JP2000023674A - 分化を抑制するペプチドと造血幹細胞増殖法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 新規なノッチリガンド遺伝子、及び、細胞刺
激因子との共存により造血幹細胞の分化を抑制し、造血
幹細胞あるいは造血前駆細胞を増殖させることが可能な
ポリペプチドの提供。 【解決手段】 ノッチリガンド（例えば、以下の（Ａ）
又は（Ｂ）のタンパク質）のＤＳＬ領域のアミノ酸配列
の少なくとも一部のアミノ酸配列を有し、かつ、造血幹
細胞及び造血前駆細胞の分化抑制能を有するポリペプチ
ドの存在下で、造血幹細胞または造血前駆細胞を培養す
る。 （Ａ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を有するタ
ンパク質。 （Ｂ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において、
１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入された
アミノ酸配列を有し、かつ、造血幹細胞及び造血前駆細
胞の分化抑制能を有するタンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なノッチリガ
ンド、造血幹細胞及び造血前駆細胞の分化抑制能を有す
るポリペプチド、及びこれらの利用に関する。本発明の
ノッチリガンド及びポリペプチドは、医薬品分野等で有
用である。

【０００２】

【従来の技術】生体内を流れる成熟血液細胞は、短期間
の寿命（ヒトでは赤血球で約１２０日、血小板で約７
日）しかなく、成熟血液細胞は造血前駆細胞から毎日分
化増殖し、末梢血の成熟血液細胞の恒常性を保ってい
る。造血幹細胞は、すべての血液細胞に分化する能力を
持ち、その分化の多能性を維持しながら自己複製するこ
とが可能な細胞と想定されている。そして、この造血幹
細胞が生体内に維持され続けることで、個体の生涯を通
じて血液細胞が供給されるものと考えられる。

【０００３】造血細胞を増殖させる因子としては、SCF
（stem cell factor）、flt-3/flk-2リガンドや、イン
ターロイキン、コロニー刺激因子などが知られている。
これらのサイトカイン等を用いて造血幹細胞を培養する
と、造血幹細胞は多分化能を失い、幹細胞としての性質
が消失する。分化を抑制することで幹細胞、あるいは造
血前駆細胞を未分化な状態に保ち、造血幹細胞、あるい
は造血前駆細胞を増殖あるいは維持することが可能なの
ではないかと考えられる（ WO97/19172）。

【０００４】細胞の分化を抑制的に制御する系として、
ノッチシグナル伝達系が知られている（Egan, S. E., C
urr Top Microbiol Immunol, 228:273, 1998; Artavani
s-Tsakonas, S., Science, 268:225, 1995; Nye, J.S.,
Current Biol., 5:966, 1995）。ショウジョウバエ、
線虫などの下等生物でノッチシグナル伝達系の機能解析
がなされ、細胞の分化を抑制的に制御することが神経細
胞においてもっとも知られている。ノッチシグナル伝達
系は、造血細胞の分化に関しても、T細胞の分化（Robe
y, E., Cell, 87:483, 1996）、好中球の分化に関与す
ることが明らかにされている（Milner, L.A., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 93:13014, 1997）。さらに、造血
幹細胞、あるいは造血前駆細胞に対しても、分化を抑制
する活性が見いだされた（Varnum-Finney, B., Blood,
91:4084, 1998）。

【０００５】ノッチシグナル伝達系は、受容体であるノ
ッチ（Notch）とノッチリガンドの相互作用を介して伝
達される。ノッチ及びノッチリガンドは、ともに膜結合
型の分子である。下等生物であるショウジョウバエでは
ノッチ遺伝子は一つしか存在しないが、哺乳類のノッチ
遺伝子は現在ノッチ−１、ノッチ−２、ノッチ−３、ノ
ッチ−４の４種が知られており、ファミリーを形成して
いる。ノッチファミリーの特徴は、細胞外領域に３６個
程度の多数のEGFモチーフリピートを有し、細胞内のシ
グナル伝達分子の結合領域も類似の構造を有するところ
にある。ショウジョウバエのノッチは、１１番目および
１２番目のEGFモチーフリピートを介し、カルシウム存
在下にノッチリガンドと結合することが知られており
（Fehon, R.G., Cell, 61: 523,1990; Rebay, I., Cel
l, 67:687, 1991） 、哺乳類のノッチについても同様の
機構でリガンドと結合するものと推測されている。EGF
モチーフリピートは、細胞間の情報伝達因子、細胞接着
因子の機能的な領域として広範な遺伝子に存在すること
が知られている。

【０００６】一方、ノッチリガンドも細胞外領域にEGF
モチーフリピートを持ち、EGFモチーフを８個程度有す
るデルタ類縁分子と１５個程度有するセレート（Serrat
e）／ジャグド（Jagged）類縁分子が知られている。ヒ
ト、マウスでは、デルタ類縁遺伝子としてデルタ−１
｛ヒトDelta-1（WO97/19172）、あるいはマウスDll-1
（Bettenhausen, B., Development, 121:2407, 199
5）｝およびマウスDll-3（SallyL., Development, 124:
3065, 1997）が、セレート／ジャグド類縁遺伝子として
ヒト・ジャグド−１／ヒト・セレート−１（Li, L. Imm
unity, 8:43, 1998、WO97/19172）がクローン化されて
いる。さらに、類似遺伝子としてヒト・ジャグド−２／
ヒト・セレート−２（Luo, B., Mol. Cell. Biol., 17:
6057, 1997、WO98/02458）のクローン化がなされてい
る。ノッチリガンドは、EGFリピートに加えて、種間を
越えて非常に保存された領域がN末付近に存在する。こ
の部分を下等生物のノッチリガンドの頭文字に因んでＤ
ＳＬ領域（Delta/Serrate/Lag-2 領域）と命名された
（Henderson, S.T., Development, 120:2913, 1994; Ta
x, F. E., Nature, 368:150, 1994）。このＤＳＬ領域
で保存された配列は、例えばWO97/19172に記載されてい
る（配列番号４４参照）。ＤＳＬ配列はノッチリガンド
に特有な配列であり、ＤＳＬ配列と高い相同性を示すア
ミノ酸配列をコードする遺伝子はノッチリガンドファミ
リーに属すると言って過言でない。

【０００７】ノッチシグナル伝達系を利用して、造血幹
細胞の分化を抑制し、造血幹細胞あるいは造血前駆細胞
を増殖させることも可能と考えられた（WO97/19172）。
ノッチシグナル伝達系の造血幹細胞あるいは造血前駆細
胞に対する作用に関しては、これまでにいくつかの知見
がある。Liらは、ジャグド−１を様々な形で発現させ、
その活性を検討した（Li, L. Immunity, 8:43, 199
8）。すなわち、ラットジャグド−１全長を付着性細胞
に発現させた場合、または細胞外領域に６個のヒスチジ
ンからなるタグを付加して可溶化型にした場合、さらに
はＤＳＬ領域の１７アミノ酸に相当する合成ペプチドを
用いた場合について、その活性を検討した。マウス前骨
髄球細胞株32Dは、G-CSFの刺激により好中球へ分化する
能力を持つが、マウスノッチ−１遺伝子を32D細胞に強
制発現させ、上記の種々のヒトジャグド−１又はその部
分ペプチドを作用させた。その結果、これらすべての分
子について32D細胞の好中球への分化を抑制する活性が
確認された。この結果は、ＤＳＬの部分ペプチドがノッ
チとの結合領域として機能することを示している。

【０００８】Varnum-Finneyらは、ヒト・ジャグド−１
を接着細胞に発現させ、あるいはヒト・ジャグド−１の
細胞外領域をビーズに固定化し、マウスの造血前駆細
胞、造血幹細胞に作用させた（Varnum-Finney, B., Blo
od, 91:4084, 1998）。その結果、いずれの場合にもヒ
トジャグド−１は、造血前駆細胞、造血幹細胞の分化を
抑制する活性を示した。

【０００９】WO97/19172には、サイトカインによるヒト
臍帯血CD34陽性血液細胞の分化が、ヒト・セレート−
１、ヒト・デルタ−１より抑制されることが開示されて
いる。これらの知見は、ノッチリガンドの造血幹細胞あ
るいは造血前駆細胞の分化を抑制しつつ増殖させる系で
の有効性を示唆している。

【００１０】ところで、ノッチリガンドは、種間を越え
て保存されており、その保存されたアミノ酸配列に基づ
いて作製した核酸プローブを用いたハイブリダイゼーシ
ョンにより、あるいは縮重プライマーを用いてRT-PCR法
により、ノッチリガンドの相同遺伝子をクローン化する
ことが可能と考えられる。

【００１１】WO97/19172では、ノッチリガンドのサブフ
ァミリーであるデルタ、ならびにセレート／ジャグドの
それぞれのEGFモチーフ領域をもとに作製した縮重プラ
イマーを用いてＰＣＲを行い、それぞれのヒトの相同遺
伝子（オーソログ）の単離を行っている。WO98/02458で
は、セレート−１に相同性を有するＥＳＴ配列からプロ
ーブを作製し、ヒト胎児脳ライブラリーよりハイブリダ
イゼーションによりセレート−２の遺伝子を取得してい
る。Liらは、ラット・ジャグド−１のＤＳＬ領域内とEG
Fモチーフ部位のアミノ酸配列から作製した縮重プライ
マーを用いてPCRを行い、ヒト・ジャグド−１（オーソ
ログ）の単離を行っている（Li, L. Immunity, 8:43, 1
998）。Luoらは、ＤＮＡデータベースのなかにラット・
セレート／ジャグド相同遺伝子（オーソログ）を発見
し、ジャグド−２をクローン化している（Luo B., Mol.
Cel. Biol., 17:6057, 1997）。これらのオーソログ間
のアミノ酸配列の相同性は８０％程度と非常に高いもの
である。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、これま
での研究により得られた知見は、ノッチリガンドまたは
その部分ペプチドが、造血幹細胞あるいは造血前駆細胞
を増殖させるのに有効であることを示唆してはいるが、
その有効性は明らかではない。本発明は、かかる観点か
らなされたものであり、新規なノッチリガンド遺伝子、
及び、造血幹細胞の分化を抑制し、細胞刺激因子との共
存により造血幹細胞あるいは造血前駆細胞を増殖させる
ことが可能なポリペプチド、並びにこれらの用途を提供
することを課題とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために、新規なノッチリガンド遺伝子の探索を
試みた。その際、前述のように、ノッチリガンドの種間
相同遺伝子（オーソログ）間の相同性が非常に高いこと
から、公知のノッチリガンド遺伝子の単離法では、ノッ
チリガンドサブファミリーのそれぞれの遺伝子について
オーソログを単離することしかできず、オーソログ以外
の遺伝子の単離は不可能であると考えた。そこで本発明
者らは、ＰＣＲに用いる縮重プライマーを鋭意工夫して
設計することで、EGFモチーフを有する遺伝子をクロー
ン化する方法を確立し、既知のＤＳＬ領域と高い相同性
を示す新規遺伝子のクローン化に成功した。さらに、該
遺伝子がコードするポリペプチドおよび公知のノッチリ
ガンドの部分ペプチドが、造血幹細胞の分化を抑制し、
細胞刺激因子との共存により造血幹細胞あるいは造血前
駆細胞を増殖させることができることを見出し、本発明
を完成させた。

【００１４】すなわち本発明は、以下の（Ａ）又は
（Ｂ）のタンパク質である。 （Ａ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を有するタ
ンパク質。 （Ｂ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において、
１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入された
アミノ酸配列を有し、かつ、造血幹細胞及び造血前駆細
胞の分化抑制能を有するタンパク質。

【００１５】本発明はまた、以下の（ａ）又は（ｂ）の
ＤＮＡからなるノッチリガンドLDE-1遺伝子を提供す
る。 （ａ）配列番号１又は３に示す塩基配列を有するＤＮ
Ａ。 （ｂ）前記（ａ）のＤＮＡと相同性が６０％以上の塩基
配列を有し、かつ、造血幹細胞及び造血前駆細胞の分化
抑制能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【００１６】本発明はさらに、ノッチリガンドのＤＳＬ
領域のアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を
有し、かつ、造血幹細胞及び造血前駆細胞の分化抑制能
を有するポリペプチド（配列番号２５に示すアミノ酸配
列を有するポリペプチドを除く）を提供する。

【００１７】また、本発明は、前記ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを提供する。さらに、本発明は、ノッチリ
ガンドのＤＳＬ領域のアミノ酸配列の少なくとも一部の
アミノ酸配列を有し、かつ、造血幹細胞及び造血前駆細
胞の分化抑制能を有するポリペプチド又は前記タンパク
質の存在下で造血幹細胞または造血前駆細胞を培養する
ことを含む、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖方法
を提供する。

【００１８】本発明はまた、ノッチリガンドのＤＳＬ領
域のアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を有
し、かつ、造血幹細胞及び造血前駆細胞の分化抑制能を
有するポリペプチド又は前記タンパク質を構成成分とし
て含む、造血幹細胞および造血前駆細胞の生体外増幅用
試薬または試薬キットを提供する。

【００１９】またさらに、本発明は前記タンパク質また
はポリペプチドをコードするＤＮＡが導入されて形質転
換された形質転換細胞を提供する。

【００２０】尚、Taxら（Henderson, S.T., Developmen
t, 120:2913, 1994; Tax, F. E., Nature, 368:150, 19
94）によりノッチリガンドのＮ末端近傍の４５アミノ酸
残基からなる領域として命名されたものをＤＳＬ領域と
して定義する。

【００２１】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００２２】＜１＞新規ノッチリガンドLDE-1及びそれ
をコードするＤＮＡ 本発明のタンパク質は、LDE-1と命名された新規なノッ
チリガンドであり、造血幹細胞及び造血前駆細胞に対し
て、分化を抑制する作用を有する。LDE-1は、公知のノ
ッチリガンドのＤＳＬ領域と高い相同性を示す配列を含
むことから、ノッチリガンドであると推測された。これ
まで、幅広い生物種において多くのノッチリガンド遺伝
子がクローン化されているが（Egan,S.E., Curr. Top.
Microbiol. Immunol., 228:273, 1998）、LDE-1とアミ
ノ酸配列及び塩基配列で６０％以上の相同性を示すノッ
チリガンドは報告されておらず、全く新規なタンパク質
であると考えられる。

【００２３】本発明のタンパク質は、後述するLDE-1を
コードするＤＮＡ（LDE-1遺伝子）を適当な宿主細胞に
導入して形質転換細胞を調製し、該形質転換細胞中で前
記ＤＮＡを発現させることによって製造することができ
る。LDE-1遺伝子として、配列番号１に示す塩基配列を
有するＤＮＡを用いれば、マウス由来のLDE-1が、配列
番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡを用いれば、ヒト
由来のLDE-1が得られる。マウス由来のLDE-1は配列番号
２に示すアミノ酸配列を、ヒト由来のLDE-1は配列番号
４に示すアミノ酸配列を、それぞれ有する。

【００２４】LDE-1遺伝子を発現させるための宿主とし
ては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、酵母
等の微生物、動物又は植物由来の培養細胞等が用いられ
る。宿主としては、哺乳動物由来の培養細胞が好まし
い。

【００２５】LDE-1遺伝子の宿主細胞への導入は、例え
ば、宿主に対応したベクターに、LDE-1遺伝子を発現可
能な形態で組み込み、得られる組換えベクターを宿主細
胞に導入することによって行うことができる。

【００２６】哺乳動物由来の培養細胞としては、CHO細
胞、293細胞、COS7細胞等が挙げられる。LDE-1遺伝子を
発現させるためのプロモーターなどの発現調節配列は、
LDE-1遺伝子固有のものであっても、他の遺伝子由来の
もの、例えばサイトメガロウイルスプロモーター、エロ
ンゲーションファクター１プロモーター等であってもよ
い。

【００２７】また、動物培養細胞用のベクターとして
は、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、ア
デノウイルスベクター（Neering, S.J., Blood, 88:114
7, 1996）、ヘルペスウイルスベクター（Dilloo, D., Bl
ood, 89:119, 1997）、HIVベクターなどが挙げられる。

【００２８】組換えベクターを培養細胞に導入するに
は、培養細胞の形質転換に通常用いられている方法、例
えば、リン酸カルシウム共沈殿法、リポソーム法、ＤＥ
ＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイ
クロインジェクション法等が用いられる。

【００２９】本発明のタンパク質には、配列番号２又は
４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質に加えて、配
列番号２又は４に示すアミノ酸配列において、１若しく
は数個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されたアミノ酸
配列を有し、かつ、造血幹細胞及び造血前駆細胞の分化
抑制能を有するタンパク質も含まれる。すなわち、マウ
ス及びヒト由来のLDE-1にアミノ酸が置換、欠失又は挿
入等の修飾を加えたものであっても、LDE-1の本質的な
機能を保持するものは、LDE-1と実質的に同等なものと
みなすことができる。前記「数個」とは、本発明のタン
パク質の領域によっても異なるが、全体では２〜２７４
個、好ましくは２〜１０３個、ＤＳＬ領域内では２〜２
３個、好ましくは２〜７個である。このような修飾され
たLDE-1は、LDE-1をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡを保
持する宿主を変異剤で処理するか、または該ＤＮＡに部
位特異的変異法によって特定の部位のアミノ酸が置換、
欠失又は挿入されるように変異を導入することによっ
て、取得することができる。得られた変異タンパク質
が、造血幹細胞及び造血前駆細胞に対する分化抑制能を
保持することは、ノッチ遺伝子を強制発現させた前骨髄
球細胞株32Dに対する分化抑制活性（Li, L. Immunity,
8:43, 1998）、造血幹細胞、造血前駆細胞のコロニー形
成に対する作用（WO97/19172、Varnum-Finney, B., Blo
od, 91:4084, 1998）、本願実施例５に記載の造血幹細
胞の骨髄再構築能維持能によって確認することができ
る。

【００３０】上記マウス由来のLDE-1又はヒト由来のLDE
-1をコードするＤＮＡは、本発明によってそれらの塩基
配列が明らかにされたので、それらの配列に基づいて作
製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲに
よって、又は該配列に基づいて作製したオリゴヌクレオ
チドをプローブとするハイブリダイゼーションによっ
て、マウス又はヒトのｃＤＮＡライブラリーもしくは染
色体ＤＮＡライブラリーから、単離することによっても
取得することができる。本発明のＤＮＡは、本発明を完
成するに際しては、後述するように、ＰＣＲ及びハイブ
リダイゼーションによってマウス肝臓由来ｃＤＮＡライ
ブラリー等から単離され（マウスLDE-1遺伝子）、さら
に得られたマウスLDE-1を用いてヒト脳由来のｃＤＮＡ
ライブラリー等からＰＣＲ及びハイブリダイゼーション
によって得られた（ヒトLDE-1遺伝子）ものである。

【００３１】前述のようにWO97/19172では、異種生物の
デルタからヒトデルタを、異種生物のセレート/ジャグ
ド−１からヒトセレート/ジャグド−１を見いだしてい
る。この方法では、異種の生物に存在する分子のオーソ
ログしか発見することはできない。本発明者らは、ノッ
チ、ノッチリガンドのような多数のEGFリピートを有す
る遺伝子に新たな保存性のある配列を見いだした。この
配列を利用すれば異種においても発見されていない新規
なノッチリガンドの発見ができるものと考えられた。す
なわち、多数のEGFモチーフリピートを有する分子の中
にC(KR)NGGTC(QK)D（配列番号５）の配列を含むEGFモチ
ーフ、あるいはY(HNK)C(MIN)C(NEDK)(MKNQP)GY（配列番
号６）の配列を含むEGFモチーフが存在することを見出
した。そこで、C(KR)NGGTC(QK)Dに対してKUR-1（配列番
号７）、およびY(HNK)C(MIN)C(NEDK)(MKNQP)GYに対して
DEL-2（配列番号８）のこれらのアミノ酸配列をカバー
し得るような縮重プライマーを合成し、このプライマー
を用いて種々の臓器由来のcDNAを鋳型としてPCRを実施
することで、新規なノッチリガンドであるLDE-1の発見
に成功した。

【００３２】PCRによって得られたLDE-1の部分配列の
内、KUR-1に相当する部分はCRNGGSCKD（配列番号１及び
２においてアミノ酸番号３３４〜３４２に相当）であ
り、DEL-2に相当する部分はFVCNCPYGFVG（配列番号１及
び２においてアミノ酸番号５０５〜５１５に相当）であ
る。これらの配列は、アミノ酸配列としては当初見いだ
した保存性の高い配列とは相同性が低いが、KUR-1ある
いはDEL-2の塩基配列とはそれぞれ２塩基、４塩基の違
いしかなく、本発明者らが設計したプライマーを用いて
十分クローン化されてくる配列である。

【００３３】マウスの胎仔肝臓由来のｃＤＮＡを鋳型と
して、上記プライマーを用いてＰＣＲを行うことによっ
て、配列番号１の塩基番号１０２４〜１４１９に相当す
る塩基配列を有するマウスLDE-1 ｃＤＮＡの部分配列が
取得される。次に、マウスｃＤＮＡライブラリーから、
前記LDE-1 ｃＤＮＡ部分配列又はその一部をプローブと
するハイブリダイゼーションによってLDE-1全長を含む
クローンを単離する。前記プローブは、例えば、配列番
号１１及び１２に示す塩基配列を有するプライマーを用
い、上記LDE-1 ｃＤＮＡ部分配列を鋳型とするＰＣＲに
よって、調製することができる。得られたクローンがコ
ード領域全長を含んでいない場合は、ＲＡＣＥ法によっ
てｃＤＮＡ末端領域を取得すればよい（中山広樹、バイ
オ実験イラストレイテッド、秀潤社、１９９６）。ＲＡ
ＣＥに用いるプライマーとしては、例えば、配列番号１
５及び配列番号１６に示す塩基配列を有するプライマ
ー、ならびに配列番号１７及び配列番号１８に示す塩基
配列を有するプライマーが挙げられる。

【００３４】上記のようにして得られたマウスLDE-1 ｃ
ＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。また、その塩基
配列がコードすると予想されるアミノ酸配列を配列番号
２に示す。配列番号２に示したマウスLDE1はSignalP
（シグナル配列予測プログラム、H.,Nielsen他、 Prote
in Engineering, 10, 1-6 (1997)）を用いて解析する
と、１番目から２６番目までがシグナル配列であると予
測された。また、これ以外にDSL領域（１７４番目から
２１８番目）、EGFモチーフドメイン１（２２３番目か
ら２５１番目）、 EGFモチーフドメイン２（２５４番目
から２８２番目）、 EGFモチーフドメイン３（２８９番
目から３２２番目）、 EGFモチーフドメイン４（３２９
番目から３６０番目）、 EGFモチーフドメイン５（３６
７番目から４００番目）、 EGFモチーフドメイン６（４
０７番目から４３８番目）、 EGFモチーフドメイン７
（４４５番目から４７６番目）、 EGFモチーフドメイン
８（４８５番目から５１８番目）、膜貫通領域（５３１
番目から５５３番目）というドメイン構造を有してい
る。

【００３５】上記塩基配列を配列を用いて、GenBank
（米国NCBI）のデータベースをＢｌａｓｔ（ホモロジー
検索ソフトウェア）を用いて検索したところ、マウスLD
E-1と相同性を有する配列が見いだされた（GenBank Acc
ession No. Z63545）。この配列はヒトゲノムDNAの１９
５ベースペアの部分配列であった。このうち、マウスLD
E-1との比較からエクソン部分は８１番目から１３８番
目の５８ベースペアと推測された。このエクソン部分は
ノッチリガンドで高度に保存されているDSL領域ではな
く、また、EGF領域でもない。従って、マウスLDE-1の配
列を使用せずに通常の検索によって本配列を見つけだ
し、ノッチリガンド遺伝子の一部であることを推定する
ことは困難である。すなわち、データベース検索によっ
て本配列を選出し、ヒトLDE-1をクローニングすること
は困難である。

【００３６】ヒトLDE-1遺伝子は、その塩基配列及び上
記のマウスLDE-1 ｃＤＮＡの塩基配列を利用して、ヒト
の各種の組織、細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから単
離することができる。具体的には例えば、マウスLDE-1
の配列を用いて合成した配列番号１９に示す塩基配列を
有するプライマー、及び、データベースより取得したヒ
トゲノムDNA配列とマウスLDE-1配列を結合して設計、合
成した配列番号２０に示す塩基配列を有するプライマー
を用いて、ヒトの各種の組織、細胞由来のｃＤＮＡライ
ブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ヒトLD
E-1 ｃＤＮＡの部分配列（配列番号３の塩基番号１７０
〜３９８に相当）を取得することができる。さらに、こ
のＰＣＲ産物をプローブとするハイブリダイゼーション
によって、ヒトｃＤＮＡライブラリーからヒトLDE-1 ｃ
ＤＮＡを取得することができる。得られたクローンがコ
ード領域全長を含んでいない場合は、ＲＡＣＥ法によっ
てｃＤＮＡ末端領域を取得すればよい。ＲＡＣＥに用い
るプライマーとしては、例えば、配列番号１５及び配列
番号２１に示す塩基配列を有するプライマー、ならびに
配列番号１７及び配列番号２２に示す塩基配列を有する
プライマーが挙げられる。

【００３７】上記のようにして得られたヒトLDE-1 ｃＤ
ＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。また、その塩基配
列がコードすると予想されるアミノ酸配列を配列番号４
に示す。本発明のＤＮＡは、上記LDE-1 ｃＤＮＡ配列に
限られるものではなく、ヒト又はマウスの染色体ＤＮＡ
上のLDE-1遺伝子も含まれる。このような染色体LDE-1遺
伝子は例えば、LDE-1 ｃＤＮＡ又はその一部の配列をプ
ローブに用いたハイブリダイゼーションによって、又は
LDE-1 ｃＤＮＡの配列に基づいて作製したオリゴヌクレ
オチドをプライマーとするＰＣＲによって、染色体ＤＮ
Ａライブラリーから取得することができる。染色体LDE-
1遺伝子は、イントロンによって分断されていることが
予想されるが、そのようなＤＮＡであっても、LDE-1を
コードする限り本発明のＤＮＡに含まれる。また、染色
体LDE-1遺伝子は、特表平7-500969、特表平8-503856等
に記載の方法により活性化することができる。配列番号
４に示したヒトLDE-1はSignalPを用いて解析すると、１
番目から２６番目までがシグナル配列であると予測され
た。また、これ以外にDSL領域（１７３番目から２１７
番目）、EGFモチーフドメイン１（２２２番目から２５
０番目）、 EGFモチーフドメイン２（２５３番目から２
８１番目）、 EGFモチーフドメイン３（２８８番目から
３２１番目）、 EGFモチーフドメイン４（３２８番目か
ら３５９番目）、 EGFモチーフドメイン５（３６６番目
から３９９番目）、 EGFモチーフドメイン６（４０６番
目から４３７番目）、 EGFモチーフドメイン７（４４４
番目から４７５番目）、 EGFモチーフドメイン８（４８
４番目から５１７番目）、膜貫通領域（５３０番目から
５５２番目）というドメイン構造を有している。

【００３８】また、本発明ＤＮＡには、配列番号２又は
４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミ
ノ酸が置換、欠失又は挿入されたアミノ酸配列を有し、
かつ、造血幹細胞及び造血前駆細胞の分化抑制能を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。このよう
なＤＮＡとしては、配列番号１又は３に示す塩基配列を
有するＤＮＡと相同性が６０％以上、好ましくは８５％
以上の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。より具体
的には、本発明のＤＮＡとストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。

【００３９】本発明のＤＮＡ（LDE-1遺伝子）は、LDE-1
の発現、製造に用いることができる。遺伝性疾患アラジ
ール症候群（Alagille syndorome）は、ヒト・ジャグド
−１の変異が原因である（Oda, T., Nature Genetics,
16: 235, 1997）。また、最近、ノッチ受容体の変異が
卒中（CADASIL; cerebral aoutosomal dominant arteri
opathy with subcortical infarcts and leukoencephal
opathy）あるいは痴呆に関与することが明らかにされた
（Gridley, T., Nature, 383:673, 1996）。このような
ノッチリガンドあるいはノッチ受容体の変異による疾患
などの治療用の医薬として、LDE-1ならびにその他のノ
ッチリガンドを使用しうる。LDE-1ならびにその他のノ
ッチリガンド全長あるいはノッチリガンドに由来する部
分ペプチドを有効成分とする薬剤の投与、あるいはＬＤ
Ｅ−１ならびにその他のノッチリガンド全長あるいはノ
ッチリガンドに由来する部分ぺプチドをコードするＤＮ
Ａを含むベクターによる遺伝子治療の可能性が考えられ
る。

【００４０】＜２＞本発明のポリペプチド 本発明のポリペプチドは、ノッチリガンドのＤＳＬ領域
のアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を有
し、かつ、造血幹細胞及び造血前駆細胞の分化抑制能を
有するポリペプチド（配列番号２５に示すアミノ酸配列
を有するポリペプチドを除く）である。

【００４１】上記ノッチリガンドとして具体的には、マ
ウス（Mus musculus）LDE-1、ヒト（Homo sapiens）LDE
-1、ラット（Rattus norvegicus）ジャグド−１、ヒト
・ジャグド−１、ニワトリ（Gallus gallus）セレート
−１、ニワトリ・セレート−２、ヒト・ジャグド−２、
カエル（Xenopus laevis）デルタ−１、ニワトリ・デル
タ−１、マウスDll-1、ヒト・デルタ、ゼブラフィッシ
ュ（Danio rerio）デルタ−Ａ、ゼブラフィッシュ・デ
ルタ−Ｂ、カエル・デルタ−２、ショウジョウバエ（Dr
osophila melanogaster）・デルタ、ショウジョウバエ
・セレート等が挙げられる。これらのうちでは、マウス
LDE-1及びヒトLDE-1が好ましい。これらのノッチリガン
ドのＤＳＬ領域のアミノ酸配列を、図１及び配列番号２
８〜４３に示す。図１中、塩基配列の前後の数字は、ノ
ッチリガンドのＮ末端からのアミノ酸番号を示す。ま
た、各ノッチリガンドのＤＳＬ領域間で共通して保存さ
れているアミノ酸残基を「＊」印で示す。

【００４２】ＤＳＬ領域のアミノ酸配列の少なくとも一
部のアミノ酸配列としては、ＤＳＬ領域の連続する少な
くとも１０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１
７アミノ酸残基からなる配列が挙げられる。また、図１
に示したＤＳＬ領域のアミノ酸配列において、各ＤＳＬ
領域で共通して保存されているアミノ酸残基が、少なく
とも２残基、好ましくは５残基含まれていることが好ま
しい。

【００４３】上記ＤＳＬ領域のアミノ酸配列の少なくと
も一部のアミノ酸配列を有するポリペプチドとして具体
的には、ＤＳＬ領域のＮ末端側から３番目〜１９番目の
アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する１７マーの
ポリペプチドが挙げられる。これらの１７マーのポリペ
プチド中では、マウスDll-1のＤＳＬ領域のポリペプチ
ド（配列番号２６）、マウスLDE-1のＤＳＬ領域のポリ
ペプチド（配列番号２７）、及びヒトLDE-1のＤＳＬ領
域のポリペプチド（配列番号４１のアミノ酸番号３〜１
９）が、好ましいものとして挙げられる。

【００４４】上記のようなポリペプチドは、ポリペプチ
ドの化学合成に通常用いられている方法又は装置（例え
ば、パーキンエルマー、モデル433ペプチド合成機（米
国Perkin-Elmer社)）を用いて合成することによって、
製造することができる。また、これらのポリペプチドを
コードするＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成に通常用いられ
ている方法又は装置（例えば、ABI社、3948全自動ＤＮ
Ａ合成装置）を用いて合成することによって、製造する
ことができる。

【００４５】上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを適
当な宿主細胞に導入して形質転換細胞を調製し、該形質
転換細胞中で前記ＤＮＡを発現させることによっても、
本発明のポリペプチドを得ることができる。ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡの宿主細胞への導入は、例えば、
該ＤＮＡを宿主に応じた発現ベクターに挿入し、得られ
る組換えベクターで宿主を形質転換することによって行
われる。ベクターには、同種又は異なる種類のポリペプ
チドをコードする複数のＤＮＡをタンデムに連結しても
よい。その際、各々のＤＮＡとＤＮＡの間に開始コドン
及び終止コドンを挿入し、ポリシストロニックに発現さ
せてもよいし、各々のＤＮＡをインフレームで連結させ
て、単一のポリペプチド中に本発明のポリペプチドがタ
ンデムに連結するようにして発現させてもよい。後者の
場合は、各々のＤＮＡとＤＮＡの間にメチオニン残基を
コードするコドンを介在させ、発現産物を臭化シアンで
処理すると、本発明のポリペプチドを切り離すことがで
きる。このようにすることによって、ポリペプチドの発
現量を高め、あるいは複数のポリペプチドを同時に発現
させることができる。LDE-1遺伝子を、血液細胞刺激因
子遺伝子と融合させLDE-1と血液細胞刺激因子の融合ポ
リペプチドとして産生させることも可能である。また、
LDE-1と抗体のヒンジ部分を融合タンパクとして発現さ
せるなどして、２量体型のポリペプチドを作製すること
も可能である。その他、現在知られている２量体以上の
多量体構造を持たせるあらゆる方法を適応することもで
きる。

【００４６】以上の遺伝子クローニング、遺伝子組換え
実験などは、J. Sambrook, Molecular Cloning 2nd edi
tion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989な
どの実験書を参考に実施することが可能である。

【００４７】＜３＞幹細胞増殖法、幹細胞増殖用試薬及
びキット 本発明のポリペプチド又はLDE-1タンパク質の存在下で
造血幹細胞又は造血前駆細胞を培養することによって、
これらの細胞を、分化を抑制しつつ増殖させることがで
きる。したがって、本発明のポリペプチドは、造血幹細
胞および造血前駆細胞の生体外増幅用試薬または試薬キ
ットの構成成分として利用することができる。

【００４８】後記実施例に示すように、Liら（Li, L. I
mmunity, 8:43, 1998）が報告したヒト・ジャグド−１
のＤＳＬ領域由来の１７マーのポリペプチド（配列番号
２５）、並びにマウスDll-1（Bettenhausen, B., Devel
opment, 121:2407, 1995）及びLDE-1のＤＳＬ領域の１
７マーのポリペプチド（配列番号２６及び２７）を合成
し、マウスの造血幹細胞分画に作用させたところ、造血
幹細胞あるいは造血前駆細胞の分化を抑制する活性が検
出された。これまでに報告されている造血細胞に対する
分化抑制活性（例えば前記Liら）は、前骨髄球細胞株32
Dの分化についてのみ検討しており、造血前駆細胞株に
対する作用のみを検討している。

【００４９】本発明者らは、ノッチリガンドの造血幹細
胞あるいは造血前駆細胞に対する分化抑制活性を高度に
純化されたプライマリの造血幹細胞集団を用いて判定し
た。マウスでは、各種成熟血球特異マーカーが陰性であ
り、幼若造血細胞のマーカーであるc-kitならびにSca-
１陽性の細胞の内、CD34抗原が陰性から弱陽性の性質を
示す細胞に造血幹細胞の性質が見いだされている（Osaw
a, M., Science, 273:242, 1996）。本発明者らは、マ
ウスのCD34陰性c-Kit陽性Sca-１陽性、分化抗原陰性の
幹細胞を用いて、ノッチリガンドの造血幹細胞、造血前
駆細胞への分化抑制活性を確認した。すなわち、 CD34
陰性c-Kit陽性Sca-１陽性、分化抗原陰性の幹細胞を、
ノッチリガンドポリペプチドとサイトカイン存在下に培
養した後、放射線照射マウスへ移植することにより、幹
細胞の重要な性質である自己複製についても検討した。
このように、移植実験というもっとも臨床に近い評価系
において分化抑制ポリペプチドの活性を確認したのは初
めてである。

【００５０】本発明の造血幹細胞または造血前駆細胞の
増殖法は、上記のようなノッチリガンドのＤＳＬ領域の
アミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を有し、
かつ、造血幹細胞及び造血前駆細胞の分化抑制能を有す
るポリペプチド又はLDE-1タンパク質の存在下で、造血
幹細胞または造血前駆細胞を培養することを含む。前記
ノッチリガンドとしては、配列番号２８〜４３に示す各
種生物由来のもの、好ましくはヒト・ジャグド−１（配
列番号２９）、マウスDll-1（配列番号３５）、マウスL
DE-1（配列番号４０）、及びヒトLDE-1（配列番号４
１）が挙げられる。また、上記ＤＳＬ領域のアミノ酸配
列の少なくとも一部のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドとして具体的には、ＤＳＬ領域のＮ末端側から３番目
〜１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有す
る１７マーのポリペプチドが挙げられる。これらの１７
マーのポリペプチド中では、マウスDll-1のＤＳＬ領域
のポリペプチド（配列番号２６）、マウスLDE-1のＤＳ
Ｌ領域のポリペプチド（配列番号２７）、及びヒトLDE-
1のＤＳＬ領域のポリペプチド（配列番号４１のアミノ
酸番号３〜１９）が、好ましいものとして挙げられる。

【００５１】造血幹細胞または造血前駆細胞の培養に加
えるポリペプチド又はLDE-1タンパク質の濃度として
は、通常は０．１μＭ〜１ｍＭ、好ましくは１〜５０μ
Ｍが例示される。ポリペプチド又はLDE-1タンパク質
は、１種類を単独で加えてもよく、２種又は３種以上の
ポリペプチドを加えてもよい。また、ポリペプチド又は
LDE-1タンパク質は、不溶性のビーズ等に固相化して培
養に加えると、反復して使用することができ、また、造
血幹細胞または造血前駆細胞を増殖させる活性が上昇す
ることが期待される。さらには、ポリペプチド又はLDE-
1タンパク質を培養器の内壁に固相化することによって
も、同様の効果が期待できる。本発明のポリペプチド又
はLDE-1タンパク質を医薬として用いる場合は、注射剤
が好ましい。剤型、製法は特に制限されないが、溶液、
懸濁液、乳濁液等として、常法により製造される。本発
明のポリペプチド又はLDE-1タンパク質以外の成分とし
ては、剤型に応じて通常医薬に用いられる成分を使用す
ることができ、例えば、薬理学上許容される担体、安定
剤、ｐＨ調製剤等が用いられる。本発明のポリペプチド
又はLDE-1タンパク質の医薬組成物中の配合量は、通常
１0μg/kg〜10mg/kgの範囲が例示される。投与量は、適
用対象等により異なるが、一般には本発明のポリペプチ
ド又はLDE-1タンパク質の量として成人１人１日当た
り、１0μg〜1800mg程度の範囲で用いられる。

【００５２】本発明の方法に用いる造血幹細胞または造
血前駆細胞としては、少なくとも造血幹細胞もしくは造
血前駆細胞を含む細胞群が挙げられ、造血幹細胞または
造血前駆細胞のいずれか一方が単離されたものであって
もよく、これらの両方であってもよい。また、造血幹細
胞または造血前駆細胞の少なくとも一方を含み、さらに
他の造血細胞を含んでいてもよい。また、造血幹細胞ま
たは造血前駆細胞を含む細胞群から分画された造血幹細
胞または造血前駆細胞を含む分画であってもよい。

【００５３】造血幹細胞および造血前駆細胞の採取源と
しては、ヒト及びマウス等の哺乳動物の胎児肝臓、骨
髄、胎児骨髄、末梢血、サイトカインおよび／または抗
癌剤の投与によって幹細胞を動員した末梢血、及び臍帯
血等が挙げられ、造血幹細胞を含む組織であればいずれ
であってもよい。

【００５４】本発明のポリペプチドの存在下で造血幹細
胞または造血前駆細胞を培養するにあたっては、いわゆ
る培養用のシャーレ、フラスコを用いた培養法が可能で
あるが、培地組成、pHなどを機械的に制御し、高密度で
の培養が可能なバイオリアクターによって、その培養系
を改善することもできる（Schwartz, Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.,88:6760,1991; Koller, M.R., Bio/Technolo
gy, 11:358, 1993; Koller, M.R.,Blood, 82: 378, 199
3; Palsson, B.O., Bio/Technology, 11:368,1993）。

【００５５】培養に用いる培地としては、造血幹細胞ま
たは造血前駆細胞の増殖、生存が害されない限り特に制
限されないが、例えばSF-02培地（三光純薬）、Opti-ME
M培地（GIBCO BRL）、MEM培地（GIBCO BRL）、IMDM培地
（GIBCO BRL）、PRMI1640培地（GIBCO BRL）、が好まし
いものとして挙げられる。培養温度は、通常２５〜３９
℃、好ましくは３３〜３９℃である。また、培地に添加
する物質としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血
清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリ
ン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチ
オグリセロール、２−メルカプトエタノール、ウシ血清
アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリ
コール、各種ビタミン、各種アミノ酸、各種増殖因子、
好ましくはEGF（上皮増殖因子）、PDGF（血小板由来増
殖因子）、bFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＣＯ₂
は、通常、４〜６％であり、５％が好ましい。また、ノ
ッチ、ノッチリガンドの結合は、カルシウムイオン依存
性であり、培地中のカルシウムイオン濃度を調節するこ
とで、培養系を改良することが可能である。

【００５６】本発明のポリペプチドと、細胞刺激因子の
存在下で造血幹細胞及び造血前駆細胞を培養することに
よって、これらの細胞を増殖させることができるが、細
胞刺激因子を培養系に添加することによって、より有効
に増殖させることができる。このような細胞刺激因子
は、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖を妨げないも
のであれば特に制限されないが、具体的には、SCF（幹
細胞成長因子(stem cellfactor)）、IL-3（インターロ
イキン−３）、GM-CSF（顆粒球マクロファージ・コロニ
ー刺激因子（granulocyte/macrophage colony-stimulat
ing factor)）、IL-6（インターロイキン−６）、IL-11
（インターロイキン−１１）、TPO（トロンボポエチ
ン）、G-CSF（顆粒球コロニー刺激因子(granulocyte co
lony-stimulating factor)）、TGF-β（トランスフォー
ミング成長因子−β）、MIP-1α（George, D., J. Exp.
Med. 167:1939-1944, 1988）、Flt3/Flk2-ligand等の
サイトカインに代表される増殖刺激因子、EPO（エリス
ロポエチン）のような造血ホルモン、Wnt（Thimoth, A.
W., Blood, 89:3624-3635,1997）遺伝子産物のような
分化増殖調節因子等が挙げられる。これらの刺激因子な
どはGallard, R.E., The cytokine facts book, Academ
icPress, 1994などに詳しい。また、血液細胞刺激因子
とは造血細胞に増殖、分化、生存、遊走などの刺激を与
える因子である。

【００５７】本発明の方法により増殖した造血幹細胞ま
たは造血前駆細胞は、従来の骨髄移植や臍帯血移植に代
わる血液細胞移植用の移植片として用いることができ
る。造血幹細胞の移植は、移植片が半永久的に生着させ
られることから、従来の血液細胞移植治療を改善するこ
とができる。従来、骨髄移植には、大量の骨髄の採取が
必要であったが、本発明によれば、少量の骨髄採取で済
ますことができる。例えば、自己免疫疾患等の骨髄移植
によってその改善の見られる疾患に対しては、自己ある
いは非自己の幹細胞を増殖させるに際し、本発明による
幹細胞増殖技術を利用することができる。

【００５８】具体的には、本発明の方法により増殖させ
た造血幹細胞は、白血病に対する全身Ｘ線療法や高度化
学療法を行う際に、これらの治療と組み合わせる他、種
々の疾患に用いることができる。例えば、固形癌患者の
化学療法、放射線療法等の骨髄抑制が副作用として生じ
る治療を実施する際に、施術前に骨髄を採取しておき、
造血幹細胞、造血前駆細胞を試験管内で増幅し、施術後
に患者に戻すことで、副作用による造血系の障害から早
期に回復させることができ、より強力な化学療法を行え
るようになり、化学療法の治療効果を改善する事ができ
る。

【００５９】また、本発明を利用して、患者あるいは他
人の造血幹細胞ならびに造血前駆細胞を各種血液細胞に
分化させ、それらを患者の体内に移入することにより、
各種血液細胞の低形成により不全な状況を呈している患
者の改善を図ることができる。また、再生不良性貧血な
どの貧血を呈する骨髄低形成に起因する造血不全症を改
善することができる。その他、本発明の方法による造血
幹細胞の移植が有効な疾患としては、慢性肉芽腫症、重
複免疫不全症候群、無ガンマグロブリン血症、Wiskott-
Aldrich症候群、後天性免疫不全症候群（AIDS）等の免
疫不全症候群、サラセミア、酵素欠損による溶血性貧
血、鎌状赤血球症等の先天性貧血、Gaucher病、ムコ多
糖症等のリソゾーム蓄積症、副腎白質変性症、各種の癌
または腫瘍等が挙げられる。

【００６０】上記の造血幹細胞の移植は、用いる細胞以
外は、従来行われている骨髄移植や臍帯血移植と同様に
行えばよい。上記のような造血幹細胞移植に用いられる
可能性のある造血幹細胞の由来は、骨髄に限られず、前
述したような胎児肝臓、胎児骨髄、末梢血、サイトカイ
ンおよび／または抗癌剤の投与によって幹細胞を動員し
た末梢血、及び臍帯血等を用いることができる。本発明
の移植片は、本発明の方法によって増殖した造血幹細胞
及び造血前駆細胞の他に、緩衝液等を含む組成物として
もよい。

【００６１】また、本発明の方法により増殖させた造血
幹細胞または造血前駆細胞は、ex vivoの遺伝子治療に
用いることができる。遺伝子治療には、ＤＮＡを患者に
直接投与するin vivo法と、標的細胞にＤＮＡを導入
し、遺伝子導入細胞を患者に移植するex vivo法があ
る。ex vivo法において標的細胞に骨髄細胞を用いる場
合には、大量の骨髄の採取が必要であったが、本発明に
よれば、少量の骨髄採取で済ますことができる。また、
造血幹細胞が自己複製し、長期的に造血細胞を供給でき
る性質は、遺伝子治療の好適な標的と考えられている
が、従来、その細胞周期を回転させることができず、遺
伝子の導入が困難であった。本発明のポリペプチドの存
在下で造血幹細胞または造血前駆細胞とを培養すること
により、これらの細胞の細胞周期を回転させることが可
能となり、遺伝子導入を容易に行うことができる。

【００６２】上記遺伝子治療は、本発明の方法により増
殖させた造血幹細胞または造血前駆細胞に外来遺伝子
（治療用遺伝子）を導入し、得られる遺伝子導入細胞を
用いて行われる。本発明の遺伝子治療用組成物を用いた
遺伝子治療は、本発明の方法により増殖させた造血幹細
胞または造血前駆細胞を標的細胞として用いる以外は、
従来行われている遺伝子治療と同様に行えばよい。導入
される外来遺伝子は、疾患によって適宜選択される。血
液細胞を標的細胞とする遺伝子治療の対象となる疾患と
しては、慢性肉芽腫症、重複免疫不全症候群、無ガンマ
グロブリン血症、Wiskott-Aldrich症候群、後天性免疫
不全症候群（AIDS）等の免疫不全症候群、サラセミア、
酵素欠損による溶血性貧血、鎌状赤血球症等の先天性貧
血、Gaucher病、ムコ多糖症等のリソゾーム蓄積症、副
腎白質変性症、各種の癌または腫瘍等が挙げられる。

【００６３】標的細胞に用いる造血幹細胞の由来は骨髄
に限られず、胎児肝臓、胎児骨髄、末梢血、末梢血由来
の各組織、サイトカインおよび／または抗癌剤の投与に
よって幹細胞を動員した末梢血または該末梢血由来の各
組織、末梢血由来の各組織、及び臍帯血等を用いること
ができる。

【００６４】造血幹細胞または造血前駆細胞に治療用遺
伝子を導入するには、通常動物細胞の遺伝子導入に用い
られる方法、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス等
のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、単純ヘルペスウ
イルスベクター等のウイルス由来の動物細胞用ベクター
を用いる方法、リン酸カルシウム共沈法、DEAE-デキス
トラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、
リポフェクション法、マイクロインジェクション法等を
用いることができる。これらの中では、標的細胞の染色
体ＤＮＡに組み込まれて恒久的に遺伝子の発現が期待で
きるという点から、レトロウイルスベクターまたはアデ
ノ随伴ウイルスベクターが好ましい。

【００６５】例えば、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベク
ターは、次のようにして作製することができる。まず、
野生型アデノ随伴ウイルスＤＮＡの両端のＩＴＲ（inve
rtedterminal repeat）の間に治療用遺伝子を挿入した
ベクタープラスミドと、ウイルスタンパク質を補うため
のヘルパープラスミドを２９３細胞にトランスフェクシ
ョンする。続いてヘルパーウイルスのアデノウイルスを
感染させると、AAVベクターを含むウイルス粒子が産生
される。あるいは、アデノウイルスの代わりに、ヘルパ
ー機能を担うアデノウイルス遺伝子を発現するプラスミ
ドをトランスフェクションしてもよい。次に、得られる
ウイルス粒子を造血幹細胞または造血前駆細胞に感染さ
せる。ベクターＤＮＡ中において、目的遺伝子の上流に
は、適当なプロモーター及びエンハンサーを挿入し、こ
れらによって遺伝子の発現を調節することが好ましい。
さらに、治療用遺伝子に加えて薬剤耐性遺伝子等のマー
カー遺伝子を用いると、治療用遺伝子が導入された細胞
の選択が容易となる。治療用遺伝子は、センス遺伝子で
あってもアンチセンス遺伝子であってもよい。

【００６６】レトロウイルスベクターを用いる場合は、
造血幹細胞は細胞周期ではＧ０期にあるものが大半であ
り、レトロウイルスが感染できないため、造血幹細胞に
IL-1、IL-3、IL-6及びSCFを作用させて細胞周期に入ら
せてから、ウイルスを感染させる必要がある（Nolta,
J., Exp. Hematol, 20:1065-1071 1992）。本発明の方
法によれば、造血幹細胞の細胞周期を回転させることが
できるため、効率の良いウイルス感染が可能である。

【００６７】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。

【００６８】

【実施例１】 マウスLDE1のPCR断片の単離 （１）マウス胎仔肝臓トータルＲＮＡの調製 妊娠１４．５日のマウス５匹（Ｃ５７ＢＬ６）より胎仔
肝臓を摘出し、ドライアイスにて急速に冷凍した。凍結
した肝臓の半量をＣＢ（４．２Ｍグアニジンチオシアネ
ート、０．５％サルコシル、２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
８）、０．７％２−メルカプトエタノール）１５ｍｌに
溶解した。次に、この溶液にＰＥＢ（１００ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ）
１５ｍｌを添加し、さらにＰＣ（５０％ フェノール、
５０％クロロホルム）１５ｍｌを加えて激しく撹拌した
のち、毎分２５００回転で１０分間遠心した。水相を回
収し、上記のＰＣ処理を更に３回行い、回収した水相に
クロロホルム１５ｍｌを加えて激しく撹拌したのち、毎
分２５００回転で１０分間遠心した。水相を回収し、等
量のイソプロパノールを添加して−８０℃にて一夜放置
した。

【００６９】上記混合液を融解後、遠心して沈殿を回収
し、沈殿を７０％エタノールで洗浄したのち、０．９ｍ
ｌＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、０．１ｍ
ＭＥＤＴＡ）に溶解、０．３ｍｌ １０Ｍ ＬｉＣｌを
加えて氷中で１時間放置した。遠心して上清を除いたの
ち、再度０．９ｍｌＴＥに溶解し、０．３ｍｌ １０Ｍ
ＬｉＣｌを加えて氷中で１時間放置した。これを遠心
して上清を除いたのち、沈殿を７０％エタノールで洗浄
し、この沈殿を０．９ｍｌＰＥＢに溶解した。この溶液
を０．９ｍｌ ＰＣで抽出し、水相を回収した。この水
相に０．３ｍｌ １０Ｍ ＬｉＣｌを加えて氷中で１時
間放置した。遠心して上清を除いたのち７０％エタノー
ルで洗浄し、１ｍｌ蒸留水に溶解し、３．９ｍｇのトー
タルＲＮＡを得た。

【００７０】（２）ＰＣＲ反応 上記のようにして調製したトータルＲＮＡ ５０μｇか
ら、オリゴｄＴプライマー、逆転写酵素（SuperscriptI
I、GIBCO-BRL社）を用いて、添付文書に従ってｃＤＮＡ
を合成した。合成したｃＤＮＡの内２５分の２量を鋳型
とし、KUR-1（センス）（ATGAATTCTGYMRNAAYGGNGGNACNT
GYMARGAY）（配列番号５）およびDEL-2（アンチセン
ス）（ATGAATTCRTANCCNDKNTYRCANWTRCANTKRTA）（配列
番号６）をプライマーとして、ＰＣＲを行った。反応
は、TaKaRa LA PCR Kit Ver.2（日本国、宝酒造
（株））を用いて実施し、反応液量は２０μｌ、プライ
マー濃度はそれぞれ２０μｇ／ｍｌ、それ以外の反応液
組成はキットの添付文書に従った。ＰＣＲ条件は９５
℃、１分、５３℃、１分、７４℃、３分からなる行程を
１サイクルとして３５サイクル実施した。

【００７１】得られたＰＣＲ産物１μｌを、上記と同じ
反応液組成のＰＣＲ反応液５０μｌに添加し再度ＰＣＲ
を実施した。ＰＣＲ条件は９５℃、１分、５３℃、１
分、７４℃、３分からなる行程を１サイクルとして２０
サイクル実施した。得られたＰＣＲ反応液を２％アガロ
ースにて電気泳動し、約１２００ｂｐ、８５０ｂｐおよ
び８００ｂｐの増幅断片をそれぞれ切り出し、JETSORB
（GENOMED社）を用いて精製した。

【００７２】（３）ＰＣＲ産物の塩基配列決定 精製した断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲ
Ｉで消化したpBluescriptII KS+ （Clontech社）に挿入
し、大腸菌ＤＨ５αに遺伝子導入し、アンピシリンを含
むＬＢ寒天培地に広げてコロニーを単離した。単離した
コロニーを２０μｌのPCR反応液に添加し９４℃にて１
０分間処理した後、９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、
７２℃、１分からなる行程を１サイクルとして３５サイ
クル実施した。プライマーは、M13FW（GTAAAACGACGGCCA
GTG）（配列番号９）、およびM13RV（CAGGAAACAGCTATGA
C）（配列番号１０）を、それぞれ終濃度０．２μＭで
使用した。得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルに
て電気泳動し、増幅断片を確認した。４７クローンにつ
いて、前記ＰＣＲ増幅断片を鋳型に用いてABI377ＤＮＡ
シーケンサー（Perkin Elmer社）を用いて塩基配列を決
定した。得られた配列をホモロジーサーチによって解析
したところ、種々の既知遺伝子と共に、ＥＧＦモチーフ
を有する新規な遺伝子が単離された。このとき得られた
配列は、配列番号１の塩基番号１０２４〜１４１９であ
った。この遺伝子をLDE-1（Liver Derived EGF gene）
と命名した。

【００７３】

【実施例２】 マウスLDE-1の全長クローニング 妊娠１４．５日のマウス５匹（C57BL6）より胎仔脳を摘
出し、ドライアイスにて急速に冷凍した。凍結した胎仔
脳の半量より実施例１と同様にトータルRNAを調製し
た。次に、精製したトータルＲＮＡ ５ｍｇより、オリ
ゴｄＴセルロースカラムを用いてメッセンジャーＲＮＡ
を調製した。調製したメッセンジャーＲＮＡ ５μｇよ
り、Zap Express cＤＮＡ合成キット（Stratagene社）
を用いて添付文書に従って、独立なクローン約２００万
種類を含む、cＤＮＡライブラリーを作製した。１５ｃ
ｍのシャーレに２３，０００プラークずつ１２枚蒔き、
３７℃で８時間保温した後、Hybond-N+（Amersham社）
ナイロンフィルターに、各シャーレにつき２枚ずつプラ
ークを写しとった。

【００７４】上記ナイロンフィルターを、添付文書に従
ってＤＮＡの固定処理を行い、³²Ｐ標識したＤＮＡプロ
ーブにてスクリーニングを実施した。プローブの調製方
法を以下に記す。

【００７５】実施例１で得られた遺伝子断片の配列を用
いて、プライマー、LDE101（ACTATGGCCAGCACTGTGAGCAT
A）（配列番号１１）、およびLDE102（GGCAGCGGCAGGTTC
GGCTTGGAC）（配列番号１２）を合成し、実施例１で得
られた遺伝子断片を含むプラスミドを鋳型としてＰＣＲ
を行った。ＰＣＲ条件は９４℃、３０秒、５５℃、３０
秒、７２℃、１分からなる行程を１サイクルとして３５
サイクル実施した。 ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル
にて電気泳動し、増幅断片をJETSORBを用いて精製し
た。得られたＰＣＲ断片２５ｎｇを鋳型として、Megapr
ime labeling kit（Amersham社）を用いて³²Ｐ標識した
ＤＮＡプローブを調製した。キットに添付のランダムプ
ライマーの代わりに、各１ｐｍｏｌのプライマーLDE10
1、LDE102を加え、その他は添付文書に従った。

【００７６】ハイブリダイゼーション及びフィルターの
洗浄は、ZapExpress cＤＮＡ合成キット添付文書に従っ
て実施し、BAS2000イメージアナライザ（日本国Fujix
社）用イメージングプレートに二日間露光し、 BAS2000
イメージアナライザで結果を解析した。その結果、強く
露光された部分に相当するシャーレ上のプラークを掻き
取り、１０cmシャーレに２００個程度のプラークが出る
ように再度蒔き直し、上記方法にてに再度スクリーニン
グを実施し、単一のプラークを単離した。

【００７７】得られたクローンをZapExpress cＤＮＡ合
成キット添付文書に従ってin vivoでの切り出しを実施
し、単一コロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含
むＬＢ培地５０ｍｌに植菌、３７℃で一夜培養したのち
QIAGEN Tip-100（QUIAGEN社）にてプラスミドを抽出
し、約１５μｇのプラスミドを取得した。挿入断片の両
端を、T3（AATAACCCTCACTAAAGGGA）（配列番号１３）及
びT7（TAATACGACTCACTATAGGG）（配列番号１４）プライ
マーを用いて、ABI377 ＤＮＡシーケンサーを用いて配
列決定したところ、配列番号１の塩基番号８３以降の塩
基配列を含む部分長cＤＮＡを含むことが判明した。

【００７８】得られたプラスミド約３μｇをＥｃｏＲＩ
とＮｏｔＩで切断し、０．８％アガロースゲルにて電気
泳動し、約３Ｋｂの断片を切り出しショットガンシーク
エンスを実施した。すなわち、GeneCleaneII（BIO101
社）を用いてＤＮＡ断片を回収し、回収した断片の半量
を蒸留水100μlで希釈して、SONIFIER 250D（BRANSON）
の目盛り１で２０秒間、超音波破砕を行った。得られた
ＤＮＡ溶液に３００μｌのGene CleanII添付のＮａＩ溶
液を加え、以下添付文書に従ってＤＮＡを回収した。回
収したＤＮＡ断片を、Ｔ４ポリメラーゼ反応液（１０倍
希釈添付緩衝液、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、各０．５ｍＭ）、１０
ユニットＴ４ＤＮＡポリメラーゼ）５０μｌ中に希釈し
て３７℃にて３０分間処理し、末端の平滑化を行った
後、等量のＰＣで処理し、常法に従って２−プロパノー
ル沈殿を行い、沈殿を７０％エタノールでリンスしたの
ち１０μｌ蒸留水に溶解した。

【００７９】得られたＤＮＡ断片をTaKaRa ＤＮＡライ
ゲーションキットVer.2（日本国、宝酒造（株））を用
い、ＳｍａＩ消化したpBluescriptII KS- ５０ｎｇに挿
入した。得られた反応液を大腸菌DH5αに導入し、５０
μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に蒔き、単
一コロニーを形成させた。単離したコロニー３２個をそ
れぞれ２０μｌのＰＣＲ反応液に添加し、９４℃にて１
０分間処理した後、９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、
７２℃、１分からなる行程を１サイクルとして３５サイ
クルのＰＣＲを実施した。プライマーは、M13FW、M13RV
プライマーをそれぞれ終濃度０．２μＭで使用した。

【００８０】上記ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて
電気泳動し、増幅断片を確認した後、このＰＣＲ増幅断
片を鋳型として１７クローンについてABI377 ＤＮＡシ
ーケンサーを用いて配列を決定した。得られた配列デー
タ及び前記の５’、３’両末端配列データを結合した。
上記解析で得られなかった部分は合成プライマーを用い
て決定した。上流部分を取得するため５’ＲＡＣＥを実
施した。５０μｌのＰＣＲ反応液にマウス脳Marathon-R
eady cＤＮＡ（Clontech社）、１μｌ、AP-1（CCATCCTA
ATACGACTCACTATAGGGC）（配列番号１５）、LDE105（CTG
GAAGTGCTTAAGGCAGATGCGGAAGAA）（配列番号１６）を、
それぞれ終濃度が０．２μＭとなるように添加し、TaKa
Ra LA PCR Kit Ver.2を用いて、９４℃、３０秒、６８
℃、３分からなる行程を１サイクルとして３５サイクル
のＰＣＲを実施した。更に、５０μｌのＰＣＲ反応液に
前記ＰＣＲ反応液１μｌ、AP-2（ACTCACTATAGGGCTCGAGC
GGC）（配列番号１７）及びLDE106（GTTCGCAGGACTGCCCA
TTGGCCAGCATAC）（配列番号１８）を、それぞれ終濃度
が０．２ｍＭとなるように添加し、９４℃、３０秒、６
８℃、３分からなる行程を１サイクルとして３０サイク
ルのＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ反応液を２％ア
ガロースにて電気泳動し、約５００ｂｐの増幅断片を切
り出しGeneCleanIIを用いて精製した。精製したＰＣＲ
断片はpGEM-Tベクター（Promega社）に挿入し、大腸菌D
H5αに遺伝子導入した。得られたcＤＮＡ断片の塩基配
列を、T3、T7プライマーとABI377 ＤＮＡシーケンサー
を用いて決定し、先に決定した下流部分の配列と結合す
ることによって全翻訳領域の塩基配列を決定し、塩基配
列より推定されるアミノ酸配列を推定した。

【００８１】

【実施例３】 ヒトLDE-1のクローニング マウスLDE-1の配列を用いてGenBank（米国NCBI）のデー
タベースをＢｌａｓｔ（ホモロジー検索ソフトウェア）
を用いて検索したところ、マウスLDE-1と相同性を有す
る配列が見いだされた（GenBank Accession No. Z6354
5）。このヒト由来の配列及びマウスの配列を用いてhLD
E1F2（TCTTCCGCATCTGCCTTAAGCACT）（配列番号１９）、
hLDE1R2（AGTCTCTGGCCGCAGGTCGTCTCC）（配列番号２
０）を合成した。合成したプライマーを用いてヒトＭＴ
Ｃパネル（CLONTECH社）のうち、脳、心臓、肺、肝臓、
腎臓由来のcＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施した。そ
の結果、全ての臓器から増幅断片が得られた。このう
ち、脳由来のＰＣＲ断片をpGEM-Tベクター（Promega
社）に挿入し、大腸菌DH5aに遺伝子導入し、５０μｇ／
ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に蒔き、単一コロ
ニーを形成させた。単離したコロニー８個をそれぞれ２
０μｌのＰＣＲ反応液に添加し、９４℃にて１０分間処
理した後、９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、
１分からなる行程を１サイクルとして３５サイクルのＰ
ＣＲを実施した。プライマーは、M13FW、M13RVプライマ
ーを、それぞれ終濃度0.2μMで使用した。ＰＣＲ産物を
２％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認し
た後、このＰＣＲ増幅断片を鋳型として３クローンにつ
いてABI377 ＤＮＡシーケンサーを用いて配列を決定し
た。

【００８２】これら３クローンは、塩基配列（配列番号
３の塩基番号２２６〜３９８に相当）から、マウスLDE-
1のヒトホモログであることを確認した。得られたＤＮ
Ａ断片を鋳型として、実施例２と同様にしてプローブを
作製し、λgt11に組み込まれたヒト肺由来cＤＮＡライ
ブラリー（CLONTECH社）、約８５万プラークをプラーク
ハイブリダイゼーションによってスクリーニングし、４
個の単一のプラークを単離した。得られたプラークにつ
いて、PrepEZlＤＮＡ精製キット（5prime-3prime Inc.
社）を用いて、添付文書に従ってλファージＤＮＡを取
得した。得られたＤＮＡをＥｃｏＲＩを用いて消化し、
０．８％アガロースゲルにて電気泳動し、約３Ｋｂの断
片を切り出した。切り出した断片はJETSORBを用いて精
製した。

【００８３】精製した断片を、ＥｃｏＲＩで消化したpB
luescriptII KS+に挿入し、大腸菌DH5αに遺伝子導入
し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に蒔き、４個の単
一プラークのうち、３個について単一コロニーを単離し
た。単離したコロニーをそれぞれ５個、２０μｌのＰＣ
Ｒ反応液に添加し、９４℃にて１０分間処理した後、９
４℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、１分からなる
行程を１サイクルとして３５サイクルのＰＣＲを実施し
た。プライマーはhLDE1F2、hLDE1R2プライマーを、それ
ぞれ終濃度０．２μＭで使用した。ＰＣＲ産物を２％ア
ガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。そ
の結果、３種類の単一プラーク由来のクローンの内、１
つのプラーク由来のクローンのみ増幅断片が確認され
た。

【００８４】増幅断片の確認された単一コロニーを、５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５０ｍｌに
植菌し、３７℃で一夜培養したのち、QIAGEN Tip-100を
用いてプラスミドを抽出し、約８０μｇのプラスミドを
取得した。挿入断片の両端をT3及びT7プライマーを用い
て、ABI377 ＤＮＡシーケンサーを用いて配列決定した
ところ、配列番号３の塩基番号１０５以降の塩基配列を
含む部分長cＤＮＡを含むことが判明した。

【００８５】得られたプラスミド約３μｇをＥｃｏＲＩ
及びＰｓｔＩで切断し、０．８％アガロースゲルにて電
気泳動し、約２．５Ｋｂ、約５００ｂおよび約２００ｂ
の断片を切り出し、それぞれJETSORBを用いてＤＮＡ断
片を回収した。約２．５Ｋｂの断片は実施例２と同様に
ショットガンシークエンスを行った。すなわち、約２．
５Ｋｂの断片を超音波破砕し、末端の平滑化を行った。
一方、約５００ｂ、約２００ｂの断片は、末端の平滑化
のみ行った。得られたＤＮＡ断片をTaKaRa ＤＮＡ ライ
ゲーションキット Ver.2を用いて、添付文書に従って、
ＳｍａＩ消化したpBluescriptII KS- ５０ｎｇに挿入し
た。得られた反応液を大腸菌DH5αに導入し、５０μｇ
／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に蒔き、単一コ
ロニーを形成させた。単離したコロニーのうち、超音波
破砕した断片を含むクローンは４０個、他は各８個を、
それぞれ２０μｌのＰＣＲ反応液に添加し９４℃にて１
０分間処理した後、９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、
７２℃、１分からなる行程を１サイクルとして３５サイ
クルのＰＣＲを実施した。プライマーはM13FW、M13RVプ
ライマーをそれぞれ終濃度０．２μＭで使用した。ＰＣ
Ｒ産物を２％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片
を確認した後、このＰＣＲ増幅断片を鋳型として、超音
波破砕した断片を含むクローンは２０個、他は各２個、
ABI377 ＤＮＡシーケンサーを用いて配列を決定した。
得られた配列データ及び前記の５’、３’両末端配列デ
ータを結合した。本データで得られなかった部分は合成
プライマーを用いて決定した。

【００８６】上流部分を取得するため、ヒト胎児腎臓Ma
rathon-Ready cDNA（Clontech社）を用いて５’ＲＡＣ
Ｅを実施した。２０μｌのＰＣＲ反応液に、AP-1及びhL
DE105（ACGACCGCCTGGAAGTGCTTAAGGCAGACG）（配列番号
２１）を、それぞれ終濃度が０．２ｍＭとなるように添
加し、９４℃、３０秒、６８℃、２分からなる行程を１
サイクルとして３５サイクルのＰＣＲを実施した。５０
μｌのＰＣＲ反応液に、AP-2及びhLDE106（CGGAAGAAAGT
CCGGCAGCCGGGCTCGCAA）（配列番号２２）を、それぞれ
終濃度が０．２μＭとなるように添加し、９４℃、３０
秒、６８℃、２分からなる行程を１サイクルとして３０
サイクルのＰＣＲを実施した。

【００８７】得られたＰＣＲ産物を２％アガロースにて
電気泳動し、増幅断片の存在（約５００ｂｐ）を確認し
た。このＰＣＲ反応液１μｌをpGEM-Tベクター５０ｎｇ
に挿入し、大腸菌DH5αに遺伝子導入した。得られたcＤ
ＮＡ断片の塩基配列をABI377ＤＮＡシーケンサーを用い
て決定し、先に決定した下流部分の配列と結合すること
によって、全翻訳領域の塩基配列を決定し（配列番号
３）、塩基配列より推定されるアミノ酸配列を推定した
（配列番号４）。

【００８８】

【実施例４】 マウスLDE-1の発現部位の検討 ８週齢のマウス（C57BL6）より各種臓器を摘出し、ドラ
イアイスにて急速に冷凍した。凍結した臓器をISOGEN
（日本国ニッポンジーン）３mlに溶解し、添付文書に従
ってトータルＲＮＡを調製した。また、種々の細胞株か
らも同様にしてトータルＲＮＡを調製した。調製したト
ータルＲＮＡ ５μｇからオリゴｄＴプライマー、Super
scriptIIを用いて、添付文書に従ってcＤＮＡを合成し
た。合成したcＤＮＡの内2０分の１量を鋳型とし、mLDE
181（GCCTCTCCCCAAACAACTTCGTCT）（配列番号２３）、m
LDE182（TTCTTCTGGTTTGTGTTTTTGAGC）（配列番号２４）
を用いてＰＣＲを行った。

【００８９】反応液量は２０μｌ、反応液組成は、各プ
ライマー濃度は０．２μＭ、それ以外はTaKaRa LA PCR
Kit Ver.2添付文書に従った。ＰＣＲ条件は、９４℃、
３０秒、４５℃、３０秒、７２℃、１分からなる行程を
１サイクルとして４０サイクル実施した。得られた反応
液のうち１０μｌを２％アガロースゲルにて電気泳動
し、２８３ｂｐの増幅断片の有無を確認した。その結
果、調べた全ての組織、細胞で発現が確認された。調べ
た組織、細胞は成体の脳、心臓、肝臓、骨格筋、骨髄、
脾臓、胸腺、卵黄嚢、胎仔AGM領域、各種細胞株（Balb3
T3、Swiss3T3）であった。

【００９０】

【実施例５】 マウス造血幹細胞に対する造血幹細胞あ
るいは造血前駆細胞の分化抑制活性の検討 （１）造血幹細胞の分離 以下の細胞分画法の基本的な手技は、Herzenberg, L.
A.. 「Weir s Handbookof Experimental Immunology,
5th edition」、Blackwell Science Inc. 1997、高津聖
志、「免疫研究の基礎技術」羊土社、１９９５年、に従
って行った。細胞分離用に用いた抗体は全て、Pharming
en社より購入した。 ８〜１０週令のC57BL-Ly5.1pepマ
ウス（日本クレア社に飼育委託）より骨髄細胞を分離し
た。骨髄細胞懸濁液を、Lymphoprep（Nycomed社）に重
層し、１５００ｒｐｍ，２５℃，３０分間遠心し、界面
に集まった細胞を回収した。細胞を染色バッファー（Ｐ
ＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）、５％ＦＣＳ（Hyclone
社）, ０．０５％ＮａＮ₃）で２回洗い、染色バッファ
ーに懸濁した。細胞懸濁液にビオチン化した分化抗原マ
ーカーに対する抗体、つまり、抗CD4抗体、抗CD8抗体、
抗CD11b抗体、抗Gr-1抗体、抗B220抗体、及び抗Ter119
抗体（以上、ファーミンジェン社から購入）を添加し、
氷中で３０分間放置した。

【００９１】その後、染色バッファーで２回洗浄後、ア
ビジンをコートした磁性体ビーズ（アビジンマグネット
ビーズ、Perseptive社）を添加し、氷中で３０分間放置
した。再度、染色バッファーで２回洗浄後、磁石を用い
てマグネットビーズを集めて、分化抗原を発現している
細胞を除去し、分化抗原陰性細胞群（Lin^-細胞）を取得
した。Lin^-細胞に、ＦＩＴＣ標識抗CD34抗体、フィコエ
リスリン（Phycoerythrin：PE）標識抗Sca-1抗体、テキ
サスレッド（Texas Red）標識アビジン、アロフィコシ
アニン（Allophycocyanin：APC）標識抗c-Kit抗体を添
加し、氷中で３０分間放置した。染色バッファーで２回
洗浄後、セルソーター（FACSVantage、Becton Dickinso
n社）にて、造血幹細胞画分（CD34陰性〜弱陽性、Sca-1
陽性、c-Kit陽性細胞）を選別した。

【００９２】（２）ＤＳＬペプチドの合成 ヒト・ジャグド−１、マウスDll-1、マウスLDE-1のＤＳ
Ｌ領域の１７マーのアミノ酸配列に相当するペプチド
を、パーキンエルマー、モデル433ペプチド合成機（Per
kin-Elmer社）で合成した。合成したペプチドは、一部
を逆相ＨＰＬＣ（ウォーターズ社）を用いて分取し、マ
ススペクトロメトリー（Perseptive社、ボイジャー）に
より、目的の配列の溶出画分を同定した。さらに、逆相
ＨＰＬＣにより大量に合成ペプチドの精製を行った。分
取サンプルの一部について、マススペクトロメトリーで
分子量とアミノ酸組成を決定し、さらに、一部を６Ｎの
塩酸中、１５０℃１時間放置し、分解した後、アミノ酸
組成分析機（日立製作所、L8500）を用いてアミノ酸組
成を調べ、目的のペプチドが合成されていることを確認
した。各ペプチドの配列は、ヒト・ジャグド−１；CDDY
YYGFGCNKFCRPR（配列番号２５）、マウスDll-1；CDEHYY
GEGCSVFCRPR（配列番号２６）、マウスLDE-1；CSDNYYGE
SCSRLCKKR（配列番号２７）である。

【００９３】（３）ＤＳＬペプチドの評価 造血幹細胞を培養する際の基礎培地としては、SF-03培
地（三光純薬）に０．１％ＢＳＡ（三光純薬）、マウス
ＳＣＦ｛幹細胞成長因子（stem cell factor）｝（20ng
/ml）（キリンビール（株））、ヒトIL-6（インターロ
イキン−６）（20ng/ml）（キリンビール（株））、マ
ウス IL-11（インターロイキン−１１）（20ng/ml）（R
and D Systems社）、およびヒトFlt3/Flk2-ligand（50
ng/ml）（Rand D Systems社）（Lyman, S.D. Cell, 75:
1157, 1993）を添加したものを用いた。上記で用いた造
血因子は、いずれもリコンビナント体であり、純粋なも
のである。

【００９４】上記培地に、ＤＳＬペプチドを５μＭもし
くは１０μＭ添加し、あるいはペプチドを添加せずに、
上記方法によりセルソーターにより分離した造血幹細胞
を３０個ずつ加え、９６穴プレート中で１週間培養をお
こなった。培養後、各ウエルにC57BL/6N（日本チャール
スリバー）の骨髄から調製したLin^-細胞を加え、各ウエ
ルの細胞を懸濁後、致死量のＸ線を照射（９．５Ｇｙ）
したC57BL/6N（日本チャールスリバー社）に尾部静脈よ
り移植した。移植１ヶ月後に、各マウスの眼窩静脈より
血液を採血し、赤血球を溶血後、細胞をFITC-抗Ly5.1抗
体、PE-抗Mac-1抗体、PE-抗Gr-1抗体、APC抗B220抗体、
APC抗Thy-1抗体で染色して、骨髄球系（Mac-1陽性また
はGr-1陽性）細胞、およびリンパ球系（B220陽性または
Thy-1陽性）細胞における、Ly5.1抗体陽性の割合をフロ
ーサイトメトリーにより算定した。

【００９５】（４）結果 上記評価の結果を図２に示した。図２中、インプット
（Input）は、幹細胞の培養を行わなかったときの結果
を、コントロール（Control）は、ＤＳＬペプチドを加
えずに培養したときの結果を示す。図２に示したよう
に、ＤＳＬペプチド存在下で造血幹細胞を培養したもの
では、ペプチド非存在下で培養したものと比べ、末梢血
に占める培養幹細胞に由来する細胞の割合が高いことが
判明した。このことは、ＤＳＬペプチド存在下で造血幹
細胞を培養することで、造血幹細胞もしくは前駆細胞を
より効率よく増殖させることができることを示してい
る。

【００９６】以下に、配列表に記載した各配列のリスト
を示す。

【００９７】

【発明の効果】本発明により、新規なノッチリガンド、
その遺伝子、並びに、造血幹細胞又は造血前駆細胞の分
化を抑制するポリペプチドが提供される。本発明のポリ
ペプチドを用いることにより、造血幹細胞又は造血前駆
細胞を分化させずに増殖させることが可能になる。

【００９８】

【配列表】 Sequence Listing <110> 麒麟麦酒株式会社 <120> 新規遺伝子、分化抑制ポリペプチド及びそれらの利用 <130> P-5772 <141> 1998-07-13 <160> 44 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００９９】 <210> 1 <211> 2061 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(2058) <400> 1 atg acg cct gcg tcc cgg agc gcc tgt cgc tgg gcg cta ctg ctg ctg 48 Met Thr Pro Ala Ser Arg Ser Ala Cys Arg Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 gcg gta ctg tgg ccg cag cag cgc gct gcg ggc tcc ggc atc ttc cag 96 Ala Val Leu Trp Pro Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Ile Phe Gln 20 25 30 ctg cgg ctg cag gag ttc gtc aac cag cgc ggt atg ctg gcc aat ggg 144 Leu Arg Leu Gln Glu Phe Val Asn Gln Arg Gly Met Leu Ala Asn Gly 35 40 45 cag tcc tgc gaa ccg ggc tgc cgg act ttc ttc cgc atc tgc ctt aag 192 Gln Ser Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Ile Cys Leu Lys 50 55 60 cac ttc cag gca acc ttc tcc gag gga ccc tgc acc ttt ggc aat gtc 240 His Phe Gln Ala Thr Phe Ser Glu Gly Pro Cys Thr Phe Gly Asn Val 65 70 75 80 tcc acg ccg gta ttg ggc acc aac tcc ttc gtc gtc agg gac aag aat 288 Ser Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Val Val Arg Asp Lys Asn 85 90 95 agc ggc agt ggt cgc aac cct ctg cag ttg ccc ttc aat ttc acc tgg 336 Ser Gly Ser Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp 100 105 110 ccg gga acc ttc tca ctc aac atc caa gct tgg cac aca ccg gga gac 384 Pro Gly Thr Phe Ser Leu Asn Ile Gln Ala Trp His Thr Pro Gly Asp 115 120 125 gac ctg cgg cca gag act tcg cca gga aac tct ctc atc agc caa atc 432 Asp Leu Arg Pro Glu Thr Ser Pro Gly Asn Ser Leu Ile Ser Gln Ile 130 135 140 atc atc caa ggc tct ctt gct gtg ggt aag att tgg cga aca gac gag 480 Ile Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Lys Ile Trp Arg Thr Asp Glu 145 150 155 160 caa aat gac acc ctc acc aga ctg agc tac tct tac cgg gtc atc tgc 528 Gln Asn Asp Thr Leu Thr Arg Leu Ser Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys 165 170 175 agt gac aac tac tat gga gag agc tgt tct cgc cta tgc aag aag cgc 576 Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Glu Ser Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg 180 185 190 gat gac cac ttc gga cat tat gag tgc cag cca gat ggc agc ctg tcc 624 Asp Asp His Phe Gly His Tyr Glu Cys Gln Pro Asp Gly Ser Leu Ser 195 200 205 tgc ctg ccg ggc tgg act ggg aag tac tgt gac cag cct ata tgt ctt 672 Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Lys Tyr Cys Asp Gln Pro Ile Cys Leu 210 215 220 tct ggc tgt cat gag cag aat ggt tac tgc agc aag cca gat gag tgc 720 Ser Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Asp Glu Cys 225 230 235 240 atc tgc cgt cca ggt tgg cag ggt cgc ctg tgc aat gaa tgt atc ccc 768 Ile Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro 245 250 255 cac aat ggc tgt cgt cat ggc acc tgc agc atc ccc tgg cag tgt gcc 816 His Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Ile Pro Trp Gln Cys Ala 260 265 270 tgc gat gag gga tgg gga ggt ctg ttt tgt gac caa gat ctc aac tac 864 Cys Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr 275 280 285 tgt act cac cac tct ccg tgc aag aat gga tca acg tgt tcc aac agt 912 Cys Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ser Thr Cys Ser Asn Ser 290 295 300 ggg cca aag ggt tat acc tgc acc tgt ctc cca ggc tac act ggt gag 960 Gly Pro Lys Gly Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Pro Gly Tyr Thr Gly Glu 305 310 315 320 cac tgt gag ctg gga ctc agc aag tgt gcc agc aac ccc tgt cga aat 1008 His Cys Glu Leu Gly Leu Ser Lys Cys Ala Ser Asn Pro Cys Arg Asn 325 330 335 ggt ggc agc tgt aag gac cag gag aat agc tac cac tgc ctg tgt ccc 1056 Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asn Ser Tyr His Cys Leu Cys Pro 340 345 350 cca ggc tac tat ggc cag cac tgt gag cat agt acc ttg acc tgc gcg 1104 Pro Gly Tyr Tyr Gly Gln His Cys Glu His Ser Thr Leu Thr Cys Ala gac tca ccc tgc ttc aat ggg ggc tct tgc cgg gag cgc aac cag ggg 1152 Asp Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly 370 375 380 tcc agt tat gcc tgc gaa tgc ccc ccc aac ttt acc ggc tct aac tgt 1200 Ser Ser Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys 385 390 395 400 gag aag aaa gta gac agg tgt acc agc aac ccg tgt gcc aat gga ggc 1248 Glu Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly 405 410 415 cag tgc cag aac aga ggt cca agc cga acc tgc cgc tgc cgg cct gga 1296 Gln Cys Gln Asn Arg Gly Pro Ser Arg Thr Cys Arg Cys Arg Pro Gly 420 425 430 ttc aca ggc acc cac tgt gaa ctg cac atc agc gat tgt gcc cga agt 1344 Phe Thr Gly Thr His Cys Glu Leu His Ile Ser Asp Cys Ala Arg Ser 435 440 445 ccc tgt gcc cac ggg ggc act tgc cac gat ctg gag aat ggg cct gtg 1392 Pro Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Pro Val 450 455 460 tgc acc tgc ccc gct ggc ttc tct gga agg cgc tgc gag gtg cgg ata 1440 Cys Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Ile 465 470 475 480 acc cac gat gcc tgt gcc tcc gga ccc tgc ttc aat ggg gcc acc tgc 1488 Thr His Asp Ala Cys Ala Ser Gly Pro Cys Phe Asn Gly Ala Thr Cys 485 490 495 tac act ggc ctc tcc cca aac aac ttc gtc tgc aac tgt cct tat ggc 1536 Tyr Thr Gly Leu Ser Pro Asn Asn Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly 500 505 510 ttt gtg ggc agc cgc tgc gag ttt ccc gtg ggc ttg cca ccc agc ttc 1584 Phe Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe 515 520 525 ccc tgg gta gct gtc tcg ctg ggc gtg ggg cta gtg gta ctg ctg gtg 1632 Pro Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Val Val Leu Leu Val 530 535 540 ctc ctg gtc atg gtg gta gtg gct gtg cgg cag ctg cgg ctt cgg agg 1680 Leu Leu Val Met Val Val Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg 545 550 555 560 ccc gat gac gag agc agg gaa gcc atg aac aat ctg tca gac ttc cag 1728 Pro Asp Asp Glu Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln 565 570 575 aag gac aac cta atc cct gcc gcc cag ctc aaa aac aca aac cag aag 1776 Lys Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys 580 585 590 aag gag ctg gaa gtg gac tgt ggt ctg gac aag tcc aat tgt ggc aaa 1824 Lys Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys 595 600 605 ctg cag aac cac aca ttg gac tac aat cta gcc ccg gga ctc cta gga 1872 Leu Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Leu Leu Gly 610 615 620 cgg ggc ggc atg cct ggg aag tat cct cac agt gac aag agc tta gga 1920 Arg Gly Gly Met Pro Gly Lys Tyr Pro His Ser Asp Lys Ser Leu Gly 625 630 635 640 gag aag gtg cca ctt cgg tta cac agt gag aag cca gag tgt cga ata 1968 Glu Lys Val Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg Ile 645 650 655 tca gcc att tgc tct ccc agg gac tct atg tac caa tca gtg tgt ttg 2016 Ser Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu 660 665 670 ata tca gaa gag agg aac gag tgt gtg att gcc aca gag gta taa 2061 Ile Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val 675 680 685

【０１００】 <210> 2 <211> 686 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Thr Pro Ala Ser Arg Ser Ala Cys Arg Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Val Leu Trp Pro Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Ile Phe Gln 20 25 30 Leu Arg Leu Gln Glu Phe Val Asn Gln Arg Gly Met Leu Ala Asn Gly 35 40 45 Gln Ser Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Ile Cys Leu Lys 50 55 60 His Phe Gln Ala Thr Phe Ser Glu Gly Pro Cys Thr Phe Gly Asn Val 65 70 75 80 Ser Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Val Val Arg Asp Lys Asn 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp 100 105 110 Pro Gly Thr Phe Ser Leu Asn Ile Gln Ala Trp His Thr Pro Gly Asp 115 120 125 Asp Leu Arg Pro Glu Thr Ser Pro Gly Asn Ser Leu Ile Ser Gln Ile 130 135 140 Ile Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Lys Ile Trp Arg Thr Asp Glu 145 150 155 160 Gln Asn Asp Thr Leu Thr Arg Leu Ser Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys 165 170 175 Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Glu Ser Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg 180 185 190 Asp Asp His Phe Gly His Tyr Glu Cys Gln Pro Asp Gly Ser Leu Ser 195 200 205 Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Lys Tyr Cys Asp Gln Pro Ile Cys Leu 210 215 220 Ser Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Asp Glu Cys 225 230 235 240 Ile Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro 245 250 255 His Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Ile Pro Trp Gln Cys Ala 260 265 270 Cys Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr 275 280 285 Cys Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ser Thr Cys Ser Asn Ser 290 295 300 Gly Pro Lys Gly Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Pro Gly Tyr Thr Gly Glu 305 310 315 320 His Cys Glu Leu Gly Leu Ser Lys Cys Ala Ser Asn Pro Cys Arg Asn 325 330 335 Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asn Ser Tyr His Cys Leu Cys Pro 340 345 350 Pro Gly Tyr Tyr Gly Gln His Cys Glu His Ser Thr Leu Thr Cys Ala 355 360 365 Asp Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly 370 375 380 Ser Ser Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys 385 390 395 400 Glu Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly 405 410 415 Gln Cys Gln Asn Arg Gly Pro Ser Arg Thr Cys Arg Cys Arg Pro Gly 420 425 430 Phe Thr Gly Thr His Cys Glu Leu His Ile Ser Asp Cys Ala Arg Ser 435 440 445 Pro Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Pro Val 450 455 460 Cys Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Ile 465 470 475 480 Thr His Asp Ala Cys Ala Ser Gly Pro Cys Phe Asn Gly Ala Thr Cys 485 490 495 Tyr Thr Gly Leu Ser Pro Asn Asn Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly 500 505 510 Phe Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe 515 520 525 Pro Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Val Val Leu Leu Val 530 535 540 Leu Leu Val Met Val Val Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg 545 550 555 560 Pro Asp Asp Glu Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln 565 570 575 Lys Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys 580 585 590 Lys Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys 595 600 605 Leu Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Leu Leu Gly 610 615 620 Arg Gly Gly Met Pro Gly Lys Tyr Pro His Ser Asp Lys Ser Leu Gly 625 630 635 640 Glu Lys Val Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg Ile 645 650 655 Ser Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu 660 665 670 Ile Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val 675 680 685

【０１０１】 <210> 3 <211> 2058 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2055) <400> 3 atg gcg gca gcg tcc cgg agc gcc tct ggc tgg gcg cta ctg ctg ctg 48 Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 gtg gca ctt tgg cag cag cgc gcg gcc ggc tcc ggc gtc ttc cag ctg 96 Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu 20 25 30 cag ctg cag gag ttc atc aac gag cgc ggc gta ctg gcc agt ggg cgg 144 Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg 35 40 45 cct tgc gag ccc ggc tgc cgg act ttc ttc cgc gtc tgc ctt aag cac 192 Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His 50 55 60 ttc cag gcg gtc gtc tcg ccc gga ccc tgc acc ttc ggg acc gtc tcc 240 Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 65 70 75 80 acg ccg gta ttg ggc acc aac tcc ttc gct gtc cgg gac gac agt agc 288 Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser 85 90 95 ggc ggg ggg cgc aac cct ctc caa ctg ccc ttc aat ttc acc tgg ccg 336 Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro 100 105 110 ggt acc ttc tcg ctc atc atc gaa gct tgg cac gcg cca gga gac gac 384 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp 115 120 125 ctg cgg cca gag gcc ttg cca cca gat gca ctc atc agc aag atc gcc 432 Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala 130 135 140 atc cag ggc tcc cta gct gtg ggt cag aac tgg tta ttg gat gag caa 480 Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln 145 150 155 160 acc agc acc ctc aca agg ctg cgc tac tct tac cgg gtc atc tgc agt 528 Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser 165 170 175 gac aac tac tat gga gac aac tgc tcc cgc ctg tgc aag aag cgc aat 576 Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn 180 185 190 gac cac ttc ggc cac tat gtg tgc cag cca gat ggc aac ttg tcc tgc 624 Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys 195 200 205 ctg ccc ggt tgg act ggg gaa tat tgc caa cag cct atc tgt ctt tcg 672 Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser 210 215 220 ggc tgt cat gaa cag aat ggc tac tgc agc aag cca gca gag tgc ctc 720 Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu 225 230 235 240 tgc cgc cca ggc tgg cag ggc cgg ctg tgt aac gaa tgc atc ccc cac 768 Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His 245 250 255 aat ggc tgt cgc cac ggc acc tgc agc act ccc tgg caa tgt act tgt 816 Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys 260 265 270 gat gag ggc tgg gga ggc ctg ttt tgt gac caa gat ctc aac tac tgc 864 Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys 275 280 285 acc cac cac tcc cca tgc aag aat ggg gca acg tgc tcc aac agt ggg 912 Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 300 cag cga agc tac acc tgc acc tgt cgc cca ggc tac act ggt gtg gac 960 Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 305 310 315 320 tgt gag ctg gag ctc agc gag tgt gac agc aac ccc tgt cgc aat gga 1008 Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 325 330 335 ggc agc tgt aag gac cag gag gat ggc tac cac tgc ctg tgt cct ccg 1056 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 340 345 350 ggc tac tat ggc ctg cat tgt gaa cac agc acc ttg agc tgc gcc gac 1104 Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp 355 360 365 tcc ccc tgc ttc aat ggg ggc tcc tgc cgg gag cgc aac cag ggg gcc 1152 Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala 370 375 380 aac tat gct tgt gaa tgt ccc ccc aac ttc acc ggc tcc aac tgc gag 1200 Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 385 390 395 400 aag aaa gtg gac agg tgc acc agc aac ccc tgt gcc aac ggg gga cag 1248 Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln 405 410 415 tgc ctg aac cga ggt cca agc cgc atg tgc cgc tgc cgt cct gga ttc 1296 Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 420 425 430 acg ggc acc tac tgt gaa ctc cac gtc agc gac tgt gcc cgt aac cct 1344 Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro 435 440 445 tgc gcc cac ggt ggc act tgc cat gac ctg gag aat ggg ctc atg tgc 1392 Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys 450 455 460 acc tgc cct gcc ggc ttc tct ggc cga cgc tgt gag gtg cgg aca tcc 1440 Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 465 470 475 480 atc gat gcc tgt gcc tcg agt ccc tgc ttc aac agg gcc acc tgc tac 1488 Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 485 490 495 acc gac ctc tcc aca gac acc ttt gtg tgc aac tgc cct tat ggc ttt 1536 Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe 500 505 510 gtg ggc agc cgc tgc gag ttc ccc gtg ggc ttg ccg ccc agc ttc ccc 1584 Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro 515 520 525 tgg gtg gcc gtc tcg ctg ggt gtg ggg ctg gca gtg ctg ctg gta ctg 1632 Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Leu Leu Val Leu 530 535 540 ctg ggc atg gtg gca gtg gct gtg cgg cag ctg cgg ctt cga cgg ccg 1680 Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg Pro 545 550 555 560 gac gac ggc agc agg gaa gcc atg aac aac ttg tcg gac ttc cag aag 1728 Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln Lys 565 570 575 gac aac ctg att cct gcc gcc cag ctt aaa aac aca aac cag aag aag 1776 Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys Lys 580 585 590 gag ctg gaa gtg gac tgt ggc ctg gac aag tcc aac tgt ggc aaa cag 1824 Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys Gln 595 600 605 caa aac cac aca ttg gac tat aat ctg gcc cca ggg ccc ctg ggg cgg 1872 Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Pro Leu Gly Arg 610 615 620 ggg acc atg cca gga aag ttt ccc cac agt gac aag agc tta gga gag 1920 Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His Ser Asp Lys Ser Leu Gly Glu 625 630 635 640 aag gcg cca ctg cgg tta cac agt gaa aag cca gag tgt cgg ata tca 1968 Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg Ile Ser 645 650 655 gcg ata tgc tcc ccc agg gac tcc atg tac cag tct gtg tgt ttg ata 2016 Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu Ile 660 665 670 tca gag gag agg aat gaa tgt gtc att gcc acg gag gta taa 2058 Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val 675 680 685

【０１０２】 <210> 4 <211> 685 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg 35 40 45 Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His 50 55 60 Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 65 70 75 80 Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro 100 105 110 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp 115 120 125 Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala 130 135 140 Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln 145 150 155 160 Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser 165 170 175 Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn 180 185 190 Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys 195 200 205 Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser 210 215 220 Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu 225 230 235 240 Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His 245 250 255 Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys 260 265 270 Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys 275 280 285 Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 305 310 315 320 Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 325 330 335 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 340 345 350 Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp 355 360 365 Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala 370 375 380 Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 385 390 395 400 Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln 405 410 415 Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 420 425 430 Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro 435 440 445 Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys 450 455 460 Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 465 470 475 480 Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 485 490 495 Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe 500 505 510 Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro 515 520 525 Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Leu Leu Val Leu 530 535 540 Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg Pro 545 550 555 560 Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln Lys 565 570 575 Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys Lys 580 585 590 Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys Gln 595 600 605 Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Pro Leu Gly Arg 610 615 620 Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His Ser Asp Lys Ser Leu Gly Glu 625 630 635 640 Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg Ile Ser 645 650 655 Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu Ile 660 665 670 Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val 675 680 685

【０１０３】

【０１０４】

【０１０５】 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_difference <222> (11,17,29,35) <223> Y=T or C <220> <221> misc_difference <222> (12,30) <223> M=A or C <220> <221> misc_difference <222> (13,32) <223> R=G or A <220> <221> misc_difference <222> (14,20,23,26) <223> N=A or C or G or T <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 7 ATGAATTCTG YMRNAAYGGN GGNACNTGYM ARGAY 35

【０１０６】 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_difference <222> (9,21,27,33) <223> R=G or A <220> <221> misc_difference <222> (12,15,18,24,30) <223> N=A or C or G or T <220> <221> misc_difference <222> (16) <223> D=A or G or T <220> <221> misc_difference <222> (17,31) <223> K=G or T <220> <221> misc_difference <222> (20) <223> Y=T or C <220> <221> misc_difference <222> (25) <223> W=A or T <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 ATGAATTCRT ANCCNDKNTY RCANWTRCAN TKRTA 35

【０１０７】 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 9 gtaaaacgac ggccagtg 18

【０１０８】 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 10 caggaaacag ctatgac 17

【０１０９】 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 11 actatggcca gcactgtgag cata 24

【０１１０】 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 12 ggcagcggc aggttcggctt ggac 24

【０１１１】 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 13 aataaccctc actaaaggga 20

【０１１２】 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 14 taatacgact cactataggg 20

【０１１３】 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 15 ccatcctaat acgactcact atagggc 27

【０１１４】 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 16 ctggaagtgc ttaaggcaga tgcggaagaa 30

【０１１５】 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 17 actcactata gggctcgagc ggc 23

【０１１６】 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 18 gttcgcagga ctgcccattg gccagcatac 30

【０１１７】 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 19 tcttccgcat ctgccttaag cact 24

【０１１８】 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 20 agtctctggc cgcaggtcgt ctcc 24 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 21 acgaccgcct ggaagtgctt aaggcagacg 30

【０１１９】 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 22 cggaagaaag tccggcagcc gggctcgcaa 30

【０１２０】 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 23 gcctctcccc aaacaacttc gtct 24

【０１２１】 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 24 ttcttctggt ttgtgttttt gagc 24

【０１２２】 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthtic peptide <400> 25 Cys Asp Asp Tyr Tyr Tyr Gly Phe Gly Cys Asn Lys Phe Cys Arg Pro 1 5 10 15 Arg

【０１２３】 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthtic peptide <400> 26 Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys Arg Pro 1 5 10 15 Arg

【０１２４】 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthtic peptide <400> 27 Cys Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Glu Ser Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys 1 5 10 15 Arg

【０１２５】 <210> 28 <211> 45 <212> PRT <213> Rttus norvegicus <400> 28 Val Thr Cys Asp Asp His Tyr Tyr Gly Phe Gly Cys Asn Lys Phe Cys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Asp Asp Phe Phe Gly His Tyr Ala Cys Asp Gln Asn Gly 20 25 30 Asn Lys Thr Cys Met Glu Gly Trp Met Gly Pro Glu Cys 35 40 45

【０１２６】 <210> 29 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Val Thr Cys Asp Asp Tyr Tyr Tyr Gly Phe Gly Cys Asn Lys Phe Cys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Asp Asp Phe Phe Gly His Tyr Ala Cys Asp Gln Asn Gly 20 25 30 Asn Lys Thr Cys Met Glu Gly Trp Met Gly Pro Glu Cys 35 40 45

【０１２７】 <210> 30 <211> 45 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 30 Val Thr Cys Ala Glu His Tyr Tyr Gly Phe Gly Cys Asn Lys Phe Cys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Asp Asp Phe Phe Thr His His Thr Cys Asp Gln Asn Gly 20 25 30 Asn Lys Thr Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Glu Cys 35 40 45

【０１２８】 <210> 31 <211> 45 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 31 Val Lys Cys Asp Glu Asn Tyr Tyr Ser Ala Leu Cys Asn Lys Phe Cys 1 5 10 15 Gly Pro Arg Asp Asp Phe Val Gly His Tyr Thr Cys Asp Gln Asn Gly 20 25 30 Asn Lys Ala Cys Met Glu Gly Trp Met Gly Glu Glu Cys 35 40 45

【０１２９】 <210> 32 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Val Arg Cys Asp Glu Asn Tyr Tyr Ser Ala Thr Cys Asn Lys Phe Cys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Asn Asp Phe Phe Gly His Tyr Thr Cys Asp Gln Tyr Gly 20 25 30 Asn Lys Ala Cys Met Asp Gly Trp Met Gly Lys Glu Cys 35 40 45

【０１３０】 <210> 33 <211> 45 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 33 Phe Val Cys Asp Glu Tyr Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Asp Tyr Cys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Ser Cys Gly Glu Lys Gly 20 25 30 Glu Lys Leu Cys Asn Pro Gly Trp Lys Gly Leu Tyr Cys 35 40 45

【０１３１】 <210> 34 <211> 45 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 34 Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Asp Asp Arg Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly 20 25 30 Glu Lys Val Cys Asn Pro Gly Trp Lys Gly Gln Tyr Cys 35 40 45

【０１３２】 <210> 35 <211> 45 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Asp Arg Gly 20 25 30 Glu Lys Met Cys Asp Pro Gly Trp Lys Gly Gln Tyr Cys 35 40 45

【０１３３】 <210> 36 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly 20 25 30 Glu Lys Val Cys Asn Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys 35 40 45

【０１３４】 <210> 37 <211> 45 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 37 Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly 20 25 30 Glu Ile Ile Cys Asp Ala Gly Trp Lys Gly Gln Tyr Cys 35 40 45

【０１３５】 <210> 38 <211> 45 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 38 Val Phe Cys Asp Glu Phe Tyr Phe Gly Glu Ala Cys Ser Asp Tyr Cys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Asp Asp Thr Leu Gly His Tyr Thr Cys Asp Glu Asn Gly 20 25 30 Asn Lys Glu Cys Leu Val Gly Trp Gln Gly Asp Tyr Cys 35 40 45

【０１３６】 <210> 39 <211> 45 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 39 Val Ser Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Asp Ser Cys Ser Asp Tyr Cys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Asp Asp Asn Phe Gly His Tyr Thr Cys Asp Glu Gln Gly 20 25 30 Asn Arg Leu Cys Met Ser Gly Trp Lys Gly Glu Tyr Cys 35 40 45

【０１３７】 <210> 40 <211> 45 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40 Val Ile Cys Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Glu Ser Cys Ser Arg Leu Cys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Asp Asp His Phe Gly His Tyr Glu Cys Gln Pro Asp Gly 20 25 30 Ser Leu Ser Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Lys Tyr Cys 35 40 45

【０１３８】 <210> 41 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Val Ile Cys Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Asn Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly 20 25 30 Asn Leu Ser Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys 35 40 45

【０１３９】 <210> 42 <211> 45 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 42 Val Thr Cys Asp Leu Asn Tyr Tyr Gly Ser Gly Cys Ala Lys Phe Cys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Asp Asp Ser Phe Gly His Ser Thr Cys Ser Glu Thr Gly 20 25 30 Glu Ile Ile Cys Leu Thr Gly Trp Gln Gly Asp Tyr Cys 35 40 45

【０１４０】 <210> 43 <211> 45 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 43 Val Gln Cys Ala Val Thr Tyr Tyr Asn Thr Thr Cys Thr Thr Phe Cys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Asp Asp Gln Phe Gly His Tyr Ala Cys Gly Ser Glu Gly 20 25 30 Gln Lys Leu Cys Leu Asn Gly Trp Gln Gly Val Asn Cys 35 40 45

【０１４１】 <210> 44 <211> 43 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism:consensus sequence <220> <221> UNSURE <222> (2,3,4,7,8,9,11,12,13,20,24,25,27,28,29,31,32,33,35,36,39,41,42) <400> 44 Cys Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Arg Pro 1 5 10 15 Arg Asx Asp Xaa Phe Gly His Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Cys Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Cys 35 40

【図面の簡単な説明】

【図１】 ノッチリガンドの構造と各種ノッチリガンド
のＤＳＬ領域のアミノ酸配列の比較を示す図。ノッチリ
ガンドの名称の先頭に付された文字は、以下に示す動物
を表す。r：ラット（Rattus norvegicus）、h：ヒト（H
omo sapiens）、ch：ニワトリ（ Gallus gallus）、x：
カエル（Xenopus laevis）、m：マウス（Mus musculu
s）、dr：ゼブラフィッシュ（Danio rerio）、d:ショウ
ジョウバエ（Drosophila melanogaster）

【図２】 本発明のペプチドの造血幹細胞又は造血前駆
細胞に対する効果を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 35/12 ４Ｃ０８７ // Ａ６１Ｋ 35/12 35/28 ４Ｈ０４５ 35/28 48/00 ＡＢＹ 48/00 ＡＢＹ ＡＤＹ ＡＤＹ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 西川 光郎 群馬県高崎市宮原町３番地 麒麟麦酒株式 会社医薬探索研究所内 (72)発明者 大沢 匡毅 群馬県高崎市宮原町３番地 麒麟麦酒株式 会社医薬探索研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA01 CA09 DA02 EA04 GA11 HA08 HA17 HA19 4B063 QA13 QQ08 QQ42 QR08 QR48 QR56 QR62 QS02 QS16 QS25 QX01 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA91Y AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA07 AA13 BA01 BA19 BA22 DA01 DA12 DA18 ZA512 ZB212 4C087 AA01 AA02 BB44 BB65 CA12 4H045 AA10 AA30 BA10 BA17 BA19 CA40 DA01 DA02 DA13 EA20 EA34 FA34 FA72 FA74 GA25

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。 （Ａ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を有するタ
   ンパク質。 （Ｂ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において、
   １若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入された
   アミノ酸配列を有し、かつ、造血幹細胞及び造血前駆細
   胞の分化抑制能を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからな
   るノッチリガンドLDE-1遺伝子。 （ａ）配列番号１又は３に示す塩基配列を有するＤＮ
   Ａ。 （ｂ）前記（ａ）のＤＮＡと相同性が６０％以上の塩基
   配列を有し、かつ、造血幹細胞及び造血前駆細胞の分化
   抑制能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 ノッチリガンドのＤＳＬ領域のアミノ酸
   配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を有し、かつ、造
   血幹細胞及び造血前駆細胞の分化抑制能を有するポリペ
   プチド（配列番号２５に示すアミノ酸配列を有するポリ
   ペプチドを除く）。
4. 【請求項４】 ＤＳＬ領域のアミノ酸配列が、配列番号
   ３５、４０又は４１に示すアミノ酸配列である請求項３
   記載のポリペプチド。
5. 【請求項５】 配列番号２６もしくは２７に示すアミノ
   酸配列、又は配列番号４１のアミノ酸番号３〜１９から
   なるアミノ酸配列からなる請求項４記載のポリペプチ
   ド。
6. 【請求項６】 請求項３〜５のいずれか一項に記載のポ
   リペプチドをコードするＤＮＡ。
7. 【請求項７】 ノッチリガンドのＤＳＬ領域のアミノ酸
   配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を有し、かつ、造
   血幹細胞及び造血前駆細胞の分化抑制能を有するポリペ
   プチドまたは請求項１記載のタンパク質の存在下で造血
   幹細胞または造血前駆細胞を培養することを含む、造血
   幹細胞または造血前駆細胞の増殖方法。
8. 【請求項８】 前記ノッチリガンドが、配列番号２９、
   ３５、４０および４１から選ばれるアミノ酸配列を有す
   る請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】 前記培養に、血液細胞刺激因子の添加を
   伴う、請求項７または８記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記血液細胞刺激因子が、幹細胞成長
    因子、インターロイキン−６、インターロイキン−１
    １、Flt3/Flk2-ligand、トロンボポエチンから選ばれる
    ものである請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 ノッチリガンドのＤＳＬ領域のアミノ
    酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を有し、かつ、
    造血幹細胞及び造血前駆細胞の分化抑制能を有するポリ
    ペプチド又は請求項１記載のタンパク質を構成成分とし
    て含む、造血幹細胞および造血前駆細胞の生体外増幅用
    試薬または試薬キット。
12. 【請求項１２】 請求項２又は請求項６のＤＮＡが導入
    されて形質転換された形質転換細胞。