CN1402733A - 血管生成蛋白及其应用 - Google Patents

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胡静珊
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Abstract

本发明公开了人血管生成多肽、其生物活性的、诊断或治疗有用的片段、类似物或衍生物，以及编码所述血管生成多肽的DNA(RNA)。还提供了经重组技术生产这些多肽的方法，以及这些多肽的抗体、激动剂和拮抗剂。这些多肽和多核苷酸可治疗性应用而刺激伤口愈合和血管组织修复。本发明还提供了使用抗体和拮抗剂抑制肿瘤血管发生因而抑制肿瘤生长、炎症、糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎和银屑病的方法。本发明还涉及使用抗体和激动剂促进血管发生和淋巴管发生的方法。拮抗剂还可用于治疗由血管通透性增加引起的慢性炎症。除了这些疾病，拮抗剂还可用于治疗与糖尿病相关的视网膜病、类风湿性关节炎和银屑病。激动剂和/或拮抗剂可与药物可接受载体例如本文描述的载体组合在组合物中使用。

Description

血管生成蛋白及其应用
                 发明背景
发明领域
本发明涉及血管生成蛋白，及血管生成蛋白的激动剂或拮抗剂。本发明还涉及鉴别血管生成蛋白活性的激动剂或拮抗剂的筛选方法。
相关现有技术
新血管形成，或称血管发生是胚胎发育，生长及组织修复所必需的。血管法生也是某些病理变化如瘤(即肿瘤和神经胶质瘤)的基本部分。异常血管发生与其它疾病如炎症，类风湿性关节炎，银屑病，和糖尿病视网膜病变相关〔Flkman，J.和Klagsbrun，M.，科学235：442-447(1987)〕。
酸性和碱性成纤维细胞生长因子分子均是内皮细胞和其它类型细胞的促分裂原。Angiotropin和血管生成素能诱导血管发生，尽管其功能还不清楚〔Flkman，J.，癌症医学，Lea和Febiger出版社，pp153-170(1993)〕。血管内皮细胞的高度选择性促分裂原是血管内皮细胞生长因子或VEGF〔Ferrara，N.等，内分泌研究13：19-32(1992)〕，其还已知是血管通透性因子(VPF)。
血管内皮生长因子是一种分泌的血管生长促分裂原，其靶细胞特异限定为血管内皮细胞。小鼠VEGF基因已经定性，且其在胚胎发生中的表达模式已经分析。VEGF的持续表达在透明内皮细胞附近的上皮细胞中观测到，例如在脉络膜血管和肾小球中。此资料与VEGF作为内皮细胞生长与分化的多重调节剂的作用相一致〔Breier，G.等，发育114：521-532(1992)〕。
VEGF与血小板衍生的生长因子，PDGFa和PDGFb呈序列同源〔Leung，D.W.，等，科学246：1306-1309(1989)〕。同源程度分别为大约21％和23％。有助于二硫键形成的8个半胱氨酸残基在这些蛋白质中是严格保守的。尽管是相似的，但在VEGF和PDGF之间仍有特异差别。PDGF是结缔组织的主要生长因子，而VEGF对内皮细胞是高度特异性的。VEGF和PlGF及PDGF的可变剪接的mRNAs已经鉴别，且这些不同剪接产物的生物活性和受体结合特异性不同。VEGF和PDGF有同源二聚体或异源二聚体功能，并与受体结合，且在受体二聚体化之后激发内在的酪氨酸激酶活性。
由于可变剪接，VEGF有121，165，189，和206个氨基酸的4种不同形式。VEGF121和VEGF165是可溶的，并能促进血管发生，而VEGF189和VEGF206在细胞表面与含有蛋白聚糖的肝素结合。VEGF的时间和空间表达与血管的生理增殖相关〔Gajdusek，C.M.，和Carbon，S.J.，细胞生理139：570-579(1989)；McNeil，P.L.，等，细胞生物学杂志109：811-822(1989)〕。其高亲和性结合位点只位于组织切片中的内皮细胞中〔Jakeman，L.B.，等，Clin.Invest.89：244-253(1989)〕。此因子可分离自垂体细胞及一些肿瘤细胞系，并包含于一些人体神经胶质瘤中〔Plate，K.H.，自然359：845-848(1992)〕。令人感兴趣的是VEGF121或VEGF165的表达授与中国仓鼠卵巢细胞在裸鼠体内形成肿瘤的能力〔Ferrara，N.等，临床研究杂志91：160-170(1993)〕。通过抗VEGF单克隆抗体对VEGF功能的抑制示出在免疫缺陷小鼠中抑制肿瘤生长〔Kim，K.J.，自然362：841-844(1993)〕。另外，VEGF受体的显性阴性的突变体示出在小鼠体内抑制神经胶质瘤生长。
也发现血管通透性因子(VPF)即使在创伤停止后，仍可对血浆蛋白有持续微血管高通透性应答，这是正常伤口愈合的一个典型特征。由此推测VPF是伤口愈合的一个重要因子。Brown，L.F.等，实验医学杂志176：1375-1379(1992)。
VEGF的表达在血管性组织(如肺，心，胎盘和固体肿瘤)中较高，并与时间性及空间性血管发生相关。VEGF还示出在体内诱导血管发生。由于血管发生是正常组织尤其脉管组织修复所必需的，因此VEGF已用于促进脉管组织修复(如在动脉粥样硬化中)
在1991年12月17日授权的Chen等的美国专利No.5073492中，揭示了一种在适当环境中协同性增强内皮细胞生长的方法，包括在环境中加入VEGF，效应器和血清衍生的因子。同样，血管内皮细胞生长因子C亚单位DNA已通过聚合酶链反应制备。此DNA编码的蛋白质可以是异源二聚体或同源二聚体。此蛋白质是一种哺乳动物血管内皮细胞促分裂原，并由此用于促进血管发育和修复，如1992年4月30日公布的欧洲专利申请No.92302750.2所述。
近年增加到血管内皮生长因子家族的蛋白质包括VEGF-3，VEGF-D和VEGF-E。VEGF-3生长因子是促进血管内皮细胞和/或中胚层细胞增殖的强促分裂原，如在1996年12月12日出版的Hu等的国际出版物No.WO96/39421所述。VEGF-D是血管内皮细胞生长因子家族的另一成员，并具有刺激和/或增强内皮细胞增殖或分化的能力，如1998年2月26日出版的国际出版物No.WO98/07832所揭示。最近Meyer等公布了一种血管内皮生长因子家族的新成员，称为VEGF-E。VEGF-E是一种潜在的血管生成因子，其选择性地与VEGF受体-2(KDR)结合〔Meyer等，EMBO杂志，18：363-374(1999)〕。
因此，需要促进或抑制血管生成蛋白的疗法。
                 发明概述
本发明涉及VEGF/PDGF蛋白质家族的成员及相关蛋白质，统称为“血管生成蛋白”或“血管生成多肽”，以及涉及血管生成蛋白的激动剂和/或拮抗剂。
根据本发明的另一方面，提供了利用这种多肽或编码这种多肽的多核苷酸，例如治疗性用于刺激血管发生，伤口愈合，损伤的骨和组织的生长，及促进血管组织修复的方法。尤其提供了利用这种多肽或编码这种多肽的多核苷酸治疗周围动脉疾病的方法，如治疗关键肢体局部缺血和冠状动脉缺血性心脏病。根据本发明的另一方面，提供了这种多肽的激动剂，其可用于增强这种多肽的作用，如促进血管发生，淋巴管发生，或促进血管组织修复。本发明还涉及编码多肽的抗原性或免疫原性表位的上述多肽的变体。
根据本发明的另一方面，提供了这种多肽的激动剂，其可用于增强或促进这种多肽的作用，例如阻止肿瘤血管发生，并因此抑制肿瘤生长，治疗糖尿病视网膜病变，炎症，类风湿性关节炎，和银屑病。根据本发明的又一方面，提供了这种多肽的激动剂，其可用于增强这种多肽的作用，例如促进血管发生，淋巴管发生，或促进血管组织修复。
根据本发明的另一方面，提供了抗这种多肽的抗体，和生产这种抗体的方法。根据本发明的又一方面，提供了利用这抗体治疗性用途的方法例如刺激血管生成，伤口愈合，损伤的骨和组织生长，促进血管组织修复，及刺激淋巴管发生。尤其提供了利用这种抗体治疗周围动脉疾病如关键肢体局部缺血和冠心病。
根据本发明的另一方面，提供了这种多肽的拮抗剂，其可用于抑制这种多肽的作用，例如阻止肿瘤血管生成并因此抑制肿瘤生长，治疗糖尿病视网膜病变，炎症，类风湿性关节炎和银屑病。
根据本发明的另一方面，提供了新的成熟多肽及其具有生物活性和诊断性或治疗性用途的片段，类似物和衍生物。本发明的多肽是人源的。
根据本发明的另一方面，提供了分离的核酸分子，其包含编码全长或截短的具有表1所示氨基酸序列的血管生成多肽的多核苷酸。本发明还涉及血管生成蛋白的生物活性及诊断或治疗性用途的片段，类似物和衍生物。
根据本发明的另一方面，提供了通过重组方法生产这种多肽的方法，包括在促进所述蛋白质表达的条件下，培养含有编码本发明多肽的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞，随后回收所述蛋白质。
根据本发明的又一方面，提供了包含足够长而特异杂交本发明的核酸序列的核酸分子的核酸探针。根据本发明的另一方面，提供了诊断与本发明的核酸序列或由此核酸序列编码的蛋白质中突变相关的疾病，或对此疾病易感的方法。
根据本发明的另一方面，提供了一种利用这种多肽或编码这种多肽的多核苷酸进行与科学研究、DNA合成及DNA载体生产等体外目的的方法。
根据本发明的另一方面，提供了筛选血管生成蛋白的激动剂和/或拮抗剂的方法，这些激动剂和/或拮抗剂可增强或抑制所需活性。
本发明的这些及其它方面本领域技术人员通过本文教导将显而易见。
附图简述
以下附图举例说明了本发明的实施方案，并无限制本发明权利要求所涵盖的范围。
图1A-1E示出VEGF2的全长核苷酸(SEQ ID NO：15)和推导的氨基酸(SEQ ID NO：16)序列。此多肽包含大约419个氨基酸残基，其中23个代表前导序列。使用标准单字母缩写形式。用Model373自动DNA测序仪(应用生物系统公司)进行测序。序列精确性预计高于97％。
图2A-2D示出VEGF2的截短的生物活性形式的核苷酸(SEQID NO：25)和推导的氨基酸(SEQ ID NO：26)序列。此多肽包含大约350个氨基酸残基，其中前24个氨基酸代表前导序列。
图3A-3C举例说明了在以下序列间的氨基酸序列同源性：PDGF-A(SEQ ID NO：2)，PDGF-B(SEQ ID NO：4)，P1GF(SEQID NO：6)，PlGF-2(SEQ ID NO：8)，GDGF(SEQ ID NO：10)，VEGF(SEQ ID NO：12)，VEGF-A(SEQ ID NO：14)，VEGF-2(SEQ ID NO：16)，VEGF-3(SEQ ID NO：18)，VEGF-D(SEQID NO：20)，VEGF-D1(SEQ ID NO：22)，和VEGF-E(SEQ IDNO：24)。框区代表保守的序列和8个保守的半胱氨酸残基的位置。
优选实施方案详述定义：
根据本发明的一方面，提供了多肽分子，其包含PDGF和VEGF家族的成员。更特别地，PDGF和VEGF家族成员包括：血小板衍生的生长因子A(PDGF-A)(SEQ ID NO：1-2)，如欧洲专利号EP-682110所揭示；血小板衍生的生长因子B(PDGF-B)(SEQ IDNO：3-4)，如欧洲专利号EP-282317所揭示；胎盘生长因子(PlGF)(SEQ ID NO：5-6)，如国际出版物WO92/06194所揭示；胎盘生长因子2(PlGF-2)(SEQ ID NO：7-8)，如Hauser等，生长因子4：259-268(1993)；神经胶质瘤衍生的生长因子(GDGF)，如欧洲专利号EP-399816所揭示(SEQ ID NO：9-10)；血管内皮生长因子(VEGF)(SEQ ID NO：11-12)，如国际出版物WO90/13649所揭示；血管内皮生长因子A(VEGF-A)(SEQ ID NO：13-14)，如欧洲专利号EP-506477所揭示；血管内皮生长因子2(VEGF-2)(SEQ ID NO：15-16)，如国际出版物WO96/39515所揭示；血管内皮生长因子3(VEGF-3)(SEQ ID NO：17-18)，如国际出版物WO96/39421所揭示；血管内皮生长因子D(VEGF-D)(SEQ IDNO：19-20)，如国际出版物WO98/07832所揭示；血管内皮生长因子D1(VEGF-D1)(SEQ ID NO：21-22)，如国际出版物WO98/02543所揭示；和血管内皮生长因子E(VEGF-E)(SEQ ID NO：23-24)，如德国专利DE19639601所揭示，并在此统称为“血管生成蛋白”或“血管生成多肽”。以上所述参考文献在此以其全文并入参考。
本文所用术语“激动剂”是指促进或增强血管生成蛋白所需活性的任何多核苷酸，多肽，抗体或分子，包括小分子。本文所用术语“拮抗剂”是指削弱或抑制血管生成蛋白所需活性的任何多核苷酸，多肽，抗体或分子，包括小分子。
本文所用术语“所需活性”是指与血管生成蛋白的天然活性相关的，激动剂和/或拮抗剂促进内皮细胞增殖(血管生成或淋巴管发生)，或抑制内皮细胞增殖(血管生成或淋巴管发生)的活性。血管生成蛋白的激动剂和拮抗剂：
本发明涉及血管生成蛋白的激动剂和/或拮抗剂。
血管生成蛋白激动剂的一实施方案包括抗体，其结合多肽并促进或增强所需活性。这些激动剂例如包括特异血管生成多肽的单克隆或多克隆抗体，其结合血管生成多肽并促进这些多肽的血管生成活性，例如通过稳定血管生成蛋白的二聚体化形式，或通过聚集结合抗体的多肽，从而浓缩或集中血管生成多肽的活性。
另一潜在的血管生成蛋白激动剂包括促进或增强血管生成蛋白活性的小分子。这种小分子激动剂可参与例如与血管生成蛋白受体，或者相关的受体的结合，并从而增强血管生成蛋白的活性。
在另一实施方案中，血管生成蛋白激动剂包括增强血管生成蛋白活性的多肽。这种多肽激动剂可包含于与血管生成蛋白结合受体中，或者例如相关的受体中，并从而增强血管生成蛋白的活性。
另外血管生成蛋白激动剂例如包括促进或增强血管生成蛋白所需活性的反义构建。
潜在的血管生成蛋白拮抗剂包括与多肽结合并有效刺激血管蛋白活性的抗体，或者在一些情况中的寡核苷酸。或者，潜在的拮抗剂可以是结合血管生成蛋白受体的密切相关的蛋白质，然而，它们是多肽的灭活形式，并从而阻止血管生成蛋白的作用。这些拮抗剂例如包括血管生成蛋白多肽的负显性突变体，例如血管生成蛋白的异源二聚体形式的一个链可以是显性的，并可以是突变的，由此生物活性不保留。负显性突变体例如包括截短形式的二聚体血管生成蛋白，其能与另一二聚体相互作用，形成野生型血管生成蛋白，然而所得同源二聚体是失活的，并且不能呈现所需的特征性活性。
另一潜在的血管生成蛋白的拮抗剂是用反义技术制备的一种反义构建。反义方法可用于通过三螺旋形成或反义DNA或RNA控制基因表达，这两种方法基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，编码本发明成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码部分，可用于设计长度为大约10-40bp的反义RNA寡核苷酸。设计的DNA寡核苷酸与包含于转录中的基因的一区域互补(三螺旋，见Lee等，核酸研究6：3073(1979)；Cooney等，科学241：456(1988)；和Dervan等，科学251：1360(1991)，从而阻止转录和血管蛋白产生。反义RNA寡核苷酸在体内与m RNA杂交，并阻断m RNA分子翻译为血管生成蛋白质多肽(反义，Okano，神经化学杂志56：560(1991)；寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂，CRC出版社，Boca Raton，FL(1988)。上述寡核苷酸也可送递细胞中，这样反义RNA或DNA可在体内表达以抑制血管生成蛋白的产生。
在另一实施方案中，血管生成蛋白拮抗剂还包括一种小分子，其结合并占据多肽的活性位点，从而使催化部位不可及底物，由此阻止正常生物活性。这种小分子例如包括但非限于小肽或类肽分子。
拮抗剂可用于限制固体肿瘤转移所必需的血管生成。因为血管生成和新血管化是固体肿瘤生长的必需步骤，因此抑制血管生成蛋白的活性对阻止固体肿瘤的进一步生长，延缓或者甚至退化固体肿瘤是非常有效的。
本发明还涉及一种筛选化合物的方法，以鉴别这种化合物是血管生成蛋白的激动剂还是拮抗剂。这种方法例如有利于血管生成蛋白明显刺激人内皮细胞在存在共促分裂原ConA的情况下的增殖。获得内皮细胞并在96孔平底培养平板(Costar，Cambridge，MA)中，在补加ConA(Calbiochem，La Jolla，CA)的反应混合物中培养。加入Con-A，本发明的多肽和要筛选的化合物。在37℃温育之后，将培养物用1Fci的3〔H〕胸苷(5Ci/mmol；1Ci＝37BGq；NEN)脉冲足够的时间，以掺入3〔H〕，并经玻璃纤维滤膜过滤收集(Cambridge Technology，Watertown，MA)。三份培养物的掺入的3〔H〕胸苷平均值(cpm)用液态闪烁计数仪确定(BeckmanInstruments，Irvjne，CA)，与对照分析(其中不包括要筛选的化合物)相比，有效的掺入的3〔H〕胸苷值表明刺激内皮细胞增殖。
为分析激动剂，进行上述分析，化合物在存在血管生成蛋白的情况下，具有促进3〔H〕胸苷掺入的能力，则表明此化合物是血管生成蛋白的激动剂。相反，为分析拮抗剂，进行上述分析，化合物在存在血管生成蛋白的情况下，具有抑制3〔H〕胸苷掺入的能力，则表明此化合物是血管生成蛋白的拮抗剂。或者，可通过将血管生成蛋白的拮抗剂血管生成蛋白和潜在的拮抗剂与膜结合血管生成蛋白受体或重组受体组合，在适当条件下进行竞争性抑制分析而检测。血管生成蛋白可被标记，如经放射性标记，由此与受体结合的血管生成蛋白分子的数目可确定潜在拮抗剂的效力或者，测定已知第二信使系统的应答及随后的血管生成蛋白与受体的相互作用，并将有或无要筛选的化合物的情况作对比。这种第二信使系统包括但非限于cAMP鸟苷酸环化酶，离子通道，或磷酸肌酸酯水解。在另一种方法中，将表达血管生成蛋白受体的哺乳动物细胞或膜制品，在存在筛选化合物的情况下用标记的血管蛋白温育。然后测定此化合物增强或阻断这种相互作用的能力。表位和抗体：
本发明涵盖的多肽，包含或由具有SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的多肽的表位，或由ATCC中保藏号No.97149或75698的多核苷酸编码的多肽的表位，或由与SEQ ID NO：1或3序列的补体或ATCC中保藏号No.97149或75698的序列的补体在前述严格杂交条件下或较低严格杂交条件下杂交的多核苷酸编码的多肽的表位组成。含有SEQ ID NO：2或4序列的一代表性克隆于1994年3月4日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号No.75698；及于1995年5月12日保藏于ATCC，保藏号No.97149。ATCC位于美国佛吉尼亚州马纳萨斯市。大学道20110-2209，邮编10801。ATCC保藏遵循国际共识的布达佩斯条约。本发明还涵盖了以下多核苷酸序列：编码本发明多肽序列表位的多核苷酸序列(例如SEQ IDNO：1或3所示序列)，编码本发明表位的多核苷酸序列互补链的多核苷酸序列，和在前述严格杂交条件或较低严格杂交条件下与此互补链杂交的多核苷酸序列。
本文所用术语“表位”指在动物，优选哺乳动物，更优选在人体内具有抗原性或免疫原性活性的多肽的一部分。在一优选的实施方案中，本发明涵盖一种多肽，其包含表位，以及编码此多肽的多核苷酸。本文所用术语“免疫原性表位”是指在动物体内激发抗体应答的蛋白质的一部分，其可通过本领域已知的任何方法确定，例如通过前述产生抗体的方法确定〔见例如Geysen等，美国科学院院报81：3998-4002(1983)〕。术语“抗原性表位”是指其作为抗原，抗体能特异地与之结合的蛋白质的一部分，其可通过本领域熟知的任何方法确定，例如通过本文所述的免疫分析法。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但非必需不包括与其它抗原的交叉反应。抗原性表位非必需是免疫原性的。
作为表位的片段可通过常规方法产生〔见例如Houghten，美国科学院院报82：5131-5135(1985)〕，另外见于美国专利No.4631211所述〕。
在本发明中，抗原性表位优选含有至少4，5，6，7个，更优选至少8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30，40，50个，最优选大约15-30个氨基酸。包含免疫原性或抗原性表位的优选多肽的长度至少为10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100个氨基酸。另外非排外的优选抗原性表位包括本文所揭示的抗原性表位，以及其一部分。抗原性表位例如用于产生特异结合表位的抗体，包括单克隆抗体。优选的抗原性表位包括本文所揭示的表位，以及2，3，4，5或多个这些抗原性表位的任意组合。抗原性表位可用作免疫分析中的靶分子〔见例如，Wilson等，细胞37：767-778(1984)；Sutclffe等，科学219：660-666(1983)〕。
相似地，免疫原性表位例如可用于诱导抗体，根据本领域熟知的方法〔见例如Sutcliffe等，如前；Wilson等，如前；Chow等，美国科学院院报82：910-914；和Bittle等，基因病毒学杂志66：2347-2354(1985)〕。优选的免疫原性表位包括本文所揭示的免疫原性表位，以及2，3，4，5或多个这些免疫原性表位的任意组合。包含1或多个免疫原性表位的多肽可与载体蛋白如白蛋白一起，激发动物系统(如兔或小鼠)的抗体应答，或者如果多肽足够长(至少大约25个氨基酸)，此多肽可不用载体。然而包含少如8-10个氨基酸的免疫原性表位，已示出足以产生能至少结合变性的多肽如在Western印迹中)中的线性表位的抗体。
本发明具有表位的多肽可用于诱导抗体，根据本发明熟知的方法，包括但非限于体内免疫接种，体外免疫接种和噬菌体展示方法。见例如Sutcliffe等，如前；Wilson等，如前；和Bittle等，基因病毒学杂志66：2347-2354(1985)。如果使用体内免疫接种，可用游离肽接种动物；然而抗肽抗体滴定可通过将肽与大分子载体偶联而加强，所述载体如是匙孔嘁血篮蛋白(KLH)或破伤风毒素。例如，含有半胱氨酸残基的肽可用接头与载体偶联，接头如间一马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，而其它肽可用一般的连接剂如戊二醛与载体偶联。将动物如兔，大鼠和小鼠用游离或偶联载体的肽免疫接种，例如通过腹膜内和/或皮内注射含有大约100μg肽或载体蛋白，和Freund’s佐剂或其它刺激免疫应答的任何佐剂的乳剂。可需要一些增强注射，例如间隔大约2周，以提供可例如经ELISA分析检测的抗肽抗体的有效滴定，ELISA分析是用吸附于固体表面的游离肽。通过选择抗肽抗体，例如根据本领域熟知方法将肽吸附于固体支持物并洗脱选择的抗体，可提高免疫接种动物血清中抗肽抗体的效价。
本领域技术人员意识到及如上所述，包含免疫原性或抗原性表位的多肽可融合于其它多肽序列。例如，本发明的多肽可与免疫球蛋白(IgA，IgE，IgG，IgM)的恒定区，或其一部分(CH1，CH2，CH3或其任意组合，及其一部分)融合，产生嵌合多肽。这种融合蛋白可易于纯化并提高在体内的半衰期。已示出嵌合蛋白由人CD4-多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白的重或轻链恒定区的各种机构域组成。见例如EP394827；Traunecker等，自然，331：84-86(1988)所述。在抗原(如胰岛素)与FcRn结合配体如IgG或Fc片段缀合的情况下，抗原穿经上皮细胞壁至免疫系统的输送增强已证实(见例如PCT出版物WO96/22024和WO99/04813所述)。由于IgG部分脱硫键而具有二硫键连的二聚体结构的IgG融合蛋白，也已发现比只是单体多肽或其片段在结合及中性化其它分子中更有效。见例如Fountoulakis等，生物化学杂志270：3958-3964(1995)。编码上述表位的核酸也可与作为表位标记〔如血凝素(HA)标记或flag标记〕的相应基因重组，以助于检测和纯化表达的多肽。例如，由Janknecht等所述的系统可易于纯化在人体细胞系中表达的非变性的融合蛋白(Janknecht等，1991，美国科学院院报88：8972-897)。在此系统中，将相应的基因亚克隆入豆苗重组质粒中，这样基因的开发读框翻译性的融合于由6个组氨酸残基组成的氨基末端标记中。此标记作为融合蛋白的基质结合结构域。将用重组豆苗病毒感染的细胞的提取物加样于Ni2+次氮基乙酸—琼酯糖层析柱中，且组氨酸标记的蛋白质可用含有咪唑的缓冲液选择性洗脱。
本发明的其它融合蛋白可通过基因改组，基序改组，外显子改组，和/或密码子改组(统称DNA改组)而产生。DNA改组可用于调节本发明多肽的活性，这种方法可用于产生具有改变活性的多肽，以及多肽的激动剂和拮抗剂。见美国专利No.5605793；58 11238；5830721；5834252；和5837458，和Patten等，生物技术学通用观点8：724-33(1997)；Harayama，生物技术趋势16(2)：76-82(1998)；Hansson等，分子生物学杂志287：265-76(1 999)；和Lorenzo和Blasco，生物技术24(2)：308-13(1998)所述(这些专利及文献均以全文并入参考)。在一实施方案中，相当于SEQ ID NO：1或3的多核苷酸，及由这些多核苷酸编码的多肽的变化，可通过DNA改组进行。DNA改组包括通过同源或位点特异性重组装配2或多个DNA节段，以在多核苷酸序列中产生变化。在另一实施方案中，本发明的多核苷酸或其编码的多肽，可通过易错PCR，随机插入核苷酸，或其它方法随机诱变，之后进行重组而改变。在另一实施方案中，编码本发明多肽的多核苷酸的一或多种成分，基序，节段，部分，结构域，片段等，可与一或多种异源分子的一或多种成分，基序节段，部分，结构域，片段等重组。抗体：
本发明的另外的多肽涉及抗体和T细胞抗原受体(TCR)，其免疫特异性地结合本发明SEQ ID NO：2或4的多肽，多肽片段或变体，和/或表位(通过本领域熟知的免疫分析方法分析特异性抗体—抗原结合)。本发明的抗体包括但非限于多克隆抗体，单克隆抗体，多特异性抗体，人抗体，人化抗体或嵌合抗体，单链抗体，Fab片段，F(ab’)片段，由Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗Id)抗体(包括本发明抗体的抗Id抗体)，和以上任何结合表位的片段。本文所用术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型(如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类别(如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类别的免疫球蛋白分子。
更优选的抗体是本发明结合抗原的人抗体片段，包括但非限于Fab，Fab’，和F(ab’)2，Fd，单链Fvs(scFV)，单链抗体，二硫键连的Fvs(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。结合抗原的抗体片段，包括单链抗体，可只包含可变区域或与以下完整区域或其一部分组合：绞链区，CH1，CH2和CH3结构域。本发明还包括结合抗原的片段，其也包含可变区与绞链区，CH1，CH2和CH3结构域的任意组合。本发明的抗体可来源于任何动物，包括鸟和哺乳动物。优选地，抗体来源于人，鼠(如小鼠和大鼠)，驴，兔，山羊，豚鼠，骆驼，马或鸡。本文所用术语“人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，及包括分离自人免疫球蛋白文库的抗体，或分离自用—或多种人免疫球蛋白转基因且不表达内源性免疫球蛋白的动物的抗体，如前述及例如Kucherlapati等的美国专利No.5939598所述。
本发明的抗体可以是单特异性，双特异性，三特异性或更多特异性的。多特异性抗体可特异于本发明多肽的不同表位，或特异于本发明的两种多肽，以及异源表位，如异源多肽或固体支持物。见例如PCT出版物WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tutt等，免疫学杂志，147：60-69(1991)；美国专利No.4474893；4714681；4925648；5573920；5601819；Kostelny等，免疫学杂志148：1547-1553(1992)。
本发明的抗体可以它们识别或特异结合的表位或本发明多肽的一部分等术语阐述。表位或多肽的一部分在本文特别通过N-末端和C-末端位，通过连续氨基酸残基的大小加以阐述，或在图表中列出。
在一实施方案中，可用于产生PDGF-A特异性抗体的抗原性多肽或肽包括包含以下氨基酸残基的多肽：SEQ ID NO：2的大约Lys72-Leu80，SEQ ID NO：2的大约Ile82-Ile88，SEQ ID NO：2的大约Pro106-Ser114，SEQ ID NO：2的大约Lys139-Val145，SEQ IDNO：2的大约Arg159-Lys165，和SEQ ID NO：2的大约Serl83--Thr211氨基酸残基。这些多肽片段通过使用缺失参数经Jameson-Wolf抗原指数分析，已确定携带PDGF-A蛋白的抗原性表位。
在一优选的实施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO：2的大约Ile82-Ile88氨基酸残基。
可用于产生PDGF-B特异性抗体的抗原性多肽或肽非限制性地例如包括包含以下氨基酸残基的多肽：SEQ ID NO：4的大约Arg39-Gln45，Asp51-Asp56，Thr65-Gly71，Leu110-Ala116，Ser131-Thr144，Pro188-Thr206，Arg216-Lys227，Thr229-Leu235氨基酸残基。这些多肽片段通过使用缺失参数经Jameson-Wolf抗原指数分析，已确定携带PDGF-B蛋白的抗原性表位。
在一优选的实施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO：4的大约Arg39-Gln45，Asp51-Asp56，Thr65-Gly71的氨基酸残基。
可用于产生PlGF特异性抗体的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下氨基酸残基的多肽：SEQ ID NO：6的大约Val46-Cys52，Arg110-Ser1 16，Val126-Asp144的氨基酸残基。这些多肽片段通过使用缺失参数经Jameson-Wolf抗原指数分析，已确定携带PlGF蛋白的抗原性表位。
在一优选的实施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO：6的大约Val 46-Cys52氨基酸序列。
可用于产生PlGF-2特异性抗体的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下氨基酸残基的多肽：SEQ ID NO：8的大约Val46-Cys52，Arg110-Serl 16，Val126-Asp159的氨基酸残基。这些多肽片段通过使用缺失参数经Jameson-Wolf抗原指数分析，已确定携带PlGF-2蛋白的抗原性表位。
在一优选的实施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO：8的大约Val 46-Cys52氨基酸残基。
可用于产生GDGF特异性抗体的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下氨基酸残基的多肽：SEQ ID NO：10的大约Thr30-Ala36，Tyr46-Cys5 1，Glu63-Ile68，Ser125-Cys142，Pro144-His151，Gln155-Lys172，Asn179-Arg190氨基酸残基。这些多肽片段通过使用缺失参数经Jameson-Wolf抗原指数分析，已确定携带GDGF蛋白的抗原性表位。
在一优选的实施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO：10的大约Thr30-Ala36，Tyr46-Cys5 1氨基酸残基。
可用于产生VEGF特异性抗体的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下氨基酸残基的多肽：SEQ ID NO：12的大约Glu64-Ile69，Gly85-Gly91，His125-Cys143，Pro145-His152，Glu156-Lys173，Asn180-Arg191氨基酸残基。这些多肽片段通过使用缺失参数经Jameson-Wolf抗原指数分析，已确定携带VEGF蛋白的抗原性表位。
可用于产生VEGF-A特异性抗体的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下氨基酸残基的多肽：SEQ ID NO：14的大约Thr30-Ala36，Tyr46-Cys51，Glu63-Ile68，Ser125-Val143，Gly145-Cys166，Pro 168-His 175，Gln179-Lys196，Asn203-Arg214氨基酸残基。这些多肽片段通过使用缺失参数经Jameson-Wolf抗原指数分析，已确定携带VEGF-A蛋白的抗原性表位。
在一优选的实施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO：14的大约Thr30-Ala36，和Tyr46-Cys51氨基酸残基。
可用于产生VEGF-2特异性抗体的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下氨基酸残基的多肽：SEQ ID NO：16的大约Asp40-Ala45，Lys 54-Leu60，Gln84-Gly89，Arg94-Thr106，Ile122-Cys131，Asn175-Leu181，Gln237-Pro244，Asp267-Phe276，Pro282-Asp287，Ser303-Ser314，Ala330-Thr338，Arg345-Cys358，Gly373-Cys395，Pro410-Ser419氨基酸残基。这些多肽片段通过使用缺失参数经Jameson-Wolf抗原指数分析，已确定携带VEGF-A蛋白的抗原性表位。
在一优选的实施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO：16的Asp40-Ala45，Lys 54-Leu60，Gln84-Gly89，Arg94-Thr106，和Ile122-Cys131氨基酸残基。
可用于产生VEGF-3特异性抗体的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下氨基酸残基的多肽：SEQ ID NO：18的Ser 24-Lys34，Ala45-Arg50，Arg125-Ala138，Prol41-Ser149，和His167-Pro172氨基酸残基。这些多肽片段通过使用缺失参数经Jameson-Wolf抗原指数分析，已确定携带VEGF-3蛋白的抗原性表位。
在一优选的实施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO：18的大约Ser 24-Lys34，Ala45-Arg50，氨基酸残基。
可用于产生VEGF-D特异性抗体的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下氨基酸残基的多肽：SEQ ID NO：20的大约Metl-Gln14，His29-Arg41，Met48-Thr58，Glu75-Thr87，Leu95-Phe103，Pro181-Lys191，Trp199-Cys204，Asp281-Thr293，Pro310-Ala316，Gly318-Pro325氨基酸残基。这些多肽片段通过使用缺失参数经Jameson-Wolf抗原指数分析，已确定携带VEGF-D蛋白的抗原性表位。
在一优选的实施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO：20的大约Metl-Gln14，His29-Arg41，Met48-Thr58，Glu75-Thr87氨基酸残基。
可用于产生VEGF-D1特异性抗体的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下氨基酸残基的多肽：SEQ ID NO：22的大约Ser22-Gln43，His58-Arg70，Met77-Thr87，Glu104-Thr116，Leu124-Phe132，Pro210-Lys220，Trp228-Cys233，Asp310-Thr322，Pro339-Ala345，Gly347-Pro354氨基酸残基。这些多肽片段通过使用缺失参数经Jameson-Wolf抗原指数分析，已确定携带VEGF-D1蛋白的抗原性表位。
在一优选的实施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO：22的大约Ser22-Gln43，His58-Arg70，和Met77-Thr87，氨基酸残基。
可用于产生VEGF-E特异性抗体的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下氨基酸残基的多肽：SEQ ID NO：24的大约Asp 21-Trp26，Asp46-Phe56，Gly68-Ser74，Pro121-Arg132氨基酸残基。这些多肽片段通过使用缺失参数经Jameson-Wolf抗原指数分析，已确定携带VEGF-E蛋白的抗原性表位。
在一优选的实施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO：24的大约Asp 21-Trp26氨基酸残基。
特异性结合本发明的任何表位或多肽的抗体也排除在外。因此，本发明包括特异结合本发明多肽的抗体，并又可不包括这种抗体。
本发明的抗体还可以交叉反应性加以阐述。本发明包括不结合本发明多肽的任何其它类似物，直向同源物，或同源物的抗体。本发明还包括结合与本发明多肽有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％相同性的多肽的抗体(相同性是通过本领域已知及本文所述方法计算的)。在特异的实施方案中，本发明的抗体与人体蛋白及其相应表位的小鼠，大鼠和/或兔同源物交叉反应。本发明还包括不结合与本发明多肽有少于95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，50％相同性的多肽的抗体(相同性是通过本领域已知及本文所述方法计算的)。在一特异的实施方案中，上述交叉反应性与任一种特异抗原性或免疫原性多肽，或2，3，4，5或多种特异抗原性或免疫原性多肽组合相关。本发明另外包括结合由在严格条件下与本发明多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽的抗体。本发明的抗体还可以其与本发明多肽的结合亲和性加以阐述。优选的结合亲和性包括解离常数或Kd少于以下数值的亲和性：5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，或10-15M。
本发明还提供了竞争性抑制抗体与本发明表位结合的抗体，以确定例如本文所述免疫分析中的竞争性结合，竞争性抑制是通过本领域已知方法确定的。在优选的实施方案中，抗体竞争竞争性抑制与表位结合的至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，60％或50％。
本发明抗体还作为本发明多肽的激动剂或拮抗剂。例如，本发明包括部分或完全破坏受体/配体与本发明多肽相互作用的抗体。优选地，本发明的抗体结合本文所述的抗原性表位或其一部分。本发明以受体特异性抗体和配体特异性抗体为特色。本发明还以阻止配体结合但阻止受体活化的受体特异性抗体为特色。受体活化(即信号化)可通过本文所述方法或本领域已知其它方法确定。例如，受体活化可通过检测受体或其底物在通过免疫沉淀及随后的Western印迹分析(如前述)后的磷酸化(如酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸)而确定。在特异的实施方氨中，所提供的抗体抑制的配体活性或受体活性比没有抗体的情况下至少抑制95％，90％，85％，80％，75％，70％，60％或50％。
本发明还以受体特异性抗体为特色，其阻止配体结合及受体活化，还以识别受体-配体复合物且优选不特异识别未结合的受体或未结合的配体的抗体为特色。另外，本发明包括中和抗体，其结合配偶体并阻止配体与受体的结合，以及包括结合配偶体从而阻止受体活化，但不阻止配体与受体结合的抗体。本发明另外包括激活受体的抗体。这些抗体可作为受体激动剂，即促进或活化配体介导的受体活化的所有或部分生物活性，配体介导的受体活化例如通过诱导受体二聚体化而活化。抗体可以生物活性包括本发明肽的特有生物活性的激动剂，拮抗剂或反向激动剂加以阐述。上述抗体激动剂可用本领域已知方法产生。见例如PCT出版物WO96/40281；美国专利No.5811097；Deng等，血液92(6)：1981-1988(1998)；Chen等，癌症研究58(16)：3668-3678(1998)；Harrop等，免疫学杂志161(4)：1786-1794(1998)；Zhu等，癌症研究58(15)：3209-3214(1998)；Yoon等，免疫学杂志160(7)：3170-3179(1998)；Prat等，细胞科学杂志111(Pt2)：237-247(1998)；Pitard等，免疫学方法杂志205(2)：177-190(1997)；Liautard等，细胞因子9(4)：233-241(1997)；Carlson等，生物化学杂志272(17)：11295-11301(1997)；Taryman等，神经元14(4)：755-762(1995)；Muller等，结构6(9)：1153-1167(1998)；Bartunek等，细胞因子8(1)：14-20(1996)所述，以上文献均以全文并入参考。
本发明的抗体可例如但非限制性用于纯化，检测及定向本发明的多肽，包括在体外和体内诊断及治疗方法中。例如，抗体用于免疫分析中以定量及定性测定生物样品中本发明多肽的水平。见例如Harlovo等，抗体实验手册(冷泉港实验室出版社，第二版，1988)所述，以其全文并入参考。
如以下更详细的阐述，本发明的抗体可单独或与其它组合物组合使用。抗体还可在N或C末端经重组融合于异源多肽，或化学缀合于(包括共价和非共价缀合)多肽或其它组合物。例如本发明的抗体可重组融合或缀合于在检测分析中用作标记的分子，和效应器分子，如异源多肽，药物，放射性核素或毒素。见例如PCT出版物WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利No.5314995；和EP396387。
本发明的抗体包括经修饰的衍生物，即通过将任何类型的分子共价吸附于抗体，这种共价吸附不阻止抗体产生抗独特型应答。例如但非限制性地，抗体衍生物包括已经修饰的抗体，例如通过糖基化，乙酰化，Pegylation，磷酸化，酰胺化，通过已知防护/阻断基团的衍生化，蛋白酶切，与细胞配体或其它蛋白质连接等加以修饰。可通过已知方法进行任何化学修饰，包括但非限于特异性化学切割，乙酰化，甲酰化，衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可含有一或多个非经典氨基酸。本发明的抗体可以通过本领域已知的任何适当方法产生。相应抗原的多克隆抗体可通过本领域熟知的各种方法生产。例如，可将本发明的多肽施用于各种宿主动物，包括但非限于兔，小鼠，大鼠等，以诱导含有特异于抗原的多克隆抗体的血清产生。根据宿主物种可使用各种佐剂以提高免疫应答，佐剂包括但非限于Freund’s(完全性及不完全性)佐剂，矿物质凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂，pluronic多醇，聚阴离子，肽，油乳液，匙孔嘁血篮蛋白，二硝基苯酚，和潜在用于人体的佐剂如BCG(卡介苗)和parvum棒杆菌。这些佐剂本领域已熟知。
单克隆抗体可用各种已知方法制备，包括使用杂交瘤，重组及噬菌体展示等方法，或组合使用这些方法。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法生产，包括本领域已知的及例如Harlow等，抗体实验手册(冷泉港实验室出版社，第二版，19880；Hammerling等，单克隆抗体及T细胞杂交瘤563-681(Elsevier，N.Y.，1981)所述方法，所述文献以其全文并入参考。本文所用术语“单克隆抗体”非限于通过杂交瘤方法生产的抗体。术语“单克隆抗体”是指衍生自一个单一克隆包括真核，原核或噬菌体克隆的抗体，而不是指由何种方法产生的抗体。
用杂交瘤方法生产和筛选特异性抗体的方法对本领域而言是常规且熟知的，并在实施例中加以详细阐述。在一非限制性实施例中，可用本发明的多肽或表达这种肽的细胞免疫接种小鼠。一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到特异于抗原的抗体，则收集小鼠脾组织并分离脾细胞。然后将脾细胞通过熟知的方法融合于任何适当的骨髓瘤细胞，例如得自ATCC的sp20细胞系的细胞。选择杂交瘤并通过限制稀释而克隆。然后通过本领域已知方法分析杂交瘤克隆的分泌能结合本发明多肽的抗体的细胞。通常含有高水平抗体的腹水可用阳性杂交瘤克隆免疫接种小鼠而产生。
因此，本发明提供了产生单克隆抗体的方法，以及由这些方法产生的抗体，所述方法包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中优选杂交瘤细胞是通过将脾细胞与骨髓瘤细胞融合而产生的，所用脾细胞分离自用本发明抗原免疫接种的小鼠，然后筛选经融合所得杂交瘤中分泌能结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆。
识别特异表位的抗体片段可通过已知方法产生。例如，本发明的Fab和F(ab’)2片段可通过对免疫球蛋白分子进行蛋白酶切而产生，使用的酶如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)，或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)。F(ab’)2片段含有可变区，轻链恒定区和重链的CH1结构域。
例如，本发明的抗体还可用本领域已知的各种噬菌体展示法产生。在噬菌体展示方法中，将功能性抗体结构域展示于携带编码其的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面。在一特殊的实施方案中，这种噬菌体可用于展示表达自抗体文库所有组成成分或组合抗体文库(如人或小鼠)的抗原结合结构域。表达结合相应抗原的抗原结合结构域的噬菌体，可用抗原选择或鉴别，如用标记的抗原或结合或捕捉于固体表面或玻珠的抗原。这些方法中使用的噬菌体是典型的丝状噬菌体，包括fd和M13结合结构域，其表达自具有Fab，Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域，重组融合于噬菌体基因IV或基因VIII蛋白的噬菌体。可使用的产生本发明抗体的噬菌体展示法包括：Brinkman等，免疫学方法杂志182：41-50(1995)；Ames等，免疫学方法杂志184：177-186(1995)；Kettleborough等，欧洲免疫学杂志24：952-958(1994)；Persic等，基因187，9-18(1997)；Burton等，免疫学进展57：191-280(1994)；PCT出版物No.PCT/GB91/01134；PCT出版物WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和美国专利No.5698426；5223409；5403484；5580717；5427908；5750753；5821047；5571698；5427908；5516637；5780225；5658727；5733743和5969108所述方法；所述文献以其全文并入参考。
如上述参考文献所述，在噬菌体选择后，可从噬菌体中分离抗体编码区，以产生完整抗体，包括人抗体，或任何其它所需的抗原结合片段，并在任何所需宿主中表达，包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母和细菌，如以下详细论述。例如，也可使用本领域已知的重组产生Fab，Fab’和F(ab’)2片段的方法，如PCT出版物WO WO92/22324；MuUinax等，生物技术12(6)：864-869(1992)；和Sawai等，AJRI 34：26-34(1995)；和Better等，科学240：1041-1043(1988)所述方法，所述文献以其全文并入参考。
可用于产生单链Fvs和抗体的方法例如包括美国专利4946778和5258498；Huston等，酶学方法203：46-88(1991)；Shu等，PNAS90：7995-7999(1993)；和Skerra等，科学240：1038-1040(1988).。在包括在人体内使用抗体及体外检测分析中，优选使用嵌合的人化的或人抗体。嵌合抗体是一种分子，其中抗体的不同部分衍生自不同物种动物，如具有可变区的抗体衍生自小鼠单克隆抗体和人免疫球蛋白恒定区。本领域已知产生嵌合抗体的方法。见例如Morrison，科学229：1202(1985)；Oi等，生物技术4：214(1986)；GiUies等(1989)，免疫学方法杂志125：191202；美国专利No.5807715；4816397所述方法，以上文献以其全文并入参考。人化的抗体是来自结合所需抗原的非人抗体的抗体分子，所需抗原具有一或多个非人物种的互补决定区(CDRs)和一个人免疫球蛋白分子的框架区。通常地，人框架区中的框架残基由CDR供体抗体的相应残基取代，以改变优选改良抗原结合。这些框架取代是通过本领域熟知方法鉴别的，例如通过模仿CDR与框架残基的相互作用，以鉴别框架残基对抗原结合的重要性，并对比序列以鉴别在特殊位置的异常框架残基。(见例如Queen等，美国专利No.5585089；Riechmann等，自然332：323(1988)，以其全文并入参考)。抗体可以用本领域已知的各种方法人化，包括例如CDR-移植(EP239400；PCT出版物WO 91/09967；美国专利No.5225539，5530101和5585089)；镶饰或换装新表面(EP592106；EP519596；Padlan，分子免疫学28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，蛋白质工程7(6)：805-814；Roguska等，PNAS 91：969-973(1994)，和链改组(美国专利No.5565332)。
完全性人抗体是为治疗人患者所特别需要的人抗体可通过本领域已知任何方法产生，包括上述噬菌体展示法，使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库。见例如美国专利No.4444887和4716111；和PCT出版物WO98/46645，WO98/50433，WO98/24893，WO98/16654，WO96/34096，WO96/33735，和WO91/10741；以上文献均全文并入参考。
人抗体也可用转基因小鼠产生，该小鼠不能表达功能性内源性免疫球蛋白，但能表达人免疫球蛋白基因。例如，可将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物，随机导入或同源重组于小鼠胚胎干细胞中。或者，除了人重链和轻链基因之外，可将人可变区，恒定区和多样性区导入小鼠胚胎干细胞中。可对小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因非功能性分别或同时通过同源重组导入人免疫球蛋白基因座。尤其地，JH区的纯合缺失阻止内源性抗体产生。扩展修饰的胚胎干细胞，并微注射入成纤维细胞中以产生嵌合小鼠。然后繁育此嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合子代。将转基因小鼠用选择的抗原以通常方式免疫接种，所用抗原例如是全部或部分本发明的多肽。直接抗抗原的单克隆抗体可得自用常规杂交瘤方法免疫接种的转基因小鼠。由转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因，在B细胞分化期间重新排列，随后进行类别转换和体细胞突变。因此使用这种方法可产生有治疗用途的IgG，IgA，IgM和IgE抗体。产生人抗体的这种方法参见Lonberg和Huszar，免疫学研究综述13：65-93(1995)。生产人抗体和人单克隆抗体的方法见例如PCT出版物WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO96/33735；欧洲专利No.0598877；美国专利No.5413923；5625126；5633425；5569825；5661016；5545806；5814318；5885793；5916771；和5939598所述，以其全文并入参考。另外，如Abgenix公司(Freemont，cA)和Genpharm公司(San Jose，c A)可提供直接抗选择的抗原的人抗体，使用的方法类似于以上所述方法。
识别选择表位的完全人抗体可使用称为“指导选择”的方法产生。在此方法中，选择的非人单克隆抗体如小鼠抗体，用于指导选择识别相同表位的完全人抗体〔Jespers等，生物/技术12：899-903(1988)〕。
另外，本发明的抗体反过来可用于产生“模拟”本发明多肽的抗独特型抗体，使用本领域熟知的方法(见例如Greenspan & Bona，FASEB杂志，7(5)：437-444(1989)，和Nissinoff，免疫学杂志147(8)：2429-2438(1991))。例如，结合并完全抑制多肽多聚体化和/或本发明多肽与配体结合的抗体，可用于产生抗独特型抗体，其“模拟”多肽多聚体化和/或结合结构域，从而结合并中和多肽和/或其配体。这种中和抗独特型抗体或其Fab片段，可用于治疗性中和多肽配体。例如，这种抗独特型抗体可用于结合本发明的多肽和/或结合其配体/受体，从而阻断其生物活性。编码抗体的多核苷酸：
本发明还提供了包含编码本发明抗体及其片段的核苷酸序列。本发明还涵盖了在严格或较低严格杂交条件下，与编码抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸，所述抗体优选特异结合本发明多肽的抗体，优选结合具有SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的多肽的抗体。
通过本领域已知方法可获得多核苷酸，并确定此多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果已知抗体的核苷酸序列，可从化学合成的寡核苷酸中装配编码抗体的多核苷酸〔例如Kutmeier等，生物技术17：242(1994)〕，简而言之包括合成含有编码抗体的部分序列的重叠寡核苷酸，退火并连接这些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
或者，编码抗体的多核苷酸可产生自适当来源的核酸。如果含有编码特殊抗体的核酸的克隆不适合，但抗体分子的序列已知，则编码免疫球蛋白的核酸可化学合成或得自适当来源(如产生自表达抗体的任何组织或细胞的抗体c DNA文库，或c DNA文库，或分离自表达抗体的任何组织或细胞的核酸，优选聚A+RNA，如选择的表达本发明抗体的杂交瘤细胞)，使用可与序列的3’和5’末端杂交的合成引物通过PCR扩增而获得，或使用特异于特殊基因序列的寡核苷酸探针通过克隆而获得，以例如从编码抗体的c DNA文库中鉴别-c DNA克隆。然后可将通过PCR产生的扩增的核酸，通过本领域熟知的任何方法克隆入可复制的克隆载体中。
一旦确定抗体的核苷酸序列及相应的氨基酸序列，对抗体的核苷酸序列可用本领域熟知方法进行人工操纵，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代，缺失和/或插入，所用操纵方法例如重组DNA方法，位点直接诱变，PCR等(见例如Sambrook等，1990，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY；和Ausubel等编辑，1998，分子生物学通用方法，John Wiley&Sons，NY所述方法，所述文献以其全文并入参考)。
在一特异的实施方案中，对重和/或轻链可变结构域的氨基酸序列进行检测，以鉴别互补决定区(CDRs)的序列，通过本领域熟知的方法，例如通过与其它重和轻链可变区的已知氨基酸序列进行对比，以确定序列的高变区。使用常规重组DNA方法，可将一或多个CDRs插入框架区中，例如插入人框架区以人化非人抗体，如前所述。框架可以是天然发生的或是共有框架区，优选是人框架区(见例如Chothia等，分子生物学杂志278：457-479(1998)列出了人框架区)。优选地，通过组合框架区与CDRs而产生的多核苷酸，编码特异结合本发明多肽的抗体。优选地，如前所述，可在框架区内产生一或多个氨基酸取代，并优选地，此氨基酸取代改良抗体与其抗原的结合。另外，这种方法可用于产生氨基酸取代，或缺失一或多个参与链内二硫键的可变区半胱氨酸残基，以产生缺失一或多个链内二硫键的抗体分子。多核苷酸的其它改变也涵盖在本发明内，并为技术人员熟知。
另外，可使用产生“嵌合抗体”的方法(Morrison等，美国科学院院报81：851-855(1984)；Neuberger等，自然312：604-608(1984)；Takeda等，自然314：452-454(1985))，通过将来自适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因，与来自适当生物活性的人抗体分子的基因剪接在一起而产生。如前所述，嵌合抗体是一种分子，其中不同部分衍生自不同动物物种，如具有衍生自小鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体，例如人化抗体。
或者，可使用生产单链抗体的方法生产单链抗体(美国专利No.4946778；Bird，科学242：423-42(1988)；Huston等，美国科学院院报85：5879-5883(1988)；和Ward等，自然334：544-54(1989))。单链抗体是通过氨基酸桥连接Fv区的重和轻链片段，产生单链多肽而形成的。也可使用在大肠杆菌内装配功能性Fv片段的方法〔Skerra等，科学242：1038-1041(1988)〕。生产抗体的方法：
本发明的抗体可通过本领域任何已知合成抗体的方法生产，尤其通过化合或优选通过重组表达方法。重组表达本发明的抗体，或其片段，衍生物或类似物(如本发明抗体的重链或轻链，或本发明的单链抗体)，要求构建含有编码抗体的多核苷酸的表达载体。一旦获得编码本发明抗体分子或其重链或轻链，或其一部分(优选含有重或轻链可变结构域)的多核苷酸，生产抗体分子的载体可通过本领域熟知的重组DNA方法产生。因此，本文阐述了通过表达含有抗体编码核苷酸序列的多核苷酸而制备蛋白质的方法。可使用本领域技术人员熟知的方法构建含有抗体编码序列和适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法例如包括体外重组DNA方法，合成方法，和体内遗传重组。因此本发明提供了可复制载体，其包含编码本发明抗体分子或其重或轻链，或重或轻链可变结构域的核苷酸序列，其可操纵地连于启动子。这种载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(见例如PCT出版物WO86/05807；PCT出版物WO89/01036；和美国专利No.5122464)，且抗体的可变区可克隆入这种载体中以表达完整轻或重链。
将表达载体通过常规方法移至宿主细胞中，然后通过常规方法培养转染的细胞，以产生本发明的抗体。因此，本发明包括含有编码本发明抗体，或其重或轻链，或单链抗体的多核苷酸的宿主细胞，该多核苷酸可操纵地连于异源启动子。在表达双链抗体的优选实施方案中，可将编码重和轻链的载体共同在宿主细胞中表达，以表达完整免疫球蛋白分子，如下所述。
可使用各种宿主表达载体系统以表达本发明的抗体分子。这种宿主表达系统代表可产生并随后纯化相应编码序列的载体，也可代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时，可在原位表达本发明抗体分子的细胞。这些细胞包括但非限于微生物如细菌(例如大肠杆菌，B.枯草杆菌)，该细菌用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化；酵母，(如Saccharomyces，Pichia)，其用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化；昆虫细胞系统，该细胞用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染；植物细胞系统，该细胞用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染，或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化；或哺乳细胞系统(如COS，CHO，BHK，293，3T3细胞)，该细胞具有含有衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)，或衍生自哺乳动物病毒的启动子(如腺病毒晚期启动子，痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体。优选地，细菌细胞如大肠杆菌细胞，更优选真核细胞，尤其表达整个重组抗体分子的真核细胞，用于表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，与载体如人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子因子缔合，是抗体的一种有效表达系统(Foecking等，基因45：101(1986)；Cockett等，生物/技术8：2(1990))。
在细菌系统中，根据对被表达的载体的预期使用，可优选一些表达载体。例如，当为产生抗体分子的药物组合物而大量生产这种蛋白质时，需要指导易于纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。这种载体包括但非限于大肠杆菌表达载体pUR 278(Ruther等，EMBO杂志2：1791(1983))，其中抗体编码序列可单独连接于载体中具有lacZ编码区的框架中，以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye &Inouye，核酸研究13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，生物化学杂志24：5503-5509(1989))；等。还可使用pGEX载体以表达作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白的外源多肽。一般地，这种融合蛋白是可溶的并且可易于从裂解的细胞中纯化，通过附着并结合谷胱甘肽琼脂糖珠，接着在存在游离谷胱甘肽的情况下洗脱而进行。设计的pGEX载体包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，以便克隆的靶基因产物可从GST组分中释放。
在昆虫系统中，首苜银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcNPV)用作表达外源基因的载体。此病毒生长于Spodoptera frugiperda细胞中。抗体编码序列可单独克隆入病毒的非必需区域(如多角体蛋白基因)，并在AcNPV启动子(如多角体蛋白启动子)的控制下置放。
在哺乳动物宿主细胞中，可使用一些基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况中，相应的抗体编码序列可连接于腺病毒转录/翻译控制复合物，如晚期启动子和三联前导序列。然后将此嵌合基因通过体外或体内重组插入腺病毒基因组中。在非必需区中插入病毒基因组(如在E1或E3区)产生一种重组病毒，其在感染的宿主中是可生存的并能表达抗体分子。(见Logan & Shenk，美国科学院院报81：355-359(1984))。为高效翻译插入的抗体编码序列，还需要特异的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。另外，起始密码子必须是具有所需编码序列的读框的状态，以确保翻译完整的插入体。这些内源性翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源的，天然的及合成的均可。表达效力可通过包含适当转录增强子，转录终止子等而得以加强(见Bittner等，酶学方法153：51-544(1987))。
另外，可选择调节插入序列表达，或以特异所需方式修饰及加工基因产物的宿主细胞菌株。对蛋白质产物的这种修饰(如糖基化)和加工(如裂解)对蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞具有特征性及特异性的翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统，以确保正确修饰和加工所表达的外源蛋白质。为此，可使用具有正确加工原始转录物，糖基化和磷酸化基因产物的细胞机制的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但非限于CHO，VERY，BHK，Hela，COS，MDCK，293，3T3，WI38，尤其包括乳腺癌细胞系如BT483，Hs578T，HTB2，BT20和T47D，和正常乳腺细胞系如CRL7030，和Hs578Bst。
为长期高产量产生重组蛋白质，优选稳定的表达。例如，可对稳定表达抗体分子的细胞系基因工程化。除了使用含有病毒复制起源的表达载体，宿主细胞可用由适当表达控制因子(如启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点等)控制的DNA，和一可选择标记转化。在导入外源DNA之后，使基因工程化的细胞在滋养培养基中生长1-2天，然后转换为选择性培养基。重组质粒中的可选择标记授与对选择的抗性，并使细胞稳定地将质粒整合入其染色体中，并生长形成foci，其反过来可克隆入细胞系中并扩展。色体中，并生长形成foci，其反过来可克隆入细胞系中并扩展。此方法可用于基因工程化表达抗体分子的细胞系。这种工程化的细胞系尤其用于筛选和评价直接或间接与抗体分子相互作用的化合物。
可使用一些选择系统，包括但非限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，细胞11：223(1977))，次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，美国科学院院报48：202(1992))，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，细胞22：817(1980))基因，可分别用于tk-hgprt-或aprt细胞中。同样，抗体谢物抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，其授与氨甲喋呤抗性(Wigler等，美国科学院院报77：357(1980)；O’Hare等，美国科学院院报78：1527(1981))；gpt，其授与霉酚酸抗性(Mulligan & Berg，美国科学院院报78：2072(1981))；neo，其授与氨基糖苷G-418抗性(临床药理学12：488-505；Wu和Wu，生物治疗3：87-95(1991)；Tolstoshev，药物毒性分析研究32：573-596(1993)；Mulligan，科学260：926-932(1993)；和Morgan及Anderson，生物化学分析研究62：191-217(1993)；May，1993，TIBTECH 11(5)：155-215)；hygro，其授与潮霉素抗性(Santerre等，基因30：147(1984))。本领域已知的重组DNA方法可常规用于选择所需的重组克隆，这种方法例如由Ausubel等编辑，分子生物学通用方法，John Wiley &Sons，NY(1993)；Kriegler，基因转移和表达实验手册，Stockton出版社，NY(1990)；及Dracopoli等编辑，人体遗传学通用方法，John Wiley & Sons，NY(1994)中第12章和第13章；Colberre-Garapin等，分子生物学杂志150：1(1981)所述，以上文献均以全文并入参考。
抗体分子的表达水平可通过载体扩增而提高(参见Bebbington和Hentschel，使用基于基因扩增的载体在哺乳动物细胞中表达克隆的基因，DNA克隆，第三卷(科学出版社，纽约，1987))。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时，提高宿主细胞培养物中抑制剂的水平，将提高标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体基因相缔合，因此抗体的产量也随之提高(Crouse等，分子细胞生物学3：257(1983))。
宿主细胞可用本发明的两个表达载体共转染，第一个载体编码重链衍生的多肽，第二个载体编码轻链衍生的多肽。这两个载体可含有相同的可选择标记，其能相同表达重链和轻链多肽。或者，可使用一个单一载体，其编码并能表达重链和轻链多肽。在这种情况中，轻链应置于重链之前，以避免过量的毒性游离重链(Proudfoot，自然322：52(1986)；Kohler，美国科学院院报77：2197(1980))。重链和轻链编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
一旦已经通过动物，化学合成，或重组表达产生本发明的抗体分子，其可通过本领域已知的任何纯化免疫球蛋白分子的方法纯化，例如通过层析(如离子交换层析，亲和层析，尤其在蛋白A之后特异性抗原层析，及规格柱层析)，离心，差异溶解性，或通过纯化蛋白质的任何其它方法纯化。另外，本发明的抗体或其片段可与本文所述或本领域已知的其它异源多肽序列融合，以易于纯化。
本发明涵盖了重组融合于或化学缀合于(包括共价和非共价缀合)本发明多肽(或其一部分，优选多肽的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90或100个氨基酸)的抗体，以产生融合蛋白。此融合非必需直接融合，可通过接头序列产生。此抗体可特异于除了本发明多肽(或其一部分，优选多肽的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90或100个氨基酸)的抗原。例如，抗体可用于在体外或体内将本发明多肽定向于特殊细胞类型，通过将本发明的多肽融合或缀合于特异于特殊细胞表面受体的抗体而进行。融合或缀合于本发明多肽的抗体还可用本发明已知方法用于体外免疫分析和纯化方法中，见例如Harbor等，如前，和PCT出版物WO93/21232；EP 439095；Naramura等，免疫学通讯39：91-99(1994)；美国专利5474981；Gillies等，PNAS 89：1428-1432(1992)；Fell等，免疫学杂志146：2446-2452(1991)，所述文献以其全文并入参考。
本发明还包括一种组合物，其包含融合或缀合于抗体除可变区之外的结构域的本发明多肽。例如，本发明的多肽可融合于或缀合于抗体Fc区域，或其一部分。融合于本发明多肽的抗体部分可包含恒定区，绞链区，CH1功能域，CH2功能域，和CH3结构域或者完整结构域或其一部分的任意组合。多肽也可融合或缀合于上述抗体部分以形成多聚体。例如，融合于本发明多肽的Fc部分可通过Fc部分之间的二硫键形成二聚体。通过多肽与IgA和IgM部分融合可形成较高多聚体。本领域已知将本发明多肽融合或缀合于抗体部分的方法。见例如美国专利No.5336603；5622929；5359046；5349053；5447851；5112946；EP 307434；EP 367166；PCT出版物WO96/04388；WO 91/06570；Ashkenazi等，美国科学院院报88：10535-10539(1991)；Zheng等，免疫学杂志154：5590-5600(1995)；和Vil等，美国科学院院报89：11337-11341(1992)，所述文献均以全文并入参考。
如前所述，相当于SEQ ID NO：2或4的多肽，多肽片段或变体，可融合或缀合于上述抗体部分，以提高多肽在体内的半衰期或用于免疫分析中。另外，相当于SEQ ID NO：2或4的多肽，多肽片段或变体，可融合或缀合于上述抗体部分以易于纯化。一报道的实施例阐述了由人CD-4多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白的重链或轻链恒定区的各种结构域组成的嵌合蛋白(EP 39482)；Traunecken等，自然331：84-86(1988)。融合或缀合于具有二硫键联的二聚体结构的抗体(由于IgG所致)的本发明多肽，也可比单体分泌的蛋白质或单独的蛋白质片段更有效地结合与中和其它分子(Fountoulakis等，生物化学杂志270：3958-3964(1995))。在许多情况中，融合蛋白中Fc部分在治疗和诊断中是有益的，因此例如可改善药物动力学性质。(EP A 232 262)。或者，在融合蛋白已被表达，检测和纯化后缺失的Fc部分，将是所需的。例如，如果融合蛋白用作免疫抗原，则Fc部分可阻碍治疗和诊断。在药物开发中，例如在高产量筛选分析中人体蛋白如hIL-5已与Fc部分融合，以鉴别hIL-5的拮抗剂(见Bennett等，分子识别杂志8：52-58(1995)；Johanson等，生物化学杂志270：9459-9471(1995)。
另外，本发明的抗体或其片段可融合于标记序列如肽以易于纯化。在优选的实施方案中，标记氨基酸序列是6组氨酸肽，如在pQE载体中提供的标记(QIAGEN公司，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)，其中许多是可商购的。如Gentz等，美国科学院院报86：821-824(1989)所述，6-组氨酸可进行常规纯化融合蛋白。用于纯化的其它肽标记包括但非限于“HA”标记，其相当于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，细胞37：767(1984))，和“flag”标记。
本发明还涵盖了缀合于诊断或治疗剂的抗体或其片段。抗体可诊断性地例如用于监测肿瘤的发生和转移，作为临床检测方法的一部分以例如确定给定的治疗方案的效力。可通过将抗体偶联于可检测物质而便于进行检测。可检测物质例如可包括各种酶，辅基，荧光物，发光物，生物发光物，放射性物质，用各种正电子发射断层显象法的发射正电子金属，和非放射性顺磁金属离子。使用本领域已知方法，将可检测物质直接偶联或缀合于抗体(或其片段)，或间接通过中间物(例如本领域已知的接头)偶联或缀合于抗体(或其片段)，见例如美国专利No.4741900阐述了可缀合于抗体根据本发明可用于诊断的金属离子。适当的酶例如包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱脂酶；适当的辅基复合物包括链亲和素/生物素，和亲和素/生物素；适当的荧光物包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯三嗪胺荧光素，丹磺酰氯；适当的发光物包括鲁米诺；生物发光物例如包括荧光素酶，荧光素和水母蛋白；适当的放射性物质例如包括125I，131I，111In，或99Tc。
另外，抗体或其片段可缀合于治疗性组分如细胞毒素，例如细胞静止或杀细胞性制剂，治疗性制剂或放射性金属离子如α-发射物例如213Bi。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞不利的任何制剂。例如包括paclitaxol，细胞松驰素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，吐根碱，丝裂霉素，表鬼臼毒吡喃葡糖苷，表鬼臼毒噻吩糖苷，表鬼臼毒噻吩糖苷长春新碱，长春花碱，秋水仙素，阿霉素，道诺红菌素，二羟炭疽菌素，mitoxantrone，光神霉素，放线菌素D，1-脱氢睾酮，糖皮质激素，procaine，tetracaine，lidocaine，propranolol，和嘌呤霉素及它们的类似物或同源物。治疗剂包括但非限于抗代谢物(如氨甲喋呤，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，cytarbine，5-氟尿嘧啶decarbazine)，烷化剂(如mechlorethamine，thioepachlorambucil，苯丙氨酸氮芥，卡氮芥，carmustine(BSNU)和lomustine(CCNU)，cyclothosphamide，busulfan，dibromomannitol，streptozotocin，丝裂霉素C，和顺-二胺二氯铂(II)(DDP)顺铂)，anthracyclines(如道诺红菌素(道诺霉素前体)和阿霉素)，抗生素(如dactinomycin(放线菌素前体)，博来霉素，光神霉素，和氨茴霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(如长春新碱和长春花碱)。
本发明的缀合物可用于修饰给定的生物应答。治疗剂或药物组分非限于如传统化学治疗剂般构建。例如，药物组分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括例如毒素如相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白A，假单胞杆菌外毒素，或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子，α-干扰素，β-干扰素，神经生长因子，血小板衍生生长因子，组织纤溶酶原激活物，细胞程序死亡剂如TNF-α，TNF-β。AIMI(见国际出版物No.WO97/33899)，IMII(见国际出版物No.WO97/34911)，Fas配体(Takahashi等，免疫学进展6：1567-1574(1994))，VEGI(见国际出版物No.WO 99/23105)，thrombotic剂或抗血管生成剂如angiostatin或endostatin；或生物应答修饰剂例如淋巴因子，白细细介素-1(IL-1)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-6(IL-6)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其它生长因子。
抗体可附着于特别用于免疫分析或纯化靶抗原的固体支持物。这种固体支持物包括但非限于玻璃，纤维素，聚丙烯酰胺，尼龙，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。
本领域熟知将这种治疗组分缀合于抗体的方法，见例如Arnon等，“在癌症治疗中免疫定向药物的单克隆抗体”，单克隆抗体和癌症治疗，Reisfeld等编辑，p243-56(Alan R.Liss公司，1985)；Hellstrom等，“药物输送抗体”，控制的药物输送(第2版)，Robinson等编辑，p623-53(Marcel Dekker公司，1987)；Thonpe，“癌症治疗中胞毒剂的抗体载体综述”，单克隆抗体’84：生物和临床应用，Pinchera等编辑，p475-506(1985)；“在癌症治疗中治疗性使用放射标记的抗体的分析，结果和特征”，检测和治疗癌症中的单克隆抗体，Baldwin等编辑，p303-16(科学出版社，1985)，和Thorpe等，“抗体—毒素缀合物的制备和胞毒性”，免疫学综述62：119-58(1982)。
或者，抗体可缀合于另一种抗体以形成抗体异源缀合物，如Segal的美国专利No.4676980所述，以其全文并入参考。
有或无治疗组分缀合于其的抗体，可单独施用或与胞毒因子和/或细胞因子组合施用，以进行治疗。
免疫表型：
本发明的抗体可用于对细胞系和生物样品进行免疫表型。本发明基因的翻译产物可用作细胞特异性标记，或更特别地作为细胞标记，其在特殊细胞类型的分化和/或成熟的各个阶段不同表达。直接抗特异性表位或表位组合的单克隆抗体，可以筛选表达此标记的细胞群。可利用各种使用单克隆抗体的方法筛选表达标记的细胞群，包括用抗体包被的磁性珠磁性分离，用附着于固体基质(即平板)的抗体“淘选”，和流式细胞计量(见例如美国专利5985660；和Morrison等，细胞96：737-49(1999))。
这些方法可以筛选特殊细胞群，如可发现血液恶性肿瘤(即急性白血病患者最小残余病(MRD))，和移植中的“非自身”细胞以预防移植物抗宿主疾病(GVHD)。或者，这些方法可筛选能经历增殖和/或分化的造血干细胞和祖细胞，如可在人脐带血中发现的细胞。
抗体结合分析：
可通过本领域已知的任何方法分析本发明抗体的免疫特异性结合。可使用的免疫分析包括但非限于竞争性和非竞争性分析系统，所用方法如Western印迹，放射免疫分析，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“夹心”免疫分析，免疫沉淀分析，沉淀素反应，凝胶扩散沉淀素反应，免疫扩散分析，凝集分析，补体固定分析，免疫放射分析，荧光免疫分析，蛋白A免疫分析等等。这些分析在本领域是常规且熟知的。(见例如Ausubel等编辑，1994，分子生物学通用方法，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，纽约，以其全文并入参考)。以下简要举例简述了一些免疫分析(非限制性)。
免疫沉淀方法通常包括裂解在裂解缓冲液中的细胞群，裂解缓冲液如补加蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(如EDTA，PMSF，抑蛋白酶肽，钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％ NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠，pH 7.2，1％Trasylol)，将相应抗体加入细胞裂解物中，在4℃温育一段时间(如1-4小时)，向细胞裂解物中加入蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠，在4℃温育大约1小时或更长时间，在裂解缓冲液中冲洗此珠，并将此珠再悬浮于SDS/样品缓冲液中。相应抗体免疫沉淀特殊抗原的能力可通过例如Western印迹分析确定。本领域技术人员已知可对参数加以修改以提高抗体与抗原的结合，并减少背景(如用琼脂糖珠预先澄清细胞裂解物)。关于免疫沉淀的进一步论述见例如Ausubel等编辑，1994，分子生物学通用方法，第1卷，John Wiley &Sons，Inc.，纽约，在10.6.1中所述。
Western印迹分析通常包括制备蛋白质样品。在聚丙烯酰胺凝胶中电泳此蛋白质样品(如根据抗原分子量使用8％-20％SDS-PAGE)，将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶中移至膜上如硝酸纤维素膜，PVDF膜或尼龙膜，将此膜在封阻液中封阻(如具有3％BSA或脱脂乳的PBS)，在冲洗液中冲洗此膜(如PBS-Tween 20)，用在封阻液中稀释的原始抗体(相应抗体)封阻此膜，在冲洗液中冲洗此膜，用二级抗体封阻此膜，二级抗体是在封阻液中稀释的缀合于酶促底物(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸)或放射性分子(如32p或125I)的抗体，其识别原始抗体如是抗人抗体，将此膜在冲洗液中冲洗，并检测抗原存在情况。本领域技术人员已知可对参数加以修改，以提高信号检测并降低背景干扰。关于Western印迹方法的进一步阐述见例如Ausubel等编辑，1994，分子生物学通用方法，第1卷，John Wilety & Sons，Inc.，纽约，在10.8.1中所述。
ELISA包括制备抗原，用抗原包被96孔微滴定平板的孔，向孔中加入缀合于可检测化合物如酶促底物(如辣根氧化物酶或碱性磷酸酶)的相应抗体，温育一段时间，检测抗原的存在情况。在ELISAs中，相应抗体非必须缀合于可检测化合物；可将缀合于可检测化合物的二级抗体(其识别相应抗体)加入孔中。另外，可用抗体包被孔代替用抗原包被孔。在这种情况中，缀合于可检测化合物的另一种抗体可在加入相应抗体之后加入包被的孔中。本领域技术人员已知可对参数加以修改以提高信号检测及对ELISA可作其它改变。关于ELISA的进一步阐述见例如Ausubel等编辑，1994，分子生物学通用方法，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，纽约，11.2.1所述。
抗体与抗原的结合亲和性和抗体抗原相互作用的off-rate可通过竞争性结合分析确定。竞争性结合分析例如是放射性免疫分析，包括用相应的抗体在存在增加量未标记的抗原的情况下，温育标记的抗原(如3H或125I)，并检测与标记的抗原结合的抗体。相应抗体与特殊抗原的结合亲和性及结合off-rate可通过Scatchard印迹分析的结果确定。与另一种抗体的竞争也可用放射免疫分析确定。在这种情况中，抗原用缀合于标记的化合物(如3H或125I)的相应抗体，在存在增加量未标记的另一种抗体的情况下温育。
治疗应用
本发明还小及一种基于抗体的治疗方法，包括将本发明的抗体施用于动物，优选哺乳动物，更优选病人，以治疗一或多种所述的疾病，功能失调或病理状态。本发明的治疗化合物包括但非限于本发明的抗体(包括其片段，类似物和衍生物)，和编码本发明抗体的核酸。本发明可用于治疗，抑制或预防与本发明多肽异常表达和/或活性相关的疾病，功能失调或病理状态，包括但非限于本文所述的一或多种疾病，功能失调或病理状态。治疗或预防与本发明多肽异常表达和/或活性相关的疾病，功能失调或病理状态，包括但非限于改善与这些疾病，功能失调或病理状态相关的症状。本发明的抗体可以制成药学合适的组合物，如本领域已知或本文所述。
本发明抗体可治疗性应用的途径包括将本发明的多核苷酸或多肽局部或全身性地结合于体内，或通过抗体的直接胞毒性，例如由补体细胞(CDC)或效应细胞(ADCC)介导。这些方法在下文加以详细阐述。根据本文教导，本领域技术人员知道怎样使用本发明的抗体进行诊断，监测或治疗，而不需要过多的试验。
本发明的抗体可与其它单克隆或嵌合抗体，或与淋巴因子或造血生长因子(如IL-2，IL-3和IL-7)组合应用，例如可提高与抗体相互作用的效应细胞的数目或活性。
本发明的抗体可单独施用或与其它类型的治疗方法组合施用(如放疗，化疗，激素疗法，免疫疗法和抗肿瘤剂)。通常地，施用的产物的来源或物种反应性(在抗体的情况下)优选是与病人相同的物种的。因此在一优选的实施方案中，将人抗体，其片段、衍生物，类似物或核酸施用于人，以进行治疗或预防。
优选使用抗本发明多肽或多核苷酸的高亲和性和/或潜在体内抑制和/或中和抗体，其片段或区域，以进行免疫分析和治疗与本发明多核苷酸或多肽包括其片段相关的疾病。这种抗体，片段或区域优选与本发明的多肽或多核苷酸有亲和性。优选的结合亲和性包括解离常数或kd小于以下数值：5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，和10-15M。
基因治疗
在一特异的实施中，施用包含编码抗体或其功能性衍生物的序列的核酸，通过基因疗法治疗，抑制或预防与本发明多肽异常表达和/或活性相关的疾病或功能失调。基因疗法是指通过为治疗对象施用表达的或可表达的核酸而进行治疗的方法。在本发明的这种实施方案中，核酸产生其编码的蛋白质介导治疗作用。
根据本发明可使用本领域中任何适当的基因治疗方法。例如以下所述的方法：
关于基因治疗的一般论述见于Gold spiel等，临床药理学12：488-505(1993)；Wu和Wu，生物治疗3：87-95(1991)Tolstoshev，药物毒性分析研究32：573-594(1993)；Mulligan，科学260：926-932(1993)；May，TIBITECH 11(5)：155-215(1993)。可使用的本领域已知的重组DNA方法见于Ausubel等编辑，分子生物学通用方法，John Wiley & Sons，NY(1993)；和Kriegler，基因转移和表达实验手册，Stockton出版社，NY(1990).
优选的一方面，化合物包含编码抗体的核酸序列，所述核酸序列是在适当宿主中表达抗体或其片段或嵌合蛋白或重链或轻链的表达载体的一部分。尤其地，这种核酸序列具有可操纵地连于抗体编码区的启动子，所述启动子是可诱导的或组成型的，及任选地是组织特异性的。在另一特殊的实施方案中，使用的核酸分子其中抗体编码序列和任何其它所需序列，位于基因组中所需位点启动同源重组的区域两则，因此可使抗体编码核酸在染色体内表达(Koller和Smithies，美国科学隆隆报86：8932-8935(1989)；Zijlstra等，自然342：435-438(1989)。在特异的实施方案中，表达的抗体分子是一单链抗体；或者，核酸序列包括编码抗体的重链和轻链，或其片段的序列。
将核酸施用于患者可通过直接或间接方式，直接方式是将患者直接曝露于核酸或携带核酸的载体，间接方式是将细胞首先用核酸在体外转化，然后移植到患者体内。这两种方法分别称为体内或源于体内的基因疗法。
在一特异的实施方案中，将核酸序列直接在体内施用，其在体内被表达从而产生编码的产物。这可通过本领域已知的许多方法进行，例如将它们构建为适当的表达载体的一部分，并施用由此成为胞内一部分，例如通过用缺陷的或弱化的逆转录病毒或其它病毒感染(见美国专利NO.4980286)，或通过直接注射裸DNA，或通过使用微粒轰击(如基因枪，Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，在脂质体微粒或微胶囊化，或与已知进入细胞核的肽连接而施用，与配体连接进行受体介导的胞吞作用而施用(见例如Wu和Wu，生物化学杂志262：4429-4432(1987))(其可用于定向特异表达受体而细胞类型)，等等。在另一实施方案中，可形成核酸一配体复合物，其中配体包含融合病毒肽以破坏核内体，使核酸免于被溶酶体降解。在另一实施方案中，核酸可在体内通过定向特异受体的特异定向，以进行细胞特异性吸收和表达(见例如PCT出版物WO92/06180；WO92/22635；WO92/20316；WO93/1188，WO93/20221)。或者，可通过同源重组将核酸导入细胞内和掺入宿主细胞DNA中以进行表达(Koller和Smithies，美国科学院院报86：8932-8935(1989)；Zijlstra等，自然342：435-438(1989))。
在一特异的实施方案中，使用含有编码本发明抗体的核酸序列的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(见Niller等，酶学方法217：581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有正确包装病毒基因组和整合入宿主细胞DNA所必需的组分。将在基因疗法中使用的编码抗体的核酸序列克隆入一或多个载体中，该载体易于将基因输送于病人。关于逆转录病毒载体的更详细论述见于Boesen等，生物治疗6：291-302(1994)，其阐述了使用逆转录病毒载体将mdrL基因输送于造血干细胞；以使干细胞对化疗更有抗性。在基因治疗中使用逆转录病毒载体的其它参考文献例如是Clowes等，临床研究杂志93：644-651(1994)；Kiem等，血液83：1467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg，人体基因治疗4：129-141(1993)；和Grossman和Wilson，遗传和发育通用观点3：110-114(1993)。
腺病毒是可用于基因治疗的另一种病毒载体。腺病毒是将基因输送于呼吸道上皮的特别适合的载体。腺病毒自然感染呼吸道上皮导致轻微疾病。基于腺病毒的输送系统的基它靶器官是肝，中枢神经系统，内皮细胞和肌。腺病毒具有能感染未分化细胞的优势。Kozarsky和Wilson，遗传与发育通用观点3：499-503(1993)提出了一种基于腺病毒的基因疗法。Bout等，人体基因治疗5：3-10(1994)论证了使用腺病毒载体将基因移至哮喘猴的呼吸道上皮。在基因治疗中使用腺病毒的基它实例见于Rosenteld等，科学252：431-434(1991)；Rosenteldt，68：143-155(1992)；和Wang等，基因治疗2：775-783(1995)。在一优选的实施方案中，使用腺毒载体。
腺伴随病毒(AAV)也已用于基因治疗中(Walsh等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204-289-300(1993)；美国专利No.5436 146)。
基因治疗的另一方法包括将基因移至组织培养物中的细胞中，通过如电穿孔，脂染，磷酯钙介导的转染，或病毒感染等方法。转移方法一般包括将可选择标记移至细胞中。然后将细胞选择放置以分离那些吸收并表达转移的基因的细胞，然后将这些细胞输送于患者。
在此实施方案中，将核酸导入细胞中，之后在体内施用所得重组细胞。这种导入可通过本领域已知的任何方法进行，包括但非限于转染，电穿孔，微注射，用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染，细胞融合，染色体介导的基因转移，微细胞介导的基因转移，原生质球融合等。本领域已知许多将外源基因导入细胞的方法(见例如Loeffier和Behr，酶学方法217：599-618(1993)；Cohen等，酶学方法217：618-644(1993)；Cline.，药物治疗29：69-92m(1985)，根据本发明可以使用这些方法，保证受体细胞的基本发育和生理功能不被破坏。所用方法应稳定地将核酸移至细胞，以使核酸可由细胞表达，并优选可由其细胞子代遗传和表达。
所得重组细胞可通过本领域已知的各种方法输送于患者。重组血细胞(如造血干细胞或祖细胞)优选静脉内施用。细胞用量根据所需效应，病人状态等而定，并可由本领域技术人员确定。
可导入核酸以进行基因治疗的细胞包括任何所需的适当细胞类型，包括但非限于上皮细胞，内皮细胞，角质形成细胞，成纤维细胞，肌细胞，肝细胞；血细胞如T淋巴细胞，B淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞，嗜中性白细胞，嗜酸性粒细胞，巨核细胞，粒细胞；各种干细胞或祖细胞，尤其造血干细胞或祖细胞，如得自骨髓，脐带血，周围血，胎儿肝脏等的造血干细胞或祖细胞。
在一优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自身的。
在基因治疗中使用重组细胞的一实施方案中，将编码抗体的核酸序列导入细胞中，这样其可由细胞或细胞子代表达，然后将重组细胞在体内施用以进行治疗。在一特异的实施方案中，使用干细胞或祖细胞。根据本发明的此实施方案可潜在使用可在体外分离和保持的任何干细胞和/或祖细胞(见例如PCT出版物WO94/08598；Stemple和Anderson，细胞71：937-985(19892)；Rheinwald，细胞生物学方法21A：229(1980)；和Pittelkow和Scott，Aayo Clinic Proc.61：771(1986))。
在一特异的实施方案中，在基因治疗中导入的核酸包含可操纵地连于编码区的可诱导启动子，这样核酸的表达可通过控制适当转录诱导子的存在与否而加以控制。论证治疗或预防活性。
本发明的化合物或药物组合物优选在体外测试，然后在体内测试所需的治疗或预防活性，之后再用于人体，例如，在体外分析论证化合物或药物组合物的治疗或预防活性，包括化合物对细胞系或患者组织样品的作用。化合物或组合物对细胞系和/或组织样品的作用，可通过本领域已知方法确定，包括但非限于花结形成分析和细胞裂解分析。根据本发明，可使用的确定特异化合物的施用是否是指定的体外分析，包括体外细胞培养分析，其中将病人组织样品生长于培养基中，曝露于或另外施用化合物，观测这种化合物对组织样品的作用。
治疗性/预防性施用及组合物
本发明提供了通过为治疗对象施用有效量的本发明化合物或药物组合物，优选本发明抗体，以进行治疗，抑制和预防的方法。优选的一方面，化合物是基本纯化的(如基本没有限制其作用或产生非所需副作用的物质)。治疗对象优选是动物，包括但非限于牛、猪、马、鸡、猫、狗等，优选是哺乳动物，更优选是人。
当化合物包含核酸或免疫球蛋白时，可应用的施用配方和方法如上所述；其它适当的配方和施用途径可选自以下所述。
已知许多输送系统并可用于施用本发明的化合物，例如在脂质体、微粒、微囊中胶囊化，能表达化合物的重组细胞，受体介导的胞吞(见例如Wu和Wu，生物化学杂志，262：4429-4432(1987))，将核酸构建为逆录病毒或其它载体的一部分等，导入方法包括但非限于皮内，肌内，腹膜内，静脉内，皮下，鼻内，epidural和口服。化合物或组合物可通过任何常规途径施用，例如通过融合或大丸注射，通过上皮或粘膜与皮肤界线(如口腔粘膜，直肠和小肠粘膜等)吸收，及可与其它生物活性剂一起施用。可系统或局部施用。另外，可通过任何适当途径将本发明的药物化合物或组合物导入中枢神经系统，包括静脉内和动脉内注射；静脉内注射可通过静脉内导管注射，例如附着于贮液槽如Ommaya贮液槽，也可使用肺部施用，如通过使用吸入器或喷雾器，及使用具有雾化剂的配方。
在一特异的实施方案中，可将本发明的药物化合物或组合物局部施用于需要治疗的部位；这可例如但非限于通过在手术期间局部灌注，局部应用如在手术后与伤口加压结合，通过注射，利用导管，利用栓剂，或利用移植体，所述移植体是有孔，无孔或凝胶物，包括膜如sialastic膜或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质包括抗体时，必须注意使用该蛋白质不吸收的物质。
在另一实施方案中，化合物或组合物可在载体中输送，尤其在脂质体中(见Langer，科学249：1527-1533(1990))；Treat等，感染性疾病和癌症治疗中的脂质体，Lopez-Berestein和Fidler编辑，Liss，纽约，pp 3353-35(1989)；Lopez-Berstein，如上，pp 317-327；如上)。
在另一实施方案中，化合物或组合化合物可在控制释放系统中输送。在一实施方案中，可使用泵(见Langer，如前；Sefton，CRCCrit.Ret.Biomed.Eng.14：20l(1987)；Buchwald等，外科学88：507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。在另一实施方案中，可使用多聚体物质(见控制释放的医学应用，Langer和Wise编辑，CRC出版社，Boca Raton，Floride(1974)；控制的药物生物适应性，药品设计与生产，Smolen和Ball编辑，Wiley，纽约(1984)；Ranger和Pdppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；也见于Levy等，科学228：190(1985)；During等，神经学分析25：351(1989)；Howard等，神经药物杂志71：105(1989)。在另一实施方案中，控制的释放系统可置于治疗靶器官的邻近，即脑组织中，因此只需要全身剂量的一部分(见例如Goodson，控制释放的医学应用，如前，第2卷，pp 115-138(1984))。
其它控制释放系统参见Langre所述(科学249：1527-1533(1990))。
在一特异的实施方案中，其中本发明的化合物是编码蛋白质的核酸，可将核酸在体内施用以促进其编码的蛋白质表达，通过将其构建为适当核酸表达载体的一部分，并将其施用，以使其成为胞内一部分，例如使用逆转录病毒载体(见美国专利No.4980286)或通过直接注射，或使用微粒轰击(如基因枪，Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或与已知进入细胞核的类同源核的类同源框肽连接而施用(见例如Joliot等，美国科学院院报88：1864-1868(1991))等。或者，可通过同源重组将核酸导入细胞内或掺入宿主细胞DNA中表达。
本发明还提供了药物组合物。这种组合物包含治疗有效量的化合物，和药物适当的载体。在一特异的实施方案中，术语“药物适当的”是指联邦政府或政府部门管理机构批准的，或美国药曲或其它公认药典中所列的可用于动物尤其是人的物品。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂，佐剂，赋形剂或运载体。这种药物载体可以是无菌液体如水和油，包括石油，动物油，植物油或合成油，如花生油、豆油、矿物油，芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液及甘油溶液也可用作液体载体，尤其可注射溶液。适当的药物赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽糖，米，面粉，石灰，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油，滑石，氯化钠，无水脱脂乳，甘油，丙烯，二醇，水，乙醇等。如果需要，组合物也可含有少量湿化或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以是溶液，悬浮液，乳液，片剂，丸剂，胶囊、粉末，缓释配方等。组合物可用传统结合剂和载体如甘油三酯配制为栓剂。口服配方可包括标准载体如药物梯度的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁、糖精钠，纤维素，碳酸镁等。适当的药物载体例如由E.W.Martin的“Remington’s药物科学”所述。这种组合物含有治疗有效量的化合物，优选纯化形式的，及适量的载体，以提供施用于患者的适当形式。配方应适于施用方式。
在优选的实施方案中，组合物是根据配制适于静脉内施用于人体的药物组合物的常规方法配制的。典型地，静脉内施用的组合物是在无菌等渗水溶液缓冲液中的溶液。如果需要，组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂如Lignocaine，以减轻注射部位的疼痛。通常地，单独或以单位剂量形式混合的配料，例如在密封的容器中干燥冻干的粉末或无水浓缩物，密封的容器如是表明活性数量的安瓿或Sachette。在通过灌注施用组合物之处，其可用含有无菌药物级水或盐水的灌注瓶分液。在通过注射施用组合物之处，可提供一安瓿无菌注射用水或盐水，以在施用前将配料混合。
本发明的化合物可以中性或盐形式配制，药物适当的盐包括阴离子如产生自盐酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等，和与阳离子如产生自NaOH，KOH，NH4OH，Ca(OH)2，Fe(OH)2，异丙胺，三乙胺，2-乙氨乙醇，组胺，procaine等形成的盐。
可通过标准临床方法确定本发明化合物的数量，该数量在治疗，抑制和预防与本发明多肽异常表达和/或活性相关的疾病或功能失调中是有效的。另外，可任选地应用体外分析，以助于鉴别最佳剂量范围。配方中所应用的实际剂量根据施用途径，疾病程度而定，并应根据医生诊断和每个病人的状况而定。有效剂量可从体外或动物模型测式系统产生的剂量应答曲线中推断。
就抗体而言，施用于患者的剂量为0.1mg/kg体重-100mg/kg体重。优选地，施用于患者的剂量为0.1mg/kg体重-20mg/kg体重，更优选为1mg/kg体重-10mg/kg体重。通常地，人抗体比其它物种的抗体在人体内的半衰期长，这是因为对外源多肽的免疫应答所致。因此，通常可以非频繁施用较少剂量的人抗体。另外，本发明抗体施用剂量和频率，可通过对抗体加以修饰例如脂质化，而增强吸收和进入组织(如进入脑组织)的能力，从而减少施用本发明抗体的剂量和频率。
本发明还提供了一种药物包装或试剂盒，其包含一或多个充填本发明药物组合物的一或多种配料的容器。这种容器中有一份由政府管理生产，使用或销售药物或生物制品的机构所准许的告示，反映该药物可用于人体。
诊断和显影：
特异结合相应多肽的标记的抗体，及其衍生物和类似物，可用于检测，诊断或监测与本发明多肽的异常表达和/或活性相关的疾病，功能失调和/或病理状态。本发明提供了检测相应多肽异常表达的方法，包括(a)用一或种特异于相应多肽的抗体，分析在个体的细胞或体液中相应多肽的表达，和(b)将此基因表达水平与标准基因表达水平相对比，分析的多肽基因表达水平与标准表达水平相比提高或降低，表明是异常表达。
本发明提供了论断疾病的分析方法，包括(a)用特异于相应多肽一或多种抗体，分析在个体的细胞或体液中相应多肽的表达，和(b)将此基因表达水平与标准基因表达水平相对比，从而分析的多肽基因基因表达水平与标准表达水平相比提高或降低，表明特定疾病的存在。就癌症而言，个体活检组织中存在相对高数量的转录物，可表明疾病发生的倾向，或提供在实际临床症状出现之前检测疾病的一种方法。这种诊断方法更明确可使医生早期应用预防措施或大胆治疗，从而防止癌症发生或进一步转移。
可使用本发明的抗体分析生物样品中蛋白质水平，使用本领域已知的传统免疫组织学方法(见例如Jalkanen等，细胞生物学杂志101：976-985(1985)：Jaldanen等，细胞生物学杂志105：3087-3096(1987))。用于检测蛋白质基因表达的其它基于抗体的方法包括免疫分析，如酶联免疫吸附测定(ELISA)，和放射免疫分析(RIA)。本领域已知适当的抗体分析标记，并包括酶标记，如葡糖氧化酶；放射性同位素，如碘(125I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(112In)和锗(99Tc)发光标记，如鲁米诺；和荧光标记，如荧光素和罗丹明和生物素。
本发明的一个方面是检测和论断在动物体，优选哺乳动物，更优选在人体与相应肽异常表达相关的疾病或功能失调。在一实施方案如，诊断方法包括：a)为治疗对象施用(例如经非肠道，皮下或腹膜内施用)有效量的特异结合相应多肽的标记的分子；b)施用后间隔一段时间，以使标记的在治疗对象体内表达多肽的部位优选浓缩(并从背景水平清除未结合的标记的分子)；c)确定背景水平；和d)检测治疗对象中标记的分子，这样检测标记的分子高于背景水平，表明对象具有与相应多肽异常表达相关的特殊病症或功能失调。可通过各种方法确定背景水平，包括将检测的标记的分子的数量与预先在特定系统中确定的标准值相对比。
本领域知道根据对象的大小和使用的显影系统，确定产生诊断图像所需的显影组分的数量。在放射性同位素组分的情况下，对人而言，注射的放射性物质的数量通常为大约5-20毫居里的99mTc。然后标记的抗体或抗体片段优先在含有特异蛋白质的细胞累积。体内肿瘤显影见S.W.Burchiel等，“放射标记的抗体及其片段的免疫药物学”，(肿瘤显影：癌症的放射性化学检测，第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编辑，Masson出版公司(1982))所述。
根据各种变化，包括使用的标记类型和施用模式，在施用后以使标记的分子优先在对象一定部位浓缩，及从背景水平清除未结合的标记的分子，所间隔的时间为6-48小时或6-24小时，或6-12小时。在另一实施方案中，施用后的间隔时间为5-20天或5-10天。
在一实施方案中，监测疾病或功能失调是通过重复诊断疾病的方法进行的，例如在开始诊断后1个月，6个月，1年等重复一次。
可使用本领域已知体内扫描方法检测病人体内标记的分子的存在情况。这些方法依赖于所使用的标记类型。熟练技术人员可确定检测特殊标记的适当方法。可用于本发明诊断方法和设备包括但非限于CT，全身扫描如正电子发射断层显象(PET)，核磁共振显像(MRI)和声像。
在一特异的实施方案中，分子是用放射性同位素标记的，并用辐射应答外科仪器在病人体内检测的(Thruston等，美国专利No.5441050)。在另一实施方案中，分子是用荧光化合物标记的，并用荧光应答扫描仪在病人体内检测的。在另一实施方案中，分子是用发射正电子金属标记的，并用正电子发射断层显象在病人体内检测。在另一实施方案中，分子是用顺磁性标记标记的，并用核磁共振显象(MRI)在病人体内检测。
试剂盒：
本发明提供了可在上述方法中使用的试剂盒。在一实施方案中，试剂盒包含一或多个装有本发明的抗体，优选纯化的抗体的容器。在一特异的实施方案中，本发明的试剂盒含有一基本分离的多肽，其包含与试剂盒中的抗体特异性免疫反应的表位。优选地，本发明的试剂盒还包含对照抗体，其不与相应多肽反应。在另一特异的实施方案中，本发明的试剂盒含有一种检测抗体与相应多肽结合的方法(例如，可将抗体与可检测物如荧光化合物，酶底物，放射性化合物或发光化合物缀合，或者可将识别第一种抗体的第二种抗体与可检测底物缀合)。
在本发明另一特异的实施方案中，试剂盒是一种用于筛选含有抗体的血清的诊断试剂盒，该抗体特异抗增殖性和/或癌性多核苷酸和多肽。这种试剂盒可包括基本分离的多肽抗原，其包含与至少一种抗多肽抗原抗体特异性免疫反应的表位。另外，这种试剂盒包括检测所述抗体与抗原结合的方法(例如，可将抗体与荧光化合物缀合，如可通过流式细胞计量术检测的荧光素或罗丹明)。在特异的实施方案中，试剂盒可包括重组产生的或化学合成的多肽抗原。试剂盒的多肽抗原也可附着于固体支持物。
在更特异的实施方案中，上述试剂盒的检测方法包括一固体支持物，所述多肽抗原附着于其。这种试剂盒还可包括非附着的报道分子标记的抗人抗体。在此实施方案中，抗体与多肽抗原的结合可通过所述报道分子标记的抗体的结合而检测。
在另一实施方案中，本发明包括用于筛选血清的诊断试剂盒，该血清含有本发明多肽的抗原。此诊断试剂盒包括基本分离的与多肽或多核苷酸抗原特异性免疫反应的抗体，和检测多核苷酸或多肽抗原与抗体结合的方法。在一实施方案中，抗体附着于固体支持物。在一特异的实施方案中，抗体可以是单克隆抗体。试剂盒的检测方法可包括另一种标记的单克隆抗体。或者，或另外，检测方法可包括标记的竞争抗原。
在一诊断性构型中，测试血清与通过本发明方法获得的表面结合抗原的固相试剂反应。在特异性抗原抗体与试剂结合，并通过冲洗除去未结合的血清成分后，试剂与报道分子标记的抗人抗体反应，报道分子与试剂的结合与固体支持物上结合的抗抗原抗体的数量成比例。将此试剂再次冲洗以除去未结合的标记的抗体，并确定与试剂相关的报道分子数量。典型地，报道分子是一种酶，其可通过在存在适当的荧光性，发光性或比色底物的情况下，温育此固相支持物而检测(Sigma，St.Louis，MO)。
上述分析中的固体表面试剂，是通过将蛋白质附着于固体支持物的已知方法制备的，固体支持物如聚合物珠，96孔平板或滤膜。这些附着方法一般包括将蛋白质非特异性吸附于支持物，或通过游离氨基将蛋白质共价附着于固体支持物上的化学反应基团，如活化的羧基，羟基，或醛基。或者，可使用链亲和素包被的平板与生物素酰化的抗原。
因此，本发明提供了进行这种诊断方法的分析系统或试剂盒。此试剂盒通常包括具有表面结合重组抗原的支持物，和报道分子标记的抗人抗体，以检测表面结合的抗抗原抗体。
多核苷酸：
包含本发明多核苷酸的分离的核酸分子包括：血小板衍生生长因子A(PDGF-A)，如欧洲专利EP-682110(SEQ ID NO：1)所揭示；血小板衍生生长因子B(PDGF-B)，如欧洲专利EP-282317(SEQ ID NO：3)所揭示；胎盘生长因子(PlGF)，如国际出版物WO 92/06194(SEQ ID NO：5)所揭示；胎盘生长因子-2(PlGF-2)，如Hauser等，生长因子4：259-268(1993)(SEQ ID NO：7)所揭示；胶质瘤衍生生长因子(GDGF)，如欧洲专利EP-399816(SEQID NO：9)所揭示；血管内皮生长因子(VEGF)，如国际出版物WO90/13649(SEQ ID NO：11)所揭示；血管内皮生长因子-A(VEGF-A)，如欧洲专利EP-506477(SEQ ID NO：13)所揭示；血管内皮生长因子-2(VEGF-2)，如国际出版物WO96/39515(SEQ IDNO：15)所揭示；血管内皮生长因子-3(VEGF-3)，如国际出版物WO96/39421(SEQ ID NO：17)所揭示；血管内皮生长因子-D(VEGF-D)，如国际出版物WO98/07832(SEQ ID NO：19)所揭示；血管内皮生长因子-D1(VEGF-D1)，如国际出版物WO98/02543(SEQ ID NO：21)所揭示；和血管内皮生长因子-E(VEGF-E)，如德国专利DE 19639601(SEQ ID NO：23)所揭示。以上所提及的文献均以全文并入参考。
本发明的血管生成蛋白均是结构相关的。尤为重要的是在VEGF/PDGF家族的所有成员中，所有8个半胱氨酸残基均是保守的(见图3A-3C的方框区域)。另外，PDGF/VEGF家族的特征，PXCVXXXRCXGCC(SEQ ID NO：29)，在本文所揭示的所有血管生成蛋白中均是保守的(见图3A-3C)。
本发明的血管生成多肽包括全长多肽和多核苷酸序列，多核苷酸序列编码全长多肽的任何前导序列和活性片段。
本发明的多核苷酸可以是RNA或DNA形式，DNA包括cDNA，基因组DNA，和合成DNA。DNA可以是双链或单链的，如果是单链的，可以是编码链或非编码链(反义链)。编码成熟多肽的编码序列可以与表1的核苷酸序列的编码序列相同，或者可以是不同的编码序列，是由编码与SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23的DNA相同的成熟多肽的遗传密码丰余或简并产生的。
编码图3A-3C的代表性成熟多肽的多核苷酸可包括：只是代表性成熟多肽的编码序列；代表性成熟多肽的编码序列和另外的编码序列如前导或分泌序列或前蛋白序列；代表性成熟多肽的编码序列(和任选的另外的编码序列)及非编码序列，如内含子或成熟多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖了只包括多肽编码序列的多核苷酸，以及包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变体，其编码具有图3A-3C推导的氨基酸序列的多肽的片段，类似物和衍生物。多核苷酸可以是天然发生的多核苷酸的等位基因变体，或非天然发生的多核苷酸。
因此，本发明包括编码与图3A-3C所示相同的代表性成熟多肽的多核苷酸，以及这种多核苷酸的变体，此变体编码图3A-3C所示多肽的片段，衍生物或类似物。这种核苷酸变体包括缺失变体，取代变体，和添加或插入变体。
如上所述，多核苷酸可具有一种编码序列，该序列是SEQ IDNO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23编码序列的天然发生的等位基因变体。如本领域所知，等位基因变体是多核苷酸序列的另一种形式，其具有一或多个核苷酸取代，缺失或添加，但基本不改变所编码的多肽的功能。
本发明还包括多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可融合于多核苷酸的相同读框，有助于在宿主细胞表达和分泌多肽，例如，前导序列作为分泌序列以控制多肽转运至细胞。具有前导序列的多肽是一种前蛋白，并可具有由宿主细胞裂解的前导序列，以形成多肽的成熟形式。此多核苷酸还可编码是成熟蛋白加上另外的5’氨基酸残基组成的蛋白原。具有序列原的成熟蛋白是一蛋白原，且是失活形式的蛋白质。一旦序列原裂解，保留活性成熟蛋白。
因此，例如本发明的多核苷酸可编码成熟蛋白，编码具有序列原的蛋白质，或编码具有序列原和前序列(前导序列)的蛋白质。
本发明的多核苷酸也可具有融合于标记序列框中的编码序列，以纯化本发明的多肽。标记序列可以是由PQE-9载体提供的6组氨酸标记，以在细菌宿主的情况中纯化融合于标记的成熟多肽，或者例如当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，标记序列可以是血凝素(HA)标记。HA标记相当于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson.，I.等，细胞37：767(1984))。
本发明的其它实施例方案包括分离的核酸分子，其包括具有与以下序列有至少95％，优选至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：2所示大约1-211位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互补于(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的其它实施例方案包括分离的核酸分子，其包括具有与以下序列有至少95％，优选至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：4所示大约1-241位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互补于(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的其它实施例方案包括分离的核酸分子，其包括具有与以下序列有至少95％，优选至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：6所示大约1-149位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互补于(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的其它实施例方案包括分离的核酸分子，其包括具有与以下序列有至少95％，优选至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：8所示大约1-170位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互补于(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的其它实施例方案包括分离的核酸分子，其包括具有与以下序列有至少95％，优选至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：10所示大约1-190位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互补于(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的其它实施例方案包括分离的核酸分子，其包括具有与以下序列有至少95％，优选至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：12所示大约1-191位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互补于(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的其它实施例方案包括分离的核酸分子，其包括具有与以下序列有至少95％，优选至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码具有SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：14所示氨基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：14所示大约1-214位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互补于(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的其它实施例方案包括分离的核酸分子，其包括具有与以下序列有至少95％，优选至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码具有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：16所示大约1-419位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；(d)编码具有由ATCC保藏号97149的cDNA克隆编码的氨基酸序列的核苷酸序列；(e)编码具有ATCC保藏号97149的cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟VEGF2多肽的核苷酸序列；(f)编码具有ATCC保藏号97149的cDNA克隆编码的氨基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；或(g)互补于(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的其它实施例方案包括分离的核酸分子，其包括具有与以下序列有至少95％，优选至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码具有SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：18所示氨基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：18所示大约1-207位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互补于(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的其它实施例方案包括分离的核酸分子，其包括具有与以下序列有至少95％，优选至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码具有SEQ ID NO：20所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：20所示氨基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：20所示大约1-325位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互补于(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。。
本发明的其它实施例方案包括分离的核酸分子，其包括具有与以下序列有至少95％，优选至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码具有SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：22所示氨基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：22所示大约1-354位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互补于(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的其它实施例方案包括分离的核酸分子，其包括具有与以下序列有至少95％，优选至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码具有SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：24所示氨基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：24所示大约1-132位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互补于(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
具有与编码血管生成多肽的参照核苷酸序列有例如至少95％“相同性”的核苷酸序列的多核苷酸，是指此多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，除了此多核苷酸可包括编码血管生成多肽的参照核苷酸序列的每100个核苷酸有5个点突变。换而言之，为获得含有与参照核苷酸序列有至少95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中5％的核苷酸可缺失或用另外核苷酸取代，或者可将占参照序列中总核苷酸数5％的核苷酸插入参照序列中。参照序列的这些突变可发生在参照核苷酸序列的5’或3’末端，或这些末端之间的任一之处，单独分散于参照序列的核苷酸之间，或以一或多个连续基因存在于参照序列间。
实际上，任何特殊核酸分子是否至少95％、96％、97％，98％或99％与例如SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示核苷酸序列相同，可用已知计算机程序常规确定，例如Bestfit程序(Wisconsin序列分析程序，Version8 for Unix，GeneticsComputer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源序列对比(Advances in Applied Mathematies 2：482-489(1981))，发现二个序列间的最佳同源节段。当使用Bestfit或任何其它序列对比程序，以确定特殊序列是否与本发明的参照序列例如有95％相同性时，当然要设定参数，这样在全长参照核苷酸序列之上计算相同性百分率，并允许有占参照序列总核苷酸数5％的同源缺口。
血管生成“多核苷酸”还包括那结能在严格杂交条件下，与SEQID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示序列，或例如ATCC保藏号97149或75698的cDNA克隆所含序列，或其互补序列杂交的多核苷酸。“严格杂交条件”指在42℃，在包含50％甲酰胺，5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5x Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯，和20μg/ml变性的剪切的鲑精DNA的溶液中温育过夜，随后用0.1×SSC在65℃冲洗滤膜。
核酸分子也可在较低严格杂交条件下与血管生成多核苷酸杂交。杂交严格性和信号检测中的变化，可通过人为操纵甲酰胺浓度(甲酰胺百分率低导致较低严格性)；盐条件，或温度而加以调节。例如，较低严格条件包括在37℃在含有6x SSPE(20×SSPE＝3MNaCl；0.2M Na2HPO4；0.02M EDTA，pH7.4)，0.5％SDS，30％甲酰胺，100μg/ml鲑精封阻DNA的溶液中温育过夜；随后在50℃用1×SSPE，0.1％SDS冲洗。另外，为达到更低严格性，可在严格杂交后用更高盐浓度进行冲洗(如5×SSC)。
注意上述条件的变化可通过包含和/或用另一种封阻剂取代而达到，用于抑制杂交试验中的背景水平。典型的封阻剂包括Denhardt’s试剂，BLOTTO，肝素，变性的鲑精DNA，和可商购的Proprietary配方。包含特异的封阻剂需要修改上述杂交条件，因为相容性的问题。
当然，只与聚A+序列(如序列表中所示cDNA的任何3’末端聚A+序列段)，或只与T(或U)残基的互补序列杂交的多核苷酸，不包括在所述“多核苷酸”内，因为这种多核苷酸与含有聚A序列或其互补序列(如任何双链cDNA克隆)的任何核酸分子均杂交。
与多核苷酸的“一部分”杂交的多核苷酸是指与参照的多核苷酸的至少大约15个，优选至少大约20个，更优选至少大约30个，最优选大约30-70个核苷酸杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。这些多核苷酸如上述用作诊断探针和引物，并在下文详细阐述。
例如：长度至少为20nt”的多核苷酸部分，是指参照多核苷酸的核苷酸序列(如表1的核苷酸序列)的20或更多个连续核苷酸。当然，只与聚A序列(如SEQ ID NO：X的3’末端聚(A)段)，或只与T(或U)残基的互补序列杂交的多核苷酸，不包括在本发明用于杂交本发明核酸一部分的多核苷酸内，因为这种多核苷酸与含有聚(A)序列或其互补序列的任何核酸分子均杂交(如任何双链的cDNA基隆)。
然而，优选的是具有与SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示核苷酸序列，或与编码具有血管生成蛋白活性的多肽的保藏的cDNA的核酸序列，有至少95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列的核酸分子。“具有血管生成活性的多肽”是指在特殊的生物学分析中呈血管生成活性的多肽。例如，血管生成蛋白活性可用例如促分裂原分析或内皮细胞迁移分析加以测定。见例如Olofsson等，美国科学院院报93：2576-2581(1996)和Joukovt，EMBO杂志5：290-298(1996)。“具有淋巴管生成活性的多肽”是指在特殊的生物学活性分析中呈淋巴管生成活性的多肽。例如，血管生成蛋白活性可例如促分裂原分析和内皮细胞迁移分析加以测定。见例如Olofsson等，美国科学院院报93：2576-2581(1996)和Joukov等，EMBO杂志5：290-298(1996)。
当然，由于遗传密码的简并，本领域技术人员可立即意识到大量具有与保藏的cDNA的核酸序列或SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示核酸序列，有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列的核酸分子，将编码“具有血管生成蛋白活性”的多肽。事实上，由于这些核苷酸序列的简并变体均编码相同多肽，对此技术人员不需进行上述对比分析就清楚。本领域另外意识到，不是简并的这种核酸分子，有许多也编码具有血管生成蛋白活性的多肽。这是因为本领域技术人员充分意识到氨基酸取代很少或几乎不明显影响蛋白质功能(如用一个脂肪族氨基酸置换另一个脂肪族氨基酸)。
例如，关于怎样产生表型沉默氨基酸取代见Bowie，J.U.等“译解蛋白质序列中信息：对氨基酸取代的耐受性”，科学247：1304-1310(1990)所述，其中作者指明蛋白质非常耐受氨基酸取代。
因此，本发明涉及一种多核苷酸，其与编码SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24所示多肽的多核苷酸，有至少70％，优选至少90％，更优选至少95％，96％，97％或98％相同性，本发明还小及这种多核苷酸的片段，该片段具有至少30个优选至少50个碱基，另外本发明还涉及由这种多核苷酸编码的多肽。
“相同性”具有本领域所公认的含义并可用公布的方法计算(见例如(COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lest，A.M.ed.，牛津大学出版社，纽约(1988)；BIOCOMPUTING：INFORMATICSAND GENOME PROJECTS，Smith，D.W.，ed.，科学出版社，纽约(1993)；COMPUTE ANALYSIS OF SEQVENCE DATA，PARTI，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编辑，Humana出版社，新泽西(1994)；SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G.，科学出版社(1987)；和SEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribskov，M.和Devereux J.编辑，M Stockton出版社，纽约(1991))。这呈现了许多测定两个多核苷酸或多肽序列间相同性的方法，术语“相同性“为本领域技术人员所熟知(Carillo，H.，和Lipton，D.，SIAMJ.Applied Math.48：1073(1988))。通常使用的测定两序列间相同性或相似性的方法包括但非限于“Guide to Huge Computers”，MartinJ.Bishop编辑，科学出版社，San Diego(1994)，和Carillo，H.，和Lipton，D.，SIAM J.Applied Math.48：1074(1988)。对比多核苷酸或多肽序列的计算机程序包括GCG程序包(Devereux，J.，等，核酸研究12(1)：287(1984))，BLASTD，BLASTN，FASTA(Atschul，S.F.等，分子生物学杂志215：403(1990))，Bestfit程序(Wisconsin序列分析程序包，VERSRON8 FOR Unix.Genetics Computer Group.UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison)，WI 53711(使用Smith和Waterman的局部同源序列对比，应用数学进展2：482-489(1981))。具有与本发明参照核苷酸序列有例如至少95％“相同性”的核苷酸序列的多核苷酸，是指此多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，除了其包核苷酸序列相对于编码血管生成多肽的参照核苷酸序列的每100个核苷酸中最多有5个点突变。换而言之，为获得具有与参照核苷酸序列有至少95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中最多5％的核苷酸可缺失或用另外的核苷酸取代，或者占参照序列总核苷酸数最多5％的核苷酸可插入参照序列中。参比序列可以是SEQ ID NO：1，3，4，7，9，11，13，15，17，19，21或23的完整序列，ORF(开放读框)，或本文所述的任何片段。
实际上，任何特殊的核酸分子或多肽是否与本发明的核苷酸序列有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性，可通过已知计算机程序常规确定。确定参比序列(本发明序列)与目标序列之间的是佳完全匹配的方法，也称总体序列对比，优选使用基于Brutlag等的序列对比方法的FASTDB计算机程序(Comp.App.Biosci.6：237-245(1990))。在序列对比中，参比序列与目标序列均是DNA序列。RNA序列可通过将U’s转换为T’s加以对比。所述总体序列对比的结果是相同性百分率。DNA序列的FASTDB序列对比中所用的计算相同性百分率的参数优选是：Matrix＝Unitary，k-tuple＝4，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝30，Randomization GroupLength＝0，Cutoff Score＝1，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window S ize＝500或目标核苷酸序列长度，无论哪个更短。
如果因为5’或3’缺失而非内部缺失导致目标序列比参比序列短，要进行手工校正，因为FASTDB程序当计算相同性百分比时不计算目标序列的5’和3’的短缺。对于目标序列相对于查询序列5’和3’端的短缺，百分比性的校正是通过计算不匹配的位于目标序列5’或3’端的参比序列的碱基数，以作为参比序列总碱基数的百分比。通过FASTDB序列对比的结果来确定一个核苷酸是否匹配。然后将此百分数从相同性百分比中减去，从而获得最终的相同性百分比结果。此校正的结果可用于本发明。FASTDB序列对比中所显示出的，只有在目标序列5’或3’端外侧的碱基，它们不与参比序列匹配，才用于计算以手工调节百分比相同性结果。例如，一个90个碱基的目标序列与一个100个碱基的参比序列对比以确定相同性百分比。缺失发生于目标序列的5’末端。因此FASTDB比对不显示出5’端前10个碱基的匹配。这10个不匹配的碱基相当于序列的10％(5’或3’端不匹配的碱基数/参比序列中的碱基总数)，因而从FASTDB程序计算的相同性百分比中减去这10％。如果剩余的90个碱基都完全匹配，那么最终的相同性百分比就是90％。再例如，一个90个碱基的目标序列与一个100个碱基的参比序列相比较，这时缺的的是内部的核苷酸，因而目标序列的5’或3’端碱基没有与参比序列不匹配的。在这种情况下，FASTDB程序计算的相同性百分比不需手工校正。再强调一次，只有目的序列的5’或3’端碱基与参比序列不匹配时才需要手工校正。对于本发明不需要进行其它的手工校正。
对于一个多肽，其所含的氨基酸序列与本发明的参比氨基酸序列具有例如至少95％“相同性”是指，除了相对于参比氨基酸序列的每100个氨基酸，该目标多肽序列可包含最多5个氨基酸改变这外，该目标多肽的基酸序列与参比序列相同。换言之，为获得具有与参比氨基酸序列至少95％相同性的氨基酸序列的多肽，在目标序列中最多5％的氨基酸残基可插入，缺失或用另外氨基酸取代。这些参照序列上的变化可发生在参照氨基酸序列的氨基酸端或羧基端，或位于末端之间的任何位置，可以是在参照序列的残基间各自分散的，或在参照序列上呈连续的一组或多组。
实际上，任一特定的多肽与例如表1所示的氨基酸序列，或保藏的DNA克隆编码的氨基酸序列是否具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性，可以方便地利用已知的计算机程序确定。测定参比序列(本发明的序列)与目标序列间最佳匹配的方法，也称为总体序列对比，可优选使用基于Brutlag等的序列对比方法的FASTDB计算机程序确定(Comp.App.Biosci.(1990)6：237-245)。在序列对比中参比序列和目标序列均是核苷酸序列或均是氨基酸序列。所述总体序列对比的结果是相同性百分率。用于FASTDB氨基酸序列对比中的参数优选为：Matrix＝PAM 0)k-tuple＝2，MismatchPenalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group Length＝0，CutoffScore＝1，Window Size＝序列长度，Gap Penalty＝5，Gap SizePenalty＝0.05，Window Size＝500或目标氨基酸序列长度，无论哪个更短。
如果因为N或C缺失而非内部缺失导致目标序列比参比序列短，要进行手工校正，因为FASTDB程序当计算相同性百分比时不计算目标序列的N和C的短缺。对于目标序列相对于查询序列N和C端的短缺，百分比性的校正是通过计算不匹配的位于目标序列N或C端的参比序列的碱基数，以作为参比序列总碱基数的百分比。通过FASTDB序列对比的结果来确定一个核苷酸是否匹配。然后将此百分数从相同性百分比中减去，从而获得最终的相同性百分比结果。此校正的结果可用于本发明。FASTDB序列对比中所显示出的，只有在目标序列N或C端外侧的碱基，它们不与参比序列匹配，才用于计算以手工调节百分比相同性结果。例如，一个90个碱基的目标序列与一个100个碱基的参比序列对比以确定相同性百分比。缺失发生于目标序列的C末端。因此FASTDB比对不显示出C，端前10个碱基的匹配。这10个不匹配的碱基相当于序列的10％(N或C端不匹配的碱基数/参比序列中的碱基总数)，因而从FASTDB程序计算的相同性百分比中减去这10％。如果剩余的90个碱基都完全匹配，那么最终的相同性百分比就是90％。再例如，一个90个碱基的目标序列与一个100个碱基的参比序列相比较，这时缺的的是内部的核苷酸，因而目标序列的N或C端碱基没有与参比序列不匹配的。在这种情况下，FASTDB程序计算的相同性百分比不需手工校正。再强调一次，只有目的序列N或C端碱基与参比序列不匹配时才需要手工校正。对于本发明不需要进行其它的手工校正。
血管生成多肽
本发明还涉及具有图3A-3C推导的氨基酸序列的多肽，以及这种多肽的片段，类似物和衍生物。
在本发明中，“多肽片段”是指包含于SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24中，或由保藏的克隆中cDNA编码的短基酸。蛋白质片段可以是“free stanging”，或包含于较大片段中，其片段形成一部分或区域，优选一个单独的连续区域。本发明多肽片段代表性例如包括1-20，21-40，41-60，61-80，81-100，102-120，121-140，141-160，161-180，181-200，201-220，221-240，241-260，261-280或281-编码区末端的氨基酸组成的片段。另外，多肽片段长度可以是大约20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140或150个氨基酸。在文中“大约”包括在一端或两端可多或少12个(5，4，3，2或1)个氨基酸的特定范围(见表1)。
                  血管生成蛋白表1
基因序号 基因名称 核苷酸序列SEQ IDNO：X 序列的总核苷酸数 起始密码子的5’核苷酸数 氨基酸序列SEQ IDNO：Y  ORF后的氨基酸
    1   PDGF-A     1     1308     388     2     211
    2   PDGF-B     3     2137     983     4     241
    3   PlGF     5     1645     322     6     149
    4   PlGF-2     7     597     13     8     170
    5   GDGF     9     577     5     10     190
    6   VEGF     11     989     56     12     191
    7   VEGF-A     13     649     5     14     214
    8   VEFG-2     15     1674     12     16     419
    9   VEGF-3     17     624     1     18     207
    10   VEGF-D     19     2846     1771     20     325
    11  VEGF-D1     21     2004     403     22     354
    12   VEGF-E     23     399     1     24     132
优选的多肽片段包括分泌的血管生成蛋白以及其成熟形式。另外优选的多肽片段包括分泌的血管生成蛋白或其成熟形式，其氨基端或羧基端或这两端均连续缺失残基。例如分泌的血管生成蛋白多肽或成熟形式的氨基端可缺失1-60个范围内的任何数目的氨基酸。相似地，分泌的血管生成蛋白多肽或成熟形式的羧基端可缺失1-40个范围内的任何数目的氨基酸。另外，优选以上氨基和羧基端缺失的任意组合。相似地，编码这些血管生成多肽片段的多核苷酸片段也是优选的。
特征在于结构或功能结构域的血管生成多肽和多核苷酸片段也是优选的，如包含α-螺旋和α-螺旋形成区，β-折叠和β-折叠形成区，转角区和转角形成区，卷曲和卷曲形成区，亲水区，疏水区，α两亲区，β两亲区，柔性区，表面形成区，底物结合区，和高抗原指数区。在保守的结构域内的SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24的多肽片段是本发明特别期望的。(见图3A-3C)。另外，表面这些结构域的多核苷酸片段也是期望的。
其它优选的片段是生物活性的血管生成蛋白片段。生物活性片段是那些与揭示的血管生成多肽之一活性相似，但不必相同的片段。片段的生物活性可包括改良所需活性，或降低非所需活性。
本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽，或合成多肽，优选重组多肽。
本领域意识到血管生成多肽的一些氨基酸序列可以发生变化，但不明显影响蛋白质的结构或功能。如果序列中的这种差异是期望的，应记得这是蛋白质上确定活性的关键部位。
因此，本发明还包括血管生成多肽的变体，其呈现血管生成多肽的基本活性，或包括血管生成多肽如下所述蛋白质部分的区域。这种突变包括缺失，插入，转换，重复和类型取代。如上所述，关于氨基酸变化可以是表型沉默取代的文献参见Bowie，J.U.等，“译解蛋白质序列中的信息：耐受氨基酸取代”，科学247：1306-1310(1990)。
因此，表1的多肽的片段，衍生物，或类似物可以是：(i)其中一或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代，这种取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的；或(ii)其中一或多个氨基酸残基包括取代基；或)iii)其中成熟多肽融合于另一种化合物，如提高多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的氨基酸融合于成熟多肽，如前导序列或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或蛋白原序列；或(v)其中包含少量SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24所示氨基酸残基，及保留保守的基序，并还保留VEGF/PDGF多肽家族的活性特点。根据本发明教导，这种片段，衍生物和类似物包括在本领域技术范围内。
特别感兴趣的是用另一种荷电的氨基酸及用中性或阴性荷电的氨基酸前导荷电的氨基酸。后者导致蛋白质带还原的阳性电荷，以改良血管生成蛋白的特性。特别需要防止聚集反应。蛋白质的聚集不仅导致活性丧失，当制备药物配方时也是问题，因为它们可以是免疫原性的。(Pinckard等，免疫学临床试验2：33l-340(1967)；Robbins等，糖尿病36：838-845(1987)；Cleland等，治疗性药物载体系统评价10：307-377(1993))。
氨基酸置换也可改变与细胞表面受体结合的选择性。Ostade等，自然361：266-268(1993)阐述了一些突变导致TNF-α只与两种已知的TNF受体之一选择性结合。因此，本发明的血管生成蛋白可包括一或多个氨基酸取代，缺失或添加，自然突变或人为操作。
如上所述，变化优选是最自然的，如保守氨基酸取代，其不明显影响蛋白质的折叠或活性(见表2)。
表2：保守氨基酸取代
芳香族 苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸
疏水的 亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸
极性的 谷氨酰胺，天冬酰胺
碱性的 精氨酸，赖氨酸，组氨酸
酸性的 天冬氨酸，谷氨酸
小的 丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸
当然，技术人员可根据许多因素包括上述那些因素确定氨基酸取代的数目。一般来讲，给定的任何血管生成多肽的取代数目不超过50，40，30，25，20，15，10，5或3个。
本发明血管生成蛋白中的基本功能性氨基酸，可通过本领域已知方法鉴别，如位点直接诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244：1081-1085(1989))。后一方法介绍了在分子的每个残基进行单一丙氨酸突变。然后测试所得突变分子的生物活性如受体结合或在体外或体内增殖活性。配体—受体结合的关键位点也可通过结构分析确定，如结晶，核磁共振或光亲和标记(Smith等，分子生物学杂志224：899-904(1992)和Vos等，科学255：306-312(1992))。
本发明的多肽和多核苷酸优选以分离形式提供，并优选纯化为均质。
术语“分离的”是指从其原始环境中(如其天然发生的环境)获得的物质。例如，存活动物中天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的，但分离自自然系统中一些或所有共存物的相同多核苷酸或DNA或多肽，是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分，和/或这种多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并在这种载体或组合物不是其一部分的天然环境中仍是分离的。
在特异的实施方案中，本发明的多核苷酸长度少于300，200，100，50，15，10或7.5kb。在另一实施方案中，本发明的多核苷酸包含所揭示的血管生成蛋白的编码序列的至少15个连续核苷酸，但不包含特定血管生成蛋白的所有或部分内含子。在另一实施方案中，包含特定血管生成蛋白编码序列的核酸，不包含基因组侧翼基因的编码序列(即基因组中特定血管生成蛋白基因的5’或3’序列)。
本发明的多肽包括SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24所示多肽(尤其其成熟形式多肽)，以及与SEQ IDNO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24所示多肽有至少70％相似性(优选至少70％相同性)，优选有至少90％相似性(优选至少95％相同性)，更优选有至少95％相似性(优选至少90％相同性)的多肽，并还包括这种多肽的一部分，多肽的这一部分通常含有至少30个氨基酸，更优选含有至少50个氨基酸。
如本领域已知，两个多肽之间的“相似性”是通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸取代与另一多肽的序列相对比取代的。
本发明多肽的片段或一部分可通过肽合成生产相应的全长多肽；因此，可将此片段用作生产全长多肽的中间物。本发明多核苷酸的片段或一部分可用于合成本发明全长多核苷酸。氨基端和羧基端缺失
另外，可应用蛋白质基因工程改良或改变天然血管生成蛋白的一或多种弹特性。羧基端氨基酸的缺失可增强蛋白质的活性。一个例子是γ-干扰素，通过蛋白质的羧基端缺失10个氨基酸，显示出活性提高将近10倍。(Dobeli等，生物技术学杂志7：199-216(1988))。因此，本发明的一个方面是提供血管生成蛋白的多肽类似物，和编码类似物的核苷酸序列，这种类似物与天然血管生成蛋白相比稳定性增强(例如，当暴露于典型的pH，热度条件或其它贮存条件时，稳定性增强)。
本发明还包括N或C末端均缺失氨基酸的缺失突变体。这种突变体包括下述形式的N末端缺失突变体和C末端缺失突变体的所有组合。这些组合可用本领域已知的重组方法成产生。
特别地，血管生成蛋白的N末端缺失可以以下通式阐述：
1)m2-211，其中m2是1-210之间的任一整数，其中m2相当于SEQ ID NO：2中鉴别的氨基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n2阐述，其中n2是2-211之间的任一整数，n2相当于SEQ IDNO：2中鉴别的氨基酸位置。另外，本发明还提供了氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸的多肽，其通常阐述为具有m2-n2残基，其中n2和m2是如上述的整数。
2)m4-241，其中m4是1-240之间的任一整数，其中m4相当于SEQ ID NO：4中鉴别的氨基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n4阐述，其中n4是2-241之间的任一整数，n4相当于SEQ IDNO：4中鉴别的氨基酸位置。另外，本发明还提供了氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸的多肽，其通常阐述为具有m4-n4残基，其中n4和m4是如上述的整数。
3)m6-149，其中m6是1-148之间的任一整数，其中m6相当于SEQ ID NO：6中鉴别的氨基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n6阐述，其中n6是2-149之间的任一整数，n6相当于SEQID NO：6中鉴别的氨基酸位置。另外，本发明还提供了氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸的多肽，其通常阐述为具有m6-n6残基，其中n6和m6是如上述的整数。
4)m8-170，其中m8是1-169之间的任一整数，其中m8相当于SEQ ID NO：8中鉴别的氨基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n8阐述，其中n8是2-170之间的任一整数，n8相当于SEQ ID NO：8中鉴别的氨基酸位置。另外，本发明还提供了氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸的多肽，其通常阐述为具有m8-n8残基，其中n8和m8是如上述的整数。
5)m10-190，其中m10是1-189之间的任一整数，其中m10相当于SEQ ID NO：10中鉴别的氨基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n10阐述，其中n10是2-190之间的任一整数，n10相当于SEQ ID NO：10中鉴别的氨基酸位置。另外，本发明还提供了氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸的多肽，其通常阐述为具有m10-n10残基，其中n10和m10是如上述的整数。
6)m12-191，其中m12是1-190之间的任一整数，其中m12相当于SEQ ID NO：12中鉴别的氨基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n12阐述，其中n12是2-191之间的任一整数，n12相当于SEQ ID NO：12中鉴别的氨基酸位置。另外，本发明还提供了氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸的多肽，其通常阐述为具有m12-n12残基，其中n12和m12是如上述的整数。
7)m14-214，其中m14是1-213之间的任一整数，其中m14相当于SEQ ID NO：14中鉴别的氨基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n14阐述，其中n14是2-214之间的任一整数，n14相当于SEQ ID NO：14中鉴别的氨基酸位置。另外，本发明还提供了氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸的多肽，其通常阐述为具有m14-n14残基，其中n14和m14是如上述的整数。
8)m16-419，其中m16是1-418之间的任一整数，其中m16相当于SEQ ID NO：16中鉴别的氨基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n16阐述，其中n16是2-419之间的任一整数，n16相当于SEQ ID NO：16中鉴别的氨基酸位置。另外，本发明还提供了氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸的多肽，其通常阐述为具有m16-n16残基，其中n16和m16是如上述的整数。
特别优选的是包含SEQ ID NO：16的F32-R226氨基酸残基的多肽片段，以及编码这种多肽的多核苷酸。同样，另一优选的实施方案包含SEQ ID NO：16的S228-S419氨基酸。编码这些多肽的多核苷酸也是优选的。另外，SEQ ID NO：16多肽的F32-R226优选与SEQ ID NO：16多肽的S228-S419缔合。可通过二硫键，共价或非共价相互作用，通过接头连接(如丝氨酸，甘氨酸，脯氨酸连接)，或通过抗体进行缔合。
9)m18-207，其中m18是1-206之间的任一整数，其中m18相当于SEQ ID NO：18中鉴别的氨基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n18阐述，其中n18是2-207之间的任一整数，n18相当于SEQ ID NO：18中鉴别的氨基酸位置。另外，本发明还提供了氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸的多肽，其通常阐述为具有m18-n18残基，其中n18和m18是如上述的整数。
10)m20-325，其中m20是1-324之间的任一整数，其中m20相当于SEQ ID NO：20中鉴别的氨基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n20阐述，其中n20是2-325之间的任一整数，n20相当于SEQ ID NO：20中鉴别的氨基酸位置。另外，本发明还提供了氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸的多肽，其通常阐述为具有m20-n20残基，其中n20和m20是如上述的整数。
11)m22-354，其中m22是1-353之间的任一整数，其中m22相当于SEQ ID NO：22中鉴别的氨基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n22阐述，其中n22是2-354之间的任一整数，n22相当于SEQ ID NO：22中鉴别的氨基酸位置。另外，本发明还提供了氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸的多肽，其通常阐述为具有m22-n22残基，其中n22和m22是如上述的整数。
12)m24-132，其中m24是1-131之间的任一整数，其中m24相当于SEQ ID NO：24中鉴别的氨基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n24阐述，其中n24是2-132之间的任一整数，n24相当于SEQ ID NO：24中鉴别的氨基酸位置。另外，本发明还提供了氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸的多肽，其通常阐述为具有m24-n24残基，其中n24和m24是如上述的整数。
本发明另一方面包括N末端和C末端均缺失氨基酸的缺失突变体。这种突变体包括上述N末端突变体和C末端突变体的所有组合。
本发明的另一方面，揭示的血管生成多肽的突变体用作筛选剂，以检测血管生成活性的激动剂和/或拮抗剂，或者，将其修饰用作揭示的血管生成多肽的血管生成活性的激动剂和/或拮抗剂，或者可与其它制剂联合应用，如与特异于揭示的血管生成多肽的单克隆抗体联合应用，例如结果可以是揭示的血管生成多肽的血管生成活性的激动剂和/或拮抗剂。
本发明的另一方面，可产生其它参考的和揭示的本发明血管生成多肽，SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24的片段，以产生可用作激动剂和/或拮抗剂的突变体，调节揭示的血管生成多肽的活性。另外，这些多肽突变体可与其它制剂联合应用，如特异于揭示的血管生成多肽的单克隆抗体联合应用，例如增强或降低特异的所需活性。
术语“基因”是指涉及多肽链产生的DNA片段；它包括在编码区之前和之后的区域(前导和加尾区)以及各个编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
本发明进一步是指分离的本文所述的核酸分子片段。一个分离的具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示的核苷酸序列的核酸分子片段，应当至少15nt的片段，并且优选的是长度至少约20nt，更为优选的为至少约30nt，再更为优选的为约40nt，它可用作本文所述的诊断探针和引物。当然也可以根据本发明使用更大的、与大多数，如非全部的如SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23所示的核苷酸序列相应的50，75，100，125，175，200，225，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500，525，550，575，600，625，650，675，700，725，750，775，800，825，850，875，900，925，950，975，1000，1025，1050，1075，1100，1125，1150，1175，1200，1225，1250，1275，1300，1325，1350，1375，1400，1425，1475，1500，1525，1550，1575，1600，1625，或者1650nt长度的片段。例如，一个长度为至少20nt的片段，是指包括有来自如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23所示的核苷酸序列的20个或者更多个连续碱基的片段。
文中的“大约的”包括该特别提到的范围、在一端或者两端再大几个或小几个(5，4，3，2，或1个)核苷酸。优选地，这些片段编码具有生物学活性的多肽。
本发明全长基因的片段可用作cDNA文库的杂交探针，以分离全长cDNA及分离其它与此基因具有高度序列相似性或相似生物活性的cDNA。这类探针优选具有至少30个碱基，并可含有例如50或更多个碱基。此探针还可用于鉴别相当于全长转录物的cDNA克隆和基因组克隆或含有完整基因的克隆，所述完整基因包括调节区，启动子区，外显子，和内含子。筛选例如包括通过使用已知DNA序列分离基因的编码区，以合成寡核苷酸探针。具有互补于本发明基因的序列的标记的寡核苷酸，用于筛选人类cDNA，基因组DNA或mRNA的文库，以取代探针与文库的哪个成员杂交。融合蛋白
任何揭示的血管生成多肽都可以用于产生融合蛋白。例如，血管生成多肽在与第二个蛋白融合时，可以用作抗原性标签。针对该血管生成多肽产生的抗体可以通过与血管生成的结合用于对第二个蛋白间接检测。而且，由于分泌蛋白根据转运信号来进行细胞定位，所以血管生成多肽一旦与其他蛋白相融合就可以用作为靶向性分子。
可以与血管生成多肽融合的结构域的实例不仅包括异源性信号序列，还包括其他异源性功能区域。融合不一定必须是直接的，也可以通过接头序列来实现。
而且，融合蛋白也可以通过操作而改进一或多种血管生成多肽的特性。例如，可以将添加的氨基酸区域，尤其是带电荷的氨基酸，加到血管生成多肽N末端，从而在从宿主细胞中纯化或者后续的操作和储藏过程中提高其稳定性和持续性。另外，可以将肽半族添加到揭示的血管生成多肽上以利于纯化。该区域可以在特定的血管生成多肽的最终制备之前去除。添加肽半族以利于多肽的操作是本领域中熟知的常规性技术。
而且，揭示的血管生成多肽，包括片段，和特异表位可以与免疫球蛋白(IgG)的部分恒定区域相结合，形成嵌合多肽。这些融合蛋白有利于纯化并在体内显示出延长了半衰期。一个已报道的实例描述了一种嵌合蛋白，它由人CD4多肽的前两个区域和哺乳动物免疫球蛋白的重或轻链上恒定区的不同结构域组成。(EPA 394，827；Traunecker等，自然，331：84-86(1988))。含有二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白(由于IgG)还可在结合和中和其他分子的过程中比单体的分泌蛋白或单独的蛋白片段更为有效。(Fountoulakis等，生物化学杂志，270：3958-3964(1995)。
类似地，EP-A-0 464 533(Canadian counterpart 2045869)公开了含有免疫球蛋白分子的恒定区的不同部分育龄一个人蛋白或其部分一起所构成的融合蛋白。在多数情况下，融合蛋白的Fc部分对治疗和诊断有利，因而可以，例如，改进遗传药理学特性。(EP-A 0232 262.)也可能需要对表达、检测和纯化后的融合蛋白去除Fc部分。例如，如果融合蛋白用作免疫的抗原，Fc部分可能会阻碍治疗和诊断。在药物开发中，例如，人蛋白如hIL-5，曾与Fc部分融合，为的是进行高效率的扫描试验以鉴定hIL-5的拮抗剂。(见D.Bennett等，分子识别杂志，5：52-58(1995)；K.Johanson等，生物化学杂志，270：9459-9471(1995)。
而且，揭示的血管生成多肽可以与标记序列相融合，如有利于纯化特定的血管生成多肽的肽。在优选的实施方案中，标记的氨基酸序列是一个六个组氨酸的肽，如pOE载体(QIAGEN，Inc.，9259 EtonAvenue，Chatsworth，CA，91311)上所提供的标签，等等，其中很多都可以商业购得。正如Gentz等，美国科学院研究进展，56：821-824(1989)中所述，例如，六个组氨酸提供了对该融合蛋白的纯化提供了方便。另一个用于纯化的肽标签是“HA”标签，它相应于来自流感红血球凝聚素蛋白的表位(Wilson等，细胞，37：767(1984)。
因此，可以用揭示的血管生成多核苷酸或多肽操作产生上述的任何融合形式。载体和宿主细胞
本发明还涉及含有编码揭示的血管生成蛋白的多核苷酸的载体、宿主细胞，以及应用重组技术，生产多肽的方法。载体例如可以是噬菌体，质粒，病毒，或逆转录病毒载体等。逆转录病毒可以是有复制能力的或是复制缺陷的。在后一情况中，病毒增殖通常只发生在补体宿主细胞中。
编码揭示的血管生成蛋白的多核苷酸可与含有可选择标记的载体连接，以在宿主中增殖。通常地，将质粒载体导入沉淀物中，如磷酸钙沉淀，或与荷电脂质复合。如果载体是病毒，可将其在体外用适当的包装细胞系包装，然后转导入宿主细胞中。
编码揭示的血管生成蛋白的多核苷酸插入体应可操纵地连于适当的启动子，如噬菌体λPL启动子，大肠杆菌lac，trp，phoA，和tac启动子，SV40早期和晚期启动子，及逆转录病毒LTRs的启动子等。本领域技术人员已知其它适当的启动子。此表达构建体还含有转录起始，终止位点，和转录区内的核糖体结合位点以进行翻译。由此构建体表达的转录物的编码部分，优选包括在密码子(UAA，UGA或UAG)的起端和末端的翻译起始密码子，密码子(UAA，UGA或UAG)适当的位于翻译多肽的末端。
如上所述，表达载体优选包括至少一个可选择标记。这种标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶(DHFR)，G418或新霉素抗性基因，以及用于大肠杆菌或其他细菌培养的四环素，卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。适当的宿主例如包括但非限于细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌，和沙门氏菌typhimurium细胞；真菌细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇S2，和Spodoptera Sf9细胞；动物细胞如CHO，COS，293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。本领域已知上述宿主细胞的适当培养基和培养条件。
在细菌中使用的优选载体包括得自QIAGEN公司的pQE70，pQE60和pQE-9；得自Stratagene克隆系统公司的pBluescript载体，Phagescript载体，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A；和得自Pharmacia生物技术公司的ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5。优选的真核载体包括得自Stratagene公司的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1和pSG；和得自Pharmacia公司的pSVK3，Pbpv，pMSG和pSVL。本领域技术人员也易于知道其它适当载体。
将构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，阳离子脂质介导的转染，电穿孔，转导，感染或其它方法进行。这种方法在许多标准实验指导中均有阐述，见例如Davis等，分子生物学基本方法(1986)。特别期望的是揭示的血管生成多肽事实上可由无重组载体的宿主细胞表达。
通过已知方法可从重组细胞培养物中回收及纯化揭示的血管生成多肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析和凝集素层析。优选利用高效液相层析(HPLC)进行纯化。
揭示的血管生成多肽，优选分泌形式的多肽，也可回收自：纯化自天然原料包括体液，组织和细胞的产物，无论是直接分离的还是培养的；化合产物；通过重组技术从原核或真核宿主中产生的产物，所述宿主包括例如细菌，酵母，高等植物，昆虫，和哺乳动物细胞。根据重组技术中所用的宿主，揭示的血管生成多肽可以是或不是糖基化的。另外，揭示的血管生成多肽还可包括一个初始修饰的甲硫氨酸残基，在一些情况下，是宿主介导的加工结果。因此，本领域熟知由翻译起始密码子编码的N末端甲硫氨酸，通常在所有真核细胞中翻译后从任何蛋白质中高效除去。在大多数蛋白质上的N末端甲硫氨酸也在大多数原核细胞中有效除去，对一些蛋白质而言，根据N末端甲硫氨酸共价连接的氨基酸的性质，这种从原核细胞除去甲硫氨酸的方法是无效的。
本发明除了涵盖含有所述载体构建体的宿主细胞之外，还涵盖了初级，二级，和无限增殖化的脊椎动物尤其哺乳动物宿主细胞，这种细胞已经工程化为缺失或置换内源性遗传物质(例如血管生成蛋白编码序列)，和/或工程化为包括遗传物质(例如异源性多核苷酸序列)，该遗传物质可操纵地与编码本发明血管生成蛋白的多核苷酸缔合，以激活，改变和/或扩增编码血管生成蛋白的内源性多核苷酸。例如，可使用本领域已知的方法通过同源重组，将异源控制区(如启动子和/或增强子)与编码血管生成蛋白的内源性多核苷酸序列可操纵的缔合(见例如1997年6月24日公布的美国专利No.5641670；1996年9月26日出版的国际出版物WO 96/29411；1994年8月4日出版的国际出版物WO94/12650；Koller等，美国科学院院报86：8932-8935(1989)；和Zijlstra等，自然342：435-438(1989)，所述文献以其全文并入参考)。
另外，本发明的多肽可用本领域已知的方法化学合成。(见例如Creighton，1983，蛋白质：结构和分子原理，W.H.Freeman &Co.，N.Y.和Hunkapiller，M.等，1984，自然310：105-111)。例如，相当于本发明血管生成多肽的片段的肽，可使用肽合成仪合成。另外，如果需要，可以把非典型氨基酸或氨基酸的化学类似物作为替代物或附加物，引入编码血管生成多肽的多核苷酸序列。不典型氨基酸包括，但不仅限于这些：普通氨基酸的D型同分异构体，2，4-二氨基丁酸，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，同型瓜氨酸，磺基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己丙氨酸，b-丙氨酸，含氟氨基酸，含修饰基团的氨基酸，如b-甲基氨基酸，钙-甲基氨基酸，钠-甲基氨基酸，以及通常的氨基酸的类似物。再者，氨基酸既可以为D型(右旋)亦可以为L型(左旋)。
本发明所涉及的血管生成多肽，在翻译或翻译后可以进行修饰，如糖基化，酰基化，磷酸化，酰胺化，通过基团的保护或抑制而形成的衍生物，蛋白水解酶的裂解，与抗体分子或其它细胞配体的偶联，等。许多化学修饰均可通过已知的技术方法来完成，包括以下方法(但不仅限于这些)：溴化氰，胰蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，四氢硼化钠(NaBH4)所引起的特异化学裂解；乙酰化，甲酰化，氧化，还原；衣霉素存在时所引起的代谢合成增加；等等。
本发明中也涉及到其他翻译后的修饰，例如包括N-偶联或O-偶联的糖链，N末端或C末端的加工处理，化学小分子粘附于氨基酸的骨架上，N-或O-连接糖链的化学修饰，以及原核生物宿主细胞表达后，添加或去除N末端的甲硫氨酸残基，均可以看成宿主细胞表达的增加。多肽还可以用检测标记进行修饰，例如酶，荧光，同位素或亲和标记，用于蛋白质的检测和分离。
本发明还提供了化学修饰的血管生成蛋白的衍生物，它具有其他优点，如多肽的溶解性、稳定性和循环时间均增高，或免疫性降低(见美国专利第4179337号)。衍生的小片段可以从水溶性的多聚体中分离出来，如聚乙二醇，丙二醇/丙三醇共多聚物，羰甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯乙醇及其类似物。多肽可以在分子内任何位点进行随机修饰，或在分子内预定的位点进行修饰，多肽分子可包括一个、两个、三个或多个粘附的化学小分子。
多聚体可以有任何大小的分子量，并且可以有侧链，也可以没有侧链。对聚乙二醇而言，优选的分子量在约1kD到100kD之间(“大约”一词表明不同的聚乙二醇的制备，有些分子比所说的分子量重些，有些则轻些)，并较易处理和制备。也可使用其他大小的分子，要根据治疗方案而定(如要求持续释放的时程，效应，如果有的话，取决于生物学活性，易于操作，抗原性的大小或缺失，以及其他已知的聚乙二醇对某种治疗性蛋白或蛋白类似物的效应)。
聚乙二醇分子(或其他化学小分子)应当与蛋白质结合，应当考虑到对蛋白质的功能或抗原性结构域的影响。对本领域熟练的技术人员而言，有许多结合方法，如EP0401384，并附有参考文献(PEG与G-CSF偶联)，还可以参见Malik等，实验血液学，1992，20：1028-1035(用tresyl chloride报告GM-CSF的pegylation)。例如，聚乙二醇可以与氨基酸残基上的反应基团共价结合，例如游离的氨基或羰基。反应基团是那些活化的聚乙二醇可与之结合的分子。带有游离的氨基的氨基酸残基，包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基；带有游离羰基的氨基酸包括天冬氨酸残基，谷氨酸残基和C-末端氨基酸残基。磺酸基团还可以作为粘附聚乙二醇分子的反应基团。聚乙二醇治疗用时优选的分子是连接在氨基，如粘附在N末端或赖氨酸基团上。
人们特别希望在蛋白质N末端进行化学修饰。聚乙二醇作为现有组份的实例，你可以从各种不同的聚乙二醇分子中进行挑选(根据分子量，侧链，等)，混合物中，聚乙二醇与蛋白质(或多肽)分子的比例，所进行的pegylation反应类型，以及获得选择的N端pegylated蛋白质分子的方法。获得N端pegylated标本的方法(即必要时，就将这种分子与其他monopegylated分子分离开)为通过把N末端pegylated成分从大量的pegylated分子中纯化出来。选择那些在N端发生化学修饰的蛋白质是通过还原烷基化实现的，还原烷基化为检测不同原始氨基基团的类型(赖氨酸比N末端)的分化的反应性，这些基团为某种特异蛋白质的衍化物。在适当的反应条件下，可以有选择性的获得蛋白质的衍生物，这类蛋白质为N末端携带羰基，并含有多聚体。
本发明的血管生成多肽可以是单体或多聚体(即二聚体，三聚体，四聚体和更大的多聚体)。因此，本发明与本发明中VEGF-2多肽的单体和多聚体，它们的分离制备，以及它们的组成(尤其是指药理成分)有关。在特殊的实例中，本发明的多肽为多基因，二聚体，三聚体或四聚体。在另外的实例中，本发明的多聚体至少是二聚体，三聚体或四聚体。
本发明所涉及的多聚体可以是同聚体或异聚体。本文这里所使用的“同聚体”术语，是指仅含有本发明的血管生成多肽(包括本文这里所述的VEGF-2片段，变异体，不同的剪接产物和融合蛋白)。这些同聚体为含有相同或不同的氨基酸序列的血管生成多肽。在一个特殊的实例中，本发明的一个同聚体为一个仅含有血管生成多肽的多聚体，后者含有相同的氨基酸序列。在另一个特殊的实例中，本发明的一个同聚体为一个含有VEGF-2多肽的多聚体，而后者含有不同的氨基酸序列。在特殊的实例中，本发明的多聚体为一同源二聚体(例如，含有相同或不同的氨基酸序列的血管生成多肽)或一同源三聚体(如，含有相同和/或不同的氨基酸序列的血管生成多肽)。在另外的实例中，本发明的同聚物性多聚体至少应是一个同源二聚体，同源三聚体或同源四聚体。
“异聚体”这一术语，在本文是指一个除含有本发明的血管生成多肽外，还含有一个或多个异源性多肽的多聚体(即不同的蛋白多肽)。在一个特殊的实例中，本发明的多聚体为异源二聚体，异源三聚体，或异源四聚体。在另外的实例中，本发明的同源多聚体至少为一个同源二聚体，同源三聚体，或同源四聚体。
本发明的多聚体是由亲水，疏水，离子和/或共价连接和/或间接连接，例如通过脂质体的形成。因此，在一个实施例中，本发明的多聚体，如，同源多聚体或异源多聚体在本发明的多肽在溶液中与另一个分子接触时，就可以形成多聚体。在另一个实施例中，本发明的异源多聚体，例如，在溶液中，本发明的多肽与此肽的抗体接触(包括针对本发明的融合蛋白中的异源多肽序列的抗体)就可以形成异源三聚体或四聚体。在另外一些实施例中，本发明的多聚体可以通过与和/或本发明的VEGF-2多肽之间的共价连接形成。这些共价连接包括一个或多个存在于该多肽内的氨基酸残基(如，引自SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24的多肽中)。在某种情况下，共价连接为位于多肽序列内的半胱氨酸残基之间的交联，它们在天然状态下就发生作用(即自然发生)。而在另一种情况下，共价连接为化学或重组操作的结果。另外，这些共价连接含有一个或多个存在于血管生成融合蛋白的异源多肽序列中的氨基酸残基。在一个实施例中，共价连接是位于本发明中的一个融合蛋白的异源序列之间(见，如美国专利号为：5478925)。在一个特殊实施例中，共价连接为位于本发明中的一个血管生成多肽-Fc融合蛋白的异源序列之间(见本文所述)。在另一个实施例中，本发明融合蛋白的共价连接存在于另一个TNF家族的配体/受体家族成员的异源序列多肽之间，该序列能够形成共价连接的多聚体，例如osteroprotegetin(见，例如，国际出版，世界专利第98/49305，这里的所有内容均附有参考文献)。
本发明的多聚体应用本领域所熟知的化学技术方法可以合成。例如，存在于本发明多聚体中的多肽，应用本领域中所熟知的连接子分子和连接子分子长度最佳技术，进行化学交联(见，如美国专利号：5478925，本文附有完整的参考文献)。再者，本发明的多肽应用在多肽的C末端或N末端增加半胱氨酸或生物素方法，可进行常规修饰，本领域的这些技术可用于合成含有一个或多个此类修饰的多肽的多聚体(见，例如美国专利号：5478925，本文附有完整的参考文献)。另外，这些本领域所熟知的技术可用于合成含有多肽的脂质体，而多肽存在于本发明的多聚体中(见，例如，美国专利号：5478925，本文附有全部的参考文献)。
另一方面，本发明的多聚体可以应用本领域所熟知的遗传工程技术进行合成。在一个实施例中，存在于本发明的多聚体中的多肽，使用本文所述的融合蛋白技术可以进行重组合成(美国专利号：5478925，本文附有完整的参考文献)。在一个特殊的实施例中，编码本发明的同源二聚体的多核苷酸序列可通过以下技术进行合成，即将一个编码本发明的多肽的多核苷酸连接到一个编码连接子多肽的序列上，然后再连接到一个人工合成的可以翻译成多肽产物的序列中，而该多肽为反向排列的，即从C末端到N末端(无前导序列)(见，例如，美国专利号：5478925，本文附有完整的参考文献)。在另一个实施例中，本文所述的重组技术或其他本领域中所熟知的技术可用于合成本发明的含有一个跨膜结构域的重组多肽(或疏水或前导肽)，并且通过膜的重组技术可以整合脂质体中(见，例如，美国专利号：5478925，本文附有完整的参考文献)。血管生成多肽的生物学活性
血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可以用于检测一种或多种生物学活性的试验。如果在某个试验中血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂表现出活性，血管生成多核苷酸或多肽就可能与该生物学活性相关的疾病有关联。因此，血管生成多肽可以用来治疗相关疾病。以下所述的生物活性包括于血管生成蛋白“所需活性”中。免疫活性
血管生成多肽或多核苷酸，或其激动剂或拮抗剂，通过激活或抑制免疫细胞的增殖、分化或激动(趋药性)，可以用于治疗免疫系统的缺陷或紊乱。免疫细胞通过造血作用发育，由多能干细胞产生脊髓细胞(血小板、红细胞、嗜中性粒细胞、和巨噬细胞)和淋巴细胞(B和T淋巴细胞)。这些免疫缺陷或疾病的发病原因可能是遗传性的、体细胞的，如癌症或自身免疫性疾病，获得性(如化疗或毒素引起的)，或感染性的。再者，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可以作为某种特异的免疫系统疾病或紊乱的一种标记或检测物。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于治疗或检测造血细胞的缺陷或功能异常。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于提高造血细胞的分化和增殖，包括多能干细胞，试图用于治疗那些与某种(或多种)类型造血细胞有关的疾病。免疫缺陷综合征的实例包括，但不仅限于这些：血红蛋白病(如丙种球蛋白缺乏症，丙种球蛋白异常症)，共济失调性毛细血管扩张症，常见的变异性免疫缺陷症，Digeorge综合征，HIV(人免疫缺陷病毒)感染，HTLV-BLV(人T淋巴细胞-B淋巴细胞)感染，白细胞粘附缺陷综合征，淋巴细胞减少症，吞噬细胞杀伤功能异常，重症联合免疫缺陷症(SCIDs)，Wiskott-Adrich病，贫血，血小板减少症，或血红蛋白尿。
再者，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，还可用于调节止血(中止出血)或血栓活性(血栓形成)。例如，通过提高止血或血栓活性，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可以用于治疗血液凝固性疾病(如纤维蛋白原缺乏症，凝血因子缺陷)，血小板异常(如血小板减少症)，或由外伤，手术或其他原因造成的创伤。另一方面，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，还可降低止血或血栓活性，可用于抑制或溶解血栓，这在治疗心脏病发作(心肌梗塞)，中风或疤痕形成时，非常重要。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，还可用于治疗或检测自身免疫性疾病。许多自身免疫性疾病起源于免疫细胞将自身的组织作为外源性的异物进行的异常识别。这种异常识别导致宿主组织破坏的免疫应答。因此，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可以抑制免疫应答，尤其抑制T细胞的增殖、分化或趋化，所以血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂在预防自身免疫性疾病时，可能是一种有效的治疗措施。
可以治疗或诊断的自身免疫性疾病的实例包括，但不仅限于这些：艾迪森氏病，溶血性贫血，抗磷脂综合征，类风湿性关节炎，皮炎，过敏性脑脊髓炎，肾小球肾炎，Goodpasture综合征，Graves病，多发性硬化，重症肌无力，神经炎，眼炎，大天疱样疮，天疱疮，多内分泌腺病，紫癜，Reiter病，Stiff-Man综合征，自身免疫性甲状腺炎，系统性红斑狼疮，自身免疫性肺部炎症，格林-巴里(Guillain-Barre)综合征，胰岛素依赖的糖尿病和自身免疫性炎性眼病。
同样地，过敏反应和疾病，例如哮喘(尤其是过敏性哮喘)或其他呼吸系统疾病，也可用血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂进行治疗。再者，这些分子还可用于治疗过敏反应，抗原分子或血型不符所引起的超敏反应。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂还可用于治疗和/或预防器官排斥或移植物抗宿主反应(GVHD)。器官排斥反应是宿主的免疫细胞通过免疫应答破坏移植组织的反应。同样地，GVHD还会发生另一种免疫应答，而此时却是外源移植物的免疫细胞破坏宿主组织。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可以抑制免疫应答，尤其可以抑制T细胞的增殖、分化或趋化，因此可以作为预防器官排斥或GVHD的一种有效的治疗手段。
同样，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂还可用于调节炎症反应。例如，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可以抑制参与炎症反应的细胞的增殖与分化。这些分子可用于治疗急性和慢性炎性疾病，包括与炎症相关的感染(如感染性败血症性休克，脓毒症，或全身炎性反应综合征(SIRS)，缺血-再灌注性损伤，内毒素性损害，关节炎，补体介导的超急排斥反应，肾炎，细胞因子或趋化因子引起的肺损伤，炎性肠病，克隆(Crohn)病，或细胞因子生成过多引起的疾病(如TNF或IL-1)。过度增殖性疾病
血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于治疗或检测过度增殖性疾病，包括肿瘤。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，通过直接或间接作用，可以抑制此类疾病的增殖。另一方面，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可以使其他细胞增殖，而这些细胞可以抑制过度增殖性疾病。
例如，通过提高免疫应答，尤其是提高过度增殖性疾病的抗原质量或通过使T细胞的增殖，分化或动员，用于过度增殖性疾病的治疗。通过提高现有的免疫应答，或启动新的免疫应答，均可提高这种免疫应答。另一种情况，降低免疫应答还可作为治疗过度增殖性疾病的一种方法，如化疗药物。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于治疗或检测过度增殖性疾病的实例包括，但不仅限于以下部位的肿瘤：腹部，骨骼，乳腺，消化道，肝脏，胰腺，腹膜，内分泌腺(肾上腺，甲状旁腺，垂体，睾丸，卵巢，胸腺，甲状腺)，眼睛，头颈部，神经(中枢和周围神经)，淋巴系统，盆腔，皮肤，软组织，脾脏，胸部和泌尿生殖器。
同样地，其他过度增殖性疾病还可用血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂治疗或检测。这些过度增殖性疾病的实例包括，但不仅限于以下这些情况：高丙种球蛋白血症，淋巴增殖性疾病，异型蛋白血症，紫癜，结节病，Sezary综合征，Waldenstron巨球蛋白血症，Gaucher(高雪)氏病，组织细胞增多症，以及其他所有过度增殖性疾病，还包括位于上述所列举的各器官、系统的肿瘤。心血管疾病
血管生成多肽或多核苷酸，或其激动剂或拮抗剂，可用于治疗心血管疾病，包括周围动脉血管疾病，例如四肢缺血。
心血管疾病包括心血管的异常，例如动脉—动脉瘘，动静脉瘘，脑动静脉畸形，先天性心脏病，肺动脉闭锁和Scimitar综合征。先天性心脏病包括主动脉狭窄，cortriatriatum，冠状血管异常，十字心脏(crisscross heart)，右位心，动脉导管闭锁不全，Ebstein(爱波斯坦)异常，Eisenmenger(埃森曼格)综合症，发育不全性的左心综合征，左位心，法乐氏四联症，大血管转位，双流出道的右心室，三尖瓣闭锁，持续性腹主动脉关闭不全和心脏间隔缺损，例如主动脉—肺动脉间隔缺损，心内膜垫缺损，Lutembacher综合征，法乐氏三联症，心室间隔缺损。
心血管疾病还包括心脏病，例如心律失常，瘤样心脏病，高心输出量，低心输出量，心包填塞，心内膜炎(包括细菌性)，心血管瘤，心脏停搏，充血性心力衰竭，充血性心肌病，阵发性呼吸困难，心源性水肿，心肌肥大，左心室肥大，右心室肥大，梗塞后心脏破裂，室间隔破裂，心瓣膜病，心肌病变，心肌缺血，心包积液，心包炎(包括缩窄性和结核性)，心包积气，心包切除后综合征，肺心病，风湿性心脏病，心室功能失常，充血，妊娠期心血管并发症，Scimitar综合征，梅毒性心脏病和结核性心脏病。
心律失常包括窦性心律失常，房颤(心房颤动)，房扑(心房扑动)，心动过缓，期前收缩，阿—斯(Adams-Strokes)综合征，束枝阻滞，窦房阻滞，长QT综合征，收缩，Lown-Ganong-Levine综合征，Mahaim型的预激综合征，Wolff-Parkinson-White综合征，病窦综合征，心动过速和室颤(心室颤动)。心动过速包括阵发性心动过速，室上性心动过速，进行性心室自发节律，房室结折返性心动过速，异位交界性心动过速，窦房结折返性心动过速，窦性心动过速，Torsades de Poiners，和室性心动过速。
心瓣膜疾病包括主动脉瓣关闭不全，主动脉瓣狭窄，心脏杂音，主动脉瓣脱垂，二尖瓣脱垂，三尖瓣脱垂，二尖瓣关闭不全，二尖瓣狭窄，肺动脉闭锁，肺动脉瓣关闭不全，肺动脉瓣狭窄，三尖瓣闭锁，三尖瓣关闭不全和三尖瓣狭窄。
心肌病变包括酒精性心肌病，扩张型心肌病，肥厚型心肌病，主动脉瓣膜下狭窄，肺动脉瓣膜下狭窄，限制型心肌病，Chagas心肌病，心内膜下纤维组织增生，心内膜纤维化，Kearns综合征，心肌再灌注损伤，心肌炎。
心肌缺血包括冠心病，例如心绞痛，冠状动脉瘤，冠状动脉粥样硬化，冠状血栓，冠状动脉痉挛，心肌梗塞和心脏骤停。
心血管疾病还包括血管疾病，如动脉瘤，多发性血管瘤，杆状多发性血管瘤，Hippel-Lindau病，Klippel-Trenaunay-Weber综合征，Sturge-Weber综合征，血管神经瘤性水肿，Takayasu动脉炎，主动脉炎，Leriche综合征，动脉闭塞性疾病，动脉炎，杵臼动脉炎，结节性多发性动脉炎，脑血管疾病，糖尿病性血管病，糖尿病性视网膜病，栓塞，血栓，红斑性肢痛症，痔疮，肝静脉阻塞性疾病，高血压，低血压，缺血，外周血管疾病，静脉炎，肺静脉阻塞性疾病，雷诺(Raunaud)氏病，CREST综合征，视网膜静脉阻塞，Scimitar综合征，上腔静脉综合征，毛细血管扩张症，共济失调性毛细血管扩张症，遗传性出血性毛细血管扩张症，精索静脉曲张，静脉曲张，静脉曲张溃疡，脉管炎和静脉功能不全。
动脉瘤包括分割性动脉瘤，假性动脉瘤，感染性动脉瘤，破裂性动脉瘤，主动脉瘤，脑动脉瘤，冠状动脉瘤，心脏室壁瘤和髂动脉瘤。
动脉阻塞性疾病包括动脉粥样硬化，间歇性跛行，颈动脉狭窄，纤维肌肉发育不全，间质血管阻塞，Moyamoya病，肾动脉阻塞，视网膜动脉阻塞，血栓闭塞性脉管炎。
脑血管疾病包括颈动脉疾病，脑血管淀粉样病，脑动脉瘤，脑缺氧，脑动脉粥样硬化，脑动静脉畸形，脑动脉疾病，脑栓塞和血栓，颈动脉血栓，窦血栓，Wallenberg综合征，脑出血，脑梗塞，脑缺血(包括短暂性的脑缺血)，锁骨下动脉改道综合征，脑室leukomalacia，血管性头疼，丛集性头疼，偏头疼和椎基底动脉供血不足。
栓塞包括气拴，羊水栓塞，胆固醇栓塞，肺栓塞和血栓栓塞。血栓包括冠状血管血栓，肝静脉血栓，视网膜静脉阻塞，颈动脉血栓，窦性血栓，Walenberg综合征和血栓性静脉炎。
缺血包括脑缺血，缺血性结肠炎，脑室综合征，前脑室综合征，心肌梗塞，灌注性损伤和周围四肢缺血。血管炎包括主动脉炎，动脉炎，Behcet综合征，Churg-Strauss综合征，粘膜淋巴结综合征，血栓闭塞性脉管炎，高反应性血管炎，Schoenlein-Henoch紫癜，过敏性皮肤血管炎和Wegener肉芽肿。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂对治疗危急的肢体缺血和冠心病特别有效。如实施例中所述，将血管生成多核苷酸和多肽施用于实验诱导的缺血兔的后肢，可恢复血压，血流，血管造影分值和毛细血管密度。
血管生成多肽可用本领域已知的方法施用，包括但非限于在输送位点直接针注，静脉内注射，局部施用，导管灌注，biolistic注射器，颗粒加速器，海绵，其它商购的海绵，渗透泵，口服或栓剂固体药物配方，在手术期间倒入或局部应用，气雾剂应用。本领域已知这种方法。血管生成多肽可作为药物组合物的一部分施用，如以下详细阐述。以下详细阐述了输送血管生成多核苷酸的方法。抗血管生成活性
在内源性血管生成刺激剂和抑制剂之间天然发生的平衡，是其中抑制性影响占优势。Rastinejad等，细胞56：345-355(1989)。在新血管形成是在正常生理条件下发生的那些罕见的情况中，如伤口愈合，器官再生，胚胎发育，和女性生殖过程，血管生成是严格控制的，并在空间和时间上确定界限的。在病理性血管生成的条件下，如固体肿瘤生长阶段，这些调节性控制无效。未调节的血管生成成为病理性的，并成为许多肿瘤和非肿瘤疾病进展的支柱。许多严重疾病是由异常新血管发生引起的，包括固体肿瘤生长和转移，关节炎，一些眼部疾病和银屑病。见例如Moses等，生物技术9：630-634(1991)；Folkman等，N.Engl.J.Med.333：1757-1763(1995)；Auerbach等，微血管研究杂志29：401-411(1985)；Folkman，癌症研究进展，Klein和Weinhouse编辑，科学出版社，纽约，pp175-203(1985)；Patz，Am.J.Opthalmol 94：715-743(1982)；和Folkman等，科学221：719-725(1983)。在许多病理状态下，血管生成的过程决定疾病的状态。例如，已积累的有意义的数据推断，固体肿瘤的生长依赖于血管生成。Folkman和Klagsbrun，科学235：442-447(1987)。
本发明提供了治疗与新血管发生相关的疾病或功能失调的方法，是通过施用血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂进行治疗的。可用本发明的多核苷酸和多肽，或其激动剂或拮抗剂治疗的恶性和转移肿瘤包括但非限于恶性肿瘤，固体肿瘤，和本文及本领域已知的其它癌症(参见Fishman等，医学，第二版，J.B.LippincottCo.，Philadelphia(1985))。
可用本发明的血管生成多核苷酸和多肽，或其激动剂或拮抗剂治疗的，与新血管发生相关的眼功能失调包括但非限于：新生血管性青光眼，糖尿病视网膜病变，眼癌，眼晶状体纤维增生，眼色素层炎，超前黄斑变性的视网膜病变，角膜移植物新血管发生，以及其它眼部炎症疾病，眼部肿瘤和与脉络膜或虹膜新血管发生相关的疾病。见例如Waltman等，Am.J.Ophthal.85：704-710(1978)和Gartner等，Surv.Ophthal.22：291-312(1978)。
另外，可用本发明的血管生成多核苷酸和多肽，或其激动剂或拮抗剂治疗的功能失调包括但非限于血管瘤，关节炎，银屑病，血管纤维瘤，动脉硬化，伤口愈合延迟，粒细胞性血友病关节炎，过度生长的瘢痕，骨不连骨折，Osler-Weber综合征，化脓性肉芽瘤，硬皮病，沙眼，和血管粘连。
再者，可用本发明的血管生成多核苷酸和多肽，或其激动剂或拮抗剂治疗的功能失调和/或病理状态，包括但非限于固体肿瘤，血生肿瘤如白血病，肿瘤转移，Kaposi’s肉瘤，良性肿瘤，例如血管瘤，听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼，和化脓性肉芽瘤，类风湿性关节炎，银屑病，眼部血管生成疾病例如糖尿病视网膜病变，超前黄斑变性的视网膜病变，角膜移植物排斥反应，新生血管性青光眼，眼晶状体纤维增生，虹膜炎，眼癌和眼色素层炎，伤口愈合延迟，子宫内膜异位，血管发生，granulations，过度生长的瘢痕(瘢痕瘤)，骨不连骨折，硬皮病，沙眼，血管粘连，心肌血管生成，冠状动脉侧支形成，脑动脉侧支形成，动静脉畸形，局部缺血肢体血管生成，Olser-Webber综合征，新血管生成斑，毛细血管扩张，血友病关节炎，血管纤维瘤，纤维肌性发育不良，伤口凸凹不平，Crohn’s病，动脉硬化，通过阻止胚胎植入所需的血管生成控制月经的出生控制剂，血管生成导致病理结果如猫抓病(Rochele minalia quintosa)，巴尔通氏体病和杆状血管瘤。在细胞水平的疾病
可用本发明的血管生成多核苷酸和多肽，或其激动剂或拮抗剂治疗的，与细胞存活性提高或细胞程序死亡抑制相关的疾病，包括癌症(如滤泡淋巴瘤，具有p53突变的癌症，和激素依赖型肿瘤，包括但非限于结肠癌，心脏肿瘤，胰腺癌，黑素瘤，眼癌，恶性胶质瘤，肺癌，小肠癌，睾丸癌，胃癌，成神经细胞瘤，粘液瘤，肌瘤，淋巴瘤，内皮瘤，成骨细胞瘤，破骨细胞瘤，骨肉瘤，软骨肉瘤，腺瘤，乳腺癌，前列腺癌，Kaposi’s肉瘤和卵巢癌)；自身免疫功能失调(如多发性硬化，Sjogren’s综合征，Hashimoto’s甲状腺炎，胆道硬化，Behcet’s病，Crohn’s病，多发性肌炎，系统性红斑狼疮和免疫相关的肾小球肾炎和类风湿性关节炎)，和病毒感染(如疱疹病毒，牛痘病毒和腺病毒)，炎症，移植物抗宿主病，急性移植物排斥反应，和慢性移植物排斥反应。在一优选的实施方案中，本发明的血管生成多核苷酸，多肽和/或拮抗剂用于抑制癌症的生长，进展和/或转移，尤其上述那些癌症。
可用本发明的血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂治疗或检测的，与细胞存活性提高相关的疾病或功能失调，包括但非限于恶性肿瘤的进展和/或转移，及相关的功能失调如白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病，急性粒细胞白血病(包括原粒细胞，promyelocytic，myelomonocytic，monocytic，和红细胞白血病))，和慢性白血病(例如慢性中幼粒细胞(粒细胞性)白血病，和慢性淋巴细胞白血病))，红细胞增多症，淋巴瘤(例如Hodgkin’s病和非Hodgkin’s病)，多发性肌瘤，Waldenstrom’s巨球蛋白血症，重链病，和固体肿瘤包括但非限于肉瘤和癌，如纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，软骨瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，Ewing’s肿瘤，平滑肌肉瘤，骨骼肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，脂肪腺癌，乳头样癌，乳头样腺癌，囊腺癌，骨髓癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞瘤，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎样癌，Wilm’s肿瘤，宫颈癌，睾丸癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，胶质瘤，星细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少枝胶质瘤，menangioma，黑素瘤，成神经细胞瘤，和眼癌。
可用血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂治疗或检测的，与细胞程序死亡增加相关的疾病，包括AIDS；神经变性疾病(如Alzheimer’s病，Parkinson’s病，Amyotrophic晚期硬化，视网膜色素细胞瘤，小脑变性，和脑肿瘤或相关疾病)；自身免疫功能失调(如多发性硬化，Sjogren’s综合征，Hashimoto’s甲状腺炎，胆管硬化，Behcet’s病，Crohn’s病，多发性肌炎，系统性红斑狼疮和免疫相关的肾小球肾炎，和类风湿性关节炎)，myelodysplastic综合征(如aplastic贫血)，移植物抗宿主病，缺血性损伤(如由心肌梗塞，休克和再灌注损伤所致)，肝损伤(例如肝损伤相关的肝炎，缺血性/再灌注损伤，cholestosis(胆管损伤)，和肝癌)；毒素诱导的肝脏疾病(如由乙醇所致)，败血病休克，恶病质，和厌食。伤口愈合和上皮细胞增殖
本发明的另一方面提供了一种利用血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂进行治疗的方法，例如，刺激上皮细胞和基底角质形成细胞增殖，以促进伤口愈合，及刺激毛囊产生和皮肤伤口愈合。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可临床用于刺激伤口愈合包括手术伤口，切口，深度伤口包括损伤真皮和表皮的伤口，眼组织伤口，牙周组织伤口，口腔伤口，糖尿病溃疡，皮肤溃疡，前臂溃疡，动脉溃疡，静脉曲张溃疡，烫伤或化学物质烧伤，及其它异常伤口愈合状态，如尿毒症，营养不良，维生素缺乏，和与全身施用类固醇，放疗和抗肿瘤药和抗代谢物进行治疗相关的并发症。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于在皮肤损伤后促进皮肤再生。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可用于提高皮肤移植物与伤口床的粘着，并刺激伤口床的再上皮化。以下是可用血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，提高与伤口床粘着的移植物类型：自身移植物，人造移植物，同种异体移植物，自皮移植物，自上皮移植物，avacular移植物，Blair-Brown移植物，骨移植物，胚胎期形成的移植物，真皮移植物，延迟的移植物，皮肤移植物，上皮移植物，带状移植物，全层移植物，异源移植物，异种移植物，同源移植物，增生性移植物，片层移植物，网眼移植物，粘膜移植物，Ollier-Thiersch移植物，omenpal移植物，片状移植物，带蒂移植物，penetrating移植物，分离皮肤移植物，全层分离移植物。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于促进皮肤强度，并改进年老皮肤的外观。
确信血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，对肝细胞增殖，和肺，乳房，胰腺，胃，小肠和大肠中上皮细胞增殖也产生改变。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可促进上皮细胞增殖如sebocytes，毛囊，肝细胞，II型肺泡细胞，产生粘液素的杯状细胞，和其它上皮细胞及其包含于皮肤，肺，肝和胃肠道中的祖细胞。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可促进内皮细胞，角质形成细胞和基底角质形成细胞增殖。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，还可用于降低由放疗，化疗或病毒感染所产生的内脏毒素的副作用。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，对小肠粘膜还具有细胞防护性作用。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，还可刺激由化疗和病毒感染所产生的粘膜炎(口腔溃疡)的伤口愈合。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，还可用于在全层或部分皮肤缺损的情况中完全再生皮肤，包括烧伤(即毛囊，汗腺和皮脂腺的再生)，治疗其它皮肤缺损如银屑病。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于治疗大疱性表皮松解症，这是一种表皮与下层真皮粘着缺失，产生多发的开放的疼痛的水疱，这是通过促进这些损害的再上皮化进行治疗的。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，还可用于治疗胃和十二指肠溃疡，并有助于其愈合，这是通过粘膜下层瘢痕形成及腺粘膜和十二指肠粘膜下层更迅速再生进行的。肠道炎症如Crohn’s病和溃疡性结肠炎，分别是由小肠和大肠的粘膜表面破坏所致的疾病。因此，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于促进粘膜表面再生，以助于更迅速愈合并阻止肠道炎症进展。用血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂进行治疗，期望对胃肠道粘液产生有明显作用，并可用于保护小肠粘膜免于咽下的或手术后有害物质损伤。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于治疗与血管生成多肽低表达相关的疾病。
另外，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于预防和愈合由各种病理状态所致的肺部损伤。生长因子如血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，其可刺激肺泡和支气管上皮增殖和分化并促进其修复，以预防或治疗急性或慢性肺部疾患。例如，肺气肿，是由肺泡渐进性丧失和吸入性伤害所致的疾病，即由吸烟和灼伤所致的，导致支气管上皮和肺泡坏死，这种疾病可由血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂进行治疗。同样，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于刺激II型肺泡细胞增殖和分化，这可有助于治疗或预防如透明膜病，如新生儿呼吸窘迫综合征，和早产儿支气管肺不张。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可刺激肝细胞增殖和分化，因此可用于减轻或治疗肝脏疾病和病变，如由爆发性肝硬化，由肝炎病毒和毒性物质(即对乙酰氨基酚，四氯化碳和其它本领域已知肝毒性物质)所致的肝脏损伤。
另外，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于治疗或预防糖尿病并发症发生。在新诊断的仍保留一些胰岛细胞功能的I型和II型糖尿病患者中，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于保持胰岛功能以减轻，延迟或预防此疾病的持久表现。同样，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用作胰岛细胞移植中的辅助剂，以改进或促进胰岛细胞功能。感染性疾病
血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于治疗或检测传染病原体。例如，通过提高免疫应答，尤其是提高B和/或T细胞的增殖和分化，治疗感染性疾病。通过提高现有的免疫应答，或启动新的免疫应答，均可提高这种免疫应答。另外，VEGF-2的多核苷酸或多肽还可直接抑制感染性病原体，而不产生免疫应答。
病毒是一种可以引起疾病或症状的感染性病原体，此类疾病可以用血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂进行治疗或检测。例如包括但非限于以下DNA或RNA病毒家族：虫媒病毒科，腺病毒科，动脉病毒，双节RNA病毒科，布尼亚病毒科，杯状病毒科，Circoviridae，冠状病毒科，黄病毒科，DNA肝病毒科(肝炎病毒)，疱疹病毒科(例如，巨细胞病毒，单纯疱疹病毒，带状疱疹病毒)，Mononegavirus(如，副粘病毒科，麻疹病毒，弹状病毒科)，正粘病毒科(如流感病毒)，乳多空病毒科，细小病毒科，小RNA病毒科，痘病毒科(如水痘或牛痘病毒)，呼肠孤病毒科(如轮状病毒)逆转录病毒科(HTLV-I，HTLV-II，慢病毒)和外衣病毒科(如风疹病毒)。上述不同种类的病毒可以引起各种各样的疾病或症状，包括，不仅限于这些：关节炎，细支气管炎，脑炎，眼部感染(如结膜炎，角膜炎)，慢性疲劳综合征，肝炎(甲、乙、丙、戊、慢性活动性肝炎、非甲非乙型肝炎)，脑膜炎，机会感染(如艾滋病)，肺炎，Burkitt淋巴瘤，水痘，出血热，麻疹，腮腺炎，副流感，狂犬病，普通感冒，脊髓灰质炎，白血病，风疹，性传播疾病，皮肤病(如卡波氏瘤，疣)，病毒血症。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于治疗或检测所有疾病和症状。
同样，细菌或真菌也可以引起疾病或症状，并能用血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂治疗或检测，包括但非限于以下革兰氏阴性和革兰氏阳性菌和真菌，：放线菌(如棒状杆菌，分枝杆菌，奴卡氏菌)，曲霉菌，芽孢杆菌(如炭疽杆菌，梭状芽孢杆菌)，多形杆状菌，芽生菌，博代杆菌，疏螺旋体菌，布鲁杆菌，念珠菌，弯曲杆菌，球孢子菌，隐球菌，Dermatocycoses，肠杆菌(如克雷伯杆菌，沙门氏菌，沙雷氏菌，耶尔森氏菌)，丹毒丝菌，螺杆菌，军团菌，钩端螺旋体，李斯特菌，支原体，奈瑟氏菌(如不动杆菌，淋球菌，脑膜炎球菌)，巴斯德菌感染(如放线杆菌，嗜血杆菌，巴斯德菌)，假单胞菌，立克次氏体，衣原体，梅毒和葡萄球菌。这些杆菌或真菌可引起以下疾病和症状，包括但不仅限于这些：菌血症，心内膜炎，眼部感染(结膜炎，结核，葡萄膜炎)，牙龈炎，机会感染(如艾滋病相关的感染)，甲沟炎，修复术有关的感染，Reiter病，呼吸道感染，如百日咳或脓胸，败血症，莱姆病，猫抓病，痢疾，副伤寒，食物中毒，伤寒，肺炎，淋病，脑脊膜盐炎，衣原体病，梅毒，白喉，麻风病，类结核，结核，狼疮，肉毒素中毒，坏疽，破伤风，脓疱病，风湿热，猩红热，性传播疾病，皮肤病(如蜂窝组织炎，Dermatocycoses)，毒血症，尿路感染，伤口感染。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可以治疗或检测上述任何疾病和症状。
再者，寄生虫引起的疾病和症状也可以用血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂治疗或诊断，包括但非限于以下疾病，：阿米巴病，巴贝虫病，球虫病，Cryptosporidiosis，双核阿米巴病，Dourine，体外寄生虫病，贾第鞭毛虫病，蠕虫病，利什曼原虫病，Theileriasis，弓形体病，锥虫病和毛滴虫病。这些寄生虫可以引起多种疾病和症状，包括但不仅限于这些，疥疮，Trombiculiasis，眼部感染，肠病(如痢疾，贾第鞭毛虫病)，肝病，肺病，机会性感染(如艾滋病相关的)，疟疾，妊娠期并发症，弓形体病。血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于治疗或检测这些症状和疾病。
优选的方法，用血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂进行治疗，既可通过给患者使用有效剂量的血管生成多肽，也可通过先从患者体内取出细胞，将血管生成多核苷酸装入此种细胞，再将这些“工程”细胞输回患者体内(间接体内治疗)。再者，血管生成多核苷酸或多肽可以作为疫苗的一种抗原，提高机体抗感染性疾病的免疫应答。再生
血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于诱导细胞的分化、增殖，以及吸引细胞，促进组织的再生(见科学，1997，276：59-87)。组织再生可用于修复、取代或保护由以下原因造成的组织损伤：先天性缺陷，创伤(伤口，烧伤，切口或溃疡)，衰老，疾病(如骨质疏松症，骨关节炎，牙周疾病，肝功衰竭)，手术，包括美容整形术，纤维化，再灌注性损伤，或系统性细胞因子受损。
使用本发明可以使组织再生，包括器官(如胰腺，肝脏，肠，肾脏，皮肤，内皮)，肌肉(平滑肌，骨骼肌或心肌)，血管(包括血管内皮)，淋巴管(包括淋巴管内皮)，神经，造血器官，骨骼(骨骼，软骨，肌腱和韧带)组织。尤其是，再生不伴有或降低疤痕的形成。再生还包括血管生成。
再者，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可以促进难愈合组织的再生。例如，肌腱/韧带再生能力的提高，可以加快损伤后痊愈时间。本发明的V血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，还可用于预防，避免损伤。用于一些特殊疾病的治疗，包括肌腱炎，腕管综合征和其他腱或韧带缺损。还有一些不愈合性伤口的组织再生的实例，包括紧张性溃疡，血管缺损性溃疡，手术和外伤。
同样地，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可以使神经和脑组织再生，因为它可以使神经细胞增殖和分化。使用该方法治疗的疾病包括中枢和周围神经系统疾病，神经病变，或机械性和外伤性疾病(如，脊索疾病，头外伤，脑血管病和中风)。尤其是与周围神经损伤有关的疾病，周围神经病(如由化疗或其他疗法引起)局部神经病和中枢神经系统疾病(如阿尔兹海默病，帕金森病，亨廷顿病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症和Shy-Drager综合征)，均可用血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂进行治疗。趋化性
血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂具有趋化活性。趋化分子可以吸引或动员细胞(如单核细胞，成纤维细胞，中性粒细胞，T细胞，肥大细胞、嗜酸性粒细胞，上皮细胞和/或内皮细胞)到达体内特定的位点，如炎症，感染或过度增殖等部位。动员的细胞继而对抗和/或愈合特异的损伤或异常。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可以提高某些特定细胞的趋化活性。这些趋化分子继而又通过提高细胞到达体内特异靶组织位点的数量治疗炎症、感染、过度增殖性疾病，或任何免疫系统疾病。例如，趋化分子通过吸引免疫细胞到达受损部位，可以治疗伤口和其他组织创伤。VEGF-2作为一种趋化分子还可吸引成纤维细胞用于治疗伤口。
还应该考虑到血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可以抑制趋化活性。这些分子还用于疾病的治疗。因此，血管生成多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可以作为一种趋化抑制剂。结合活性
血管生成多肽可用于筛选结合血管生成多肽的分子，或血管生成多肽结合的分子。血管生成多肽与分子的结合可以活化(激动剂)、提高、抑制(拮抗剂)、或降低血管生成多肽或结合分子的活性。这样的分子实例包括抗体、寡核苷酸、蛋白质(如受体)、或小分子。
优选，对这些分子的筛选，包括生成可表达血管生成多肽的细胞，血管生成多肽既可以作为一种分泌蛋白，也可以是一种膜结合蛋白。优选的细胞包括哺乳动物，酵母，果蝇，或大肠杆菌的细胞。表达血管生成多肽的细胞(或含有表达多肽的细胞膜)优先与一种检测化合物作用，该化合物具有潜在的结合、刺激，或抑制血管生成多肽或分子本身活性的分子。
该分析方法可以很容易地检测备选化合物与血管生成多肽的结合，可通过某种标记进行检测，或通过与标记的竞争物的竞争来分析测定。再者，该方法可以检测备选化合物是否导致结合血管生成多肽的信号。
另一种情况，还可以用不含细胞的标本，与固相结合的多肽/分子，化学制剂文库，或天然产品混合物进行测试。该方法非常简单，仅包括以下步骤：将备选化合物与含有血管生成多肽的溶液混合，检测血管生成多肽/分子的活性或结合，以及将血管生成多肽/分子活性或结合与标准物比较。
应用单克隆抗体或多克隆抗体，优选ELISA(酶联免疫吸附试验)法，来检测样本(如生物样本)中血管生成多肽的量或活性。抗体通过直接或间接地结合血管生成多肽，或与血管生成多肽竞争结合底物，用来检测血管生成多肽的水平或活性。
另外，血管生成多肽结合的受体可通过本领域技术人员已知的许多方法鉴别，例如配体淘选和FACS分选(见Colihan等，当代免疫学方法，1(2)：第五章，1991)。例如，应用表达克隆，其中聚腺苷酸化的RNA制备自对此多肽应答的细胞，例如NIH3T3细胞，其已知含有FGF家族蛋白的多个受体，和SC-3细胞，将产生自此RNA的cDNA文库分为集合库，用于转染COS细胞或其它对此多肽不应答的细胞。将在玻片上生长的转染细胞，在标记后暴露于本发明的多肽。此多肽可通过各种方法标记，包括用碘标记或包含位点特异性蛋白激酶的识别位点。
在固定和温育后，将此玻片进行放射自显影分析。鉴别阳性集合体，并制备亚集合体，用重复的亚集合和再筛选方法再转染，，最后产生一个编码推定的受体的单一克隆。
鉴别受体的另一种方法是，将标记的多肽与表达受体分子的细胞膜或提取物光亲和性连接。交联物通过PAGE分析解离，并暴露于X光片。切下含有多肽受体的标记的复合物，解离为肽片段，并进行蛋白质微量测序。得自蛋白质微量测序的氨基酸序列用于设计一系列简并的寡核苷酸探针，以筛选cDNA文库，鉴别编码推定的受体的基因。
另外，本发明提供了一种筛选化合物的方法，以鉴别调节本发明多肽作用的化合物。这种分析例如包括将哺乳动物成纤维细胞，本发明的多肽，要筛选的化合物，3〔H〕胸苷，在成纤维细胞正常增殖的细胞培养条件下组合。在无要筛选的化合物的情况下进行对照分析，并与存在要筛选的化合物的情况下成纤维细胞增殖的数量相对比，通过确定在每种情况下3〔H〕胸苷的吸收，从而确定此化合物是否刺激增殖。成纤维细胞增殖的数量是通过液体闪烁层析测定的，该层析测定3〔H〕胸苷的掺入情况。激动剂和拮抗剂均可通过此方法鉴别。
在另一方法中，将表达本发明多肽受体的哺乳动物细胞或膜制备物，用标记的本发明多肽在存在化合物的情况下温育。然后测定此化合物增强或阻断此反应的能力。或者，在筛选化合物与本发明血管生成多肽受体相互作用后，测定已知第二信使系统的应答，并测定此化合物结合受体并激发第二信使应答的能力，从而确定此化合物是否是潜在的激动剂或拮抗剂。这种第二信使系统包括但非限于cAMP鸟苷酸环化酶，离子通道或磷酸肌醇水解。
上述所有的检测方法可以作为诊断或预后的指标。用这些方法发现的分子，通过活化或抑制血管生成多肽/分子，可治疗疾病或给患者带来某种特殊后果(如血管生长)。再者，这些检测方法可以发现某些可以抑制或增加血管生成多肽从合适的细胞或组织中合成的物质。
因此，本发明包括一种鉴别与血管生成多肽结合的化合物的方法，包括以下步骤：(a)将一种备选的具有结合功能的化合物与血管生成多肽一起温育；(b)如果已经结合，进行检测。再者，本发明包括一种识别激动剂/拮抗剂的方法，有以下几步：(a)将一种备选化合物与血管生成多肽一起温育，(b)确定血管生成多肽的生物学活性是否已经发生变化。反义和核酶(拮抗剂)
在特异的实施方案中，本发明的拮抗剂是相当于SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23中包含的序列或其互补链的核酸。在一实施方案中，反义序列是通过有机质产生的，在另一实施方案中，反义序列是单独施用的(见例如O’Connor，神经化学杂志56：560(1991)。寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂，CRC出版社，Boca Raton，FL(1988)。可使用反义方法通过反义DNA或RNA，或通过三螺旋形成，控制基因表达。反义方法例如Okano，神经化学杂志56；560(1991)；寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂，CRC出版社，Boca Raton，FL(1988)所述。三螺旋形成见例如Lee等，核酸研究6：3073(1979)；Cooney等，科学241：456(1988)；和Dervan等，科学251：1300(1991)所述。此方法基于多核苷酸与互补DNA或RNA的集合。
例如，编码本发明成熟多肽的多核苷酸的5’编码部分，可用于设计长度为大约10-40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。将DNA寡核苷酸设计为与转录中包含的基因的一区域互补，从而阻止转录和受体产生。此反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交并阻断mRNA翻译为受体多肽。
在一实施方案中，本发明的血管生成反义核酸是通过从外源序列转录在细胞内产生的。例如，转录载体或其一部分，产生本发明的反义核酸(RNA)。这种载体含有编码血管生成反义核酸的序列。这种载体可保留附加体，或成为经染色体整合的，只要其可被转录产生所需的反义RNA。这种载体可通过本领域标准的重组DNA方法构建。载体可以是质粒，病毒，或其它本领域已知载体，用于在脊椎动物细胞中表达和复制。编码血管生成蛋白的序列或其片段的表达，可通过本领域已知的任何启动子进行，以在脊椎动物优选人体细胞中起作用。这种启动子可以是可诱导的或组成型的。这种启动子包括但非限于SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon，自然29：304-310(1981))，包含于Rous肉瘤病毒的3’长末端重复中的启动子(Yamamoto等，细胞22；787-797(1980))，疱疹胸苷启动子(Wagner等，美国科学院院报78：1441-1445(1981))，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，自然296：39-42(1982))等。
本发明的反义核酸包含与血管生成基因的RNA转录物的至少一部分互补的序列。然而，绝对互补尽管是优选的，但不需要。“与RNA的至少一部分互补”的序列，是指具有充分互补性能与RNA杂交，形成稳定双螺旋的序列；在双链反义核酸定向编码血管生成蛋白的抗RNA转录物的情况下，可测试单链的双螺旋DNA，或可分析三螺旋形成。杂交能力依赖于反义核酸的互补程度和长度。通常地，杂交分子越大，与血管生成RNA的错配越多，并仍形成稳定的双螺旋(或三螺旋)。本领域技术人员通过使用标准方法确定杂交的复合物的熔点，可确定可容忍的错配程度。
互补于信使5’末端如5’未翻译区直至并包括AUG起始密码子的寡核苷酸，，在抑制翻译方面更有效。然而，互补于mRNA的3’未翻译序列的序列已示出在抑制mRNA翻译方面一样有效。见Wangner，R.，1994，自然372：333-335。因此，与图3A-3C所示血管生成蛋白的5’或3’未翻译的非编码区互补的寡核苷酸，可用于反义技术，以抑制编码血管生成蛋白的内源性mRNA翻译。互补于mRNA的5’未翻译区的寡核苷酸应包括AUG起始密码子的补体。互补于mRNA编码区的反义寡核苷酸是低效的翻译抑制剂，但根据本发明可以使用。不论是与血管生成mRNA的5’，3’序列还是与编码区杂交，反义核酸长度应至少为6个核苷酸，并优选寡核苷酸的长度在6-50个核苷酸范围。寡核苷酸的长度至少为17，25或50个核苷酸。
本发明的多核苷酸可以是DNA或RNA，或嵌合混合物或其衍生物或修饰的形式，可以是单链或双链的。对寡核苷酸可在碱基组分，糖组分或磷酸主链进行修饰，以例如改进分子的稳定性，杂交等。此寡核苷酸可包括其它附加的基团如肽(例如在体内定向宿主细胞)，或促进转运经过细胞膜的制剂(见例如Letsinger等，1989，美国科学院院报86：6553-6556；Lemaitre等，1987，美国科学院院报84：648-652；PCT出版物WO88/09810，1988年12月15日出版)，或促进转运经过血脑屏障的制剂(见例如PCT出版物WO89/10134，1988年4月25日出版)，触发杂交的裂解剂(见例如Krol等，1988，生物技术6：958-976)或嵌入剂(见例如Zon，1988，药物研究5：539-549)。总而言之，此寡核苷酸可缀合于其它分子，例如肽，触发杂交的交联剂，转运剂，触发杂交的裂解剂等。
反义寡核苷酸可包含至少一个修饰的碱基组分，其选自以下基团，包括但非限于5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，xantine，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧羟甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖queosine，肌苷，N6-异戊烯腺苷，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺苷，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6腺苷，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖queosine，5’-甲氧羧甲基尿嘧啶，5-甲氧尿嘧啶，2-甲基硫-N6-异戊烯腺苷，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸，(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp)w，和2，6-二氨基嘌呤。
反义寡核苷酸也可包含至少一个修饰的糖组分，选自以下基团，包括但非限于阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖，和己糖。
另一方面，反义寡核苷酸包含至少一个修饰的磷酸主链，选自以下基团，包括但非限于硫代磷酸盐，二硫代磷酸盐，硫代磷酸铵，磷酸铵，磷酸二铵，甲基磷酸盐，烷基磷酸三酯，和formacetal或其类似物。
在另一实施方案中，反义寡核苷酸是一种端基异构寡核苷酸。端基异构寡核苷酸与互补RNA形成特异的双链杂合体，其中与通常的b-单位相反，此双链彼此互相平行(Gautier等，1987，核酸研究15：6625-6641)。此寡核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，核酸研究15：6131-6148)，或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBS通信215：327-330)。
本发明的多核苷酸可通过本领域已知的标准方法合成，例如通过自动DNA合成仪(如购自Biosearch，Applied Biosystems，等，)。例如，硫代磷酸盐寡核苷酸可通过Stein等所述方法合成(1988，核酸研究16：3209)，甲基磷酸盐寡核苷酸可通过使用控制网眼玻璃聚酯支持物制备(Sarin等，1988，美国科学院院报85：7448-7451)等。
当使用互补于编码血管生成蛋白的编码区序列的反义核苷酸时，最优选互补于转录的未翻译区的寡核苷酸。
本发明的潜在拮抗剂还包括催化的RNA，或核酶(见例如PCT国际出版物WO90/11364，1990年10月4日出版；Sarver等，科学247：1222-1225(1990))。当使用在特异识别序列位点裂解mRNA的核酶，以破坏编码血管生成蛋白的mRNA时，优选使用锤头核酶。锤头核酶裂解位于与靶mRNA形成互补碱基对的区域两侧mRNAs。唯一的要求是靶mRNA具有以下两个碱基的序列：5’-UG-3’。本领域已知锤头核酶的构建和产生，详见Haseloff和Gerlach，自然334：585-591(1988)所述。在编码血管生成蛋白的核苷酸序列内(SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23)有许多潜在的锤头核酶切割位点。优选地，核酶是工程化的，以便切割位点位于编码血管生成蛋白的mRNA的5’末端附近；即提高效力，和最大限度的减少非功能性mRNA转录物的胞内积累。
在反义方法中，本发明的核酶可以由修改的寡核苷酸组成(例如为改进稳定性，定向等)，并输送至在体内表达血管生成蛋白的细胞。编码核酶的DNA构建体可以与上述导入反义编码DNA相同方式导入细胞。输送的优选方法包括使用在强组成型启动子的控制下的编码核酶的DNA构建体，如polIII或polII启动子，以便转染的细胞产生足量的核酶，以破坏编码血管生成蛋白的内源性信息，并抑制其翻译。与反义分子不同，核酶是催化性的，因此需要较低的胞内浓度以更加有效。
拮抗剂/激动剂化合物可用于抑制肿瘤细胞生长和本发明多肽在肿瘤细胞和组织上的增殖作用，即刺激肿瘤的血管生成，因此延迟或预防例如在肿瘤形成或生长中异常细胞生长和增殖。
拮抗剂/激动剂也可用于预防过度血管化的疾病，并预防在白内障囊外摘除术后晶状体上皮细胞的增殖。在一些情况中也需要阻止本发明多肽的促分裂原活性，如在气囊血管成形术后再狭窄。
拮抗剂/激动剂也可用于预防在伤口愈合期间疤痕组织的生长。
拮抗剂/激动剂也可用于治疗本文所述的疾病。其它活性
本发明的多肽，由于具有刺激血管内皮细胞生长的能力，可用于刺激缺血组织再血管化，缺血组织是由于各种疾病所致的如血栓，动脉硬化及其它心血管疾病。这些多肽还可用于刺激血管发生和侧支重建，如上所述。
本发明的多肽还可用于治疗由于创伤，烧伤，组织修复术后，和溃疡所致的伤口，因为其具有是各种不同来源的细胞的促分裂原的能力，如成纤维细胞和骨骼肌细胞，因此促进损伤或病变组织的修复或更新。
本发明的多肽还可用于刺激神经元生长，及治疗和预防神经元损伤，如发生在中枢神经系统疾病或神经退化疾病如Alzheimer’s疾病，Parkinson’s疾病，和AIDS相关的综合征。血管生成蛋白，其激动剂和/或拮抗剂，可具有刺激软骨细胞生长的能力，并因此可用于增强骨和牙周膜重建，及有助于组织移植或骨移植。
本发明的多肽也可通过刺激角质形成细胞生长，用于预防由于日晒所致的皮肤老化。
血管生成蛋白，其激动剂和/或拮抗剂，也可在移植之前用于维持器官，或支持原始组织的细胞培养物。
本发明的多肽也可用于诱导早期胚胎中胚层组织分化。
血管生成蛋白，其激动剂和/或拮抗剂，也可提高或降低除造血细胞系之外胚胎干细胞的分化或增殖，如上所述。
血管生成蛋白，其激动剂和/或拮抗剂，也可用于调节哺乳动物特性，如身高，体重，发色，眼睛颜色，皮肤，脂肪组织百分率，肤色，大小和形状(如美容外科)。相似地，血管生成蛋白，其激动剂和/或拮抗剂，可通过影响分解代谢，合成代谢，加工，利用和能量贮存，用于调节哺乳动物代谢。
血管生成蛋白，其激动剂和/或拮抗剂，可通过影响生物节律，caricadic节律，压力(包括忧郁症)，暴力倾向，痛阈，生殖力(优选通过活化素或类抑制素活性)，激素或内分泌水平，食欲，性欲，记忆力，应激力或其它感知性，用于改变哺乳动物的精神状态或自然状态。
血管生成蛋白，其激动剂和/或拮抗剂，也可用作食物添加剂或防腐剂，如提高或降低贮存力，脂肪含量，脂质，蛋白质，碳水化合物，维生素，无机盐，辅因子或其它营养成分。
上述应用可用于众多宿主中。这种宿主包括但非限于人，鼠，兔，山羊，豚鼠，骆驼，马，小鼠，大鼠，仓鼠，猪，小猪，鸡，牛，绵羊，狗，猫，非人灵长类动物，和人。在特异的实施方案中，宿主是小鼠，兔，山羊，豚鼠，鸡，大鼠，仓鼠，猪，绵羊，狗或猫。在优选的实施方案中，宿主是哺乳动物。在更优选的实施方案中，宿主是人。治疗应用
本发明的血管生成蛋白是血管和淋巴内皮细胞的潜在的促分裂原。因此，血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，可通过促进血管发生用于治疗血管损伤。例如，刺激进行冠脉搭桥术处移植的组织生长。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于促进伤口愈合，尤其使损伤组织再生血管，或在缺血期间刺激间接血流，及用于需要形成新毛细血管处。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，可用于治疗全层伤口，如皮肤溃疡包括压痛，静脉溃疡，和糖尿病溃疡。另外，血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，可用于治疗全层烧伤和损伤，其中使用皮肤移植物或皮瓣修复这种烧伤和损伤。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于整形手术，例如修复破口，手术或其它外伤。另外，血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，可用于促进伤口愈合和眼外伤以及治疗眼病。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于诱导损伤的骨，牙周膜或韧带组织生长。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于重建例如由牙周病或外伤所伤的牙周组织，包括牙骨质和牙周膜。
由于血管生成对保持伤口清洁和非感染是重要的，因此血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，可与手术联合应用及随后修复切口。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于治疗腹部伤口，腹部伤口感染危险性高。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，可用于在血管移植术中促进内皮化。在使用移植的或合成物的血管移植情况中，血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，可用于移植物表面或接合处，以促进血管内皮细胞生长。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于修复由于心肌梗塞所损伤的心肌组织。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于修复缺血后的心血管系统。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于治疗由冠心病及周围和CNS血管疾病。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于包被植入机体内的人造prostheses或自然器官，以使排斥移植物反应最小，并刺激移植物血管发生。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于修复损伤的血管组织，例如在动脉硬化期间发生的血管损伤，及用于在血管损伤处进行气囊血管成形术后。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于治疗周围动脉疾病。因此，本发明另一方面提供了利用血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，治疗周围动脉疾病的方法。优选地，将血管生成多肽与激动剂共同施用于个体，以减轻或治疗周围动脉疾病。适当的剂量，配方和施用途径见下述。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于促进淋巴组织和淋巴管的内皮功能，如治疗淋巴管损伤，淋巴管闭塞，和淋巴管瘤。血管生成多肽与激动剂也可用于刺激淋巴细胞产生。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于治疗新生儿血管瘤。因此，本发明另一方面提供了利用血管生成多肽与激动剂和/或拮抗剂共同治疗新生儿血管瘤的方法。优选地，将血管生成多肽与激动剂联合施用于个体，以减轻或治疗新生儿血管瘤。适当的剂量，配方和施用途径见下述。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于预防或治疗早产新生儿异常视网膜发育。因此，本发明另一方面提供了利用血管生成多肽与激动剂或拮抗剂联合治疗早产新生儿异常视网膜发育。优选地，将血管生成多肽与激动剂或拮抗剂联合施用于个体，以减轻或治疗早产新生儿异常视网膜发育。适当的剂量，配方和施用途径见下述。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，可用于治疗原发性(独特型)淋巴腺瘤，包括Milroy’s病和早发的淋巴腺瘤。因此，本发明另一方面提供了利用血管生成多肽与激动剂联合治疗原发性(独特型)淋巴腺瘤，包括Milroy’s病和早发的淋巴腺瘤的方法。优选地，将血管生成多肽与激动剂联合施用于个体，以减轻或治疗原发性(独特型)淋巴腺瘤包括Milroy’s病或早发的淋巴腺瘤。血管生成多肽与激动剂也可用于治疗水肿以及影响动物血压。适当的剂量，配方和施用途径见下述。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于治疗二级寿命(受阻碍的)，包括由(i)除去淋巴结和淋巴管，(ii)治疗癌症的放疗和手术，和(iii)损伤和感染所致的二级寿命。因此本发明另一方面提供了利用血管生成多肽与激动剂联合治疗二级寿命(受阻碍的)，包括由(i)除去淋巴结和淋巴管，(ii)治疗癌症的放疗和手术，和(iii)损伤和感染所致的二级寿命。优选地，将血管生成多肽与激动剂联合施用于个体，以治疗二级寿命(受阻碍的)，包括由(i)除去淋巴结和淋巴管，(ii)治疗癌症的放疗和手术，和(iii)损伤和感染所致的二级寿命。适当的剂量，配方和施用途径见下述。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激动剂和/或拮抗剂，也可用于治疗Kaposi’s肉瘤。因此本发明另一方面提供了利用血管生成多肽与激动剂联合治疗Kaposi’s肉瘤的方法。优选地，将血管生成多肽与激动剂联合施用于个体，以减轻或治疗Kaposi’s肉瘤。适当的剂量，配方和施用途径见下述。
血管生成多肽的拮抗剂可通过抑制支持癌症和肿瘤生长所必需的血管发生，用于治疗癌症。基因治疗方法
本发明的另一方面是治疗功能失调，疾病和病理状态的基因疗法。基因疗法涉及将核酸(DNA，RNA和反义DNA或RNA)序列导入动物体，以表达本发明的血管生成多肽。此方法需要操纵性连于启动子的编码血管生成多肽的多核苷酸，和通过靶组织表达多肽所必需的任何其它遗传因子。本领域已知这种基因疗法和输送方法，见例如WO 90/11092，以其全文并入参考。
因此，例如可将患者的细胞用包含可操纵地连于源自体内的血管生成多肽的启动子的多核苷酸(DNA或RNA)工程化，然后将工程化的细胞施用于患者以用多肽进行治疗。本领域熟知这种方法。例如见Belldegrun，A.，等，J.Natl.Cancer Inst.85：207-216(1993)；Ferrantini，M.等，癌症研究53：1107-1112(1 993)；Ferrantini，M.等，免疫学杂志153：4604-4615(1994)；Kaido，T.，等Int.J.Cancer60：221-229(1995)；Ogura，H.，等，癌症研究50：5102-5106(1990)；Santodonato，L.，等，人体基因治疗7：1-10(1996)；Santodonato，L，基因治疗4：1246-1255(1997)；和Zhang，J.，-F等，癌症基因治疗3：31-38(1996)，所述文献以其全文并入参考。在一实施方案中，工程化的细胞是动脉细胞。可通过直接注射入动脉，动脉周围组织，或通过导管注射，将此动脉细胞再导入患者体内。
如下文更详细的阐述，可通过将可注射物质输送至动物细胞的任何方法输送血管生成多核苷酸构建体，如注射入组织间隙内(心，肌，皮肤，肺，肝等)。血管生成多核苷酸可在药物适当液体或水溶液载体中输送。
在一实施方案中，血管生成多核苷酸以裸多核苷酸方式输送。术语“裸”多核苷酸，DNA或RNA是指游离自任何有助于，促进或易于进入细胞内的输送载体的序列，包括病毒序列，病毒颗粒，脂质体配方，Lipofectin试剂或沉淀剂等。然而，血管生成多核苷酸也可在脂质体配方和Lipofectin配方中输送，脂质体配方和Lipofectin配方可通过本领域熟知的方法制备。这种方法例如美国专利No：5593972，5589466和5580859所述，以其全文并入参考。
基因疗法中使用的血管生成多核苷酸载体构建体优选是即不整合入宿主基因组，也不含有进行复制的序列的构建体。适当的载体包括得自Stratagene公司的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1和pSG；得自Pharmacia公司的pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL；及得自Invitrogen公司的pEF1/V5，pcDNA3.1和pRc/CMV2。其它适当的载体也为本领域技术人员所显而易见。
可使用本领域已知的任何强启动子以驱动血管生成DNA表达。适当的启动子包括腺病毒启动子，如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；可诱导启动子如MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人球蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，如单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTRs；β-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。启动子也可以是编码给定血管生成蛋白的代表基因的天然启动子。
与其它基因疗法不同，将裸核酸序列导入靶细胞的一个主要优点是细胞中多核苷酸合成的短时性。研究表明可将非复制的DNA序列导入细胞中，以在6个月以上的时间产生所需的多肽。
可将血管生成多核苷酸构建体输送至动物组织间隙内，包括肌，皮肤，脑，肺，肝，脾，骨髓，胸腺，心，淋巴，血液，骨，软骨，胰腺，肾，膀胱，胃，小肠，睾丸，卵巢，子宫，直肠，神经系统，眼，腺体和结缔组织。组织间隙内包含细胞内液，组织液，器官组织的网状纤维中的粘多糖基质，血管或腔壁中的弹性纤维，纤维性组织中的胶原纤维，或包裹肌细胞或骨松质内的结缔组织内相同基质。此间隙内还有循环血浆和淋巴管道内的淋巴液。由于下述原因优选输送至肌组织间隙内。便于通过注射至包含这些细胞的组织内而输送。优选将其输送至分化的未分开的细胞中并持久表达，尽管可输送至未分化的或未晚期分化的细胞中并表达，例如血干细胞或皮肤成纤维细胞。在体内肌细胞能吸收并表达多核苷酸。
为注射裸核苷酸序列，DNA或RNA的有效剂量在大约0.05mg/kg体重-50mg/kg体重范围内。优选的剂量为大约0.005mg/kg体重-20mg/kg体重，更优选大约0.05mg/kg体重-5mg/kg体重。当然，本领域技术人员意识道，此剂量将根据注射的组织位置加以变化。本领域技术人员易于确定适当的和有效的剂量，并可根据治疗的疾病和施用途径加以确定。
优选的施用途径是非肠道经注射至组织间隙内。然而，也可使用其它非肠道途径，如以气雾剂配方吸入而特别输送至肺或支气管组织，咽喉或鼻粘膜。另外，血管生成DNA构建体可在血管成形术期间通过导管输送至动脉中。
裸多核苷酸可通过本领域已知的任何方法输送，包括但非限于在输送部位直接针注，静脉内注射，局部施用，导管灌注，和所谓的“基因枪”。本领域已知这些输送方法。
现已证实在体内施用裸VEGF-2核酸序列，可在兔的股动脉中充分表达VEGF-2。
此构建体也可用输送载体输送，如病毒序列，病毒颗粒，脂质体配方，Lipofectin试剂，沉淀剂等。本领域已知这种方法。
在一些实施方案中，血管生成多核苷酸构建体是与脂质体制品复合的。本发明中使用的脂质体制品包括阳离子(正电荷)，阴离子(负电荷)和中性制品。然而，尤为优选阳离子脂质体，因为在阳离子脂质体和聚阴离子核酸之间可形成紧密的荷电复合物。阳离子脂质体已示出介导以功能形式的质粒DNA(Felgner等，美国科学院院报(1987)84：7413-7416，以其全文并入参考)；mRNA(Malone等，美国科学院院报(1989)86：6077-6081，以其全文并入参考)；和纯化的转录因子(Debs等，生物化学杂志(1990)265：10189-10192，以其全文并入参考)的胞内输送。
阳离子脂质体是易于获得的。例如N-〔1-(2，3-二油酰氧)丙基〕-N，N，N-氯化三甲铵(DOTMA)脂质体是特别适用的，并可得自GIBCO BRL，Grand Island，N.Y.，商标为Lipofectin(见Felgner等，美国科学院院报(1987)84：7413-7416，以其全文并入参考)。其它可商购脂质体包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boehringer)。
使用本领域已知方法可从易得物质中制备其它阳离子脂质体。见例如PCT出版物No.WO90/11092(以其全文并入参考)阐述了DOTAP〔1-(2，3-二油酰氧)丙基〕-N，N，N-氯化三甲铵丙烷〕脂质体的合成。阐述DOTMA脂质体制备的文献见例如P.Felgner等，美国科学院院报84：7413-7417所述，以其全文并入参考。可使用相似的方法从其它阳离子脂质中制备脂质体。
相似地，阴离子和中性脂质体也是易得的，如得自Avanti PolarLipids(Birmingham，Ala.)，或可使用易得物简单制备。这种物质包括磷脂酰胆碱，胆固醇，磷脂酰乙醇胺，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，等。这些物质也可以适当比例与DOTMA和DOTAP起始物混合。本领域熟知使用这些物质产生脂质体的方法。
例如，可使用商购的二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的各种组合物，加入或不加入胆固醇产生常规的脂质体。因此，例如DOPG/DOPC小泡可通过在将氮气流入超声瓶，干燥50mg DOPG和50mg DOPC而制备。将此样品置于真空泵中过夜，并在第二天用去离子水水合。然后将此样品在盖上盖的小瓶中超声2小时，使用装备转动杯(沐浴型)探针的Heat Systems350型超声发生器，在最大设定进行超声，沐浴循环在15℃。或者，可不用超声装备阴离子小泡，以产生多薄片小泡，或通过核孔膜排挤产生不连续规格的单薄片小泡。本领域已知其它方法。
脂质体可包含多薄片小泡(MLVs)，小单薄片小泡(SUVs)，或大单薄片小泡(LUVs)，SUVs是优选的。各种脂质体—核酸复合物是通过本领域已知方法制备的。见例如Straubinger等，免疫学方法(1983)，101：512-527，以其全文并入参考。例如，含有核酸的MLVs可通过将磷脂薄膜置于在玻璃管壁上，接着用此物质的溶液水合以胶囊化。SUVs是通过长期超声MLVs制备的，以产生同源单薄片脂质体群。将截留物加入预先制备的MLVs悬浮液中，然后超声。当使用含有阳离子脂质的脂质体时，将干燥的脂质薄膜再悬浮于适当的溶液中，如无菌水或等渗缓冲液如10mM Tris/NaCl中，超声，然后将预先制备的脂质体与DNA直接混合。由于阳离子的脂质体与阳离子的DNA结合，脂质体和DNA形成非常稳定的复合物。SUVs发现与小核酸片段一起使用。LUVs是通过本领域已知的许多方法制备的。通常使用的方法包括Ca2+-EDTA螯合(Papahadjopoulos等，生物化学生物生理学学报(1975)394：483；Wilson等，细胞(1979)17：77)；乙醚注射(Deamer，D.，和Bangham，A.，生物化学生物生理学学报(1976)443-629；Ostro等，生物化学生物生理学研究综述(1977)76：836；Fraley等，美国科学院院报(1979)76：3348)；去污剂透析(Enoch，H.，和Strittmatter，P.，美国科学院院报(1979)76：145)；和反向蒸发(REV)(Fraley等，生物化学杂志(1980)255：1043 1；Szoka，F.，和Papahadiopoulos，D.，美国科学院院报(1978)75：145；Schaefer-Ridder等，科学(1982)215：166)，所述文献以其全文并入参考。
DNA与脂质体的比率通常为大约10∶1-1∶10。优选地，此比率为大约5∶1-1∶5。更优选地，此比率为大约3∶1-1∶3。最优选地，此比率为大约1∶1。
美国专利No.5676954(以其全文并入参考)报道了将遗传物质与阳离子脂质体载体复合，注射至小鼠体内。美国专利No.4897355，4946787，5049386，5459127，5589466，5693622，5580859，5703055，和国际出版物WO 94/9469(以其全文并入参考)，提供了阳离子脂质，用于将DNA转染至细胞和哺乳动物中。美国专利No.5589466，5693622，5580859，5703055和国际出版物WO 94/9469(以其全文并入参考)，提供了将DNA-阳离子脂质复合物输送至哺乳动物的方法。
在一些实施方案中，细胞是用含有RNA的逆转录病毒颗粒在体内基因工程化的，所述RNA包含编码血管生成蛋白的序列。可衍生逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但非限于Moloney鼠白血病病毒，脾坏死病毒，Rous肉瘤病毒，Harvby肉瘤病毒，禽白血病病毒，长臂猿白血病病毒，人免疫缺陷病毒，骨髓增殖性肉瘤病毒，和乳腺肿瘤病毒。
逆转录病毒质粒载体用于转导包装细胞系，以形成生产细胞系。可被转导的包装细胞系例如包括但非限于PE501，PA317，R-2，R-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，RCRE，RCRIP，GP+E-86，GP+envAm12，和DAN细胞系，如Miller，人体基因治疗1∶5-14(1990)所述，以其全文并入参考。载体可通过本领域已知任何方法转导包装细胞。这种方法包括但非限于电穿孔，使用脂质体和CaPO4沉淀。或者，逆转录病毒质粒载体可在脂质体中胶囊化，或与脂质偶联，然后施用于宿主。
生产细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒，其包括编码血管生成蛋白的多核苷酸。然后用这种逆转录病毒载体颗粒在体外或体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达血管生成蛋白。
在一些其它实施方案中，细胞是在体内用包含于腺病毒载体中的血管生成多核苷酸基因工程化的。对腺病毒可进行人为操纵为编码和表达血管生成蛋白，并同时在正常病毒寿命裂解周期中其复制能力是失活的。不用将病毒DNA整合入宿主细胞染色体即可达到腺病毒表达，从而减轻插入诱变。另外，腺病毒作为活肠道疫苗已使用许多年，具有完好的安全性(Schwartz，A.R.等，(1974)Am.Rev.Respir.Dis.109：233-238)。最后，腺病毒介导的基因转移在许多情况中已证实，包括将α-1-抗胰蛋白酶和CFTR移至棉田鼠的肺部(Rosenfeld，M.A.等(1991)科学252：431-434；Rosenfeld等，(1992)细胞68：143-155)。另外，尝试将腺病毒设立为人体癌症的致病剂的敏感性研究，均是阴性的(Green，M.等，(1979)美国科学院院报76：6606)。
用于本发明的适当腺病毒载体例如是由Kozarsky和Wilson，遗传发育通用观点3：499-503(1993)；Rosenfeld等，细胞68：143-155(1992)；Engelhardt等，人体基因治疗4：759-769(1993)；Yang等，自然遗传7：362-369(1994)；Wilson等，自然365：691-692(1993)；和美国专利No.5652224所述，以其全文并入参考。例如，可使用腺病毒载体Ad2，且可在人293细胞中生长。这些细胞含有腺病毒的E1区域，并组成型表达E1a和E1b，E1a和E1b通过提供缺失自载体的基因产物与缺陷性腺病毒互补。除了Ad2之外，本发明也可使用其它腺病毒的变体(如Ad3，Ad5，和Ad7)。
优选地，本发明使用的腺病毒是复制缺陷的。复制缺陷的腺病毒需要借助于帮助病毒和/或包装细胞系以形成感染性颗粒。所得病毒能感染细胞并能表达相应的多核苷酸，该核苷酸可操纵地连于启动子，例如本发明的HARP启动子，但在大多数细胞中不能复制。复制缺陷腺病毒可缺失以下一或多个基因的全部或部分：E1a，E1b，E3，E4，E2a，或L1-L5。
在一些其它实施方案中，细胞是在体内用腺伴随病毒(AAV)基因工程化的。AAVs是天然发生的缺陷病毒，其需要帮助病毒产生感染性颗粒(Muzyczka，N.，分子生物免疫学通用论题158：97(1992))。其也是可将其DNA整合入未分开的细胞中的少数病毒之一。含有少如300个碱基对的AAV的载体可包装并整合，但外源性DNA的空间限为大约4.5kb。本领域已知产生和使用这种AAVs的方法。见例如美国专利No.5139941，5173414，5354678，5436146，5474935，5478745和5589377所述。
例如，用于本发明的适当AAV载体，包括DNA复制，衣壳化，和宿主细胞整合所必需的所有序列。使用标准克隆方法将血管生成多核苷酸构建体插入AAV载体中，如Sambrook等，分子克隆实验手册，冷泉港出版社(1989)所述方法。然后将重组AAV载体转染入用帮助病毒感染的包装细胞中，使用任何帮助方法转染，包括脂染，电穿孔，磷酸钙沉淀等。适当的帮助病毒包括腺病毒，巨细胞病毒，痘苗病毒或疱疹病毒。一旦帮助细胞被转染和感染，它们将产生含有血管生成多核苷酸个体的感染性AAV颗粒。任何将这些病毒颗粒在体内用于转导真核细胞。转导的细胞含有真核入其基因组的血管生成多核苷酸构建体，并表达血管生成蛋白。
基因治疗的另一方法包括通过同源重组可操纵地联合异源对照区与内源性多核苷酸序列(如编码血管生成蛋白的序列)(见例如1997年6月24日公布的美国专利No.5641670；1996年4月26日出版的国际出版物WO 96/29411；1994年8月4日出版的国际出版物WO94/12650；Koller等，美国科学院院报86：8932-8935(1989)；和Zijlstra等，自然342：435-438(1989)所述)。此方法包括活化在靶细胞中呈递的基因，但该基因在此细胞中不正常表达，或低水平表达。
使用本领域已知的标准方法产生多核苷酸构建体，该构建体含有启动子，启动子两侧具有定向序列。适当的启动子如本文所述。定向序列充分互补于内源性序列，以用内源性序列同源重组启动子定向的序列。定向序列十分邻近血管生成蛋白的所需内源性多核苷酸序列的5’末端，因此启动子通过同源重组可操纵地连于内源性序列。
启动子和定向序列可使用PCR扩增。优选地，扩增的启动子在5’和3’末端含有明显的限制酶位点。优选地，第一个定向序列的3’末端含有与扩增的启动子的5’末端相同的限制酶位点，第二个定向序列的5’末端含有与扩增的启动子的3’末端相同的限制酶位点。将扩增的启动子和定向序列消化并连接在一起。
将启动子—定向序列构建体以裸多核苷酸或与转染促进剂一起输送至细胞，转染促进剂如以上详细阐述的脂质体，病毒序列，病毒颗粒，全病毒，脂染剂，沉淀剂等。P启动子—定向序列可通过任何方法输送，包括直接针注，静脉内注射，局部施用，导管灌注，颗粒加速器等。此方法在以下加以详细阐述。
启动子—定向序列构建体由细胞吸收。在构建体和内源性序列之间发生同源重组，这样编码血管生成蛋白的内源性序列在启动子的控制下置放。然后启动子驱动内源性血管生成序列表达。
编码血管生成蛋白的多核苷酸可与编码其它血管生成蛋白的其它多核苷酸一起施用。
优选地，编码血管生成蛋白的多核苷酸含有一分泌信号序列，其促进蛋白质的分泌。典型地，信号序列位于被表达的多核苷酸的编码区周围，或在编码区的5’末端。此信号序列可以同源或异源于相应多核苷酸，并可以同源或异源于转染的细胞。另外，此信号序列可以是用本领域已知方法化学合成的。
可使用施用以上所述的多核苷酸构建体的任何方式，只要此方式导致一或多种分子以足够数量表达，产生治疗效应。这种施用方式包括直接针注，全身注射，导管灌注，biolistic注射器，颗粒加速器(即基因枪)，明胶海绵纱布补给，其它商购补给物，渗透泵(如Alza微泵)，口服或栓剂固体(片剂或药丸)药物配方，和在手术期间轻轻倒入或局部应用。例如，将裸磷酸钙沉淀的质粒直接注射入大鼠肝和脾中，或将蛋白质包被的质粒直接注射入门静脉中，已经在大鼠肝脏中产生外源基因表达(Kaneda等，科学243：375(1989))。
优选的局部施用方法是直接注射。优选地，与输送载体复合的本发明的重组分子，是通过直接注射入动脉内或在动脉局部施用的。在动脉局部施用组合物是指将组合物注射入厘米优选毫米范围内的动脉。
局部施用的另一方法是将本发明的多核苷酸构建体施用于外科手术伤口处或其周围。例如，病人经历手术，将此多核苷酸构建体包被于伤口内侧组织表面，或将构建体注射入伤口内侧组织中。
用于全身施用的治疗组合物包括与本发明定向的输送载体复合的本发明的重组分子。全身施用的适当输送载体包括将载体定向于特定部位的配体。
优选的全身施用方法包括静脉内注射，气雾剂，口服和经皮(局部)输送。可使用本领域已知的标准方法进行静脉内注射。气雾剂输送也可使用本领域已知的标准方法进行(见例如Stribling等，美国科学院院报189：11277-11281，1992，以其全文病人参考)。口腔服用可通过将本发明的多核苷酸构建体与载体复合进行，所述载体在动物消化道中能抵挡消化酶降解。这种载体例如包括本领域已知的塑胶囊或片剂。局部输送可通过将本发明的多核苷酸构建体与亲脂剂(如DMSO)混合而进行，所述亲脂剂能穿过皮肤。
确定所施用物质的有效量可依赖于许多因素，例如包括施用物质的化学结构和生物活性，动物年龄和体重，需要治疗的准确病情及其严重度，及施用途径。治疗频率依赖于许多因素，如每剂施用的多核苷酸构建体的数量，以及对象的健康状态和病史。准确数量，剂量数，和时间由主治医生确定。
本发明的治疗组合物可施用于任何动物，优选哺乳动物和鸟类。优选的哺乳动物包括人，狗，猫，小鼠，大鼠，兔，绵羊，牛，马和猪，优选人。药物组合物
血管生成多肽，多核苷酸及激动剂和拮抗剂可与适当的药物载体组合应用。这种组合物包括治疗有效量的多肽或激动剂或拮抗剂，和药物适当的载体或赋形剂。这种载体包括但非限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，及其组合物。配方应适于施用模式。
本发明还提供了药物包装或试剂盒，其包含一或多个充填本发明药物组合物的一或多种配料的容器。这种容器内有政府管理生产，使用或销售药物或生物制品的机构的告示，该告示反映了生产，使用或销售药物或生物制品管理机构准许施用于人。另外，药物组合物可与其它治疗化合物联合应用。
药物组合物可以常规方式施用，如通过局部施用，静脉内，腹膜内，肌内，肿瘤内，皮下，鼻内，或皮内施用。药物组合物以有效治疗和/或预防特定疾病的数量施用。通常地，药物组合物的施用剂量为至少大约10mg/kg体重，在大多数情况下施用数量每天不超过大约8mg/kg体重。考虑施用途径，症状等，在大多数情况下施用剂量为大约每天10mg/kg体重-1mg/kg体重。
血管生成多肽，及是多肽的激动剂或拮抗剂，根据本发明也可通过在体内表达这种多肽而应用，通常称之为“基因治疗”，如上所述。
因此，例如细胞如骨髓细胞可在体内用编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)基因工程化，然后将基因工程化的细胞施用于患者，用此多肽进行治疗。本领域熟知这种方法。例如，细胞可通过本领域已知方法，使用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒基因工程化。
相似地，细胞可在体内基因工程化，以在体内表达多肽，例如通过本领域已知方法。如本领域所知，可将生产细胞施用于患者以在体内基因工程化细胞，并在体内表达多肽，所述生产细胞产生含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒。本领域技术人员通过本发明的教导，可理解施用本发明多肽的这些及其它方法。例如，基因工程细胞的表达载体除了逆转录病毒颗粒之外，可以是腺病毒，其与适当输送载体组合后可用于在体内基因工程化细胞。
从中可产生手术逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒，包括但非限于Moloney鼠白血病病毒，脾坏死病毒，逆转录病毒如Rous肉瘤病毒，Harvey肉瘤病毒，禽白血病病毒，类人猿白血病病毒，人免疫缺陷病毒，腺病毒，骨髓增殖性肉瘤病毒，和乳腺肿瘤病毒。
载体包括一或多个启动子。可应用的适当启动子包括但非限于逆转录病毒LTR；SV40启动子；和人巨细胞病毒(CMV)启动子，如Miller等，生物技术7；980-990(1989)；或任何其它启动子(例如细胞启动子如真核细胞启动子包括但非限于组蛋白，pol III和β-肌动蛋白启动子)。可应用的其它病毒启动子包括但非限于腺病毒启动子，胸苷激酶(TK)启动子，和B19细小病毒启动子。根据本发明教导，本领域技术人员可选择适当的启动子。
编码本发明多肽的核酸序列在适当启动子的控制下。可应用的适当启动子包括但非限于腺病毒启动子如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；可诱导启动子如MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热激启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人球蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子如单纯疱疹胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTRs(包括上述修改的逆转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。启动子还可以是控制编码多肽的基因的天然启动子。
使用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系，以形成生产细胞系。可被转染的包装细胞系例如包括但非限于PE501，PA317，y-2，y-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，yCRE，yCRIP，GP+E-86，GP+envAm12，和DAN细胞系，如Miller，人体基因治疗1∶5-14(1990)所述，以其全文并入参考。载体可通过本领域任何已知方法转导包装细胞系。这种方法包括但非限于电穿孔，使用脂质体，和磷酸钙沉淀。在一实施方案中，可将逆转录病毒质粒载体在脂质体中胶囊化，或偶联于主治，然后施用于宿主。
生产细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒，其包括编码多肽的核酸序列。然后用这种逆转录病毒载体颗粒在体外或体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码多肽的核酸序列。可转导的真核细胞包括但非限于胚胎干细胞，胚胎癌细胞，以及造血干细胞，血细胞，成纤维细胞，成肌细胞，角质细胞，内皮细胞和支气管上皮细胞。诊断分析
本发明还涉及使用编码血管生成蛋白的基因作为诊断分析的一部分，以检测与编码血管生成蛋白的核酸序列中突变相关的疾病或对这种疾病的易感性。
携带编码血管生成蛋白的基因中突变体的个体，可通过各种方法在DNA水平检测。用于诊断的核酸可得自患者细胞如来自血液，尿液，唾液，组织活检和尸检物质。可直接使用基因组DNA进行检测，或经PCR酶促扩增(Saiki等，自然324：163-166(1986))，之后进行分析。也可使用RNA或cDNA。例如，互补于编码血管生成蛋白的核酸的PCR引物，可用于鉴别和分析其突变体。例如，可通过扩增产物与正常基因型相比大小发生变化而检测缺失或插入。鉴别点突变可通过将扩增的DNA与放射标记的编码血管生成蛋白的RNA杂交，或者，与特异于编码血管生成蛋白的RNA的放射标记的反义DNA序列杂交而进行。完全匹配的序列可通过RNase A消化或通过熔点不同，从错配的双链体中区分。
基于DNA序列不同的遗传测试，可通过检测有或无变性剂的凝胶中DNA片段的电泳迁移率的变化而进行。少量序列缺失和插入可通过高分辨凝胶电泳观测。不同序列的DNA片段可在变性甲酰胺梯度凝胶上区分，其中不同DNA片段的迁移率根据其特异熔解或部分熔解温度阻滞在凝胶的不同位置(见例如Myers等，科学230：1242(1985))。
在特异位置的序列变化也可通过核酸酶保护分析显示，如RNase和S1保护或化学裂解方法(例如Cotton等，PNAS，美国85：4397-4401(1985))。
因此，可通过如以下方法检测特异的DNA序列，如杂交，RNase保护，化学裂解，直接DNA测序或使用限制酶(例如限制性片段长度多态性(RFLP))及Southern印迹基因组DNA。
除了更常规的凝胶电泳和DNA测序，突变也可通过原位分析检测。
本发明还涉及检测各种阻滞中血管生成蛋白水平的变化的诊断分析，因为与正常对照组织样品相比蛋白质的过表达，可检测疾病或对疾病的易感性，例如异常细胞分化。本领域技术人员熟知检测得自宿主的样品中血管生成蛋白水平的分析方法，包括放射免疫分析，竞争结合分析，Western印迹分析，ELISA分析和“夹心”分析。ELISA分析(Coligan等，免疫学通用方法1(2)，第6章，(1991))包括制备通特异于血管生成蛋白抗原的抗体，优选单克隆抗体。另外制备抗此单克隆抗体的报道分子抗体。与此报道分子抗体吸附的是可检测试剂如放射性，荧光试剂，在此实施例中是辣根过氧化物酶。自宿主取样品，并在结合样品中蛋白质的固体支持物上温育，如聚苯乙烯平皿。然后用非特异性蛋白质如牛血清白蛋白温育覆盖平皿上任何游离蛋白结合位点。接着，将单克隆抗体在此平皿中温育，在此期间单克隆抗体附着于吸附于聚苯乙烯平皿上的任何血管生成蛋白。用缓冲液冲洗掉所有未结合的单克隆抗体。将与辣根过氧化物酶连接的报道分子抗体置于平皿中，使报道分子抗体与结合血管生成蛋白的任何单克隆抗体结合。冲洗掉未吸附的报道分子抗体。然后将过氧化物酶底物加入平皿，在给定时间内发生的颜色量，与标准曲线相比，测定给定体积的患者样品中血管生成蛋白数量。
可使用竞争分析，其中特异于血管生成蛋白的抗体附着于固体支持物。然后标记本发明的多肽，例如放射性标记，将得自宿主的样品经过固体支持物，例如通过液体闪烁层析检测的标记数量，与样品中血管生成蛋白的数量相关。
“夹心”分析类似于ELISA分析。在“夹心”分析中，将血管生成蛋白数量的经过固体支持物并与附着于固体支持物的抗体结合。然后将第二种抗体与血管生成蛋白结合。然后将标记的并特异于第二种抗体的第三种抗体经过固体支持物，并与第二种抗体结合，然后定量。多核苷酸鉴别
本发明的序列对染色体鉴别也有价值。此序列是靶特异性的，能与人的某一染色体上特异位点杂交。另外，当前还用于鉴别染色体上的特异位点。目前根据实际的序列数据(重复序列的多态性)，还几乎不能对染色体进行定位。根据本发明对染色体进行DNA作图，对那些与疾病有关的基因序列而言，是至关重要的第一步。
简而言之，作图通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)，可以对染色体的序列进行作图。用计算机cDNA进行分析，可以迅速选择在基因组DNA中不跨越一个以上外显子的引物，否则使扩增过程变得复杂。然后将这些引物用于PCR筛选含有人染色体的体细胞杂合体。只有那些含有相当于引物的人类基因的杂合体才能产生扩增的片段。
体细胞杂交体的PCR作图，在确定某个特异的染色体上的一个特异的DNA时，是非常快速的。按相同方式，借助于来自特异染色体的一组片段或许多大的基因组克隆，可以获得进一步定位。其它的类似染色体作图策略包括原位杂交，用标记的流式染色体预筛选，并通过杂交预选，来构建体染色体的cDNA特异性文库。
cDNA克隆与展开的有丝分裂中期的染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以只用一个步骤就可对染色体进行精确定位。此方法可与来自长度仅50或60bp的cDNA探针一起使用。此方法的综述参见Verma等，人类染色体基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。
某一序列一旦在染色体上精确作图定位，该序列在染色体上的物理位置应符合遗传作图数据。这种数据见例如V.McKusick，人类的孟德尔遗传(可以在网上从约翰霍普金斯大学的Welch医学图书馆获得)。在基因和已经在同一染色体的部位作图定位的疾病之间的关系可以通过连锁分析进行鉴定(物理位置相近的共遗传)。
再者，有必要确定在发生异常和未发生异常的个体之间cDNA或基因组序列的差异。如果在一些或全部发生异常的个体(而不是所有正常个体)中均发现存在突变，则此突变可能是导致疾病的因素。根据现有的物理作图和异常作图技术的分辨率，将与某种疾病有关的，精确定位在染色体上的某个cDNA可能只是50-500种可能病因之一(假定100万个碱基对的作图分辨率和每20kb一个基因)。
对比正常和异常的个体通常包括首先寻找染色体中的结构变化，如缺失或移位，可以从展开的染色体上观测或用基于此cDNA序列的PCR技术检测。最后，证实在多个个体的基因的完整序列哪个存在突变，并把突变与多态性区别开。
通过以下实施例，将更易于理解本发明，以下实施例只是举例说明而无限制之意。血管生成蛋白实施例实施例1：血管生成蛋白的体外表达实施例1A：血管生成蛋白的细菌表达和纯化
编码血管生成蛋白的DNA序列可用相当于加工的蛋白(减去信号肽序列)的5’序列的PCR寡核苷酸引物，和相当于基因3’序列的载体扩增。将相当于基因的另外的核苷酸加入5’和3’序列中。可将此PCR产物克隆入pQE60(Qiagen，Inc.Chatsworth，CA91311)。
限制酶位点相当于细菌表达载体pQE60上的限制酶位点。PQE60编码抗生素抗性(Ampr)，细菌复制起点(ori)，IPTG-可调节启动子操纵子(P/O)，核糖体结合位点(RBS)，6-组氨酸标记和限制酶位点。然后将pQE60用NcoI和BglII消化。将扩增的序列连接于pQE-60，并插入具有编码组氨酸标记和核糖体结合位点(RBS)的序列的框架中。将连接混合物用于转化大肠杆菌菌株M15/rep4(Qiagen，Inc.)中通过Sambrook，J.等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，(1989)所述方法进行。M15/rep4含有质粒pREP4的多个拷贝，其表达1acI阻抑物并还授予卡那霉素抗性(Kanr)。通过在LB平板上的生长能力鉴别转化体，并选择氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA，并通过限制分析证实。将含有所需构建体的克隆在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的液体LB培养基中生长过夜(O/N)。将O/N培养物以1∶100-1∶250比率接种大培养基。细胞生长至光密度600(O.D.600)为0.4-0.6。然后加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终体积为1mM。IPTG通过灭活1acI阻抑物，清除P/O而提高基因表达。将细胞另外生长3-4修饰。然后通过离心收集细胞。将细胞粒状沉淀溶解于离液剂6M盐酸胍中。在澄清后，从此溶液中纯化溶解的血管生成肽，在使含有6-组氨酸标记的蛋白质紧密结合的条件下，通过Nickel-螯合层析柱层析进行(Hochμli，E.等，层析杂志411：177-184(1984))。将蛋白质在6M盐酸胍pH5.0中从层析柱洗脱，并为复性而调节为3M盐酸胍，100mM磷酸钠，10mM谷胱甘肽(还原的)和2mM谷胱甘肽(氧化的)。在此溶液中温育12修饰后，将蛋白质用10mM磷酸钠透析。
除了上述表达载体之外，本发明还包括一种称为pHE4a的表达载体，其包含操纵性地连于编码血管生成多肽的多核苷酸的噬菌体操纵基因和和启动子因子(于1998年2月25日保藏于ATCC，登记号No：209645)，此载体包含：1)作为选择标记的新霉素磷酸转移酶基因，2)大肠杆菌复制起点，3)T5噬菌体启动子序列，4)两个1ac操纵基因序列，5)Shine-Delgamo序列，和6)乳糖操纵子阻抑物基因(1acIq)。复制起点(oriC)衍生自pUC19(LTI，Gaithersburg，MD)。此启动子序列和操纵基因序列是合成的。
DNA可插入pHEa中，通过用XbaI，BamHI，XhoI或Asp718限制载体，将限制产物置于凝胶上，并分离较大的片段(填充片段应大约310bp)。DNA插入体是根据上述PCR方法，用具有NodI(5’引物)和XbaI，BamHI，XhoI或Asp718(3’引物)的限制位点的PCR引物产生。PCR引物是凝胶纯化的并用相容酶限制的。将此插入体和载体根据标准方法连接。
在上述方法中可用基因工程化的载体代替以在细菌系统中表达蛋白质。实施例1B：在杆状病毒病毒系统中克隆和病毒血管生成蛋白
将编码全长血管生成蛋白的DNA序列用相当于基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增。
将扩增的序列用商购的试剂盒(Geneclean，BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca)从1％琼脂糖凝胶中分离。然后将此片段用代表性的内切酶消化，并再在1％琼脂糖凝胶上纯化。此片段称为F2。
将载体pA2(pVL941载体的修饰体，见下述)用于通过杆状病毒病毒系统表达蛋白质(参见：Summers，M.D.和Smith，G.E.1987，杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法手册，德克萨斯州农业试验基地报告No：1555)。此表达载体含有苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体启动子，后接限制性内切酶BamHI和XbaI的识别位点。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效聚腺苷酸化。为易于选择重组病毒，将大肠杆菌的β-半乳糖苷酶以与多角体蛋白相同方向插入，后接多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。多角体蛋白序列位于病毒序列的两侧，以经细胞介导同源重组共转染的野生型病毒DNA。可用一些其它的杆状病毒代替pA2，如pRG1，pAc373，pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summers，M.D.，病毒学，170：31-39)。
将质粒通过本领域已知方法用限制酶消化，并用小牛小肠磷酸酶去磷酸化。然后将DNA用商购的试剂盒(Geneclean，BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca)从1％琼脂糖凝胶中分离。此载体DNA称为V2。
将片段F2和去磷酸化的质粒V2用T4 DNA连接酶连接。然后转化大肠杆菌DH5α细胞，并用代表性的限制酶鉴别含有质粒的细菌。克隆的片段的序列通过DNA测序取确定。
将5μg的质粒用1.0μg的商购线性化的杆状病毒(BacμloGold杆状病毒DNA，Pharmingen，San Diego，CA)共转染(Felgner等，美国科学院院报84：7413-7417(1987))。
将1μg BacμloGold病毒DNA和5μg质粒，在含有50μl无血清Grace’s培养基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的微滴定平板的无菌孔中混合。然后加入10μl Lipofectin和90μ1 Grace’s培养基，混合，并在室温温育15分钟。将转染混合物滴加入Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)中，Sf9细胞种植于具有1ml无血清Grace’s培养基的35mm组织培养皿中。将此平皿前后摇动以混合新加入的溶液。然后将此平皿在27℃温育5修饰。在转染5修饰后，将溶液从平皿中除去，并加入补加10％胎牛血清的1ml的Grace’s昆虫培养基。将平皿再放入温育器中，并在27℃持续培养4天。
在4天后，收集上清并通过类似于Summers和Smith(如前)所述进行噬斑分析。使用经“Blue Gal”(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)修饰的琼脂糖凝胶，其易于分离蓝染的噬斑。(关于“噬斑分析”的详细论述也可见于由Life Technologies Inc.，Gaithersburg所提供的昆虫细胞培养和杆状病毒学的使用指导，p9-10)。
在系列稀释4天后，将病毒加入细胞中，并用Eppendorf移液管尖挑取蓝染的噬斑。然后将含有重组病毒的琼脂再悬浮于含有200μl Grace’s培养基的Eppendorf试管中。通过简单离心除去琼脂，并将含有重组杆状病毒的上清用于种植于35mm平皿当中昆虫细胞中。4天后，收集之下培养平皿的上清然后在4℃贮存。
将Sf9细胞在补加10％热灭活的FBS的Grace’s培养基中。将细胞用重组杆状病毒以感染复数(MOI)为2进行感染。6小时后，除去培养基并更换为减去甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900 II培养基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)。42小时后，加入5μCi的35S-甲硫氨酸和5μCi35S-半胱氨酸(Amersham)。将细胞进一步温育16小时，之后通过离心收集并通过SDS-PAGE和放射自显影分析标记的蛋白质。
对纯化的蛋白质的氨基末端的氨基酸序列进行微测序，可用于确定产生的血管生成蛋白的氨基末端序列。实施例1C：在哺乳动物细胞中表达重组血管生成蛋白在COS细胞中克隆和表达
质粒X-HA(X代表相应的血管生成蛋白)的表达，衍生自含有以下结构的载体pcDNA3/Amp(Invitrogen)：1)SV40的复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起点，4)CMV启动子后接多接头区，SV40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码血管生成蛋白全部前体的DNA片段和在框架中融合于3’末端的HA标记，克隆入载体的多接头区域，由此重组蛋白表达在CMV启动子的指导下。HA标记相当于衍生自流感血凝素蛋白的表位，如前所述(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，和R.Lerner，1984，细胞37：767(1984))。HA标记与靶蛋白的融合可易于检测具有识别HA表位的抗体的重组蛋白。
质粒构建策略如下所述：
编码血管生成多肽的DNA序列是用两种引物通过PCR构建的：5’引物含有BamHI位点后接起自起始密码子的18个核苷酸的编码序列；3’引物含有互补于XhoI位点的序列，翻译终止密码子，HA标记和血管生成蛋白编码序列的后18个核苷酸(不包括起始密码子)。因此，PCR产物含有一个BamHI位点，编码序列，后接融合于框架中的HA标记，翻译终止密码子后接HA标记和一个XhoI位点。
将经PCR扩增的DNA片段和载体pcDNA3/Amp用限制性内切酶消化并连接。将此连接混合物转化入大肠杆菌SURE(得自Stratagene克隆系统，La Jolla，CA 92037)，将转化培养物铺板于氨苄青霉素培养平板上并选择抗性集落。从转化体中分离质粒DNA并通过限制分析检测适当片段的存在与否。为表达重组血管生成多肽，将COS细胞用表达载体通过DEAE-DEXTRAN方法转染(J.Ssmbrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，(1989))。X-HA蛋白的表达通过放射标记和免疫沉淀方法检测(E.Harlow，D.Lane，抗体实验手册，冷泉港实验室出版社(1988))。将细胞在转染2天后，用35S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养基并将细胞用去污剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)裂解(Wilson，I.等，Id.37：767(1984))。将细胞裂解物和培养基均用HA特异性单克隆抗体沉淀。沉淀的蛋白质在15％SDS-PAGE凝胶上分析。在其它哺乳动物细胞中克隆和表达
血管生成多肽可在哺乳动物细胞中表达。一典型的哺乳动物表达载体含有介导mRNA转录的开始的启动子因子，蛋白质编码序列，和终止转录及转录物聚腺苷酸化所需的信号。其它因子包括增强子，Kozak序列和RNA剪接供体和受体两侧的间插序列。使用SV40的早期和晚期启动子，逆转录病毒的长末端重复(LTRs)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子可达到高效转录，逆转录病毒如是RSV，HTLVI，HIVI。然而也可使用细胞因子(如人肌动蛋白启动子)。
本发明实际应用的适当表达载体例如包括pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，pRSVcat(37152ATCC)，pSV2DHFR(ATCC37146)，pBC12MI(ATCC67109)，pCMVSport2.0，和pCMVSport3.0。可使用的哺乳动物宿主包括人Hela，293，H9和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos 1，Cos 7和CV1，quail QC1-3细胞，小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
或者，血管生成多肽可在稳定细胞系中表达，稳定细胞系含有编码整合入染色体中的血管生成多肽的多核苷酸。用可选择的标记如DHFR，gpt，新霉素，潮霉素共转染可鉴别和分离转染的细胞。
编码血管生成多肽的转染的基因也可扩增以表达大量的编码蛋白。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记用于开发携带几百个或几千个相应基因拷贝的细胞系(见例如Alt，F.W.，等，生物化学杂志253：1357-1370(1978)；Hamlin，J.L和Ma，C.，生物化学及生物物理学学报，1097：107-143(1990)；Page，M.J.和Sydenham，M.A.，生物技术9：64-68(1991))。其它有效的选择标记是谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等，生物化学杂志227：277-279(1991)；Bebbington等，生物/技术10：169-175(1992))。使用这些标记，将哺乳动物细胞生长于选择性培养基中，并选择最高抗性的细胞。这些细胞系含有整合入染色体的扩增的基因。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和NSO细胞通常用于生产蛋白质。
质粒pSV2-DHFR(ATCC登记号No：37146)的衍生物，表达载体pC4(ATCC登记号No：209646)和pC6(ATCC登记号No：209647)含有Rous肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cμllen等，分子和细胞生物学，438-447(1985年3月))，加上CMV-增强子的片段(Boshart等，细胞41：521-530(1985))。如具有限制酶切割位点BamHI，XbaI和Asp718的多克隆位点，促进编码血管生成多肽的基因的克隆。载体还含有3’内含子，鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化和终止信号，和在SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。
特别地，通过本领域已知方法，将质粒pC6或pC4用适当的限制酶消化，然后用牛小肠磷酸酶去磷酸化。然后从1％琼脂糖凝胶中分离载体。
将编码全长血管生成蛋白的cDNA序列，用相当于基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增。如果使用天然发生的信号序列产生分泌的蛋白质，，载体不需要第二种信号肽。或者，如果不使用天然发生的信号序列，载体可修饰为包括异源信号序列，以努力从细胞中分泌蛋白质(见例如WO 96/34891)。
将扩增的片段用适当的限制酶消化，并用商购的试剂盒在1％琼脂糖凝胶上纯化(Geneclean，BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca)。然后将分离的片段和去磷酸化的载体用T4 DNA连接酶连接。将大肠杆菌HB 101或XL-1Blue细胞转化，并例如用限制酶分析鉴别含有插入质粒pC6或pC4的片段的细菌。
将缺失活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞用于转染。将5μg的表达质粒pC6或pC4用0.5μg的质粒pSVneo通过脂染法共转染(Felgner等，如前)。质粒pSV-2-neo含有显性可选择标记，来自Tn5的neo基因，Tn5编码授予一组抗生素抗性的酶，包括G418。将细胞种植于补加1mg/ml G418的α负MEM中。2天后，将细胞用胰蛋白酶消化，并种植于补加10，25或50ng/ml氨甲喋呤+1mg/mlG418的α负MEM中的杂交瘤克隆平板中(Greiner，德国)。在大约10-14天后，将单个克隆用胰蛋白酶消化，然后种植于具有不同浓度氨甲喋呤(50，100，200，400，800nM)的6孔培养皿或10ml烧瓶中。然后将在最高浓度氨甲喋呤生长的克隆移至新的含有更高浓度氨甲喋呤(1uM，2uM，5uM，10mM，20mM)的6孔平板中。重复相同步骤直至获得在100-200uM浓度氨甲喋呤中生长的克隆。例如通过SDS-PAGE和Western印迹或通过反向HPLC分析方法分析血管生成多肽的表达。实施例2：分离编码血管生成多肽的基因组克隆
将人基因组P1文库(基因组系统公司)根据Sambrook所述方法通过PCR筛选，选择使用cDNA序列分别相当于SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23的引物。实施例3：血管生成多肽的组织分布
血管生成蛋白的mRNA表达的组织分布，通过Sambrook所述Northern印迹分析起点。例如，将特异于编码相应血管生成蛋白的基因的探针，用P32通过rediprimeTM DNA标记系统(Amersham LifeScience)标记，根据说明书使用。在标记后，根据说明书PT1200-1，将探针用CHROMA SPIN-100TM层析柱(ClontechLaboratories，Inc.)纯化。然后将纯化的探针用于检测各种人体组织的mRNA表达情况。
将含有各种人体组织(H)或人免疫系统组织(IM)的多组织Northern(MTN)(Clontech)印迹，根据说明书PT1190-1，用标记的探针通过ExpressHybTM杂交液(Clontech)进行检测。在杂交及冲洗后，计数印迹并在-70℃暴露于胶片过夜，根据标准方法研究此胶片。实施例4：血管生成蛋白的染色体图
根据SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23的5’末端序列，分别设计寡核苷酸引物系列。这种引物优选跨越大约100个核苷酸。然后将这种引物系列在以下条件下用于聚合酶链反应：30秒95℃；1分钟56℃；1分钟70℃。将此循环重复32次，然后进行一次5分钟70℃循环。除了含有个体染色体或染色体片段的体细胞杂交体组之外，将人，小鼠和仓鼠DNA用作模板。在8％聚丙烯酰胺凝胶或3.5％琼脂糖凝胶上分析此反应。染色体图通过在特殊体细胞杂交体中存在一大约100 bp的PCR片段而确定。实施例5：从包含体中纯化血管生成多肽
当血管生成多肽以包含体形式存在时，以下方法可用于纯化在大肠杆菌中表达的血管生成多肽。除非特别说明，以下所有步骤均在4-10℃进行。
在大肠杆菌发酵生产阶段完成基础上，将细胞培养物冷却至4-10℃，并通过在15000rpm连续离心收集细胞(Heraeus Sepatech)。在每单位重量细胞糊产生期望量的蛋白质，和所需纯化的蛋白质的数量的基础上，将适量(重量)的细胞糊悬浮于含有100Mm Tris，50mM EDTA的缓冲液pH7.4中。用高剪切混合器将细胞分散为均匀的悬浮液。
将细胞在4000-6000psi通过微液化仪(Microfuidics，Corp.或APV Gaμlin，Inc.)溶液两次而裂解。然后将此均匀混合物与NaCl溶液混合至终浓度为0.5M NaCl，随后在7000×g离心15分钟。所得沉淀再用0.5M NaCl，100mM Tris，50mM EDTA，pH7.4冲洗。
将所得经冲洗的包含体在1.5M盐酸胍(GuHCl)中溶解2-4小时。在7000×g离心15分钟后，将沉淀弃去并将含有多肽的上清在4℃温育过夜，以进行进一步GuHCl提取。
在高速离心(30000×g)除去可溶颗粒后，通过将GuHCl提取物与20体积含有50mM钠，pH4.5，150mM NaCl，2mM EDTA的缓冲液经用力搅拌快速混合，将GuHCl溶解的蛋白质再折叠。将再折叠的稀释的蛋白质溶液不混合在4℃保持12小时，之后进行进一步纯化步骤。
为澄清再折叠的多肽溶液，使用预先制备的装备具有适当表面积的0.16um滤膜的切向过滤单位(如Filtron)，该单位用40mM乙酸钠pH6.0平衡。将过滤的样品加样于阳离子交换树脂上(如PorosHS-50，Perseptive Biosystems)。将次层析柱用40mM乙酸钠，pH6.0冲洗，并用在相同缓冲液中250mM，500mM，1000mM，和1500mMNaCl梯度洗脱。连续监测流出物在280nm的吸光度。收集级分并通过SDS-PAGE进一步分析。
然后集合含有血管生成多肽的级分，并与4体积水混合。将稀释的样品加样于预先制备的强阴离子(Poros HQ-50，PerseptiveBiosystems)和弱阴离子(Poros CM-20，Perseptive Biosystems)交换树脂的一前一后层析柱中。将层析柱用40mM乙酸钠，pH6.0平衡。将这两个层析柱均用40mM乙酸钠，pH6.0，200mM NaCl冲洗。然后将CM-20层析柱用10层析柱体积的以从0.2M NaCl，50mM乙酸钠，pH6.0至1.0M NaCl，50mM乙酸钠，pH6.5的线性梯度洗脱。在恒定A280监测流出物下收集级分。然后集合含有多肽的级分(例如通过16％SDS-PAGE确定的)。
在上述再折叠和纯化步骤之后，所得血管生成多肽应呈现高于95％纯度。当加样5μg纯化的蛋白质时，从Commassie蓝染的16％SDS-PAGE凝胶中应观测到无主要污染物的条带。也可对纯化的血管生成蛋白进行内毒素/LPS污染测试，典型地，根据LAL分析LPS含量少于0.1ng/ml。实施例6：构建N-末端和/或C-末端缺失突变体
以下一般方法可用于克隆血管生成蛋白的N-末端或C-末端缺失突变体。一般地，分别从SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23的多核苷酸的所需5’和3’位衍生两种大约15-25个核苷酸的寡核苷酸引物。引物的5’和3’位是基于编码血管生成多肽的所需多核苷酸片段确定的。如果需要，将一起始和终止密码子分别加入5’和3’引物中，以表达由此多核苷酸片段编码的血管生成多肽片段。
也可将含有限制位点，以促进编码血管生成多肽的多核苷酸片段在所需载体中克隆的其它核苷酸，加入5’和3’引物序列中。编码血管生成多肽的多核苷酸片段扩增自基因组DNA或cDNA克隆，使用适当的PCR寡核苷酸引物及本文所述或本领域已知的条件。由本发明适当多核苷酸片段编码的血管生成多肽片段可以与全长多肽相同方式表达和纯化，尽管由于特别片段和全长多肽之间化学和物理性质的不同而必需进行常规修饰。
将扩增的多核苷酸片段和表达载体用识别引物中位点的限制酶消化。然后将消化的多核苷酸连接在一起。将编码血管生成多肽的多核苷酸片段插入限制表达载体中，优选以将血管生成多肽片段编码区置于启动子的下游。将此连接混合物转化入感受态大肠杆菌细胞中，使用标准方法及本文实施例所述方法转化。从抗性集落中分离质粒DNA，并通过限制性分析，PCR和DNA测序确定克隆的DNA的相同性。实施例7：血管生成多肽的蛋白质融合
血管生成多肽优选融合于其它蛋白质。这些融合蛋白质可用于各种应用中。例如，血管生成多肽与His标记，HA标记，蛋白质A，IgG结构域，和麦芽糖集合蛋白的融合促进纯化。(见实施例5；也见于EP A 394827；Traunecker等，自然331：84-86(1988))。相似地，与IgG-1，IgG-3，和白蛋白的融合提高在体内的半衰期。融合于血管生成多肽的核定位信号可将蛋白质定向于特异的亚细胞定位，而共价异源二聚体或同源二聚体可提高或降低融合蛋白的活性。融合蛋白还可产生具有一种以上功能的嵌合分子。最后，融合蛋白与非融合蛋白相比，可提高融合蛋白的溶解性和/或稳定性。上述所有类型的融合蛋白可通过以下修改方法或实施例中所述的方法产生，修改方法概述了多肽与IgG分子的融合。
简而言之，人IgG分子的Fc部分可通过PCR扩增，使用跨越下述序列5’和3’末端的引物进行。这些引物还应具有常规限制酶位点，以易于克隆入表达载体，优选哺乳动物表达载体中。
例如，如果使用pC4(登记号No：209646)，人Fc部分可连接于BamHI克隆位点中。注意3’BamHI位点应破坏。接着，含有人Fc部分的载体再用BamHI限制，线性化载体，并将通过PCR分离的编码血管生成多肽的多核苷酸连接于此BamHI位点中。注意多核苷酸不用终止密码子克隆，否则不产生融合蛋白。
如果天然发生的信号序列用于产生分泌的蛋白质，pC4不需要第二种信号肽。或者，如果不使用天然发生的信号序列可将载体修饰为包括异源信号序列(见例如WO96/34891)。人IgG Fc区域：GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT(SEQ ID NO 30)。实施例8：抗体的产生实施例8A：杂交瘤方法
本发明的抗体可通过各种方法制备。(见通用方法，第二章)。这些方法之一例如是将表达血管生成多肽的细胞施用于底物，以诱导含有多克隆抗体的血清产生。在一优选的实施方案中，制备血管生成蛋白制品并纯化以使其基本没有天然的污染物。然后将这种制品导入动物体以产生较高特异活性的多克隆抗血清。
在最优选的方法中，本发明的抗体是单克隆抗体(或其蛋白质结合片段)。这种单克隆抗体可以用杂交瘤方法制备(Kohler等，自然256：495(1975)；Kohler等，欧洲免疫学杂志6：511(1976)；Kohler等，欧洲免疫学杂志6：292(1976)；Hammerling等，单克隆抗体和T细胞杂交瘤，Elsevier，N.Y.，pp563-681(1981))。通常地，这种方法包括用血管生成多肽或更优选用表达分泌的血管生成多肽的细胞，免疫接种动物(优选小鼠)。这种细胞可在任何适当组织培养基中培养；然而，优选将细胞在Earle’s修改的Eagle’s培养基中培养，该培养基补加了10％小牛血清(在大约56℃灭活)，10g/l非必需氨基酸，大约1000U/ml青霉素，和大约100μg/ml链霉素。
提取这种小鼠的脾细胞并用适当骨髓瘤细胞系融合。根据本发明可使用任何适当的骨髓瘤细胞系；然而优选使用得自ATCC的亲代骨髓瘤细胞系(SP2O)。在融合后，将所得杂交瘤细胞选择性保持在HAT培养基中，然后通过如Wands等所述限制性稀释克隆(Gastroenterology80：225-232(1981))。然后分析通过这种选择获得的杂交瘤细胞，以鉴别分泌能结合血管生成多肽的抗体的克隆。或者，能结合血管生成多肽的其它抗体可用抗独特型抗体以两步方法产生。这种方法中，抗体是其自身抗原，因此可能获得结合另一种抗体的抗体。根据这种方法，将蛋白质特异性抗体用于免疫接种动物，优选小鼠。然后将这种动物的脾细胞用于产生杂交瘤细胞，并筛选杂交瘤细胞以鉴别产生抗体的克隆，其结合血管生成蛋白特异性抗体的努力可由血管生成蛋白阻断。这种抗体包括血管生成蛋白特异性抗体的抗独特型抗体，并可用于免疫接种动物以诱导进一步的血管生成蛋白特异性抗体的形成。
应意识到，根据本文所述方法，可使用本发明抗体的Fab和F(ab’)2和其它片段。这种片段典型是通过蛋白酶切产生的，使用如木瓜酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)片段)。或者，结合分泌的血管生成蛋白的片段可通过重组DNA方法或合成化学产生。
为在人体内使用抗体，优选使用“人化的”嵌合单克隆抗体。这种抗体可用衍生自产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞的遗传构建体产生。本领域已知产生嵌合抗体的方法。(参见Morrison，科学229：1202(1985)；Oi等，生物技术4：214(1986)；Cabilly等，美国专利No：4816567；Taniguchi等等，EP171496；Morrison等，EP173494；Neuberger等，WO8601533；Robinson等，WO8702671；Boμlianne等，自然312：643(1984)；Neuberger等，自然314：268(1985))。实施例8B：从scFvs文库中分离直接抗血管生成多肽的抗体片段
将分离自人PBLs的天然发生的V-基因，构建入含有抗血管生成多肽抗体片段的大文库中，其含有抗血管生成多肽反应性，供体可以或不暴露于此文库(见例如美国专利5885793，以其全文并入参考)。文库的拯救
scFvs文库构建自人PBLs的RNA，如WO92/01047所述。为拯救展示抗体片段的噬菌体，将大约109个携带噬菌粒的大肠杆菌用于接种含有1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的50ml 2xTY(2xTY-AMP-GLU)，并摇动生长至O.D.为0.8。将5ml此培养物用于接种50ml的2xTY-AMP-GLU，加入2×108TU的δ基因3辅助子(M13δ基因III，见WO921047)，在37℃将此培养物不摇动培养45分钟，然后在37℃将此培养物摇动培养45分钟。将此培养物在4000rpm离心10分钟，并将沉淀再悬浮于2升含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2xTY中，并生长过夜。如WO92/01047所述制备噬菌体。
如下制备M13δ基因：M13δ基因III辅助噬菌体不编码基因III蛋白，因此展示噬菌粒的抗体片段具有结合抗原的较强亲和力。感染性M13δ基因III颗粒是通过将辅助噬菌体在具有pUC19衍生物的细胞中生长而产生的，pUC19衍生物在噬菌体形态发生期间提供野生型基因III蛋白。将培养物在37℃不摇动培养1小时，然后在37℃摇动培养4小时。将细胞上下转动(IEC-Centra8，4000revs/分10分钟)，再悬浮于300ml含有100μg氨苄青霉素/ml和25μg卡那霉素/ml的2xTY肉汤中(2xTY-AMP-KAN)，并在37℃摇动培养过夜。纯化噬菌体颗粒并通过两次PEG-沉淀从培养基中浓缩(Sambrook等，1990)，在悬浮于2ml PBS中，并经过0.45um滤膜(Minisart NML；Sartorius)过滤，以提供终浓度为大约1013转导单位/ml(氨苄青霉素抗性克隆)。文库的淘选
将免疫试管(Nunc)在PBS中用4ml的100μg/ml或10μg/ml的本发明多肽包被过夜。将试管用2％Marvel-PBS在37℃封阻2小时，然后在PBS中冲洗3次。将大约1013TU噬菌体用于试管中，并在室温上下翻动温育30分钟，然后静置1.5小时。将试管用PBS 0.1％Tween-20冲洗10次，及用PBS冲洗10次。通过加入1ml 100mM三乙胺及上下翻动15分钟，之后将此溶液立即用0.5ml 1.0MTris-HCl，pH7.4中和，从而洗脱噬菌体。然后通过用细菌将洗脱的噬菌体在37℃温育30分钟，而将噬菌体用于感染10ml的对数中期大肠杆菌TG1。然后将大肠杆菌铺板于含有1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TYE平板上。所得细菌文库然后用δ基因III辅助噬菌体拯救，以制备进行下一选择循环的噬菌体。然后重复4次亲和纯化，在第3和4次循环中用PBS，0.1％Tween-20冲洗试管增加至20次，用PBS冲洗20次。结合体的定性
将在第3和第4次选择中洗脱的噬菌体用于感染大肠杆菌2151HB，并从单独的集落中生产可溶的scFv(Marks等，1991)进行分析。用在50mM碳酸氢盐中10pg/ml的本发明多肽包被的微滴定平板进行ELISAs。在ELISA中是阳性的的克隆通过PCR指纹分析(见WO92/01047)然后通过测序而定性。实施例9：产生血管生成蛋白进行筛选分析
以下方法产生了一种含有被测试的血管生产多肽的上清。此上清然后可用于实施例14-21所述的筛选分析中。
首先，将聚-D-赖氨酸(644587 Boehringer-Mannheim)母液(在PBS中1mg/ml)在PBS中以1∶20稀释(w/o钙或镁17-516FBiowhittaker)，使反应液为50μg/ml。将200μl此溶液加入每个孔中(24孔平板)，在室温温育20分钟。确保此溶液分布于每个孔(注：可使用在每个通道均具有尖端的12通道移液器)。抽吸出聚-D-赖氨酸溶液，并用1mlPBS(磷酸盐缓冲盐水)漂洗。PBS应保持在孔中，直至铺板细胞之前，平板可以是预先用聚—赖氨酸包被两周以上时间的。
在5ml DMEM(Dμlbecco’s改进的Eagle培养基)(具有4.5G/L葡萄糖和L-谷氨酰胺(12-604F Biowhittaker))/10％热灭活的FBS(14-503F Biowhittaker)/1×Penstrep(17-602E Biowhittaker)中，铺板293T细胞(不携带P+20细胞)。使这些细胞生长过夜。
第二天，在无菌溶液池中将以下物质混合在一起：300μlLipofectamine(18324-012 Gibco/BRL)和5ml Optimem I(31985070Gibco/BRL)/96孔平板。用小体积的多通道移液器，在每个孔中加入50μl Lipofectamine-Optimem I混合物。将移液器轻轻上下翻动以混合。在室温温育15-45分钟。在大约20分钟后，用多通道移液器在每个孔中加入150μl Optimem I。作为对照，将一个平板的缺失插入体的载体DNA用每种转染方法转染。
优选地，转染应通过以下标记组进行。通过标记组，时间减半，且细胞在PBS上不需花费太多时间。首先，一个人(A)从细胞的4个24孔平板中抽吸出培养基，然后另一个人(B)用0.5-1ml PBS漂洗每个孔。然后A抽吸出PBS漂洗液，B用每个通道均具有尖端的12-通道移液器，首先在排列在24孔平板中的奇数孔然后在偶数孔中加入200μl的DNA/Lipofectamine/Optimem I复合物。在37℃温育6小时。
当温育细胞时，制备适当的培养基：在具有1×penstrep的DMEM中1％BSA，或HGSCHO-5培养基(116.6mg/L CaCl2(无水)；0.00130mg/L CuSO4-5H2O；0.050mg/L Fe(NO3)3-9H2O；0.417mg/LFeSO4-7H2O；311.80mg/L KCl；28.64mg/L MgCl2；48.84mg/LMgSO4；6995.50mg/L NaCl；2400.0mg/L NaHCO3；62.50mg/LNaH2PO4-H2O；71.02mg/L Na2HPO4；0.4320mg/L ZnSO4-7H2O；0.002mg/L花生四烯酸；1.022mg/L胆固醇；0.070mg/L DL-α-生育酚-乙酸盐；0.0520mg/L亚油酸；0.010mg/L亚麻酸；0.010mg/L豆蔻酸；0.010mg/L油酸；0.010mg/L棕榈酸；100mg/L Pluronic F-68；0.010mg/L硬脂酸；2.20mg/L Tween 80；4551mg/L D-葡萄糖；130.85mg/ml L-丙氨酸；147.50mg/ml L-盐酸精氨酸；7.50mg/ml L-天冬酰胺-H2O；6.65mg/ml L-天冬氨酸；29.56mg/ml L-半胱氨酸-HCl-H2O；31.29mg/ml L-半胱氨酸-2HCl；7.35mg/ml谷氨酸；365.0mg/ml L-谷氨酰胺；18.75mg/ml甘氨酸；52.48mg/ml L-组氨酸-HCl-H2O；106.97mg/ml L-异亮氨酸；111.45mg/ml L-亮氨酸；163.75mg/ml L-盐酸赖氨酸；32.34mg/ml L-甲硫氨酸；68.48mg/ml L-苯丙氨酸；40.0mg/ml L-脯氨酸；26.25mg/ml L-丝氨酸；101.05mg/ml L-苏氨酸；19.22mg/ml L-色氨酸；91.79mg/ml L-Tryrosine-2Na-2H2O；和99.65mg/ml L-缬氨酸；0.0035mg/L生物素；3.24mg/L D-泛酸钙；11.78mg/L氯化胆碱；4.65mg/L叶酸；15.60mg/Li-肌醇；3.02mg/L烟酸酰胺；3.00mg/L盐酸吡哆醛；0.031mg/L吡哆醇；0.319mg/L核黄素；3.17mg/L盐酸硫胺素；0.365mg/L胸苷；0.680mg/L VB12；25mM HEPES缓冲液；2.39mg/L次黄嘌呤钠；0.105mg/L硫辛酸；0.081mg/L腐胺钠-2HCl；55.0mg/L丙酮酸钠；0.0067mg/L亚硒酸钠；20uM乙醇胺；0.122mg/L柠檬酸铁；41.70mg/L与亚油酸复合的甲基-B-环糊精；33.33mg/L与油酸复合的甲基-B-环糊精；；10mg/L与retinal acetate复合的甲基-B-环糊精。用2mm谷氨酰胺和1×penstrep将同渗容摩调节为327mOsm。(10％BSA母液是将100gm BSA(81-068-3 Bayer)溶解于1L DMEM中)。过滤培养基并收集50μl在15ml聚苯乙烯锥形瓶中进行内毒素分析。在温育末期优选通过标记组终止转染反应。一个人(A)抽吸出转染培养基，同时另一个人(B)在每个孔中加入1.5ml适当培养基。根据使用的培养基在37℃温育45或72小时：1％BSA温育45小时或CHO-5温育72小时。
在第四天，用300μl多通道移液器将600μl等分置于一个1ml深孔平板中，并将剩余上清置于2ml深孔中。然后将取自每个孔的上清用于实施例10-12所述的分析中。
特别指出的是，当在下述使用上清的任何分析中获得活性时，此活性可直接源自血管生产多肽(如作为分泌的蛋白质)，或通过血管生产多肽诱导其它蛋白质表达，然后分泌入上清中。因此，本发明还提供了在上清中鉴别特征在于在特殊分析中有活性的蛋白质。实施例10：鉴别小分子浓度和膜通透性变化的筛选分析
配体与受体的结合已知改变小分子的胞内水平，如钙离子，钾离子，钠离子和pH，以及改变膜电压。这些改变在分析中可测定，以鉴别与特殊细胞受体结合的上清。尽管以下方法阐述了一种钙离子分析，但可对此方法加以简单修改以检测钾离子，钠离子，pH，膜电压，或可通过荧光探针检测的任何其它小分子的变化。
以下分析使用荧光显影平板Reader(FLIPR)，测定结合小分子荧光分子(分子探针)中的改变。明显地，可使用检测小分子的任何荧光分子代替在此使用的钙荧光分子，fluo-3。
就贴壁细胞而言，将细胞以10000-20000个细胞/孔种植于Co-star黑色透明底的96孔平板中。将此平板在CO2温育器温育20小时。在Biotek冲洗器中，将贴壁细胞用200μl HBSS(Hank’s平衡盐溶液)冲洗两次，在最终冲洗后剩下100μl缓冲液。
1mg/ml fluo-3母液是在10％ pluronic acid DMSO中产生的。为用fluo-3加样细胞，将50μl的12μg/ml fluo-3加入每个孔中。将平板在温育器中在37℃温育60分钟。将平板在Biotek冲洗器中用剩余的100μl缓冲液HBSS冲洗4次。
就非贴壁细胞而言，将细胞从培养基中旋下。将细胞在50ml锥形试管中用HBSS再悬浮为2-5×106个细胞/ml。将在10％ pluronicacid DMSO中4μl的1mg/ml fluo-3溶液加入每ml细胞悬浮液中。任何将试管置于37℃水浴中30-60分钟。用HBSS将细胞冲洗两次，再悬浮为1×106个细胞/ml，并分散于100μl/孔的微平板中。将此平板在1000rpm离心5分钟。然后将此平板在Denley细胞冲洗器中用200μl冲洗一次，随后经抽吸至终体积为100μl。
就非细胞基础的分析而言，每个孔含有荧光分子如fluo-3。将上清加入孔中，并检测荧光变化。
为测定胞内钙离子的荧光性，将FLIPR设定为以下参数：(1)系统gain为300-800mW；(2)曝光时间为0.4秒；(3)Camera F/stop为F/2；(4)激发光谱为488nm；(5)发射光谱为530nm；及(6)加入样品为50μl。在530nm发射增加表明由分子所致的胞外信号结果，所述分子是血管生成多肽或由血管生成多肽诱导的分子，其导致胞内钙离子浓度增加。实施例11：鉴别酪氨酸激酶活性的筛选分析
蛋白质酪氨酸激酶(PTK)代表跨膜和胞质激酶的不同组群。在受体蛋白质酪氨酸激酶(RPTK)中是一系列促分裂原性和代谢性生长因子的受体，包括PDGF，FGF，EGF，NGF，HGF和胰岛素受体亚家族。另外有一个PDTKs的大家族的相应配体还未知。PDTKs的配体主要包括分泌的小蛋白质，但还包括膜结合的和胞外基质蛋白。
通过配体激活RPTK包括配体介导的受体二聚体化，导致受体亚单位转磷酸化，并活化胞质酪氨酸激酶。胞质酪氨酸激酶包括src家族的受体相关的酪氨酸激酶(如src，yes，lck，lyn，fyn)，及非受体连接的和胞质蛋白质酪氨酸激酶，如Jak家族，其成员介导由受体细胞因子超家族(例如白细胞介素，干扰素，GM-CSF和Leptin)引发的信号转导。
由于能刺激酪氨酸激酶活性的已知因子有很多，因此感兴趣鉴别血管生成多肽或由血管生成多肽诱导的分子是否能激活酪氨酸激酶信号转导途径。因此，设计以下方法鉴别能激活酪氨酸激酶信号转导途径的这种分子。
将靶细胞(如原始角质形成细胞)以大约25000个细胞/孔的密度，种植于购自Nalge Nunc(Naperville，IL)的96孔Loprodyne沉默筛选平板中。将平板用100％乙醇漂洗30分钟两次而灭菌，用水漂洗并干燥过夜。将一些平板用购自Sigma Chemicals(St.Louis，MO)的100ml的细胞培养梯度I型胶原(50mg/ml)，明胶(2％)或聚赖氨酸(50mg/ml)，或购自Becton Dickinson(Bedford，MA)的10％Matrigel，或牛血清包被2小时，用PBS漂洗并贮存在4℃。对在这些平板中生长的细胞进行分析，可通过将细胞以5000个细胞/孔种植于生长培养基中，并在48小时后使用alamarBlue间接确定细胞数目进行，alamarBlue由Alamar Biosciences公司(Sacramento，CA)生产。将得自Becton Dickinson(Bedford，MA)的Falcon平板盖#3071盖在Loprodyne沉默筛选平板上。Falcon MicrotestIII细胞培养平板也可用于一些增殖试验中。
为制备提取物，将A431细胞种植于Loprodyne平板的尼龙膜上(20000/200ml/孔)，并在完全培养基中培养过夜。将细胞通过在无血清的基本培养基中温育24小时而静止。在用EGF(60ng/ml)或50μl实施例12中制备的上清处理5-20分钟后，除去培养基，在每个空中加入100ml提取缓冲液(20mM HEPES pH7.5，0.15M NaCl，1％Triton X-100，0.1％SDS，2mMNa3VO4，2mM Na4P2O7，和得自Boeheringer Mannheim(Indianapolis，IN)蛋白酶抑制剂的混合物(#1836170))，将平板在4℃在旋转摇动器中摇动5分钟。然后将平板置于真空转移多支管中，并用真空室将提取物通过每个孔的0.45mm膜底过滤。将提取物收集在真空多支管底的96孔捕获/分析平板中，并立即置于冰上。为很多通过离心澄清的提取物，在用去污剂溶解5分钟后，除去每个孔的内容物，并在4℃以16000×g离心15分钟。
对经过滤的提取物测试酪氨酸激酶活性的水平。尽管已知许多检测酪氨酸激酶活性的方法，但本发明仍阐述了一种方法。
通常地，上清中酪氨酸激酶活性，是通过确定其对特异底物(生物素酰化的肽)上酪氨酸残基的磷酸化能力而评定的。所用生物素酰化的肽包括PSK1(相当于细胞分裂激酶cdc2-p34的6-20位氨基酸)，和PSK2(相当于胃泌素的1-17位氨基酸)。这两种肽均是酪氨酸激酶的底物，并可得自Boehringer Mannheim。酪氨酸激酶反应通过依次加入以下成分而设立。首先，加入10μl的5uM生物素酰化的肽，然后加入10μl ATP/Mg2+(5mM ATP/50mM MgCl2)，接着加入10μl的5×分析缓冲液(40mM盐酸咪唑，pH 7.3，40mMβ-甘油磷脂，1mM EGTA，100mM MgCl2，5mM MnCl2，0.5mg/mlBSA)，然后加入5μl钒酸钠(1mM)，接着加入5μl水。轻轻混合组分，并将此反应混合物在30℃预温育2分钟。加入10μl对照酶或过滤的上清开始反应。
然后通过加入10μl的120mM EDTA终止酪氨酸激酶分析反应，并将反应物置于冰上。
通过将50μl反应混合物等分移至微滴定平板(MTP)组件中，并在37℃温育20分钟，从而确定酪氨酸激酶活性。这使链亲和素包被的96孔平板与生物素酰化的肽相关。用300μl/孔PBS将MTP组件冲洗4次。接着在每个孔中加入75μl与辣根过氧化物酶缀合的抗磷酸酪氨酸抗体(抗P-Tyr-POD(0.5u/ml))，并在37℃温育1小时。如上冲洗此孔。
接着加入100μl过氧化物酶底物溶液(Boehringer Mannheim)，并在室温温育至少5分钟(至30分钟)。用ELISA读器测定样品在405nm的吸光度。用ELISA读器定量确定结合的过氧化物酶活性水平，并反映酪氨酸激酶活性的水平。实施例12：鉴别磷酸化活性的筛选分析
作为对实施例11所述的蛋白质酪氨酸激酶活性分析的潜在改变和/或完善分析，可使用检测主要胞内信号转导中间物的活化(磷酸化)的分析。例如，如以下所述的一种特殊分析可检测Erk-1和Erk-2激酶的酪氨酸磷酸化。然而，其它分子的磷酸化，如Raf，JNK，p38MAP，Map激酶(MEK)，MEK激酶，Src，肌特异性激酶(MuSK)，IRAK，Tec和Janus，以及任何其它磷酸丝氨酸，磷酸酪氨酸或磷酸苏氨酸分子，可通过在以下分析中用Erk-1或Erk-2取代这些分子而检测。
特别地，分析平板是通过用0.1ml蛋白质G(1μg/ml)在室温包被96孔ELISA平板2小时而产生的。将平板用PBS漂洗并用3％BSA/PBS在室温封阻1小时。然后将蛋白质G平板用抗Erk-1和Erk-2的两个商业单克隆抗体(100ng/ml)在室温处理1小时(SantaCruz Biotechnology)。(为检测其它分子，可将此步骤通过替换检测任何上述分子的单克隆抗体而简单修改)。在用PBS漂洗3-5次后，将平板在4℃贮存直至使用。
将A431细胞以20000/孔种植于96孔Loprodyne滤板中，并在生长培养基中培养过夜。将细胞在基本培养基(DMEM)中饥饿48小时，然后用EGF(6ng/ml)或50μl实施例12中所得上清处理5-20分钟。然后将细胞溶解并将提取物直接过滤到分析平板中。
在用在室温温育1小时后，将孔再次漂洗。作为阳性对照，用商业制备的MAP激酶(10ng/ml)代替A431提取物。然后将平板用商业多克隆(兔)抗体(1μg/ml)在室温处理1小时，所用抗体特异识别Erk-1和Erk-2激酶的磷酸化表位。此抗体是通过标准方法生物素酰化的。然后用Wallac DELFIA设备中的铕链亲和素和铕荧光增强剂连续温育，确定结合的多克隆抗体数量。高于背景的荧光信号表明血管生成多肽或由血管生成多肽诱导的分子的磷酸化。实施例13：确定编码血管生成多肽的基因中变化的方法
分离自具有相应表型(如疾病)的全部家族或个体病人的RNA是分离的。然后通过本领域已知方法从这些RNA样品中产生cDNA(见Sambrook)。将此cDNA用作PCR模板，使用编码代表性血管生成多肽的核苷酸系列中相应的区域作引物。设定PCR条件为35次循环：95℃ 30秒，52-58℃60-120秒，70℃ 60-120秒，使用Sidransky，D.等，科学252：706(1991)所述的缓冲液。
然后使用在其5’末端用T4多核苷酸激酶标记的引物，应用SequiTherm聚合酶(Epicentre Technologies)，对PCR产物测序。对编码血管生成多肽的基因的选择的外显子的内含子—外显子边界也进行确定，并分析基因组PCR产物以证实此结果。将携带编码血管生成多肽的基因中可疑突变的PCR产物克隆并测序，以证实直接测序的结果。
将编码血管生成多肽的基因的PCR产物克隆入T-有尾载体中，如Holton，T.A.和Graham，M.W.，核酸研究19：1156(1991)所述，并用T7聚合酶(United States Biochemical)测序。感染的个体通过编码血管生成多肽的基因中的突变而鉴别，未感染的个体中没有此突变。
通过确定编码血管生成多肽的基因中的变化，还观测到基因组的重新排列。框架实施例2分离的基因组克隆是用洋地黄毒苷脱氧—尿苷5’-三磷酸(Boehringer Manheim)和FISH切口平移的，如Johnson，Cg.等，细胞生物学方法35：73-99(1991)所述进行。用标记的探针进行杂交是用大量的特异杂交编码血管生成多肽的基因组基因座的人cot-1 DNA进行的。
用4，6-二氨基-2-苯基lidole和亚丙基碘化物对染色体进行对染，产生C-和R-带的组合。使用三带滤膜系列(ChromaTechnology，Brattleboro，VT)，组合冷却的偶联电荷的照相机(Photometrics，Tucson，AZ)和可变发射波长滤膜(Johnson，Cv.等，Genet.Anal.Tech.App1.8：75(1991))，可获得序列对比图像的精确作图。图像收集，分析和染色体分级长度测定是使用IseeGraphical程序系统(Inovision公司，Durham，NC.)进行的。编码血管生成多肽(通过探针杂交的)的基因的基因组区域的染色体变化，经鉴别是插入，缺失和转运。这些变化用作相关疾病的诊断标记。实施例14：检测生物样品中血管生成多肽的异常水平的方法
血管生成多肽可在生物样品中检测，且如果检测到血管生成多肽水平提高或降低，则此多肽是特殊表型的标记。检测方法有许多，因此本领域技术人员根据其特殊需要可对以下分析加以修改。
例如，使用抗体夹心ELISAs检测样品优选生物样品中的血管生成多肽。微滴定平板的孔用血管生成多肽的特异抗体包被，抗体终浓度为0.2-10μg/ml。抗体是单克隆或多克隆抗体，且是由实施例8所述方法产生的。将孔封阻以便降低血管生成多肽与孔的非特异性结合。
将包被的孔在室温用含有血管生成多肽的样品温育2小时以上。优选地，将连续稀释的样品用于证实结果。然后将平板用去离子水或蒸馏水冲洗3次，以除去未结合血管生成多肽。
接着，将50μl的抗体—碱性磷酸酶缀合物，以25-400ng的浓度加入，并在室温温育2小时。将平板再用去离子水或蒸馏水冲洗3次，以除去未结合的缀合物。
在每个孔中加入75μl的4-methylumbelliferyl phosphate(MUP)或p-nitrophenyl phosphate(NPP)底物，并在室温温育1小时。通过微滴定平板读器测定反应。使用连续稀释的对照样品制备标准曲线，X轴表示血管生成多肽浓度(对数值)，Y轴表示荧光型或吸光度(线性值)。使用标准曲线添加样品中血管生成多肽浓度。实施例15：配方
本发明还提供了治疗和/或预防疾病，功能失调和/或病理状况(例如本文所述的一或多种疾病，功能失调和/或病理状况)的方法，通过为受试者施用有效量的治疗剂而进行。治疗剂是指本发明的多核苷酸或多肽(包括片段和变体)，其激动剂或拮抗剂，和/或其抗体，组合药物适当的载体(如无菌载体)。
结合各个患者的临床状况(尤其单用此治疗剂进行治疗的副作用)，输送位置，施用方法，施用顺序，及从业者已知的其它因素，以取得良好疗效的方式配制及确定治疗剂的剂量。“有效量”因此是通过这些条件确定的。
一般而言，非肠道施用的治疗剂的每剂总药物有效量在大约1μg/kg体重/天——10mg/kg体重/天，虽然如上所述要进行治疗性评价。优选地，此剂量为证实至少0.01mg/kg体重/天，更优选对人而言为0.01-1mg/kg体重/天激素。如果连续施用，治疗剂典型以大约1μg/kg体重/小时-50μg/kg体重/小时的剂量施用，每天注射1-4次，或连续皮下灌注，例如使用微泵。也可使用静脉内输液。需根据产生的治疗效果观测变化和间隔，从而根据所需效应对治疗长度加以变化。
治疗剂可经口腔，直肠，非肠道，膀胱内，阴道内，腹膜内，局部(如通过粉末，药膏，凝胶，滴剂或经皮贴)，面颊或者经口腔或鼻腔喷雾而施用。“药物适当载体”是指非毒性的固体，半固体或液体充填剂，稀释剂，胶囊物或任何类型的配方辅助剂。本文所用术语“非肠道”是指包括静脉内，肌内，腹膜内，胸骨内，皮下和动脉内注射及灌注的施用模式。
本发明的治疗剂适于通过缓释系统施用。缓释的治疗剂例如是通过口腔，直肠，非肠道，膀胱内，阴道内，腹膜内，局部(如通过粉末，药膏，凝胶，滴剂或经皮贴)，面颊或者经口腔或鼻腔喷雾而施用。“药物适当载体”是指非毒性的固体，半固体或液体充填剂，稀释剂，胶囊物或任何类型的配方辅助剂。本文所用术语“非肠道”是指包括静脉内，肌内，腹膜内，胸骨内，皮下和动脉内注射及灌注的施用模式。
本发明的治疗剂也适于通过缓释系统施用。缓释的治疗剂例如包括适当的聚合物(例如成形物形式的半透性聚合物基质，如覆以薄膜，或胶囊物)，适当的疏水物(例如在适当油中的乳状液)，或离子交换树脂，及可溶的衍生物(例如可溶的盐)。
缓释基质包括polyactides(美国专利No：3773919，EP58481)，L-谷氨酸和γ-乙基-谷氨酸的共聚物(Sidman，U.等，生物聚合物22：547-556(1983))，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸(R.Langer，化学教学12：98-105(1982))，乙基乙烯乙酸盐(R.Langer等)或聚-D-(-)-3-羟丁酸(EP133988)。
缓释的治疗剂还包括本发明脂质体包载的治疗剂(见Langer，科学249：1527-1533(1990)；Treat等，感染性疾病和癌症治疗中的脂质体，Lopez-Berestein和Fidler编辑，Liss，纽约，pp317-327和353-365(1989))。含有治疗剂的脂质体上通过已知方法制备的，参见：3218121DE；Epstein等，美国科学院院报82：3688-3692(1985)；Hwang等，美国科学院院报77：4030-4034(1980)；EP52322；EP36676；EP88046；EP143949；EP142641；日本专利申请83-118008；美国专利No：4485045和4544545；及EP102324。通常地，脂质体是小unilamellar型(大约200-800埃)，其中脂质含量高于30mol/胆固醇，调整所选择的比例以达到最佳治疗。
在另一实施方案中，本发明的治疗剂是通过泵输送的(见Langer，如前；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等，外科88：507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。
其它控制的释放系统参见Langer所述(科学249：1527-1533(1990))。
为非肠道施用，在一个实施方案中，治疗剂一般通过将其在所需纯度，以单位剂量可注射形式(溶液，悬浮液或乳状液)，与药物适当载体混合，所述载体即在所用剂量和浓度对受体无毒性，并与配方中其它配料可相容的载体。例如，配方优选不包括氧化剂或其它已知对治疗剂有害的化合物。
通常地，配方是通过将治疗剂均匀及密切地与液体载体或充分分散的固体载体或二者接触而制备的。然后如果需要，将产物在所需配方中成形。优选地，此载体是非肠道载体，更优选是与受体血液等渗的溶液。这种载体例如包括水，盐水，Ringer’s液，和葡萄糖溶液。本发明还使用非水性载体如固定脂和乙基油酸，以及脂质体。
载体适当的含有少量添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。这种物质在所用剂量和浓度对受体无毒性，包括缓冲液如磷酸，柠檬酸，琥珀酸，乙酸和其它有机酸或其盐；抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量多肽(少于大约10个残基)如聚精氨酸或三肽；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸或精氨酸；单糖，二糖，及其它碳水化合物，包括纤维素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；平衡离子如Na+；和/或非离子表面活性剂如polysorbates，poloxamers，或PEG。
在这种载体中治疗剂典型的以0.1-100mg/ml浓度，优选1-10mg/ml，pH为大约3-8配制。应知使用上述的一些赋形剂，载体或稳定剂将导致多肽盐形成。
使用的治疗剂是无菌的。可通过无菌滤膜(如0.2微米膜)过滤达到无菌状态。通常将治疗性多肽组合物置于具有无菌通道的容器中，例如具有通过皮下注射针头可穿过的塞子的静脉内注射溶液袋或小瓶。治疗性多肽通常贮存在单位或多剂量容器中，例如密封的安瓶或小瓶，以水溶液存在或以冻干配方重建。例如冻干配方是将10ml小瓶充填5ml无菌过滤的1％(w/v)治疗剂水溶液，并将所得混合物冻干。通过用无菌注射用水重建冻干的治疗剂制备灌注液。
本发明还提供了药物包装或试剂盒，其包含一或多个充填本发明一或多种配料的容器。与此容器相关的是由政府对药物或生物制品的生产，使用或销售的告示，其反映了由政府批准的施用于人的药物或生物制品的生产，使用或销售机构。另外，治疗剂可与其它治疗性化合物联合使用。
本发明的治疗剂可单独使用或与佐剂组合使用。可与本发明治疗剂组合使用的佐剂包括但非限于明矾，明矾+脱氧胆酸(免疫Ag)，MTP-PE(Biocine公司)，QS21(Genentech公司)，BCG，和MPL。在一特异的实施方案中，本发明的治疗剂与明矾组合施用。在另一特异的实施例方案中，本发明的治疗剂与QS21组合施用。可与本发明的治疗剂组合施用的其它佐剂包括但非限于单磷酰脂免疫调制剂，AdjuVax 100a，QS21，QS18，CRL1005，铝盐，MF59，和病毒体佐剂方法。可与本发明治疗剂组合施用的疫苗包括但非限于抗MMR(麻疹，腮腺炎，风疹)，脊髓灰质炎，水痘，破伤风/白喉，甲型肝炎，乙型肝炎，B型嗜血杆菌流感，百日咳，肺炎，流感，Lyme’s病，轮状病毒感染，霍乱，黄热病，乙型脑炎，脊髓灰质炎，狂犬病，伤寒，和百日咳的疫苗。可伴随组合施用如分别但同时混合施用；或相继组合施用。这包括组合剂是作为治疗性混合物一起施用的，还包括组合剂是分别但同时施用的，如提供分别的静脉通道同时输入一个个体中。“组合”施用还包括先施用所供化合物或制剂之一，再施用第二种。
本发明的治疗剂可单独或与其它治疗剂组合施用。可与本发明组合物组合施用的治疗剂包括但非限于TNF家族的其它成员，化疗剂，抗生素，类固醇或非类固醇抗炎剂，常规免疫治疗剂，细胞因子和/或生长因子。可伴随组合施用如分别但同时混合施用；或相继组合施用。这包括组合剂是作为治疗性混合物一起施用的，还包括组合剂是分别但同时施用的，如提供分别的静脉通道同时输入一个个体中。“组合”施用还包括先施用所供化合物或制剂之一，再施用第二种。
在一实施方案中，本发明的治疗剂与TNF家族的其它成员组合施用。可与本发明组合物组合施用的TNF，TNF相关的或类TNF分子包括但非限于可溶形式的TNF-α，淋巴毒素-α(LT-α，也称为TNF-β)，LT-β(在LT-α2-β异源三聚体复合物中发现的)，OPGL，FasL，CD27L，CD30L，4-1BBL，DcR3，OX40L，TNF-γ(国际出版物WO 96/14328)，AIM-I(国际出版物WO97/33899)，内因子-α(国际出版物WO 98/07880)，TR6(国际出版物WO 98/30694)，OPG，和neutrokine-α(国际出版物WO98/18921)，OX40，和神经生长因子(NGF)，及可溶形式的Fas，CD30，CD27，CD40和4-IBB，TR2(国际出版物WO 96/34095)，DR3(国际出版物WO 97/33904)，DR4(国际出版物WO 98/32856)，TR5(国际出版物WO 98/30693)，TR6(国际出版物WO 98/30694)，TR7(国际出版物WO 98/41629)，TRANK，TR9(国际出版物WO 98/56892)，TR10(国际出版物WO 98/54202)，312C2(国际出版物WO98/06842)，和TR12，及可溶形式的CD154，CD70，和CD153。
在一些实施方案中，本发明的治疗剂与抗逆转录病毒剂，核苷逆转录酶抑制剂，非核苷逆转录酶抑制剂，和/或蛋白酶抑制剂组合施用。可与本发明治疗剂组合施用的核苷逆转录酶抑制剂包括但非限于RETROVIRTM(zidovudine/AZT)，VIDEXTM(2’，3’-双脱氧肌苷/ddI)，HIVIDTM(2’，3’-双脱氧胞苷/ddC)，ZERITTM(双脱氧胸苷/d4T)，EPIVIRTM(lamivudine/3TC)，和COMBIVIRTM(zidovudine/lamivudine)。可与本发明治疗剂组合施用的非核苷逆转录酶抑制剂包括但非限于VIRAMUNETM(nevirapine)，RESCRIPTORTM(delavirdine)，和SUSTIVATM(efavirenz)。可与本发明治疗剂组合施用的蛋白酶抑制剂包括但非限于CRIXIVANTM(indinavir)，NORVIRTM(ritonavir)，INVIRASETM(saquinavir)，和VIRACEPTTM(nelfinavir)。在一特异的实施方案中，抗逆转录病毒剂，核苷逆转录酶抑制剂，非核苷逆转录酶抑制剂，和/或蛋白酶抑制剂可与本发明治疗剂组合施用，以治疗AIDS和/或预防或治疗HIV感染。
在其它实施方案中，本发明的治疗剂可与抗机会感染剂组合施用。可与本发明治疗剂组合施用的抗机会感染剂包括但非限于TRIMETHOPRIM-S M LFAMETHOXAZOLETM，DAPSONETM，PENTAMIDINETM，ATOVAQUONETM，ISONIAZIDTM，RIFAMPINTM，PYRAZINAMIDETM，ETHAMBUTOLTM，RIFABUTINTM，CLARITHROMYCINTM，AZITHROMYCINTM，GANCICLOVIRTM，FOSCARNETTM，CIDOFOVIRTM，FLUCONAZOLETM，ITRACONAZOLETM，KETOCONAZOLETM，ACYCLOVIRTM，FAMCICOLVIRTM，PYRIMETHAMINETM，LEUCOVORINTM，NEUPOGENTM(filgrastim/G-CSF)，和LEUKINETM(sargramostim/GM-CSF)。在一特异的实施方案中，本发明的治疗剂可与TRIMETHOPRIM-S  M  LFAMETHOXAZOLETM，DAPSONETM，PENTAMIDINETM，和/或ATOVAQUONETM任意组合施用，以预防性治疗或预防机会性肺囊虫属carinii肺部感染。在另一特异的实施方案中，本发明的治疗剂与ISONIAZIDTM，RIFAMPINTM，PYRAZINAMIDETM，和/或ETHAMBUTOLTM任意组合施用，以预防性治疗或预防分支杆菌avium复合感染。在另一特异的实施方案中，本发明的治疗剂与RIFABUTINTM，CLARITHROMYCINTM，和/或AZITHROMYCINTM任意组合施用，以预防性治疗或预防分支杆菌tubercμlosis感染。在另一特异的实施方案中，本发明的治疗剂与GANCICLOVIRTM，FOSCARNETTM，和/或CIDOFOVIRTM任意组合施用，以预防性治疗或预防机会性巨细胞病毒感染。在另一特异的实施方案中，本发明的治疗剂与FLUCONAZOLETM，ITRACONAZOLETM，和/或KETOCONAZOLETM任意组合施用，以预防性治疗或预防机会性真菌感染。在另一特异的实施方案中，本发明的治疗剂与ACYCLOVIRTM，和/或FAMCICOLVIRTM任意组合施用，以预防性治疗或预防机会性I型或II型单纯疱疹病毒感染。在另一特异的实施方案中，本发明的治疗剂与PYRIMETHAMINETM，和/或LEUCOVORINTM任意组合施用，以预防性治疗或预防机会性弓形体gondii感染。在另一特异的实施方案中，本发明的治疗剂与LEUCOVORINTM，和/或NEUPOGENTM任意组合施用，以预防性治疗或预防机会性细菌感染。
在另一实施方案中，本发明的治疗剂与抗病毒剂组合施用。可与本发明治疗剂组合施用的抗病毒剂包括但非限于无环鸟苷，病毒唑，金刚烷胺和remantidine。
在另一实施方案中，本发明的治疗剂与抗生素组合施用。可与本发明治疗剂组合施用的抗生素包括但非限于阿莫西林，β-内酰胺酶，氨基糖苷，β-内酰胺(糖肽)，β-内酰胺酶，氯林可霉素，氯霉素，头胞菌素，卷须霉素，erythromycin，氟喹诺酮，大环内酯类，甲硝唑，青霉素，喹诺酮类，利福平，链霉素，磺胺类，四环素，三甲氧苄二氨嘧啶，三甲氧苄二氨嘧啶-sulfamthoxazole，和万古霉素。
可与本发明组合物组合施用的常规免疫抑制剂包括但非限于类固醇，cycloporine，cycloporine类似物，环磷酰胺，甲基强的松，强的松，咪唑硫嘌呤，FK-506，15-deoxyspergualin，和其它通过抑制T细胞应答功能而起作用的免疫抑制剂。
在特异的实施方案中，本发明的治疗剂与免疫抑制剂组合施用。可与本发明治疗剂组合施用的免疫抑制剂制品包括但非限于ORTHOCLONETM(OKT3)，SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(cycloporine)，PROGRAFTM(血流谱)，CELLCEPTTM(mycophenolate)，咪唑硫嘌呤，glucorticosteroids，和RAPAMNETM(sirolimus)。在一特异实施方案中，免疫抑制剂可用于预防器官或骨髓移植的排斥反应。
在另一实施方案中，本发明的治疗剂单独施用或与一或多种静脉内免疫球蛋白制品组合施用。可与本发明治疗剂组合施用的静脉内免疫球蛋白制品包括但非限于GAMMARTM，IVEEGAMTM，SANDOGLOBMLINTM，GAMMAGARD S/DTM，和GAMIMUNETM。在一特异实施方案中，本发明的治疗剂与静脉内免疫球蛋白制品组合施用在移植疗法中(如骨髓移植)。
在另一实施方案中，本发明的组合物与抗生素组合施用。可与本发明组合物组合施用的抗生素包括但非限于四环素，甲硝唑，阿莫西林，β-内酰胺酶，氨基糖甙类，大环内酯类，喹诺酮类，氟基喹诺酮类，头胞菌素，erythromycin，卷须霉素，和链霉素。
在另一实施方胺中，本发明的组合物单独施用或与抗炎剂组合施用。可与本发明组合物组合施用的抗炎剂包括但非限于糖皮质激素和非类固醇抗炎剂，氨基芳香羧酸衍生物，芳香乙酸衍生物，芳香丁酸衍生物，芳香羧酸，芳香丙酰酸衍生物，吡唑，吡唑啉酮，水杨酸衍生物，thiazinecarboxamides，e-acetamidocaproic acid，S-酰苷甲硫氨酸，3-氨基-4羟丁酸，amixetrine，苯吲酸，炎痛静，丁基环己基巴比妥，difenpiramide，双苯唑醇，emorfazone，愈创奥，nabumetone，nimesulide，orgotein，oxaceprol，paranyline，perisoxal，pifoxime，蛋白酶，和tenidap。
在另一实施方案中，本发明的组合物与化疗剂组合施用。可与本发明组合物组合施用的化疗剂包括但非限于抗生素衍生物(如阿霉素，博来霉素，道诺红菌素和更生霉素)；抗雌激素(如三苯氧胺)；抗代谢物(如氟尿嘧啶，5-FU，氨甲喋呤，5氟脱氯尿苷，α干扰素-2b，谷氨酸，plicamycin，巯基嘌呤，和6-硫鸟嘌呤)；胞毒剂(如亚硝基氮芥，BCNU，环己亚硝脲，CCNU，胞核嘧啶阿拉伯糖苷，环磷酰胺，estramustine，羟基脲，甲基苄肼，丝裂霉素，二甲磺酸丁酯，顺铂，和长春新碱硫酸盐)；激素(如甲孕酮，estramustine磷酸钠，乙炔基雌二醇，雌二醇，乙酸基孕甾酮，甲基睾甾酮，二磷酸己烯雌酚，三对甲氧苯氯乙烯和睾丸内酯)；氮芥衍生物(如mephalen，chorambucil，二氯甲基二乙胺(氮芥)和三胺硫磷)；类固醇及其组合物(如bethamethasone磷酸钠)；及其它物质(如dicarbazine，天冬酰胺酶，邻氯苯对氯苯二氯乙烷，硫酸长春新碱，硫酸长春碱，和etoposide)。
在一特异的实施方案中，本发明的治疗剂与CHOP(环磷酰胺，阿霉素，长春新碱，强的松)或任意组合的CHOP组分组合施用。在另一实施方案中，本发明的治疗剂与Rituximab组合施用。在另一实施方案中，本发明的治疗剂与Rituxmab和CHOP组合施用，或与Rituxmab和任意组合的CHOP组分组合施用。
在另一实施方案中，本发明的组合物与细胞因子组合施用。可与本发明的组合物组合施用的细胞因子包括但非限于IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL10，IL12，IL13，IL15，抗-CD40，CD40L，IFN-γ，和TNF-α。在另一实施方案中，本发明的治疗剂可与任何白细胞介素组合施用，包括但非限于IL1-α，IL1-β，IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL8，IL9，IL10，IL11，IL12，IL13，IL14，IL15，IL16，IL17，IL18，IL19，IL20，和IL21。
在另一实施方案中，本发明的组合物与血管生成蛋白组合施用。可与本发明组合物组合施用的血管生成蛋白包括但非限于神经胶质瘤衍生生长因子(GDGF)，如欧洲专利EP-399816所述；血小板衍生生长因子-A(PDGF-A)，如欧洲专利EP-682110所述；血小板衍生生长因子-B(PDGF-B)，如欧洲专利EP-282317所述；胎盘生长因子(PlGF)，如国际出版物WO92/06194所述；胎盘生长因子-2(PlGF-2)，如Hauser等，生长因子4：259-268(1993)；血管内皮细胞生长因子(VEGF)，如国际出版物WO90/13649所述；血管内皮细胞生长因子-A(VEGF-A)，如欧洲专利EP-506477所述；血管内皮细胞生长因子-2(VEGF-2)，如国际出版物WO96/39515所述；血管内皮细胞生长因子B-186(VEGF-B186)，如国际出版物WO96/26736所述；血管内皮细胞生长因子-D(VEGF-D)，如国际出版物WO98/07832所述；和血管内皮细胞生长因子-E(VEGF-E)，如德国专利DE19639601所述。上述文献以其全文并入参考。
在另一实施方案中，本发明的组合物与成纤维细胞生长因子组合施用。可与本发明组合物组合施用的成纤维细胞生长因子包括但非限于FGF-1，FGF-2，FGF-3，FGF-4，FGF-5，FGF-6，FGF-7，FGF-8，FGF-9，FGF-10，FGF-11，FGF-12，FGF-13，FGF-14，和FGF-15。
在另一实施方案中，本发明的组合物与其它治疗性或预防性方法组合施用，例如放射疗法。实施例16：治疗血管生成蛋白水平降低的方法
本发明还涉及一种治疗需要提高机体内血管生成多肽活性水平的个体的方法，包括为这种个体施用包含治疗有效量的血管生成多肽或其激动剂的组合物。
另外，应意识到由个体内血管生成多肽低于标准或正常表达水平所导致的疾病，可通过施用血管生成多肽优选分泌形式的多肽而加以治疗。因此，本发明还提供了一种治疗需要提高血管生成多肽水平的个体的方法，包括为这种个体施用包含一定量血管生成多肽的药物组合物，以提高这种个体中血管生成多肽的活性水平。
例如，对血管生成多肽水平降低的患者每天施用0.1-100μg/kg的此多肽，连续6天。优选此多肽是分泌形式的。基于施用和配方的服用方式见实施例15所述。实施例17：治疗血管生成蛋白水平增高的方法
本发明还涉及一种治疗需要降低机体内血管生成多肽活性水平的个体的方法，包括为这种个体施用包含治疗有效量血管生成多肽拮抗剂的组合物。用于本发明的优选拮抗剂是血管生成多肽特异性抗体。
反义技术用于抑制血管生成多肽的产生。此技术是降低各种病原学如癌症中血管生成多肽水平的方法之一，此血管生成多肽优选是分泌形式的。
例如，对血管生成多肽水平异常增高的患者，在静脉内施用0.5，1.0，1.5，2.0和3.0mg/kg/天的反义多核苷酸，共21天。如果对此治疗良好耐受，在休息7天后重复此治疗。此反义多核苷酸的配方见实施例15所述。实施例18：使用体内基因治疗的方法
基因治疗的一种方法是将能表达血管生成多肽的成纤维细胞移植到患者体内。通常地，成纤维细胞得自皮肤活检组织样品。将所得组织置于组织培养基中，并分离成小片。将小块组织置于组织培养瓶的湿表面上，每个培养瓶放置近10片。将此培养瓶倒置，密封并在室温过夜。在室温下24小时后，将此培养瓶倒转，组织片仍固定于瓶底，加入新鲜培养基(如具有10％FBS，青霉素和链霉素的Ham’s F12培养基)。然后，将此培养瓶在37℃温育近1周时间。
在此期间，加入新鲜培养基，并每隔几天更换一次。在另外培养2周后，形成一层成纤维细胞。将此单层细胞用胰蛋白酶消化，并分散置于较大的培养瓶中。
将在Moloney鼠肉瘤病毒长末端重复两侧的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7：219-25(1988))，用EcoHI和HindIII消化，接着用牛碱性磷酸酶处理。将此线性载体用玻珠在琼脂糖凝胶上分级分离并纯化。
编码血管生成多肽的cDNA可用PCR引物扩增，所用引物如实施例1所述分别相当于5’和3’末端序列。优选地，5’引物含有一个EcoRI位点，3’引物含有一个HindIII位点。将等量的Moloney鼠肉瘤病毒线性主链和扩增的EcoRI和HindIII片段，在存在T4 DNA连接酶的情况下加在一起。将此连接混合物保持在在适当条件下以连接这两个片段。然后将此连接混合物用于转化细菌HB101，接着将其铺板于含有卡那霉素的琼脂上，以确定载体含有正确插入的编码血管生成多肽的基因。
将兼嗜性pA317或GP+am12包装细胞，在具有10％牛血清(CS)，青霉素和链霉素的Dμlbecco’s修改的Eagles培养基(DMEM)中生长，至组织培养物达到铺满密度。然后将含有编码血管生成多肽的基因的MSV载体加入培养基中，并用此载体转导包装细胞。这时包装细胞产生含有编码血管生成多肽的基因的感染性病毒颗粒(此时包装细胞称为生成细胞)。
将新鲜培养基加入转导的生产细胞中，并接着从铺满生产细胞的10cm平板中收集培养基。将含有感染性病毒颗粒的失效培养基通过微孔滤膜过滤，以除去脱附的生产细胞，然后用此培养基用于感染成纤维细胞。从亚铺满成纤维细胞的平板中除去培养基，并迅速用取自生产细胞的培养基代替。除去此培养基并代以新鲜培养基。如果病毒的效价高，实际上所用成纤维细胞被感染，且不需要进行选择。如果效价非常低，则必需使用具有可选择标记如neo或his的逆转录病毒载体。一旦成纤维细胞已经有效感染，对此成纤维细胞进行分析，以确定血管生成蛋白是否产生。然后将基因工程化的成纤维细胞移植到宿主中，单独移植或在cytodex3微载体珠上生长至铺满后移植。实施例19：使用编码血管生成蛋白的内源性基因的基因治疗
本发明的另一种基因治疗方法包括通过同源重组，可操纵地将编码血管生成蛋白的内源性序列与启动子缔合，如美国专利No：5641670，1997年6月24日发布；国际出版物WO96/29411，1996年9月26日出版；国际出版物WO94/12650，1994年8月4日出版；Koller等，美国科学院院报86：8932-8935(1989)；和Zijlstra等，自然342：435-438(1989)所述。此方法包括激活一种基因，该基因存在于靶细胞中，但其不在此细胞中表达，或在此细胞中以低于所需水平表达。
产生含有一个启动子和的多核苷酸构建体，靶序列同源于编码血管生成多肽的内源性基因的5’非编码序列，位于启动子的两侧。将靶序列紧位于基因的5’末端附近，以便启动子在同源重组之上可操纵的与内源性序列连接。启动子和靶序列可用PCR扩增。优选地，扩增的启动子在5’和3’末端含有独特的限制酶位点。优选地，第一个靶序列的3’末端含有与扩增的启动子5’末端相同的限制酶位点，第二个靶序列的5’末端含有与扩增的启动子3’末端相同的限制酶位点。将扩增的启动子和扩增的靶序列用适当的限制酶消化，接着用牛小肠磷酸酶处理。在存在T4 DNA连接酶的情况下，将消化的启动子和消化的靶序列加在一起。所得混合物在适于这两个片段连接的条件下保持。将构建体在琼脂糖凝胶上按大小分级分离，然后通过苯酚提取和乙醇沉淀而纯化。
在此实施例中，多核苷酸构建体通过电穿孔以裸多核苷酸施用。然而，多核苷酸构建体还可与促进转染剂如脂质体，病毒序列，病毒颗粒，沉淀剂等组合施用。本领域已知这种输送方法。
一旦细胞被转染，进行同源重组，使启动子可操纵的连接于内源性基因序列。这导致血管生成多肽在细胞中表达。表达可通过免疫染色，或本领域已知任何其它方法检测。
成纤维细胞得自皮肤活检组织样品。将所得组织置于DMEM+10％胎牛血清中。将按指数规律生长的或早期稳定期的成纤维细胞用胰蛋白酶消化，并用营养培养基从塑料表面冲洗下。移出等份细胞悬浮液进行计数，剩余细胞进行离心。抽吸申请并将沉淀再悬浮于5ml电穿孔缓冲液中(20mM HEPES pH 7.3，137mM NaCl，5mMKCl，0.7mM Na2HPO4，6mM葡萄糖)。将细胞再离心，抽吸上清，并将细胞再悬浮于含有1mg/ml乙酰化的牛血清白蛋白的电穿孔缓冲液中。最终细胞悬浮液含有大约3×106个细胞/ml。在再悬浮后应立即进行电穿孔。
根据标准方法制备质粒DNA。例如，为构建定向于编码血管生成蛋白的基因所位于的基因座的质粒，将质粒pUC18(MBIFermentas，Amherst，NY)用HindIII消化。将CMV启动子通过PCR扩增，XbaI位点在5’末端，BamHI位点在3’末端。将两个血管生成蛋白非编码序列通过PCR扩增：一个血管生成蛋白非编码序列(血管生成蛋白片段1)扩增，BamHI位点在5’末端，Xba位点在3’末端；另一个血管生成蛋白非编码序列(血管生成蛋白片段2)扩增，BamHI位点在5’末端，HindIII位点在3’末端。将CMV启动子和血管生成蛋白片段用适当酶消化(CMV启动子-XbaI和BamHI；血管生成蛋白片段1-XbaI；血管生成蛋白片段2-BamHI)，并连接在一起。将所得产物用HindIII消化，并用HindIII消化的pUC18质粒连接在一起。
将质粒DNA加入具有0.4cm电缺口的无菌样品池(Bio-Rad)中。最终DNA浓度一般为至少120μg/ml。然后在样品池中加入0.5ml细胞悬浮液(含有大约1.5×106个细胞)，并将细胞悬浮液与DNA溶液轻轻混合。用Gene-Pμlser设备(Bio-Rad)进行电穿孔。电容和电压分别设为960μF和250-300V。随着电压升高，细胞存活力降低，但稳定将导入的DNA掺入其基因组中的存活细胞的百分率明显提高。给定这些参数，应观测到大约14-20mSec的脉冲时间。
将电穿孔的细胞在室温保持大约5分钟，然后用无菌移液管轻轻除去样品池的内容物。将细胞直接加入10cm平皿中10ml预温的营养培养基中(具有10％牛血清的DMEM)，并在37℃温育。第二天国，抽吸培养基，并用10ml新鲜培养基更换，另外温育16-24小时。
然后将基因工程化的成纤维细胞注射入宿主体内，单独施用或在cytodex3微载体珠上生长至铺满后施用。这时成纤维细胞产生蛋白质产物。然后将成纤维细胞导入患者体内，如上所述。实施例20：使用体内基因治疗的方法
本发明的另一方面是使用体内基因疗法以治疗功能失调，疾病和病理状况。此基因疗法涉及将编码血管生成多肽的裸核酸(DNA，RNA，和反义DNA或RNA)序列导入动物体，以提高或降低血管生成多肽的表达。编码血管生成多肽的多核苷酸可操纵的连接于启动子或通过靶组织表达血管生成多肽所必需的其它遗传因子。本领域已知这种基因治疗和输送方法，见例如WO90/11092，WO98/11779；美国专利No：5693662，5705151，5580859；Tabata H.等，(1997)心血管研究35(3)：470-479，Chao J等(1997)，药学研究35(6)：517-522，Wolff J.A.(1997)，神经肌功能失调7(5)：314-318，Schwartz B.等，(1996)基因专利3(5)；405-411，TsurumiY等(1996)循环94(12)：3281-3290所述，以上文献以其全文并入参考。
含有编码血管生成多肽的基因的多核苷酸构建体，可通过将可注射物输送至动物细胞的任何方法输送，如注射入组织的间隙内(心脏，肌，皮肤，肺，肝，小肠等)。另外，多核苷酸构建体可在药物适当的液体或水性载体中输送。
术语“裸”多核苷酸，DNA或RNA指游离自任何输送载体的序列，该载体帮助，促进或易于使序列进入细胞中，包括病毒序列，病毒颗粒，脂质体配方，脂质转染试剂或沉淀剂等。然而，编码血管生成多肽的多核苷酸也可在脂质体配方中输送(如Felgner P.L.等(1995)，Ann.NY Acad.Sci.772：126-139和Abdallah B.等(1995)生物细胞85(1)：1-7)，脂质体配方可通过本领域熟知的方法制备。
用于基因疗法中含有编码血管生成多肽的基因的多核苷酸载体构建体，优选是即不整合入宿主基因组又不含有进行复制的序列的构建体。可以使用本领域已知的任何强启动子，以驱动DNA表达。与其它基因疗法不同，将裸核酸序列导入靶细胞的一个优点是细胞中多核苷酸合成的时间短。研究还示出可将非复制DNA序列导入细胞中，以使所需多肽生产6个月以上。
含有编码血管生成多肽的基因的多核苷酸构建体可输送至动物体内组织间隙中，包括肌，皮肤，脑，肺，肝，脾，骨髓，胸腺，心脏，淋巴，血液，骨，软骨，胰腺，肾，胆囊，胃，小肠，睾丸，卵巢，子宫，直肠，神经系统，眼，腺体和结缔组织。组织间隙包括细胞内液，器官组织网状纤维中的粘多糖基质，血管或心腔壁中的弹性纤维，纤维性组织的胶原纤维，或掺入肌细胞内的或骨松质中结缔组织中的相同基质。相似地，此间隙由循环血浆和淋巴管道内的淋巴液占据。根据以下原因优选输送至肌组织间隙内。因为它们可通过注射输送至包含这些细胞的组织中。优选将它们输送至并在持续未分开的分化的细胞中表达，尽管可在未分化或未全分化的细胞中间隙输送和表达，如血液或皮肤成纤维细胞的干细胞。在体内的肌细胞是其进行并表达多核苷酸的能力中的重要成分。
为注射编码血管生成多肽的裸多核苷酸，DNA或RNA的有效剂量在大约0.05g/kg体重-50mg/kg体重之间。此剂量优选在大约0.005mg/kg-20mg/kg，更优选在0.05mg/kg-5mg/kg之间。当然，技术人员意识到此剂量可根据注射的组织位置而加以变化。核酸序列的适当和有效剂量可易于为本领域技术人员根据病情和施用途径所确定。优选的施用途径是通过非肠道途径注射至组织间隙内。然而，也可使用其它非肠道途径，如吸入气雾剂配方特别输送至肺或支气管组织，咽喉或鼻粘膜。另外，含有编码血管生成多肽的基因的裸多核苷酸构建体可在血管成形术期间通过导管输送至动脉中。
在体内肌内注射的编码血管生成多肽的多核苷酸的剂量应答效应如下确定。根据标准重组DNA方法制备编码血管生成多肽的适当的模板DNA，以产生编码血管生成多肽的mRNA。此模板DNA可以是环形或线性的，其可用作裸DNA或与脂质体复合。然后用各种数量的模板DNA注射小鼠的四头肌。
将5-6周龄的雌性和雄性Balb/C小鼠通过腹膜内注射0.3ml的2.5％Avertin麻醉。在前肢上做一个1.5cm的切口，并直接显现四头肌。将在0.1ml载体中编码血管生成多肽的模板DNA，在1cc注射器中通过27号针头注射1分钟以上时间，从肌注位至膝大约0.5cm，注射深度为大约0.2cm。在注射位进行缝合以进一步定位，并用不锈钢夹子封闭皮肤。
在适当的温育时间后(如7天)后，通过切下整个四头肌制备肌提取物。将各个四头肌的每15um横切面进行组织染色，以观测血管生成多肽表达。血管生成多肽表达的时间经过以相似方式进行，除了在不同时间收集不同小鼠的四头肌。在注射后肌中编码血管生成多肽的DNA的持续性，可在从经注射的及对照的小鼠中制备总细胞DNA和HIRT上清后，通过Southern印迹分析确定。在小鼠中进行的以上试验结果，可用于推断在人体和其它动物使用编码血管生成多肽的裸DNA的正确剂量及其它治疗参数。实施例21：血管生成多肽转基因动物
血管生成多肽也可在转基因动物中表达。任何物种的动物包括小鼠，大鼠，兔，仓鼠，豚鼠，猪，小猪，山羊，牛和非人灵长类动物如狒狒，猴，和黑猩猩，可用于产生转基因动物。在一特异的实施方案中，使用本文所述的及本领域已知的其它方法在人体中表达本发明的多肽，作为基因治疗方法的一部分。
可使用本领域已知的任何方法将转基因(即本发明的多核苷酸)导入动物体，以产生转基因动物的创始系。这种方法包括但非限于前核微注射法(Paterson等，应用微生物学生物技术40：691-698(1994)；Carver等，生物技术(NY)11：1263-1270(1993)；Wright等，生物技术(NY)9：830-834(1991)；和Hoppe等，美国专利No：4873191(1989))；将逆转录病毒介导的基因移至微生物系(Van derPutten等，美国科学院院报82：6148-6152(1985))，胚泡或胚胎中；胚胎干细胞中基因定向(Thompson等，细胞56：313-321(1989))；电穿孔细胞或胚胎(Lo，1983，分子细胞生物学3：1803-1814(1983))；使用基因枪导入本发明的多核苷酸(见例如Ulmer等，科学259：1745(1993))；将核酸构建体导入胚胎多能性干细胞中及将此干细胞反过来移至胚泡中；和精子介导的基因转移(Lavitrano等，细胞57：717-723(1989)；等。这种方法参见Gordon，“转基因动物”，Intl.Rev.Cytol.115：171-229(1989)，以其全文并入参考。
可使用本领域已知的任何方法产生含有本发明多核苷酸的转基因克隆，例如将核移至经培养的胚胎，胎儿，或成体细胞的的核仁的去核卵母细胞中，诱导为静止态。(Campell等，自然380：64-66(1996)；Wilmut等，自然385：810-813(1997))。
本发明提供了在其所有细胞中均携带转基因的转基因动物，以及在其一些而非全部细胞中携带转基因的动物，即嵌合动物。可将转基因整合为单一基因或多拷贝如多联体，例如头—头串联或头—尾串联。也可选择性将转基因导入特殊细胞类型中并激活，例如通过Lasko所述方法(Lasko等，美国科学院院报89：6232-6236(1992))。这种细胞类型特异性激活所需的调节序列依赖于相应的细胞类型，本领域技术人员已知这一点。当需要将多核苷酸转基因整合入内源性基因的染色体位点中时，优选基因定向方法。
简而言之，当利用这种方法时，设计含有与内源性基因同源的一些核苷酸序列的载体，以通过与染色体序列同源重组而整合入并破坏内源性基因的核苷酸序列的功能。也可选择性将转基因导入特殊细胞类型中，由此灭活只在该细胞类型中的内源性基因，例如通过Gu等，所述方法(Gu等，科学265：103-106(1994))。这种细胞类型特异性激活所需的调节序列依赖于相应的细胞类型，本领域技术人员已知这一点。所述文献均以全文并入参考。
一旦产生转基因动物，可利用标准方法分析重组基因的表达。初始筛选可通过Southern印迹分析或PCR方法分析动物组织，以证实已经发生整合。在转基因动物组织中转基因的mRNA表达水平也可使用以下方法评定，包括但非限于对得自动物的组织样品进行Northern印迹分析，原位杂交分析，和逆转录酶-PCR(rt-PCR)。也可对表达转基因的组织样品通过使用特异于转基因产物的抗体而进行免疫细胞化学性或免疫组织化学性评价。
一旦产生创始动物，，将它们繁殖，生育，远系繁殖或异种交配，以产生特殊动物集落。这种繁殖方法例如包括但非限于远系繁殖具有一个以上整合位点的创始动物，以建立分离的体系；使分离的体系生育以产生较高水平表达转基因的化合物转基因，转基因以较高水平表达是由于每个转基因的加成表达所致；异种交配杂种转基因动物以产生与给定整合位点纯合的动物，以增加表达和不需要通过DNA分析筛选动物；进行繁殖以将转基因置于独特的背景中，该背景适于相应的试验模型。
本发明转基因动物的用途包括但非限于用作动物模型系统，以详细阐述血管生成多肽的生物功能，研究与异常血管生成多肽表达相关的疾病，及筛选可改善这种疾病的化合物。实施例22：血管生成蛋白剔除动物
内源性血管生成蛋白基因表达也可使用定向同源重组，通过灭活或“剔除”编码血管生成蛋白的基因和/或其启动子而降低。(见例如Smithies等，自然317：230-234(1985)；Thomas和Capecchi，细胞51：503-512(1987)；Thompson等，细胞5：313-321(1989)；以上文献均以全文并入参考)。例如可使用一种有或无可选择标记和/或阴性可选择标记的突变体，以转染在体内表达本发明多肽的细胞，这种突变体是位于与内源性多核苷酸序列(基因的编码区或调节区)同源的DNA两侧的本发明的非功能性多核苷酸。在另一实施方案中，使用本领域已知方法在细胞中进行剔除，该细胞含有但不表达相应的基因。通过定向同源重组掺入DNA构建体，导致定向的基因灭活。这种方法特别适用于研究和农业领域，其中对胚胎干细胞进行修饰可用于产生具有灭活的定向基因的动物子代(见例如Thomas和Capecchi，1987及Thompson 1989，如前)。但此方法可常规用于人体，将重组DNA构建体用本领域技术人员熟知的适当病毒载体，直接施用于或定向于在体内所需位点。
在本发明的另一实施方案中，将经遗传工程化而表达本发明多肽的细胞，或经遗传工程化(如剔除)而不表达本发明多肽的细胞，在体内施用于患者。这种细胞可得自患者(即动物包括人)或MHC相容供体，并可包括但非限于成纤维细胞，骨髓细胞，血细胞(如淋巴细胞)，脂肪细胞，肌细胞，内皮细胞等。细胞在体外使用重组DNA方法基因工程化，以将本发明多肽的编码序列导入细胞中，或者破坏与本发明多肽相关的编码序列和/或内源性调节序列，例如通过转导(使用病毒载体，优选将转基因整合入细胞基因组中的载体)或转染方法，包括但非限于质粒，粘粒，YACs，裸DNA，电穿孔，脂质体等转染。本发明多肽的编码序列可在强组成型或可诱导型启动子或启动子/增强子的控制下置放，以表达优选分泌血管生成多肽。表达及优选分泌本发明多肽的工程化细胞，可全身性导入患者体内，如经血液循环或经腹膜内施用。
或者，细胞可掺入基质中，并植入机体中，如基因工程化的成纤维细胞可作为皮肤移植体的一部分植入；基因工程和的内皮细胞可作为淋巴或血管移植体的一部分植入(见例如Anderson等，美国专利No：5399349；和Mulligan和Wilson，美国专利No：5460959，所述文献均以全文并入参考)。
当施用的细胞是非自身或非MHC相容细胞时，可用熟知的方法施用，以防止宿主抗导入细胞的免疫应答产生。例如，细胞可以胶囊形式导入，这样可与相邻的胞外环境交换组分，使导入细胞不被宿主免疫系统识别。
本发明的剔除动物的用途包括但非限于作为动物模型系统，用于详细阐述血管生成多肽的生物功能，研究与血管生成蛋白异常表达相关的疾病，及筛选可改善这种疾病的化合物。实施例23：血管生成多肽生物效应
成纤维细胞和内皮细胞分析  人体肺成纤维细胞得自Clonetics(San Diego，CA)，并保持在得自Clonetics的生长培养基中。皮肤微血管内皮细胞得自Cell Applications(San Diego，CA)。为进行增殖分析，可将人体肺成纤维细胞和皮肤微血管内皮细胞，以5000个细胞/孔在96孔平板在生长培养基中培养一天。然后将细胞在0.1％BSA基本培养基中温育一天。在用新鲜0.1％BSA培养基更换原来的培养基后，将细胞用测试蛋白温育3天。在每个孔中加入Alamar蓝至终浓度为10％。将细胞温育4小时。通过CytoFluor荧光读器测定细胞生存力。为进行PGE2分析，将人体肺成纤维细胞以5000个细胞/孔在96孔平板中培养一天。在将培养基更换为0.1％BSA基本培养基后，将细胞用FGF-2或有或无IL-1α的血管生成多肽温育24小时。收集上清并通过EIA试剂盒(Cayman，Ann Arbor，MI)分析PGE2。为进行IL-6分析，将人体肺成纤维细胞以5000个细胞/孔在96孔平板中培养一天。在将培养基更换为0.1％BSA基本培养基后，将细胞用FGF-2或有或无IL-1α的血管生成多肽温育24小时。收集上清并通过ELISA试剂盒(Endogen，Cambridge，MA)分析PGE2。
将人体肺成纤维细胞用FGF-2或血管生成多肽在基本培养基中培养3天，之后加入Alamar蓝确定对成纤维细胞生长的作用。FGF-2应示出在10-2500ng/ml的刺激作用，这可用于与血管生成多肽对比刺激作用。实施例24：血管生成多肽对血管内皮细胞生长的作用
在第一天，将人体脐静脉内皮细胞(HUVEC)以2-5×104个细胞/35mm平皿密度，种植于含有4％胎牛血清(FBS)，16单位/ml肝素，和50单位/ml内皮细胞生长上清(ECGS，Biotechnique，Inc.)的M199培养基中。在第二天，将培养基用含有10％FBS，8单位/ml肝素的M199更换，加入各种浓度的血管生成多肽和阳性对照如碱性FGF(bFGF)。在第4和第6天，更换培养基。在第8天，用Coulter计数器确定细胞数目。
HUVEC细胞数目增加表示血管生成多肽可增殖血管内皮细胞。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例25：血管生成多肽对血管内皮细胞增殖的刺激作用
为评价生长因子的促分裂原活性，用电子偶联试剂PMS(吩嗪硫酸甲酯)进行比色MTS(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-5-(3-羧甲基苯基)-2-(4-硫代苯基)2H-四唑)分析(CellTiter96 AQ，Promega)。将细胞种植于96孔平板的0.1ml补加血清的培养基中(5000个细胞/孔)，使其附着过夜。在0.5％FBS中血清饥饿12小时后，将有或无肝素(8U/ml)的条件(在0.5％FBS中的bFGF，VEGF165或血管生成多肽)加入孔中48小时。在每个孔中加入20mg的MTS/PMS混合物(1∶0.05)，并在37℃温育1小时，之后用ELISA平板读器测定在490nm的吸光度。减去得自对照孔(相同培养基，无细胞)的的背景吸光度，对每种条件在7个孔中并列进行。见Leak等，体外细胞发育生物学，30A：512-518(1994)。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例26：抑制PDGF诱导的血管平滑肌细胞增殖刺激作用
HAoSMC增殖可例如通过BrdUrd掺入而测定。简而言之，将在4通道玻片上生长的亚铺满的静止细胞用CRP或FITC标记的AT2-3LP转染。然后，将细胞用10％小牛血清和6mg/ml BrdUrd脉冲。24小时后，使用BrdUrd染色试剂盒(Zymed实验室)进行免疫细胞化学分析。简而言之，将细胞暴露于变性溶液后，用生物素酰化的小鼠抗BrdUrd抗体在4温育2小时，然后用链亲和素-过氧化物酶和二氨基联苯胺温育。
在用苏木精对染后，将细胞制成标本用显微镜检查，并计数BrdUrd阳性细胞。以BrdUrd阳性细胞与总细胞数的百分比计算BrdUrd指数。另外，对各个细胞进行BrdUrd染色(核)和FITC吸收(胞质)的刺激性检测，通过伴随使用明视野照明和暗视野-UV荧光照明进行。见Hayashida等，生物化学杂志6：271(36)：21985-21992(1996)。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例27：刺激内皮迁移
本实施例用于探究血管生成多肽可刺激淋巴内皮细胞迁移的可能性。
用48孔微趋化室进行内皮细胞迁移分析(Neuroprobe Inc.。CabinJohn，MD；Falk，W.，等，免疫学方法杂志1980；33：239-247)。将8um孔规格的无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜，用0.1％明胶在室温包被至少6小时，并在无菌空气中干燥。将测试物在补加0.25％牛血清白蛋白(BSA)的M199中稀释为适当浓度，并将25ul终稀释液置于修改的Boyden设备的下面腔室内。将亚铺满的，早期传代(2-6)HUVEC或BMEC培养物进行冲洗，并用胰蛋白酶消化达到细胞分离所需的最少的时间。在将滤膜置于下面和上面腔室之间后，将悬浮于含有1％FBS的50ul M199中的2.5×105个细胞种植于上面间隔间中。然后将此设备在37℃在5％ CO2的潮湿腔中温育，以使细胞迁移。在温育阶段后，除去滤膜并将滤膜上面未迁移的细胞用橡胶刮棒刮掉。将滤膜用甲醇固定并用Giemsa溶液染色(Diff-Quick，Baxter，McGraw Park，IL)。通过计数在每个孔中3个随机高能域(40×)的细胞数对迁移进行定量，所有组均以一式四份进行。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例28；通过内皮细胞刺激氧化氮产生
由血管内皮释放的氧化氮确信是血管内皮松弛的中介体。因此，血管生成蛋白活性可通过确定由内皮细胞对血管生成多肽应答而产生的氧化氮而分析。
氧化氮是在96孔平板中测定的，该平板铺满饥饿24小时接着暴露于各种水平阳性对照物和血管生成多肽4小时的微血管内皮细胞。在通过硝酸盐还原酶还原氧化氮产生的硝酸盐后，使用Griess试剂测定总硝酸盐，从而确定培养基中的氧化氮。血管生成多肽对氧化氮释放的作用在HUVEC上检测。
简而言之，从培养的HUVEC单层细胞中释放的氧化氮是用氧化氮特异性极谱仪电极与氧化氮仪表(Iso-NO，World PrecisionInstruments Inc.)连接而测定的。氧化氮的校准根据以下等式进行：
2KNO2+2KI+2H2SO462NO+I2+H2O+2K2SO4
标准校正曲线是通过在含有KI和H2SO4的校准溶液中加入梯度浓度的KNO2(0，5，10，25，50，100，250，和500nmol/L)而获得的。Iso-NO电极对氧化氮的特异性预先通过测定真正氧化氮气体中的氧化氮(1050)而确定。除去培养基并将HUVECs用Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水冲洗两次。然后将细胞在6孔平板中的5ml过滤的Krebs-Henseleit溶液中水浴，并将细胞平板保持在玻片温热器中(Lab Line Instruments Inc.)。温度保持在37℃。将氧化氮传感器探针垂直插入孔中，保持电极尖端在溶液下2mm，之后加入不同条件。将S-亚硝基乙酰基青霉素胺(SNAP)用作阳性对照物。释放的氧化氮数量以pmol/1×106个内皮细胞表示。报道的所有数值均是在每组中进行4-6次测定的平均值(细胞培养孔的数目)。见Leak等，生物化学和生物生理学研究综述217：96-105(1995)。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例29：血管生成多肽对血管形成中条索形成的作用
血管形成的另一步骤是条索形成，表现为内皮细胞分化。本生物分析测定当在体外培养时，微血管内皮细胞形成类毛细管结构(中空结构)的能力。
CADMEC(微血管内皮细胞)购自Cell Applications，Inc.作为增殖(2期)细胞，并在Cell Applications的CADMEC数值培养基中培养，及在5期使用。为进行体外血管生成分析，将48孔细胞培养平板的孔用Cell Applications的吸附因子培养基(200ml/孔)在37℃包被30分钟。将CADMEC以7500个细胞/孔种植于包被的孔中，并在生长培养基中培养过夜。然后将生长培养基用含有对照缓冲液或血管生成多肽(0.1-100ng/ml)的300mg Cell Applications的条索形成培养基中置换，并将细胞另外培养48小时。类毛细管条索的数目和长度通过使用Boeckeler VIA-170图像显影分析仪而定量。所有分析均一式三份。
商购(R&D)的VEGF(50ng/ml)用作阳性对照。b-雌二醇(1ng/ml)用作阴性对照。将适当的缓冲液(无蛋白质)也用作对照。本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例30：对鸡绒毛尿囊膜的血管生成作用
鸡绒毛尿囊膜(CAM)是检测血管生成的一完好建立的系统。在CAM上的血管形成易于观测及可定量。可在CAM中检测血管生成多肽刺激血管生成的能力。将白来亨鸡(Gallus gallus)和日本qual(Coturnix coturnix)的受精卵在37.8℃和80％湿度温育。将16天龄鸡和13天龄qual胚胎的分化的CAM用以下方法研究。在发育的第4天，在鸡蛋的蛋壳上穿一个洞。选择正常发育的胚胎并用cellotape将鸡蛋密封。将其进一步温育直至第13天。将Thermanox盖玻片(Nunc，Naperville，IL)切割为直径大约为5mm的圆片。将无菌和无盐生长因子溶解于蒸馏水中并用移液管将大约3.3mg/5ml滴至圆片上。在空气中干燥后，将圆片倒转置于CAM上。3天后，将样品在3％戊二醛和2％甲醛中固定，并用0.12M  甲次砷酸钠缓冲液冲洗。将其用立体显微镜〔Wild M8〕照相，并包埋如上述作半及超薄切片。对照组是用只有载体的圆片进行的。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例31：在小鼠中用matrigel植入体进行血管生成分析
对血管生成多肽的体内血管生成分析，测定现有的毛细血管网在植入的小鼠胞外基质物的胶囊(Matrigel)中形成新血管的能力。将蛋白质与液态Matrigel在4℃混合，然后将混合物皮下注射至小鼠，在注射处其凝固。7天后，除去Matrigel的固体“栓”，并检测其中新血管的存在情况。Matrigel购自Becton DickinsonLabware/Collaborative Biomedical Products。
当在4℃解冻时，Matrigel物是液态的。将Matrigel与血管生成多肽以150ng/ml在4℃混合，并抽吸入冷却的3ml针管中。将大约8周龄的雌性C57B1/6小鼠，用Matrigel和试验蛋白的混合物在腹部中间的两处位置注射(0.5ml/处)。7天后，将小鼠通过颈部脱臼而处死，除去Matrigel栓并清洁(即除去所有黏性膜和纤维组织)。将复制的整个栓子在中性缓冲的10％甲醛中固定，包埋于石腊中，并在用Masson’sTrichrome染色后，用于制备组织切片。从每个栓子的3个不同区域进行横切面。将选择的切片染色以检测vWF的存在情况。此分析的阳性对照是牛碱性FGF(150ng/ml)。单独Matrigel用于确定血管形成的基本水平。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例32：在兔下肢模型中拯救局部缺血
为研究血管生成多肽对局部缺血的体内作用，兔下肢局部缺血模型通过手术除去一条股动脉而产生的(Takeshita，S.等，AmJ.Pathol147：1649-1660(1995))。切除股动脉导致血栓逆向增殖及髂外动脉闭塞。结果，血液流向局部缺血肢体依赖于源自髂内动脉的侧支血管(Takeshita，S.等，Am J.Pathol147：1649-1660(1995))。间隔10天使兔在手术后恢复及内源性侧支血管产生。在手术后10天(0天)，进行基线血管造影后，将局部缺血肢体的髂内动脉，用500mg编码血管生成多肽的裸表达质粒，使用水凝胶包被的气囊导尿管，通过动脉基因转移方法转染(Riessen，R.等，人体基因治疗4：749-758(1993)；Leclerc，G.等，临床研究杂志90：936-944(1992))。当在此处理中使用编码血管生成多肽的DNA时，将一丸500mg血管生成蛋白或对照物在1分钟以上的时间，通过导尿管灌注输送至局部缺血肢体的髂内动脉中。在第30天，在这些兔中测定各种参数：(a)BP比率—局部缺血肢体与正常肢体的收缩压比率；(b)血流与流量—静止FL：在未加宽条件下血流和最大FL：在充分加宽条件下血流(也是间接测定血管数量)和流量是通过最大FL与静止FL的比率表示；(c)angiographic血管造影结果—这是通过侧支血管造影测定的。此结果是通过覆盖载网中循环百分率确定的，此覆盖载网中具有由兔股动脉总数分开的交叉的不透明的动脉；(d)毛细管密度—侧支毛细管数目在取自下肢的光学显微镜切片中确定。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例33：血管生成蛋白对血管舒张的作用
由于血管内皮的扩张对降低血压是重要的，因此检测血管生成多肽在自发高血压大鼠(SHR)中影响血压的能力。将增加剂量的血管生成多肽(0，10，30，100和900mg/kg)施用于13-14周龄的自发高血压大鼠(SHR)中。数据以平均值+/-SEM表示。用成对t-试验进行统计学分析，及有统计学意义的是对单独缓冲液应答的p＜0.05。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例34：大鼠局部缺血皮瓣模型
评价参数包括皮肤血流，皮肤温度，和因子VIII免疫组织化学或内皮碱性磷酸酶反应。在皮肤局部缺血期间血管生成蛋白的表达使用原位杂交法研究。
此模型中的研究分为以下三部分：
a)局部缺血
b)局部缺血皮肤伤口
c)正常伤口
试验方法包括：
a)取3×4cm，单一血管的全层随机皮瓣(动物下肢的
myocutaneous皮瓣)
b)在局部缺血皮肤(皮瓣)中作一切口(直径4-6mm)
c)用1mg-100mg剂量范围的血管生成多肽对切口(在作切口
0，1，2，3，4天后)进行局部处理
d)在作切口3，5，7，10，14和21天后收集伤口组织，以进行
组织学，免疫组织化学和原位研究。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例35：周围动脉疾病模型
使用血管生成多肽的血管生成性治疗是一种新的治疗方法，以在周围动脉疾病情况下，在局部缺血周围重建血流。实验方法包括：
a)将一侧股动脉结扎使该下肢肌产生局部缺血，其它下肢作为对照。
b)将剂量在20-500mg范围内的血管生成蛋白，每周经静脉内和/或肌内注射3次(可更多次)，连续2-3周。
c)在结扎股动脉1，2和3周后收集局部缺血的肌组织，分析血管生成蛋白的表达和组织学分析。对照下肢的正常肌组织也进行活检。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例36：局部缺血性心肌疾病模型
血管生成多肽经评价是能在冠状动脉闭塞后刺激侧支血管发生并重建新血管的潜在促分裂原。血管生成蛋白表达的变化是在原位检测的。实验方法包括：
a)在大鼠经左侧胸廓切开术暴露心脏。立即用细缝合线(6-0)结扎左侧冠状动脉并关闭胸腔。
b)将剂量为将剂量在20-500mg范围内的血管生成蛋白，每周经静脉内和/或肌内注射3次(可更多次)，连续2-3周。
c)在手术后30天，除去心脏并作横切面以进行形态学和原位分析。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例37：大鼠角膜伤口愈合模型
动物模型示出血管生成多肽对新血管生成的作用。实验方法包括：
a)在角膜中心作一长度为1-1.5mm的切口至基质层。
b)在切口边缘下插入spatula贴在眼角膜外。
c)作一口袋(其底部是在眼缘1-1.5mm形成)。
a)将含有50ng-5ug血管生成多肽的小球置于口袋内。
b)也可在角膜伤口局部以20mg-500mg剂量进行血管生成多肽
处理(日一次共5天)。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例38：糖尿病小鼠和糖皮质激素减少的伤口愈合模型A.糖尿病db+/db+小鼠模型
为证实血管生成多肽可促进愈合过程，使用遗传性糖尿病小鼠伤口愈合模型。在db+/db+小鼠中的全层伤口愈合模型是经充分定性，临床相应和可再生的削弱的伤口愈合模型。糖尿病伤口愈合除了组织收缩外依赖于组织粗糙表面形成和再上皮化(Gartner，M.H.等，外科学研究杂志52：389(1992)；Greenhalgh，D.G.等，病理学杂志136：1235(1990))。
糖尿病动物有许多在II型糖尿病mellitus中观测到的特征。纯合(db+/db+)小鼠比其孪生的正常杂种(db+/+m)肥大。突变的糖尿病(db+/db+)小鼠在第4染色体(db+)上有一单独的常染色体隐性突变(Coleman等，美国科学院院报77：283-293(1982))。动物表现为多食，多饮，多尿症。突变的糖尿病小鼠(db+/db+)血糖高，胰岛素水平提高或正常，细胞免疫受抑制(Mandel等，免疫学杂志，120：1375(1978)；Debray-Sachs，M.等，免疫学临床实验51(1)：1-7(1983)；Leiter等，病理学杂志114：46-55(1985))。在这些动物体内已阐述有周围神经病变，心肌病变等并发症，和微血管损害，基底膜增厚和肾小球滤过异常(Norido，F.等，实验神经学83(2)：221-232(1984)；Robertson等，糖尿病29(1)：60-67(1980)；Giacomelli等，实验进展40(4)：460-473(1979)；Coleman，D.L.糖尿病31(Suppl)：1-6(1982))。这些纯合糖尿病小鼠产生高血糖症，其对与人II型糖尿病相似的胰岛素有抗性。
由在这些动物中观测的特征推断，在此模型中的伤口愈合可与在人糖尿病患者中观测的伤口愈合相似(Greenhalgh等，病理学杂志136：1235-1246(1990))。
在此项研究中(Jackson实验室)使用遗传的糖尿病雌性C57BL/KsJ(db+/db+)小鼠及其孪生非糖尿病(db+/+m)杂种。购买6周龄的动物，并在8周龄开始研究。将动物置于单室中并无限制的给予食物和水。所有操作均使用无菌方法进行。根据人体基因组科学公司动物饲养和使用委员会的条例和指导，及实验动物的饲养和使用指导进行实验。
根据先前报道的方法产生伤口(Tsuboi，R.和Rifkin，D.B.，实验方法杂志172：245-251(1990))。简而言之，在产生伤口当天，将动物经腹膜内注射溶解于去离子水中的Avertin(0.01mg/ml)，2，2，2-三溴乙醇和2-甲基-2-丁醇而麻醉。刮削动物的脊背区域，并用70％乙醇溶液和碘酒冲洗皮肤。在产生伤口之前将手术部位用无菌纱布使其干燥。然后用Keyes组织打孔器产生一8mm全层伤口。在伤口产生后，立即将周围皮肤轻轻伸展以消除伤口扩展。在试验期间将伤口开放保持。从产生伤口当天连续5天局部应用给定的处理方法。在处理之前，将伤口轻轻用无菌盐水和纱布清洁。
在手术当天及之后间隔2天的固定间隔时间，对伤口进行观测和照相。在第1-5天和第8天，每天测定伤口闭合情况。使用校准的Jameson测径器水平及垂直地测定伤口。如果可观测到的粗糙表面的组织不是很长，且伤口由连续上皮覆盖，则可认为伤口愈合。
将血管生成多肽在载体中，以每处伤口每天施用4mg-500mg范围内不同剂量的血管生成多肽，连续8天。对照组施用50ml的载体溶液。
将动物在第8天经腹膜内注射戊巴比妥钠(300mg/kg)而安乐死。然后收集伤口和周围皮肤进行组织学和免疫组织化学分析。将组织样品置于活检组织盒中10％中性缓冲的福尔马林中以进一步加工。对3组每组10只动物(5只糖尿病及5只非糖尿病对照)进行评价：1)载体安慰剂对照
2)血管生成蛋白
通过在垂直轴和水平轴测定范围和所得伤口总面积对伤口闭合情况进行分析。然后通过确定在开始(0天)伤口面积和处理后(第8天)的伤口面积之间的差异，评价伤口收缩情况。在0天伤口面积为64mm2，相当于在皮肤上打孔大小。用以下公式进行计算：〔在第8天开放面积〕-〔在第1天开放面积〕/〔在第1天开放面积〕。样品固定于10％缓冲的福尔马林中，并将石腊包埋的样品垂直于伤口表面切片(5mm)，并使用Reichert-Jung切片机切割。对截开的伤口组织的横切面进行常规HE染色。对伤口组织进行组织学测试，以确定通过用血管生成多肽处理是否改变所修复皮肤的愈合过程和形态学表现。此确定包括确认细胞积聚，炎症细胞，毛细管，成纤维细胞，再上皮化和表皮完备情况(Greenhalgh，D.G.等，病理学杂志136：1235(1990))。目测不准可使用校准的透镜测微计。
将组织切片也用多克隆兔抗人角蛋白抗体，经ABC Elite检测系统进行免疫组织化学染色。将人体皮肤用作阳性组织对照而非免疫IgG用作阴性对照。角质细胞生长通过用校准的透镜测微计检测伤口的再上皮化情况而确定。
皮肤样品中增殖细胞核抗原/细胞周期蛋白(PCNA)通过使用抗PCNA抗体(1∶50)，经ABC Elite检测系统证实。人结肠癌作为阳性对照，人脑组织用作阴性对照。每个样品包括具有原始抗体omission和非免疫小鼠IgG取代的切片。这些切片基于增殖情况排列在0-8刻度，较低刻度表示轻度增殖，较高刻度表示强度增殖。实验数据使用不成对的t检验分析。P值＜0.05表示有效。B.类固醇削弱的大鼠模型
通过类固醇抑制伤口愈合已在各种体外和体内系统中充分证明(Wahl，S.M.糖皮质激素和伤口愈合，抗炎类固醇作用：基本和临床方面，280-302(1989)；Wahl，S.M.等，免疫学杂志115：476-481(1975)；Werb，Z.等，实验方法杂志147：1684-1694(1978))。糖皮质激素通过抑制血管形成，降低血管通透性(Ebert，R.H.，等，An.Intern.Med.37：701-705(1952))，成纤维细胞增殖和胶原合成(Beck，L.S.等，生长因子5：295-304(1991)；Haynes，B.F.等，临床进展杂志61：703-797(1978))，并产生循环血中单核细胞瞬时减少(Haynes，B.F.等，临床进展杂志61：703-797(1978)；Wahl，S.M.，“糖皮质激素和伤口愈合”，抗炎类固醇作用：基本和临床方面，科学出版社，纽约，pp.280-302(1 989))，从而阻碍伤口愈合。对愈合力下降的伤口系统性施用类固醇在大鼠中已是充分确定的现象(Beck，L.S.等，生长因子5：295-304(1991)；Haynes，B.F.等，临床进展杂志61：703-797(1978)；Wahl，S.M.“糖皮质激素和伤口愈合”，抗炎类固醇作用：基本和临床方面，科学出版社，纽约，pp.280-302(1989)；Pierce，G.F.等，美国科学院院报86：2229-2233(1989))。
为证实血管生成多肽可促进愈合过程，对在大鼠全层皮肤切口处重复局部应用血管生成多肽的作用进行确定，其中伤口愈合已通过系统施用甲基强的松龙而削弱。
在此实施例中使用年幼的雄性Sprague Dawley大鼠重250-300g(Charles River实验室)。在8周龄购买动物并在9周龄开始研究。大鼠中伤口愈合应答通过在创伤时系统性施用甲基强的松龙(肌注17mg/kg/鼠)而削弱。将动物单室饲养并无限制给予食物和水。所有操作均用无菌方法进行。此研究根据人体基因组科学公司动物饲养和使用委员会的条例和指导，及实验动物的饲养和使用指导进行实验。
创伤方法根据以上A章节所述进行。在创伤当天，将动物通过肌注酮亚胺(50mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉。削刮该动物的脊背区并用70％乙醇和碘酒溶液冲洗皮肤。手术区域在创伤之前用无菌纱布干燥。用Keyes组织打孔器产生一8mm全层伤口。在试验期间将伤口保持开放。在产生当天对试验动物开始局部每天施用给定方法连续7天，随后施用甲基强的松龙。在处理之前，将伤口用无菌盐水和纱布轻轻清洁。
在手术当天及处理结束期间以固定间隔时间，对伤口进行观测和照相。在第1-5天和第8天，每天测定伤口闭合情况。使用校准的Jameson测径器水平及垂直地测定伤口。如果可观测到的粗糙表面的组织不是很长，且伤口由连续上皮覆盖，则可认为伤口愈合。
将血管生成多肽在载体中，以每处伤口每天施用4mg-500mg范围内不同剂量的血管生成多肽，连续8天。对照组施用50ml的载体溶液。
将动物在第8天经腹膜内注射戊巴比妥钠(300mg/kg)而安乐死。然后收集伤口和周围皮肤进行组织学和免疫组织化学分析。将组织样品置于活检组织盒中10％中性缓冲的福尔马林中以进一步加工。
对4组每组10只动物(5只用甲基强的松龙处理及5只未用糖皮质激素处理)进行评价：
1)未处理组
2)载体安慰剂处理
3)血管生成多肽处理组
通过在垂直轴和水平轴测定范围和所得伤口总面积对伤口闭合情况进行分析。然后通过确定在开始(0天)伤口面积和处理后(第8天)的伤口面积之间的差异，评价伤口收缩情况。在0天伤口面积为64mm2，相当于在皮肤上打孔大小。用以下公式进行计算：
〔在第8天开放面积〕-〔在第1天开放面积〕/〔在第1天开放面积〕
样品固定于10％缓冲的福尔马林中，并将石腊包埋的样品垂直于伤口表面切片(5mm)，并使用Reichert-Jung切片机切割。对截开的伤口组织的横切面进行常规HE染色。对伤口组织进行组织学测试，以确定通过用血管生成多肽处理是否改善所修复皮肤的愈合过程和形态学表现。目测不准可使用校准的透镜测微计。
实验数据使用不成对的t检验分析。P值＜0.05表示有效。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例39：淋巴腺瘤动物模型
本实验方法的目的是产生一适当的和一致的淋巴腺瘤模型，以测试血管生成多肽在大鼠后肢淋巴管发生和淋巴循环系统的重建中的治疗作用。通过受影响的肢体的膨胀体积，淋巴管定量，总血浆蛋白和组织病理学测定作用效果。对急性淋巴腺瘤观测7-10天。也许更重要地，腺瘤的慢性进程在随后的3-4周。在开始手术之前，抽取血压样品急性蛋白质浓度分析。将约重350g的雄性大鼠施用戊巴比妥。接着，将右肢从膝至臀削刮。削刮区域用在70％EtOH中浸湿的纱布擦拭。抽取血压以进行总蛋白测试。在标记两个测定水平(足跟上0.5cm，脊背与脚爪中间)之后，测定周长和体积，之后将染料注射脚爪中。将右脚爪和左脚爪均皮内注射0.05ml的1％Evan’s蓝。在将染料注射入脚爪后测定周长和体积。
以膝关节为界，对腿中部腹股沟作环形切口以定位股动脉。用镊子和止血钳剥离和分离皮瓣。在定位股动脉后，定位与股动脉伴行的淋巴管。然后将在此区域内的主要淋巴管电凝或缝合结扎。
使用显微镜对腿后肌肉(在半腱肌和内收肌附近)钝性分离。然后定位腘窝部淋巴结。通过缝合结扎2条最接近的和2条末梢淋巴管和腘窝淋巴结末梢血供。然后通过切除结缔组织抽取腘窝淋巴结及任何附属脂肪组织。
注意控制在此方法中产生的任何轻微出血现象。在淋巴管闭塞之后，将皮瓣用液态皮肤(Vetbond)(AJ Buck)密封。将分离的皮肤边缘密封于肌组织之下，在腿周围剩余约0.5cm的缝隙。当需要时，也可将皮肤通过缝合于肌组织之下而固定。
为避免感染，将动物单独置于网眼室中(无草垫)。每日通过最佳水肿峰值检测恢复的动物，最佳水肿峰值典型的发生在第5-7天。然后观测稳定的水肿峰值。为估计淋巴腺瘤密度，在处理之前和之后7天，在每个脚爪上2个指定位置测定周长和体积。测定血浆蛋白对淋巴腺瘤的作用，及研究蛋白质分析是否是有益的测试周长。在2个位置评价对照和水肿肢体的重量。以盲试进行分析。
测定周长：将动物用气体简单麻醉以预防肢体活动，用布带测定肢体周长。2个不同的人在踝骨和脚爪进行测定，然后对这两个结果进行平均。结果得自对照组和水肿肢体。
测定体积；在手术当天，在手术之前将动物用戊巴比妥麻醉并测试。为每日测定体积，将动物用三氟溴氯乙烷简单麻醉(迅速固定并迅速恢复)，对两腿进行削刮并用防水标记在腿上相等标记。将腿首先浸在水中，然后将腿浸于仪器中至每个标记水平，接着通过Buxco水肿软件(Chen/Victor)进行测定。一个人记录数据，另一人将肢体浸至标记部位。
血浆蛋白测定：在手术前抽取血液，旋转，并分离血清，然后测定总蛋白并对比Ca2+。
肢重对比：在抽取血液后，制备动物以收集组织。将肢体用quillitine切除，然后将试验和对照腿在绷带处切割并称重。分离tibiocacaneal关节再称重，并称重足部。
组织学制备：将位于膝后部(腘窝)的横纹肌分割，并备于金属模子中，用冷冻凝胶充填，浸于冷冻甲基丁烷中，在-80℃置于标记的样品包中直至切片。依赖于切片，在荧光显微镜下观测肌组织所含淋巴情况。本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例40：通过血管生成多肽抑制TNF-α诱导的粘着分子表达
炎症和血管发生部位淋巴细胞的募集包括在淋巴细胞上细胞表面粘着分子(CAMs)与血管内皮之间的特异性受体—配体相互作用。在正常和病理状态下的粘着过程及随后的多步级联，包括在内皮细胞(EC)上胞内粘着分子-1(ICAM-1)，血管细胞粘着分子-1(VCAM-1)和内皮白细胞粘着分子-1(E-selectin)表达。这些分子和其它分子在血管内皮上的表达确定在炎症应答发生期间，白细胞可粘着于局部血管并从血管中渗入局部组织中。细胞因子和生长因子的局部浓度参与调节这些CAMs的表达。
肿瘤坏死因子α(TNF-α)，一种潜在的前炎症细胞因子，是内皮细胞上所有三种CAMs的刺激剂，并可包含于各种炎症应答中，通常产生病理结果。
对血管生成多肽抑制TNF-α应答的CAM表达的潜力可进行检测。当用血管生成蛋白家族成员共刺激时，应用一种修改的ELISA分析测定在TNF-α处理的Ecs上CAM表达的数量，修改的ELISA分析使用ECs作固相吸收剂。为进行试验，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养物得自集合的脐带，并在37℃保持于含有5％CO2的湿化的温育器中补加10％FCS和1％青霉素/链霉素的生长培养基中(EGM-2；Clonetics，San Diego，CA)。将HUVECs在37℃，以1×104个细胞/孔的密度种植于96孔平板中EGM培养基中，温育18-24小时或直至铺满。接着将此单层细胞用补加100U/ml青霉素和100mg/ml的无血清RPMI-1640溶液冲洗3次，并用给定的细胞因子和/或生长因子在37℃处理24小时。在温育后，评价细胞CAM表达情况。
将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)种植于标准96孔平板中至铺满。从细胞中除去生长培养基，并用90ul的199培养基(10％FBS)更换。将测试样品和阳性或阴性对照物一式三份加入平板中(10ul体积)。将平板在37℃温育5小时(选择蛋白和整联蛋白表达)或24小时(只是整联蛋白表达)。从平板中吸出培养基并将100ul的0.1％低聚甲醛-PBS(具有Ca2+和Mg2+)加入每个孔中。将平板在4℃保持30分钟。然后从孔中除去固定剂，并将孔用PBS(具有Ca2+和Mg2+)+0.5％BSA冲洗一次，并排出液体。不要使孔干燥。向测试孔和对照孔中加入10ul稀释的原始抗体。使用10ug/ml的抗-ICAM-1-食物素，抗-VCAM-1-生物素和抗-E-选择蛋白-生物素(0.1mg/ml原种抗体的1∶10稀释液)。将细胞在湿化环境下在37℃温育30分钟。将孔用PBS(具有Ca2+和Mg2+)+0.5％BSA冲洗3次。
然后将20ul稀释的ExtrAvidin-碱性磷酸酶(1∶5000稀释度)加入每个孔中，并在37℃温育30分钟。将孔用PBS(具有Ca2+和Mg2+)+0.5％BSA冲洗3次。将一片p-硝基苯酚磷酸盐(pNPP)溶解于5ml甘氨酸缓冲液(pH10.4)中。将甘氨酸缓冲液中100ul pNPP底物加入每个测试孔中。用甘氨酸缓冲液中以下稀释度的ExtrAvidin-碱性磷酸酶一式三份制备标准孔：1∶5000(100)＞10-0.5＞10-1＞10-1.5。将5ul每种稀释液加入一式三份孔中，每个孔中所得AP含量为5.50ng，1.74ng，0.55ng，0.18ng。然后必须将100ul pNPP加入每个标准孔中。平板必须在37℃温育4小时。将50ul的3M NaOH加入所有孔中。在405nm在平板读器上对结果进行定量。对只用甘氨酸缓冲液充填的空白孔中使用减少选项背景。设立模板以表明在每个标准孔中AP-缀合物的浓度(5.50ng；1.74ng；0.55ng；0.18ng)。结果以每个样品中结合的AP-缀合物数量表示。
本实施例中所述研究是在血管生成蛋白中测试活性。然而，本领域技术人员对例证的研究可加以修改，以测试编码血管生成多肽(如基因治疗)，其激动剂，和/或拮抗剂的多核苷酸活性。实施例41：免疫接种小鼠以产生单克隆抗体
将动物单室饲养并无限制给予食物和水。所有操作均以无菌方法进行。根据人体基因组科学公司动物饲养和使用委员会的条例和指导，及实验动物的饲养和使用指导进行实验。
将蛋白质在350ul磷酸盐缓冲液(PBS)或其它中性缓冲液中稀释，至终浓度为0.43mg/ml。用0.35ml Freund’s完全佐剂，乳化佐剂和蛋白质溶液10分钟，使用3cc玻璃针管和3路可任意使用的活塞(Baxter Cat.No.2C6240)。为定性测试乳化，将50ul乳化液置于倾口烧杯中冰水表面。如果乳化液不保持完整白色滴状，则需要进一步混合。
将所有乳状液抽吸入一个针管中，使用27号针头，用总量为200ul的乳状液皮下注射小鼠的4-8处，包括腋窝和腹股沟区，颈后和背部。
在2-3周后，用Freund’s不完全佐剂(与Freund’s完全佐剂相对)重复上述注射步骤。
又2-3周后，再进行第三次上述注射步骤，使用Freund’s不完全佐剂。
在第三次注射后10-14天，通过将小鼠尾静脉放血获得100-200ul血液。将血液在37℃温育60分钟，然后在4℃冷却过夜。在4℃温育后，将血液离心10分钟。将血清移至新试管中，并测试小鼠血清滴定。如果发现滴定较低，可间隔二周腹膜内(ip)注射一次。为进行ip注射，在200-400ul的PBS/小鼠中制备10-20ug蛋白质/小鼠。使用1cc针管和26号针头将此溶液注射入小鼠中。在注射后10-14天进行第二次尾部静脉放血，并再测试小鼠血清滴定。实施例42：小鼠血清滴定ELISA
用2ug/mlPBS的纯化的抗原以50ul/孔包被ELISA平板。将ELISA平板用石腊膜包被并在湿化腔中在4℃温育过夜。在温育后，用200ul/孔PBS将平板冲洗4次。用3％BSA以200ul/孔在室温封阻60分钟。摇动出封阻液。
将在含有0.1％BSA的PBS中稀释10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，和10-7的血清样品，以50ul/孔双份加入。空白缓冲液以及阳性和阴性对照血清均以上述稀释度稀释。在室温温育1-2小时。用PBST(具有0.05％ Tween的PBS)以250ul/孔冲洗4次。
将在含有0.1％BSA和2％马血清的PBST中，浓度为0.5ug/ml的生物素腺化的抗小鼠IgG以50ul/孔加入。在室温温育30-60分钟。用PBST冲洗平板4次。
向平板中加入50ul/ml ABC试剂(Vector Cat.No.PK-6100)并在室温温育30分钟。用PBST冲洗平板6次。
将1片四甲基联苯胺二盐酸(TMB)(Sigma Cat.No.T-3405)溶解于5ml的ddH2O中以制备底物进行ELISA检测。加入5ml的0.1M磷酸柠檬酸盐缓冲液(25.7ml的0.2M NaH2PO4，24.3ml的0.1M柠檬酸单水合物，pH5.0)。加入2ul新鲜30％过氧化氢，旋动并立即使用。
在温育和冲洗平板之后，加入100ul底物溶液并在室温温育大约15-30分钟。通过加入25ul/孔 2M H2SO4终止反应，并在30分钟内在450nm读平板。实施例43：产生杂交瘤的融合方法
在融合前一周，生产P3X培养基(1X DMEM 0％(GibcoCat.No.11965-019)，5-10％胎牛血清，1X L-谷氨酰胺(BiofluidsCat.NO.300)，和1X丙酮酸钠(Biofluids Cat.NO.333))。将一新瓶P3X小鼠骨髓瘤细胞在6孔平皿的一个孔中解冻(见前述解冻方法)，并在P3X生长培养基中扩展它们。如果生存力良好，第二天将它们移至一100mm平皿中。细胞密度必须不超过106个细胞/ml或更高。另外，这些细胞的细胞膜外观不应是粒状的。在进行融合步骤当天，应有5-8×105个细胞/ml的6-8个平板。在HAT培养基中测试一些P3X细胞是一个好主意。所有细胞应在大约4天内死亡。如果不，则应将P3X细胞在含有15ug/ml 8-氮鸟嘌呤的P3X培养基中生长以消除回复体。
在进行融合步骤前4天，应将小鼠经ip注射大约10ug高纯度蛋白质而免疫。
在融合前一天，将P3X细胞割裂并将它们用所需新鲜培养基供养，以便使细胞健康并在第二天生长于对数期。
在融合当天，将50ml P3X培养基，PEG溶液和HAT培养基(1×DMEM0％，20％胎牛血清，补加BM Condimed HI的4％杂交瘤(Boehringer Mannheim)，1×NEAA，1×丙酮酸钠，1×HAT(SigmaCat.No.H0262)，1×0.05M 2ME，和1×青霉素—链霉素)置于37℃水浴中。可使用大约100ml冷却的DMEM0％。
对所有P3X细胞平板检测可能的污染情况并确定细胞健康状况。从4个平板或烧瓶中将细胞再悬浮，并组合在50ml试管中。在200×G离心10分钟。吸储使其。用10ml DMEM0％将每个试管再悬浮并集合。用台盼蓝生存染色计数活细胞数(生存力应高于90％)。细胞总数应为2-4×107个细胞。如果没有足够的细胞，用更多的平板重复进行此方法。将细胞置于周围室温(ART)中直至需要进行下一步骤。
制备hood，其中脾用以下物质除去：70％EtOH，无菌仪器包括滤网和栓塞，2个含有10ml DMEM0％的培养皿和15ml离心管(2个)。
将小鼠处死，然后从尸体中收集脾。将脾组织置于含有DMEM0％的培养皿中。将滤网置于另一含有10ml DMEM0％的的平皿中，并用平板盖覆盖。用无菌forecep对和带有针头的针管将脾组织移至滤网上，整理分开的脾组织以使细胞散落于培养基中。然后，用另一栓塞轻轻将脾组织压过滤网。避免将脾组织研磨经过滤网，因为这样将导致巨大的成纤维细胞生长。
除去滤网并将脾细胞悬浮液移至15ml离心管中。用5ml DMEM0％从平皿中冲洗剩余的细胞，并加入试管中。将试管静置5分钟以使大碎片沉于底部。然后将没有碎片的细胞悬浮液移至另一15ml试管中。将此试管在200×G离心15分钟。抽吸s/n并将脾细胞再悬浮于5ml DMEM0％中。加入5ml以上的DMEM0％，并将全部体积移至50ml试管中。
除去10ul脾细胞悬浮液，并加入500ul的台盼蓝以计数淋巴细胞数。(注意：正常脾产生108个淋巴细胞)。
融合
在含有脾细胞的50ml离心管中加入足够的P3X细胞，以使淋巴细胞与P3X细胞的比率为5∶1(例如108个淋巴细胞需要2×107个P3X细胞)。用DMEM0％将总体积加至45-50ml，并在200×G离心10分钟。用定时器，温PEG，温P3X培养基，和一烧杯大约38-40℃的水制备转移hood。从P3X-淋巴细胞沉淀中抽吸所有上清，并轻弹试管使沉淀松开。将试管置于小水浴中。将融合试管保持在温水中，轻轻摇动，在1分钟以上的时间内滴加入1ml PEG。然后，将试管静置1-2分钟，偶尔摇动一下，接着在1分钟以上的时间内滴加入1mlP3X培养基。接着，在1分钟以上的时间内滴加入3mlP3X培养基，随后在1分钟以上的时间内滴加入10ml P3X培养基。
轻轻加入P3X培养基使总体积为45ml。将试管静置10分钟，然后在200×G离心10分钟。抽吸上清并将沉淀轻轻再悬浮于5ml或更少的HAT培养基中。将细胞悬浮液移至含有400ml的HAT培养基的烧瓶中并旋动混合。将一些细胞悬浮液倒入无菌贮液槽中。
用具有过滤吸头的12道移液器，将细胞以200ul/孔置于96孔平板中。将平板置于温育器中。每天监测平板的杂交瘤生长或污染情况。将平板温育3天。在第7天第一次供养(更换培养基)，用8多支管在每个孔中吸出大约一半的培养基，并更换为100-150ul/孔的HT培养基。供养一周或至第一次筛选之前，以助于稀释任何由未融合的淋巴细胞产生的抗体，发现未融合的淋巴细胞在培养2周后持续产生抗体。当集落充填孔的一半以上，及上清已变为桔黄色/黄色时，将一些或所有孔均制成样品，以在融合后2周内进行筛选。实施例44：对小鼠杂交瘤进行ELISA筛选
为筛选小鼠杂交瘤，将ELISA平板(Immulon 2“U”形底微滴定平板(Dynatech Cat.No.011-010-3555))用2ug/mlPBS的抗原以50ul/孔包被。用塑料盖覆盖ELISA平板并在4℃温育过夜。在温育后，每次用200ul/孔/的PBS将平板冲洗4次。用3％BSA以200ul/孔在室温封阻60分钟。摇动出封阻液。
以150ul/孔将杂交瘤上清加入Corning96孔分析平板中，然后从Corning分析平板的每个孔中移出50ul的上清至ELISA平板中。ELISA平板包括空白培养基以及阳性和阴性小鼠血清对照。在室温温育1-2小时，或在4℃温育过夜。用PBST(PBS+0.05％Tween)以250ul/孔冲洗4次。
加入50ul/孔生物素酰化的抗小鼠IgG H+L，浓度为在含有0.1-0.3％BSA和1％马血清的PBST中0.5ug/ml。在室温温育30-60分钟。用PBST冲洗平板4次。
在平板中加入50ul/孔的ABC试剂(Vector Cat.No.PK-6100)，并在室温温育30分钟。用PBST冲洗平板6次。
制备进行ELISA检测的底物，将1片四甲基联苯胺二盐酸(TMB)(Sigma Cat.No.T-3405)溶解于5ml ddH2O中。加入5ml的0.1M磷酸柠檬酸盐缓冲液(25.7ml的0.2M NaH2PO4，24.3ml的0.1M柠檬酸单水合物，pH5.0)。加入2ul新鲜的30％过氧化氢，旋动并立即使用。
在温育和冲洗平板后，加入100ul底物溶液并在室温温育大约15-30分钟。加入25ul/孔的2M H2SO4终止反应，并在30分钟内在450nm读与对照物相对的平板。实施例45：测试衍生自培养物上清的单克隆的相对亲和性A.确定包被抗原浓度
产生大约1ml的抗原，浓度为4ug/mlPBS。移至微稀释试管中。在9个微稀释管中均加入0.5mlPBS，然后进行1/2系列稀释，通过将此管中0.5mlPBS移至起始的4ug/ml试管中进行。使这9个试管含有4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06，0.03，0.015，和0.0075ug/ml抗原。将平板用上述浓度的抗原以50ul/孔包被，每个平板包被6个孔。
将平板盖上并在4℃温育过夜。在温育后，每次用200ul/孔PBS将平板冲洗4次。用3％BSA以200ul/孔在室温封阻60分钟。摇出封阻液。
观测对抗原是阳性的小鼠血清的滴定曲线。确定在滴定曲线顶部血清稀释度。在B-D排，2-11柱中，加入在含有0.1％BSA的PBS中此稀释度的阳性小鼠血清，50ul/孔。包括以上稀释度的阴性对照血清在E-G排，2-11柱。在4℃温育过夜。在温育之后，在阳性对照血清数值中减去阴性对照血清数值。在线性范围绘制抗抗原浓度的平均值(O.D.450)。确定提供亚最大O.D.值的抗原包被浓度。这即是由于相关亲和分析的包被浓度。B.使用Boehringer Mannheim Biochemica试剂盒“小鼠-IgGELISA”(Cat.No.1333 151)，确定杂交瘤上清样品的小鼠IgG浓度
用ddH2O将包被缓冲液浓缩物稀释1/10。需要10-20ml。获取捕捉抗体等份。将3个试管的包被后缓冲液浓缩物(封阻液)解冻。需要12个孔作为标准及对4-6个孔的上清进行测试。计算假定50ul/孔包被体积所需的稀释的捕捉抗体的ml数。稀释的捕捉抗体比例如下：25ul捕捉抗体/1ml包被缓冲液＝X ul捕捉抗体/# ml包被缓冲液
用溶液包被Nunc平板并在室温在摇动器中温育30分钟。用ddH2O将包被缓冲液浓缩物稀释1/10。用ELISA冲洗缓冲液冲洗平板(0.9％NaCl，0.1％Tween 20)，并用200ul/孔包被后缓冲液(封阻液)在室温封阻15分钟。将IgG标准物在包被后缓冲液(封阻液)中稀释为以下浓度：0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125和0.00625ug/ml。
将上清在封阻液中稀释至终浓度为1/100和1/1000。在封阻后，冲洗平板并以双份加入50ul/孔稀释的IgG标准物和稀释的上清。在摇动器中在室温温育30分钟。
将缀合溶液在包被后缓冲液(封阻液)中根据以下比例稀释：
50ul缀合物/1ml封阻液＝X ul缀合物/#ml封阻液
冲洗平板并加入50ul/孔缀合物。将平板在摇动器中在室温温育30分钟。
将一片底物溶解于5ml底物缓冲液中。冲洗平板并加入50ul/孔底物。在摇动器中在室温温育30分钟，并在405nm读取。A.相关亲和分析
用预先确定浓度的抗原在4℃将适当的ELISA平板包被过夜。如上封阻平板。在PBS+0.1％BSA测试上清中产生1/3系列稀释液。
以双份或三份在ELISA平板中加入50ul/孔上清样品稀释液，包括为稀释的样品。阳性对照组由少量含有相同浓度阳性对照小鼠血清的孔组成，由于确定抗原包被浓度。阴性对照组由少量含有稀释的缓冲液的孔组成。在4℃包被及温育过夜。
在4个适当参数曲线上绘制抗平均值(O.D.450)的每个上清的IgG浓度。偏于左侧的上清曲线是最高亲和性的上清。实施例46：在小鼠体内产生腹水
杂交瘤细胞应是健康的且在对数期生长以产生腹水。将细胞移至15ml试管中并计数。确定含有4×106个细胞的体积，并将此体积移至另一试管中，将细胞离心。将沉淀在0.9ml HBSS(Hank’s平衡盐溶液)中再悬浮并移至微量离心管中。
用1cc针管抽取细胞悬浮液并如下对小鼠进行ip注射：如果起始细胞数为4×106则每只小鼠注射0.2cc，如果起始细胞数为3×106则每只小鼠注射0.3cc。当腹部非常膨大且触之如气球时(通常在第9或10天，但有时晚至第14天)，此时为对小鼠进行放腹水的时候。
A.放腹水
左手握小鼠，并用酒精棉球擦拭小鼠左后肢上方的腹部区域。将小鼠握在15ml离心管口上，将19号针头插入腹部。应将腹水立即经针头末端滴至离心管中。一只小鼠平均应产生3-6ml的腹水。
B.加工和贮存腹水
集合收集自每只小鼠的腹水(所有小鼠均用相同杂交瘤注射)，并置于室温下1-2小时，或在37℃放置15-30分钟。然后将腹水在4℃放置过夜以形成凝块。将凝集的腹水离心10分钟。将液体腹水移至50ml离心管中，并在-20℃贮存。接着可将流出物加入此50ml试管中。当处死所有小鼠后，可解冻集合的腹水，再旋转，并将等份长期贮存于-20℃或-70℃。通过ELISA对腹水进行滴定。
实施例47：冷冻和解冻小鼠杂交瘤和骨髓瘤细胞的方法
A.冷冻
冷冻的细胞应是健康的，在对数期生长且浓度为5-8×105个细胞/ml。将取自6孔平板或烧瓶的再悬浮的细胞移至15ml试管中并计数。计算总细胞数，并分为每瓶1-3×106个细胞，以确定将冷冻的瓶数。
在200-3000×G将细胞离心5-10分钟。从沉淀中吸出上清并再悬浮于充分冷冻的培养基中(DMEM中50％FBS，10％DMSO；或Origen DMSO冷冻培养基(IGEN)，Fisher Cat.No.IG-50-0715)，以达到所需的每ml细胞数/瓶(细胞密度应在5×105-1×107个细胞/瓶范围)。立即将细胞悬浮液移至冷冻瓶中，1ml/瓶，并置于冰上。将冷冻瓶置于控制速度冷冻器中，并将冷冻器置于-70℃过夜。24小时后，将冷冻瓶移至液氮槽中或在-130℃冷冻器中长期贮存。
B.解冻
将10ml冷冻培养基(如P3X培养基)加入15ml试管中。取含有冷冻细胞的冷冻瓶并置于干冰上直至进行解冻。将置于37℃水浴中迅速解冻。在解冻期间握住冷冻瓶并轻轻摇动，直至冷冻瓶中只剩下少量冰块。不要使内容物超过4℃。在冷冻瓶外用乙醇
用无菌巴氏吸管且不接触冷冻瓶的边缘，将瓶中细胞悬浮液移至10ml冷冻培养基中。在200-300×G离心5-10分钟。吸出上清并将沉淀再悬浮于6ml HT克隆培养基中(如前)。移至6孔平皿的1个孔中。在24小时后确定生存力。生存力应不小于50％。实施例48：体外分析血管生成蛋白的活性
以下分析是检测血管生成蛋白活性，优选VEGF-2活性。例如，通过将编码Flt-4受体胞外结构域的核苷酸(SEQ ID NO：27)(Galland等，基因组13(2)：475-478(1992)，以其全文并入参考)，与编码Flk-1的跨膜域和胞内域的核苷酸(SEQ ID NO：28)(Davis-Smith等，EMBO杂志15(18)4919-4927(1996)，以其全文并入参考)融合，产生嵌合受体。因此，嵌合抗体包括分别融合于SEQ IDNO：28的765-1356位氨基酸的SEQ ID NO：27的1-775位氨基酸。
或者，可如上设计嵌合受体，但用红细胞生成素受体(EPOR)的跨膜域和胞内域代替Flk-1受体的跨膜域和胞内域，如Pacifici等，JBC269(3)：1571-1574(1994)所述，以其全文并入参考(见图1)。
将编码嵌合受体的所得DNA克隆入适当的哺乳动物，杆状病毒，或细菌表达载体中，例如pC4，pCDNA3，或pA2中，如前所述。可用于表达嵌合受体的哺乳动物宿主细胞包括NIH3T3(如前)，或前B细胞系BaF3(Achen等，PNAS95(2)：548-553(1998)，以其全文并入参考)。
为测试活性，将血管生成蛋白与表达嵌合受体的细胞系或其提取物接触。然后，可通过测定由嵌合受体转导的任何所得信号，检测与嵌合受体结合的血管生成蛋白。
本领域技术人员清楚对本发明可以与前述不同方式实行。根据上述教导及在所附权利要求范围内，可对本发明加以各种修改和变化。
在发明背景，发明详述，和实施例中所列举的各种文献(包括专利，专利申请，杂志文章，摘要，实验手册，书籍或其它揭示)均以其全文并入参考。另外，文中所列序列并入参考。另外，美国发明应用系列No：08/207412，正在申请的美国专利No：5817485和08/803926均以全文并入参考。
                           序列表<110>人体基因科学有限公司，等<120>血管生成蛋白及其应用<130>PF112PCT5<140>Unassigned<141>2000-06-01<150>60/137，796<151>1999-06-03<160>30<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1308<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1tccgcaaata tgcagaatta ccggccgggt cgctcctgaa gccagcgcgg ggaggcagcg 60cggcggcggc cagcaccggg aacgcaccga ggaagaagcc cagcccccgc cctccgcccc 120ttccgtcccc acccccatcc cggcggccca ggaggctccc cgcgctggcg cgcactccct 180gtttctcctc ctcctggctg gcgctgcctg cctctccgca ctcactgctc gccgggcgcc 240gtccgccagc tccgtgctcc ccgcgccacc ctcctccggg ccgcgctccc taagggatgg 300tactgatttt cgccgccaca ggagaccggc tggagcgccg ccccgcggcc tcgcctctcc 360tccgagcagc cagcgcctcg ggacgcgatg aggaccttgg cttgcctgct gctcctcggc 420tgcggatacc tcgcccatgt tctggccgag gaagccgaga tcccccgcga ggtgatcgag 480aggctggccc gcagtcagat ccacagcatc cgggacctcc agcgactcct ggagatagac 540tccgtaggga gtgaggattc tttggacacc agcctgagag ctcacggggt ccatgccact 600aagcatgtgc ccgagaagcg gcccctgccc attcggagga agagaagcat cgaggaagct 660gtccccgctg tctgcaagac caggacggtc atttacgaga ttcctcggag tcaggtcgac 720cccacgtccg ccaacttcct gatctggccc ccgtgcgtgg aggtgaaacg ctgcaccggc 780tgctgcaaca cgagcagtgt caagtgccag ccctcccgcg tccaccaccg cagcgtcaag 840gtggccaagg tggaatacgt caggaagaag ccaaaattaa aagaagtcca ggtgaggtta 900gaggagcatt tggagtgcgc ctgcgcgacc acaagcctga atccggatta tcgggaagag 960gacacgggaa ggcctaggga gtcaggtaaa aaacggaaaa gaaaaaggtt aaaacccacc 1020taaagcagcc aaccagatgt gaggtgagga tgagccgcag ccctttcctg ggacatggat 1080gtacatggcg tgttacattc ctgaacctac tatgtacggt gctttattgc cagtgtgcgg 1140tctttgttct cctccgtgaa aaactgtgtc cgagaacact cgggagaaca aagagacagt 1200gcacatttgt ttaatgtgac atcaaagcaa gtattgtagc actcggtgaa gcagtaagaa 1260gcttccttgt caaaaagaga gagagagaaa agaaaaaaaa aggaattc              1308<210> 2<211> 211<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 2Met Arg Thr Leu Ala Cys Leu Leu Leu Leu Gly Cys Gly Tyr Leu Ala1               5                  10                  15His Val Leu Ala Glu Glu Ala Glu Ile Pro Arg Glu Val Ile Glu Arg
         20                  25                  30Leu Ala Arg Ser Gln Ile His Ser Ile Arg Asp Leu Gln Arg Leu Leu
     35                  40                  45Glu Ile Asp Ser Val Gly Ser Glu Asp Ser Leu Asp Thr Ser Leu Arg
 50                  55                  60Ala His Gly Val His Ala Thr Lys His Val Pro Glu Lys Arg Pro Leu65                  70                  75                  80Pro Ile Arg Arg Lys Arg Ser Ile Glu Glu Ala Val Pro Ala Val Cys
             85                  90                  95Lys Thr Arg Thr Val Ile Tyr Glu Ile Pro Arg Ser Gln Val Asp Pro
        100                 105                 110Thr Ser Ala Asn Phe Leu Ile Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Lys Arg
    115                 120                  125Cys Thr Gly Cys Cys Asn Thr Ser Ser Val Lys Cys Gln Pro Ser Arg
130                 135                 140Val His His Arg Ser Val Lys Val Ala Lys Val Glu Tyr Val Arg Lys145                 150                 155                 160Lys Pro Lys Leu Lys Glu Val Gln Val Arg Leu Glu Glu His Leu Glu
            165                 170                 175Cys Ala Cys Ala Thr Thr Ser Leu Asn Pro Asp Tyr Arg Glu Glu Asp
        180                 185                 190Thr Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu
    195                 200                 205Lys Pro Thr
210<210> 3<211> 2137<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 3ccctgcctgc ctccctgcgc acccgcagcc tcccccgctg cctccctagg gctcccctcc 60ggccgccagc gcccattttt cattccctag atagagatac tttgcgcgca cacacataca 120tacgcgcgca aaaaggaaaa aaaaaaaaaa aagcccaccc tccagcctcg ctgcaaagag 180aaaaccggag cagccgcagc tcgcagctcg cagcccgcag cccgcagagg acgcccagag 240cggcgagcgg gcgggcagac ggaccgacgg actcgcgccg cgtccacctg tcggccgggc 300ccagccgagc gcgcagcggg cacgccgcgc gcgcggagca gccgtgcccg ccgcccgggc 360ccgccgccag ggcgcacacg ctcccgcccc cctacccggc ccgggcggga gtttgcacct 420ctccctgccc gggtgctcga gctgccgttg caaagccaac tttggaaaaa gttttttggg 480ggagacttgg gccttgaggt gcccagctcc gcgctttccg attttggggg cctttccaga 540aaatgttgca aaaaagctaa gccggcgggc agaggaaaac gcctgtagcc ggcgagtgaa 600gacgaaccat cgactgccgt gttccttttc ctcttggagg ttggagtccc ctgggcgccc 660ccacacggct agacgcctcg gctggttcgc gacgcagccc cccggccgtg gatgctgcac 720tcgggctcgg gatccgccca ggtagcggcc tcggacccag gtcctgcgcc caggtcctcc 780cctgcccccc agcgacggag ccggggccgg gggcggcggc gccgggggca tgcgggtgag 840ccgcggctgc agaggcctga gcgcctgatc gccgcggacc cgagccgagc ccacccccct 900ccccagcccc ccaccctggc cgcgggggcg gcgcgctcga tctacgcgtt cggggccccg 960cggggccggg cccggagtcg gcatgaatcg ctgctgggcg ctcttcctgt ctctctgctg 1020ctacctgcgt ctggtcagcg ccgaggggga ccccattccc gaggagcttt atgagatgct 1080gagtgaccac tcgatccgct cctttgatga tctccaacgc ctgctgcacg gagaccccgg 1140agaggaagat ggggccgagt tggacctgaa catgacccgc tcccactctg gaggcgagct 1200ggagagcttg gctcgtggaa gaaggagcct gggttccctg accattgctg agccggccat 1260gatcgccgag tgcaagacgc gcaccgaggt gttcgagatc tcccggcgcc tcatagaccg 1320caccaacgcc aacttcctgg tgtggccgcc ctgtgtggag gtgcagcgct gctccggctg 1380ctgcaacaac cgcaacgtgc agtgccgccc cacccaggtg cagctgcgac ctgtccaggt 1440gagaaagatc gagattgtgc ggaagaagcc aatctttaag aaggccacgg tgacgctgga 1500agaccacctg gcatgcaagt gtgagacagt ggcagctgca cggcctgtga cccgaagccc 1560ggggggttcc caggagcagc gagccaaaac gccccaaact cgggtgacca ttcggacggt 1620gcgagtccgc cggcccccca agggcaagca ccggaaattc aagcacacgc atgacaagac 1680ggcactgaag gagacccttg gagcctaggg gcatcggcag gagagtgtgt gggcagggtt 1740atttaatatg gtatttgctg tattgccccc atggggcctt ggagtagata atattgtttc 1800cctcgtccgt ctgtctcgat gcctgattcg gacggccaat ggtgcctccc ccacccctcc 1860acgtgtccgt ccacccttcc atcagcgggt ctcctcccag cggcctccgg ctcttgccca 1920gcagctcaag aagaaaaaga aggactgaac tccatcgcca tcttcttccc ttaactccaa 1980gaacttggga taagagtgtg agagagactg atggggtcgc tctttggggg aaacgggttc 2040cttcccctgc acctggcctg ggccacacct gagcgctgtg gactgtcctg aggagccctg 2100aggacctctc agcatagcct gcctgatccc tgaaccc                          2137<210> 4<211> 241<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 4Met Asn Arg Cys Trp Ala Leu Phe Leu Ser Leu Cys Cys Tyr Leu Arg1               5                  10                  15Leu Val Ser Ala Glu Gly Asp Pro Ile Pro Glu Glu Leu Tyr Glu Met
         20                  25                  30Leu Ser Asp His Ser Ile Arg Ser Phe Asp Asp Leu Gln Arg Leu Leu
     35                  40                  45His Gly Asp Pro Gly Glu Glu Asp Gly Ala Glu Leu Asp Leu Asn Met
 50                  55                  60Thr Arg Ser His Ser Gly Gly Glu Leu Glu Ser Leu Ala Arg Gly Arg65                  70                  75                  80Arg Ser Leu Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu
             85                  90                  95Cys Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp
        100                 105                 110Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln
    115                 120                 125Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr
130                 135                 140Gln Val Gln Leu Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg145                 150                 155                 160Lys Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu
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        180                 185                 190Pro Gly Gly Ser Gln Glu Gln Arg Ala Lys Thr Pro Gln Thr Arg Val
    195                 200                 205Thr Ile Arg Thr Val Arg Val Arg Arg Pro Pro Lys Gly Lys His Arg
210                 215                 220Lys Phe Lys His Thr His Asp Lys Thr Ala Leu Lys Glu Thr Leu Gly225                 230                 235                 240Ala<210> 5<211> 1645<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 5gggattcggg ccgcccagct acgggaggac ctggagtggc actgggcgcc cgacggacca 60tccccgggac ccgcctgccc ctcggcgccc cgccccgccg ggccgctccc cgtcgggttc 120cccagccaca gccttaccta cgggctcctg actccgcaag gcttccagaa gatgctcgaa 180ccaccggccg gggcctcggg gcagcagtga gggaggcgtc cagcccccca ctcagctctt 240ctcctcctgt gccaggggct ccccggggga tgagcatggt ggttttccct cggagccccc 300tggctcggga cgtctgagaa gatgccggtc atgaggctgt tcccttgctt cctgcagctc 360ctggccgggc tggcgctgcc tgctgtgccc ccccagcagt gggccttgtc tgctgggaac 420ggctcgtcag aggtggaagt ggtacccttc caggaagtgt ggggccgcag ctactgccgg 480gcgctggaga ggctggtgga cgtcgtgtcc gagtacccca gcgaggtgga gcacatgttc 540agcccatcct gtgtctccct gctgcgctgc accggctgct gcggcgatga gaatctgcac 600tgtgtgccgg tggagacggc caatgtcacc atgcagctcc taaagatccg ttctggggac 660cggccctcct acgtggagct gacgttctct cagcacgttc gctgcgaatg ccggcctctg 720cgggagaaga tgaagccgga aaggtgcggc gatgctgttc cccggaggta acccacccct 780tggaggagag agaccccgca cccggctcgt gtatttatta ccgtcacact cttcagtgac 840tcctgctggt acctgccctc tatttattag ccaactgttt ccctgctgaa tgcctcgctc 900ccttcaagac gaggggcagg gaaggacagg accctcagga attcagtgcc ttcaacaacg 960tgagagaaag agagaagcca gccacagacc cctgggagct tccgctttga aagaagcaag 1020acacgtggcc tcgtgagggg caagctaggc cccagaggcc ctggaggtct ccaggggcct 1080gcagaaggaa agaagggggc cctgctacct gttcttgggc ctcaggctct gcacagacaa 1140gcagcccttg ctttcggagc tcctgtccaa agtagggatg cggattctgc tggggccgcc 1200acggcctggt ggtgggaagg ccggcagcgg gcggagggga ttcagccact tccccctctt 1260cttctgaaga tcagaacatt cagctctgga gaacagtggt tgcctggggg cttttgccac 1320tccttgtccc ccgtgatctc ccctcacact ttgccatttg cttgtactgg gacattgttc 1380tttccggccg aggtgccacc accctgcccc cactaagaga cacatacaga gtgggccccg 1440ggctggagaa agagctgcct ggatgagaaa cagctcagcc agtggggatg aggtcaccag 1500gggaggagcc tgtgcgtccc agctgaaggc agtggcaggg gagcaggttc cccaagggcc 1560ctggcacccc cacaagctgt ccctgcaggg ccatctgact gccaagccag attctcttga 1620ataaagtatt ctagtgtgga aacgc                                       1645<210> 6<211> 149<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 6Met Pro Val Met Arg Leu Phe Pro Cys Phe Leu Gln Leu Leu Ala Gly1               5                  10                  15Leu Ala Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly
         20                  25                  30Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly
     35                  40                  45Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu
 50                  55                  60Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu65                  70                  75                  80Leu Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro
             85                  90                  95Val Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly
        100                 105                 110Asp Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys
    115                 120                 125Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Cys Gly Asp
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         20                  25                  30Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly
     35                  40                  45Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Val Ser
 50                  55                  60Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu65                  70                  75                  80Leu Ara Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asp Leu His Cys Val Pro
             85                  90                  95Val Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly
        100                 105                 110Asp Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys
    115                 120                 125Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Ara Arg Pro
130                 135                 140Lys Gly Ara Gly Lys Arg Ara Ara Glu Lys Gln Arg Pro Thr Asp Cys145                 150                 155                 160His Leu Cys Gly Asp Ala Val Pro Arg Arg
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         20                  25                  30Glu Gln Lys Ala His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg
     35                  40                  45Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr
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             85                  90                  95Ser Glu Ser Asn Val Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln
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        180                 185                 190<210> 11<211> 989<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 11cagtgtgctg gcggcccggc gcgagccggc ccggccccgg tcgggcctcc gaaccatgaa 60ctttctgctg tcttgggtgc attggagcct cgccttgctg ctctacctcc accatgccaa 120gtggtcccag gctgcaccca tggcagaagg aggagggcag aatcatcacg aagtggtgaa 180gttcatggat gtctatcagc gcagctactg ccatccaatc gagaccctgg tggacatctt 240ccaggagtac cctgatgaga tcgagtacat cttcaagcca tcctgtgtgc ccctgatgcg 300atgcgggggc tgctgcaatg acgagggcct ggagtgtgtg cccactgagg agtccaacat 360caccatgcag attatgcgga tcaaacctca ccaaggccag cacataggag agatgagctt 420cctacagcac aacaaatgtg aatgcagacc aaagaaagat agagcaagac aagaaaatcc 480ctgtgggcct tgctcagagc ggagaaagca tttgtttgta caagatccgc agacgtgtaa 540atgttcctgc aaaaacacag actcgcgttg caaggcgagg cagcttgagt taaacgaacg 600tacttgcaga tgtgacaagc cgaggcggtg agccgggcag gaggaaggag cctccctcag 660ggtttcggga accagatctc tcaccaggaa agactgatac agaacgatcg atacagaaac 720cacgctgccg ccaccacacc atcaccatcg acagaacagt ccttaatcca gaaacctgaa 780atgaaggaag aggagactct gcgcagagca ctttgggtcc ggagggcgag actccggcgg 840aagcattccc gggcgggtga cccagcacgg tccctcttgg aattggattc gccattttat 900ttttcttgct gctaaatcac cgagcccgga agattagaga gttttatttc tgggattcct 960gtagacacac cgcggccgcc agcacactg                                   989<210> 12<211> 191<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 12Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu1               5                  10                  15Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
         20                  25                  30Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
     35                  40                  45Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
 50                  55                  60Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu65                  70                  75                  80Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
             85                  90                  95Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
        100                 105                 110Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
    115                 120                 125Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly
130                 135                 140Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr145                 150                 155                 160Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln
            165                 170                 175Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
        180                 185                 190<210> 13<211> 649<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 13aaccatgaac tttctgctct cttgggtgca ctggaccctg gctttactgc tgtacctcca 60ccatgccaag tggtcccagg ctgcacccac gacagaaggg gagcagaaag cccatgaagt 120ggtgaagttc atggacgtct accagcgcag ctattgccgt ccgattgaga ccctggtgga 180catcttccag gagtaccccg atgagataga gtatatcttc aagccgtcct gtgtgcccct 240aatgcggtgt gcgggctgct gcaatgatga agccctggag tgcgtgccca cgtcggagag 300caacgtcact atgcagatca tgcggatcaa acctcaccaa agccagcaca taggagagat 360gagcttcctg cagcatagca gatgtgaatg cagaccaaag aaagatagaa caaagccaga 420aaaaaaatca gttcgaggaa agggaaaggg tcaaaaacga aagcgcaaga aatcccggtt 480taaatcctgg agagttcact gtgagccttg ttcagagcgg agaaagcatt tgtttgtcca 540agatccgcag acgtgtaaat gttcctgcaa aaacacagac tcgcgttgca aggcgaggca 600gcttgagtta aacgaacgta cttgcagatg tgacaagcca aggcggtga             649<210> 14<211> 214<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 14Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Thr Leu Ala Leu Leu Leu1               5                  10                  15Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Thr Thr Glu Gly
         20                  25                  30Glu Gln Lys Ala His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg
     35                  40                  45Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr
 50                  55                  60Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met65                  70                  75                  80Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala Leu Glu Cys Val Pro Thr
             85                  90                  95Ser Glu Ser Asn Val Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln
        100                 105                 110Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Ser Arg Cys Glu
    115                 120                 125Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro Glu Lys Lys Ser Val Arg
130                 135                 140Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Phe Lys145                 150                 155                 160Ser Trp Arg Val His Cys Glu Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu
            165                 170                 175Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp
        180                 185                 190Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg
    195                 200                 205Cys Asp Lys Pro Arg Arg
210<210> 15<211> 1674<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 15gtccttccac catgcactcg ctgggcttct tctctgtggc gtgttctctg ctcgccgctg 60cgctgctccc gggtcctcgc gaggcgcccg ccgccgccgc cgccttcgag tccggactcg 120acctctcgga cgcggagccc gacgcgggcg aggccacggc ttatgcaagc aaagatctgg 180aggagcagtt acggtctgtg tccagtgtag atgaactcat gactgtactc tacccagaat 240attggaaaat gtacaagtgt cagctaagga aaggaggctg gcaacataac agagaacagg 300ccaacctcaa ctcaaggaca gaagagacta taaaatttgc tgcagcacat tataatacag 360agatcttgaa aagtattgat aatgagtgga gaaagactca atgcatgcca cgggaggtgt 420gtatagatgt ggggaaggag tttggagtcg cgacaaacac cttctttaaa cctccatgtg 480tgtccgtcta cagatgtggg ggttgctgca atagtgaggg gctgcagtgc atgaacacca 540gcacgagcta cctcagcaag acgttatttg aaattacagt gcctctctct caaggcccca 600aaccagtaac aatcagtttt gccaatcaca cttcctgccg atgcatgtct aaactggatg 660tttacagaca agttcattcc attattagac gttccctgcc agcaacacta ccacagtgtc 720aggcagcgaa caagacctgc cccaccaatt acatgtggaa taatcacatc tgcagatgcc 780tggctcagga agattttatg ttttcctcgg atgctggaga tgactcaaca gatggattcc 840atgacatctg tggaccaaac aaggagctgg atgaagagac ctgtcagtgt gtctgcagag 900cggggcttcg gcctgccagc tgtggacccc acaaagaact agacagaaac tcatgccagt 960gtgtctgtaa aaacaaactc ttccccagcc aatgtggggc caaccgagaa tttgatgaaa 1020acacatgcca gtgtgtatgt aaaagaacct gccccagaaa tcaaccccta aatcctggaa 1080aatgtgcctg tgaatgtaca gaaagtccac agaaatgctt gttaaaagga aagaagttcc 1140accaccaaac atgcagctgt tacagacggc catgtacgaa ccgccagaag gcttgtgagc 1200caggattttc atatagtgaa gaagtgtgtc gttgtgtccc ttcatattgg caaagaccac 1260aaatgagcta agattgtact gttttccagt tcatcgattt tctattatgg aaaactgtgt 1320tgccacagta gaactgtctg tgaacagaga gacccttgtg ggtccatgct aacaaagaca 1380aaagtctgtc tttcctgaac catgtggata actttacaga aatggactgg agctcatctg 1440caaaaggcct cttgtaaaga ctggttttct gccaatgacc aaacagccaa gattttcctc 1500ttgtgatttc tttaaaagaa tgactatata atttatttcc actaaaaata ttgtttctgc 1560attcattttt atagcaacaa caattggtaa aactcactgt gatcaatatt tttatatcat 1620gcaaaatatg tttaaaataa aatgaaaatt gtatttataa aaaaaaaaaa aaaa       1674<210> 16<211> 419<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 16Met His Ser Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala1               5                  10                  15Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe
         20                  25                  30Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala
     35                  40                  45Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser
 50                  55                  60Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met65                  70                  75                  80Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln
             85                  90                  95Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala
        l00                 105                 110His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys
    ll5                 120                 125Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe
130                 135                 140Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr145                 150                 155                 160Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr
            165                 170                 175Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu
        180                 185                 190Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser
    195                 200                 205Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile
210                 215                 220Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn225                 230                 235                 240Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys
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370                 375                 380Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser385                 390                 395                 400Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Gln Arg Pro
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130                 135                 140Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro145                 150                 155                 160Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala
            165                 170                 175His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala
        180                 185                 190Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala
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130                 135                 140Ser Val Pro Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly Cys145                 150                 155                 160Lys Cys Leu Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser Ile Ile Arg Arg
            165                 170                 175Ser Ile Gln Ile Pro Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu
        180                 185                 190Cys Pro Ile Asp Met Leu Trp Asp Ser Asn Lys Cys Lys Cys Val Leu
    195                 200                 205Gln Glu Glu Asn Pro Leu Ala Gly Thr Glu Asp His Ser His Leu Gln
210                 215                 220Glu Pro Ala Leu Cys Gly Pro His Met Met Phe Asp Glu Asp Arg Cys225                 230                 235                 240Glu Cys Val Cys Lys Thr Pro Cys Pro Lys Asp Leu Ile Gln His Pro
            245                 250                 255Lys Asn Cys Ser Cys Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys
        260                 265                 270Gln Lys His Lys Leu Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg
    275                 280                 285Cys Pro Phe His Thr Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala
290                 295                 300Lys His Cys Arg Phe Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gln Gly Pro His305                 310                 315                 320Ser Arg Lys Asn Pro
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        100                 105                 110Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr
    115                 120                 125Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly
130                 135                 140Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr145                 150                 155                 160Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro
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    195                 200                 205Ile Pro Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu Cys Pro Ile
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    275                 280                 285Ser Cys Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys Gln Lys His
290                 295                 300Lys Leu Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg Cys Pro Phe305                 310                 315                 320His Thr Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys
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         20                  25                  30Ser Gly Cys Lys Pro Arg Pro Met Val Phe Arg Val His Asp Glu His
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130                 135                 140Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser145                 150                 155                 160Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg
            165                 170                 175Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile
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210                 215                 220Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu225                 230                 235                 240Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile
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        260                 265                 270Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe
    275                 280                 285Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu
290                 295                 300Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr305                 310                 315                 320Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met
            325                 330                 335Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala
        340                 345                 350Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly
    355                 360                 365Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr
370                 375                 380Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu385                 390                 395                 400Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val
            405                 410                 415Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val
        420                 425                 430Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr
    435                 440                 445Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu
450                 455                 460Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr465                 470                 475                 480Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys
            485                 490                 495Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys
        500                 505                 510Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr
    515                 520                 525Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser
530                 535                 540Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln545                 550                 555                 560Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser
            565                 570                 575Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro
        580                 585                 590Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr
    595                 600                 605Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile
610                 615                 620Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr625                 630                 635                 640Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val
            645                 650                 655Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn
        660                 665                 670Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys
    675                 680                 685Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn
690                 695                 700Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg705                 710                 715                 720Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr
            725                 730                 735Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe
        740                 745                 750Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu
    755                 760                 765Val Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile
770                 775                 780Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly785                 790                 795                 800Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His
            805                 810                 815Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp
        820                 825                 830Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val
    835                 840                 845Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr
850                 855                 860Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg865                 870                 875                 880Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu
            885                 890                 895Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu
        900                 905                 910Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu
    915                 920                 925Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg
930                 935                 940Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys945                 950                 955                 960Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly
            965                 970                 975Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro
        980                 985                 990Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr
    995                1000                1005Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys1010                1015                1020Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn1025               1030                1035                1040Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp
           1045                1050                1055Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met
       1060                1065                1070Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val
   1075                1080                1085Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser1090                1095                1100Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys1105               1110                1115                1120Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr
           1125                1130                1135Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr
       1140                1145                1150Phe Ser Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala
   1155                1160                1165Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu1170                1175                1180Ser Met Glu Glu Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser1185               1190                1195                1200Cys Met Glu Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn
           1205                1210                1215Thr Ala Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg
       1220                1225                1230Pro Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu
   1235                1240                1245Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu1250                1255                1260Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu Ser Pro1265               1270                1275                1280Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser Val Ala Ser
           1285                1290                1295Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly Tyr His Ser Asp
       1300                1305                1310Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu Ala Glu Leu Leu Lys
   1315                1320                1325Leu Ile Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser Thr Ala Gln Ile Leu Gln1330                1335                1340Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser Pro Pro Val1345               1350                1355<210>29<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<220><221>SITE<222>(2)<223>Xaa equals any amino acid<220><221>SITE<222>(5)<223>Xaa equals any amino acid<220><221>SITE<222>(6)<223>Xaa equals any amino acid<220><221>SITE<222>(7)<223>Xaa equals any amino acid<220><221>SITE<222>(10)<223>Xaa equals any amino acid<400>29Pro Xaa Cys Val Xaa Xaa Xaa Arg Cys Xaa Gly Cys Cys1               5                  10<210>30<211>733<212>DNA<213>Homo sapiens<400>30gggatccgga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg 60aattcgaggg tgcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 120tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg 180tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg 360agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 600acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc 660acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc 720gactctagag gat                                                    733
                 134表
            关于微生物保藏的说明
               (PCT细则13之二) PCT/RO/134表(1992年7月)ATCC保藏号97149加拿大
申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时，才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家，申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威
申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚
申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰
申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。联合王国
申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。丹麦
申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典
申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰
申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时，才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局，以两者中较早日为准。
              关于微生物保藏的说明
                  (PCT细则13之二) PCT/RO/134表(1992年7月)ATCC保藏号75698加拿大
申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时，才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家，申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威
申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚
申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰
申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。联合王国
申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。丹麦
申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典
申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰
申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时，才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局，以两者中较早日为准。

Claims (23)

1.一种分离的核酸分子，包含具有与选自以下一组的序列有至少95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：(a)SEQ ID NO：X的多核苷酸片段，其可与SEQ ID NO：X杂交；(b)编码SEQ ID NO：Y的多肽片段的多核苷酸，其可与SEQ ID
NO：X杂交；(c)编码SEQ ID NO：Y的多肽结构域的多核苷酸，其可与SEQ ID
NO：X杂交；(d)编码SEQ ID NO：Y的多肽表位的多核苷酸，其可与SEQ ID
NO：X杂交；(e)编码SEQ ID NO：Y的多肽的多核苷酸，其可与SEQ ID NO：
X杂交，具有生物活性；(f)是SEQ ID NO：X变体的多核苷酸；(g)是SEQ ID NO：X等位基因变体的多核苷酸；(h)编码SEQ ID NO：Y种间同源物的多核苷酸；(i)在严格杂交条件下，能与(a)-(h)中所述任一种多核苷酸
杂交的多核苷酸，其中所述多核苷酸在严格杂交条件下不与只
有A残基或只有T残基的核苷酸序列的核酸分子杂交。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中多核苷酸片段包含编码分泌蛋白的核苷酸序列。
3.权利要求1的分离的核酸分子，其中多核苷酸片段包含编码与SEQ ID NO：Y的序列的核苷酸序列，其可与SEQ ID NO：X杂交。
4.权利要求1的分离的核酸分子，其中多核苷酸片段包含SEQ IDNO：X的完整核苷酸序列，其可与SEQ ID NO：X杂交。
5.权利要求2的分离的核酸分子，其中核苷酸序列包含在C末端或N末端的顺序核苷酸缺失。
6.权利要求3的分离的核酸分子，其中核苷酸序列包含在C末端或N末端的顺序核苷酸缺失。
7.一种重组的载体，其包含权利要求1的分离的核酸分子。
8.一种产生包含权利要求1的分离的核酸分子的重组宿主细胞的方法。
9.一种通过权利要求8的方法产生的重组宿主细胞。
10.权利要求9的重组宿主细胞，其包含载体序列。
11.一种分离的多肽，包含与选自以下一组的序列至少95％相同的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：Y的多肽片段；
(b)具有生物活性的SEQ ID NO：Y的多肽片段，；
(c)SEQ ID NO：Y的多肽结构域；
(d)SEQ ID NO：Y多肽表位；
(e)SEQ ID NO：Y的分泌形式；
(f)SEQ ID NO：Y的全长蛋白质；
(g)SEQ ID NO：Y的变体；
(h)SEQ ID NO：Y的等位基因变体；或
(i)SEQ ID NO：Y的种间同源物。
12.权利要求11的分离的多肽，其中分泌形式或全长蛋白质包含在C末端或N末端的顺序氨基酸缺失。
13.一种分离的抗体，其特异性结合权利要求11的分离的多肽。
14.一种重组的宿主细胞，其表达权利要求11的分离的多肽。
15.一种制备分离的多肽的方法，包括：
(a)在所述多肽被表达的条件下培养权利要求14的重组宿主细胞；及
(b)回收所述多肽。
16.通过权利要求15的方法产生的多肽。
17.一种预防，治疗或改善医学症状的方法，包括对哺乳动物受试者施用治疗有效量的权利要求11的多肽或权利要求1的多核苷酸。
18.一种诊断受试者中病理状态或对病理状态易感性的方法，包括：
(a)确定权利要求1的多核苷酸中是否有突变；及
(b)基于有或无所述突变诊断病理状态或对病理状态易感性。
19.一种诊断受试者中病理状态或对病理状态易感性的方法，包括：
(a)确定生物样品中权利要求11的多肽的表达的存在或表达量；和
(b)基于多肽表达的存在或量诊断病理状态或对病理状态易感性。
20.一种鉴别权利要求11的多肽的结合配偶体的方法，包括：
(a)将权利要求11的多肽与结合配偶体接触；及
(b)确定结合配偶体是否对多肽活性有作用。
21.相应于SEQ ID NO：Y的cDNA序列的基因。
22.一种鉴别生物分析中活性的方法，其中包括：
(a)在细胞中表达SEQ ID NO：X；
(b)分离上清；
(c)检测生物分析中活性；及
(d)鉴别上清中具有所述活性的蛋白质。
23.通过权利要求20的方法产生的产物。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111487398A (zh) * 2019-01-25 2020-08-04 四川大学华西医院 血管瘤治疗的生物标记物
CN111518218A (zh) * 2006-11-02 2020-08-11 阿塞勒隆制药公司 Alk1受体和配体拮抗剂及其用途
CN111902158A (zh) * 2018-03-22 2020-11-06 儿童医疗中心有限公司 与肺修复有关的方法和组合物
CN113402582A (zh) * 2021-06-19 2021-09-17 江西农业大学 Ank三肽及其应用
CN114042163A (zh) * 2021-12-28 2022-02-15 上海市皮肤病医院 Aldh3a1/il-17轴在制备难治性溃疡药物中的应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932540A (en) 1994-03-08 1999-08-03 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2
US6734285B2 (en) 1994-03-08 2004-05-11 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2 proteins and compositions
ES2249762T3 (es) 1994-03-08 2006-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Factor de crecimiento del endotelio vascular 2.
US7109308B1 (en) 1994-03-08 2006-09-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human vascular endothelial growth factor 2
US7153827B1 (en) 1994-03-08 2006-12-26 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2 and methods of use
US6608182B1 (en) 1994-03-08 2003-08-19 Human Genome Sciences, Inc. Human vascular endothelial growth factor 2
US6040157A (en) 1994-03-08 2000-03-21 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2
US7186688B1 (en) 1994-03-08 2007-03-06 Human Genome Sciences, Inc. Methods of stimulating angiogenesis in a patient by administering vascular endothelial growth factor 2
US7223724B1 (en) 1999-02-08 2007-05-29 Human Genome Sciences, Inc. Use of vascular endothelial growth factor to treat photoreceptor cells
US7273751B2 (en) 2000-08-04 2007-09-25 Human Genome Science, Inc. Vascular endothelial growth factor-2
US7402312B2 (en) 2001-04-13 2008-07-22 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to vascular endothelial growth factor 2 (VEGF-2)
EP2228389B1 (en) 2001-04-13 2015-07-08 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against vascular endothelial growth factor 2
US7981863B2 (en) * 2001-09-19 2011-07-19 Neuronova Ab Treatment of Parkinson's disease with PDGF
ITRM20020277A1 (it) * 2002-05-17 2003-11-17 Geymonat Spa Muteine del fattore di crescita placentare tipo 1, metodo di preparazione e loro applicazioni.
ATE394679T1 (de) 2002-11-16 2008-05-15 Dade Behring Marburg Gmbh Scd40l, papp-a und plazentaler-wachstumsfaktor (pigf) als biochemische markerkombinationen bei kardiovaskulären erkrankungen
EP1560025A3 (en) * 2003-10-03 2011-09-07 F. Hoffmann-La Roche AG Specific markers for diabetes
DE102005022047A1 (de) 2005-05-09 2006-11-30 Dade Behring Marburg Gmbh Bindungspartner des Plazentalen Wachstumsfaktors insbesondere gegen den Plazentalen Wachstumsfaktor gerichtete Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung
DK2274008T3 (da) 2008-03-27 2014-05-12 Zymogenetics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til hæmning af PDGFRBETA og VEGF-A
EP3955948A1 (en) * 2019-04-19 2022-02-23 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Treatment of vascular and lymphatic disease

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111518218A (zh) * 2006-11-02 2020-08-11 阿塞勒隆制药公司 Alk1受体和配体拮抗剂及其用途
CN111902158A (zh) * 2018-03-22 2020-11-06 儿童医疗中心有限公司 与肺修复有关的方法和组合物
CN111487398A (zh) * 2019-01-25 2020-08-04 四川大学华西医院 血管瘤治疗的生物标记物
CN113402582A (zh) * 2021-06-19 2021-09-17 江西农业大学 Ank三肽及其应用
CN114042163A (zh) * 2021-12-28 2022-02-15 上海市皮肤病医院 Aldh3a1/il-17轴在制备难治性溃疡药物中的应用
CN114042163B (zh) * 2021-12-28 2022-11-18 上海市皮肤病医院 Aldh3a1/il-17轴在制备难治性溃疡药物中的应用

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