ES2292204T3 - Receptor de tipo tirosina cinasa humano, kdr. - Google Patents

Receptor de tipo tirosina cinasa humano, kdr. Download PDF

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Kenneth A. Thomas
Xianzhi Mao
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una forma biológicamente activa de la proteína KDR humana en la que la posición 848 es Val, la posición 498 es Glu, la posición 772 es Ala, la posición 787 es Arg, la posición 835 es Lys y la posición 1.347 es Ser.

Description

Receptor de tipo tirosina cinasa humano, KDR.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada (polinucleótido) que codifica un receptor de tipo tirosina cinasa humano, KDR, que se expresa en células endoteliales humanas. Este receptor se activa por VEGF y media una señal mitogénica. La presente invención también se refiere a vectores recombinantes y a huéspedes recombinantes que contienen un fragmento de ADN que codifica el KDR humano, un fragmento de ADN que codifica la porción intracelular del KDR, un fragmento de ADN que codifica la porción extracelular del KDR con o sin una secuencia de anclaje a la membrana, formas sustancialmente purificadas del KDR humano asociado y formas de KDR humanas mutantes.
Antecedentes de la invención
Las células endoteliales vasculares forman una monocapa luminal no trombogénica a lo largo del sistema vascular. Los mitógenos promueven el desarrollo vascular embrionario, el crecimiento, reparación y angiogénesis en estas células. La angiogénesis supone la degradación proteolítica de la membrana basal en la que residen las células endoteliales, seguida de la posterior migración quimiotáctica y mitosis de estas células para mantener el crecimiento sostenido de un nuevo brote capilar. Una clase de mitógenos selectivos para las células endoteliales vasculares incluye el factor de crecimiento endotelial vascular (denominado VEGF o VEGF-A) y homólogos al factor de crecimiento placentario (PIGF), VEGF-B y VEGF-C.
El VEGF humano se presenta como un homodímero glucosilado en una de las cuatro formas maduras procesadas que contienen 206, 189 (véase la patente de EE.UU. Nº 5.240.848), 165 (véase la patente de EE.UU. Nº 5.332.671) y 121 (patente de EE.UU. Nº 5.332.671) aminoácidos, siendo la forma más frecuente la de 165 aminoácidos. Las formas de 206 aminoácidos y de 189 aminoácidos del VEGF humano contienen todas ellas una inserción de 24 aminoácidos muy básicos que promueve una unión estrecha con la heparina y, presumiblemente, con los proteoglicanos de heparina de las superficies celulares y de las matrices extracelulares (Ferrara y col., 1991, J. Cell. Biochem, 47: 211-
218).
El PIGF humano también es un homodímero glucosilado que comparte una homología del 46% con VEGF a nivel de proteína. Un ayuste diferencial del ARNm del PIGF humano produce precursores de 170 ó 149 restos de aminoácidos, que se procesan mediante proteolisis en sus formas maduras de 152 ó 131 restos de aminoácidos de longitud, respectivamente (Maglione y col., 1993, Oncogene 8: 925-931; Bayne y Thomas, 1992, Publicación EPO Nº 0 506 477 A1; Hauser y Weich, 1993, Growth Factors 9: 259-268).
VEGF-B ha sido aislado y caracterizado (Grimmond y col., 1996, Genoma Research 6:124-131; Olofsson y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2576-2581). Los ADNc humanos de longitud completa codifican precursores de 188 y 207 restos de aminoácidos en los que las porciones terminales NH_{2} se procesan mediante proteolisis para producir las formas maduras de 167 y 186 restos de aminoácidos de longitud. La expresión del VEGF-B humano se encontró predominantemente en corazón y en músculo esquelético como un homodímero unido por enlaces disulfuro. Sin embargo, el VEGF-B humano también puede formar un heterodímero con VEGF (id a 2580).
VEGF-C también se ha aislado y caracterizado (Joukov y col., 1996, EMBO J. 15: 290-298). Se obtuvo un ADNc que codifica VEGF-C a partir de una línea celular de adenocarcinoma prostático humano. La proteína precursora de 32 kDa se procesa mediante proteolisis para generar la forma madura de 23 kDa, que se une al receptor tirosina cinasa Flt-4.
El VEGF y su homólogo transmiten su actividad uniéndose a receptores de tipo tirosina cinasa que atraviesan la membrana plasmática de las células del endotelio vascular que, a continuación, activa una señal mitogénica intracelular. La familia del receptor KDR es el principal receptor de tipo tirosina cinasa que transduce la señal mitogénica iniciada por VEGF.
Shibuya y col. (1990, Oncogene 5: 519-524) describen un gen flt de un receptor de tipo tirosina cinasa humano, que comprende una fase de lectura abierta de 4,2 Kb codificante de una proteína de 1.338 aminoácidos que comprende un dominio extracelular glucosilado, una región que atraviesa la membrana y un dominio predicho con actividad tirosina cinasa.
Pajusola y col. (1992, Cancer Res. 52: 5738-5743) describen un gen de un receptor humano de tipo tirosina cinasa que, como se apuntó anteriormente, se une al VEGF-C humano.
El factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) se une a los receptores de tipo tirosina cinasa de alta afinidad que atraviesan la membrana KDR y Flt-1. El cultivo celular y los experimentos de silenciamiento de genes indican que cada receptor contribuye a diferentes aspectos de la angiogénesis. KDR media la función mitogénica de VEGF mientras que parece que Flt-1 modula funciones no mitogénicas, tales como aquellas asociadas con la adhesión celular. Por tanto, la inhibición de KDR disminuye significativamente el nivel de actividad mitogénica de
VEGF.
El crecimiento vascular en la retina lleva a la degeneración visual que termina en ceguera. El VEGF es responsable de la mayor parte de la actividad angiogénica producida en la retina o próxima a ella en la retinopatía diabética. El ARNm y la proteína VEGF ocular se elevan en condiciones tales como la oclusión de la vena de la retina en primates y disminuyen los niveles de pO_{2} en ratones, lo que lleva a la neovascularización. Las inyecciones intraoculares de anticuerpos monoclonales anti-VEGF o de inmunofusiones del receptor de VEGF inhiben la neovascularización ocular en modelos de neovascularización en roedores y primates. Independientemente de la causa de inducción del VEGF en retinopatía diabética humana, la inhibición del VEGF ocular es útil para el tratamiento de la
enfermedad.
La expresión de VEGF también aumenta de forma significativa en regiones hipóxicas de tumores animales y humanos adyacentes a áreas de necrosis. Los anticuerpos monoclonales y policlonales anti-VEGF inhiben el crecimiento de tumores humanos en ratones desnudos. Aunque estas mismas células tumorales siguen expresando VEGF en cultivo, los anticuerpos no disminuyen la tasa de mitosis de la mayoría, si no de todas, las células tumorales derivadas de células distintas a las células endoteliales vasculares en si. Por tanto, el VEGF derivado de tumores no funciona como un factor mitogénico autocrino para la mayoría de los tumores. Por tanto, el VEGF contribuye al crecimiento tumoral in vivo, promoviendo la angiogénesis a través de sus actividades paracrina quimiotácticas y mitogénicas sobre la célula endotelial vascular. Estos anticuerpos monoclonales también inhiben el crecimiento de los cánceres de colon humano normalmente menos vascularizados en ratones atímicos y disminuyen el número de tumores que surgen a partir de las células inoculadas. La expresión viral de una construcción de unión a VEGF de Flk-1, el homólogo al receptor KDR en ratón, truncado para eliminar los dominios tirosina cinasa citoplásmicos, pero que retienen el anclaje a la membrana, prácticamente suprime el crecimiento de un glioblastoma que puede trasplantarse a ratones, presumiblemente mediante el mecanismo dominante negativo de formación de heterodímeros con los receptores de VEGF que atraviesan la membrana de la célula endotelial. Las células troncales embrionarias, que normalmente crecen como tumores sólidos en ratones desnudos, no producen tumores detectables si se silencian ambos alelos de VEGF. En conjunto estos datos indican la función del VEGF en el crecimiento de tumores sólidos. KDR y Flt-1 están implicados en la neoangiogénesis patológica y los inhibidores de estos receptores son útiles para el tratamiento de enfermedades en las que la neoangiogénesis es parte de la patología general, por ejemplo, vascularización diabética retinal, diversas formas de cáncer así como formas de inflamación, tales como la artritis reumatoide, soriasis, dermatitis de contacto y reacción de hipersensibilidad
Terman y col. (1991, Oncogene 6: 1677-1683; 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 1579-1586) describen un ADNc de longitud completa que codifica una forma de KDR. Sin embargo, la descripción de Terman y col., no identifica un nuevo fragmento de ácido nucleico óptimo que codifica la forma humana del gen del receptor de tipo tirosina cinasa, KDR. Será ventajoso identificar y aislar una secuencia de ADNc humano que codifique una forma optimizada del KDR humano. Una molécula de ácido nucleico que exprese la proteína KDR humana será útil para seleccionar compuestos que actúen como moduladores del dominio proteína cinasa de esta proteína. Este compuesto o compuestos serán útiles para modular la señal mitogénica de VEGF y de proteínas relacionadas con VEGF en las células endoteliales vasculares. La secuencia del ácido nucleico de KDR también puede ser útil para terapia génica codificando una porción de la proteína KDR que podría contener restos de unión al ligando funcional y de anclaje a la membrana pero no actividad tirosina cinasa. También son útiles para la selección de antagonistas de VEGF la proteína KDR completa o una porción de la misma. La secuencia de ácido nucleico de KDR puede transfectarse en células para el análisis de la función en ausencia de Flt-1. La proteína KDR también es útil para el análisis de la estructura por rayos X en presencia o ausencia de ligandos y/o inhibidores. La presente invención aborda y cubre estas necesidades describiendo un fragmento de ácido nucleico aislado que expresa una forma de KDR humano, que mediante modelado por ordenador se muestra como una predicción de mayor actividad y funcionalidad que el KDR descrito
previamente.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada (polinucleótido) que codifica un nuevo gen de un receptor de tipo tirosina cinasa humano, KDR como se muestra en la reivindicación 1. Esta memoria descriptiva describe una nueva molécula de ADN optimizada que tiene la secuencia mostrada en la ID SEC Nº 1 que codifica KDR, un receptor de tipo tirosina cinasa expresado en células endoteliales humanas.
La presente invención también se refiere a fragmentos o mutantes biológicamente activas de la ID SEC Nº 1 que codifican un ARNm que expresa un nuevo gen del receptor del tipo tirosina cinasa humano, KDR. Cualquiera de estos fragmentos y/o mutantes biológicamente activos codificarán una proteína o un fragmento de la proteína que comprende al menos un dominio cinasa intracelular de la proteína KDR humana como se muestra en la ID SEC Nº 2. Cualquiera de estos polinucleótidos incluye, pero no está necesariamente limitado a sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos, truncamientos del extremo amino terminal y truncamientos del extremo carboxilo terminal, de modo que estas mutaciones codifican un ARNm que expresa dicha proteína o fragmento de la proteína de uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico, y útil par la selección de agonistas y/o antagonistas de la función de
KDR.
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La molécula de ácido nucleico aislado de la presente invención puede incluir una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN), tal como ADN genómico y ADN complementario (ADNc), que puede ser de cadena sencilla (cadena codificante o no codificante) o doble, así como ADN sintético, tal como un polinucleótido de cadena sencilla sintetizada. La molécula de ácido nucleico aislado de la presente invención también puede incluir una molécula de ácido ribonucleico (ARN).
La presente invención también se refiere a vectores recombinantes y a huéspedes recombinantes, tanto procariotas como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas descritas a lo largo de esta memoria descriptiva.
La presente invención también se refiere a fracciones subcelulares de membrana de las células huésped recombinantes (tanto procariotas como eucariotas así como tanto células transformadas de forma estable como transitoria) que comprenden los ácidos nucleicos de la presente invención. Estas fracciones subcelulares de membrana comprenderán formas mutante o humana de tipo silvestre de KDR a niveles sustancialmente por encima de los niveles de tipo silvestre y, por tanto, serán útiles para diversos ensayos descritos a lo largo de esta memoria descrip-
tiva.
En la Figura 1 A, en la Figura 1 B y en la ID SEC Nº 1 se describe un aspecto preferido de la presente invención, un ADNc humano que codifica un nuevo gen de un receptor de tipo tirosina cinasa, KDR.
La presente invención también se refiere a una forma sustancialmente purificada del gen del receptor de tipo tirosina cinasa, KDR, que se describe en la Figura 2 y se muestra en la ID SEC Nº 2.
La presente invención también se refiere a fragmentos definidos biológicamente activos de la proteína KDR, como se muestra inicialmente en la ID SEC Nº 2, de uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico y útiles para la selección de agonistas y/o antagonistas de la función KDR.
En la Figura 2 y en la ID SEC Nº 1 se describe un aspecto preferido de la presente invención, la secuencia de aminoácidos de un nuevo gen de un receptor de tipo tirosina cinasa, KDR.
La presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que son construcciones de fusión que expresan proteínas de fusión útiles en ensayos para identificar compuestos que modulan la actividad KDR humana de tipo silvestre. Un aspecto preferido de esta porción de la invención incluye, pero sin limitaciones, construcciones de fusión glutatión S-transferasa (GST)-KDR. Estas construcciones de fusión incluyen, pero sin limitaciones, el dominio tirosina cinasa intracelular del KDR humano como una fusión en fase en el extremo carboxilo terminal del gen GST mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Pueden expresarse proteínas de fusión recombinantes solubles de GST-dominio cinasa en diversos sistemas de expresión, incluyendo células del insecto Spodoptera frugiperda (Sf21) (Invitrogen), usando un vector de expresión de baculovirus (pAcG2T,
Pharmingen).
La presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican fragmentos de la proteína KDR humana que comprenden una porción del dominio KDR intracelular. Los fragmentos de la proteína son útiles en los ensayos para identificar compuestos que modulen la actividad KDR humana de tipo silvestre. En este aspecto, la invención proporciona una construcción de ácido nucleico que codifica la porción intracelular de KDR humano, del aminoácido 790 al aminoácido 1.356.
Por tanto, la presente invención se refiere a procedimientos para expresar el gen del receptor de tipo tirosina cinasa, KDR, y equivalentes biológicos descritos en este documento, ensayos que emplean estos genes del receptor de tipo tirosina cinasa, células que expresan estos genes del receptor de tipo tirosina cinasa y compuestos identificados mediante el uso de estos genes del receptor de tipo tirosina cinasa y de la proteína KDR humana expresada, incluyendo uno o más moduladores de la cinasa dependiente de KDR humano a través del contacto directo con el dominio cinasa del KDR humano o un compuesto que previene la unión de VEGF al KDR humano, o la dimerización apropiada del receptor KDR que antagoniza la transducción de las señales intracelulares normales asociadas con la angiogénesis inducida por VEGF.
También es un objeto de presente invención proporcionar construcciones de fusión en fase basadas en KDR, procedimientos para la expresión del gen del receptor de tipo tirosina cinasa, KDR y equivalentes biológicos descritos en este documento, ensayos relacionados, células recombinantes que expresan estos genes del receptor de tipo tirosina cinasa y compuestos agonistas y/o antagonistas identificados mediante el uso de estos genes del receptor de tipo tirosina cinasa y la proteína KDR humana expresada.
Según se usa en este documento, "VEGF" o "VEGF-A" se refiere a un factor de crecimiento del endotelio vascular.
Según se usa en este documento, "KDR" o "FLK-1" se refiere a un receptor que contiene un dominio cinasa insertado.
\newpage
Según se usa en este documento, "FLT-1" se refiere a un receptor de tipo tirosina cinasa similar a aletas.
Según se usa en este documento, la expresión " huésped mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo al ser humano.
Breve descripción de los dibujos
la Figura 1A y la Figura 1B muestran la secuencia de nucleótidos que codifica el KDR humano, como se muestra en la ID SEC Nº 1.
la Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos del KDR humano, como también se muestra en la ID SEC Nº 2. Los restos de aminoácidos subrayados representan diferencias en comparación con una forma del KDR humano previamente descrita.
la Figura 3A muestra el dominio de unión a ATP del modelo de homología del mutante V848E de KDR unido a AMP-PCP. La cadena lateral de E848 está en contacto con la adenina de AMP-PCP. No es visible el fosfato gamma de AMP-PCP. El trazado del carbono alfa de la proteína se muestra entre líneas, el AMP-PCP en modelo de varillas y la cadena lateral de E848 en modelo de bolas. El lóbulo N-terminal aparece coloreado de azul (o, alternativamente, marcado con círculos vacíos) con la excepción de la estructura modificada rica en glicina que está coloreada de verde (o, alternativamente, marcada como una región rayada). El lóbulo C-terminal está coloreado en rojo (o, alternativamente, se señala con círculos negros).
la Figura 3B muestra el dominio de unión a ATP del modelo de homología de KDR unido a AMP-PCP. La cadena lateral de las formas hidrófobas V848 está en contacto con la adenina de AMP-PCP. No es visible el fosfato gamma de AMP-PCP. El trazado de carbono alfa de la proteína se muestra entre líneas, el AMP-PCP en modelo de varillas y la cadena lateral de V848 en modelo de bolas. El lóbulo N-terminal aparece coloreado de azul (o, alternativamente, marcado con círculos vacíos) con la excepción de la estructura modificada rica en glicina que está coloreado de verde (o, alternativamente, marcado como una región rayada). El lóbulo C-terminal está coloreado en rojo (o alternativamente, marcado con círculos negros).
las Figuras 4A y 4B muestran que GST-KDR_{cyt}E848 purificada no podía autofosforilarse en presencia de ATP 1 mM, en donde 12 ng de GST-KDR_{cyt}V848 en presencia de ATP 1 mM daba lugar a la autofosforilación (Figura 4A) y que tanto 120 ng de GST-KDR_{cyt}E848 como 12 ng de GST-KDR_{cyt}V848 reaccionan con un anticuerpo anti-KDR (Figura 4B).
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a formas de ácido nucleico y de proteína aisladas que representan al KDR humano. Esta memoria descriptiva describe una molécula de ADN que codifica el KDR humano, un receptor de tipo tirosina cinasa expresado en células endoteliales humanas. El receptor se activa mediante el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y media una señal mitogénica. Esta activación y la mitogénesis posterior conduce a una respuesta angiogénica in vivo. La molécula de ácido nucleico descrita en la memoria descriptiva como ID SEC Nº 1, codifica una proteína KDR humana (ID SEC Nº 2) que presenta diferencias en seis aminoácidos de la secuencia publicada (Terman y col., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 1579-1586, Terman y col., solicitud PCT internacional Nº WO 92/14748, solicitud internacional número PCT/US92/01300). Estos cambios están en las posiciones 498 (Ala a Glu), 772 (Thr a Ala), 787 (Gly a Arg), 835 (Asn a Lys), 848 (Glu a Val) y 1.347 (Thr a Ser). Estos seis cambios de aminoácidos afectan a la actividad del receptor. La Val 848 está conservada en la mayoría de la familia de tirosina cinasas y parece ser importante para la unión del ATP y, presumiblemente, de inhibidores competitivos de ATP, al receptor de tipo cinasa KDR según se deduce del modelado por ordenador. El cambio a Glu en esta posición da lugar a una cinasa no funcional como consecuencia de la unión a ATP alterada. Los demás cambios también pueden causar diferencias en la actividad.
La presente invención también se refiere a fragmentos o mutantes biológicamente activos de la ID SEC Nº 1, que codifica ARN_{m} que expresa un nuevo gen de un receptor del tipo tirosina cinasa humano, KDR. Cualquiera de estos fragmentos biológicamente activos codificará una proteína o fragmento de la proteína que comprende al menos un dominio cinasa intracelular de la proteína KDR humana, como se muestra en la ID SEC Nº 2 y retiene la Val en la posición 848. También se prevé que otros dominios basados en el fragmento intracelular de KDR darán lugar a un fragmento de la proteína soluble que mimetiza la estructura y función del dominio intracelular de tipo silvestre. Cualquiera de estos fragmentos de la proteína puede ser una proteína de fusión, tal como la fusión GST-KDR utilizada como ejemplo, o puede comprender únicamente el dominio intracelular de KDR, con aumento de deleciones en la región del extremo COOH terminal. Es especialmente preferible que se mantengan los siguientes aminoácidos, si este dominio abarca la proteína o fragmento de la proteína respectiva: Val en la posición 848, Glu en la posición 498, Ala en la posición 772, Arg en la posición 787, Lys en la posición 835 y Ser en la posición 1.347. Por tanto, cualquiera de estos polinucleótidos incluye, pero no está necesariamente limitado, sustituciones, deleciones, adiciones de nucleótidos, truncamientos del extremo amino terminal y truncamientos del extremo carboxílico, de modo que estas mutaciones codifican ARNm que expresan una proteína o fragmento de la proteína para uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico y es útil para la identificación de moduladores de la actividad del receptor KDR.
La molécula de ácido nucleico aislado de la presente invención puede incluir una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN), tal como ADN genómico y ADN complementario (ADNc), que puede ser de cadena sencilla (cadena codificante o no codificante) o doble, así como ADN sintético, tal como un polinucleótido de cadena sencilla sintetizada. La molécula de ácido nucleico aislado de la presente invención también puede incluir una molécula de ácido ribonucleico (ARN).
Es sabido que las secuencias de ADN que codifican un péptido pueden alterarse de modo que codifiquen un péptido que tiene propiedades diferentes a aquellas de un péptido que aparece de forma natural. Los procedimientos para alterar las secuencias de ADN incluyen, pero sin limitaciones, la mutagénesis dirigida a sitio. Ejemplos de propiedades alteradas incluyen, pero sin limitaciones, cambios en la afinidad de una enzima por un sustrato o de un receptor por un ligando.
Según se usa en este documento, "purificado" y "aislado" se utilizan indistintamente para mantener la proposición de que el ácido nucleico, la proteína o el fragmento respectivo de estos en cuestión, se retira sustancialmente de su ambiente in vivo, de modo que pueda ser manipulada por el experto tal como, pero sin limitaciones, mediante secuenciación de nucleótidos, digestión con enzimas de restricción, mutagénesis dirigida a sitio y subclonado en vectores de expresión para un fragmento de ácido nucleico así como la obtención de la proteína o el fragmento de la proteína en cantidades puras de modo que ofrezca la oportunidad de generar anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, secuenciación de aminoácidos y digestión de péptidos. Por tanto, los ácidos nucleicos reivindicados en este documento pueden estar presentes en células completas o en lisados celulares, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente purificada. Se considera que un ácido nucleico está sustancialmente purificado cuando se purifica de los contaminantes ambientales. De este modo, se considera que una secuencia de ácido nucleico aislada de las células está sustancialmente purificada cuando se purifica de los componentes celulares mediante procedimientos convencionales, mientras que una secuencia de ácido nucleico sintetizado químicamente se considera que está sustancialmente purificada cuando se purifica de sus precursores químicos.
La presente invención también se refiere a vectores recombinantes y a huéspedes recombinantes, tanto procariotas como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas descritas a lo largo de esta memoria descriptiva.
La presente invención también se refiere a fracciones subcelulares de la membrana de células huésped recombinantes (tanto procariotas como eucariotas, así como tanto células transformadas de forma estable como transitoria) que comprenden los ácidos nucleicos de la presente invención. Estas fracciones subcelulares de membrana comprenderán formas mutante o humana de tipo silvestre de KDR a niveles sustancialmente por encima de los niveles de tipo silvestre y, por tanto, serán útiles para diversos ensayos descritos a lo largo de esta memoria
descriptiva.
En la Figura 1 A, en la Figura 1 B y en la ID SEC Nº 1 se describe un aspecto preferido de la presente invención, que es un ADNc humano que codifica un nuevo gen de un receptor de tipo tirosina cinasa, KDR, descrita como
sigue:
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La presente invención también se refiere a una forma sustancialmente purificada del gen del receptor de tipo tirosina cinasa que comprende la secuencia de aminoácidos KDR descrita en la Figura 2 y mostrada en la ID SEC Nº 2, que incluye Glu en la posición 498, Ala en la posición 772, Arg en la posición 787, Lys en la posición 835, Val en la posición 848 y Ser en la posición 1.347, descrita como sigue:
2
La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican porciones solubles del dominio intracelular de KDR. Son especialmente preferidas las moléculas de ácido nucleico que codifican un fragmento de la proteína KDR con deleción del extremo COOH-terminal útil en los ensayos para identificar compuestos que modulen la actividad KDR humana de tipo silvestre. Cualquiera de estos ácidos nucleicos codificará un fragmento de la proteína KDR que mimetiza la actividad KDR de tipo silvestre dentro del dominio respectivo, tal como el dominio cinasa del KDR humano. Estos fragmentos de proteína solubles expresados pueden contener o no una porción de la región amino terminal del KDR humano o de una secuencia heteróloga. Estos ácidos nucleicos pueden expresarse en cualquiera de los diversos sistemas de expresión disponibles para el experto. Puede utilizar cualquiera de estas construcciones basadas en la región intracelular de KDR de la presente invención en aplicaciones de terapia génica, de modo que actúe como agonista o antagonista soluble de la actividad cinasa asociada normalmente con la actividad cinasa de tipo silvestre asociada a membrana.
Por tanto, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican fragmentos de una proteína KDR humana que comprenden una porción del dominio intracelular de KDR. Los fragmentos de proteína son útiles en ensayos para identificar compuestos que modulan la actividad KDR humana de tipo silvestre. Este aspecto de la invención proporciona una construcción de ácido nucleico que codifica la porción intracelular del KDR humano, del aminoácido 790 al aminoácido 1.356. Los datos ilustrados en la sección de ejemplos 3 muestran que las deleciones del extremo COOH terminal de la porción intracelular soluble de KDR muestran actividad cinasa.
Por tanto, la presente invención se refiere a procedimientos de expresión del gen del receptor de tipo tirosina cinasa, KDR, y equivalentes biológicos descritos en este documento, ensayos que emplean estos genes del receptor de tipo tirosina cinasa, células que expresan estos genes del receptor de tipo tirosina cinasa y compuestos agonistas y/o antagonistas identificados mediante el uso de estos genes del receptor de tipo de tirosina cinasa y la proteína de KDR humana expresada, incluyendo, pero sin limitaciones, uno o más moduladores de la cinasa dependiente de KDR humano mediante contacto directo con el dominio cinasa de KDR humano o un compuesto que previene la unión de VEGF al KDR humano, o previene o promueve la dimerización y/o activación del receptor induciendo o antagonizando así la transducción de las señales intracelulares normales asociadas con la angiogénesis inducida por VEGF.
Según se usa en este documento, un "equivalente biológicamente activo" o "derivado funcional" de un KDR humano de tipo silvestre posee actividad biológica que es sustancialmente similar a la actividad biológica del KDR humano de tipo silvestre. La expresión "derivado funcional" pretende incluir los "fragmentos", "mutantes", "variantes", "variantes degeneradas", "análogos" y "homólogos" o los "derivados químicos" de la proteína KDR humana de tipo silvestre. El término "fragmento" pretende referirse a cualquier subgrupo de polipéptidos del KDR humano de tipo silvestre. El término "mutante" pretende referirse a una molécula que puede ser sustancialmente similar a la forma de tipo silvestre, pero posee características biológicas diferenciadas. Estas características alteradas incluyen, pero no como limitación, alterar la unión al sustrato, alterar la afinidad por el sustrato y alterar la sensibilidad a los compuestos químicos que afectan a la actividad biológica del KDR humano o un derivado funcional de KDR humano. El término "variante" pretende referirse a una molécula sustancialmente similar en estructura y función a la proteína completa de tipo silvestre o a un fragmento de la misma. Una molécula es "sustancialmente similar" a una proteína similar a KDR humana de tipo silvestre si ambas moléculas tienen estructuras sustancialmente similares o si ambas moléculas poseen una actividad biológica similar. Por tanto, si las dos moléculas poseen actividad sustancialmente similar, se consideran variantes incluso si la estructura de una de las moléculas no se encuentra en la otra o incluso si las dos secuencias de aminoácidos no son idénticas. El término "análogo" se refiere a una molécula sustancialmente similar en función a la proteína KDR humana de longitud completa o a un fragmento biológicamente activo de la misma.
Puede usarse cualquiera de los distintos procedimientos para clonar el KDR humano. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitaciones, (1) una técnica de clonación de PCR RACE (Frohman, y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8998-9002). El RACE 5' y/o 3' pueden realizarse para generar una secuencia de ADNc de longitud completa. Esta estrategia implica el uso de cebadores oligonucleotídicos específicos del gen para la amplificación por PCR del ADNc del KDR humano. Estos cebadores específicos del gen se diseñan por medio de la identificación de una etiqueta de secuencia expresada (EST), secuencia de nucleótidos que se ha identificado mediante búsqueda en cualquier base de datos de ácidos nucleicos y proteínas públicamente disponibles; (2) expresión funcional directa del ADNc del KDR humano seguido de la construcción de una biblioteca de ADNc que contiene KDR humano en un sistema de vector de expresión adecuado; (3) selección de una biblioteca de ADNc que contiene el KDR humano, construida en un vector lanzadera de plásmido o bacteriófago con una sonda oligonucleotídica degenerada, marcada y diseñada a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína KDR humana y (4) selección de una biblioteca de ADNc que contiene el KDR humano, construida en un vector lanzadera de plásmido o bacteriófago con un ADNc parcial que codifica la proteína KDR humana. Este ADNc parcial se obtiene mediante la amplificación por PCR específica de fragmentos de ADN del KDR humano a través del diseño de cebadores oligonucleotídicos degenerados a partir de la secuencia de aminoácidos conocida de otras cinasas que están relacionadas con la proteína KDR humana; (5) selección de una biblioteca de ADNc que contiene el KDR humano, construida en un vector lanzadera de plásmido o bacteriófago con un ADNc parcial que codifica la proteína KDR humana. Esta estrategia también puede implicar el uso de cebadores oligonucleotídicos específicos de gen para amplificación por PCR del ADNc del KDR humano identificado como una EST como se describe anteriormente o (6) diseñar oligonucleótidos 5' y 3' específicos del gen, usando la ID SEC Nº 1 como molde de modo que pueda generarse el ADNc de longitud completa mediante técnicas RACE conocidas, o pueda generarse una porción de la región codificante mediante estas mismas técnicas RACE conocidas para generar y aislar una porción de la región codificante usada como sonda para seleccionar uno de los diversos tipos de bibliotecas de ADNc y/o genómicas para aislar una versión de longitud completa de la secuencia nucleotídica que codifica el KDR humano.
Es fácilmente evidente para los expertos en la materia que pueden ser útiles otros tipos de bibliotecas, así como bibliotecas construidas a partir de otros tipos de células o tipos de especies, para aislar un ADN que codifica el KDR humano o un homólogo del KDR humano. Otros tipos de bibliotecas incluyen, peo sin limitaciones, bibliotecas de ADNc derivadas de otras células o líneas celulares diferentes a células o tejidos humanos, tales como células murinas, células de roedores o cualquier otro huésped vertebrado que puede contener el ADN que codifica el KDR humano. Adicionalmente, puede aislarse un gen de KDR humano y homólogos mediante selección por hibridación en base a oligonucleótidos o polinucleótidos de una biblioteca genómica de vertebrado, incluyendo pero sin limitación, una biblioteca genómica murina, una biblioteca genómica de roedor así como bibliotecas concomitantes de ADN genómico humano.
Es fácilmente evidente para los expertos en la materia que pueden prepararse bibliotecas de ADNc adecuadas a partir de células o líneas celulares que tienen actividad KDR. La selección de células o líneas celulares para su uso en la preparación de una biblioteca de ADNc para aislar un ADNc que codifica el KDR humano puede hacerse midiendo en primer lugar la actividad KDR asociada a la células usando cualquier ensayo conocido disponible para este fin.
La preparación de bibliotecas de ADNc puede realizarse mediante técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. Pueden encontrarse técnicas de construcción de una biblioteca de ADNc bien conocidas, por ejemplo, en Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. También pueden obtenerse bibliotecas de ADN complementario a partir de numerosas fuentes comerciales incluyendo, pero sin limitaciones, Clonetech Laboratorios, Inc. y Stratagene.
También es fácilmente evidente para los expertos en la materia que el ADN que codificada el KDR humano también puede aislarse a partir de una biblioteca de ADN genómico adecuada. La construcción de bibliotecas de ADN genómicas puede realizarse mediante técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. Pueden encontrarse técnicas de construcción de bibliotecas de ADN bien conocidas en Sambrook y col. anteriormente.
Para clonar el gen del KDR humano mediante uno cualquiera de los procedimientos preferidos, puede ser necesaria la secuencia de aminoácidos o de ADN del KDR humano o una proteína homóloga. Para conseguir esto, puede purificarse la proteína KDR o una proteína homóloga y determinarse la secuencia parcial de aminoácidos mediante secuenciadores automáticos. No es necesario determinar la secuencia de aminoácidos completa, pero puede determinarse la secuencia lineal de dos regiones de 6 a 8 aminoácidos para la amplificación por PCR de un fragmento parcial del ADN del KDR humano. Una vez que se hayan identificado las secuencias de aminoácidos adecuadas, pueden sintetizarse las secuencias de ADN capaces de codificarlas. Debido a que el código genético está degenerado, puede usarse más de un codón para codificar un aminoácido en particular y, por tanto, la secuencia de aminoácidos puede estar codificada por cualquiera de un grupo de oligonucleótidos de ADN similares de un grupo. Sólo un miembro del grupo será idéntico a la secuencia del KDR humano, pero los otros del grupo serán capaces de hibridar con el ADN del KDR humano incluso en presencia de oligonucleótidos de ADN con faltas de coincidencia. Los oligonucleótidos de ADN desapareados pueden seguir hibridando suficientemente con el ADN del KDR humano para permitir la identificación y el aislamiento del ADN que codifica el KDR humano. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos de una región de una secuencia expresada puede identificarse mediante la búsqueda en una o más bases de datos genómicas disponibles. Pueden usarse cebadores específicos del gen para realizar amplificación por PCR de un ADNc de interés a partir de una biblioteca de ADNc o de una población de ADNc. Como se apunta anteriormente, la secuencia de nucleótidos apropiados para su uso en un procedimiento basado en PCR puede obtenerse a partir de la ID SEC Nº 1, con el fin del aislamiento de productos de RACE 5' y 3' solapantes para la generación de una secuencia de longitud completa que codifica el KDR humano o para aislar una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica el KDR humano para su uso como sonda para seleccionar una o más bibliotecas basadas en ADNc o genómicas para aislar una secuencia de longitud completa que codifica el KDR humano o proteínas similares al KDR humano.
En un procedimiento ilustrativo, el ADNc de longitud completa del KDR humano de la presente invención se generó mediante selección de una biblioteca de ADNc en fago lambda de las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) con una sonda de ADN específica de KDR de 576 pares de bases usando los cebadores KDR-A: 5'-GGAATTCCATCCAAGCGGCAAATGTGTC-3' (ID SEC Nº 3) y KDR-B: 5'-GGAATTCCGAGTCTTCTA
CAAGGGTCTC-3' (ID SEC Nº 4). Se aislaron clones del fago lambda que contenían inserciones únicas a través de tres rondas de siembra en placa repetida y, a continuación, se caracterizaron. Los 110 pares de bases del extremo 3' no representados en ninguno de los clones aislados se clonaron mediante PCR a partir de la misma biblioteca como anteriormente, usando los cebadores KDR-C: 5'-TTATGACAACACAGCAGG-3' (ID SEC Nº 5) y KDR-D: 5'-TTGGATCCTCGAGTTGGGGTGTGGATGC-3' (ID SEC Nº 6). Se usaron clones solapantes para generar un gen de KDR de longitud completa dentro del vector plasmídico pGEM7Z. El gen contenía un sitio XhoI en el extremo 5' terminal que se cambió por un sitio BamHI cortando primero con XhoI y formando a continuación un extremo romo con la ADN polimerasa y ligando un enlazador oligonucleotídico BamHI y, finalmente, clonándolo como un fragmento BamHI/BamHI en pGEm7Z. El gen se secuenció en un secuenciador automático ABI Prism modelo número 377. Además, el dominio citoplásmico de KDR que contiene actividad tirosina cinasa se clonó independientemente como una fusión del gen de GST en un vector de expresión de baculovirus para caracterizar la actividad tirosina cinasa.
Pueden usarse diversos vectores de expresión de mamíferos para expresar el KDR humano recombinante en células de mamífero. En este documento, los vectores de expresión se definen como secuencias de ADN que son necesarias para la transcripción de ADN clonado y la traducción de sus ARNm en un huésped apropiado. Estos vectores pueden usarse para expresar ADN eucariótico en una diversidad de huéspedes, tales como bacterias, algas verdeazuladas, células vegetales, células de insecto y células animales. Los vectores diseñados específicamente permiten la transferencia de ADN entre huéspedes, tales como entre células de bacterias y levaduras o de bacterias y animales. Un vector de expresión construido apropiadamente debería contener: un origen de replicación para la replicación autónoma en células huésped, marcadores susceptibles de selección, un número limitado de sitios para enzimas de restricción útiles, la posibilidad de un número elevado de copias y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige la unión del ADN con la ARN polimerasa e inicia la síntesis de ARN. Un promotor potente es aquel que hace que se inicie la síntesis del ARNm a una frecuencia elevada. Los vectores de expresión pueden incluir, pero sin limitaciones, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos o virus especialmente diseñados.
Los vectores de expresión de mamíferos disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión del KDR humano recombinante incluye, pero sin limitaciones, pcDNA3.1 (Invitrogen), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 y pLITMUS39 (New England Bioloabs), pcDNAI, pcDNAlamp (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) y \lambdaZD35 (ATCC 37565).
Pueden usarse diversos vectores de expresión bacterianos para expresar el KDR humano recombinante en células bacterianas. Los vectores de expresión bacterianos disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión del KDR humano recombinante incluyen, pero sin limitaciones, pCR2.1 (Invitrogen), pET11a (Novagen), lambda gt11 (Invitrogen) y pKK223-3 (Pharmacia).
Pueden usarse diversos vectores de expresión en células fúngicas para expresar el KDR humano recombinante en células fúngicas. Los vectores de expresión en células fúngicas disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión del KDR humano recombinante incluyen, pero sin limitaciones, pYES2 (Invitrogen) y vector de expresión de Pichia (Invitrogen).
Pueden usarse diversos vectores de expresión en células de insecto para expresar el receptor recombinante en células de insecto. Los vectores de expresión en células de insecto disponibles en el mercado, que pueden ser adecuados para la expresión recombinantes del KDR humano incluyen, pero sin limitaciones, pBlueBacIII y pBlueBacHis2 (Invitrogen) y pAcG2T (Pharmingen).
Un vector de expresión que contiene el ADN que codifica una proteína similar al KDR humano puede usarse para la expresión del KDR humano en una célula huésped recombinante. Las células huésped recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas incluyendo, pero sin limitaciones, bacterias tales como E. coli, células fúngicas, tales como levaduras, células de mamífero incluyendo, pero sin limitaciones, líneas celulares de origen humano, bovino, porcino, de mono y de roedores y células de insecto incluyendo, pero sin limitaciones, líneas celulares derivadas de Drosophila y del gusano de la seda. Las líneas celulares derivadas de especies de mamíferos que pueden ser adecuadas y que están disponibles en el mercado incluyen, pero sin limitaciones, células L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), células L-M (ATCC CCL 1.2), Saos-2 (ATCC HTB-85), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171) y CPAE (ATCC CCL 209).
El vector de expresión puede introducirse en células huésped a través de cualquiera de las numerosas técnicas incluyendo, sin limitaciones, la transformación, transfección, fusión de protoplastos y electroporación. Las células que contienen el vector de expresión se analizan individualmente para determinar si producen la proteína KDR humana. La identificación de las células que expresan el KDR humano puede realizarse mediante varios medios incluyendo, pero sin limitaciones, reactividad inmunológica con anticuerpos anti KDR humano, unión al ligando marcado y la presencia de actividad KDR humana asociada a la célula huésped.
El ADNc del KDR humano clonado obtenido a través de los procedimientos descritos anteriormente puede expresarse recombinantemente mediante clonación molecular en un vector de expresión (tal como pcDNA3.1, pCR2.1, pBlueBacHis2 y pLITMUS28) que contiene un promotor adecuado y otros elementos reguladores de la transcripción apropiados y transferirse a células huésped procariotas o eucariotas para producir KDR humana recombinante. Las técnicas para estas manipulaciones pueden encontrarse descritas en Sambrook y col., anteriormente, se describen completamente en la sección de Ejemplos y son bien conocidas y fácilmente disponibles para el experto en la materia.
La expresión del ADN del KDR humano también puede realizarse usando ARNm sintético producido in vitro. El ARNm sintético puede traducirse de forma eficaz en diversos sistemas libres de células incluyendo pero sin limitaciones extractos de germen de trigo y extractos de reticulocitos, así como traducidos de forma eficaz en sistemas basados en células que incluyen, pero sin limitaciones, la microinyección de oocitos de rana, prefiriéndose la microinyección de oocitos de rana.
Para determinar la secuencia o secuencias del ADNc del KDR humano que produce niveles óptimos de KDR humano, pueden construirse moléculas de ADNc que incluyen, pero sin limitaciones: un fragmento de ADNc que contiene la fase de lectura abierta de longitud completa del KDR humano así como diversas construcciones que contienen porciones del ADNc que codifica sólo dominios específicos de la proteína o de los dominios reorganizados de la proteína. Todas las construcciones pueden diseñarse para que contengan ninguna, todas o porciones de las regiones 5' y/o 3' no traducidas de un ADNc del KDR humano. Los niveles de expresión y actividad del KDR humano pueden determinarse tras la introducción, ambos individualmente y en combinación, de estas construcciones en las células huésped apropiadas. Tras la determinación del casete de ADNc del KDR humano que produce la expresión óptima en ensayos transitorios, esta construcción de ADNc del KDR se transfiera a una diversidad de vectores de expresión (incluyendo virus recombinante) incluyendo, sin limitaciones, células de mamíferos, células vegetales, células de insectos, ovocitos, bacterias y células de levadura.
Los niveles de KDR humano en las células huéspedes se cuantifican mediante diversas técnicas incluyendo, pero sin limitaciones, técnicas de inmunoafinidad y/o afinidad por ligando. Se usan perlas de afinidad específicas de KDR o anticuerpos específicos de KDR para aislar KDR marcada o no con ^{35}S-metionina. La proteína KDR marcada se analiza mediante PAGE-SDS. La proteína KDR no marcada se detecta mediante ensayos de transferencia Western, ELISA o RIA empleando anticuerpos específicos de la proteína KDR y/o anticuerpos antifosfotirosina.
Siguiendo la expresión de KDR en una célula huésped, puede recuperarse la proteína KDR para proporcionar una proteína KDR en forma activa. Se dispone de varios procedimientos para la purificación de la proteína KDR que son adecuados para su uso. La proteína KDR recombinante puede purificarse a partir de lisados y extractos celulares o, a partir del medio de cultivo condicionado, mediante diversas combinaciones, o la aplicación individual del fraccionamiento salino, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de adsorción en hidroxilapatita y cromatografía de interacción hidrófoba.
Además, la proteína KDR recombinante puede separarse a partir de otras proteínas celulares mediante el uso de una columna de inmunoafinidad fabricada con anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para la proteína KDR de longitud completa, o fragmentos polipeptídicos de la proteína KDR. Adicionalmente, pueden obtenerse anticuerpos policlonales o monoclonales frente a un péptido sintético (normalmente de aproximadamente 9 a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud) a partir de una porción de la proteína descrita en la ID SEC Nº 2. Los anticuerpos monoespecíficos frente al KDR humano se purifican a partir de antisueros de mamíferos que contienen anticuerpos reactivos frente a KDR humano o se prepara como anticuerpos monoclonales reactivos con KDR humano usando la técnica de Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497). Un anticuerpo monoespecífico, según se usa en este documento, se define como una especie única de anticuerpo o especies múltiples de anticuerpos con características de unión homogéneas para KDR humano. La unión homogénea según se usa en este documento se refiere a la capacidad de la especie de anticuerpo para unirse a un antígeno o epítopo específico, tal como aquellos asociados con el KDR humano, como se describe anteriormente. Los anticuerpos específicos de KDR humano se obtienen inmunizando animales, tales como ratones, ratas, cobayas, conejos, cabras, caballos y similares, con una concentración apropiada de la proteína KDR humana o un péptido sintético generado a partir de una porción de KDR humana con o sin un adyuvante inmune.
El suero preinmune se recoge antes de la primera inmunización. Cada animal recibe entre aproximadamente 0,1 \mug y aproximadamente 1.000 \mug de proteína KDR humana asociada con un adyuvante inmune aceptable. Estos adyuvantes aceptables incluyen, pero sin limitaciones, completo de Freund, incompleto de Freund, precipitado de alumbre, emulsión de agua en aceite que contiene Corynebacterium parvum y ARNt. La inmunización inicial consisten en la proteína KDR humana o un fragmento peptídico de la misma preferiblemente en adyuvante completo de Freund en múltiples sitios por vía subcutánea (SC), intraperitoneal (IP) o ambas. A cada animal se le extrae sangre a intervalos regulares, preferiblemente cada semana, para determinar la titulación del anticuerpo. Los animales pueden o no recibir inyecciones de refuerzo tras la inmunización inicial. Generalmente, a los animales que reciben inyecciones de refuerzo se les administra una cantidad igual de KDR humana en adyuvante incompleto de Freund por la misma vía. La inyecciones de refuerzo se administrar a intervalos de aproximadamente tres semanas hasta que se obtienen las titulaciones máximas. Aproximadamente 7 días después de cada inmunización de refuerzo o aproximadamente semanalmente después de una inmunización única, se extrae sangre a los animales, se recoge el suero y se distribuye en alícuotas que se conservan a aproximadamente -20ºC.
Los anticuerpos monoclonales (Acm) reactivos con KDR humano se preparan mediante inmunización de ratones endogámicos, preferiblemente Balb/c, con la proteína KDR humana. Los ratones se inmunizaron por vía IP o SC con de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 100 \mug, preferiblemente aproximadamente 10 \mug de proteína KDR humana en aproximadamente 0,5 ml de tampón o solución salina incorporada en un volumen igual de un adyuvante aceptable, como se discute anteriormente. Se prefiere el adyuvante completo de Freund. Los ratones reciben una inmunización inicial el día 0 y se les deja descansar de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 semanas. Los ratones inmunizados reciben una o más inmunizaciones de refuerzo de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 \mug de KDR humano en una solución tampón, tal como una solución salina tamponada con fosfato por vía intravenosa (IV). Los linfocitos de los ratones positivos para anticuerpo, preferiblemente linfocitos esplénicos, se obtuvieron extrayendo los bazos de los ratones inmunizados mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Las células de hibridoma se producen mezclado los linfocitos esplénicos con un compañero apropiado de fusión, preferiblemente con células de mieloma, en condiciones que permitirán la formación de hibridomas estables. Estos compañeros de fusión pueden incluir, pero sin limitaciones: mielomas de ratón P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 y Sp 2/0, prefiriéndose Sp 2/0. Las células que producen anticuerpos y las células de mieloma se fusionan en polietilénglicol, con un peso molecular de aproximadamente 1.000 a concentraciones de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 50%. Las células de hibridoma fusionadas se seleccionan mediante el crecimiento en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con hipoxantina, timidina y aminopterina mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se recoge el líquido del sobrenadante de los pocillos con crecimiento positivo en aproximadamente los días 14, 18 y 21 y se analiza la producción de anticuerpo mediante un inmunoensayo, tal como un inmunorradioensayo en fase sólida (SPIRA) usando KDR humano como antígeno. Los líquidos del cultivo también se ensayan en el ensayo de precipitación de Ouchterlony para determinar el isotipo del Acm. Las células de los hibridomas de los pocillos positivos para la producción de anticuerpo se clonan por técnicas tales como técnicas en agar blando de MacPherson, 1973, Soft Agar-Techniques, en Tissue Culture Methods and Applications, Kruse y Paterson, Editores, Academic
Press.
Los anticuerpos monoclonales se producen in vivo mediante la inyección de ratones Balb/c estimulados con aproximadamente 0,5 ml de pristano por ratón, con de aproximadamente 2x10^{6} a aproximadamente 6x10^{6} células de hibridoma después de unos 4 días tras la estimulación. El líquido ascítico se recoge aproximadamente de 8 a 12 días después de la transferencia celular y los anticuerpos monoclonales se purifican mediante técnicas conocidas en la técnica.
La producción in vitro de Acm anti-KDR humano se realiza cultivando el hibridoma en DMEM que contiene aproximadamente el 2% de suero fetal de ternera para obtener cantidades suficientes del Acm específico. Los Acm se purifican mediante técnicas conocidas en la materia.
Los títulos de anticuerpo en los líquidos ascíticos o de cultivo del hibridoma se determinan mediante diversos ensayos serológicos o inmunológicos que incluyen, pero sin limitaciones, precipitación, aglutinación pasiva, técnica de inmunoabsorción del anticuerpo ligado a enzima (ELISA) y técnicas de radioinmunoensayo (RIA). Se utilizan ensayos similares para detectar la presencia del KDR humano en fluidos corporales o en extractos de tejidos y extractos celulares.
Será fácilmente evidente para los expertos en la materia que los procedimientos descritos anteriormente para la producción de anticuerpos monoespecíficos pueden utilizarse para producir anticuerpos específicos de fragmentos peptídicos del KDR humano o del KDR humano de longitud completa.
Se hacen columnas de afinidad con el anticuerpo frente a KDR humano, por ejemplo, uniendo los anticuerpos a Affigel-10 (Biorad), un gel soporte que se activa previamente con ésteres de N-hidroxisuccinimida, de modo que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de perlas del gel de agarosa. A continuación, los anticuerpos se acoplan con el gel a través de enlaces amida con el brazo espaciador. Los ésteres activados que quedan se inactivan a continuación con etanolamina HCl 1M (pH 8). La columna se lava con agua seguido de glicina HCl 0,23 M (pH 2,6) para eliminar cualquier anticuerpo no conjugado o proteínas extrañas. A continuación, la columna se equilibra en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,3) y se pasa lentamente a través de la columna los sobrenadantes de los cultivos celulares o los extractos celulares que contenían el KDR humano de longitud completa o fragmentos de la proteína KDR humana. Después, la columna se lava con solución salina tamponada con fosfato hasta que la densidad óptica (A_{280}) desciende hasta el valor de fondo y luego se eluye la proteína con glicina HCl 0,23 M (pH 2,6). A continuación, la proteína KDR humana purificada se dializa frente a una solución salina tamponada con
fosfato.
La proteína KDR humana de la presente invención es adecuada para su uso en un procedimiento de ensayo para la identificación de compuestos que modulan la actividad KDR. Para medir la actividad KDR se utiliza una construcción de fusión que contiene KDR, tal como la fusión GST-KDR como se discute en esta memoria de descripción. La actividad cinasa se mide, por ejemplo, mediante la incorporación de fosfato marcado radiactivamente en el sustrato ácido poliglutámico, tirosina, 4:1 (pEY). El producto pEY fosforilado queda atrapado en una membrana de filtración y la incorporación del fosfato marcado radiactivamente se cuantifica mediante recuento de centelleo. Las proteínas de fusión recombinantes GST-dominio cinasa solubles se expresan en células de insectos Sf21 (Invitrogen) usando un vector de expresión de baculovirus (pAcG2T; Pharmingen). El tampón de lisis es Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 0,5 M, DTT 5 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100 al 0,5%, glicerol al 10%, leupeptina, pepstatina y aprotinina a 10 \mug/ml cada uno y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1mM (todos de Sigma). El tampón de lavado es Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 0,5 M, DTT 5 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100 al 0,05%, glicerol al 10%, leupeptina, pepstatina y aprotinina a 10 \mug/ml cada uno y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1mM. El tampón de diálisis es Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 0,5 M, DTT 5 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100 al 0,05%, glicerol al 50%, leupeptina, pepstatina y aprotinina a 10 \mug/ml cada uno y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1mM. El tampón de reacción 10x es Tris 200 mM, pH 7,4, NaCl 1,0 M, MnCl_{2} 50 mM, DTT 10 mM y albúmina de suero bovino a 5 mg/ml (Sigma). El tampón de dilución de la enzima es Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 0,1 M, DTT 1 mM, glicerol al 10% y BSA a 100 mg/ml. La solución del sustrato 10x podría ser poli(ácido glutámico, tirosina, 4:1) (Sigma) a 750 \mug/ml; la solución de parada es ácido tricloroacético al 30%, pirofosfato sódico 0,2 M (ambos Fisher) y la solución de lavado es ácido tricloroacético al 15%, pirofosfato sódico 0,2 M. Las placas de filtración son placas de 96 pocillos con fibra de vidrio GF/C, Millipore MAFC NOB.
En primer lugar, las células Sf21 se infectan con virus recombinantes con una multiplicidad de infección de 5 partículas de virus/célula y se cultivan a 27ºC durante 48 horas. Todas las etapas posteriores se realizaron a 4ºC, las células infectadas se recogen mediante centrifugación a 1.000xg y se lisan a 4ºC durante 30 minutos con 1/10 de volumen de tampón de lisis seguido de la centrifugación a 100.000xg durante 1 hora. A continuación, el sobrenadante se pasa a través de una columna de glutatión-Sepharosa (Pharmacia) equilibrada en tampón de lisis y se lava con 5 volúmenes del mismo tampón seguido de 5 volúmenes de tampón de lavado. La proteína GST-KDR recombinante se eluye con tampón de lavado/glutatión reducido 10 mM (Sigma) y se dializa frente al tampón de diálisis.
El ensayo de KDR comprende las siguientes etapas:
1. Añadir 5 \mul de inhibidor o control al ensayo en DMSO al 50%;
2. Añadir 35 \mul de la mezcla de reacción que contiene 5 \mul de tampón de reacción 10x, 5 \mul de ATP 25 mM /10 \muCi de [^{32}P]ATP (Amersham) y 5 \mul de sustrato 10x;
3. Iniciar la reacción mediante la adición de 10 \mul de KDR (25 mM) en tampón de dilución de la enzima.
4. Mezclar e incubar a temperatura ambiente (\sim22ºC) durante 15 minutos;
5. Parar mediante la adición de 50 \mul de la solución de parada;
6. Incubar durante 15 minutos a 4ºC;
7. Transferir una alícuota de 90 \mul a la placa de filtración;
8. Aspirar y lavar 3 veces con 100 \mul de solución de lavado;
9. Añadir 30 \mul de mezcla de centelleo, sellar la placa y contar en un contador de centelleo Microbeta de Wallac.
La modulación de KDR incluye la inhibición o activación de la cinasa que afecta la función mitogénica de VEGF. Los compuestos que modulan a KDR incluyen agonistas y antagonistas.
Por tanto, la proteína KDR humana de la presente invención puede obtenerse a partir de fuentes tanto nativas como recombinantes (como una proteína de longitud completa, fragmento de la proteína biológicamente activo o construcción de fusión) para su uso en un procedimiento de ensayo para identificar moduladores del KDR humano. En general, un procedimiento de ensayo para identificar moduladores del KDR humano contendrá el dominio intracelular de KDR humano y un compuesto o muestra de ensayo que contiene un posible agonista o antagonista de la cinasa de KDR. Los compuestos o muestras de ensayo pueden probarse directamente sobre, por ejemplo, KDR purificada, cinasa KDR o una fusión GST- cinasa KDR, fracciones subcelulares de células que producen KDR nativo o recombinante, células completas que expresan KDR humano nativo o recombinante, fragmentos de la proteína KDR intracelular y los respectivos fragmentos de deleción y/o fragmentos extracelulares o intracelulares de la proteína KDR y sus fragmentos de deleción respectivos. Pueden añadirse el compuesto o muestra del ensayo a KDR en presencia o ausencia de un sustrato del KDR humano conocido. La actividad moduladora del compuesto o muestra de ensayo puede determinarse, por ejemplo, analizando la capacidad del compuesto o muestra de ensayo para unirse al dominio intracelular de KDR, activar la proteína, inhibir la proteína, inhibir o potenciar la unión de otros compuestos al KDR humano, modificar la regulación del receptor VEGF o modificar la actividad cinasa.
Por tanto, la presente invención también se refiere a las fracciones subcelulares de membrana de las células huésped recombinantes (tanto procariotas como eucariotas así como tanto células transformadas tanto de forma estable como transitoria) que comprenden los ácidos nucleicos de la presente invención. Estas fracciones subcelulares de membrana comprenderán el KDR humano a niveles sustancialmente por encima de los niveles de tipo silvestre y, por tanto, serán útiles para diversos ensayos descritos a lo largo de esta memoria descriptiva.
La identificación de moduladores del KDR humano será útil para el tratamiento de diversas enfermedades. Por ejemplo, el crecimiento vascular en la retina o próximo a ella lleva a la degeneración visual que termina en ceguera. El VEGF es responsable de la mayor parte de la actividad angiogénica producida en la retina o próxima a ella en la retinopatía diabética. El ARNm y la proteína VEGF ocular se elevan en condiciones tales como la oclusión de la vena de la retina en primates y disminuyen los niveles de pO_{2} en ratones lo que lleva a la neovascularización. La expresión de VEGF también aumenta de forma significativa en regiones hipóxicas de tumores animales y humanos adyacentes a áreas de necrosis. El VEGF contribuye al crecimiento tumoral in vivo, promoviendo la angiogénesis a través de sus actividades paracrina quimiotácticas y mitogénicas de la célula endotelial vascular. La inhibición de KDR está implicada en la neoangiogénesis patológica y los compuestos que inhiben la actividad mitogénica de VEGF mediante la inhibición del KDR, serán útiles en el tratamiento de enfermedades en las que la neoangiogénesis es parte de la patología general, tal como vascularización de la retina diabética, diversas formas de cáncer e inflamación, lo que demuestra niveles elevados de expresión del gen y de la proteína. Ejemplos de estos cánceres incluyen cánceres de encéfalo, de mama, del tracto genitourinario, del sistema linfático, de estomago, intestinales incluyendo de colon, páncreas, próstata, laringe y pulmón. Estos incluyen linfoma histiocítico, adenocarcinoma de pulmón, glioblastoma y cánceres de pulmón de células pequeñas. Ejemplos de inflamación incluyen artritis reumatoide, soriasis, dermatitis de contacto y reacciones de hipersensibilidad.
La presente invención también se dirige a procedimientos para seleccionar compuestos que modulen la expresión del ADN o ARN que codifica una proteína KDR humana. Los compuestos que modulan estas actividades pueden ser ADN, ARN, péptidos, proteínas o moléculas orgánicas no proteicas. Los compuestos pueden modular mediante el aumento o atenuación de la expresión del ADN o ARN que codifica el KDR humano o de la función del KDR humano. Los compuestos que modulan la expresión del ADN o ARN que codifican el KDR humano o la función biológica del mismo pueden detectarse mediante diversos ensayos. El ensayo puede ser un simple ensayo de "si/no" para determinar si hay cambios en la expresión o en la función. El ensayo puede hacerse cuantitativo mediante la comparación de la expresión o función de una muestra de prueba con los niveles de expresión o función de una muestra convencional. Pueden prepararse kits que contengan el KDR humano, anticuerpos frente a KDR humano o KDR humano modificado mediante procedimientos conocidos para tales usos.
Las moléculas de ADN, moléculas de ARN, proteína recombinante y anticuerpos de la presente invención pueden usarse para la selección y medida de los niveles de KDR humano. Las proteínas recombinantes, moléculas de ADN, moléculas de ARN y anticuerpos llevan por si solas a la formulación de kits adecuados para la detección y tipado del KDR humano. Este kit podría comprender un vehículo compartimentalizado adecuado para mantener confinado en al menos un recipiente cerrado. El vehículo además podría comprender reactivos tales como KDR recombinante o anticuerpos anti-KDR adecuados para la detección del KDR humano. El vehículo también puede contener un medio para la detección tal como antígeno marcado o sustratos enzimáticos o similares.
Las composiciones farmacéuticamente útiles que comprenden moduladores del KDR humano podrían formularse según procedimientos conocidos, tales como mediante la mezcla de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de estos vehículos y procedimientos de formulación pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences. Para formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para una administración eficaz, estas composiciones contendrán una cantidad eficaz de la proteína, ADN, ARN, KDR humano modificado u agonistas o antagonistas de KDR, incluyendo activadores o inhibidores de la tirosina cinasa.
Las composiciones terapéuticas o diagnósticas de la invención se administran a un individuo en cantidades suficientes para tratar o diagnosticar trastornos. La cantidad eficaz puede variar según diversos factores, tales como estado, peso, sexo y edad del individuo. Otros factores incluyen el modo de administración.
Las composiciones farmacéuticas pueden proporcionarse al individuo mediante diversas vías, tales como subcutánea, tópica, oral e intramuscular.
La expresión "derivado químico" describe una molécula que contiene restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la molécula base. Estos restos pueden mejorar la solubilidad, semivida, absorción, etc., de la molécula base. Alternativamente, los restos pueden atenuar efectos adversos no deseados de la molécula base o disminuir la toxicidad de la molécula base. Ejemplos de estos restos se describen en diversos libros de texto, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences.
Los compuestos identificados según los procedimientos descritos en este documento pueden utilizarse de forma independiente a dosis apropiadas. Alternativamente, puede ser deseable la administración conjunta o secuencial de otros agentes.
Las composiciones que contienen compuestos identificados según esta invención como el principio activo pueden administrarse en una amplia variedad de formas de dosificación terapéutica en vehículos convencionales para la administración. Por ejemplo, los compuestos pueden administrarse en formas de dosificación oral; tales como comprimidos, cápsulas (incluyendo cada una formulaciones de liberación programada y liberación mantenida), píldoras, polvos, granulados, elixires, tinciones, soluciones, suspensiones, jarabes y emulsiones, o mediante inyección. Así mismo, también pueden administrarse de forma intravenosa (tanto en bolo como en infusión), intraperitoneal, subcutánea, tópica con o sin oclusión o intramuscular, siendo todas las formas bien conocidas por los expertos en la materia farmacéutica.
De forma ventajosa, los compuestos pueden administrarse en una dosis única diaria, o la dosis total diaria puede administrase dividida en dos, tres o cuatro dosis al día. Además, los compuestos de la presente invención pueden administrarse de forma intranasal a través del uso tópico de vehículos intranasales adecuados, o a través de vías transdérmicas, usando las formas de parches cutáneos transdérmicos bien conocidos por los expertos en la materia. Para su administración en forma de un sistema de administración transdérmico, la administración de la dosis será, por supuesto, continua en lugar de manera intermitente a lo largo del régimen de dosificación.
Para una politerapia con más de un agente activo, cuando los agentes activos están en formulaciones de dosificación independientes, los agentes activos pueden administrarse de forma concomitante o pueden administrarse separados a tiempos escalonados.
El régimen de dosificación que utiliza los compuestos de la presente invención, se selecciona de acuerdo con una diversidad de factores que incluyen tipo, especie, edad, peso, sexo y condición médica del paciente, la gravedad de la enfermedad que se va a tratar; la vía de administración, las funciones renal, hepática y cardiovascular del paciente y el compuesto en especial del mismo empleado. Un medico o veterinario experto puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad eficaz del fármaco para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la enfermedad. La precisión óptima para alcanzar las concentraciones del fármaco dentro del intervalo que produce eficacia sin toxicidad requiere un régimen basado en los parámetros cinéticos de la disponibilidad del fármaco en los sitios diana. Esto supone una consideración de la distribución, equilibrio y eliminación de un fármaco.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar la presente invención sin limitar, sin embargo, a la misma.
Ejemplo 1
Aislamiento de un ADNc que codifica el KDR humano
Materiales: Se obtuvo una biblioteca de ADNc de fago lambda de células endoteliales de la vena umbilical humana de Clonetech (Nº de Cat. HL1070b). La modificación del ADN y las enzimas de restricción se obtuvieron de Promega. El plásmido pGEM7Z se obtuvo de Promega (Nº de Cat. P2251), la polimerasa Taq era de Perkin Elmer Cetus (número de parte N801-0055). Los enlazadores BamHI se obtuvieron de New England Bilolabs (Nº de Cat. 1071). El [\alpha-^{32}P]dATP se obtuvo de Amersham (Nº de Cat. PB 10204). Rediprime también se obtuvo de Amersham (Nº de Cat. RPN 1633). El vector de expresión de baculovirus pAcG2T se obtuvo de Pharmingen (Nº de Cat. 21414P).
Los cebadores para PCR son los siguientes:
KDR-A 5'-GGAATTCCATCCAAGCGGCAAATGTGTC-3' (ID SEC Nº 3);
KDR-B 5'-GGAATTCCGAGTCTTCTACAAGGGTCTC-3' (ID SEC Nº 4);
KDR-C 5'-TTATGACAACACAGCAGG-3' (ID SEC Nº 5) y
KDR-D 5'-TTGGATCCTCGAGTTGGGGTGTGGATGC-3' (ID SEC Nº 6).
Procedimientos: Clonación del gen: El ADNc del KDR se aisló sometiendo una biblioteca de ADNc de fago lambda de células endoteliales de la vena umbilical humana de Clonetech a una sonda de ADN específica de KDR de 576 pares de bases. La sonda se preparó mediante PCR usando los cebadores KDR-A/KDR-B y la polimerasa Taq, marcándose a continuación hasta una actividad específica de 1x10^{7} cpm/ng mediante cebado aleatorio. El fago se dispuso en placas a aproximadamente 50.000 placas de fago/placa y la hibridación se realizó mediante protocolos convencionales. Se analizaron un total de 1x10^{6} fagos. Se aislaron clones del fago lambda que contenían inserciones únicas a través de tres rondas de cultivo en placa repetido y, a continuación, se caracterizaron. Los 110 pares de bases del extremo 3' no representados en ninguno de los clones aislados se clonaron por PCR a partir de la misma biblioteca que anteriormente usando los cebadores KDR-C y KDR-D. Se usaron clones superpuestos para generar un gen KDR de longitud completa mediante digestión por enzimas de restricción, aislamiento de los fragmentos individuales del gen y ligamiento (las enzimas de restricción y la ligasa se obtuvieron de Promega) en pGEM7Z. El gen contenía un sitio XhoI en el extremo 5' terminal que se cambió por un sitio BamHI cortando primero con XhoI y formando a continuación un extremo romo con la ADN polimerasa y ligando un enlazador oligonucleotídico BamHI y, finalmente, clonándolo como un fragmento BamHI/BamHT en pGEm7Z. El gen se secuenció en un secuenciador automático ABI Prism modelo número 377. La secuencia de ADNc del KDR humano se muestra en las Figuras 1A y 1B. En la Figura 2 se muestra la secuencia de aminoácidos deducida del KDR humano.
Ejemplo 2
Construcción de GST/KDR-1
El dominio citoplásmico de KDR que contiene la actividad tirosina cinasa se clonó independientemente como una fusión génica con la glutatión S-transferasa (GST) en un vector de expresión de baculovirus para caracterizar la actividad tirosina cinasa. Para construir esta fusión con GST, se introdujo un sitio de clonación Kpn I en el gen KDR cambiando los codones que codifican los restos Gly 800 (GGG a GGC) y Leu 802 (TTG a CTG), y el sitio BamHI existente se eliminó cambiando el codón que codifica Asp 807 (GAT a GAC); estos cambios son silenciosos y no cambian la secuencia de aminoácidos del receptor.
Se introdujo un nuevo sitio BamHI para formar una fusión en fase con el extremo carboxílico terminal de GST y KDR en la Ala 792. La GST y los fragmentos digeridos con BamHI de KDR se ligaron para generar la fusión en fase GST/KDR. La proteína tirosina cinasa GST/KDR activa se produce en células de insectos.
Ejemplo 3
Construcción del núcleo del dominio cinasa de KDR
El dominio cinasa de KDR se clonó usando el sitio BamHI preexistente en el extremo 5' del dominio cinasa e introduciendo un codón de parada seguido por un sitio Sall en el extremo 3' del dominio cinasa (Tyr 1.175, TAC se cambió por TAA). El ADN de KDR se usó como molde en una reacción de PCR con los cebadores KDR-E (5'-GGATC
CAGATGAACTCCCATTG-3' [ID SEC Nº 7]) y KDR-F (5'-GTCGACTTAGTCTTTGCCATCCTGCTGAGC-3' [ID SEC Nº 8]). El fragmento BamHI/SaII del núcleo cinasa de KDR resultante se clonó en pBlueBacHis2B, esto crea una fusión en fase del codón de iniciación de metionina y la secuencia de poli histidina del vector con el dominio cinasa de KDR. Este vector, pBBH-KDR-1, también proporciona un sitio de reconocimiento para la enterocinasa para eliminar la etiqueta polipeptídica de His mediante proteolisis. El núcleo de la proteína cinasa KDR se expresó en células de insecto y se purificó en una columna quelante de níquel. El núcleo cinasa de la KDR purificada se activó en el ensayo cinasa descrito en este documento.
Ejemplo 4
Modelado molecular del KDR humano
El dominio citoplásmico del receptor de VEGF se alineó a mano con la secuencia de FGFR1 tomada de la estructura cristalina publicada (Mohammadi, M., Schlessinger, J. y Hubbard, S.R., 1996, Cell 86:577). Las secuencias eran \sim60% idénticas en este alineamiento. A continuación, se construyó un modelo de homología de la cinasa de KDR en Quanta (versión 4.1p) copiando las coordenadas de la estructura cristalina de FGFR1/AMP-PCP. La región cinasa insertada (restos 933-1.006 de KDR) no se incluyó en el modelo ya que no había una conformación única para esta región en la estructura cristalina. A continuación, el modelo de homología se minimizó usando CHARMM en Quanta limitando el esqueleto de la proteína y permitiendo que las cadenas laterales se muevan libremente.
El cambio del resto de aminoácido 848 de la Glu publicada por Val en la ID SEC Nº 2 se encuentra en la estructura modificada rica en glicina, que forma parte del bolsillo de unión a ATP. Se encuentra que la Val altamente conservada establecía contactos hidrófobos con el ATP en otras cinasas y parece estar posicionada para formar estos mismos contactos en KDR. Probablemente, la Glu cargada en esta posición no permite un contacto adecuado con el ATP. Esto se muestra mediante el modelado por ordenador en la Figura 3A y 3B. La Figura 3A muestra el dominio de unión a ATP del modelo de homología del mutante V848E de KDR con AMP-PCP unido. La cadena lateral de E848 está en contacto con la adenina de AMP-PCP. No es visible el fosfato gamma de AMP-PCP. El trazado del carbono alfa de la proteína se muestra entre líneas, el AMP-PCP en modelo de varillas y la cadena lateral de E848 en modelo de bolas. El lóbulo N-terminal aparece coloreado de azul (o, alternativamente, marcado con círculos vacíos) con la excepción de la estructura modificada rica en glicina que está coloreado de verde (o alternativamente marcada como una región rayada). El lóbulo C-terminal está coloreado en rojo (o alternativamente, marcado con círculos negros). La Figura 3B muestra el dominio de unión a ATP del modelo de homología de KDR con AMP-PCP unido. La cadena lateral de V848 forma contactos hidrófobos con la adenina de AMP-PCP. No es visible el fosfato gamma de AMP-PCP. El trazado de carbono alfa de la proteína se muestra entre líneas, el AMP-PCP en modelo de varillas y la cadena lateral de V848 en modelo de bolas. El lóbulo N-terminal aparece coloreado de azul (o, alternativamente, marcado con círculos vacíos) con la excepción de la estructura modificada rica en glicina que está coloreado de verde (o alternativamente marcada como una región rayada). El lóbulo C-terminal está coloreado en rojo (o alternativamente, marcado con círculos negros).
Ejemplo 5
Fosforilación de la tirosina de mutantes KDRcyt
KDRcytE848 y KDR_{cyt}V848 purificados se incubaron a concentraciones de 12 ng o 120 ng, respectivamente, con o sin ATP 1 mM a 37ºC durante 10 min. La reacción se detuvo mediante la adición de un volumen igual de tampón de muestra de PAGE-SDS 2x y se hirvió durante 5 min. Los productos de reacción se separaron mediante PAGE SDS al 7,5% y se analizaron mediante transferencia Western incubados con el anticuerpo antifosfotirosina PY20 (Transduction Laboratories; Figura 4A) o un anticuerpo anti-KDR (Santa Cruz Biotechnology; Figura 4B), se visualizaron usando el kit de detección ECL y se cuantificó mediante barrido con un densitómetro (Molecular Dynamics). La Figura 4A muestra como GST-KDR_{cyt}E848 purificado no era capaz de autofosforilarse en presencia de ATP 1 mM, en el que 12 ng de GST-KDR_{cyt}V848 en presencia de ATP 1 mM daba lugar a la autofosforilación. La Figura 4B muestra una señal frente al anticuerpo anti-KDR para 120 ng de GST-KDR_{cyt}E848 y 12 ng de GST-KDR_{cyt}V848.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTES: Merck & Co., Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTOR DE TIPO TIROSINA CINASA HUMANO, KDR
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Merck & Co., Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: P.O. Box 2000
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Rahway
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: NJ
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 07065-0907
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM compatible con PC
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1,30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Hand, J. Mark
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 36.545
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 19963PV
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 732/594-3905
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 732/594-4720
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4.071 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:
3
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1.356 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
6
7
8
9
10 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc= "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAATTCCAT CCAAGCGGCA AATGTGTC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc= "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAATTCCGA GTCTTCTACA AGGGTCTC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc= "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTATGACAAC ACAGCAGG 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc= "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEQ Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGGATCCTC GAGTTGGGGT GTGGGATGC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCAGAT GAACTCCCAT TG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCGACTTAG TCTTTGCCAT CCTGCTGAGC 
\hfill
30

Claims (20)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una forma biológicamente activa de la proteína KDR humana en la que la posición 848 es Val, la posición 498 es Glu, la posición 772 es Ala, la posición 787 es Arg, la posición 835 es Lys y la posición 1.347 es Ser.
2. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 1.
3. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una porción intracelular de una proteína KDR humana que comprende del aminoácido 790 al aminoácido 1.356 de la secuencia mostrada en la ID SEC Nº 2.
4. Un ácido nucleico según la reivindicación 3 en el que se inserta un codón de terminación, de modo que la fase de lectura abierta de KDR termina en la Tyr 1.175.
5. Un ácido nucleico según la reivindicación 3 que codifica una proteína de fusión KDR soluble que comprende del aminoácido 790 al aminoácido 1.356 de la secuencia mostrada en la ID SEC Nº 2.
6. Un ácido nucleico según la reivindicación 5 que codifica GST-KDR.
7. Un ácido nucleico según la reivindicación 4 que está contenido en un vector de ADN, pBlucBacHis2B.
8. Un vector de expresión para la expresión de una proteína KDR humana en una célula huésped recombinante en el que dicho vector de expresión comprende un ácido nucleico según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
9. Una célula huésped que expresa una proteína KDR humana recombinante en la que dicha célula huésped contiene un vector de expresión según la reivindicación 8.
10. Una célula huésped según la reivindicación 9 que es una célula eucariota.
11. Una célula huésped según la reivindicación 9 que es una célula procariota.
12. Una fracción subcelular de membrana obtenida a partir de una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 que contiene la proteína KDR humana recombinante.
13. Un procedimiento para la expresión de una proteína KDR humana en una célula huésped recombinante que comprende:
(a) transfectar un vector de expresión según la reivindicación 8 en una célula huésped adecuada, y
(b) cultivar la célula huésped de la etapa (a) en condiciones que permiten la expresión de la proteína KDR humana a partir del vector de expresión.
14. Una proteína KDR humana aislada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 2.
15. Un fragmento de una proteína aislado que es una porción intracelular de una proteína KDR humana y que comprende del aminoácido 790 al aminoácido 1.356 de la secuencia mostrada en la ID SEC Nº 2.
16. Una proteína según la reivindicación 15 que es una proteína de fusión de KDR soluble.
17. La proteína según la reivindicación 16 que es GST-KDR.
18. Un procedimiento para identificar un compuesto que es un modulador del KDR humano que comprende:
(a) combinar una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, un sustrato y un compuesto de ensayo y
(b) medir la actividad tirosina cinasa de dicha proteína.
19. Un procedimiento según la reivindicación 18 en el que el sustrato es pEY.
20. Un procedimiento según la reivindicación 18 ó 19 en el que la proteína es GST-KDR.
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