JP3527760B2 - 新規骨形成誘導蛋白質、それをコードするｄｎａ及び該蛋白質の製造方法並びにそれを有効成分とする骨形成誘導剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な骨形成誘導蛋白
質、それをコードするＤＮＡ及び該蛋白質の製造方法並
びに該蛋白質を有効成分とする骨形成誘導剤に関し、更
に詳しくは、脊椎動物の骨由来の新規なＤＮＡの発現に
より得られる新規な骨形成誘導蛋白質及び該ＤＮＡを組
み込んだ形質転換細胞の培養により該蛋白質を製造する
方法並びに該蛋白質を有効成分とする骨粗鬆症、骨欠損
症、例えば、歯槽膿漏による顎骨の部分欠損及び骨折の
治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、高齢者の増加に伴い骨粗鬆症が社
会的、医学的に注目されている。これまで、この骨粗鬆
症の治療薬として、カルシトニン、女性ホルモン、活性
ビタミンＤ₃ 、蛋白同化ステロイド等が用いられてき
た。しかしながら、これら治療薬は、骨溶解を抑制する
に過ぎず、骨量の増加を図るという根本的な治療を達成
するものではない。また、例えば、ビタミンＤ₃ を用い
た場合には、高カルシウム尿症といった副作用も問題と
なる。一方、歯槽膿漏による歯の脱落は、顎骨の部分欠
損を原因とするものであり、特に高齢者において起こり
易く、かつ、骨の欠損を伴うという点で骨粗鬆症と共通
するものであるが、これに対して有効な治療法はない。

【０００３】これら疾患はいずれも骨欠損によるものな
ので、欠損部位の骨形成を促進できれば、根本的な治療
が可能になる。また、骨折の治療においても、骨形成の
促進は、骨折部位の癒合を促進して骨折の加療期間を短
縮し、リハビリテーション期間の短縮、更には医療費の
低減という利点をもたらす。このような骨形成を促進す
る物質として、ウリスト(Urist）らは、0.６Ｎ塩酸で脱
灰した骨基質を用いた異所性骨誘導実験系を確立し〔Sc
ience, 150, 893-899 (1965)〕、その後、この骨誘導現
象は石灰化組織のコラーゲンに固く結合した蛋白質によ
って引き起こされることを実験的に示し、それを骨形態
形成蛋白質（ＢＭＰ）と命名した。以来、骨肉腫あるい
は脱灰骨や脱灰歯牙基質から、４Ｍ塩酸グアニジンや６
Ｍ尿素を溶媒として抽出し、イオン交換やゲル濾過等の
精製方法を用いてＢＭＰを精製した例が報告されている
〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,,85, 9484-9488 (1988)：
J.Bio.Chem., 264, 13377-13380 (1989)：J.Bio.Chem.,
265, 13198-13205 (1990)〕。また、かかるＢＭＰをコ
ードするＤＮＡ配列も報告されており、それらは、例え
ば、特表平２−５００２４１号、特表平３−５０３６４
９号及び特開平３−１９５４９５号公報に記載されてい
る。しかしながら、これら精製されまたはコードされた
ＢＭＰはいずれも骨誘導活性が低く、上記骨欠損症の治
療剤として用いるには、より活性の高い骨形成誘導蛋白
質が望まれているのである。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、高い骨誘導
活性を有する骨形成誘導蛋白質、それをコードするＤＮ
Ａ及び該骨形成誘導蛋白質を製造する方法並びにそれを
有効成分とする骨形成誘導剤を提供することを目的とす
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究した結果、脊椎動物の骨の中に極
めて高活性な骨形成誘導蛋白質をコードするｍＲＮＡが
存在することを見出し、本発明を完成するに至った。即
ち、本発明は、配列表の配列番号１のアミノ酸１〜１１
０で示されるアミノ酸配列またはそれと類似の配列を含
む蛋白質（以下、ＢＩＰと略称することがある）の発明
である。この配列番号１のアミノ酸−３６８〜＋１１０
の蛋白質は前駆体蛋白質であり、このうちアミノ酸１〜
１１０で示されるアミノ酸配列の蛋白質は成熟蛋白質の
１つである。

【０００６】配列番号１のアミノ酸１〜１１０で示され
るアミノ酸配列と類似の配列とは、該アミノ酸配列と実
質的に相同なアミノ酸配列であって、かつ、その蛋白質
が配列番号１のアミノ酸１〜１１０の蛋白質と同様な骨
形成誘導能を有するものを意味する。かかるアミノ酸配
列は、配列番号１のアミノ酸１〜１１０で示されるアミ
ノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸が異なった
ものである。少なくとも１つのアミノ酸が異なる態様と
しては、少なくとも１つのアミノ酸が置換している場
合、少なくとも１つの新たなアミノ酸が挿入されている
場合、少なくとも１つのアミノ酸が欠損している場合が
ある。なお、これら類似のアミノ酸配列からなる蛋白質
も成熟蛋白質である。かかる配列番号１のアミノ酸１〜
１１０で示されるアミノ酸配列と類似の配列の例として
は、配列番号３のアミノ酸１〜１１０で示されるアミノ
酸配列を挙げることができる。これらアミノ酸配列の間
では２つのアミノ酸の種類が相違している。

【０００７】また、これらアミノ酸配列を含む蛋白質と
は、これら成熟蛋白質の骨形成誘導能を維持する範囲
で、成熟蛋白質の両端のいずれかのペプチド鎖が少なく
とも１アミノ酸延長された蛋白質を意味しており、例え
ば、配列番号１のアミノ酸−３６８〜＋１１０の前駆体
蛋白質のほか、かかる前駆体蛋白質の前駆体領域が他の
配列で置換されたもの、及びアミノ酸１より上流で前駆
体蛋白質から切り出された蛋白質、例えば、配列番号１
のアミノ酸−１や−２で前駆体蛋白質から切り出された
成熟蛋白質を挙げることができる。かかる本発明の蛋白
質は、上記の如きアミノ酸配列を有する限り蛋白質の他
の構造的特徴を問わない。つまり、本発明の蛋白質を含
む蛋白質の二量体、グルコシル化部位における糖鎖の修
飾の有無等は問わず、かかる蛋白質及びそれらの混合物
も本発明の蛋白質に含まれる。

【０００８】本発明は、また、本発明の骨形成誘導蛋白
質をコードするＤＮＡの発明である。このようなＤＮＡ
には、配列表の配列番号１の塩基１１９１〜１５２０で
示される塩基配列を含むＤＮＡのほか、それと類似のＤ
ＮＡ、及び塩基配列の類似性は低いものの本発明の骨形
成誘導蛋白質をコードできるＤＮＡがある。配列番号１
の塩基１１９１〜１５２０で示される塩基配列を含むＤ
ＮＡとしては、例えば、配列番号１の塩基８７〜１５２
０示される塩基配列のＤＮＡがある。この塩基配列は、
配列番号１のアミノ酸−３６８〜＋１１０の前駆体蛋白
質をコードする配列である。ここで、類似のＤＮＡと
は、配列番号１の塩基１１９１〜１５２０で示される塩
基配列と実質的に相同な塩基配列を含むＤＮＡを意味す
る。かかるＤＮＡ配列は、配列番号１の塩基１１９１〜
１５２０に相当する部分の少なくとも１つのコドンが異
なったものである。少なくとも１つのコドンが異なる態
様としては、少なくとも１つのコドンが置換している場
合、少なくとも１つの新たなコドンが挿入されている場
合、少なくとも１つのコドンが欠損している場合があ
る。

【０００９】また、塩基配列の類似性は低いものの本発
明の蛋白質をコードできるＤＮＡとは、配列番号１の塩
基１１９１〜１５２０の配列中のかなりの数のコドンが
相違しているが、該相違するコドンが同一のアミノ酸を
コードできるため、結果として本発明の骨形成誘導蛋白
質をコードすることができるＤＮＡをいう。かかるＤＮ
Ａは、本発明の蛋白質の配列の各アミノ酸をコードする
各コドンを適宜組み合わせて設計することができる。な
お、上記のＤＮＡのうち本発明の骨形成誘導蛋白質の前
駆体領域をコードする塩基配列を適宜変換したＤＮＡも
本発明の骨形成誘導蛋白質の成熟蛋白質をコードするも
のであり、かかるＤＮＡも本発明の範囲に属することは
言うまでもない。

【００１０】以下に、本発明の骨形成誘導蛋白質及びそ
れをコードするＤＮＡの調製方法を詳しく説明する。本
発明の骨形成誘導蛋白質をコードするＤＮＡは次のよう
にして得られる。まず、脊椎動物の組織から本発明のｃ
ＤＮＡの鋳型であるｍＲＮＡを抽出、単離する。脊椎動
物としては、哺乳類を挙げることができ、具体的には、
ヒト、ラット及びウシを挙げることができる。特にヒト
及び新生ラットが好ましい。使用する組織は特に限定さ
れないが、大腿骨、大腿骨頭、頭蓋冠等を挙げることが
でき、特にヒトの大腿骨骨頭及び新生ラットの頭蓋冠若
しくは大腿骨が好ましい。ｍＲＮＡの抽出及び単離は常
法で行うことができる。ｍＲＮＡを単離したら、これか
らｃＤＮＡライブラリーを作成する。ｍＲＮＡからのｃ
ＤＮＡライブラリーの作成も常法で行うことができる。

【００１１】一方、このｃＤＮＡライブラリー中に存在
する目的のクローンを検出するためのＤＮＡプローブを
調製する。このＤＮＡプローブの基になるオリゴヌクレ
オチドプライマーは、公知の骨形成誘導蛋白質をコード
するｃＤＮＡを参考にして合成することができる。この
ようにして得られたプローブをラベル化し、上記のｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ハ
イブリダイゼーションしたクローンが得られる。このプ
ローブでは、本発明のｃＤＮＡに対応するクローンだけ
がハイブリダイゼーションするのではなく、公知のクロ
ーンもハイブリダイゼーションするが、本発明のクロー
ンは、相対的にハイブリダイゼーションの程度が低く、
公知のクローンとはサザーンのハイブリダイゼーション
によるシグナルの強さによって分離することができる。
一旦、本発明のｃＤＮＡが得られれば、その決定された
塩基配列からｃＤＮＡを合成することができ、もはやク
ローン化することを要さない。

【００１２】本発明の骨形成誘導蛋白質は、このｃＤＮ
Ａを発現ベクターに組み込み、該発現ベクターを用いて
宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションし、こ
れを増殖して、細胞内または培地中に分泌させることに
よって得られるほか、例えば、カゼインプロモーター制
御下に該ＤＮＡを連結して得られたＤＮＡを用いて作成
したトランスジェニック動物、例えば、ヤギやウシの乳
汁中に分泌させることによっても得られる。

【００１３】前者の方法を採用する場合に使用できる発
現ベクターとしては、プラスミド、ウィルス、ファー
ジ、及び、本発明のｃＤＮＡを組み込むことが可能でか
つ宿主細胞に導入可能なＤＮＡを挙げることができる。
発現ベクターは、転写プロモーター、転写を制御するエ
ンハンサー或いはオペレーター配列、適切なリボソーム
結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終止を制
御する配列が含まれる必要があり、場合によっては、宿
主細胞内での発現用ベクターが複製を行うために必要な
ＤＮＡ配列、或いはジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）
の阻害剤であるメトトレキセート存在下で導入ＤＮＡの
増幅を可能ならしめるｄｈｆｒ遺伝子とその発現に必要
な制御配列が必要である。具体的には、動物細胞を用い
て発現する場合には、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６（Mol. C
ell. Biol.８ 466, 1988）、ｐＣＤＭ８〔シード（B.Se
ed）Nature 329, 840, 1987〕、ｐＭＡＭ neo〔リー
(F.lee）ら、Nature 294, 228, 1981〕、ＢＣＭＧ Neo
〔カラスヤマら、Eur. J. Immuno. 18, 97, 1988〕、ｐ
ＳＶ２ｄｈｆｒ（リーら、前記文献）等のベクターを挙
げることができ、このうち、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６及
びｐＳＶ２ｄｈｆｒが好ましい。また、昆虫を宿主とし
た場合には、ｐＡｃ３７３〔スミス(G.E.Smith）ら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 8404, 1985〕、酵母の
場合には、ｐＡＭ８０（ミヤノハラら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA. 80, 1, 1983 ）、大腸菌の場合には、ｐ
Ｔｒｃ９９Ａ〔アマン(E.Amann）ら、Gene 69, 301, 1
988 〕等のベクターを挙げることができる。なお、発現
ベクターは必要に応じて改変して用いることができる。

【００１４】また、本発明の骨形成誘導蛋白質を発現さ
せるのに適切な宿主細胞には、例えば、ＣＯＳ−１細
胞、Verots細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＣ１２７細胞、ヒ
ト２９３細胞、シリアンハムスターＢＨＫ細胞、ヒトＮ
ａｍａｌｗａ細胞、サルＶｏｒｏ細胞等を挙げることが
でき、好ましい宿主細胞はＣＯＳ−１細胞、ヒト２９３
細胞、シリアンハムスターＢＨＫ細胞である。宿主細胞
を形質転換またはトランスフェクションする際に使用す
る培地は、使用した宿主細胞の種類によって異なるが、
例えば、牛胎児血清を含むＤＭＥＭ、αＭＥＭ、Ｈａｍ
１２、ＲＰＭＩ−１６４０等を用いることができる。宿
主細胞がＣＯＳ−１細胞である場合にはＤＭＥＭが好ま
しく、ＣＨＯ細胞である場合にはαＭＥＭが好ましい。

【００１５】好ましい発現系と宿主細胞の組み合わせ
は、例えば、一過性発現ではｐｃＤＬ−ＳＲα２９６ベ
クターとＣＯＳ−１細胞であり、安定発現ではｐＳＶ２
ｄｈｆｒベクターとシリアンハムスターＢＨＫ細胞であ
る。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションし
た後は、蛋白質が発現される条件で増殖させる。蛋白質
が培地中に分泌される場合には細胞を除去して培地から
直接精製することができる。蛋白質が細胞内に蓄積する
場合には、細胞溶解物から単離される。

【００１６】本発明の骨形成誘導蛋白質は、宿主細胞内
で活性を有さない前駆体として生合成された後、プロセ
スサイトにおいてプロテアーゼにより切断されることに
より活性型の成熟体に変換されると考えられる。本発明
の骨形成誘導蛋白質を組み換えＤＮＡ技術により動物細
胞において高発現する場合、このプロセスサイトのアミ
ノ酸配列がプロテアーゼにより効率よく切断されること
が望ましい。前駆体構造を有する既知の蛋白質のプロセ
スサイトのアミノ酸配列は、Arg-Ｘ-Arg/Lys-Arg（Ｘは
必須アミノ酸を表す）が最も多いことが知られており
（J. Biol. Chem.267, 16335-16340 (1992)）、この配
列はコンセンサス配列として提唱された。この配列で
は、最後のArg のＣ末端で前駆体は切断される。また、
この配列の場合、プロテアーゼによるプロセシングが効
率よく起こる。

【００１７】一方、本発明のヒト骨形成誘導蛋白質（ｈ
ＢＩＰ）の前駆体のプロセスサイトのアミノ酸配列は、
配列表の配列番号１のアミノ酸−４〜−１であるAla-Ar
g-Arg-Lys と考えられ、この配列は上記のコンセンサス
配列とは異なっている。従って、本発明のヒト骨形成誘
導蛋白質を効率よく分泌生産させるためにはプロセスサ
イトのアミノ酸配列を上記のコンセンサス配列と一致さ
せることが好ましい。そのような方法として、例えば、
プロセスサイトに対応するｃＤＮＡ領域（配列表の配列
番号１の塩基１１７９〜１１９０）を目的のアミノ酸配
列に対応するように設計した合成ＤＮＡに置換すること
により、コンセンサス配列に変換することができる。例
えば、コンセンサス配列と一致するヒトＢＭＰ−２（特
表平２−５００２４１号）のプロセス配列であるArg-Gl
u-Lys-Arg 或いはヒトアクチビンＡ（D. Huylebroeck e
t al., Mol. Endocrynol. 4, 1153 (1990)) のプロセス
配列であるArg-Arg-Arg-Arg はコンセンサス配列と一致
しており、これらのアミノ酸配列をコードする合成ＤＮ
Ａを用いて本発明のヒト骨形成誘導蛋白質が本来持って
いるプロセス配列をそれぞれのコンセンサス配列に変換
できる。このような合成ＤＮＡで置換されたｃＤＮＡを
用いて、適当な宿主細胞において安定生産株を構築すれ
ばヒト骨形成誘導蛋白質を効率良く分泌生産することが
できる。安定生産株の構築に適した宿主細胞としては、
上記したもののうち、ヒト２９３細胞、シリアンハムス
ターＢＨＫ細胞、ヒトＮａｍａｌｗａ細胞、サルＶｅｒ
ｏ細胞等が挙げられる。

【００１８】本発明は、また、このようにして得られた
骨形成誘導蛋白質またはその活性断片を有効成分とする
骨形成誘導剤の発明である。本発明の蛋白質は、その優
れた骨形成誘導活性から、骨粗鬆症、骨欠損症、例え
ば、歯槽膿漏等の骨欠損を伴う疾患及び骨折の治療剤と
して有用なものである。本発明の治療剤の投与は、例え
ば、経口、注射、骨損傷部への移植等、種々の方法で行
うことができ、また、それぞれに適した製剤、例えば、
散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、内用液剤、乳化剤、
懸濁剤等の経口投与剤、注射剤及び移植に適した製剤に
することができる。特に、注射剤は骨損傷部への到達に
適した剤形で行うことができ、骨損傷部へ移植する場合
にはマトリックスとともに行うことができる。かかる製
剤は、本発明の蛋白質は単独に、または本発明の蛋白質
を各剤形に応じた薬学的、製剤学的に許容される添加剤
との混合物として投与してもよい。これら製剤は適当な
溶剤中に溶解、乳化または懸濁する等して、常法により
行うことができる。

【００１９】散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等に加え
る添加剤としては、賦形剤（例えば、乳糖、ブドウ糖、
Ｄ‐マンニトール、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシ
ウム、カオリン等）、結合剤（例えば、デンプン糊液、
ゼラチン溶液、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロ
キシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリド
ン、エタノール等）、崩壊剤（例えば、デンプン、ゼラ
チン末、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチ
ルセルロースカルシウム塩等）、滑沢剤（例えば、ステ
アリン酸マグネシウム、タルク等）、コーティング剤
（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アセ
チルセルロース、白糖、酸化チタン等）があり、その他
必要に応じて着色剤、矯味剤等が加えられる。また、内
用液剤に加えられる添加剤としては、保存剤（例えば、
安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸
ナトリウム等）、懸濁化剤または乳化剤（例えば、アラ
ビアゴム、トラガント、カルボキシメチルセルロースナ
トリウム塩、メチルセルロース、卵黄、界面活性剤
等）、甘味剤（例えば、白糖、単シロップ、クエン酸
等）があり、その他必要に応じて着色剤、安定剤等が加
えられ、これらに使用される溶剤は、主として精製水で
あるが、エタノール、グリセリン、プロピレングリコー
ル等も使用される。

【００２０】注射剤に使用する溶剤としては、蒸留水、
注射用水、非水溶剤（例えば、エタノール、グリセリ
ン、プロピレングリコール、マクロゴール等）があり、
また、注射剤に使用する添加剤には、緩衝剤（例えば、
リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リ
ン酸ナトリウム等）、等張剤（例えば、ブドウ糖、塩化
ナトリウム等）、保存剤（例えば、フェノール、チメロ
サール、パラオキシ安息香酸エステル等）、安定剤（例
えば、亜硫酸水素ナトリウム等）があり、その他必要に
応じて、無痛化剤、溶解補助剤等が加えられる。また、
骨損傷部へ移植する場合に、本発明の蛋白質と共に移植
されるマトリックスとしては、生物吸収性で化学的なも
のとして、例えば、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、
硫酸カルシウムなどがあり、生物吸収性で生物学的なも
のとして、例えば、Ｉ型コラーゲンや骨などがある。ま
た、生物非吸収性のものとして、例えば、セラミックス
やチタンなどがある。これらは組み合わせて使用するこ
とができる。なお、骨粗鬆症の治療には、主として注射
剤が適用され、歯槽膿漏及び骨折の治療には、経口剤、
注射剤以外に上記の如く骨損傷部への移植が行われる。

【００２１】本発明の治療剤の投与量は、その投与方法
及び製剤の種類のほか、疾患の種類、患者の年令、性別
等によって大きく変動するが、一般に、本発明の蛋白質
またはその活性断片の量が成人で0.０１〜１００ｍｇ／
日である。また、コラーゲン等との混合剤として患部に
移植する場合の本発明の蛋白質またはその活性断片とコ
ラーゲン等との混合比は、４×１０^-6〜４×１０^-1重量
％、好ましくは４×１０^-6〜４×１０^-2重量％、更に好
ましくは４×１０^-5〜４×１０^-3重量％とするのがよ
い。移植する混合剤の量は、疾患の程度により、医師に
より適宜決定される。

【００２２】

【発明の効果】本発明により、歯槽膿漏による歯の脱落
及び骨粗鬆症の予防及び根本的治療が可能となり、ま
た、骨折の加療期間を短縮することができる。以下に実
施例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらの記
載によって限定されるものではない。

【００２３】

【実施例】実施例１ ヒト骨形成誘導蛋白質（ｈＢＩＰ）をコード
するｃＤＮＡの単離プローブの調製 下記のプライマーを自動ＤＮＡ合成機で合成し、これら
を用いて下記反応条件下でＤＮＡ断片をヒト胎盤染色体
ＤＮＡよりＰＣＲ法で増幅した。 プライマー１ 5'‐ＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＣＡＴＧＣ
ＴＡＣＣ‐3' プライマー２ 5'‐ＴＣＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＡＣ
ＴＣＴＡ‐3' 反応液：１０mMトリス−塩酸（ｐＨ8.３）、５０mMＫＣ
ｌ、1.５mMＭｇＣｌ₂ 、0.００１％ゼラチン、２００μ
M ｄＡＴＰ、２００μM ｄＣＴＰ、２００μM ｄＧＴ
Ｐ、２００μM ｄＴＴＰ、2.５ユニットAmpliTaq（Perk
in Elmer Cetus社製）、２５０nMプライマー１、２５０
nMプライマー２、１μg ヒト胎盤染色体ＤＮＡ／１００
μl 条件：９４℃で１分間、３７℃で２分間及び７２℃で３
分間を１サイクルとして２５サイクル行った。

【００２４】反応終了後、反応液をアガロース電気泳動
にかけ、約１８０ｂｐのＤＮＡ断片をガラス吸着法にて
回収した。この断片にＥｃｏＲＩアダプター（ファルマ
シア社製）を常法に従いＴ４リガーゼで結合後、同様に
してこれをプラスミドBlueScriptIISK＋〔ストラタジェ
ン（Stratagene）社製〕の制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位
に連結した。この反応液を用いて、イノウエら（Gene,
96, 23. 1990）の方法にて調製した大腸菌（E.coli JM1
09）のコンピテントセルを形質転換した。得られた形質
転換株をＬＢ培地で培養して回収した菌体よりアルカリ
・ＳＤＳ法〔バーンボイム（Birnboim）ら、Nucleic Ac
ids Res.,7, 1513. 1979〕を使用して、プラスミドＤＮ
Ａを単離後、混在しているＲＮＡを RNaseＡ処理ＤＥ除
き、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）沈澱及びフェノ
ール抽出により除蛋白し、エタノール沈澱にてプラスミ
ドＤＮＡを調製した。こうして調製したプラスミドＤＮ
Ａの塩基配列の決定は、ハットリら（Analytical Bioch
emistry 152, 232.1986）の方法でＤＮＡを変性後、Ｔ
７ＤＮＡポリメラーゼを用いたダイデオキシ法〔サンガ
ー（Sanger）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,74, 54
63. 1977〕で行った。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を
配列表２に示した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで消化後、１％アガロース電気泳動しガラス吸
着法にて回収した約１８０ｂｐの断片をプローブとし
た。

【００２５】ヒト骨組織のｃＤＮＡライブラリーの調製 ヒトの大腿骨頭４２ｇより酸グアニジンチオシアネート
・フェノール・クロロホルム抽出法（Analytical Bioch
emistry 162, 156. 1987）にて、トータルＲＮＡを1.９
ｍｇ調製した。このＲＮＡ1.３ｍｇからオリゴｄＴラテ
ックス（日本ロッシュ社製）によりポリ（Ａ）ＲＮＡを
抽出し、このポリ（Ａ）ＲＮＡ５μｇから、グブラー
（Gubler）、ホフマン(Hoffman）の方法に従って二本鎖
ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡにＥｃｏＲＩアダプ
ターをＴ４リガーゼで結合した後１％アガロース電気泳
動にかけ、２〜５ｋｂの画分をアガロースゲルより抽出
した。このｃＤＮＡをラムダファージλｇｔ１０アーム
〔マーレイ（Murray）ら、Mol. gen. Genet.,150, 53.
1977〕〔ベセスダ（Bethesda）研究所製〕の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ認識部位に結合後、インビトロ・パッケージン
グ〔コリンス(Collins）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA.,71, 4242. 1978〕を行い、ｃＤＮＡライブラリーを
作成した。

【００２６】ｃＤＮＡのクローニング 得られたライブラリーに含まれる組み換え体ファージを
大腸菌Ｃ６００ｆｈｌ（DNA cloning,１, 56, 1985）に
感染させた。得られた約1,００0,０００個のプラークを
ニトロセルロースフィルターに固定した〔ベントン（Be
nton）ら、Science 196, 180. 1977〕。このフィルター
を３７℃でハイブリダイゼーション溶液（２０％ホルム
アミド、６×ＳＳＰＥ、0.１％ＳＤＳ、１００μｇ／ml
サケ精子ＤＮＡ）中で２０時間プレハイブリダイゼーシ
ョンし、その後、マルチプライムラベリングキット〔ア
マシャム（Amersham）社製〕により〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴ
Ｐで放射ラベルした上記プローブＤＮＡを用いて、４２
℃で上記ハイブリダイゼーション溶液中でハイブリダイ
ゼーションを行った。次いで、このフィルターを２×Ｓ
ＳＣ、0.１％ＳＤＳ溶液中、５０℃で洗浄後、オートラ
ジオグラフィーにてポジティブクローンを１６クローン
得た。得られたクローンを常法に従って純化しそのＤＮ
Ａを調製した。これら組み換えファージＤＮＡに挿入さ
れたＤＮＡ断片をサザーン（Southern）の方法（J. Mo
l. Biol., 98, 503. 1975）で、上記プローブによるハ
イブリダイゼーションにて確認した。これらのクローン
をＨＥ２４、２５、２７と命名した。いずれも同じ塩基
配列であった。

【００２７】ｃＤＮＡの塩基配列の決定 得られた組み換えファージＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで
消化後アガロース電気泳動に付し、ガラス吸着法で精製
したｃＤＮＡ断片をプラスミドBlueScriptIISK＋のＮｏ
ｔＩ部位に挿入しサブクローン化した。ＨＥ２４を含む
大腸菌は、１９９２年７月３日に工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３０
４５）。このプラスミドＤＮＡを用いてダイデオキシ法
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463. 1977 ）に
従って、ｃＤＮＡの部分塩基配列を決定した。このｃＤ
ＮＡの塩基配列及びこれによってコードされるアミノ酸
配列を配列表の配列番号１に示した。この結果から、ヒ
ト骨形成誘導蛋白質は塩基８７から１５２０にコードさ
れている４７８残基のアミノ酸からなることがわかる。
即ち、この蛋白質は分泌シグナルを含む４７８残基の前
駆体蛋白質として合成され、分泌された後は更にアミノ
酸−２、−１或いは１で切断され、１１２、１１１或い
は１１０残基のアミノ酸よりなる成熟蛋白質が作られ
る。

【００２８】実施例２ ラット骨形成誘導蛋白質（ｒＢ
ＩＰ）をコードするｃＤＮＡの単離ラット骨組織のｃＤＮＡライブラリーの調製 誕生直後の新生ラットの大腿骨２ｇより酸グアニジンチ
オシアネート・フェノール・クロロホルム抽出法（Anal
ytical Biochemistry 162, 156. 1987）にて、トータル
ＲＮＡ5.８ｍｇを調製した。このトータルＲＮＡ２ｍｇ
からオリゴｄＴラテックス（日本ロッシュ社製）により
ポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出し、このポリ（Ａ）ＲＮＡ５μ
ｇから、グブラー（Gubler）、ホフマン(Hoffman）の方
法に従って二本鎖ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡに
ＥｃｏＲＩアダプターをＴ４リガーゼで結合した後１％
アガロース電気泳動にかけ、1.２〜５ｋｂの画分をアガ
ロースゲルより抽出した。このｃＤＮＡをラムダファー
ジλｇｔ１０アーム〔マーレイ（Murray）ら、Mol. ge
n. Genet.,150, 53. 1977〕〔ベセスダ（Bethesda）研
究所製〕の制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位に結合後、イン
ビトロ・パッケージング〔コリンス(Collins）ら、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA.,71, 4242. 1978〕を行い、
ｃＤＮＡライブラリーを作成した。

【００２９】ｃＤＮＡのクローニング 得られたライブラリーに含まれる組み換え体ファージを
大腸菌Ｃ６００ｆｈｌ（DNA １, 56, 1985）に感染させ
た。得られた約1,００0,０００個のプラークをニトロセ
ルロースフィルターに固定した〔ベントン（Benton）
ら、Science 196,180. 1977〕。このフィルターをハイ
ブリダイゼーション溶液（２０％ホルムアミド、６×Ｓ
ＳＰＥ、５×デンハルツ、0.５％ＳＤＳ、１００μｇ／
mlサケ精子ＤＮＡ）中で３７℃でプレハイブリダイゼー
ションし、その後、マルチプライムラベリングキット
（アマシャム社製）により〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰで放射
ラベルした実施例１で得たプローブＤＮＡを用いて、４
２℃で上記ハイブリダイゼーション溶液中でハイブリダ
イゼーションを行った。次いで、このフィルターを２×
ＳＳＣ、0.１％ＳＤＳ溶液中、５０℃で洗浄後、オート
ラジオグラフィーにてポジティブクローンを２４クロー
ン得た。得られたクローンを常法に従って純化しそのＤ
ＮＡを調製した。これら組み換えファージＤＮＡに挿入
されたＤＮＡ断片をサザーンの方法（J. Mol. Biol., 9
8, 503. 1975）で、上記プローブによるハイブリダイゼ
ーションにて確認した。これらのクローンをＲＢ１２、
４５、ＲＣ２と命名した。いずれも同じ塩基配列であっ
た。

【００３０】ｃＤＮＡの塩基配列の決定 得られた組み換えファージＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで
消化後アガロース電気泳動に付し、ガラス吸着法で精製
したｃＤＮＡ断片をプラスミドBlueScriptIISK＋のＮｏ
ｔＩ部位に挿入しサブクローン化した。ＲＢ４５を有す
るプラスミドＤＮＡを含む大腸菌は、１９９２年７月３
日に工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した（受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３０４６）。このプラスミドＤＮ
Ａを用いてダイデオキシ法（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA., 74,5, 463. 1977）に従って、ｃＤＮＡの塩基配列
を決定した。このｃＤＮＡの塩基配列及びこれによって
コードされるアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示し
た。この結果から、ラット骨形成誘導蛋白質は配列番号
３の塩基６０から１４８７にコードされている４７６残
基のアミノ酸からなることがわかる。この蛋白質は更に
プロセスを受けて塩基１１５２、１１５５或いは１１５
８〜１４８７の間にコードされている１１２、１１１或
いは１１０残基からなる成熟蛋白質が作られる。

【００３１】実施例３ ＣＯＳ−１細胞におけるヒト骨
形成誘導蛋白質の発現 本発明のヒト骨形成誘導蛋白質が骨形成活性を有するこ
とを確認するために、実施例１で得られたｃＤＮＡを一
過性発現ベクターに連結し、これをＣＯＳ−１細胞（Gl
uzman: Cell, 23, 175. 1981）に導入・発現させ、培養
上清中の生成物の活性を測定した。発現ベクターの構築 一過性発現ベクターには、武部らによって報告されたｐ
ｃＤＬ−ＳＲα２９６〔Mol. Cell. Biol. 8(1) 466,19
88〕を改変したｐｃＤＬ−ＳＲＤを用いた。即ち、ベク
ターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６を制限酵素ＫｐｎＩ、Ｐｓ
ｔＩで消化後、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて平滑末端
とし、ＥｃｏＲＩリンカーを挿入したものである。ま
ず、本発明のヒト骨形成誘導蛋白質をコードするｃＤＮ
Ａを図１に示す方法で蛋白質の非コード領域の除去を行
った。即ち、5'側の非コード領域を除去するために、Ｈ
Ｅ２４を制限酵素ＮｃｏＩで消化しＤＮＡポリメラーゼ
Ｉをもちいて平滑末端とした後、制限酵素ＳａｌＩで消
化し、開始コドンを含む5'側のフラグメントであるＮｃ
ｏ△−ＳａｌＩフラグメントを単離した。一方、ＨＥ２
４から制限酵素ＳａｌＩ及びＫｐｎＩで消化して得たＳ
ａｌ−Ｋｐｎフラグメントを単離した。上記の２つのＤ
ＮＡフラグメントをBlueScriptIISK＋を制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII で消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩをもちいて平滑
末端とした後、制限酵素ＫｐｎＩで消化したベクターに
連結した。得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＶ及
びＫｐｎＩで消化し、ＥＶ−Ｋｐｎフラグメントを単離
した。次に、下に示すような本発明の蛋白質のＣ末端に
対応するｃＤＮＡ領域を増幅するための２種のＰＣＲ用
プライマー： Ｃ−１ 5'‐ＧＡＴＡＴＣＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＧＣＡ
ＣＡＧＧＴＧ‐3' Ｃ−２ 5'‐ＴＣＣＣＧＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧ
Ｔ‐3' を合成した。

【００３２】次いで、これらプライマーを用いて、ＨＥ
２４を鋳型にＰＣＲを下記反応条件で行ったのち、アガ
ロース電気泳動でＤＮＡを分離し、ガラス吸着法にて、
各所望のＤＮＡ断片を単離・精製した。 反応液：１０mMトリス−塩酸（ｐＨ8.３）、５０mMＫＣ
ｌ、1.５mMＭｇＣｌ₂ 、0.００１％ゼラチン、２００μ
M ｄＡＴＰ、２００μM ｄＣＴＰ、２００μM ｄＧＴ
Ｐ、２００μM ｄＴＴＰ、５ユニットAmpliTaq（Perkin
Elmer Cetus社製）、１μM プライマーＣ−１、１μM
プライマーＣ−２、５００ｐg ＨＥ２４プラスミドＤＮ
Ａ／５０μl 条件：９２℃で１分間、５０℃で２分間及び７２℃で３
分間を１サイクルとして３２サイクル

【００３３】こうして得られたＣ末端側のＤＮＡ・Ｋｐ
ｎＩ−ＥｃｏＲＶ（Ｋｐｎ−ＥＶ）フラグメントを単離
し、BlueScriptIISK＋の制限酵素認識部位ＥｃｏＲＶの
3'末端にｄＴＴＰをＴ−ベクターに連結し、実施例１と
同様にＤＮＡ塩基配列を決定した。得られたプラスミド
は、制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＶで消化してＫｐｎ
−ＥＶフラグメントを単離した。このフラグメントを上
記ＥＶ−Ｋｐｎフラグメント及びBlueScriptIISK＋を制
限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後、アルカリ性ホスファタ
ーゼ処理により脱リン酸化したものと連結して非コード
領域を除去したコード領域全長のｃＤＮＡを得た。この
ｃＤＮＡをBlueScriptIISK＋／ＥＶから制限酵素Ｅｃｏ
ＲＶで消化することによって単離し、前記のｐｃＤＬ−
ＳＲＤベクターのＥｃｏＲＩ認識部位を平滑末端とした
ところに連結して、ヒト骨形成誘導蛋白質発現ベクター
（ＳＲＤ−ｈＢＩＰ）を構築した。図２は、得られたプ
ラスミドの制限酵素地図である。

【００３４】ヒト骨形成誘導蛋白質発現ベクターのトラ
ンスフェクション及び発現 サムブルーク（Sambrook）らの方法（Molecular Clonin
g:Cold Spring HaborLaboratory Press. 16. 41. 198
9）に従い、得られたベクターでＣＯＳ−１細胞にトラ
ンスフェクションし、ヒト骨形成誘導蛋白質を発現させ
た。１０mlのＤＭＥＭ＋１０％牛胎児血清を培地とし
て、１００mm細胞培養用ディッシュに１×１０⁶ 個のＣ
ＯＳ−１細胞を播種し、５％ＣＯ₂ インキュベーター内
で３７℃で１８時間培養後、１０mlのリン酸緩衝生理食
塩水〔ＰＢＳ（−）〕で２回洗浄した。これに２μｇの
上記ベクターとＤＥＡＥデキストランとの混合溶液を添
加し、室温で１５分間静置後、１００μＭのクロロキン
を含む５mlのＤＭＥＭ＋１０％牛胎児血清を添加して、
３７℃で３時間３０分保温後に培地を除き、９００μl
の１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＤＭ
ＥＭ＋１０％牛胎児血清を加え、室温で２分間静置し
た。その後、ＰＢＳ（−）、ＤＭＥＭ＋１０％牛胎児血
清各５mlで１回洗浄し、ＤＭＥＭ＋１０％牛胎児血清を
１０ml加え、５％ＣＯ₂ インキュベーター内で３７℃で
２４時間培養した後、培地を除いて１０mlのＤＭＥＭ＋
２％牛胎児血清を添加し、５％ＣＯ₂ インキュベーター
内で３７℃で保温した。５日後、培地を回収し４℃で１
００００rpm の回転数で１０分間遠心分離し、上清を採
取した。

【００３５】この上清１４００mlに尿素及びトリス−塩
酸（ｐＨ7.０）を加えて、６Ｍ尿素５０mMトリス−塩酸
（ｐＨ7.０）となるように調整し、これを６Ｍ尿素／５
０mMトリス−塩酸（ｐＨ7.０）で予め平衡化したヘパリ
ン−セファロースカラム（２０ｍｌ，ファルマシア製）
に流した。吸着された蛋白質を同緩衝液で洗浄した後、
0.５Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液３０mlで溶出させ
た。セントリコンを用いた限外濾過により約５mlまで濃
縮した後、脱イオン水に対し透析を行い、更に凍結乾燥
を行い、１％デオキシコール酸ナトリウム／５０mMトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.０）で溶解した。これを同緩衝
液で予め平衡化したＣｏｎＡ−セファロースカラム（２
００μl 、ファルマシア製）に流し、同緩衝液で洗浄し
た後、0.５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシドを含む同緩衝
液１mlで溶出を行った。また、対照（モック）として、
ヒト骨形成誘導蛋白質をコードするｃＤＮＡを含まない
ｐｃＤＬ−ＳＲＤベクターだけを用いて上記と同様に処
理した。

【００３６】骨形成誘導活性の測定 サンパスらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80,
6591. 1983 ）に従って、上記のＣｏｎＡ吸着画分及び
非吸着画分の骨形成誘導活性を測定した。まず、ラット
脱灰骨から４Ｍグアニジン塩酸により、骨形成誘導活性
を除去したマトリックス残渣２５mgと前項で調製した蛋
白質試料とで共沈澱ペレットを作り、これを２１〜２８
日齢雄ＳＤラットの腹胸部皮下に移植した。次いで、１
２日後にペレットを取り出し、その中のアルカリ性ホス
ファターゼ活性及びカルシウム含量を測定した。対照と
してモック・トランスフェクション上清を用いて、ヘパ
リン−セファロースカラム、ＣｏｎＡ−セファロースカ
ラムにより同様の方法で精製を行った蛋白質試料につい
て骨形成誘導活性を測定した。その結果を表１に示し
た。

【００３７】

【表１】 表 １ ──────────────────────────────── 試 料 アルカリ性ホスファターゼ活性 カルシウム含量 ユニット／インプラント mg／インプラント ──────────────────────────────── ＣｏｎＡ吸着画分 ２7.５ 9.０ ＣｏｎＡ非吸着画分 0.７６ 0.２４ モックＣｏｎＡ吸着画分 2.９８ 0.０ ────────────────────────────────

【００３８】表１に示されるように、ヒト骨形成誘導蛋
白質を含むＣｏｎＡ吸着画分に、モックに比べ強い骨形
成誘導活性が検出された。このことから、本発明のヒト
骨形成誘導蛋白質は強い骨形成誘導活性を有する蛋白質
であることが明らかである。

【００３９】実施例４ ２９３Ｔ細胞におけるヒト骨形
成誘導蛋白質の発現 ヒト腎由来の２９３Ｔ細胞（J. Gen. Virology, 36, 59
-72 (1977)) において生産した本発明のヒト骨形成誘導
蛋白質が骨形成活性を有することを確認するために、実
施例３で構築した一過性発現ベクターを用い、これを２
９３Ｔ細胞に導入・発現させ、培養上清中の生成物の活
性を測定した。ヒト骨形成誘導蛋白質発現ベクターのトランスフェクシ
ョン及び発現 実施例３で構築した一過性発現ベクター（ＳＲＤ−ｈＢ
ＩＰ）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、ヒト
骨形成誘導蛋白質を発現させた。１０mlのＭＥＭ＋１０
％牛胎児血清を培地として、１００mm細胞培養用ディッ
シュに１×１０⁶ 個の２９３Ｔ細胞を播種し、５％ＣＯ
₂ インキュベーター内で３７℃で１８時間培養後、実施
例３で構築したＳＲＤ−ｈＢＩＰを用いて調製した２０
μｇのリン酸カルシウムの沈殿を加え、５％ＣＯ₂ イン
キュベーター内で保温した。１８時間培養後、培地を除
いて１０mlのＭＥＭ＋２％牛胎児血清を添加し、５％Ｃ
Ｏ₂ インキュベーター内で３７℃で保温した。３日後培
地を回収して４℃で１００００rpm の回転数で１０分間
遠心分離し、上清を採取した。また、対照（モック）と
して、上記と同様に２９３Ｔ細胞へｐｃＤＬ−ＳＲＤベ
クターのみをトランスフェクションして培養後、上清を
採取した。

【００４０】これら上清１４００mlに尿素及びトリス−
塩酸（ｐＨ7.０）を加えて、６Ｍ尿素５０mMトリス−塩
酸（ｐＨ7.０）となるように調整し、これを６Ｍ尿素／
５０mMトリス−塩酸（ｐＨ7.０）で予め平衡化したヘパ
リン−セファロースカラム（２０ml，ファルマシア製）
に流した。吸着された蛋白質を同緩衝液で洗浄した後、
0.５Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液３０mlで溶出させ
た。セントリコンを用いた限外濾過により約５mlまで濃
縮した後、脱イオン水に対し透析を行い、更に凍結乾燥
を行い、１％デオキシコール酸ナトリウム／５０mMトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.０）に溶解した。これを同緩衝
液で予め平衡化したＣｏｎＡ−セファロースカラム（２
００μl 、ファルマシア製）に流し、同緩衝液で洗浄し
た後、0.５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシドを含む同緩衝
液１mlで溶出を行った。

【００４１】骨形成誘導活性の測定 実施例３と同様にして、骨形成誘導活性を測定した。即
ち、マトリックス残渣２５mgと前項で調製した蛋白質試
料とで共沈澱ペレットを作り、これを２１〜２８日齢雄
ＳＤラットの腹胸部皮下に移植した。次いで、１２日後
にペレットを取り出し、その中のアルカリ性ホスファタ
ーゼ活性及びカルシウム含量を測定した。対照としてモ
ック・トランスフェクション上清を用いて、ヘパリン−
セファロースカラム、ＣｏｎＡ−セファロースカラムに
より同様の方法で精製を行った蛋白質試料について骨形
成誘導活性を測定した。その結果を表２に示した。

【００４２】

【表２】 表 ２ ──────────────────────────────── 試 料 アルカリ性ホスファターゼ活性 カルシウム含量 ユニット／インプラント mg／インプラント ──────────────────────────────── ＣｏｎＡ吸着画分 １0.３ 0.９４ ＣｏｎＡ非吸着画分 0.４ 0.０４ モックＣｏｎＡ吸着画分 2.２４ 0.２５ モックＣｏｎＡ非吸着画分 0.３３ 0.００ ────────────────────────────────

【００４３】表２に示されるように、ヒト骨形成誘導蛋
白質を含むＣｏｎＡ吸着画分に、モックに比べ強い骨形
成誘導活性が検出された。このことから、２９３Ｔ細胞
において生産した本発明のヒト骨形成誘導蛋白質も強い
骨形成誘導活性を有する蛋白質であることが明らかであ
る。

【００４４】実施例５ ＣＯＳ−１細胞におけるラット
骨形成誘導蛋白質の発現 本発明のラット骨形成誘導蛋白質が骨形成活性を有する
ことを確認するために、実施例２で得られたｃＤＮＡを
一過性発現ベクターに連結し、これをＣＯＳ−１細胞に
導入・発現させ、培養上清中の生成物の活性を測定し
た。発現ベクターの構築 一過性発現ベクターには、実施例３と同様に武部らによ
って報告されたｐｃＤＬ−ＳＲα２９６を改変したｐｃ
ＤＬ−ＳＲＤを用いた。即ち、ベクターｐｃＤＬ−ＳＲ
α２９６を制限酵素ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩで消化後、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩを用いて平滑末端とし、ＥｃｏＲＩリ
ンカーを挿入したものである。まず、このベクターを制
限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩを用
いて平滑末端とした後、アルカリ性ホスファターゼ処理
により脱リン酸化した。一方、本発明の骨形成誘導蛋白
質をコードするｃＤＮＡは、図３に示す方法で蛋白質の
非コード領域の除去を行った。まず、下に示すような本
発明の蛋白質のＮ末端（ＡＴＧ；開始コドン）及びＣ末
端（ＴＡＡ；停止コドン）各２種のＰＣＲ用プライマ
ー： Ｎ末端プライマー Ｎ−１ 5'‐ＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣ
ＴＴＧＣ‐3' Ｎ−２ 5'‐ＧＣＡＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＧＡＣＧ‐
3' Ｃ末端プライマー Ｃ−１ 5'‐ＧＡＴＡＴＣＴＴＡＣＣＧＡＣＡＧＧＣＡ
ＣＡＧＧＴ‐3' Ｃ−２ 5'‐ＣＣＡＧＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧ‐
3' を合成した。

【００４５】次いで、上記Ｎ−１及びＮ−２プライマー
を用いてＲＢ４５を鋳型にＰＣＲを下記条件でＮ末端側
ＤＮＡを増幅後、アガロース電気泳動でＤＮＡを分離
し、ガラス吸着法にて、各所望のＤＮＡ断片を単離・精
製した。 反応液：１０mMトリス−塩酸（ｐＨ8.３）、５０mMＫＣ
ｌ、1.５mMＭｇＣｌ₂ 、0.００１％ゼラチン、２００μ
M ｄＡＴＰ、２００μM ｄＣＴＰ、２００μM ｄＧＴ
Ｐ、２００μM ｄＴＴＰ、５ユニットAmpliTaq（Perkin
Elmer Cetus社製）、１μM プライマーＮ−１、１μM
プライマーＮ−２、５００ｐg ＲＢプラスミドＤＮＡ／
５０μl 条件：９４℃で１分間、４５℃で２分間及び７２℃で２
分間を１サイクルとして３０サイクル反応を行った。

【００４６】次いで、Ｃ−１及びＣ−２プライマーを用
いて同条件でＣ末端側ＤＮＡを増幅・単離・精製した。
こうして得られたＮ末端側ＤＮＡ・ＥｃｏＲＶ−Ｈｉｎ
ｄIII （ＥＶ−Ｈ３）フラグメント及びＣ末端側ＤＮＡ
・ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＶ（Ｋｐｎ−ＥＶ）フラグメント
それぞれを、実施例２のＴ−ベクターに別々に連結し、
実施例１と同様にＤＮＡ塩基配列を決定した。得られた
２種類のプラスミドＤＮＡのうち、Ｎ末端側ＤＮＡであ
るＥＶ−Ｈ３フラグメントを連結したプラスミドＤＮＡ
については、制限酵素ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄIII で消化
して単離したＥＶ−Ｈ３フラグメントを、ＲＢ４５を制
限酵素ＨｉｎｄIII 及びＫｐｎＩで消化して単離したＨ
ｉｎｄIII −ＫｐｎＩ（Ｈ３−Ｋｐｎ）フラグメントと
共に、BlueScriptIISK＋の制限酵素認識部位ＥｃｏＲＶ
とＫｐｎＩの間に挿入し、更にこうして得られたプラス
ミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＫｐｎＩで消化し
てＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ（ＥＶ−Ｋｐｎ）フラグメント
を単離した。

【００４７】一方、Ｃ末端側生成物であるＫｐｎ−ＥＶ
フラグメントを連結したプラスミドＤＮＡについては、
制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＶで消化してＫｐｎ−Ｅ
Ｖフラグメントを単離した。これら両フラグメントを前
記のｐｃＤＬ−ＳＲＤベクターの平滑末端とした制限酵
素ＥｃｏＲＩ認識部位に連結して、骨形成誘導蛋白質発
現ベクターを構築した。図４は、得られたプラスミドの
制限酵素地図である。

【００４８】ラット骨形成誘導蛋白質発現ベクターのト
ランスフェクション及び発現 前項で得られたベクターをＣＯＳ−１細胞にトランスフ
ェクションし、ラット骨形成誘導蛋白質を発現させた。
１０mlのＤＭＥＭ＋１０％牛胎児血清を培地として、１
００mm細胞培養用ディッシュに１×１０⁶ 個のＣＯＳ−
１細胞を播種し、５％ＣＯ₂ インキュベーター内で３７
℃で１８時間培養後、１０mlのリン酸緩衝生理食塩水
〔ＰＢＳ（−）〕で２回洗浄した。これに２μｇの上記
ベクターとＤＥＡＥデキストランとの混合溶液を添加
し、室温で１５分間静置後、１００μＭのクロロキンを
含む５mlのＤＭＥＭ＋１０％牛胎児血清を添加して、３
７℃で３時間３０分保温後に培地を除き、９００μl の
１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＤＭＥ
Ｍ＋１０％牛胎児血清を加え、室温で２分間静置した。
その後、ＰＢＳ（−）、ＤＭＥＭ＋１０％牛胎児血清各
５mlで１回洗浄し、ＤＭＥＭ＋１０％牛胎児血清を１０
ml加え、５％ＣＯ₂ インキュベーター内で３７℃で２４
時間培養した後、培地を除いて１０mlのＤＭＥＭ＋２％
牛胎児血清を添加し、５％ＣＯ₂ インキュベーター内で
３７℃で保温した。５日後、培地を回収し４℃で１００
００rpm の回転数で１０分間遠心分離し、上清を採取し
た。また、対照（モック）として、骨形成誘導蛋白質を
コードするｃＤＮＡを含まないｐｃＤＬ−ＳＲＤベクタ
ーだけを用いて上記と同様にＣＯＳ−１細胞を形質転換
し、培養を行って上清を採取した。

【００４９】これら上清７００mlに尿素及びトリス−塩
酸（ｐＨ7.０）を加えて、６Ｍ尿素５０mMトリス−塩酸
（ｐＨ7.０）となるように調整し、これを６Ｍ尿素／５
０mMトリス−塩酸（ｐＨ7.０）で予め平衡化したヘパリ
ン−セファロースカラム（２０ｍｌ，ファルマシア製）
に流した。吸着された蛋白質を同緩衝液で洗浄した後、
0.５Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液３０mlで溶出させ
た。セントリコンを用いた限外濾過により約５mlまで濃
縮した後、脱イオン水に対し透析を行い、更に凍結乾燥
を行い、１％デオキシコール酸ナトリウム／５０mMトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.０）に溶解した。これを該緩衝
液で予め平衡化したＣｏｎＡセファロースカラム（２０
０μl 、ファルマシア製）に流し、同緩衝液で洗浄した
後、0.５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシドを含む同緩衝液
１mlで溶出を行った。

【００５０】骨形成誘導活性の測定 実施例３と同様にして、上記のＣｏｎＡ吸着画分及び非
吸着画分の骨形成誘導活性を測定した。まず、ラット脱
灰骨から４Ｍグアニジン塩酸により、骨形成誘導活性を
除去したマトリックス残渣２５mgと前項で調製した蛋白
質試料とで共沈澱ペレットを作り、これを２１〜２８日
齢雄ＳＤラットの腹胸部皮下に移植した。次いで、１２
日後にペレットを取り出し、その中のアルカリ性ホスフ
ァターゼ活性及びカルシウム含量を測定した。対照とし
てモック・トランスフェクション上清を用いて、ヘパリ
ン吸着画分について骨形成誘導活性を測定した。その結
果を表３に示した。

【００５１】

【表３】 表 ３ ──────────────────────────────── 試 料 アルカリ性ホスファターゼ活性 カルシウム含量 ユニット／インプラント mg／インプラント ──────────────────────────────── ＣｏｎＡ吸着画分 ２3.９ 8.９ ＣｏｎＡ非吸着画分 0.８１ 0.０６ モック 1.２５ 0.１３ ────────────────────────────────

【００５２】表３に示されるように、ラット骨形成誘導
蛋白質を含むＣｏｎＡ吸着画分に、モックに比べ強い骨
形成誘導活性が検出された。このことから、本発明の骨
形成誘導蛋白質は強い骨形成誘導活性を有する蛋白質で
あることが明らかである。図５〜１０に、骨形成誘導活
性を測定した際の１２日目のペレットの組織学的所見を
示した。図５〜７は、ＣｏｎＡ吸着画分の部分精製ラッ
ト骨形成誘導蛋白質とラット骨マトリックス残渣の共沈
澱ペレットを移植したものであり、図８〜１０は、モッ
ク培養上清よりヘパリンセファロースにより部分精製し
たものとラット骨マトリックス残渣の共沈澱ペレットを
移植したものである。図５及び８は、ヘマトキシリン及
びエオシン染色後の顕微鏡写真（×１５０）であり、図
６及び９は、ＰＡＳ及びアルシャン・ブルー染色後の顕
微鏡写真（×２００）であり、図７及び１０は、von Ko
ssa 染色後の顕微鏡写真（×２００）である。

【００５３】図５では、移植したコラーゲンマトリック
スの間隙に顕著な間質細胞の増生が認められる。その中
には、破骨細胞や線維芽細胞がみられ、コラーゲンマト
リックスの周囲に沿って存在する骨芽細胞と考えられる
細胞も認められる。また、軟骨細胞を伴う軟骨基質の増
生も認められる。更に、コラーゲンマトリックスには顕
著な石灰化が認められ、軟骨基質にも点状に石灰化が認
められる。図６では、軟骨細胞がアルシャン・ブルーに
淡染し、その中にはアルシャン・ブルーに強染する軟骨
細胞が散見される。また、ＰＡＳで染色される石灰化物
質が認められる。図７では、コラーゲンマトリックス及
び軟骨基質中に顕著な石灰化物質が認められる。一方、
図８〜１０では、コラーゲンマトリックスの間隙での細
胞増生は少なく、殆どが線維芽細胞と考えられる。ま
た、軟骨基質、破骨細胞、骨芽細胞及び石灰化も認めら
れない。このように、組織学的所見からも本発明の蛋白
質は明らかに骨形成を誘導していることが認められた。

【００５４】実施例６ ラット骨形成誘導蛋白質の発現
分布 ラットの種々の組織からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出し、ノ
ーザン・ハイブリダイゼーション法により該ラット骨形
成誘導蛋白質のｍＲＮＡの発現を検出した。１０〜１５
週齢のＳＤラットの小脳、肋骨、肋軟骨、気管、血管、
脾臓、胸腺、筋肉及び骨髄及び新生子ラットのＳＤラッ
トの大腿骨、頭蓋冠より、酸グアニジンチオシアネー
ト、フェノール、クロロホルム抽出法にてＲＮＡを抽出
し、これらからオリゴｄＴラテックスでポリ（Ａ）ＲＮ
Ａを抽出した。各組織のポリ（Ａ）ＲＮＡ１０μｇを１
Ｍグリオキサール、５０％ジメチルスルホキシド、１０
mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.０）中にて、５０
℃、１時間変性した後、１％アガロースゲル〔１０mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.０）〕にて電気泳動を行
った。既知分子量のＲＮＡ（GIBCO BRL社製）を上記と
同様の処理を行って分子量マーカーとして使用した。

【００５５】次に、分離したポリ（Ａ）ＲＮＡを吸引に
よりアガロースゲルからナイロンメンブレン（商品名；
ハイボンドＮ（アマシャム社製））に転写した。このフ
ィルターを４２℃でハイブリダイゼーション溶液（４０
％ホルムアミド、６×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ、0.１
％ＳＤＳ、１００μｇ／mlサケ精子ＤＮＡ）中で３時間
プレ−ハイブリダイゼーションし、その後、マルチプラ
イムラベリングキットにより〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰで放
射ラベルしたラット骨形成誘導蛋白質プローブを用いて
４２℃で２０時間上記ハイブリダイゼーション溶液中で
ハイブリダイゼーションを行った。ラット骨形成誘導蛋
白質プローブは、プラスミドＲＢ１２から制限酵素Ｎｏ
ｔＩで切り出されるラット骨形成誘導蛋白質ｃＤＮＡの
全2.２ＫｂのＤＮＡフラグメントを用いた。次いで、こ
のフィルターを0.１×ＳＳＣ、0.１％ＳＤＳ溶液中、５
０℃で洗浄後、オートラジオグラフィーを行い、シグナ
ルの強度により各組織のラット骨形成誘導蛋白質の発現
分布と存在量を検出した。

【００５６】このオートラジオグラフィーを行うに際
し、特表平２−５００２４１号及び特表平３−５０３６
４９号等に記載された骨形成誘導蛋白質であるＢＭＰ−
２及びＢＭＰ−３についても、それぞれラットＢＭＰ−
２ｃＤＮＡ及びラットＢＭＰ−３ｃＤＮＡをプローブと
してハイブリダイゼーションを行い、発現分布と存在量
を検出した。ラットＢＭＰ−２のプローブの調製 特表平２−５００２４１号に記載されたヒトＢＭＰ−２
ｃＤＮＡの塩基配列よりＤＮＡプローブ（5'-ACTAATCAT
GCCATTGTTCAGACGTTGGTCAACTCTGTTAAC-3'）を合成した。
このプローブを用いてヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーよ
り、ヒトＢＭＰ−２ｃＤＮＡをクローニングした。ヒト
ＢＭＰ−２の全コード領域を含むｃＤＮＡフラグメント
をプローブとして用い、ラット胎盤ｃＤＮＡライブラリ
ーから、ラットＢＭＰ−２ｃＤＮＡをクローニングし
た。ラットＢＭＰ−２の全コード領域を含むｃＤＮＡフ
ラグメントをノーザン・ハイブリダイゼーションのプロ
ーブとして用いた。ラットＢＭＰ−３のプローブの調製 特表平２−５００２４１号に記載されたヒトＢＭＰ−３
ｃＤＮＡの塩基配列よりプライマーＤＮＡを合成した。
実施例１及び２に記載した方法に従って、このプライマ
ーを用いてヒト胎盤染色体ＤＮＡから、１８０ｂｐの成
熟体領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した
後、プラスミドBlueScriptIISK＋にサブクローニングし
た。このＤＮＡ断片をプローブとして用い、ラット大腿
骨ｃＤＮＡライブラリーから、ラットＢＭＰ−３ｃＤＮ
Ａをクローニングした。ラットＢＭＰ−３の全長を含む
ｃＤＮＡフラグメントをノーザン・ハイブリダイゼーシ
ョンのプローブとして用いた。

【００５７】図１１は得られたオートラジオグラムであ
る。Ａ及びＢは本発明の骨形成誘導蛋白質のオートラジ
オグラムであり、ＣはＢＭＰ−２のオートラジオグラム
であり、Ｄ及びＥはＢＭＰ−３のオートラジオグラムで
ある。また、レーンＡ〜Ｋは以下の組織のオートラジオ
グラムである。 Ａ 小脳 成熟ＳＤラット Ｂ 肋骨 〃 Ｃ 肋軟骨 〃 Ｄ 気管 〃 Ｅ 血管 〃 Ｆ 脾臓 〃 Ｇ 胸腺 〃 Ｈ 筋肉 〃 Ｉ 骨髄 〃 Ｊ 大腿骨 新生ＳＤラット Ｋ 頭蓋冠 〃

【００５８】Ａ及びＢから、本発明のラット骨形成誘導
蛋白質ｍＲＮＡの大きさは、4.１ｋｂ及び2.８ｋｂであ
ることがわかる。また、本発明のラット骨形成誘導蛋白
質ｍＲＮＡは、新生子ラットの大腿骨、頭蓋冠、成熟ラ
ットの小脳、肋軟骨、気管及び血管に強い存在が認めら
れた。一方、Ｃ〜Ｅから、ラットＢＭＰ−２ｍＲＮＡの
大きさは、3.８ｋｂ及び2.５ｋｂであり、ラットＢＭＰ
−３ｃＤＮＡｍＲＮＡの大きさは、6.７ｋｂ、4.７ｋｂ
及び2.６ｋｂであって、本発明のラット骨形成誘導蛋白
質ｍＲＮＡの大きさとＢＭＰ−２及びＢＭＰ−３ｍＲＮ
Ａの大きさとは異なる。このことは、本発明の骨形成誘
導蛋白質の遺伝子がＢＭＰ−２及びＢＭＰ−３の遺伝子
とは異なることを示している。また、ｍＲＮＡの発現分
布についても、ラットＢＭＰ−２及びラットＢＭＰ−３
は、本発明のラット骨形成誘導蛋白質と大きな相違を見
せている。即ち、ラットＢＭＰ−２においては、気管に
強い存在が認められるものの小脳、肋軟骨及び血管には
弱い存在しか認められず、また、ラットＢＭＰ−３にお
いても、気管に強い存在が認められるものの小脳及び肋
軟骨には存在が認められない。このように、本発明のラ
ット骨形成誘導蛋白質は、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−３と
明らかに異なる蛋白質である。なお、本発明の骨形成誘
導蛋白質ｍＲＮＡは小脳及び肋軟骨で強い存在が認めら
れることから、中枢神経系及び軟骨形成で重要な役割を
果たしている可能性がある。

【００５９】実施例７ ヒト骨形成誘導蛋白質のプロセ
ス配列の置換 本発明の前駆体蛋白質から成熟蛋白質を効率よく切り出
すために、以下に示される、配列表の配列番号１におい
て塩基１１７１〜１２２６で示される、本発明の前駆体
蛋白質のプロセス配列を含むアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ配列： 5'-TG CAG AAA GCC CGG AGG AAG CAG TGG GAT GAG CCG AGG GTG TGC TCC 3'-C TTT CGG GCC TCC TTC GTC ACC CTA CTC GGC TCC CAC ACG AGG Glu Lys Ala Arg Arg Lys Gln Trp Asp Gln Pro Arg Val Cys Ser CGG AGG TAC-3' GCC TC-5' Arg Arg Tyr を、先に述べたコンセンサス配列（Arg-Glu-Lys-Arg ）
を含む以下のヒトＢＭＰ−２タイプ合成ＤＮＡと置換し
た。 （ヒトＢＭＰ−２タイプ） 5'-TG CAC AAA CGC GAG AAG AGG CAG TGG GAT GAG CCG AGG GTG TGC TCC 3'-G TTT GCG CTC TTC TCC GTC ACC CTA CTC GGC TCC CAC ACG AGG His Lys Arg Gln Lys Arg CGG AGG TAC-3' GCC TC-5' まず、図１２に示したＳＫ＋／Ｈ３△，Ｋｐｎを制限酵
素ＢｂｓＩ及びＫｐｎＩで消化し、上記合成ＤＮＡを連
結してＳＫ＋／Ｈ３△，Ｋｐｎ改変体を得た。次いで、
この改変体をＥｃｏＲＶ及びＫｐｎＩで消化し、前駆体
領域と改変部分を含むＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメン
トを得た。一方、ＳＫ＋／ＥＶをＫｐｎＩ及びＥｃｏＲ
Ｖで消化し、ヒト骨形成誘導蛋白質の成熟領域のＣ末端
部分を含むＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを得た。
これら２つのＤＮＡフラグメントをBlueScriptIISK+ の
制限酵素ＥｃｏＲＶ認識部位に挿入した。こうして得ら
れたプラスミドＤＮＡのＥｃｏＲＶフラグメント中のヒ
ト骨形成誘導蛋白質ｃＤＮＡのプロセス配列はコンセン
サス配列に置換されていた。更に、下記合成ＤＮＡを用
いて、上記と同じ処理をしたところ、やはり、ヒト骨形
成誘導蛋白質ｃＤＮＡのプロセス配列はコンセンサス配
列（Arg-Arg-Arg-Arg ）に置換されていた。 （ヒトアクチビンＡタイプ) 5'-TG CAG AAA CGC CGG AGG AGG CAG TGG GAT GAG CCG AGG GTG TGC TCC 3'-C TTT GCG GCC TCC TCC GTC ACC CTA CTC GGC TCC CAC ACG AGG Gln Lys Arg Arg Arg Arg CGG AGG TAC-3' GCC TC-5' 図１２はこれらの方法を示したものである。このように
して得られたｃＤＮＡを用いて形質転換した細胞は、本
発明のヒト骨形成誘導蛋白質を効率良く分泌生産した。

【００６０】実施例８ 安定生産株の樹立 ヒト２９３細胞を使用して安定生産株を樹立した。安定発現ベクターの構築 ベクターｐＥＶＭＴの制限酵素ＥｃｏＲＶ切断部位を制
限酵素ＥｃｏＲＶで消化後、バクテリアル・アルカリ性
ホスファターゼで5'末端の脱リン酸化を行った。このＤ
ＮＡに、上記実施例３で作製したプラスミドBlueScript
IISK＋／ＥＶを制限酵素ＥｃｏＲＶで消化して単離した
ＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し
て、安定発現ベクターｐＥＶＭＴ（ｈＢＩＰ）を構築し
た。また、ベクターｐＥＶＣＭＶを使用して同様の操作
を行い、安定発現ベクターｐＥＶＣＭＶ（ｈＢＩＰ）を
構築した。ヒト２９３細胞の形質転換及び高生産株の分離 次に、チェンら（Chen, c.＆ Okayama, H. Mol. Cell B
iol., 7, 12745-12752(1987））の方法に従って、２０
μｇの安定発現ベクターｐＥＶＭＴ（ｈＢＩＰ）ＤＮＡ
と２μｇのｐＳＶ２ｎｅｏを用いてリン酸カルシウム共
沈澱を作製した。これを、培地（９０％ＭＥＭ＋１０％
牛胎児血清）１ｍｌ当たり２×１０⁵ 個のヒト２９３細
胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ₂ ガス中で１晩培養した
細胞培養用１００ｍｍディッシュに滴下した。１晩保温
後、0.０２５％トリプシン−0.０１％ＥＤＴＡで細胞を
剥がし、この細胞を選択培地（９０％ＭＥＭ＋１０％牛
胎児血清１ｍｌ＋Ｇ４１８ ２ｍｇ／Ｌ）で１０倍に希
釈して１０枚の１００ｍｍディッシュに播種し、同培地
中でコロニーが出現するまで、培地を交換しながら培養
した。出現したコロニーをそれぞれ拡大培養し、培養上
清中に発現したヒト骨形成誘導蛋白の量を酵素抗体測定
法（ＥＩＡ）で測定し、発現量の多い生産株を分離し
た。安定発現ベクターｐＥＶＣＭＶ（ｈＢＩＰ）につい
ても同様に処理し、発現量の多い生産株を分離した。図
１３は、以上の方法を示したものである。こうして得ら
れた株は、培地中にメトトレキセート（ＭＴＸ）を添加
し、順次その濃度を上げて馴養を行えば、更に高発現の
株となる。

【配列表】

【００６１】配列番号：１ 配列の長さ：1560 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：（ヒト） 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：87..1520 特徴を決定した方法：P 特徴を示す記号：mat peptide 存在位置：1191..1520 特徴を決定した方法：P 配列 GCCGCGAGGT CAGTCCGCAG CCTCCGGTGC GCCAGCGCTC GCCTTCCTCC TCCTGGACTT 60 CGGCCCTTTG CCGCCCTCAC CACGCC ATG GCT CAT GTC CCC GCT CGG ACC AGC 113 Met Ala His Val Pro Ala Arg Thr Ser -365 -360 CCG GGA CCC GGG CCC CAG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CCG TTG TTT CTG 161 Pro Gly Pro Gly Pro Gln Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Phe Leu -355 -350 -345 CTG TTG CTC CGG GAT GTG GCC GGC AGC CAC AGG GCC CCC GCC TGG TCC 209 Leu Leu Leu Arg Asp Val Ala Gly Ser His Arg Ala Pro Ala Trp Ser -340 -335 -330 GCA CTG CCC GCG GCC GCC GAC GGC CTG CAG GGG GAC AGG GAT CTC CAG 257 Ala Leu Pro Ala Ala Ala Asp Gly Leu Gln Gly Asp Arg Asp Leu Gln -325 -320 -315 CGG CAC CCT GGG GAC GCG GCC GCC ACG TTG GGC CCC AGC GCC CAG GAC 305 Arg His Pro Gly Asp Ala Ala Ala Thr Leu Gly Pro Ser Ala Gln Asp -310 -305 -300 ATG GTC GCT GTC CAC ATG CAC AGG CTC TAT GAG AAG TAC AGC CGG CAG 353 Met Val Ala Val His Met His Arg Leu Tyr Glu Lys Tyr Ser Arg Gln -295 -290 -285 -280 GGC GCG CGG CCG GGA GGG GGC AAC ACG GTC CGC AGC TTC AGG GCC AGG 401 Gly Ala Arg Pro Gly Gly Gly Asn Thr Val Arg Ser Phe Arg Ala Arg -275 -270 -265 CTG GAA GTG GTC GAC CAG AAG GCC GTG TAT TTC TTC AAC CTG ACT TCC 449 Leu Glu Val Val Asp Gln Lys Ala Val Tyr Phe Phe Asn Leu Thr Ser -260 -255 -250 ATG CAA GAC TCG GAA ATG ATC CTT ACG GCC ACT TTC CAC TTC TAC TCA 497 Met Gln Asp Ser Glu Met Ile Leu Thr Ala Thr Phe His Phe Tyr Ser -245 -240 -235 GAG CCG CCT CGG TGG CCT CGA GCG CTC GAG GTG CTA TGC AAG CCG CGG 545 Glu Pro Pro Arg Trp Pro Arg Ala Leu Glu Val Leu Cys Lys Pro Arg -230 -225 -220 GCC AAG AAC GCT TCA GGC CGC CCG CTG CCC CTG GGC CCG CCC ACA CGC 593 Ala Lys Asn Ala Ser Gly Arg Pro Leu Pro Leu Gly Pro Pro Thr Arg -215 -210 -205 -200 CAG CAC CTG CTC TTC CGC AGC CTC TCG CAG AAC ACG GCC ACA CAG GGG 641 Gln His Leu Leu Phe Arg Ser Leu Ser Gln Asn Thr Ala Thr Gln Gly -195 -190 -185 CTA CTC CGC GGG GCC ATG GCC CTG GCG CCC CCA CCG CGC GGC CTG TGG 689 Leu Leu Arg Gly Ala Met Ala Leu Ala Pro Pro Pro Arg Gly Leu Trp -180 -175 -170 CAG GCC AAG GAC ATC TCC CCC ATC GTC AAG GCG GCC CGC CGG GAT GGC 737 Gln Ala Lys Asp Ile Ser Pro Ile Val Lys Ala Ala Arg Arg Asp Gly -165 -160 -155 GAG CTG CTC CTC TCC GCC CAG CTG GAT TCT GAG GAG AGG GAC CCG GGG 785 Glu Leu Leu Leu Ser Ala Gln Leu Asp Ser Glu Glu Arg Asp Pro Gly -150 -145 -140 GTG CCC CGG CCC AGC CCC TAT GCG CCC TAC ATC CTA GTC TAT GCC AAC 833 Val Pro Arg Pro Ser Pro Tyr Ala Pro Tyr Ile Leu Val Tyr Ala Asn -135 -130 -125 -120 GAT CTG GCC ATC TCG GAG CCC AAC AGC GTG GCA GTG ACG CTG CAG AGA 881 Asp Leu Ala Ile Ser Glu Pro Asn Ser Val Ala Val Thr Leu Gln Arg -115 -110 -105 TAC GAC CCC TTC CCT GCC GGA GAC CCC GAG CCC CGC GCA GCC CCC AAC 929 Tyr Asp Pro Phe Pro Ala Gly Asp Pro Glu Pro Arg Ala Ala Pro Asn -100 -95 -90 AAC TCA GCG GAC CCC CGC GTG CGC CGA GCC GCG CAG GCC ACT GGG CCC 977 Asn Ser Ala Asp Pro Arg Val Arg Arg Ala Ala Gln Ala Thr Gly Pro -85 -80 -75 CTC CAG GAC AAC GAG CTG CCG GGG CTG GAT GAG AGG CCG CCG CGC GCC 1025 Leu Gln Asp Asn Glu Leu Pro Gly Leu Asp Glu Arg Pro Pro Arg Ala -70 -65 -60 CAC GCA CAG CAC TTC CAC AAG CAC CAG CTG TGG CCC AGC CCC TTC CGG 1073 His Ala Gln His Phe His Lys His Gln Leu Trp Pro Ser Pro Phe Arg -55 -50 -45 -40 GCG CTG AAA CCC CGG CCA GGG CGC AAA GAC CGC AGG AAG AAG GGC CAG 1121 Ala Leu Lys Pro Arg Pro Gly Arg Lys Asp Arg Arg Lys Lys Gly Gln -35 -30 -25 GAG GTG TTC ATG GCC GCC TCG CAG GTG CTG GAC TTT GAC GAG AAG ACG 1169 Glu Val Phe Met Ala Ala Ser Gln Val Leu Asp Phe Asp Glu Lys Thr -20 -15 -10 ATG CAG AAA GCC CGG AGG AAG CAG TGG GAT GAG CCG AGG GTG TGC TCC 1217 Met Gln Lys Ala Arg Arg Lys Gln Trp Asp Glu Pro Arg Val Cys Ser -5 1 5 CGG AGG TAC CTG AAG GTG GAC TTC GCA GAC ATC GGC TGG AAT GAA TGG 1265 Arg Arg Tyr Leu Lys Val Asp Phe Ala Asp Ile Gly Trp Asn Glu Trp 10 15 20 25 ATA ATC TCA CCG AAA TCT TTT GAT GCC TAC TAC TGC GCG GGA GCA TGT 1313 Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe Asp Ala Tyr Tyr Cys Ala Gly Ala Cys 30 35 40 GAG TTC CCC ATG CCT AAG ATC GTT CGT CCA TCC AAC CAT GCC ACC ATC 1361 Glu Phe Pro Met Pro Lys Ile Val Arg Pro Ser Asn His Ala Thr Ile 45 50 55 CAG AGC ATT GTC AGG GCT GTG GGC ATC ATC CCT GGC ATC CCA GAG CCC 1409 Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ 60 65 70 TGC TGT GTT CCC GAT AAG ATG AAC TCC CTT GGG GTC CTC TTC CTG GAT 1457 Cys Cys Val Pro Asp Lys Met Asn Ser Leu Gly Val Leu Phe Leu Asp 75 80 85 GAG AAT CGG AAT GTG GTT CTG AAG GTG TAC CCC AAC ATG TCC GTG GAC 1505 Glu Asn Arg Asn Val Val Leu Lys Val Tyr Pro Asn Met Ser Val Asp 90 95 100 105 ACC TGT GCC TGC CGG TGAGACCACT CCAGGGTGGA AAGAAGCCAC GCCCAGCAGA 1560 Thr Cys Ala Cys Arg 110

【００６２】配列番号：２ 配列の長さ：182 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ヒトゲノムを鋳型にしたＰＣＲ
産物） 配列 AGCCATCAAA TCATGCTACC ATCCAGAGTA TAGTGAGAGC TGTGGGGGTC GTTCCTGGGA 60 TTCCTGAGCC TTGCTGTGTA CCAGAAAAGA TGTCCTCACT CAGTATTTTA TTCTTTGATG 120 AAAATAAGAA TGTAGTGCTT AAAGTATACC CTAACATGAC AGTAGAGTCT TGCGCTTGCA 180 GA 182

【００６３】配列番号：３ 配列の長さ：1497 配列の種類：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：（ラット） 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：60..1487 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1158..1487 特徴を決定した方法：P 配列 CACTGAGCCT TCCCTGTCTG CCCTCCTGGG CTCAGACCCT TCACCACTGT CACTCAGCC 59 ATG GCT CCA GGT CTT GCT CGG ATC AGC TTG AGG TCT CAG CTG CTG CCC 107 Met Ala Pro Gly Leu Ala Arg Ile Ser Leu Arg Ser Gln Leu Leu Pro -365 -360 -355 TTG GTG CCG CTG CTC CTG CTA CTG CGG GGC GCA GGC TGC GGC CAC AGA 155 Leu Val Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Ala Gly Cys Gly His Arg -350 -345 -340 -335 GTC CCC TCA TGG TCC TCA CTG CCT TCA GCA GCT GAC AGT GTG CAG AGG 203 Val Pro Ser Trp Ser Ser Leu Pro Ser Ala Ala Asp Ser Val Gln Arg -330 -325 -320 GAC AGG GAC CTC CAG CAG TCA CCC GGG GAC GCT GCA GCC GCT CTG GGT 251 Asp Arg Asp Leu Gln Gln Ser Pro Gly Asp Ala Ala Ala Ala Leu Gly -315 -310 -305 CCA GGC GCC CAG GAC ATA GTC GCT GTC CAC ATG CTC AGG CTC TAT GAG 299 Pro Gly Ala Gln Asp Ile Val Ala Val His Met Leu Arg Leu Tyr Glu -300 -295 -290 AAG TAC AAC CGG AGA GGC GCT CCA CCA GGA GGA GGC AAC ACC GTC CGA 347 Lys Tyr Asn Arg Arg Gly Ala Pro Pro Gly Gly Gly Asn Thr Val Arg -285 -280 -275 AGC TTC CGT GCC CGG CTG GAT GTG ATC GAC CAG AAG CCT GTG TAT TTC 395 Ser Phe Arg Ala Arg Leu Asp Val Ile Asp Gln Lys Pro Val Tyr Phe -270 -265 -260 -255 TTC AAC TTG ACT TCC ATG CAA GAC TCA GAA ATG ATC CTC ACA GCC ACC 443 Phe Asn Leu Thr Ser Met Gln Asp Ser Glu Met Ile Leu Thr Ala Thr -250 -245 -240 TTC CAC TTC TAC TCA GAA CCT CCA CGG TGG CCC CGG GCT CGT GAG GTA 491 Phe His Phe Tyr Ser Glu Pro Pro Arg Trp Pro Arg Ala Arg Glu Val -235 -230 -225 TTC TGC AAG CCC CGA GCT AAG AAT GCA TCC TGC CGG CTC CTG ACC CCA 539 Phe Cys Lys Pro Arg Ala Lys Asn Ala Ser Cys Arg Leu Leu Thr Pro -220 -215 -210 GGT CTG CCT GCT CGC TTG CAC CTA ATC TTC CGC AGT CTC TCG CAG AAC 587 Gly Leu Pro Ala Arg Leu His Leu Ile Phe Arg Ser Leu Ser Gln Asn -205 -200 -195 ACT GCC ACT CAG GGG CTG CTC CGC GGG GCC ATG GCC CTG ACA CCT CCA 635 Thr Ala Thr Gln Gly Leu Leu Arg Gly Ala Met Ala Leu Thr Pro Pro -190 -185 -180 -175 CCA CGT GGC CTC TGG CAG GCC AAG GAC ATC TCC TCA ATC ATC AAG GCT 683 Pro Arg Gly Leu Trp Gln Ala Lys Asp Ile Ser Ser Ile Ile Lys Ala -170 -165 -160 GCC CGA AGG GAT GGA GAA CTT CTT CTC TCT GCT CAG CTG GAT TCT GGA 731 Ala Arg Arg Asp Gly Glu Leu Leu Leu Ser Ala Gln Leu Asp Ser Gly -155 -150 -145 GAG AAG GAT CTC GGA GTG CCA CGG CCC AGT TCC CAC ATG CCC TAT ATC 779 Glu Lys Asp Leu Gly Val Pro Arg Pro Ser Ser His Met Pro Tyr Ile -140 -135 -130 CTT GTC TAT GCA AAT GAC CTG GCC ATC TCG GAG CCC AAC AGT GTA GCA 827 Leu Val Tyr Ala Asn Asp Leu Ala Ile Ser Glu Pro Asn Ser Val Ala -125 -120 -115 GTG ACG CTA CAG AGA TAC GAC CCA TTT CCA GCT GGA GAC TTT GAG CCT 875 Val Thr Leu Gln Arg Tyr Asp Pro Phe Pro Ala Gly Asp Phe Glu Pro -110 -105 -100 -95 GGA GCA GCC CCC AAC AGC TCA GCG GAT CCC CGC GTG CGC AGG GCG GCA 923 Gly Ala Ala Pro Asn Ser Ser Ala Asp Pro Arg Val Arg Arg Ala Ala -90 -85 -80 CAG GTA TCC AAA CCC CTG CAA GAC AAT GAA CTT CCA GGG CTG GAC GAA 971 Gln Val Ser Lys Pro Leu Gln Asp Asn Glu Leu Pro Gly Leu Asp Glu -75 -70 -65 AGA CCA GCG CCT GCC CTG CAC GCC CAG CAT TTC CAC AAG CAC GAG TTC 1019 Arg Pro Ala Pro Ala Leu His Ala Gln His Phe His Lys His Glu Phe -60 -55 -50 TGG TCC AGT CCT TTC CGG GCA CTG AAA CCC CGC ACC GGG CGC AAA GAC 1067 Trp Ser Ser Pro Phe Arg Ala Leu Lys Pro Arg Thr Gly Arg Lys Asp -45 -40 -35 CGC AAG AAG AAA GAC CAG GAT ACA TTC ACC CCC TCC TCC TCG CAG GTG 1115 Arg Lys Lys Lys Asp Gln Asp Thr Phe Thr Pro Ser Ser Ser Gln Val -30 -25 -20 -15 CTG GAC TTT GAT GAG AAG ACG ATG CAG AAA GCC AGG AGG CGG CAG TGG 1163 Leu Asp Phe Asp Glu Lys Thr Met Gln Lys Ala Arg Arg Arg Gln Trp -10 -5 1 GAT GAG CCT CGG GTC TGC TCC AGG AGG TAC CTG AAG GTG GAT TTT GCA 1211 Asp Glu Pro Arg Val Cys Ser Arg Arg Tyr Leu Lys Val Asp Phe Ala 5 10 15 GAC ATC GGG TGG AAT GAA TGG ATC ATC TCA CCC AAA TCC TTT GAT GCC 1259 Asp Ile Gly Trp Asn Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe Asp Ala 20 25 30 TAC TAC TGT GCT GGA GCC TGC GAG TTC CCC ATG CCC AAG ATC GTC CGC 1307 Tyr Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Phe Pro Met Pro Lys Ile Val Arg 35 40 45 50 CCG TCC AAC CAT GCC ACC ATC CAG AGC ATC GTC AGA GCT GTG GGC ATT 1355 Pro Ser Asn His Ala Thr Ile Gln Ser Ile Val Arg Ala Val Gly Ile 55 60 65 GTC CCT GGC ATC CCG GAG CCA TGC TGT GTC CCA GAC AAG ATG AAC TCC 1403 Val Pro Gly Ile Pro Glu Pro Cys Cys Val Pro Asp Lys Met Asn Ser 70 75 80 CTT GGA GTC CTT TTC CTG GAC GAG AAT CGG AAT GTG GTT CTG AAG GTG 1451 Leu Gly Val Leu Phe Leu Asp Glu Asn Arg Asn Val Val Leu Lys Val 85 90 95 TAC CCC AAT ATG TCC GTA GAG ACC TGT GCC TGT CGG TAAGGTGGCT 1497 Tyr Pro Asn Met Ser Val Glu Thr Cys Ala Cys Arg 100 105 110 TCAAGATGGA AGGCAGACCT CCTTCACCCC TGCTGTGCAG AGTGGCATTC TTGGAGCCAG 1557

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３のヒト骨形成誘導蛋白質発現ベクター
の構築の方法を図示したものである。

【図２】実施例３のヒト骨形成誘導蛋白質発現ベクター
の制限酵素地図である。

【図３】実施例５のラット骨形成誘導蛋白質発現ベクタ
ーの構築の方法を図示したものである。

【図４】実施例５のラット骨形成誘導蛋白質発現ベクタ
ーの制限酵素地図である。

【図５】実施例５で得られたＣｏｎＡ吸着画分の骨形成
誘導活性を測定した際の１２日目のペレットの組織学的
所見写真である。

【図６】実施例５で得られたＣｏｎＡ吸着画分の骨形成
誘導活性を測定した際の１２日目のペレットの組織学的
所見写真である。

【図７】実施例５で得られたＣｏｎＡ吸着画分の骨形成
誘導活性を測定した際の１２日目のペレットの組織学的
所見写真である。

【図８】実施例５のモック培養上清を移植したペレット
の１２日目の組織学的所見写真である。

【図９】実施例５のモック培養上清を移植したペレット
の１２日目の組織学的所見写真である。

【図１０】実施例５のモック培養上清を移植したペレッ
トの１２日目の組織学的所見写真である。

【図１１】実施例６のオートラジオグラムである。Ａ及
びＢは本発明の骨形成誘導蛋白質のオートラジオグラム
であり、Ｃ〜Ｅは従来技術の骨形態形成蛋白質のオート
ラジオグラムである。Ａ〜Ｉは順に成熟ＳＤラットの小
脳、肋骨、肋軟骨、気管、血管、脾臓、胸腺、筋肉、骨
髄のレーンであり、Ｊ及びＫは新生ＳＤラットの大腿骨
及び頭蓋冠のレーンである。

【図１２】実施例７のプロセス配列の置換方法を示した
ものである。

【図１３】ヒト骨形成誘導蛋白質の安定発現ベクターの
構築方法を示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 今野 保彦 奈良県奈良市北市町75−１−102 (72)発明者 高雄 誠 奈良県奈良市北市町75−１−403 (56)参考文献 国際公開89／010409（ＷＯ，Ａ１) Ｊｏｈｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃ ｉｅｎｃｅ，1988年，242，1528−1534 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記アミノ酸配列のアミノ酸１〜１１０で
   示されるアミノ酸配列を含む蛋白質、又は下記アミノ酸
   配列のアミノ酸１〜１１０で示されるアミノ酸配列の１
   個若しくは２個又は数個のアミノ酸が置換、挿入又は欠
   損している配列を含み、かつ骨形成誘導能を有する蛋白
   質。
2. 【請求項２】ヒト由来の蛋白質である請求項１記載の蛋
   白質。
3. 【請求項３】ラット由来の蛋白質である請求項１記載の
   蛋白質。
4. 【請求項４】下記アミノ酸配列のアミノ酸１〜１１０で
   示されるアミノ酸配列を含む蛋白質、又は下記アミノ酸
   配列のアミノ酸１〜１１０で示されるアミノ酸配列の１
   個若しくは２個又は数個のアミノ酸が置換、挿入又は欠
   損している配列を含み、かつ骨形成誘導能を有する蛋白
   質をコードするＤＮＡ。 コードするＤＮＡ。
5. 【請求項５】蛋白質がヒト由来の蛋白質である請求項４
   記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】蛋白質がラット由来の蛋白質である請求項
   ４記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】配列表の配列番号１の塩基１１９１〜１５
   ２０で示される塩基配列、又は配列番号１の塩基１１９
   １〜１５２０で示される塩基配列の１個又は数個の塩基
   が置換、挿入又は欠損している配列を含む請求項４記載
   のＤＮＡ。
8. 【請求項８】配列表の配列番号１の塩基８７〜１５２０
   で示される塩基配列、又は配列番号１の塩基８７〜１５
   ２０で示される塩基配列の１個又は数個の塩基が置換、
   挿入又は欠損している配列を含む請求項７記載のＤＮ
   Ａ。
9. 【請求項９】下記アミノ酸配列のアミノ酸１〜１１０で
   示されるアミノ酸配列を含む蛋白質、又は下記アミノ酸
   配列のアミノ酸１〜１１０で示されるアミノ酸配列の１
   個若しくは２個又は数個のアミノ酸が置換、挿入又は欠
   損している配列を含み、かつ骨形成誘導能を有する蛋白
   質を製造する方法であって、 （ａ）発現制御配列を有する、該蛋白質をコードするＤ
   ＮＡで細胞を形質転換する工程；及び （ｂ）該形質転換細胞を培養する工程を含む方法。 ）該形質転換細胞を培養する工程を含む方法。
10. 【請求項１０】下記アミノ酸配列のアミノ酸１〜１１０
    で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質、又は下記アミノ
    酸配列のアミノ酸１〜１１０で示されるアミノ酸配列の
    １個若しくは２個又は数個のアミノ酸が置換、挿入又は
    欠損している配列を含み、かつ骨形成誘導能を有する蛋
    白質を有効成分とする骨形成誘導剤。