JPH0965885A

JPH0965885A - エピモルフィン改変体

Info

Publication number: JPH0965885A
Application number: JP8099684A
Authority: JP
Inventors: Shogo Koshida; 将悟越田; Yumiko Oka; 由美子岡; Yohei Hirai; 洋平平井
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1995-03-31
Filing date: 1996-03-29
Publication date: 1997-03-11

Abstract

(57)【要約】【課題】エピモルフィンの生理活性を高度に保持し、
しかも調製及び精製が容易なエピモルフィン改変体及び
その変異体を提供すること。【解決手段】Ｎ末端側にコイルドコイル領域（１）、
中央部に機能ドメイン（２）、Ｃ末端側にコイルドコイ
ル領域（３）、及びＣ末端部に疎水性領域を有するエピ
モルフィンの全長から、Ｃ末端部の疎水性領域が削除さ
れていると共に、コイルドコイル領域（１）及び（３）
のうちの少なくとも一方の末端側から少なくとも一部の
アミノ酸が削除された構造のポリペプチドからなること
を特徴とするエピモルフィン改変体。該エピモルフィン
改変体のアミノ酸配列に、アミノ酸の部分的な置換、欠
失または挿入がなされた変異エピモルフィン改変体。ヒ
ト及びマウスエピモルフィン改変体及びその変異体をコ
ードするＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、及びエ
ピモルフィン改変体またはその変異体の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、間充織細胞に存在
し、上皮組織の形態形成を制御するポリペプチドである
エピモルフィンを改変したエピモルフィン改変体に関
し、さらに詳しくは、上皮組織の形態形成異常に起因す
る疾患の診断法・治療法の開発、あるいは新たな創傷治
癒薬等の開発等に有用なエピモルフィン改変体、及びそ
の変異体に関する。また、本発明は、このようなエピモ
ルフィン改変体及びその変異体をコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターを
導入した形質転換体、及び該形質転換体を用いたエピモ
ルフィン改変体またはその変異体の製造方法に関する。
なお、変異体とは、エピモルフィン改変体の元の配列が
有する機能を実質的に保持する程度において、そのアミ
ノ酸配列に、アミノ酸の部分的な置換、欠失または挿入
がなされた配列をいう。

【０００２】

【従来の技術】上皮組織の正常な形態形成は、間充織細
胞由来の因子による制御を受けていること、また、上皮
組織の形態形成異常に起因する疾患の多くは、そのまわ
りに存在する間充織細胞が原因となることから、古くか
ら間充織細胞が上皮組織の形態形成を支持するメカニズ
ムについて研究がなされている。しかしながら、上皮組
織の形態形成を制御する分子の単離及びその解析は、研
究対象が複雑な系の中で時間的及び空間的な制限を受け
て発現する物質のために、単純化された実験系を作るこ
とができず、今日まで大きな進展は見られていない。上
皮組織の形態形成異常に起因する疾患の診断法・治療法
の開発のためには、このような上皮組織の形態形成を制
御する分子の単離、精製、構造解析等が不可欠の前提で
あり、当該物質の単離、精製、構造解析を早期に達成す
ることが、当該分野における重要課題となっていた。

【０００３】このような状況のなかで最近、本発明者ら
は上皮組織の形態形成を制御する分子の単離に成功し、
当該分子をエピモルフィン（Ｅｐｉｍｏｒｐｈｉｎ）と
命名した（特開平６−２５２９５号公報）。本発明者ら
は、ヒト及びマウスのエピモルフィンの配列を決定する
ことに成功したが、エピモルフィンには、それぞれの遺
伝子のスプライシングにより、各々少なくとも３種のタ
イプが存在する。特開平６−２５２９５号公報に示され
ているように、ヒトエピモルフィンには、２８８個の
アミノ酸からなるヒトエピモルフィン、２８７個のア
ミノ酸からなるヒトエピモルフィンのアイソフォーム
Ａ、及び２７７個のアミノ酸からなるヒトエピモルフ
ィンのアイソフォームＢが存在する。同様に、マウスエ
ピモルフィンには、２８９個のアミノ酸からなるマウ
スエピモルフィン、２８８個のアミノ酸からなるマウ
スエピモルフィンのアイソフォームＡ、及び２７９個
のアミノ酸からなるマウスエピモルフィンのアイソフォ
ームＢが存在する。

【０００４】しかしながら、これらのエピモルフィン
は、生体内で複雑な高次構造を取り、かつ、Ｃ末端に存
在する疎水性の非常に強い領域で細胞膜と結合している
ため、活性を高いレベルで保持したまま分離、精製する
ことは困難であった。細胞膜結合部分が存在すると、培
養動物細胞により産生させたエピモルフィンを培養液中
に分泌させて、分離、精製することが困難である。その
ため、本発明者らは、Ｃ末端の疎水性の非常に強い領域
を取り除く方法を提案したが（特開平６−２５２９５号
公報）、この方法は、高活性の維持と可溶性との両立の
点で、いまだ不十分であった。

【０００５】エピモルフィンの生理活性を高度に保持
し、しかも調製及び精製が容易なエピモルフィン改変体
を得ることができるならば、上皮組織の形態異常に起因
する疾患の発症機序の解明と治療法の開発などに有用で
ある。このようなエピモルフィン改変体は、火傷や手術
後の各種組織の治療、あるいは人工臓器等に直接利用す
ることができるほか、化粧品、育毛剤等の成分としても
利用可能である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、エピ
モルフィンの生理活性を高度に保持し、しかも調製及び
精製が容易なエピモルフィン改変体及びその変異体を提
供することにある。本発明の他の目的は、エピモルフィ
ン改変体及びその変異体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡ
を含有する組換えベクター、該組換えベクターを導入し
た形質転換体、及び該形質転換体を用いたエピモルフィ
ン改変体またはその変異体の製造方法を提供することに
ある。

【０００７】本発明者らは、前記従来技術の問題点を克
服するために鋭意研究した結果、Ｃ末端の疎水性部分が
削除されたエピモルフィンポリペプチドからコイルドコ
イル領域の少なくとも一部を削除することにより、生理
活性を高めることができ、その結果、生理活性と可溶性
とのバランスを所望のものにすることができることを見
いだした。この方法によれば、エピモルフィンの高次構
造や活性に悪影響を及ぼすことなく、上皮組織の形態形
成異常に起因する疾患の診断法・治療法の開発、あるい
は新たな創傷治癒薬等の開発のために有効なエピモルフ
ィン改変体を得ることができる。本発明は、これらの知
見に基づいて完成するに至ったものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】かくして、本発明によれ
ば、Ｎ末端側にコイルドコイル領域（１）、中央部に機
能ドメイン（２）、Ｃ末端側にコイルドコイル領域
（３）、及びＣ末端部に疎水性領域を有するエピモルフ
ィンの全長から、Ｃ末端部の疎水性領域が削除されてい
ると共に、コイルドコイル領域（１）及び（３）のうち
の少なくとも一方の末端側から少なくとも一部のアミノ
酸が削除された構造のポリペプチドからなることを特徴
とするエピモルフィン改変体が提供される。

【０００９】これらのエピモルフィン改変体は、そのア
ミノ酸配列にアミノ酸の部分的な置換、欠失または挿入
がなされた変異体（変異エピモルフィン改変体）であっ
てもよい。また、本発明によれば、前記エピモルフィン
改変体及びその変異体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを
含有する組換えベクター、該組換えベクターを導入した
形質転換体、及び該形質転換体を用いたエピモルフィン
改変体またはその変異体の製造方法が提供される。

【００１０】より具体的に、本発明の実施の態様を示す
と、以下のとおりである。１．Ｎ末端側からコイルドコイル領域（１）の少なくと
も一部のアミノ酸が削除された構造のポリペプチドから
なる前記のエピモルフィン改変体。２．少なくとも機能ドメイン（２）を有する前記のエピ
モルフィン改変体。３．エピモルフィンが、ヒトエピモルフィンである前記
のエピモルフィン改変体。４．コイルドコイル領域（１）のＮ末端から１個以上２
８個までの範囲のアミノ酸が削除された構造のポリペプ
チドからなる第３項に記載のエピモルフィン改変体。５．コイルドコイル領域（１）のＮ末端から２９個以上
７７個までの範囲のアミノ酸が削除された構造のポリペ
プチドからなる第３項に記載のエピモルフィン改変体。６．コイルドコイル領域（１）のＮ末端から７８個以上
１０３個までの範囲のアミノ酸が削除された構造のポリ
ペプチドからなる第３項に記載のエピモルフィン改変
体。

【００１１】７．エピモルフィンが、マウスエピモルフ
ィンである前記のエピモルフィン改変体。８．コイルドコイル領域（１）のＮ末端から１個以上２
９個までの範囲のアミノ酸が削除された構造のポリペプ
チドからなる第７項に記載のエピモルフィン改変体。９．コイルドコイル領域（１）のＮ末端から３０個以上
７８個までの範囲のアミノ酸が削除された構造のポリペ
プチドからなる第７項に記載のエピモルフィン改変体。１０．コイルドコイル領域（１）のＮ末端から７９個以
上１０４個までの範囲のアミノ酸が削除された構造のポ
リペプチドからなる第７項に記載のエピモルフィン改変
体。１１．配列表の配列番号９ないし１１、及び配列番号１
１の１〜８４位のいずれか１つのアミノ酸配列で示され
るヒトエピモルフィン改変体。１２．配列表の配列番号１２ないし１４、及び配列番号
１４の１〜８４位のいずれか１つのアミノ酸配列で示さ
れるマウスエピモルフィン改変体。

【００１２】１３．前記のエピモルフィン改変体のアミ
ノ酸配列に、該エピモルフィン改変体の元の配列が有す
る機能を保持する程度に、部分的なアミノ酸の置換、欠
失または挿入がなされた変異エピモルフィン改変体。１４．前記のエピモルフィン改変体をコードするＤＮ
Ａ。１５．前記の変異エピモルフィン改変体をコードするＤ
ＮＡ。１６．配列表の配列番号１ないし３のいずれか１つの塩
基配列で示されるヒトエピモルフィン改変体をコードす
るＤＮＡ。１７．配列表の配列番号５ないし７のいずれか１つの塩
基配列で示されるマウスエピモルフィン改変体をコード
するＤＮＡ。１８．第１４項または第１５項に記載のＤＮＡを含有
し、ポリペプチドとして発現させることが可能な組換え
ベクター。

【００１３】１９．第１６項に記載のＤＮＡを含有し、
ポリペプチドとして発現させることが可能な組換えベク
ター。２０．第１８項に記載の組換えベクターを導入した形質
転換体。２１．第１９項に記載の組換えベクターを導入した形質
転換体。２２．形質転換体がＥ．ｃｏｌｉである第２０項に記載
の形質転換体。２３．形質転換体がＥ．ｃｏｌｉである第２１項に記載
の形質転換体。２４．第１７項に記載のＤＮＡを含有し、ポリペプチド
として発現させることが可能な組換えベクター。２５．第２４項に記載の組換えベクターを導入した形質
転換体。２６．形質転換体がＥ．ｃｏｌｉである第２５項に記載
の形質転換体。２７．第２０項に記載の形質転換体を用いたエピモルフ
ィン改変体または変異エピモルフィン改変体の製造方
法。２８．第２１項に記載の形質転換体を用いたヒトエピモ
ルフィン改変体の製造方法。２９．第２５項に記載の形質転換体を用いたマウスエピ
モルフィン改変体の製造方法。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳述する。
エピモルフィンは、胎児期の上皮形成に必要な間充織細
胞膜分子であり、生体組織の構築にも関与していると推
定される。エピモルフィンは、各種の胎児組織の正常な
上皮形成を阻害するモノクローナル抗体ＭＣ−１〔Ｃｅ
ｌｌ，Ｖｏｌ．６９，ｐ．４７１−４８１（１９９
２）〕により認識される抗原分子として同定された膜タ
ンパク質である。エピモルフィンは、上皮組織を取り巻
く間充織細胞中に存在しており、上皮組織の形態形成を
制御する等の機能を有している。このようなエピモルフ
ィンは、通常、複雑な立体構造をとりながら、その分子
中のＣ末端の疎水性領域により細胞膜と結合した形で機
能している。エピモルフィンのｃＤＮＡから予測される
物質は、分子量が約３３ｋＤａの分子であるが、生体内
において、この分子は、ＳＤＳ耐性の複合体を複数種形
成し、そのうちの分子量が約１５０ｋＤａの物質が細胞
外に分泌してモノクローナル抗体ＭＣ−１によって認識
されることが判明している。

【００１５】本発明者らは、エピモルフィン全長を構成
するアミノ酸配列をコンピューター解析した結果、図１
に示すように、エピモルフィンは、構造上大きく４個の
フラグメントに分けられることを見いだした。すなわ
ち、エピモルフィンの全長を構成するポリペプチドは、
Ｎ末端側より、コイルドコイル領域（１）、機能ドメイ
ン（２）、コイルドコイル領域（３）、及びＣ末端の疎
水性領域に分けることができる。Ｃ末端の疎水性領域
（膜貫通ドメイン）を除いた領域は、疎水性アミノ酸が
規則正しく並んで（ｈｅｐｔａｄｒｅｐｅａｔｓ）、
いわゆるコイルドコイル構造を取りやすいＮ，Ｃ両末端
のフラグメント〔コイルドコイル領域（１）及び
（３）〕と、それらとほぼ同じ大きさの中央のフラグメ
ント（２）から構成される。このフラグメント（１）及
び（３）は、各々さらに細かく、４つのサブフラグメン
トに分離可能なことを見いだした。図２にフラグメント
（１）の詳細について示す。

【００１６】ヒトエピモルフィンでは、エピモルフィ
ン、エピモルフィンのアイソフォームＡ、及びアイソフ
ォームＢに共通して、フラグメント（１）は、Ｎ末端か
らアミノ酸１０３個目までの領域であり、フラグメント
（２）は、Ｎ末端からアミノ酸１０４個目から１８７個
目までの領域であり、フラグメント（３）は、Ｎ末端か
らアミノ酸１８８個目からＣ末端の疎水性領域の直前ま
での領域である。Ｃ末端の疎水性領域は、一般に、アミ
ノ酸２３〜２４個程度から構成される。

【００１７】マウスエピモルフィンでは、エピモルフィ
ン、エピモルフィンのアイソフォームＡ、及びアイソフ
ォームＢに共通して、フラグメント（１）は、Ｎ末端か
らアミノ酸１０４個目までの領域であり、フラグメント
（２）は、Ｎ末端からアミノ酸１０５個目から１８８個
目までの領域であり、フラグメント（３）は、Ｎ末端か
らアミノ酸１８９個目からＣ末端の疎水性領域の直前ま
での領域である。Ｃ末端の疎水性領域は、一般に、アミ
ノ酸２３〜２４個程度から構成される。

【００１８】本発明者らの研究結果によれば、中央フラ
グメント（２）が機能ドメインであることが判明した。
エピモルフィンの中央部領域に機能ドメインが存在する
ことは、フラグメント（２）やフラグメント（２３）、
フラグメント（１２３）などのフラグメント（２）を含
む各フラグメントと、フラグメント（１３）などのフラ
グメント（２）を含まないフラグメントを作成し、それ
ぞれのモノクローナル抗体ＭＣ−１との反応性、細胞接
着能、あるいはサイトカインＧＭ−ＣＳＦの分泌量を測
定することにより判定することができる。

【００１９】特に、フラグメント（２）及びフラグメン
ト（２３）が、モノクローナル抗体ＭＣ−１と強い反応
性を示すことが分かっている。モノクローナル抗体ＭＣ
−１は、生体内でエピモルフィンの活性を阻害すること
が判明しているので、この中央フラグメント（２）がエ
ピモルフィンの生理活性と密接にかかわっていると推定
できる。

【００２０】細胞接着能については、例えば、８Ｍ尿素
に溶解した各フラグメントをそれぞれ細胞培養用に処理
されていないディッシュ（ｄｉｓｈ）にコートし、８Ｍ
尿素とＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）にて十分に洗浄
して、各フラグメントを薄く均一にコートし、この上で
上皮細胞等を培養し、その応答性を調べることにより判
定することができる。中央フラグメント（２）をコート
したディッシュのみに、種々の上皮細胞が速やかに接着
することが分かった。この接着現象は、モノクローナル
抗体ＭＣ−１を添加することにより阻害される。つま
り、中央フラグメント（２）の部分が直接細胞に作用す
ることが明らかになっている。

【００２１】エピモルフィンの中央フラグメント（２）
が機能ドメインであることは、次の事実からも明らかで
ある。すなわち、特開平６−２５２９５号公報に示され
ているように、エピモルフィンは、上皮組織の形態形成
を促進させる機能をもつが、このことは、分子生物学的
にみると、エピモルフィンが細胞の核内に何らかのシグ
ナルを伝達しているということである。このことを定量
的に確認するには、例えば、細胞が分泌する物質がエピ
モルフィンの投与により増減する現象を定量的に評価す
ればよい。後記の実施例４に示すように、フラグメント
（２）及びフラグメント（１２３）などのフラグメント
（２）を含む各フラグメントを作用させることにより、
細胞（例：Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２ｃｌｏｎｅ８細
胞）が分泌するサイトカインのＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−
マクロファージ−コロニー刺激因子）の分泌量が大幅に
増大することが確認されている。

【００２２】したがって、中央フラグメント（２）がエ
ピモルフィンの機能ドメインであることは明らかであ
る。本発明では、エピモルフィンの機能ドメインの機能
について、細胞接着性、抗体ＭＣ−１との反応性、
及びＧＭ−ＣＳＦの分泌量の変化により確認してい
る。エピモルフィン改変体やその変異体がエピモルフィ
ンが有する機能を実質的に保持しているか否かは、これ
らの機能〜の少なくとも一つを有することを指標と
して容易に確認することができる。ただし、これら〜
は、エピモルフィンの機能の例示であって、エピモル
フィン及びフラグメント（２）の機能は、これらに限定
されるものではない。

【００２３】機能ドメイン（２）は、そのエピモルフィ
ン活性を利用して、各種用途に適用することが期待され
る。しかし、機能ドメイン（２）は、生理的溶液に対し
て殆ど溶けないものである。エピモルフィン全長からＣ
末端部の疎水性領域を削除すると、生理的溶液に対して
可溶性のポリペプチドを得ることができるが、活性の弱
いものである。

【００２４】エピモルフィンの各フラグメントの活性と
可溶性について詳細に解析を進めた結果、フラグメント
（１２３）は可溶性であるが、活性は極めて弱く、逆
に、フラグメント（２３）は、不溶性であるが高活性で
あることを見いだした。このことから、本発明者らは、
フラグメント（１）の働きについて、以下のような仮説
を立てた。すなわち、フラグメント（１）は、活性につ
いては、機能ドメインをマスクするなどの作用によりネ
ガティブに働くが、可溶性の面では、フラグメント（２
３）の高次構造を変化させるなどの作用により、増大さ
せる働きを持っている。

【００２５】そこで、本発明者らは、図３に示すよう
に、エピモルフィン全長からＣ末端部の疎水性領域を
削除したフラグメント（１２３）のＮ末端からアミノ酸
を２８個（ヒトエピモルフィンの場合）または２９個
（マウスエピモルフィンの場合）を削除した２Ｍフラグ
メント、フラグメント（１２３）のＮ末端からアミノ
酸を７７個（ヒトエピモルフィンの場合）または７８個
（マウスエピモルフィンの場合）を削除した３Ｍフラグ
メント、及びフラグメント（１２３）のＮ末端からフ
ラグメント（１）を削除したフラグメント（２３）を作
成し、各特性を解析した。

【００２６】その結果、図３（右側参照）に示したよう
に、Ｎ末端から削除するアミノ酸の数を増やすことによ
り、活性が上昇し、一方では、可溶性が減少するという
関係が明らかになった。したがって、Ｃ末端部の疎水性
領域が削除されているエピモルフィンペプチドの活性と
可溶性の調節は、Ｎ末端から削除するアミノ酸の数の増
減により、コントロールできることが判明した。

【００２７】このように、本発明によれば、上皮組織の
形態形成異常に起因する疾患の診断法・治療法の開発、
あるいは新たな創傷治癒薬等の開発のために、活性と可
溶性を制御できるエピモルフィン改変体の提供が可能と
なった。すなわち、より活性を重視する場合には、Ｎ末
端から削除するアミノ酸の数を増やしたフラグメントを
作成すればよい。ヒトエピモルフィンの場合、活性の高
いエピモルフィン改変体を得るには、Ｎ末端より７８個
以上１０３個までの範囲のアミノ酸が削除された構造の
ポリペプチド、より好ましくは、Ｎ末端より９１個以上
１０３個までの範囲のアミノ酸が削除された構造のポリ
ペプチドを作成すればよい。マウスエピモルフィンの場
合には、活性の高いエピモルフィン改変体を得るには、
Ｎ末端より７９個以上１０４個までの範囲のアミノ酸が
削除された構造のポリペプチド、より好ましくは、Ｎ末
端より９２個以上１０４個までの範囲のアミノ酸が削除
された構造のポリペプチドを作成すればよい。例えば、
フラグメント（２３）を用いればよい。

【００２８】より可溶性を重視する場合には、Ｎ末端か
ら削除するアミノ酸の数を少なくしたフラグメントを作
成すればよい。ヒトエピモルフィンの場合、可溶性の高
いエピモルフィン改変体を得るには、Ｎ末端より１個以
上２８個までの範囲のアミノ酸が削除された構造のポリ
ペプチド、より好ましくは、Ｎ末端より１４個以上２８
個までの範囲のアミノ酸が削除された構造のポリペプチ
ドを作成すればよい。マウスエピモルフィンの場合に
は、可溶性の高いエピモルフィン改変体を得るには、Ｎ
末端より１個以上２９個までの範囲のアミノ酸が削除さ
れた構造のポリペプチド、より好ましくは、Ｎ末端より
１４個以上２９個までの範囲のアミノ酸が削除された構
造のポリペプチドを作成すればよい。例えば、フラグメ
ント（２Ｍ）を用いればよい。

【００２９】また、活性及び可溶性が共にバランスよく
保持されたフラグメントが使いたい場合には、Ｎ末端か
ら削除するアミノ酸の数が上記の中間に位置するフラグ
メントを作成すればよい。ヒトエピモルフィンの場合に
は、Ｎ末端より２９個以上７７個までの範囲のアミノ酸
が削除された構造のポリペプチド、より好ましくは、Ｎ
末端より６１個以上７７個までの範囲のアミノ酸が削除
された構造のポリペプチドを作成すればよい。マウスエ
ピモルフィンの場合には、Ｎ末端より３０個以上７８個
までの範囲のアミノ酸が削除された構造のポリペプチ
ド、より好ましくは、Ｎ末端より６２個以上７８個まで
の範囲のアミノ酸が削除された構造のポリペプチドを作
成すればよい。例えば、フラグメント（３Ｍ）を用いれ
ばよい。

【００３０】このように、本発明のエピモルフィン改変
体は、目的や用途によりその構造を変化させて、使い分
けることがきる。したがって、本発明のエピモルフィン
改変体を使用すれば、上皮組織の形態形成異常に起因す
る疾患の診断法・治療法の開発、あるいは新たな創傷治
癒薬等の開発を、より効率的に進めることが可能とな
る。エピモルフィンは、約２８０個のアミノ酸からなる
タンパク質であり、マウスエピモルフィンは、例えば、
モデル動物を用いた上皮組織の形態形成異常に起因する
疾患の発生メカニズムの解明等に有用である。ヒトエピ
モルフィンは、例えば、上記の疾患の診断・治療等に有
用である。これらの分子は、上皮組織を取り巻く間充織
細胞中に存在しており、上皮組織の形態形成を制御する
等の機能を有している。

【００３１】エピモルフィンのＮ末端からアミノ酸を削
除する方法としては、生化学的手法や遺伝子工学的手法
等の方法を採用することができる。生化学的手法を用い
た方法としては、エピモルフィンを化学的あるいは物理
的に切断し、上記フラグメントを得ることができる。遺
伝子工学的手法を用いた方法としては、各フラグメント
のエピモルフィンをコードするｃＤＮＡを適当なベクタ
ーに組み込んで宿主中で発現させる方法を例示すること
ができる。具体的な方法としては、例えば、次に示すよ
うな手法が簡便なものとして利用できる。

【００３２】まず、エピモルフィン全長をコードするｃ
ＤＮＡ（Ａ）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により
合成し、一方、作成するエピモルフィンのＮ末端、Ｃ末
端の１０ないし２０塩基がつながった一本鎖ＤＮＡ（Ｂ
およびＣ）を各々ＤＮＡ合成装置により作成する。次
に、（Ａ）をテンプレートとし、（Ｂ）及び（Ｃ）をプ
ライマーとし、ＰＣＲにより目的のエピモルフィン改変
体をコードする二本鎖ＤＮＡを得る。

【００３３】得られた二本鎖ＤＮＡは発現するための構
造を備えたベクター、例えば、ｐＥＴ３Ｃ（ＲＩＫＥＮ
ＤＮＡＢａｎｋＲＤＢ５１９）等に組み込み、組
換えベクターを作成する。次にこの組換えベクターを適
当な宿主、例えば、ＢＬ２１（ＲＩＫＥＮＤＮＡＢ
ａｎｋＲＤＢ０２２）等に導入し、形質転換体を得
る。さらに、この形質転換体を大量に増殖させた後、発
現を誘導する処置、例えば、ＩＰＴＧを培地中に終濃度
１ｍＭになるよう添加する等を行い、目的のエピモルフ
ィン改変体を得る。

【００３４】後記の配列表には、ヒトエピモルフィンの
フラグメント（２Ｍ）、（３Ｍ）、（２３）、（２）、
及び（１２３）をコードするＤＮＡ配列が示されてい
る。配列番号１は、ヒトエピモルフィンのフラグメント
（２Ｍ）のＤＮＡ配列、配列番号２は、ヒトエピモルフ
ィンのフラグメント（３Ｍ）のＤＮＡ配列、配列番号３
は、ヒトエピモルフィンのフラグメント（２３）のＤＮ
Ａ配列、そして、配列番号４は、ヒトエピモルフィンの
フラグメント（１２３）のＤＮＡ配列である。配列番号
３のフラグメント（２３）のＤＮＡ配列の１位から２５
２位までがフラグメント（２）のＤＮＡ配列である。

【００３５】配列表には、マウスエピモルフィンのフラ
グメント（２Ｍ）、（３Ｍ）、（２３）、及び（１２
３）をコードするＤＮＡ配列が示されている。配列番号
５は、マウスエピモルフィンのフラグメント（２Ｍ）の
ＤＮＡ配列、配列番号６は、マウスエピモルフィンのフ
ラグメント（３Ｍ）のＤＮＡ配列、配列番号７は、マウ
スエピモルフィンのフラグメント（２３）のＤＮＡ配
列、そして、配列番号８はマウスエピモルフィンのフラ
グメント（１２３）のＤＮＡ配列である。配列番号７の
フラグメント（２３）の１位から２５２位までがフラグ
メント（２）のＤＮＡ配列である。

【００３６】配列表には、ヒトエピモルフィンのフラグ
メント（２Ｍ）、（３Ｍ）、（２）及び（２３）のアミ
ノ酸配列が示されている。配列番号９は、ヒトエピモル
フィンのフラグメント（２Ｍ）のアミノ酸配列、配列番
号１０は、ヒトエピモルフィンのフラグメント（３Ｍ）
のアミノ酸配列、そして、配列番号１１は、ヒトエピモ
ルフィンのフラグメント（２３）のアミノ酸配列であ
る。配列番号１１のフラグメント（２３）の１位から８
４位までがフラグメント（２）のアミノ酸配列である。

【００３７】配列表には、マウスエピモルフィンのフラ
グメント（２Ｍ）、（３Ｍ）、（２）及び（２３）のア
ミノ酸配列が示されている。配列番号１２は、マウスエ
ピモルフィンのフラグメント（２Ｍ）のアミノ酸配列、
配列番号１３は、マウスエピモルフィンのフラグメント
（３Ｍ）のアミノ酸配列、そして、配列番号１４は、マ
ウスエピモルフィンのフラグメント（２３）のアミノ酸
配列である。配列番号１４のフラグメント（２３）の１
位から８４位までがフラグメント（２）のアミノ酸配列
である。

【００３８】本発明により得られたエピモルフィン改変
体を用いることにより、医療をはじめとする種々の用
途、例えば、火傷や手術後の各種組織の治療や人工臓器
等に直接利用できる。また、化粧品、育毛剤等の成分と
しても利用できるなどの利点を有する。本発明のエピモ
ルフィン改変体は、実質的にエピモルフィン活性を保持
している限り、そのアミノ酸配列中に、部分的なアミノ
酸の置換、欠失または挿入がなされた変異体であっても
よい。部分的なアミノ酸の置換、欠失または挿入は、そ
れぞれ単独でなされてもよいが、これらが組み合わされ
たものであってもよい。部分的なアミノ酸の置換、欠失
または挿入がなされるアミノ酸配列の箇所（変異箇所）
は、通常、エピモルフィンの機能ドメイン（２）を含む
ポリペプチドのアミノ酸配列である。この変異箇所は、
エピモルフィンの機能ドメイン（２）のアミノ酸配列で
あってもよい。このような変異体自体は、常法により容
易に作成することが可能である。一般に、蛋白質のアミ
ノ酸配列の一部を置換、欠失または挿入させて、該蛋白
質の変異体を得ること自体は、公知の技術であり、例え
ば、［ＰＣＲ実験マニュアル」（１９９１年、ＨＪＢ出
版局）第１５５〜１６０頁に記載されているリコンビナ
ントＰＣＲ法や「実験医学増刊Ｖｏｌ．８．Ｎｏ．９」
（１９９０、羊土社）第６３〜６７頁に記載されている
ＰＣＲを使った変異遺伝子の作製法により行うことがで
きる。本発明の変異エピモルフィン改変体は、細胞接着
性などのエピモルフィン改変体が有する機能を実質的に
保持しているものであることが好ましい。

【００３９】

【実施例】以下に本発明について実施例を示してより具
体的に説明するが、本発明は、以下の実施例のみに限定
されるものではない。

【００４０】［実施例１］エピモルフィン改変体の作成（１）細胞エピモルフィンを発現している間葉系の細胞、例えば、
大日本製薬（株）で販売しているＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２
ｃｌｏｎｅ８（コード番号０８−２２６）を購入し、説
明書通りに培養した。（２）ＲＮＡの調製ＲＮＡの調製には、ライフテックオリエンタル（株）で
販売しているＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ．
Ｎｏ．１５５９６−０２６）を用いた。製品に添付され
ているプロトコルに従いＲＮＡを調製した。調製後のＲ
ＮＡは、ライフテックオリエンタル（株）製ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎｇｒａｄｅＤＮａｓｅＩ（Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．８０６８ＳＡ）で、製品添付のプロトコル通
り処理した。

【００４１】（３）ＲＴ−ＰＣＲによるエピモルフィン
ｃＤＮＡの調製調製したＲＮＡを元にして宝酒造（株）が販売している
ＲＮＡＰＣＲｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１２）を
用いて、製品添付のプロトコル通り逆転写酵素反応を行
った。次に、エピモルフィンｃＤＮＡのみを増幅するた
めにエピモルフィン特異的上流プライマーと下流プライ
マー（５′ＡＴＧＣＧＧＧＡＣＣＧＧＣＴＧ３′及び
５′ＴＣＡＴＴＴＧＣＣＡＡＣＣＧＡ３′）を用いて、
製品添付のプロトコル通りＰＣＲを行い、エピモルフィ
ンｃＤＮＡを得た。エピモルフィン特異的上流プライマ
ーと下流プライマーは、ベックス（株）に製造を委託し
た。

【００４２】（４）各フラグメントの調製次に、ヒトエピモルフィンのフラグメント（２Ｍ）、
（３Ｍ）、（２３）、及び（１２３）をコードするｃＤ
ＮＡに関し、各々のフラグメント特異的なプライマーの
塩基配列を配列表の配列番号１（ヒト：２Ｍ）、配列番
号２（ヒト：３Ｍ）、配列番号３（ヒト：２３）、及び
配列番号４（ヒト：１２３）より求めた。そして、上流
プライマーの５′側に制限酵素ＮｄｅＩサイト（５′Ｃ
ＡＴＡＴＧ３′）を、また、下流プライマーの５′側に
制限酵素ＮｈｅＩサイト（５′ＧＣＴＡＧＣ３′）を付
加したプライマーを、ベックス（株）より購入した。同
様に、マウスエピモルフィンのフラグメント（２Ｍ）、
（３Ｍ）、（２３）、及び（１２３）をコードするｃＤ
ＮＡに関し、各々のフラグメント特異的なプライマーの
塩基配列を配列表の配列番号５（マウス：２Ｍ）、配列
番号６（マウス：３Ｍ）、配列番号７（マウス：２
３）、及び配列番号８（マウス：１２３）より求めた。
そして、上流プライマーの５′側に制限酵素ＮｄｅＩサ
イト（５′ＣＡＴＡＴＧ３′）を、また、下流プライマ
ーの５′側に制限酵素ＮｈｅＩサイト（５′ＧＣＴＡＧ
Ｃ３′）を付加したプライマーを、ベックス（株）より
購入した。各々のプライマーのペアを用いて、ＰＣＲに
より、各フラグメントを得た。ＰＣＲは、宝酒造（株）
が販売しているＴａｋａｒａＴａｑ（Ｃａｔ．Ｎｏ．
Ｒ００１Ａ）を用いて、製品添付のプロトコル通りに行
った。

【００４３】（５）サブクローニング得られた二本鎖ＤＮＡは、発現するためのベクター、例
えば、ｐＥＴ３Ｃ（ＲＩＫＥＮＤＮＡＢａｎｋＲ
ＤＢ５１９）の２つのＥｃｏＲＶサイトの間の領域を欠
失させたものに、一般的な方法、例えば、「ラボマニュ
アル遺伝子工学」ｐ．１１１〜１１４〔丸善（株）、１
９８８〕に記載されている方法によって組み込み、組換
えベクターを作成した。次に、このベクターを宿主であ
るＢＬ２１（ＲＩＫＥＮＤＮＡＢａｎｋＲＤＢ０２
２）に、「ラボマニュアル遺伝子工学」ｐ．１０８〜１
０９に記載されているＨａｎａｈａｎ法により導入し、
形質転換体を得た。

【００４４】（６）スクリーニングアンピシリンを５０μｇ／ｍｌ含むＬＢプレート（１％
Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％Ｂａｃｔｏ−
ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ、１．５％
Ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）上で生育してくるコロニーを選
ぶことで、形質転換体の１次スクリーニングとした。さ
らに、組換えベクターを有する形質転換体の最終確認と
して、形質転換体に含まれる組換えベクターをテンプレ
ートとし、目的のエピモルフィン改変体特異的な上流プ
ライマーと下流プライマーを用いてＰＣＲを行い、エピ
モルフィンｃＤＮＡの有無を確認した（この時点で１０
ケ中９ケのクローンに該ＤＮＡがあった）。得られた形
質転換体は、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む液体Ｌ
Ｂ培地（１％Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％
Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣ
ｌ）で３７℃で振盪培養により、大量に増殖させた後、
発現を誘導するための物質ＩＰＴＧを培地中に終濃度１
ｍＭになるように添加し、その後２時間、３７℃で振盪
培養を続け、種々のヒト及びマウスエピモルフィン改変
体を大腸菌内で作成させた。大腸菌内の全タンパク質を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動で解析した所、すべてのエ
ピモルフィン改変体がほぼ当量作成されていることがわ
かった。

【００４５】［実施例２］各々のエピモルフィン改変体
の可溶性の検討実施例１により調製した、ヒト及びマウスエピモルフィ
ン改変体を発現させた形質転換体をＬｙｓｉｓバッファ
ー〔５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍ
ＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌ〕に懸濁して洗
い、遠心操作により菌体を沈澱させ、Ｌｙｓｉｓバッフ
ァーに懸濁後、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡＬ−６
８７６）を１ｍｇ／ｍｌになるよう添加し、凍結融解を
３回繰り返して大腸菌を溶菌させ、超音波処理を行っ
た。その後、遠心で上清を除き、沈澱を２ＭＵｒｅａ／
Ｌｙｓｉｓバッファーで４回洗った後、８ＭＵｒｅａ／
Ｌｙｓｉｓバッファーに再懸濁し、遠心操作で上清画分
を得た。得られた上清画分を過剰量のＰＢＳバッファー
に対して透析し、さらに遠心操作により上清と沈澱画分
に分離し、各々の画分に存在する種々のエピモルフィン
改変体の割合により可溶性を検討するため、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥの電気泳動で解析した。その結果、図３に示した
ように、エピモルフィンポリペプチドのＮ末端から削除
するアミノ酸の数が多くなればなるほど溶けにくくなる
傾向が見られた。

【００４６】［実施例３］各々のエピモルフィン改変体
の活性の検討エピモルフィン改変体の活性評価の指標として、培養細
胞との結合性について検討した。実施例２で調製したエ
ピモルフィン改変体（８ＭＵｒｅａ／Ｌｙｓｉｓバッフ
ァーに懸濁しているもの）を浮遊培養用ディッシュに塗
布し、乾燥後、８ＭＵｒｅａ／Ｌｙｓｉｓバッファーで
１回洗った。その後ＰＢＳでディッシュを５回洗い、培
養細胞−Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２ｃｌｏｎｅ８（大日本製
薬（株）０８−２２６）をＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ−Ａ−
７０３０）が２０ｍｇ／ｍｌ添加されたＤ−ＭＥＭ／Ｆ
−１２培地（ＳＩＧＭＡＤ８９００）を用い、ディッ
シュにまいた。１時間、１日後に、各々ディッシュをＰ
ＢＳで３回荒い、次いで、０．５ＮＮａＯＨを用いて細
胞を溶かした後、溶液を回収して更に超音波処理を行っ
た。その後、該溶液中のＤＮＡ量を分光光度計で測定す
ることによりディッシュに結合した細胞数を測定し、各
々のエピモルフィン改変体の活性評価の指標とした。結
果を図３に示すが、活性の程度は可溶性と反対の傾向を
示した。

【００４７】［実施例４］サイトカインＧＭ−ＣＳＦの
分泌量測定１．エピモルフィンのフラグメント（２）及び（１２
３）のＮ末端にヒスチジンが６個連続したタグを付加し
たフラグメント（Ｈ２）及び（Ｈ１２３）を、それぞれ
以下のようにして作製した。ヒスチジンタグの付加は、
可溶性を更に高めるためと、精製目的のために行った。
ヒスチジンタグの付加による機能への影響はない。（Ａ）：マウスエピモルフィンのフラグメント（２）を
コードするｃＤＮＡ。（Ｂ）：（Ａ）のセンス鎖の５′末端の１０ないし２０
塩基である一本鎖ＤＮＡに、該一本鎖ＤＮＡの５′末端
に制限酵素ＮｄｅＩを認識する塩基配列、及びヒスチジ
ンをコードする塩基配列をつなげた一本鎖ＤＮＡ。（Ｃ）：（Ａ）のアンチセンス鎖の５′末端側の１０な
いし２０塩基である一本鎖ＤＮＡに、該一本鎖ＤＮＡの
５′末端に制限酵素ＮｈｅＩを認識する塩基配列をつな
げた一本鎖ＤＮＡ。

【００４８】（１）（Ｂ）及び（Ｃ）をＤＮＡ合成装置
により作成した。（２）（Ａ）をテンプレートとし、（Ｂ）及び（Ｃ）を
プライマーとして、ＰＣＲ法により二本鎖ＤＮＡを得
た。これにより、（Ａ）の塩基配列の５′側に６個のヒ
スチジンをコードする塩基配列をもち、さらに５′末端
にＮｄｅＩサイト、３′末端にＮｈｅＩサイトをもつ二
本鎖ＤＮＡを得た。（３）得られた二本鎖ＤＮＡを、ｐＥＴ３Ｃの２つのＥ
ｃｏＲＶサイト側の領域を欠失させたもののＮｄｅＩ、
ＮｈｅＩサイトに組み込み、組換えベクターを作成し
た。次に、このベクターを宿主である大腸菌ＢＬ２１に
Ｈａｎａｈａｎ法により導入した。（４）この大腸菌を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含
むＬＢプレート（１％Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ、
０．５％Ｂａｃｔｏｙｅａｓｔｅｘｔｒａｘｔ、１
％ＮａＣｌ、１．５％Ｂａｃｔｏａｇａｒ）上に巻き
込み、３７℃で一晩培養した。

【００４９】（５）成育してくるコロニーが組換えベク
ターを有する形質転換体であることの確認として、通常
のＰＣＲ法を行い、目的の変異エピモルフィン改変体を
コードするＤＮＡを増幅した後、アガロースゲル電気泳
動法でそのバンドを確認する操作を行った。（６）得られた形質転換体は、５０μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含む液体ＬＢ培地で３７℃で振盪培養により、大
量に増殖させた後、発現を誘導するための物質ＩＰＴＧ
を培地中に終濃度１ｍＭになるように添加し、その後２
時間振盪培養を続け、種々の変異エピモルフィン改変体
を大腸菌内で作成させた。（７）（６）の大腸菌をＬｙｓｉｓバッファーに懸濁し
て洗い、遠心操作により菌体を沈殿させ、上清を捨てた
後、再度回収し、Ｌｙｓｉｓバッファーに懸濁後Ｌｙｚ
ｏｚｙｍｅを１ｍｇ／ｍｌになるように添加し、凍結融
解を３回繰り返して大腸菌を溶菌させ、超音波処理を行
った。その後、遠心操作で上清を除き、沈殿を２ＭＵｒ
ｅａ／Ｌｙｓｉｓバッファーで４回洗った後、８ＭＵｒ
ｅａ／Ｌｙｓｉｓバッファーに再懸濁し、遠心操作で上
清画分を得た。

【００５０】さらに、ＱＩＡＧＥＮ社のＮｉ²⁺−ＮＴＡ
−Ａｇａｒｏｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．３０２３０）を用い
て、上清画分に含まれるフラグメント（Ｈ２）を添付の
プロトコールに従って精製した。フラグメント（Ｈ１２
３）についても、同様に調製し、精製した。２．フラグメント（Ｈ２）及び（Ｈ１２３）をそれぞ
れ８ＭＵｒｅａ／Ｌｙｓｉｓバッファーを用いて、
０．５μｇ／μｌの濃度に調整した。３．上記２で作製した液をそれぞれ５μｌづつ、組織
培養用の２４ウエルディッシュの各ウエルにコートし、
約１０分間室温で乾燥させた。対照には、８ＭＵｒｅａ
／Ｌｙｓｉｓバッファーのみを用いた。４．次に、各ウエルを８ＭＵｒｅａ／Ｌｙｓｉｓバ
ッファーで１回洗浄し、尿素（Ｕｒｅａ）を除くため、
さらにＰＢＳで５回洗浄を繰り返した。５．その後、１０％の牛胎児血清を含むＤＨ培地に懸
濁したＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２ｃｌｏｎｅ８細胞をコ
ンフルエントになるようにディッシュにまきこんだ。６．３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で１８時間培養後、
培養液を集めてＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージ
−コロニー刺激因子）の含有量をｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎ
ｋｅｄｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ法を用いて説明書の操
作方法に従って定量した（ＥＮＤＯＧＥＮ社のキットを
使用）。結果を表１及び図４に示す。

【００５１】

【表１】表１及び図４の結果から、エピモルフィンのフラグメン
ト（２）及び（１２３）のＮ末端にヒスチジンが６個連
続したタグを付加したフラグメント（Ｈ２）及び（Ｈ１
２３）の添加により、ＧＭ−ＣＳＦの分泌は、２倍以上
に増え、しかも両者は、バラツキの範囲を考慮して同程
度の分泌促進の効果を有していることが分かった。結
局、これらの実験結果から、エピモルフィンのフラグメ
ント（２）が機能ドメインであることが明らかである。

【００５２】［実施例５］変異エピモルフィン改変体の
作製（Ａ）：マウスエピモルフィンのフラグメント（２）を
コードするｃＤＮＡ。（Ｂ）：（Ａ）のセンス鎖の５′末端の１０ないし２０
塩基である一本鎖ＤＮＡに、該一本鎖ＤＮＡの５′末端
に制限酵素ＮｄｅＩを認識する塩基配列をつなげた一本
鎖ＤＮＡ。（Ｃ）：（Ａ）のアンチセンス鎖の５′末端側の１０な
いし２０塩基である一本鎖ＤＮＡに、該一本鎖ＤＮＡの
５′末端に制限酵素ＮｈｅＩを認識する塩基配列をつな
げた一本鎖ＤＮＡ。（１）（Ｂ）及び（Ｃ）をＤＮＡ合成装置により作成し
た。（２）（Ａ）をテンプレートとし、（Ｂ）及び（Ｃ）を
プライマーとして、ＰＣＲ法により二本鎖ＤＮＡを得
た。この際、ＰＣＲ条件は、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ−ａ
ｊｏｕｒｎａｌｏｆｍｅｔｈｏｄｓｉｎｃｅｌ
ｌａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌ．１，Ｎｏ．１（Ａｕｇｕｓｔ），１９８９，ｐ
ｐ．１１−１５に記載の通り行った。これにより、
（Ａ）の塩基配列の一部に置換変異を持つ変異エピモル
フィンフラグメント（２）をコードするＤＮＡ（複数）
を得た。（３）得られたＤＮＡをｐＥＴ３Ｃの２つのＥｃｏＲＶ
サイト側の領域を欠失させたもののＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ
サイトに組み込み、組換えベクターを作成した。次に、
このベクターを宿主である大腸菌ＢＬ２１にＨａｎａｈ
ａｎ法により導入した。

【００５３】（４）この大腸菌を５０μｇ／ｍｌアンピ
シリンを含むＬＢプレート（１％Ｂａｃｔｏｔｒｙｐ
ｔｏｎｅ、０．５％Ｂａｃｔｏｙｅａｓｔｅｘｔｒ
ａｘｔ、１％ＮａＣｌ、１．５％Ｂａｃｔｏａｇａ
ｒ）上に巻き込み、３７℃で一晩培養した。（５）成育してくるコロニーが組換えベクターを有する
形質転換体であることの確認として、通常のＰＣＲ法を
行い、目的の変異エピモルフィン改変体をコードするＤ
ＮＡを増幅した後、アガロースゲル電気泳動法でそのバ
ンドを確認する操作を行った。（６）得られた形質転換体は、５０μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含む液体ＬＢ培地で３７℃で振盪培養により、大
量に増殖させた後、発現を誘導するための物質ＩＰＴＧ
を培地中に終濃度１ｍＭになるように添加し、その後２
時間振盪培養を続け、種々の変異エピモルフィン改変体
を大腸菌内で作成させた。（７）（６）の大腸菌をＬｙｓｉｓバッファーに懸濁し
て洗い、遠心操作により菌体を沈殿させ、上清を捨てた
後、再度回収し、Ｌｙｓｉｓバッファーに懸濁後Ｌｙｚ
ｏｚｙｍｅを１ｍｇ／ｍｌになるように添加し、凍結融
解を３回繰り返して大腸菌を溶菌させ、超音波処理を行
った。その後、遠心操作で上清を除き、沈殿を２ＭＵｒ
ｅａ／Ｌｙｓｉｓバッファーで４回洗った後、８ＭＵｒ
ｅａ／Ｌｙｓｉｓバッファーに再懸濁し、遠心操作で上
清画分を得た。

【００５４】［実施例６］変異エピモルフィン改変体の
アミノ酸配列の決定実施例５（５）のコロニーの大腸菌内のプラスミドＤＮ
Ａをアルカリ法（「ラボマニュアル遺伝子工学」丸善
（株）、第５１〜５３頁、１９８８）で調製し、変異エ
ピモルフィン改変体をコードするＤＮＡの塩基配列をＤ
ＮＡシークエンサーで解析した。これによってコードさ
れるアミノ酸配列を決定し、実施例５で得られた対応す
る変異エピモルフィン改変体のアミノ酸配列として決定
した。

【００５５】［実施例７］変異エピモルフィン改変体の
細胞培養に評価（１）実施例５で調製した変異エピモルフィン改変体
（８ＭＵｒｅａ／Ｌｙｓｉｓバッファーに懸濁している
もの）を、浮遊培養ディッシュに１０μｇ／ｃｍ²にな
るように塗布し、乾燥後、８ＭＵｒｅａ／Ｌｙｓｉｓバ
ッファーで１回洗った。その後、ＰＢＳでディッシュを
５回洗い、培養細胞ＣＨ３／１０Ｔ１／２ｃｌｏｎｅ８
を、ＢＳＡが２０ｍｇ／ｍｌ添加されたＤ−ＭＥＭ／Ｆ
−１２培地（ＳＩＧＭＡＤ８９００）を用いてディッ
シュにまいた。（２）１時間後に、ディッシュをＰＢＳで３回洗った
後、０．５ＮＮａＯＨを用いって細胞を回収した。そ
のＤＮＡ量を反映するＯＤ２６０ｎｍの値を分光光度計
で測定した。その結果、変異していないエピモルフィン
改変体の吸光度が０．３３±０．０１５であるのに対し
て、ほぼこの範囲の吸光度が得られた変異体は６種あっ
た。これより、エピモルフィン改変体には、一部のアミ
ノ酸配列を変異させたものが許容されることが判明し
た。実施例５〜７で作製し、評価したマウスエピモルフ
ィン改変体の変異体（ａ〜ｆ）の変異した部分は、表２
に示す通りであった。

【００５６】

【表２】（＊１）マウスエピモルフィン全長のＮ末端から数えた
番号である。

【００５７】

【発明の効果】本発明によれば、活性と可溶性が共に優
れたエピモルフィン改変体、特に活性に特に優れたエピ
モルフィン改変体、あるいは特に可溶性に特に優れたエ
ピモルフィン改変体が提供される。また、本発明によれ
ば、エピモルフィン改変体のアミノ酸配列に、アミノ酸
の部分的な置換、欠失または挿入がなされた変異体が提
供押される。研究、医療分野等において、その目的によ
って、用いるエピモルフィン改変体またはその変異体を
使い分けることにより、上皮組織の形態形成異常に起因
する疾患の診断法・治療法の開発、あるいは新たな創傷
治癒薬等の開発をより効率的に進めることが可能となっ
た。また、これらのエピモルフィン改変体及びその変異
体は、医療をはじめとする種々の用途、例えば、火傷や
手術後の各種組織の治療や、人工臓器等に直接利用でき
る他、化粧品、育毛剤等の成分としても有用である。

【００５８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：７１１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 ATG GAT GAT TTC TTC CAT CAG GTG GAG GAG AAT AGA AAC AGT ATT GAT 48 AAA ATA ACT CAA TAT GTT GAA GAA GTA AAG AAA AAC CAC AGC ATC ATT 96 CTT TCT GCA CCA AAC CCG GAA GGA AAA ATA AAA GAA GAG CTT GAA GAT 144 CTG AAC AAA GAA ATC AAG AAA ACT GCG AAT AAA ATT CGA GCC AAG TTA 192 AAG GCT ATT GAA CAA AGT TTT GAT CAG GAT GAG AGT GGG AAC CGG ACT 240 TCA GTG GAT CTT CGG ATA CGA AGA ACC CAG CAT TCG GTG CTG TCT CGG 288 AAG TTT GTG GAA GCC ATG GCG GAG TAC AAT GAG GCA CAG ACT CTG TTT 336 CGG GAG CGG AGC AAA GGC CGC ATC CAG CGC CAG CTG GAG ATA ACT GGG 384 AGA ACC ACC ACA GAC GAC GAG CTA GAA GAG ATG CTG GAG AGC GGG AAG 432 CCA TCC ATC TTC ACT TCC GAC ATT ATA TCA GAT TCA CAA ATT ACT AGA 480 CAA GCT CTC AAT GAA ATC GAG TCA CGT CAC AAG GAC ATC ATG AAG CTG 528 GAG ACC AGC ATC CGA GAG TTG CAT GAG ATG TTC ATG GAC ATG GCT ATG 576 TTT GTG GAG ACT CAG GGT GAA ATG ATC AAC AAC ATA GAA AGA AAT GTT 624 ATG AAT GCC ACA GAC TAT GTA GAA CAC GCT AAA GAA GAA ACA AAA AAA 672 GCT ATC AAA TAT CAG AGC AAG GCA AGA AGG AAA AAG TGA 711

【００５９】配列番号：２配列の長さ：５６４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 AAC AAA GAA ATC AAG AAA ACT GCG AAT AAA ATT CGA GCC AAG TTA AAG 48 GCT ATT GAA CAA AGT TTT GAT CAG GAT GAG AGT GGG AAC CGG ACT TCA 96 GTG GAT CTT CGG ATA CGA AGA ACC CAG CAT TCG GTG CTG TCT CGG AAG 144 TTT GTG GAA GCC ATG GCG GAG TAC AAT GAG GCA CAG ACT CTG TTT CGG 192 GAG CGG AGC AAA GGC CGC ATC CAG CGC CAG CTG GAG ATA ACT GGG AGA 240 ACC ACC ACA GAC GAC GAG CTA GAA GAG ATG CTG GAG AGC GGG AAG CCA 288 TCC ATC TTC ACT TCC GAC ATT ATA TCA GAT TCA CAA ATT ACT AGA CAA 336 GCT CTC AAT GAA ATC GAG TCA CGT CAC AAG GAC ATC ATG AAG CTG GAG 384 ACC AGC ATC CGA GAG TTG CAT GAG ATG TTC ATG GAC ATG GCT ATG TTT 432 GTG GAG ACT CAG GGT GAA ATG ATC AAC AAC ATA GAA AGA AAT GTT ATG 480 AAT GCC ACA GAC TAT GTA GAA CAC GCT AAA GAA GAA ACA AAA AAA GCT 528 ATC AAA TAT CAG AGC AAG GCA AGA AGG AAA AAG TGA 564

【００６０】配列番号：３配列の長さ：４８６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 AGT GGG AAC CGG ACT TCA GTG GAT CTT CGG ATA CGA AGA ACC CAG CAT 48 TCG GTG CTG TCT CGG AAG TTT GTG GAA GCC ATG GCG GAG TAC AAT GAG 96 GCA CAG ACT CTG TTT CGG GAG CGG AGC AAA GGC CGC ATC CAG CGC CAG 144 CTG GAG ATA ACT GGG AGA ACC ACC ACA GAC GAC GAG CTA GAA GAG ATG 192 CTG GAG AGC GGG AAG CCA TCC ATC TTC ACT TCC GAC ATT ATA TCA GAT 240 TCA CAA ATT ACT AGA CAA GCT CTC AAT GAA ATC GAG TCA CGT CAC AAG 288 GAC ATC ATG AAG CTG GAG ACC AGC ATC CGA GAG TTG CAT GAG ATG TTC 336 ATG GAC ATG GCT ATG TTT GTG GAG ACT CAG GGT GAA ATG ATC AAC AAC 384 ATA GAA AGA AAT GTT ATG AAT GCC ACA GAC TAT GTA GAA CAC GCT AAA 432 GAA GAA ACA AAA AAA GCT ATC AAA TAT CAG AGC AAG GCA AGA AGG AAA 480 AAG TGA 486

【００６１】配列番号：４配列の長さ：７９５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 ATG CGG GAC CGG CTG CCA GAC CTG ACG GCG TGT AGG AAG AAT GAT GAT 48 GGA GAC ACA GTT GTT GTG GTT GAG AAA GAT CAT TTC ATG GAT GAT TTC 96 TTC CAT CAG GTG GAG GAG ATT AGA AAC AGT ATT GAT AAA ATA ACT CAA 144 TAT GTT GAA GAA GTA AAG AAA AAC CAC AGC ATC ATT CTT TCT GCA CCA 192 AAC CCG GAA GGA AAA ATA AAA GAA GAG CTT GAA GAT CTG AAC AAA GAA 240 ATC AAG AAA ACT GCG AAT AAA ATT CGA GCC AAG TTA AAG GCT ATT GAA 288 CAA AGT TTT GAT CAG GAT GAG AGT GGG AAC CGG ACT TCA GTG GAT CTT 336 CGG ATA CGA AGA ACC CAG CAT TCG GTG CTG TCT CGG AAG TTT GTG GAA 384 GCC ATG GCG GAG TAC AAT GAG GCA CAG ACT CTG TTT CGG GAG CGG AGC 432 AAA GGC CGC ATC CAG CGC CAG CTG GAG ATA ACT GGG AGA ACC ACC ACA 480 GAC GAC GAG CTA GAA GAG ATG CTG GAG AGC GGG AAG CCA TCC ATC TTC 528 ACT TCC GAC ATT ATA TCA GAT TCA CAA ATT ACT AGA CAA GCT CTC AAT 576 GAA ATC GAG TCA CGT CAC AAG GAC ATC ATG AAG CTG GAG ACC AGC ATC 624 CGA GAG TTG CAT GAG ATG TTC ATG GAC ATG GCT ATG TTT GTG GAG ACT 672 CAG GGT GAA ATG ATC AAC AAC ATA GAA AGA AAT GTT ATG AAT GCC ACA 720 GAC TAT GTA GAA CAC GCT AAA GAA GAA ACA AAA AAA GCT ATC AAA TAT 768 CAG AGC AAG GCA AGA AGG AAA AAG TGA 795

【００６２】配列番号：５配列の長さ：７１１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 ATG GAC GGT TTC TTC CAT CAG GTA GAG GAG ATT CGA AGC AGC ATA GCC 48 AGG ATT GCT CAG CAT GTA GAA GAC GTG AAG AAG AAC CAC AGC ATC ATC 96 CTG TCT GCT CCA AAC CCA GAA GGA AAA ATA AAA GAA GAG CTG GAG GAC 144 CTG AAC AAA GAG ATC AAG AAA ACT GCT AAC AGG ATC CGG GGC AAG CTG 192 AAG TCT ATT GAG CAG AGC TGT GAT CAG GAC GAG AAT GGG AAC CGA ACT 240 TCA GTG GAT CTG CGG ATA CGA AGG ACC CAG CAC TCG GTG CTG TCA CGG 288 AAG TTT GTG GAC GTC ATG ACA GAA TAC AAT GAA GCG CAG ATC CTG TTC 336 CGG GAG CGA AGC AAA GGC CGC ATC CAG CGC CAG CTG GAG ATC ACT GGG 384 AGG ACC ACC ACT GAC GAC GAG CTG GAA GAG ATG CTG GAG AGC GGG AAG 432 CCG TCC ATC TTC ATC TCG GAT ATT ATA TCA GAT TCA CAA ATC ACT AGG 480 CAA GCT CTC AAT GAG ATC GAG TCC CGC CAC AAA GAC ATC ATG AAG CTG 528 GAG ACC AGC ATC CGA GAG CTG CAC GAG ATG TTC ATG GAT ATG GCC ATG 576 TTT GTC GAG ACT CAG GGT GAA ATG GTC AAC AAC ATC GAG AGA AAT GTG 624 GTG AAC TCT GTA GAT TAC GTG GAA CAT GCC AAG GAA GAG ACG AAG AAA 672 GCC ATC AAA TAC CAG AGC AAG GCC AGG CGG AAA AAG TGA 711

【００６３】配列番号：６配列の長さ：５６４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 AAC AAA GAG ATC AAG AAA ACT GCT AAC AGG ATC CGG GGC AAG CTG AAG 48 TCT ATT GAG CAG AGC TGT GAT CAG GAC GAG AAT GGG AAC CGA ACT TCA 96 GTG GAT CTG CGG ATA CGA AGG ACC CAG CAC TCG GTG CTG TCA CGG AAG 144 TTT GTG GAC GTC ATG ACA GAA TAC AAT GAA GCG CAG ATC CTG TTC CGG 192 GAG CGA AGC AAA GGC CGC ATC CAG CGC CAG CTG GAG ATC ACT GGG AGG 240 ACC ACC ACT GAC GAC GAG CTG GAA GAG ATG CTG GAG AGC GGG AAG CCG 288 TCC ATC TTC ATC TCG GAT ATT ATA TCA GAT TCA CAA ATC ACT AGG CAA 336 GCT CTC AAT GAG ATC GAG TCC CGC CAC AAA GAC ATC ATG AAG CTG GAG 384 ACC AGC ATC CGA GAG CTG CAC GAG ATG TTC ATG GAT ATG GCC ATG TTT 432 GTC GAG ACT CAG GGT GAA ATG GTC AAC AAC ATC GAG AGA AAT GTG GTG 480 AAC TCT GTA GAT TAC GTG GAA CAT GCC AAG GAA GAG ACG AAG AAA GCC 528 ATC AAA TAC CAG AGC AAG GCC AGG CGG AAA AAG TGA 564

【００６４】配列番号：７配列の長さ：４８６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 AAT GGG AAC CGA ACT TCA GTG GAT CTG CGG ATA CGA AGG ACC CAG CAC 48 TCG GTG CTG TCA CGG AAG TTT GTG GAC GTC ATG ACA GAA TAC AAT GAA 96 GCG CAG ATC CTG TTC CGG GAG CGA AGC AAA GGC CGC ATC CAG CGC CAG 144 CTG GAG ATC ACT GGG AGG ACC ACC ACT GAC GAC GAG CTG GAA GAG ATG 192 CTG GAG AGC GGG AAG CCG TCC ATC TTC ATC TCG GAT ATT ATA TCA GAT 240 TCA CAA ATC ACT AGG CAA GCT CTC AAT GAG ATC GAG TCC CGC CAC AAA 288 GAC ATC ATG AAG CTG GAG ACC AGC ATC CGA GAG CTG CAC GAG ATG TTC 336 ATG GAT ATG GCC ATG TTT GTC GAG ACT CAG GGT GAA ATG GTC AAC AAC 384 ATC GAG AGA AAT GTG GTG AAC TCT GTA GAT TAC GTG GAA CAT GCC AAG 432 GAA GAG ACG AAG AAA GCC ATC AAA TAC CAG AGC AAG GCC AGG CGG AAA 480 AAG TGA 486

【００６５】配列番号：８配列の長さ：７９８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 ATG CGG GAC CGG CTG CCC GAC CTC ACG GCG TGT AGG ACA AAC GAC GAT 48 GGA GAC ACT GCT GTC GTC ATT GTG GAG AAG GAT CAT TTC ATG GAC GGT 96 TTC TTC CAT CAG GTA GAG GAG ATT CGA AGC AGC ATA GCC AGG ATT GCT 144 CAG CAT GTA GAA GAC GTG AAG AAG AAC CAC AGC ATC ATC CTG TCT GCT 192 CCA AAC CCA GAA GGA AAA ATA AAA GAA GAG CTG GAG GAC CTG GAC AAA 240 GAG ATC AAG AAA ACT GCT AAC AGG ATC CGG GGC AAG CTG AAG TCT ATT 288 GAG CAG AGC TGT GAT CAG GAC GAG AAT GGG AAC CGA ACT TCA GTG GAT 336 CTG CGG ATA CGA AGG ACC CAG CAC TCG GTG CTG TCA CGG AAG TTT GTG 384 GAC GTC ATG ACA GAA TAC AAT GAA GCG CAG ATC CTG TTC CGG GAG CGA 432 AGC AAA GGC CGC ATC CAG CGC CAG CTG GAG ATC ACT GGG AGG ACC ACC 480 ACT GAC GAC GAG CTG GAA GAG ATG CTG GAG AGC GGG AAG CCG TCC ATC 528 TTC ATC TCG GAT ATT ATA TCA GAT TCA CAA ATC ACT AGG CAA GCT CTC 576 AAT GAG ATC GAG TCC CGC CAC AAA GAC ATC ATG AAG CTG GAG ACC AGC 624 ATC CGA GAG CTG CAC GAG ATG TTC ATG GAT ATG GCC ATG TTT GTC GAG 672 ACT CAG GGT GAA ATG GTC AAC AAC ATC GAG AGA AAT GTG GTG AAC TCT 720 GTA GAT TAC GTG GAA CAT GCC AAG GAA GAG ACG AAG AAA GCC ATC AAA 768 TAC CAG AGC AAG GCC AGG CGG AAA AAG TGA 798

【００６６】配列番号：９配列の長さ：２３６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Asp Asp Phe Phe His Gln Val Glu Glu Ile Arg Asn Ser Ile Asp 1 5 10 15 Lys Ile Thr Gln Tyr Val Glu Glu Val Lys Lys Asn His Ser Ile Ile 20 25 30 Leu Ser Ala Pro Asn Pro Glu Gly Lys Ile Lys Glu Glu Leu Glu Asp 35 40 45 Leu Asn Lys Glu Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Ile Arg Ala Lys Leu 50 55 60 Lys Ala Ile Glu Gln Ser Phe Asp Gln Asp Glu Ser Gly Asn Arg Thr 65 70 75 80 Ser Val Asp Leu Arg Ile Arg Arg Thr Gln His Ser Val Leu Ser Arg 85 90 95 Lys Phe Val Glu Ala Met Ala Glu Tyr Asn Glu Ala Gln Thr Leu Phe 100 105 110 Arg Glu Arg Ser Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly 115 120 125 Arg Thr Thr Thr Asp Asp Glu Leu Glu Glu Met Leu Glu Ser Gly Lys 130 135 140 Pro Ser Ile Phe Thr Ser Asp Ile Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Arg 145 150 155 160 Gln Ala Leu Asn Glu Ile Glu Ser Arg His Lys Asp Ile Met Lys Leu 165 170 175 Glu Thr Ser Ile Arg Glu Leu His Glu Met Phe Met Asp Met Ala Met 180 185 190 Phe Val Glu Thr Gln Gly Glu Met Ile Asn Asn Ile Glu Arg Asn Val 195 200 205 Met Asn Ala Thr Asp Tyr Val Glu His Ala Lys Glu Glu Thr Lys Lys 210 215 220 Ala Ile Lys Thr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys 225 230 235

【００６７】配列番号：１０配列の長さ：１８７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asn Lys Glu Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Ile Arg Ala Lys Leu Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Gln Ser Phe Asp Gln Asp Glu Ser Gly Asn Arg Thr Ser 20 25 30 Val Asp Leu Arg Ile Arg Arg Thr Gln His Ser Val Leu Ser Arg Lys 35 40 45 Phe Val Glu Ala Met Ala Glu Tyr Asn Glu Ala Gln Thr Leu Phe Arg 50 55 60 Glu Arg Ser Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg 65 70 75 80 Thr Thr Thr Asp Asp Glu Leu Glu Glu Met Leu Glu Ser Gly Lys Pro 85 90 95 Ser Ile Phe Thr Ser Asp Ile Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Arg Gln 100 105 110 Ala Leu Asn Glu Ile Glu Ser Arg His Lys Asp Ile Met Lys Leu Glu 115 120 125 Thr Ser Ile Arg Glu Leu His Glu Met Phe Met Asp Met Ala Met Phe 130 135 140 Val Glu Thr Gln Gly Glu Met Ile Asn Asn Ile Glu Arg Asn Val Met 145 150 155 160 Asn Ala Thr Asp Tyr Val Glu His Ala Lys Glu Glu Thr Lys Lys Ala 165 170 175 Ile Lys Thr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys 180 185

【００６８】配列番号：１１配列の長さ：１６１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ser Gly Asn Arg Thr Ser Val Asp Leu Arg Ile Arg Arg Thr Gln His 1 5 10 15 Ser Val Leu Ser Arg Lys Phe Val Glu Ala Met Ala Glu Tyr Asn Glu 20 25 30 Ala Gln Thr Leu Phe Arg Glu Arg Ser Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln 35 40 45 Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr Thr Asp Asp Glu Leu Glu Glu Met 50 55 60 Leu Glu Ser Gly Lys Pro Ser Ile Phe Thr Ser Asp Ile Ile Ser Asp 65 70 75 80 Ser Gln Ile Thr Arg Gln Ala Leu Asn Glu Ile Glu Ser Arg His Lys 85 90 95 Asp Ile Met Lys Leu Glu Thr Ser Ile Arg Glu Leu His Glu Met Phe 100 105 110 Met Asp Met Ala Met Phe Val Glu Thr Gln Gly Glu Met Ile Asn Asn 115 120 125 Ile Glu Arg Asn Val Met Asn Ala Thr Asp Tyr Val Glu His Ala Lys 130 135 140 Glu Glu Thr Lys Lys Ala Ile Lys Thr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys 145 150 155 160 Lys

【００６９】配列番号：１２配列の長さ：２３６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Asp Gly Phe Phe His Gln Val Glu Glu Ile Arg Ser Ser Ile Ala 1 5 10 15 Arg Ile Ala Gln His Val Glu Asp Val Lys Lys Asn His Ser Ile Ile 20 25 30 Leu Ser Ala Pro Asn Pro Glu Gly Lys Ile Lys Glu Glu Leu Glu Asp 35 40 45 Leu Asn Lys Glu Ile Lys Lys Thr Ala Asn Arg Ile Arg Gly Lys Leu 50 55 60 Lys Ser Ile Glu Gln Ser Cys Asp Gln Asp Glu Asn Gly Asn Arg Thr 65 70 75 80 Ser Val Asp Leu Arg Ile Arg Arg Thr Gln His Ser Val Leu Ser Arg 85 90 95 Lys Phe Val Asp Val Met Thr Glu Tyr Asn Glu Ala Gln Ile Leu Phe 100 105 110 Arg Glu Arg Ser Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly 115 120 125 Arg Thr Thr Thr Asp Asp Glu Leu Glu Glu Met Leu Glu Ser Gly Lys 130 135 140 Pro Ser Ile Phe Ile Ser Asp Ile Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Arg 145 150 155 160 Gln Ala Leu Asn Glu Ile Glu Ser Arg His Lys Asp Ile Met Lys Leu 165 170 175 Glu Thr Ser Ile Arg Glu Leu His Glu Met Phe Met Asp Met Ala Met 180 185 190 Phe Val Glu Thr Gln Gly Glu Met Val Asn Asn Ile Glu Arg Asn Val 195 200 205 Val Asn Ser Val Asp Tyr Val Glu His Ala Lys Glu Glu Thr Lys Lys 210 215 220 Ala Ile Lys Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys 225 230 235

【００７０】配列番号：１３配列の長さ：１８７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asn Lys Glu Ile Lys Lys Thr Ala Asn Arg Ile Arg Gly Lys Leu Lys 1 5 10 15 Ser Ile Glu Gln Ser Cys Asp Gln Asp Glu Asn Gly Asn Arg Thr Ser 20 25 30 Val Asp Leu Arg Ile Arg Arg Thr Gln His Ser Val Leu Ser Arg Lys 35 40 45 Phe Val Asp Val Met Thr Glu Tyr Asn Glu Ala Gln Ile Leu Phe Arg 50 55 60 Glu Arg Ser Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg 65 70 75 80 Thr Thr Thr Asp Asp Glu Leu Glu Glu Met Leu Glu Ser Gly Lys Pro 85 90 95 Ser Ile Phe Ile Ser Asp Ile Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Arg Gln 100 105 110 Ala Leu Asn Glu Ile Glu Ser Arg His Lys Asp Ile Met Lys Leu Glu 115 120 125 Thr Ser Ile Arg Glu Leu His Glu Met Phe Met Asp Met Ala Met Phe 130 135 140 Val Glu Thr Gln Gly Glu Met Val Asn Asn Ile Glu Arg Asn Val Val 145 150 155 160 Asn Ser Val Asp Tyr Val Glu His Ala Lys Glu Glu Thr Lys Lys Ala 165 170 175 Ile Lys Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys 180 185

【００７１】配列番号：１４配列の長さ：１６１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asn Gly Asn Arg Thr Ser Val Asp Leu Arg Ile Arg Arg Thr Gln His 1 5 10 15 Ser Val Leu Ser Arg Lys Phe Val Asp Val Met Thr Glu Tyr Asn Glu 20 25 30 Ala Gln Ile Leu Phe Arg Glu Arg Ser Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln 35 40 45 Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr Thr Asp Asp Glu Leu Glu Glu Met 50 55 60 Leu Glu Ser Gly Lys Pro Ser Ile Phe Ile Ser Asp Ile Ile Ser Asp 65 75 75 80 Ser Gln Ile Thr Arg Gln Ala Leu Asn Glu Ile Glu Ser Arg His Lys 85 90 95 Asp Ile Met Lys Leu Glu Thr Ser Ile Arg Glu Leu His Glu Met Phe 100 105 110 Met Asp Met Ala Met Phe Val Glu Thr Gln Gly Glu Met Val Asn Asn 115 125 125 Ile Glu Arg Asn Val Val Asn Ser Val Asp Tyr Val Glu His Ala Lys 130 135 140 Glu Glu Thr Lys Lys Ala Ile Lys Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys 145 150 155 160 Lys

【図面の簡単な説明】

【図１】エピモルフィンポリペプチド全長の構造上の特
徴を示す図である。

【図２】エピモルフィンフラグメント（１）の構造上の
特徴を示す図である。

【図３】各エピモルフィンフラグメントの活性と可溶性
の関係を示す図である。

【図４】エピモルフィンのフラグメント（２）及び（１
２３）のＮ末端にヒスチジンが６個連続したタグを付加
したフラグメント（Ｈ２）及び（Ｈ１２３）の添加によ
り、細胞が分泌するＧＭ−ＣＳＦの量が増大することを
示すグラフである。

【符号の説明】

１：エピモルフィンのＮ末端側のコイルドコイル領域２：エピモルフィンの機能ドメイン３：エピモルフィンのＣ末端側のコイルドコイル領域

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＳＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｎ末端側にコイルドコイル領域（１）、
中央部に機能ドメイン（２）、Ｃ末端側にコイルドコイ
ル領域（３）、及びＣ末端部に疎水性領域を有するエピ
モルフィンの全長から、Ｃ末端部の疎水性領域が削除さ
れていると共に、コイルドコイル領域（１）及び（３）
のうちの少なくとも一方の末端側から少なくとも一部の
アミノ酸が削除された構造のポリペプチドからなること
を特徴とするエピモルフィン改変体。
【請求項２】Ｎ末端側からコイルドコイル領域（１）
の少なくとも一部のアミノ酸が削除された構造のポリペ
プチドからなる請求項１記載のエピモルフィン改変体。
【請求項３】少なくとも機能ドメイン（２）を有する
請求項１または２記載のエピモルフィン改変体。
【請求項４】エピモルフィンがヒトエピモルフィンで
あって、そのコイルドコイル領域（１）のＮ末端から１
個以上２８個までの範囲のアミノ酸が削除された構造の
ポリペプチドからなる請求項１ないし３のいずれか１項
に記載のエピモルフィン改変体。
【請求項５】エピモルフィンがヒトエピモルフィンで
あって、そのコイルドコイル領域（１）のＮ末端から１
個以上２９個以上７７個までの範囲のアミノ酸が削除さ
れた構造のポリペプチドからなる請求項１ないし３のい
ずれか１項に記載のエピモルフィン改変体。
【請求項６】エピモルフィンがヒトエピモルフィンで
あって、そのコイルドコイル領域（１）のＮ末端から１
個以上７８個以上１０３個までの範囲のアミノ酸が削除
された構造のポリペプチドからなる請求項１ないし３の
いずれか１項に記載のエピモルフィン改変体。
【請求項７】エピモルフィンがマウスエピモルフィン
であって、そのコイルドコイル領域（１）のＮ末端から
１個以上２９個までの範囲のアミノ酸が削除された構造
のポリペプチドからなる請求項１ないし３のいずれか１
項に記載のエピモルフィン改変体。
【請求項８】エピモルフィンがマウスエピモルフィン
であって、そのコイルドコイル領域（１）のＮ末端から
３０個以上７８個までの範囲のアミノ酸が削除された構
造のポリペプチドからなる請求項１ないし３のいずれか
１項に記載のエピモルフィン改変体。
【請求項９】エピモルフィンがマウスエピモルフィン
であって、そのコイルドコイル領域（１）のＮ末端から
７９個以上１０４個までの範囲のアミノ酸が削除された
構造のポリペプチドからなる請求項１ないし３のいずれ
か１項に記載のエピモルフィン改変体。
【請求項１０】配列表の配列番号９ないし１１、配列
番号１１の１〜８４位、配列番号１２ないし１４、及び
配列番号１４の１〜８４位のいずれか１つのアミノ酸配
列で示されるエピモルフィン改変体。
【請求項１１】請求項１ないし１０のいずれか１項に
記載のエピモルフィン改変体のアミノ酸配列に、該エピ
モルフィン改変体の元の配列が有する機能を保持する程
度に、部分的なアミノ酸の置換、欠失または挿入がなさ
れた変異エピモルフィン改変体。
【請求項１２】請求項１ないし１１のいずれか１項に
記載のエピモルフィン改変体または変移エピモルフィン
改変体をコードするＤＮＡ。
【請求項１３】配列表の配列番号１ないし３、及び５
ないし７のいずれか１つの塩基配列で示されるエピモル
フィン改変体をコードするＤＮＡ。