CN102382829B - Fbxl15蛋白抑制剂以及它们的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了FBXL15蛋白抑制剂以及它们的应用。本发明提供的FBXL15蛋白的抑制剂为如下(1)至(6)中的任意一种：(1)序列表的序列3所示的单链核酸；(2)序列表的序列4所示的单链核酸；(3)序列表的序列5所示的单链核酸；(4)序列表的序列3自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸；(5)序列表的序列4自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸；(6)序列表的序列5自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸。所述FBXL15蛋白的抑制剂可用于制备骨质疏松动物模型。大鼠实验证实，在骨组织中导入FBXL15蛋白抑制剂后，可以敲低FBXL15蛋白的编码基因的表达量，大鼠绝大多数骨指标明显下降，呈现明显的骨质疏松表型。
Description
技术领域
本发明涉及FBXL15蛋白抑制剂以及它们的应用。
背景技术
蛋白质是构成生命体内细胞和组织的基本物质，几乎所有的蛋白质都处在不断合成与降解的动态平衡之中。与蛋白质的合成相比，蛋白质的降解同样重要，机体内短寿命的、错误折叠的以及机体自身不需要的蛋白都需要通过降解途径来清除。其中泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-Proteasome System，UPS)就是真核生物体内普遍存在的具有高度选择性的蛋白质降解系统，主要由蛋白质泛素化和蛋白酶体降解两个过程组成。该系统的生物学功能非常广泛，参与调控细胞内几乎各个方面的生命活动，其异常与炎症、癌症及神经退行性疾病等密切相关。
泛素化修饰通过由泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme，E1)、泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme，E2)和泛素连接酶(ubiquitin-protein ligase，E3)参与介导的酶促级联反应完成，最后经蛋白酶体降解。其中E3决定底物识别的特异性，是蛋白质泛素化领域的研究热点。E3可以分为两大类：含有RING(reallyinteresting new gene)锌指结构和HECT(homologous to E6AP C-terminus)结构域的E3(图1)。
RING类E3中的大多数是基于Cullins蛋白的多亚基复合体，其中基于Cullinl所形成的SCF(Skpl-Cullinl-F-box)复合体是研究最多、最深入的RING类E3复合体。它以支架蛋白Cullin1为中心，C端结合RING锌指蛋白Roc1，N端结合接头蛋白Skp1，Skp1又进一步募集不同的F-box蛋白，F-box蛋白担当底物识别亚基的角色，这样SCF复合体就利用不同的F-box蛋白形成不同复合体，从而结合不同的底物，在细胞周期调控、细胞生长及肿瘤发生等多种生物学过程中发挥着重要作用。F-box蛋白是一个大的蛋白家族，其家族成员数量在不同的物种中差别很大，酵母中约有20种，果蝇中有27种，而在人中则有69个成员。人中的F-box蛋白家族根据其C端所含结构域的不同，可以分为三类：含有WD40结构域的FBXW亚家族，含有LRR区的FBXL亚家族，以及含有其它结构域的统称为FBXO亚家族，它们分别通过WD40、LRR及其它结构域与底物蛋白发生相互作用，介导SCF复合体对底物的识别及泛素化修饰。
发明内容
本发明的目的是提供FBXL15蛋白抑制剂以及它们的应用。
本发明提供了一种核酸(FBXL15蛋白抑制剂)，为如下(1)至(6)中的任意一种：
(1)序列表的序列3所示的单链核酸；
(2)序列表的序列4所示的单链核酸；
(3)序列表的序列5所示的单链核酸；
(4)序列表的序列3自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸；
(5)序列表的序列4自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸；
(6)序列表的序列5自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸。
本发明还保护FBXL15蛋白的抑制剂在制备骨质疏松动物模型中的应用；
所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
本发明还保护一种用于制备骨质疏松动物模型的产品，它的活性成分为所述FBXL15蛋白的抑制剂。
本发明还保护所述FBXL15蛋白的抑制剂在降低所述FBXL15蛋白的编码基因的表达量中的应用。
以上任一所述FBXL15蛋白的抑制剂均可为所述核酸中的任意一种。
以上任一所述骨质疏松动物模型的骨小梁密度(BMD)、骨小梁相对骨量(BV/TV)，骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)中的至少一种低于所述骨质疏松动物模型的出发动物。
以上任一所述动物具体可为大鼠，如SD大鼠。
所述FBXL15蛋白的编码基因可为如下(1)或(2)或(3)所述的DNA分子：
(1)序列表中序列2所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。
本发明还保护所述FBXL15蛋白或所述FBXL15蛋白的编码基因在参与大鼠体内骨稳态平衡中的应用。
大鼠实验证实，在骨组织中导入所述FBXL15蛋白抑制剂后，可以敲低FBXL15蛋白的编码基因的表达量，大鼠绝大多数骨指标明显下降，呈现明显的骨质疏松表型。
附图说明
图1为E3泛素连接酶的组成类型；根据结构组成及泛素转移方式的不同，E3可分为单体RING类E3，HECT类E3和多亚基RING类E3。
图2为FBXL15蛋白的结构域组成示意图。
图3为小鼠FBXL15基因的组织表达谱。
图4为各个实验组经过相应处理后，细胞内FBXL15基因mRNA的相对水平。
图5为大鼠胫骨骨小梁MicroCT参数分析；*表示P＜0.05；BMD的单位为“mg/ccm”，BV/TV的单位为“％”，Tb.Th的单位为“mm”，Tb.N的单位为“1/mm”，Tb.sp的单位为“mm”。
图6为大鼠胫骨骨小梁MicroCT三维重建图像。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
SD大鼠(健康6月龄雌性Sprague-Dawley大鼠)：购自军事医学科学院实验动物中心。UMR106细胞(大鼠成骨样细胞系)：购自美国标准菌种保藏中心(ATCC)，目录号为CRL-1661。
实施例1、FBXL15蛋白的基本特征描述
FBXL15蛋白由F-box结构域和6个亮氨酸富含区(LRR)所组成(结构示意图见图2)。LRR是一大类介导蛋白相互作用的结构域，根据长度及序列特征可以分为6类，FBXL15蛋白及Skp2蛋白等F-box蛋白属于其中的CC(cysteine-containing)亚类。FBXL15蛋白在进化上较为保守，在果蝇、疟蚊等无脊椎动物及鱼类、鸟类等脊椎动物以及哺乳动物中都存在FBXL15蛋白的同源基因，其中哺乳动物中FBXL15蛋白高度保守，人与其它哺乳动物的同源性高达95％以上，与鱼类、鸟类的同源性在60％左右，与无脊椎动物的进化距离较远，只有30％左右。从FBXL15蛋白与其它FBXL亚类的蛋白的进化树关系分析，FBXL15蛋白分支独立于大多数FBXL亚类蛋白，提示FBXL15蛋白的功能可能比较保守。
在获得FBXL15抗体后，对FBXL15蛋白的组织和细胞表达谱进行了分析。组织器官来自小鼠，分别为心、肝、脾、肺、肾、脑、骨、肌肉。结果显示，抗体可以识别鼠源FBXL15蛋白，FBXL15蛋白的组织表达谱比较广泛，在心、脑组织中呈高表达，在肝、脾、肾、骨、肌肉中表达中等，在肺中表达很弱(在各器官中的表达谱见图3)。
实施例2、siRNA的设计和合成
大鼠FBXL15蛋白如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2所示。
设计如下三条靶向大鼠中FBXL15蛋白的siRNA：
1#(序列表的序列3)：5’-CACCCUUUGUCAACCUACATT-3’；
2#(序列表的序列4)：5’-CACCCUGGAAUUUCAAAUATT-3’；
3#(序列表的序列5)：5’-GGCCAAAGCUAGUAAAGCUTT-3’。
设计如下阴性对照siRNA：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。
以上各条siRNA由上海吉玛公司负责合成。
实施例3、siRNA的应用
一、siRNA的敲低效率
借助Lipofectamine 2000转染试剂分别将实施例2合成的1#siRNA(si-1组)、2#siRNA(si-2组)、3#siRNA(si-3组)、阴性对照siRNA(NC组)转染24孔板中的UMR106细胞(按Lipofectamine 2000转染试剂的说明书操作；24孔板细胞生长汇合度为70％时转染细胞，2μl 20μM siRNA与1μl转染试剂混合，siRNA和细胞个数比例约为80nM siRNA：8×104个细胞)；同时设置仅转染不含有siRNA的转染试剂的平行处理，作为空白对照(VC组)。
转染48小时后，收取细胞，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，通过实时定量PCR检测siRNA对FBXL15基因的敲低效率(借助GAPDH基因调整各组细胞至浓度)。
检测GAPDH基因的引物对如下：
5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCA-3’；5’-CCATTTGATGTTAGCGGGAT-3’。
检测FBXL15基因的引物对如下(靶序列约109bp)：
5’-GCTCAGGTGGGTCCACAGA-3’；5’-CGTCCAACAGCCATTCG-3’。
对于各组处理，将FBXL15基因与GAPDH基因的表达量的比值作为FBXL15基因的标准化表达量。
以NC组细胞内FBXL15基因的标准化表达量(FBXL15mRNA的标准化表达量)为100％，计算其它几组细胞内FBXL15mRNA的相对水平(相对表达量)，见图4。敲低效率＝1-相对表达量。结果显示，3条siRNA的敲低效率均超过了90％，1#siRNA的敲低效率为96.4％，2#siRNA的敲低效率为92.3％，3#siRNA的敲低效率为93.5％，1#siRNA敲低效率最高。
二、FBXL15参与体内骨稳态的调控
目前已知Smurf1最重要的生理功能是参与调控骨平衡，Smurf1-/-小鼠呈现年龄依赖的骨量增加，成骨细胞活性增强。那么FBXL15对Smurf1的调控是否会影响骨形成呢？
特异靶向骨组织的递送系统(BTDS)中的脂质体的制备方法具体方法如下：将脂质体DOTAP(Avanti America，目录号890890)，脂质体DOPE(Avanti America，850725)，胆固醇(Chol)，DSPE-mPEG2000(Avanti America，880128)和DSPE-mPEG2000-MAL(Avanti America，880126)按照摩尔比42∶15∶38∶3∶2的比例共同溶解在氯仿中，然后使之挥发干缩至薄膜上，用10mM PBS(pH 7.4)使之水合，50℃水浴预孵育形成多室脂质体小泡(MLV)；用LipoFast挤压器(Lipofast，Avestin，多伦多，加拿大)使MLV依次透过两层直径0.2μm和0.1μm的聚碳酸酯膜(分别重复5次)，形成大的单室脂质体小泡(LUV)；LUV与N末端为乙酰半胱氨酸残基的(DSS)6(ChinaPeptides CO.，LTD，China)室温孵育2h(N末端为乙酰半胱氨酸残基的(DSS)与DSPE-PEG2000-MAL的摩尔比为3∶1)，然后用琼脂糖CL-4B柱子通过筛析色谱法去掉未结合的(DSS)6，得到脂质体悬液；将脂质体悬液每0.5ml分装成一管，与等体积的含有甘露醇的去离子水混合(甘露醇与脂质体的摩尔比为5∶1)，冻干机(Labconco，Freezezone，美国)处理48小时。
尾静脉注射前，将15μmol上述方法得到的脂质体与0.5ml含有375μg siRNA的DEPC水再水合，室温孵育20min，然后通过0.22μm的滤器过滤，然后尾静脉注射SD大鼠。siRNA利用特异靶向骨组织的递送系统(BTDS)传送到大鼠的骨组织。
将30只6月龄大雌性SD大鼠随机分为5组，每组6只；利用特异靶向骨组织的递送系统(BTDS)将siRNA传送到大鼠的骨组织，各组大鼠每次的注射体积相同，分组处理情况如下(各组同时处理)：
第一组(si-L15组)：借助BTDS将实施例2合成的1#siRNA尾静脉注射大鼠，每次剂量为4mg siRNA/kg大鼠；注射6次，每次间隔1周；第六次注射完成后取右侧胫骨进行MicroCT扫描分析；
第二组(NC组)：借助BTDS将实施例2合成的阴性对照siRNA尾静脉注射大鼠，每次剂量为4mg siRNA/kg大鼠；注射6次，每次间隔1周；第六次注射完成后取右侧胫骨进行MicroCT扫描分析；
第三组(VC组)：用BTDS尾静脉注射大鼠；注射6次，每次间隔1周；第六次注射完成后取右侧胫骨进行MicroCT扫描分析；
第四组(AM组)：大鼠不进行任何处理；与其它组同时取右侧胫骨进行MicroCT扫描分析；
第五组(BL组)：大鼠不进行任何处理，实验起始时(即比其它组少饲养5周)；取右侧胫骨进行MicroCT扫描分析。
MicroCT扫描分析采用21μm分辨率，选择8个横断面来进行，并对核心直径约2.2mm的骨小梁进行三维重建(viva CT40，SCANCO MEDICAL，Sigma＝1.2，Supports＝2and Threshold＝190)，并定量分析以下参数：骨小梁密度(BMD)、骨小梁相对骨量(BV/TV)，骨小梁数量(Tb.N)，骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁间距(Tb.sp)。各个参数的检测结果见表1和图5。大鼠胫骨骨小梁三维重建图像见图6。
表1各个参数的分析结果
MicroCT分析结果显示，注射1#siRNA大鼠的骨参数，包括骨密度、相对骨量、骨小梁厚度、骨小梁数量均比各对照组有明显的降低，骨小梁间距没有明显的差异。MicroCT的三维重建也清楚的显示，注射1#siRNA大鼠的骨量、骨结构相比于对照组有明显的减弱，呈现骨质疏松的表型。
Claims (2)
1.一种siRNA，其正义链为如下（1）至（6）中的任意一种：
（1）序列表的序列3所示的单链核酸；
（2）序列表的序列4所示的单链核酸；
（3）序列表的序列5所示的单链核酸；
（4）序列表的序列3自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸；
（5）序列表的序列4自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸；
（6）序列表的序列5自5’末端第1至19位核苷酸所示的单链核酸。
2.权利要求1中的（1）或（4）所述的siRNA在制备骨质疏松大鼠模型中的应用；所述骨质疏松大鼠模型的骨小梁密度、骨小梁相对骨量、骨小梁数量和骨小梁厚度低于所述骨质疏松大鼠模型的出发大鼠。
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