CN100448890C - 来源于mp－52蛋白质的新型蛋白质及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

一种蛋白质和它的二聚体蛋白质，该蛋白质具有序列表中序号1的氨基酸序列，来源于人MP52。上述的二聚体蛋白质可这样得到：构建一质粒，该质粒含有能编码序列表中序列号1氨基酸序列的DNA，该DNA的5′末端有编码甲硫氨酸的密码子，用这种质粒转化大肠杆菌，培养大肠杆菌，溶化培养中得到的包涵体，从溶化液中提纯得到单体蛋白质，单体蛋白质复性得到二聚体蛋白质，再对此进行纯化。所得的二聚体蛋白质可用于软骨和骨疾病的治疗。

Description

来源于MP-52蛋白质的新型蛋白质及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种蛋白质，它来源于MP52，具有序列表中序列号1的氨基酸序列。本发明还涉及该蛋白质的二聚体以及由这种二聚体蛋白质作活性成分形成的用于治疗软骨和骨疾病的药剂。本发明还涉及一种方法，就是用含有能表达上述蛋白质DNA序列的质粒转化大肠杆菌，然后用大肠杆菌制备大量、高纯度的上述蛋白质。另外，本发明涉及一种治疗方法，即施用二聚体蛋白质来治疗软骨、骨疾病。

技术背景

现在已知用于预防和治疗骨疾病的药剂有雌激素、降钙素、维他命D₃及其衍生物，以及二磷酸盐的衍生物等。最近报道TGF-β基因超家族的骨形成因子(骨形态发生蛋白：以后称作BMP)，包括BMP-2到BMP-9等一系列蛋白质有骨形成作用。

另外也有报道一种叫做MP52的蛋白质(WO93/16099及WO95/04819)具有骨形成作用。人们认为成熟型MP52是N端有丙氨酸的120个残基形成的蛋白质，其氨基酸序列在这些申请中有所描述。

自然，Vol.368、p.639-643(1994年)及WO94/15949中也记载了一种叫做GDF-5的蛋白质，它来源于小鼠，氨基酸序列与MP52很相似。

但是，以工业规模制备这些蛋白质的纯品很还容易。

曾尝试应用哺乳动物细胞如L-细胞通过遗传工程技术来制备MP52，但是不容易制备大量的纯品MP52。

发明的公开

本发明者们尝试用大肠杆菌，通过遗传工程技术来大量制备MP52。也就是把编码甲硫氨酸的密码子加到从丙氨酸开始编码MP52的DNA5′末端，用该大肠杆菌来制备MP52。产物不仅是MP52，而是MP52的混合物，还包括N端为甲硫氨酸的121个残基形成的蛋白质，以及N端脱落丙氨酸而从脯氨酸开始的119个残基形成的蛋白质，这很难从中分离出纯化MP52。

本发明者发现把编码甲硫氨酸的密码子与编码序列表中序列号1中氨基酸序列的DNA 5′末端结合，序号1的序列由MP52N末端删除丙氨酸后119个残基形成，这样来构建质粒，然后用导入了质粒的大肠杆菌来表达，这样可选择性地大量生产N末端从脯氨酸开始的序列表中序列号1的蛋白质。

而且本发明证实序列表序列号1中所述蛋白质的二聚体有软骨和骨形成作用，由此完成了本发明。

本发明涉及一种蛋白质，它具有序列表序列号1所示的氨基酸序列。该蛋白质由119个残基组成，119个残基是从人MP52120个残基形成的成熟区的N末端去除丙氨酸后形成的。本发明的蛋白质溶于水，而且因为它来源于人类，所以自身的毒性很小。

另外，本发明涉及一种用于软骨和(或)骨疾病治疗的药剂，它包括蛋白质的二聚体，而该蛋白质具有序列表中序列号1的氨基酸序列。更具体而言，由于本发明的蛋白质二聚体具有形成软骨、骨的活性，所以本发明涉及用于预防及治疗下列疾病的药剂：骨质疏松症，先天性软骨、骨疾病，变形性膝关节炎、变形性股关节症等变形性关节炎，骨关节炎，半月板损伤等软骨损伤，外伤、肿瘤切除等造成的骨、软骨缺损部分的再生，骨和软骨的缺损，骨折，软骨发育不良、软骨发育不全，无软骨形成、腭裂、骨形成不良等先天性软骨和骨疾病，另外还有牙根、牙槽的缺损等。因为本发明的蛋白质具有形成软骨、骨的活性，所以它可用于治疗整容外科的骨移植。这些治疗也包括兽医外科领域的治疗。

本发明涉及一种方法，它是用大肠杆菌来制备一种蛋白质，该蛋白质由序列表中序列号1所示，来源于人MP52的119个氨基酸残基组成。

另外，本发明涉及质粒的构建，该质粒含有编码序列表中序列号1所示来源于人MP52的119个氨基酸残基序列的DNA，其5′末端的编码甲硫氨酸。用聚合酶链式反应(PCR法)仅对人MP52cDNA的成熟区域进行扩增，其中用含有WO93/16099中cDNA的质粒载体作模板DNA。这里所用的PCR法通常指用美国专利4,683,195中描述的方法来扩增DNA或RNA的微量片段。

为了生产本发明的蛋白质，有必要构建包含有编码该蛋白质DNA的合适表达载体，然后用遗传工程技术插入到所需大肠杆菌宿主中。为了大量生产本发明的蛋白质，实施了以下两个改良方法：1)提高目的蛋白生产能力的方法：M.Nobuhara等(农业生物化学，52(6)，1331～1338，1988)提高翻译效率的方法，即提高起始密码子ATG周围AT含量的方法；2)提高质粒复制数目的方法，即复制起始点由pBR改变为pUC的方法。另外，把启动子区域与编码序列表中序列号1氨基酸序列的DNA直接连结起来，以构建本发明的表达载体(pKOT 245)。该载体于1995年4月14日保藏于通商产业省，工业科技院、国家生命科学人类技术研究所(NIBH)(茨城县筑波郡谷田部町东，丁目1-3(日本)，登记号为FERM P-14895，1996年4月10日根据布达佩斯条约转移到国际保藏(FERM BP-5499)。

本发明涉及制备单体蛋白质的方法，其步骤是构建一质粒，该质粒含有能编码序列表中序列号1氨基酸序列的DNA，DNA的5′末端有编码甲硫氨酸的密码子，把构建的质粒导入到大肠杆菌进行转化，培养大肠杆菌，得到包涵体，对此进行溶解，纯化后可得到单体蛋白质；本发明还涉及用这种单体蛋白质，经复性、纯化形成序列表中序号1蛋白质的二聚体蛋白质的制备方法，即大肠杆菌的包涵体经溶解之后经SP-Sepharose柱及Sephacryl S-200柱得到单一的磺酸化的MP52单体，然后经反相HPLC的RESOURCE，PRC柱，得到蛋白质的纯化二聚体级分。通过分析本蛋白质的N末端氨基酸序列，氨基酸组成及其电泳来了解其物理化学性质。

本发明还涉及培养大肠杆菌的方法，经本发明的表达载体插入后的大肠杆菌的培养条件是培养液温度为28℃-34℃，pH6-8，溶解的氧浓度为20-50％。

本发明蛋白质二聚体的生物学活性这样确定，对异位软骨/骨的形成进行软X线放射照片分析、组织学分析及随时间变化的分析。另外，根据对膜内骨化的作用，对关节软骨再生的效果以及对骨折/骨缺损的治愈效果来判定本发明的蛋白质对软骨/骨的重建是否有效。

可通过静脉内、肌肉内及腹腔内施用来全身施用本发明的蛋白质二聚体，静脉内施用时除应用传统的静脉内注射外，可用其它的静脉内输注的方法。

作为注射用的制剂，例如可用注射用粉末制剂。此时可应用一种或两种以上的水溶性赋形剂如甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等，在水中溶解后分装在小瓶或安瓿中，然后冷冻干燥密封保存。

局部施用时，可将本发明的蛋白质覆盖在经胶原膏、纤维蛋白胶或其它粘附剂处理的软骨/骨或牙齿表面。骨移植时可应用天然骨，也可应用传统的人工骨。所谓的人工骨指用金属、陶瓷、玻璃等天然物质或人工无机物质制成的骨。优选的人工无机物质是羟基磷灰石，例如人工骨的内部用金属材料，外侧用羟磷灰石。癌性骨组织移除后也可用本蛋白质促进骨重建，另外也可用于软骨移植。

施用的剂量要取决于影响本蛋白质作用的各种因素，例如要考虑到骨/软骨重建所形成的重量，骨/软骨损伤的部位以及病情，患者的年龄、性别、感染的严重程度，用药时间及其它临床因素，由临床医师确定其施用剂量。另外，要根据再构建时与本蛋白质一起应用的载体类型而改变其用量。通常情况下，当施用含有载体的组合物时，每份所希望的骨/软骨湿重所对应的剂量范围为10-10⁶ng，局部及全身注射应用时，每人优选的剂量为0.1-10⁴mg，频率为每周一次到每天1次。

期望与已知的生长因子，如用于骨/软骨再生的胰岛素样生长因子-I(IGF-I)一起应用能产生协同效果。

至今没有报道以工业规模、纯化形式制备本发明蛋白质的方法，因为本发明的蛋白质有形成软骨/骨的作用，所以可用作软骨、骨疾病的药剂。此外本发明的制备方法可用于制备上述TGF-β基因超家族的骨形成因子，目前为止只能用哺乳动物细胞系来制备。

附图简述

图1是实施例1(2)中本发明蛋白质表达载体(pKOT245)的质粒图。

图2是实施例4(1)中小鼠大腿肌肉中诱导形成的骨/软骨钙化组织的软X线片。

图3是实施例4(1)中小鼠大腿肌肉中形成的骨/软骨钙化组织非脱钙切片组织染色的显微镜下观察的照片。

图4是实施例4(2)组织染色的显微镜下的照片，它表示小鼠大腿肌肉内软骨/骨形成随时间的变化。

图5是实施例4(3)中大鼠顶骨脱钙切片组织染色后显微镜下的照片。

图6是实施例4(4)中家兔含关节软骨的股骨头部脱钙组织切片组织染色的显微镜照片。

图7是实施例4(5)中股骨形成骨缺损的大鼠大腿部的软X线片。

本发明的最佳实施方案

下面举例来具体说明本发明的效果但是这些实施例并不是对本发明进行限制。

实施例1载体的制备

(1)变异型MP52成熟区的分离

以包含有WO93/16099中所述cDNA的质粒载体(pSK52s)作模板DNA，用聚合酶链式反应(PCR)来扩增人MP52cDNA的成熟区。

依照增强目的基因生产能力的方法{M.Nobuhara等报道(农业生物化学，52(6)，1331-1338，(1988)}，替换成熟型MP52基因的部分DNA，以提高起始密码子ATG周围AT的含量。

替换经PCR法进行，采用序列号2上游的PCR引物。所应用PCR引物的DNA序列是，序列号2为上游引物，序列号3为下游引物。

PCR这样进行，同一试管中加入模板DNA(10ng)、上游及下游PCR引物各50皮摩尔、dNTP(0.2mmol)及MgCl₂(1.5mmol)，同Taq DNA聚合酶(5U)一起加入。

PCR进行30个循环，每一循环均经过变性(94℃，1分钟)、引物退火(55℃，1分钟)及引物延伸(72℃，2分钟)(以下的PCR均在这一条件下进行)。

所得PCR反应产物经1.5％低融点琼脂(FMC)电泳进行分离，分离出与序列号1的氨基酸相等约360bp的DNA(这为片段1)。

(2)本发明蛋白质的大肠杆菌表达载体的构建

为了增加质粒的复制数目，把复制起始点由pBR系改为pUC系。用限制性内切酶SspI和EcoRI消化市场中买到的大肠杆菌表达载体pKK223-3(购自Pharmacia Biotech)，分离到tac启动子区域，经Mung菜豆核酸酶处理后，用T₄DNA连接酶(宝酒造公司，目录号2011A)连接到片段1的起始密码子侧，用限制性内切酶SalI和SspI消化pKK223-3，分离到rrnBT₁T₂终止区域，连接到经SalI消化了的片段1的终止密码子侧，然后连接到pUC18的SmaI部位，构成生产本发明蛋白质的表达载体{pKOT245(登记号为微工研寄第P-14895号)}(图1)。pKOT245的DNA长度为3.7kb。用Pharmacia ALP DNA测序仪分析本发明蛋白质的表达载体的碱基序列。

(3)转化

依照Kushner等的氯化铷法(基因工程，p17，Elsevier(1978))进行转化，即依照上述方法将pKOT245转化到宿主大肠杆菌W3110M，形成制备本发明蛋白质的大肠杆菌。

实施例2培养

(1)培养

在调整了的SOC培养基(Bacto胰蛋白胨20g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl 0.5g/L，MgCl₂·6H₂O 2.03g/l，葡萄糖3.6g/l)中预培养表达本发明蛋白质的大肠杆菌，把100ml细菌悬液加到5L生产培养基中(细菌培养用胰蛋白胨5g/l，柠檬酸4.3g/l，K₂HPO₄ 4.675g/l，KH₂PO₄1.275g/l，NaCl 0.865g/l，FeSO₄·7H₂O 100mg/l，CuSO₄·5H₂O 1mg/l，MnSO₄·2H₂O 0.5mg/l，CaCl₂·2H₂O 2mg/l，Na₂B₄O₇·10H₂O 0.225mg/l，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.1mg/l，ZnSO₄·7H₂O 2.25mg/l，CoCl₂·6H₂O 6mg/l，MgSO₄·7H₂O 2.2g/l，硫胺HCl 5.0mg/l，葡萄糖3g/l)，在10L的培养罐中进行通气搅拌培养，在到达对数生长前期(OD550＝5.0)时，添加1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，一直培养到OD550为150。培养过程中，温度为32℃，加氨调pH值为7.15，为了防止溶解的氧浓度降低，搅拌速度增加到使溶解的氧浓度达到空气饱和的50％。为了获得高浓度的细菌，可以溶解氧浓度的急速上升为指标，添加50％的葡萄糖溶液，达到0.2％。

(2)大肠杆菌包涵体的制备

把由上述方法得到的培养液离心，收集菌体，然后悬浮到含10mM乙二胺四乙酸的25mM Tris-HCl缓冲液中(pH7.3)，在云浆器中(Gaulin公司)，破坏细菌，再次离心，收集含有包涵体的沉淀。

实施例3纯化

(1)大肠杆菌包涵体的溶化

在1％Triton X-100中洗涤3次后，把大肠杆菌包涵体在4℃、3000×g离心30分钟，所得沉淀在20mM Tris-HCl缓冲液：pH8.3，8M尿素，10mM DTT，1mM EDTA中，经超声波溶解。

(2)单体的制备

溶解液在4℃、20000×g条件下离心30分钟，收集上清液。把所得上清液通过经20mM Tris·HCl缓冲液、pH8.3，6M尿素，1mM EDTA平衡过的SP-Sepharose FF(Parmacia公司)，用相同的溶液洗涤，用含有0.5M食盐的相同溶液进行洗脱。在洗脱液中添加Na₂SO₃和Na₂S₄O₆直到各自的终浓度达到111mM、13mM，在4℃进行磺酸化15个小时。用20mM Tris-HCl缓冲液、pH8.3，6M尿素，0.2M NaCl，1mM EDTA平衡过的Sephacryl S-200HR(Pharmacia公司)对硫酸化溶液进行凝胶过滤，可得到本发明蛋白质单一磺酸化的单体。

(3)再折叠

本发明蛋白质的磺酸化单体溶液中加入9倍的pH9.8的50mM Na-甘氨酸缓冲液、0.2M NaCl、16mM CHAPS、5mM EDTA、2mMGSH(还原型谷胱甘肽)、1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)后，4℃搅拌进行再生24小时。

(4)二聚体的制备

用纯净水将再折叠溶液进行2倍稀释，加6N盐酸调pH为7.4进行等电点沉淀。3000×g离心20分钟收集沉淀，然后在30％乙腈、0.1％TFA中溶解。用纯水将所得溶液进行2倍稀释，然后在经0.05％TFA、25％乙腈平衡过的反相HPLC的RESOURCE PRC柱(Pharmacia)上加样，然后用0.05％TFA、25-45％乙腈形成的梯度液进行洗脱。在吸光光度计的280nm波长处测定洗脱液的吸光度，可得到纯化的蛋白质二聚体级分。用Speed Vac Concentrator(Serrant公司)对此进行冷冻干燥。

(5)测定本发明纯化蛋白质的物理化学性质

(A)N末端氨基酸序列的分析

用476A型氨基酸测序仪(Applied Biosystems公司)来分析上述纯化蛋白质的N末端氨基酸序列，能证实序列表中序列号1从N末端到第30个氨基酸的序列。

(B)氨基酸组成的分析

用氨基酸分析仪[PICO TAG系统(Waters公司)]来分析上述纯化蛋白质的氨基酸组成，其结果如表1所示。表1所示的数目指每一单体蛋白质的氨基酸残基数。

表1

-：未检出

(C)电泳分析

非还原条件下经SDS-PAGE确定，上述纯化蛋白质的分子量为28KDa。

由上述(A)、(B)、(C)所显示的结果可知，本发明的蛋白质是由从单个脯氨酸开始的119个氨基酸残基组成的蛋白质。实施例4生物学活性的测定

(1)异位软骨/骨组织形成的作用

把实施例3得到的500μg蛋白质溶解在50μl 10mM盐酸中，用同一溶剂稀释，制成浓度为1μg/10μl，10μg/10μl，100μg/10μl的溶液。每10μl与150μl来源于猪腱的I型胶原溶液(高研，0.5％，pH3，I-AC)混和，中和后冷冻干燥，把所得混合物埋入8周龄ICR雄性小鼠的大腿肌肉内，21天后摘取大腿，剥离皮肤，根据软X线片检测骨/软骨钙化组织的发生率。结果如表2所示。用量为1μg/部位以上时可发现部分钙化，剂量为10μg/部位以上时所有的小鼠均可出现钙化。

表2

^*每组有4例，根据对骨/软骨钙化组织的软X线片进行分

析的结果来表示发生率

另外，图2表明了各个用量时所诱导的骨/软骨钙化组织的典型软X线片。图2显示了把不同用量的MP52蛋白质埋入小鼠大腿肌肉内的结果，其中A应用的MP52蛋白质为1μg/部位，B为10μg/部位，C为100μg/部位。从这一结果可看出骨/软骨钙化组织呈剂量依赖性地增加。这些小鼠的大腿经固定后制成非脱钙切片，各自进行了Von Kossa染色、Alcian blue染色和(苏木精伊红)染色。

图3为蛋白质用量为10μg/部位时与I型胶原一起埋入后所取标本组织染色的显微镜照片。图3中A、B、C分别表示Von Kossa染色、Alcian blue染色及(苏木精伊红)染色。

图3(A)中箭头ct部分表示钙化组织，cc部分表示钙化的软骨细胞。图3(B)中箭头rc部分表示残存的软骨组织。图3(C)中箭头ad部分表示脂肪细胞，bm部分为骨髓细胞，1b部分为板层骨，ob部分为成骨细胞，wb为网状骨。图3表明施用MP52蛋白质可生成成骨细胞，骨髓细胞、钙化软骨细胞，也可形成骨/软骨钙化组织。

实施例4的结果可证明本发明蛋白质的二聚体有诱导软骨/骨形成的作用。

(2)异位骨化作用的时相分析

把从实施例3中所得的3μg蛋白质按实施例4(1)中所述的同一方法进行制备，把所得冷冻干燥物埋入ICR小鼠的大腿肌肉中，3、7、10、14、21及28日后取出组织，用10％的福尔马林进行固定，之后对组织切片进行苏木精伊红染色(HE)及Von Kossa染色。图4表示染色切片的光学显微镜照片。

第3天(图4A、HE)可看到埋入的胶原纤维(co)与周围的肌肉组织(m)之间出现未分化的间质细胞(mc)，它包含有形态学上结合的纤维细胞。从第7天(图4B，HE)到第10天(图4C、HE)可看到该部位的未分化间质细胞(mc)堆积、增殖，并且这些细胞肥大化，分化成前软骨样组织，第14日(图4D、HE；图4E、Von Kossa)可看到钙化的软骨组织(箭头cc)及骨组织(箭头b)。第21日(图4F、HE；图4G、Von Kossa)可看到骨髓细胞(箭头bm)，但根本看不到第14天所观察到的钙化软骨组织，好象被骨组织(箭头b)所取代。第28天(图4H、HE)可看到广泛的骨髓细胞(bm)，所形成的骨组织(b)好象处于吸收过程。

如用常规BMPs所证实的那样，由此可以证明rMP52能在异位诱导软骨组织，继而能引起软骨内骨形成。

(3)对膜内骨化的影响

在含有0.01％人血清白蛋白的生理磷酸盐缓冲液(pH3.4)中溶解实施例3中得到的蛋白质，配成0.01μg/20μl、0.1μg/20μl及1μg/20μl的溶液，每种溶液取20μl，用微量注射器注射到スプラダド-レ-系大鼠左右顶骨一侧的骨膜中，从大鼠出生后第1天开始注射，一天一次，连续在同一部位注射12天。在对侧顶骨骨膜内注射等量的溶剂。给对照组大鼠的两侧顶骨骨膜内注射溶剂。最后一次施用后摘出左右顶骨，固定，施用部位经脱钙后HE染色制作标本，测定显微镜照片上左右顶骨施用部位的厚度，计算同一个体施用本发明蛋白质部位的厚度与施用溶剂部位厚度的比例。结果如表3所示。图5是连续注射本发明蛋白质0.1μg/20μl时组织切片的光学显微镜照片，(图5B)与对侧施用溶剂时的光学显微镜照片(图5A)进行比较的实施例。施用本发明的蛋白质可诱导骨膜细胞(P)的活化及增殖，同时在顶骨和骨膜(P)的交界处可发现许多活化的成骨细胞，并且可证实施用部位顶骨(b)的厚度呈剂量依赖性地增厚。结果提示当局部少量注射时，本发明的蛋白质可促进膜骨化，有利于骨质疏松、骨折、牙槽、牙根缺损的治疗。

表3

顶骨厚度及其比值4例的均值±标准差

^*p＜0.05、^**p＜0.01与左右顶骨施用溶剂组相比

(4)对关节软骨再生的效果

把6只12周龄雄性家兔(新西兰白兔)的右侧膝部皮肤和关节囊切开，露出髌骨沟同时避免损伤腱，用牙科钻钻一直径5mm的骨髓腔，造成贯通的关节软骨/骨损伤。按实施例4(1)描述的方法制备含有或不含有实施例3得到的10μg蛋白质的I型胶原冷冻干燥物，然后施用给造成缺损的部位，平均施用3例，缝合关节囊及皮肤。3周后摘出大腿的股骨头，固定，然后脱钙制作组织切片，进行爱茜蓝染色。图6是1例典型的光学显微镜照片。只施用I型胶原冷冻干燥物时(图A和图B)在缺损部位只见到纤维组织(f)，而施用了含本发明实施例3蛋白质10μg的I型胶原蛋白后(图C和图D)可看到在缺损部位伴随爱茜篮染色阳性的细胞外基质有软骨细胞(ch)形成。并且它所形成的组织与正常关节软骨组织观察到的细胞构成相似，由缺损部位从外到内为静止细胞层、增殖细胞层、肥大细胞层。这些结果在每只家兔中均可看到，这表明本发明的蛋白质对软骨再生，尤其是对变形性关节炎或骨关节炎引起的关节软骨变性组织恢复为正常组织有效。

(5)对骨折/骨缺损的治愈效果

用30只スプラダド-レ-系雄性大鼠(约15周龄)做本实验把大腿部的皮肤组织切开，从周围的肌肉组织中把股骨暴露出来，用牙科钻在股骨骨干中央作成5mm的圆柱状骨缺损，然后用不锈钢制做的螺丝将残留的股骨两端固定在聚乙烯制成的板上。制做I型胶原的冷冻干燥物品，含有实施例3蛋白质的量为0，1，10或100μg，然后埋入骨缺损部位，缝合皮肤组织。刚埋入后和埋入12周以后进行软X线照片，结果如图7所示。图7A为刚造成骨缺损时的照片。如图B-E所示，单独埋入I型胶原(图7B)以及埋入含本发明蛋白质1μg的I型胶原(图7C)12周后，在缺损部位的两端仅看到若干边缘的骨内膜(箭头cs)形成而没有形成骨愈合。但是埋入含蛋白质10μg或100μg的I型胶原后(图D和图E)可见到骨缺损部位全部形成骨痂(箭头cs)，X线片上可见到骨愈合。埋入12周后摘出股骨、移去聚乙二醇制做的板，根据二重X线吸收测量学(Aloka，DCS-600)在1mm宽的扫描状态下，沿着与含有骨缺损部股骨长轴方向垂直的方向连续扫描15mm，测定骨缺损中央部位3mm处的骨矿物质含量，同时用树脂固定骨两端，装入骨强度测量仪(Malto，MZ-5000)，以180°/分的速度旋转树脂，测定破坏股骨所必要的最大旋转力度(表4)。结果显示，本发明的蛋白质埋入股骨缺损部位可剂量依赖性地增加该部位的骨矿物质含量并且可提高该部位的骨强度(旋转度)，同样这可以表明本发明的蛋白质对骨折的愈合及骨缺损的重建有效。

表4

以均值±标准误表示

^*p＜0.05与只用胶原组相比

产业上利用的可能性

由含有序列表序号1中氨基酸序列的蛋白质的二聚体构成的蛋白质具有形成软骨/骨的活性，有利于作为软骨/骨疾病的治疗药剂。此外，改变本发明蛋白质的表达载体，用它转化的大肠杆菌，通过基因工程的方法利用这种大肠杆菌可以工业规模制备纯化形式的蛋白质。

序列表

序列号：1

序列长度：119

序列类型：氨基酸

拓朴学：线性

序列的种类：肽

片段类型：N末端片段

来源：

生物名称：人(智人)

组织种类：人胎儿

序列特征：

存在位置：

其它情况：NP52氨基酸序列的383位-501位序列

序列：

CCA CTG GCC ACT CGC CAG GGC AAG CGA CCC AGC AAG AAC CTT AAG GCT  48

Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala

                 5                  10                  15

CGC TGC AGT CGG AAG GCA CTG CAT GTC AAC TTC AAG GAC ATG GGC TGG  96

Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp

            20                  25                  30

GAC GAC TGG ATC ATC GCA CCC CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC GAG  144

Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu

        35                  40                  45

GGG CTG TGC GAG TTC CCA TTG CGC TCC CAC CTG GAG CCC ACG AAT CAT  192

Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His

    50                  55                  60

GCA GTC ATC CAG ACC CTG ATG AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA CCA  240

Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro

65                  70                  75                  80

CCC ACC TGC TGT GTG CCC ACG CGA CTG AGT CCC ATC AGC ATC CTC TTC 288

Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe

                85                  90                  95

ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG GTG TAT AAG CAG TAT GAG GAC ATG GTC 336

Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val

            100                 105                 110

GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGG                                     357

Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg

        115

序列号：2

序列长度：27

序列类型：核酸

链型：单链

拓朴学：线性

序列的种类：其它核酸

来源：无

生物名称：无

株名：无

序列特征：MP52成熟型的上游PCR引物

序列：

ATAATGCCAC TAGCAACTCG TCAGGGC    27

序列号：3

序列长度：26

序列类型：核酸

链型：单链

拓朴学：线性

序列的种类：其它核酸

来源：无

生物名称：无

株名：无

序列特征：MP52成熟型的下游PCR引物

序列：

CGTCGACTAC CTGCAGCCAC ACGACT    26

Claims (24)

1.具有119个氨基酸的MP52蛋白质的制剂，所述蛋白质由序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成，以及所述制剂不含当中N-末端具有附加丙氨酸或N-末端具有附加甲硫氨酸和丙氨酸的SEQ ID NO：1所示的蛋白质。

2.权利要求1的制剂，其中所述具有119个氨基酸的MP52蛋白质是同源二聚体蛋白质。

3.一种用于治疗软骨和骨疾病的药物组合物，包括治疗有效量的权利要求2的制剂和药用载体。

4.权利要求3的药物组合物，其中软骨和骨疾病是骨质疏松症。

5.权利要求3的药物组合物，其中软骨和骨疾病是骨关节炎或关节骨炎。

6.权利要求3的药物组合物，其中软骨和骨疾病是骨折和骨缺损。

7.权利要求3的药物组合物，其中软骨和骨疾病是牙根和牙槽缺损。

8.权利要求3的药物组合物，其中软骨和骨疾病是指软骨缺损或损伤。

9.权利要求8的药物组合物，其中软骨和骨疾病是指关节半月板损伤。

10.权利要求3的药物组合物，其中软骨和骨疾病是先天性的。

11.权利要求10的药物组合物，其中软骨和骨疾病是软骨错位，软骨发育不全，软骨成长不全，裂腭和骨发育不全。

12.权利要求3的药物组合物，在骨移植或诱导骨形成有利时使用。

13.权利要求3的药物组合物，在软骨移植或诱导新的软骨形成有利时使用。

14.权利要求3的药物组合物，其中该药物组合物被配制成适于全身或局部用药的形式。

15.权利要求3的药物组合物，其中该药物组合物被配制成注射制剂。

16.权利要求3的药物组合物，其中药物载体是天然或人工骨。

17.权利要求16的药物组合物，其中药物载体是金属、陶瓷、玻璃、胶原和/或羟基磷灰石。

18.一种有选择性地制备权利要求1的所述的由SEQ ID NO：1所示的119个氨基酸组成的蛋白质的方法，包括培养质粒转化的大肠杆菌，其中编码甲硫氨酸的密码子连接编码序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的DNA序列，所述氨基酸序列由119个氨基酸残基组成且不包括MP52的N末端丙氨酸，以及使用所得的引入有质粒的大肠杆菌来进行表达。

19.一种制备由SEQ ID NO：1所示的119个氨基酸组成的蛋白质的蛋白质二聚体的方法，包括步骤：

构建质粒，该质粒含有编码序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的DNA，该氨基酸序列在N末端带有一个甲硫氨酸；

将质粒导入到大肠杆菌中进行转化；

溶解由培养所述大肠杆菌得到的包函体；

从溶解的溶液中纯化单体蛋白；

将单体蛋白再折叠成二聚体蛋白并将其纯化。

20.权利要求2的蛋白质制剂在制备用于治疗软骨和骨疾病的药物中的应用。

21.权利要求20的应用，其中所述疾病是骨质疏松症。

22.权利要求21的应用，其中所述疾病是骨关节炎或关节骨炎。

23.权利要求22的应用，其中所述疾病是骨折和骨缺损。

24.权利要求23的应用，其中所述疾病是牙根和牙槽缺损。

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