderan, preferentemente, una destruccion y/o retirada de dichas placas y una restauracion del vaso, si es necesario. Las intervenciones cardiacas preferentes de acuerdo con la presente invencion se seleccionan entre el grupo que consiste en angioplastia coronaria percutanea, angioplastia coronaria transluminal percutanea con globo, angioplastia con laser, implantacion de endoprotesis vascular coronaria, implantacion de derivacion o tecnicas intraluminales con el objetivo de restablecer el flujo sanguineo, la permeabilidad del vaso, estabilizar la placa y/o reducir la carga de trombo intracoronario.

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En el caso de que un individuo sufra una deficiencia circulatoria (como se indica por niveles elevados de un peptido natriuretico de tipo ANP), la deficiencia circulatoria en general remite cuando se elimina la causa subyacente de la isquemia.

Ademas, la presente divulgacion describe un estuche o dispositivo para llevar a cabo los procedimientos de la presente invencion que comprende medios para determinar la cantidad de sFLT-1 y, opcionalmente, HGF en una muestra de un sujeto y medios para comparar dicha cantidad con al menos una cantidad de referencia.

El termino "estuche", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una coleccion de los medios antes mencionados, preferentemente, proporcionados por separado o en un unico recipiente. El estuche puede ademas comprender medios para determinar la cantidad de una troponina cardiaca. Opcionalmente, el estuche puede comprender adicionalmente un manual del usuario para interpretar los resultados de cualquier medicion con respecto al diagnostico del estado isquemico en un sujeto tal como se define en la presente invencion. En particular, dicho manual puede incluir informacion sobre que cantidades determinadas corresponden a que tipo de diagnostico. Esto se describe en detalle en otra parte de la presente memoria descriptiva. Adicionalmente, dicho manual de usuario puede proporcionar instrucciones sobre el uso correcto de los componentes del estuche para determinar la cantidad de los biomarcadores respectivos.

El termino "dispositivo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un sistema de medios que comprenden al menos los medios mencionados anteriormente conectados operativamente entre si para permitir el diagnostico del estado isquemico o la identificacion de un sujeto susceptible de intervencion cardiaca. La invencion del dispositivo puede ademas comprender medios para determinar la cantidad de una troponina cardiaca. Los medios preferentes para determinar la cantidad de sFLT-1 y HGF y medios para llevar a cabo la comparacion se divulgan anteriormente en relacion con el procedimiento de la invencion. La forma de conectar los medios de una manera operativa dependera del tipo de medios incluidos en el dispositivo. Por ejemplo, cuando se aplican medios para determinar automaticamente la cantidad de los peptidos, los datos obtenidos mediante dichos medios de funcionamiento automatico se pueden procesar, por ejemplo, mediante un programa informatico para obtener los resultados deseados. Preferentemente, en tal caso los medios estan integrados en un unico dispositivo. Dicho dispositivo puede, por consiguiente, incluir una unidad de analisis para la medicion de la cantidad de los peptidos o polipeptidos en una muestra aplicada y una unidad de ordenador para procesar los datos resultantes para la evaluacion. Alternativamente, cuando se usan medios tales como tiras reactivas para determinar la cantidad de los peptidos o polipeptidos, los medios para comparacion pueden comprender tiras de control o tablas que asignan la cantidad determinada a una cantidad de referencia. Las tiras reactivas se acoplan, preferentemente, a un ligando que se une especificamente a los peptidos o polipeptidos a los que se hace referencia en el presente documento. La tira o dispositivo, preferentemente, comprende medios para detectar la union de dichos peptidos o polipeptidos a dicho ligando. Los medios de deteccion preferidos se divulgan en relacion con modos de realizacion relacionados con el procedimiento de la invencion anterior. En tal caso, los medios estan operativamente unidos de forma que el usuario del sistema reune el resultado de la determinacion de la cantidad y el valor diagnostico o pronostico de la misma gracias a las instrucciones e interpretaciones proporcionadas en un manual. Los medios pueden aparecer como dispositivos separados en tal modo de realizacion y, preferentemente, se empaquetan juntos en forma de estuche. El experto en la tecnica apreciara el modo de union de los medios sin mayor problema. Dispositivos preferentes son aquellos que se pueden aplicar sin el conocimiento particular de un medico especialista, por ejemplo, tiras reactivas o dispositivos electronicos que simplemente requieran la carga de una muestra. Los resultados se pueden proporcionar como resultado de datos bruto que requiere interpretacion por parte del medico. Preferentemente, la salida del dispositivo esta, sin embargo, procesada, es decir, evaluada, de forma que no se requiera la interpretacion de los datos en bruto por parte del medico. Otros dispositivos preferidos comprenden las unidades/dispositivos de analisis (por ejemplo, biosensores, matrices, soportes solidos acoplados a ligandos que reconocen especificamente los sFLT-1 o HGF, dispositivos de resonancia de plasmon superficial, espectrometros de RMN, espectrometros de masa, etc.) o las unidades/dispositivos de evaluacion mencionados anteriormente de acuerdo con el procedimiento de la invencion.

La presente divulgacion tambien describe el uso de un estuche o dispositivo para determinar la cantidad de sFLT-1 y, opcionalmente, HGF en una muestra de un sujeto de sFLT-1 y, opcionalmente, HGF y/o medios para determinar la cantidad de sFLT-1 y, opcionalmente, HGF y/o medios para comparar la cantidad de sFLT-1 y, opcionalmente, HGF con al menos una cantidad de referencia para: diagnosticar el estado isquemico en un sujeto que muestra los signos y sintomas de sindrome coronario agudo pero que no cumple los criterios diagnosticos de un infarto de miocardio; y/o monitorizar la gravedad del estado isquemico en dicho sujeto; y/o estratificar/valorar el riesgo de que dicho sujeto sufra de un infarto de miocardio; y/o identificar a dicho sujeto que es susceptible de intervencion cardiaca; y/o decidir sobre la posible intervencion cardiaca de dicho sujeto.

La presente divulgacion tambien describe el uso de al menos un anticuerpo contra sFLT-1 y, opcionalmente, HGF y/o medios para determinar la cantidad de sFLT-1 y, opcionalmente, HGF y/o medios para comparar la cantidad de sFLT-1 y, opcionalmente, HGF con al menos una cantidad de referencia para la fabricacion de una composicion diagnostica para: diagnosticar el estado isquemico en un sujeto que muestra los signos y sintomas de sindrome coronario agudo pero que no cumple los criterios diagnosticos de un infarto de miocardio; y/o monitorizar la gravedad del estado isquemico en dicho sujeto; y/o estratificar/valorar el riesgo de que dicho sujeto sufra de un

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infarto de miocardio; y/o identificar a dicho sujeto que es susceptible de intervencion cardiaca; y/o decidir sobre la posible intervencion cardiaca de dicho sujeto.

Los siguientes Ejemplos ilustran adicionalmente la presente invencion.

Ejemplos

En los ejemplos siguientes, se usaron los siguientes ensayos para la determinacion de las cantidades de los respectivos peptidos:

Se determino la troponina T con la prueba de inmunoensayo de troponina T de alta sensibilidad (hs) de Roche Diagnostics, utilizando el analizador ELECSYS 2010. 1a incubacion: 50 pl de muestra, un anticuerpo monoclonal sometido a tratamiento con biotina anti-troponina T cardiaca y un anticuerpo monoclonal anti-troponina T cardiaca marcado con un complejo de rutenio (Ru(bpy)2+3) reaccionan para formar un complejo tipo intercalado. 2a incubacion: Tras la adicion de micropartfculas revestidas con estreptavidina, el complejo se une a la fase solida a traves de la interaccion de biotina y estreptavidina. La mezcla de reaccion se aspira a la celda de medicion donde las micropartfculas se capturan magneticamente sobre la superficie del electrodo. Las sustancias no unidas se eliminan. La emision quimioluminiscente se induce mediante la aplicacion de una tension al electrodo y se mide mediante un fotomultiplicador. Los resultados se determinan a traves de una curva de calibracion.

El HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) se sometio a ensayo mediante inmunoensayo ligado a enzima (RD Systems, Minneapolis, ref. DHG00) usando un anticuerpo monoclonal especifico para HGF y una microplaca previamente revestida. Se toman los patrones y las muestras haciendo uso de pipetas y se colocan en los pocillos y cualquier HGF presente se une por medio del anticuerpo inmovilizado. Despues de eliminar las sustancias no unidas mediante lavado, se anade a los pocillos un anticuerpo policlonal ligado a enzima especifico para HGF. Despues de un lavado para eliminar cualquier reactivo anticuerpo-enzima no unido, se anade una solucion de sustrato a los pocillos y el color se desarrolla en proporcion a la cantidad de HGF unida en la etapa inicial. Se detiene el desarrollo del color y se mide la intensidad del color.

El NT-proANP se determino con el ensayo ELISA de proANP (B1-20892) obtenido en Biomedica, Viena, Austria. Este ensayo de intercalado comprende un anticuerpo policlonal de oveja especifico para NT-proANP unido a una tira de micro-valoracion. La muestra se anade a la tira de micro-valoracion para que el proANP se pueda unir al anticuerpo. Despues de la union del proANP al primer anticuerpo, se anade al recipiente un segundo anticuerpo especifico de proANP. Este segundo anticuerpo se conjuga con peroxidasa de rabano picante (HRP). Despues de la incubacion, el anticuerpo conjugado con enzima no unido se elimina lavando la tira de micro-valoracion. Finalmente, se anade tetrametilbencidina (TMB) como sustrato para la HRP. Cuanto mas ProANP contiene la muestra, mas anticuerpo conjugado se une. Por lo tanto, la actividad total de HRP presente en el recipiente depende de la cantidad de proANP en la muestra y de la velocidad inicial de conversion de TMB es una medida para la cantidad de NT- proANP en la muestra.

El sFLT-1 se determino con un inmunoensayo sFLT-1 para ser utilizado con los analizadores Elecsys y COBAS de Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania. El ensayo se basa en el principio de intercalado y comprende dos anticuerpos monoclonales de la especie sFLT-1. El primero de ellos esta sometido a tratamiento con biotina y el segundo esta marcado con un complejo tris(2,2'-bipiridil)rutenio(TT). En una primera etapa de incubacion, ambos anticuerpos se incuban con la muestra. Se forma un complejo intercalado que comprende sFLT-1 y los dos anticuerpos diferentes. En una etapa posterior de incubacion se anaden perlas revestidas con estreptavidina a este complejo. Las perlas se unen a los complejos intercalados. La mezcla de reaccion se aspira a continuacion a una celda de medicion en la que las perlas se capturan magneticamente sobre la superficie de un electrodo. La aplicacion de un voltaje induce entonces una emision quimioluminiscente del complejo de rutenio que se mide mediante un fotomultiplicador. La cantidad de luz depende de la cantidad de complejos intercalados presentes en el electrodo.

Los ensayos mencionados tambien se emplean preferentemente en el contexto general de la presente invencion para la determinacion de los respectivos peptidos.

Ejemplo 1. Determinacion de los valores de referenda

149 personas, con una edad media de 42,8 anos se sometieron a ensayos para la presencia de sFLT-1, pro ANP y HGF; tanto en el momento del ensayo como en las 2 semanas anteriores, estaban asintomaticas, especificamente no presentaban dolor toracico, y tampoco habia evidencias de disfuncion cardiaca como indicaron los ensayos de NT-proBNP.

Resultados (veaseTabla 1):

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Tabla 1:

NT-pro ANP sFLT-1 hgf

Mediana

780 pg/ml 52 pg/ml 0,16 pg/ml

25 %

610 pg/ml 42 pg/ml 0,03 pg/ml

75 %

850 pg/ml 71 pg/ml 0,35 pg/ml

95 %

1320 pg/ml 92 pg/ml 0,62 pg/ml

99 %

1674 pg/ml 109 pg/ml 0,73 pg/ml

En el contexto de la presente invencion, se considera preferentemente el percentil 95 como un valor de referencia apropiado: Se considera que los individuos que muestran valores de marcador por encima del mismo sufren un estado isquemico. Mas preferentemente, el percentil 99 define el valor de referencia indicativo de un estado isquemico. Con respecto a NT-proANP, se considera asimismo preferentemente el percentil 95 y mas preferentemente el percentil 99 como el valor de referencia que define que valores son indicativos de una deficiencia circulatoria.

Ejemplo 2: sFLT-1, HGF y NT-proANP en paoientes con dolor toraoioo y sospecha de sindrome coronario agudo

Se incluyeron en el estudio un total de 33 pacientes (edad media de 62 anos, intervalo de 47 - 72 anos, 21 varones, 12 mujeres) que presentaban signos y sintomas de sindrome coronario agudo en urgencias dentro de las 2 horas posteriores a la aparicion de los sintomas. 14/33 tenian un historial familiar de enfermedad arterial cronica y 21/33 tenian una enfermedad establecida de las arterias coronarias, 5/33 informaron sobre un infarto de miocardio previo. Todos los pacientes tenian una funcion renal normal determinada por creatinina serica, los niveles de H-FABP y mioglobina estuvieron por debajo del valor de corte para infarto de miocardio (IM) futuro (vease documentos WO 2008/145689, WO 2009/033831). Los pacientes incluidos en el analisis fueron los pacientes que no cumplian los criterios de IMSEST al final del seguimiento. Todos los pacientes cumplian los criterios del Grupo de Trabajo Conjunto ESC/ACCF/AHA/WHF para la Redefinicion del Infarto de Miocardio (The Joint European Society of Cardiology / American College of Cardiology Committee: Universal definition of myocardial infarction, European Heart Journal (2007), loc. cit.), en cuanto a que todas las muestras en las que se midio la cantidad de troponina estuvieron por debajo del percentil 99 (0,14 ng/ml, media de 0,079 ng/ml) en todos los momentos temporales medidos y durante el intervalo de tiempo recomendado (en la presentacion y (al menos) 6-9 horas despues de la presentacion).

Ninguno de los pacientes presento aumento en los niveles de mioglobina, H-FABP o NT-proBNP (mas/menos un 20 %) durante el periodo de observacion. Por lo tanto, ninguno de los pacientes seleccionados para el presente estudio mostro un infarto de miocardio de acuerdo con las directrices actuales. Se observaron cambios en el nivel de sFLT-1/HGF en 27 pacientes y no se produjeron cambios en 6 pacientes, lo que indica que 27 pacientes presentaron evidencia bioquimica de isquemia y 6 pacientes carecieron de dichos signos. Se observaron cambios agudos en la funcion circulatoria en 11 pacientes, tal como se indica en los cambios en las concentraciones de NT-proANP. Los cambios agudos en la funcion circulatoria solo se observaron en pacientes con evidencia analitica de isquemia.

Las muestras de suero se extrajeron por puncion venosa, se centrifugaron en un plazo de 30 minutos y el sobrenadante del suero se mantuvo a -20 °C hasta su analisis.

Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La Tabla 2 ilustra los cambios observados en sFLT-1 y/o HGF en 33 pacientes que presentan sindrome coronario agudo y sin desarrollo de infarto de miocardio.

La Tabla 3 presenta los resultados individuales de pacientes seleccionados.

El paciente n.° 14 presento evidencia bioquimica de isquemia, tal como viene indicado por una concentracion aumentada de HGF y sFLT-1. En el transcurso de la observacion, los niveles de sFLT-1 y HGF disminuyeron indicando una reversion de la evidencia bioquimica de isquemia que fue compatible con el alivio del dolor en este paciente sin medicacion adicional (el paciente recibio nitroglicerina en pulverizacion por parte del medico de emergencias antes de presentarse en urgencias). Los niveles de pro ANP aumentaron ligeramente durante el periodo de observacion, indicando que el episodio no habia provocado cambios funcionales agudos significativos.

El paciente n.° 21 presento signos y sintomas de SCA que volvieron a aparecer durante aproximadamente 5 minutos durante la visita en urgencias, mientras que el nivel de sFLT-1 aumento ligeramente en la presentacion, luego disminuyo y nuevamente aumento, lo que resulto compatible con el dolor toracico observado durante el periodo de

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observacion. El dolor toracico inicial se asocio a cambios funcionales significativos, tal como viene indicado por un aumento significativo de los niveles de pro ANP poco despues de la presentacion. Esto fue compatible con una taquicardia ventricular observada (durante aproximadamente 30 segundos) en la ambulancia durante el traslado a urgencias.

El paciente n.° 40 presento un episodio grave de isquemia confirmado por un incremento de los niveles de sFLT-1 y HGF con respecto a las cantidades de referencia definidas anteriormente; el paciente tambien mostro evidencias de cambios funcionales agudos, tal como viene indicado por un aumento significativo de los niveles de pro ANP una hora despues de la presentacion en urgencias. El uso de nitroglicerina en pulverizacion hizo desaparecer los sintomas de isquemia, asi como la evidencia bioquimica de isquemia, por lo que los pacientes no desarrollaron infarto de miocardio.

El paciente n.° 42 fue admitido en urgencias con signos y sintomas de SCA; en el momento de la presentacion, se observaron niveles significativamente elevados de sFLT-1 y HGF cuando se compararon con las cantidades de referencia definidas con anterioridad. Durante el seguimiento, los niveles de sFLT-1 y HGF disminuyeron lentamente, indicando isquemia grave inicial seguida de isquemia moderada que finalmente remitio. Se observo un ligero aumento de los niveles de pro ANP en la presentacion y a las 24 h de seguimiento.

El paciente n.° 43 presento signos y sintomas de SCA, que ya no estaban presentes cuando acudio a urgencias. Tenia niveles ligeramente elevados de sFLT-1 y HGF en relacion con las cantidades de referencia definidas anteriormente, pero sin signos bioquimicos definidos de isquemia. Sus niveles de pro ANP no cambiaron durante el periodo total de observacion. Basandose en la presentacion clinica, finalmente se considero que sufria sintomas no cardiacos, aunque se sabia que este paciente presentaba una enfermedad conocida de las arterias coronarias.

El paciente n.° 52 se presento con SCA todavia presente en el momento de su presentacion en urgencias. Fue tratado con nitroglicerina en pulverizacion y los sintomas desaparecieron. Durante la monitorizacion por ECG en urgencias, no se reconocio una arritmia significativa. La evidencia bioquimica de isquemia fue reversible, como lo demuestran las mediciones de sFLT-1 y HGF (los niveles de marcador aumentaron o disminuyeron, dependiendo del grado de isquemia). Se observaron ligeros cambios en los niveles de pro ANP durante la presentacion en urgencias.

Los pacientes no desarrollaron infarto de miocardio.

Tabla 2:

N,2 de paciente

intervalo de tiempo (horas) despues de la presentacion TnT (ng/ml) HGF (pg/ml) sFLT-1 (pg/ml) NT-proANP (pg/ml)

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0 0,0052 37,44 6631,95 4115,65

1 0,0059 11,49 1668,09 4500,56

2 0,0061 7,11 680,64 5151,40

3 0,0058 7,93 717,12 5900,91

21

0 0,0049 1,89 431,66 <635

1 0,0058 0,88 83,96 36963,76

2 0,0042 0,70 431,00 45324,67

3 0,0061 1,01 71,90 31076,23

4 0,0057 1,16 17,10 25059,18

40

2 0,0112 55,34 359,75 <635

3 0,0109 6425,50 6463,30

4 0,0118 35,87 4315,16 6168,70

5 0,0121 23,94 2715,41 5628,02

<24 h p1 0,0109 0,77 182,78 7271,33

42

0 0,0121 21,50 9041,81 23094,70

1 0,0139 11,96 4677,82 18533,80

2 0,0132 8,69 1561,08 15476,21

3 0,0119 7,04 1150,10 16769,73

4 0,0108 8,36 1203,32 17845,08

5 0,0112 8,45 1083,85 16433,54

6 0,0098 7,87 1070,64 16842,25

<24 h pl 0,0101 1,31 176,77 25900,17

43

0 0,0046 0,80 128,98 16689,61

2 0,0042 0,63 117,12 15619,63

3 0,0039 0,67 117,12 19013,81

4 0,0041 0,65 117,12 18435,65

52

0 0,0098 17,08 45,02 15668,18

2 0,0106 16,42 2329,96 24974,49

3 0,0111 9,06 1315,80 21617,98

4 0,0131 7,28 941,52 19231,37

5 0,0129 7,05 816,68 15239,65

Tabla 3: Numero de pacientes que muestran cambios en sFLT-1 y/o NT-proANP de al menos un 20 % con respecto a los valores basales

Cambio en sFLT-1 Cambio en NT-proANP

si 27 6

no 6 0

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Ejemplo comparative 1: sFLT-1, HGF y NT-proANP en pacientes con IM

22 pacientes que desarrollaron infarto de miocardio mostraron concentraciones de troponina T que no cumplian los criterios del Grupo de Trabajo Conjunto ESC/ACCF/AHA/WHF para la Redefinicion del Infarto de Miocardio (The 10 Joint European Society of Cardiology / American College of Cardiology Committee: Universal definition of myocardial infarction, European Heart Journal (2007), loc. cit.), aunque 4 pacientes (incluido el paciente n.° 2, Tabla 4) mostraron una concentracion de troponina T por encima del percentil del 99 % de una poblacion de referencia normal. La poblacion de referencia que desarrolla IM simplemente ilustra que todos los pacientes que desarrollaron IM presentaron niveles mayores de sFLT-1 y HGF en comparacion con la poblacion de referencia sana, tal como se 15 indica en la Tabla 1 (y por lo tanto sirve como "control positivo") en el presente estudio.

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En todos los pacientes, los niveles de sFLT-1, HGF y pro ANP se incrementaron al comienzo del estudio en comparacion con las cantidades de referencia definidas anteriormente (dos de estos pacientes se muestran en la Tabla 4). 6 pacientes recibieron un diagnostico de IMEST (es decir, cumplieron los criterios de IMSEST de acuerdo con el Grupo de Trabajo Conjunto ESC/ACCF/AHA/WHF para la Redefinicion del Infarto de Miocardio (The Joint European Society of Cardiology / American College of Cardiology Committee: Universal definition of myocardial infarction, European Heart Journal (2007), loc. cit.) al final del seguimiento). El resto de los pacientes presentaron IMSEST de acuerdo con el Grupo de Trabajo Conjunto ESC/ACCF/AHA/WHF para la Redefinicion del Infarto de Miocardio.

Paciente n.° 1: se presento con signos y sintomas de SCA, en la presentacion mostro elevacion de los niveles de sFLT-1 y HGF en relacion con las cantidades de referencia definidas anteriormente que disminuyeron durante el seguimiento y despues de que remitieran los signos de isquemia. 4 h despues de la presentacion en el hospital, los niveles de troponina T aumentaron, al igual que los niveles de NT-proANP como signo de cambio funcional agudo. Debido a los niveles crecientes de troponina T, el paciente fue sometido a angiografia coronaria y se le implanto una endoprotesis vascular.

Paciente n.° 2: se presento con signos y sintomas de SCA, que todavfa estuvieron presentes cuando acudio a urgencias. En ECG, mostro elevacion de ST en II, III y a VF, indicando un infarto de miocardio de la pared posterior del ventriculo izquierdo. Presentaba niveles muy elevados de sFLT-1 y HGF en relacion con las cantidades de referencia definidas anteriormente, el nivel de troponina T se incremento en comparacion con la cantidad de referencia definida anteriormente, pero no se diagnostico IMSEST en ese momento. Se programo inmediatamente una angiografia, justo antes de la intervencion se obtuvo una segunda muestra que mostraba un aumento en los niveles de NT- proANP y troponina T y niveles continuamente elevados de hGf y sFLT-1 con respecto a las cantidades de referencia definidas con anterioridad. En la angiografia, se implanto una endoprotesis vascular y se restablecio el flujo coronario.

Los resultados se muestran en la Tabla 4 siguiente.

Tabla 4: sFLT-1, HGF y NT-proANP en pacientes con IM

N,2 de paciente

Diagnostico Intervalo de tiempo (horas) despues de la presentacion en el hospital TnT hs (pg/ml) NT-proANP (pg/ml) HGF (ng/ml) sFLT-1 (pg/ml)

1

imsest 0 1,81 4611,05 7,21 2160,48

imsest 4 horas 20,33 6431,66 1,51 274,03

2

imest 0 22,03 13826,19 62,64 7382,76

imest 2,5 horas 481,41 27423,76 57,25 6673,91

Los datos muestran que las cantidades de sFLT-1 y HGF son mas elevadas en la isquemia mas grave (IMEST vs. IMSEST). Los niveles de sFLT-1 y HGF proporcionan informacion a corto plazo sobre el estado isquemico, como se puede apreciar por el hecho de que sus respectivas cantidades disminuyen incluso en pacientes con IMEST despues de varias horas. Los datos muestran, ademas, que la isquemia puede causar una disfuncion circulatoria, como viene indicado por los niveles elevados de NT-proANP.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   reivindicaciones

   1. Un procedimiento para diagnosticar un estado isquemico de un sujeto que muestra signos y sintomas de sindrome coronario agudo pero que no cumple los criterios diagnosticos de un infarto de miocardio por tener una cantidad de troponina T determinada en una muestra del sujeto menor de 0,1 ng/ml, que comprende

   (a) determinar la cantidad de tirosina quinasa-1 similar a fms soluble (sFLT-1) en una muestra de dicho sujeto,

   (b) comparar la cantidad de sFLT-1 determinada en la etapa a) con al menos una cantidad de referencia, y

   (c) diagnosticar el estado isquemico basandose en la informacion obtenida en la etapa b), en el que una cantidad de sFLT-1 por debajo de la cantidad de referencia es indicativa de un estado no isquemico no asociado o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible, y una cantidad de sFLT-1 igual a o mayor que la cantidad de referencia es indicativa de un estado isquemico asociado o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible.
2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que adicionalmente se determina la cantidad de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y se compara con un valor de referencia para HGF.
3. 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que la cantidad de referencia para sFLT-1 indicativa de un estado isquemico es de aproximadamente 92 pg/ml, mas preferentemente de aproximadamente 109 pg/ml.
4. 4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que una cantidad de referencia para HGF es aproximadamente 0,62 pg/ml, mas preferentemente 0,73 pg/ml, en el que una cantidad de HGF por debajo de la cantidad de referencia es indicativa de un estado no isquemico no asociado o que no conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible, y una cantidad de HGF igual a o mayor que la cantidad de referencia es indicativa de un estado isquemico asociado o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible.
5. 5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el procedimiento comprende adicionalmente determinar la cantidad de un peptido de tipo ANP, preferentemente NT-proANP en la muestra para la determinacion de una deficiencia circulatoria en el sujeto.
6. 6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que una cantidad de NT-proANP igual a o mayor que aproximadamente 1320 pg/ml, mas preferentemente aproximadamente 1674 pg/ml, es indicativa de una deficiencia circulatoria.
7. 7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el procedimiento comprende adicionalmente medir un ECG del sujeto respectivo.
8. 8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el procedimiento comprende adicionalmente la determinacion de una mioglobina y/o proteina cardiaca de union a acidos grasos (H-FABP) en la muestra.
9. 9. Un procedimiento para monitorizar el estado isquemico de un sujeto que muestra signos y sintomas de sindrome coronario agudo pero que no cumple los criterios diagnosticos de un infarto de miocardio por tener una cantidad de troponina T determinada en una muestra del sujeto menor de 0,1 ng/ml, que comprende las etapas de

   (a) determinar las cantidades de tirosina quinasa-1 similar a fms soluble (sFLT-1) en una muestra de dicho sujeto en al menos en dos momentos temporales diferentes, y

   (b) comparar las cantidades de sFLT-1 determinadas en la etapa a) con al menos una cantidad de referencia, y

   (c) diagnosticar el estado isquemico en al menos en dos momentos temporales diferentes, basandose en la informacion obtenida en la etapa b) para monitorizar el estado isquemico, en el que una cantidad de sFLT-1 por debajo de la cantidad de referencia es indicativa de un estado no isquemico no asociado o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible, y una cantidad de sFLT-1 igual a o mayor que la cantidad de referencia es indicativa de un estado isquemico asociado o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o una lesion cardiaca no reversible.
10. 10. Un procedimiento para identificar un sujeto susceptible de intervencion cardiaca, en el que el sujeto muestra signos y sintomas de sindrome coronario agudo pero que no cumple los criterios diagnosticos de un infarto de miocardio por tener una cantidad de troponina T determinada en una muestra del sujeto menor de 0,1 ng/ml, que comprende

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    (a) determinar la cantidad de sFLT-1 en una muestra de dicho sujeto, y

    (b) comparar la cantidad de sFLT-1 determinada en la etapa a) con al menos una cantidad de referencia,

    (c) diagnosticar el estado isquemico basandose en la informacion obtenida en la etapa b), e

    (d) identificar el sujeto, basandose en la informacion obtenida en la etapa c), en el que una cantidad de sFLT-1 por debajo de la cantidad de referencia es indicativa de un estado no isquemico no asociado o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o a una lesion cardiaca no reversible, y una cantidad de sFLT-1 igual a o mayor que la cantidad de referencia es indicativa de un estado isquemico asociado o que conduce a una disfuncion cardiaca no reversible o una lesion cardiaca no reversible, y en caso de que el valor de sFLT-1 no indique un estado isquemico, el individuo no requiere ningun examen adicional en cuanto a enfermedades cardiacas, y en caso de que se diagnostique una enfermedad isquemica por la cantidad de sFLT-1, el individuo respectivo se somete a una intervencion cardiaca.
11. 11. Un procedimiento para recomendar o decidir sobre una posible intervencion cardiaca o iniciar una posible intervencion cardiaca en un sujeto que muestrea signos y sintomas de sindrome coronario agudo pero que no cumple los criterios diagnosticos de un infarto de miocardio por tener una cantidad de troponina T determinada en una muestra del sujeto menor de 0,1 ng/ml, que comprende

    (a) determinar la cantidad de sFLT-1 en una muestra de dicho sujeto, y

    (b) comparar la cantidad de sFLT-1 determinada en la etapa a) con al menos una cantidad de referencia,

    (c) diagnosticar el estado isquemico basandose en la informacion obtenida en la etapa b), y

    (d) recomendar o decidir sobre el inicio de una intervencion cardiaca, iniciar la intervencion cardiaca o abstenerse de la intervencion cardiaca, basandose en la informacion obtenida en la etapa c), en el que una cantidad de sFLT-1 por debajo de la cantidad de referencia es indicativa de un estado no isquemico no asociado o que conduce a una disfuncion cardiaca reversible o a una lesion cardiaca no reversible, y una cantidad de sFLT-1 igual a o mayor que la cantidad de referencia es indicativa de un estado isquemico asociado o que conduce a una disfuncion cardiaca no reversible o una lesion cardiaca no reversible, y en caso de que el valor de sFLT-1 no indique un estado isquemico, el individuo no requiere ningun examen adicional en cuanto a enfermedades cardiacas, y en caso de que se diagnostique una enfermedad isquemica por la cantidad de sFLT-1, el individuo respectivo se somete a una intervencion cardiaca.
12. 12. El procedimiento segun la reivindicacion 11, en el que la intervencion cardiaca se selecciona entre el grupo de: administracion de productos farmaceuticos; angioplastia coronaria percutanea, angioplastia coronaria transluminal percutanea con globo, angioplastia con laser, implantacion de endoprotesis vascular coronaria, implantacion de derivacion o tecnicas intraluminales con el objetivo de restablecer el flujo sanguineo, la permeabilidad del vaso, estabilizar la placa y/o reducir la carga de trombo intracoronario.