ES2601352T3 - Cribado para compuestos anti-cáncer usando actividad de netrina-1 - Google Patents

Abstract

Procedimiento para seleccionar un compuesto para la prevención o el tratamiento de cáncer, seleccionándose dicho cáncer a prevenir o tratar entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón, neuroblastoma, glioma, leucemia, sarcoma, melanoma y adenocarcinoma, donde dicho cáncer a prevenir o tratar es un cáncer donde células tumorales expresan o sobreexpresan netrina-1, donde dicho procedimiento comprende las siguientes etapas de: a) tener un medio que contiene netrina-1, o un fragmento de la misma, y un receptor de netrina-1, o un fragmento del mismo, donde: - dicha netrina-1, o un fragmento de la misma, y dicho receptor de netrina-1, o un fragmento del mismo, son capaces de interactuar específicamente entre sí para formar un par de unión, y/o - dicha netrina-1, o un fragmento de la misma, es capaz de inducir la dimerización o multimerización del dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1; b) poner en contacto dicho medio con el compuesto a poner a prueba; c) - medir la inhibición de la interacción entre netrina-1, o un fragmento de la misma, y dicho receptor de netrina-1, o un fragmento del mismo, y/o - determinar si dicho compuesto inhibe la dimerización o multimerización de dicho receptor de netrina-1, o un fragmento del mismo, particularmente la dimerización del dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1; y d) seleccionar dicho compuesto si: - la medición en la etapa c) demuestra una inhibición significativa de la interacción entre netrina-1, o un fragmento de la misma, y el receptor de netrina-1, o un fragmento del mismo, en presencia de dicho compuesto, y/o - la determinación en la etapa c) demuestra una inhibición significativa de la dimerización o multimerización, en presencia de dicho compuesto, del dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1.

Description

DESCRIPCION

Cribado para compuestos anti-cancer usando actividad de netrina-1.

5 [0001] El asunto de la presente invencion se refiere a un procedimiento in vitro para el cribado de

compuestos anti-cancer basado en la capacidad de estos compuestos de interactuar con netrina-1 y/o de inhibir la dimerizacion del dominio intracelular del receptor de netrina-1 expresado en celulas tumorales. La invencion tambien se refiere a un procedimiento para predecir la presencia de cancer metastasico, o para determinar la eficiencia de un tratamiento anti-cancer basado en la medicion del nivel de expresion de netrina-1. La invencion comprende, ademas, 10 kits y compuestos como un medicamento para el tratamiento de un cancer metastasico tal como cancer de mama, relacionados con la sobreexpresion de netrina-1 por las celulas tumorales.

[0002] La netrina-1, una protema relacionada con laminina difusible, ha demostrado desempenar un papel

fundamental en el control de la navegacion neuronal durante el desarrollo del sistema nervioso 31, interactuando con 15 sus principales receptores, DCC (delecionado en cancer colorrectal) 1 2, 3 y UNC5H 4 5 Sin embargo, mas recientemente, la netrina-1 ha surgido como una molecula completamente diferente que regula la supervivencia celular. De hecho, los receptores de netrina-1 DCC y UNC5H, -es decir, UNC5H1, UNc5h2 y UNC5H3- pertenecen a la llamada familia de receptores de dependencia 6, 7 Los receptores de dependencia forman un grupo de receptores que comparten la capacidad de inducir muerte celular cuando se expresan en entornos en los que su 20 ligando no esta disponible 44 Dichos receptores, que tambien incluyen RET 8, p-integrinas 9, el receptor Patched 10, neogenina 11, p75NTR 12 y el receptor de androgenos 40, comparten la propiedad funcional de inducir muerte celular cuando se desprenden de sus ligandos, aunque la presencia de su ligando bloquea esta actividad proapoptotica. Dichos receptores crean, de este modo, estados celulares de dependencia de sus respectivos ligandos 13, 14

25 [0003] Se ha sugerido que este efecto de dependencia actua como un mecanismo para eliminar celulas

tumorales que se desarrollanan en entornos de indisponibilidad de ligando: proliferacion de celulas tumorales en un entorno celular con constante y limitada presencia de ligando o migracion de celulas tumorales metastasicas hacia tejidos donde el ligando no se expresa. Una ventaja selectiva para una celula tumoral sena entonces perder la capacidad proapoptotica de sus receptores de dependencia. Se predijo a partir de cribados geneticos que la netrina- 30 1-UNC6 de C. elegans interactuaba con UNC40 y con UNC5 42 Cuatro ortologos de UNC5 se identificaron en marnfferos: se descubrio que UNC5H1, H2, H3, H4 y UNC40 eran el ortologo del DCC (delecionado en cancer colorrectal) de vertebrados 39 En esta lmea, a principios de los anos 1990 se propuso que DCC era un gen supresor de tumores, cuya expresion se pierde en la amplia mayona de canceres humanos 15, 16 Esta hipotesis tambien encaja con la reciente observacion de que los genes de UNC5H son regulados negativamente en la amplia mayona 35 de tumores colorrectales, sugiriendo por lo tanto que la perdida de genes de UNC5H representa una ventaja selectiva para el desarrollo de tumores 17 Curiosamente, en ratones, tanto la inactivacion de UNC5H3 como la sobreexpresion de netrina-1 en el tracto gastrointestinal estan asociadas con la progresion del tumor intestinal 18, 19, demostrando por lo tanto per se que la perdida de receptores de dependencia de netrina-1 en la patologfa humana es un factor causal para la progresion de tumores. Sin embargo, aunque una serie inicial de informes apoyo el hecho 40 de que DCC actuaba como un supresor tumoral (para una revision, vease 29), han surgido dudas, principalmente debido a la rareza de las mutaciones puntuales en la secuencia codificante de DCC y debido a la falta de predisposicion tumoral en ratones hemicigoticos para DCC 41.

[0004] Sin embargo, el modelo descrito anteriormente predice que tanto la perdida de los receptores de 45 netrina-1 como el aumento de expresion del ligando -es decir, expresion autocrina- deben observarse en canceres

humanos, dado que deben representar ventajas selectivas similares. Esta cuestion es importante no solamente para el conocimiento basico, sino que es crucial para terapia: de hecho, inhibir la interaccion extracelular entre receptores de dependencia de netrina-1 y netrina-1 podna representar una estrategia atractiva para desencadenar regresion tumoral.

50

[0005] Es particularmente deseable proporcionar medios sencillos y uniformes para identificar y caracterizar nuevos compuestos que pueden usarse para el tratamiento de cancer.

[0006] Sorprendentemente, los inventores han demostrado en primer lugar que, en lugar de perder 55 receptores de dependencia de netrina-1, la mayona de los tumores de mama metastasicos mostraban expresion de

netrina-1 incrementada, un rasgo que puede ser usado en terapia para desencadenar la muerte del tumor metastasico.

[0007] Si la senalizacion proapoptotica de DCC y/o UNC5H esta empezando a ser documentada, una

cuestion importante en esta caractenstica distintiva muerte/vida dictada por DCC, UNC5H y, de forma mas general, por los otros receptores de dependencia conocidos, es como inhibe la presencia del ligando su actividad proapoptotica 50

5 [0008] En un segundo momento, los inventores analizaron si la multimerizacion de DCC y/o UNC5H inducida

por netrina-1 podna ser la etapa cntica que inhibe la actividad proapoptotica de DCC y/o UNC5H. Sorprendentemente, han demostrado que un receptor de netrina-1, tal como DCC y/o UNC5H multimeriza en respuesta a netrina-1, un proceso suficiente para inhibir la apoptosis.

10 [0009] En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento in vitro para seleccionar un

compuesto para la prevencion o el tratamiento de cancer, donde dicho procedimiento comprende las siguientes etapas de:

a) tener un medio que contiene netrina-1, o un fragmento de la misma, y un receptor de netrina-1, o un fragmento del 15 mismo, donde:

- dicha netrina-1, o un fragmento de la misma, y dicho receptor de netrina-1, o un fragmento del mismo, son capaces de interactuar espedficamente entre sf para formar un par de union, y/o

- dicha netrina-1, o un fragmento de la misma, es capaz de inducir la dimerizacion o multimerizacion de dicho 20 receptor de netrina-1, o un fragmento del mismo, particularmente el dominio intracelular de dicho receptor de netrina-

1;

b) poner en contacto dicho medio con el compuesto a poner a prueba;

25 c)

- medir la inhibicion de la interaccion entre netrina-1, o un fragmento de la misma, y dicho receptor de netrina-1, o un fragmento del mismo, y/o

- determinar si dicho compuesto inhibe la dimerizacion o multimerizacion de dicho receptor de netrina-1, o un 30 fragmento del mismo, particularmente la dimerizacion del dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1; y

d) seleccionar dicho compuesto si:

- la medicion en la etapa c) demuestra una inhibicion significativa de la interaccion entre netrina-1, o un fragmento de 35 la misma, y el receptor de netrina-1, o un fragmento del mismo, en presencia de dicho compuesto, y/o

- la determinacion en la etapa c) demuestra una inhibicion significativa de la dimerizacion o multimerizacion de dicho receptor de netrina-1, o un fragmento del mismo, en presencia de dicho compuesto, particularmente la dimerizacion del dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1.

40 [0010] Mediante la expresion interaccion entre netrina-1 y su receptor de netrina-1, se pretende designar en

la presente solicitud la interaccion que da como resultado la ventaja selectiva de que celulas tumorales escapan de la apoptosis inducida por receptores de dependencia de netrina-1, preferentemente debido a un nivel de netrina-1 elevado.

45 [0011] De este modo, la inhibicion de esta interaccion puede obtenerse, por ejemplo, mediante la inhibicion

completa o parcial de la union de netrina-1 a su receptor, especialmente en presencia de un ligando competitivo (tal como un anticuerpo que esta dirigido a este dominio de membrana extracelular de dicho receptor de netrina-1), o en presencia de un compuesto capaz de formar un complejo espedfico con la netrina-1 (tal como un dominio de membrana extracelular soluble de su receptor de netrina-1, o parte del mismo).

50

[0012] En una realizacion preferida, el procedimiento de acuerdo con la presente invencion se caracteriza porque dicho cancer a prevenir o tratar es un cancer donde celulas tumorales expresan o sobreexpresan netrina-1. 0013 * * * *

[0013] En otra realizacion preferida, el procedimiento de acuerdo con la presente invencion se caracteriza

55 porque dicho cancer a prevenir o tratar se selecciona entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer

colorrectal, cancer de pulmon, neuroblastoma, glioma, leucemia mieloide aguda, sarcoma, melanoma,

adenocarcinoma de ovario, adenocarcinoma renal, adenocarcinoma pancreatico, adenocarcinoma de utero,

adenocarcinoma de estomago, adenocarcinoma de rinon y adenocarcinoma rectal.

[0014] En otra realizacion preferida, el procedimiento de acuerdo con la presente invencion se caracteriza porque dicho cancer a prevenir o tratar es un cancer metastasico o agresivo.

[0015] En el procedimiento de acuerdo con la invencion, dicho receptor de netrina-1 se selecciona 5 preferentemente entre el grupo de DCC, UNC5H (particularmente UNC5H1, UNC5H2 y UNC5H3), neogenina y la

adenosina A2b, mas preferentemente se selecciona entre el grupo de DCC, UNC5H1, UNC5H2 y UNC5H3.

[0016] En otra realizacion preferida, el procedimiento de acuerdo con la presente invencion se caracteriza porque, en la etapa a):

10

- dicho fragmento del receptor de netrina-1 comprende o es el dominio extracelular del receptor de netrina-1, o parte del mismo capaz de interactuar con netrina-1; y/o

- dicho fragmento del receptor de netrina-1 comprende o es el dominio intracelular del receptor de netrina-1, o parte del mismo capaz de dimerizarse o multimerizarse en presencia de netrina-1.

15

[0017] En otra realizacion preferida, el procedimiento de acuerdo con la presente invencion se caracteriza porque dicha netrina-1 y/o dicho receptor de netrina-1 son de mairnfero, particularmente de raton, rata o ser humano.

20 [0018] En un aspecto particular del procedimiento de la presente invencion, en la etapa a) dicha netrina-1 es

de pollo.

[0019] En otra realizacion preferida, el procedimiento de acuerdo con la presente invencion se caracteriza porque dicha netrina-1 y/o dicho receptor de netrina-1 y/o el compuesto a poner a prueba esta marcado mediante un

25 marcador capaz de ser medido directa o indirectamente.

[0020] En otra realizacion preferida, el procedimiento de acuerdo con la presente invencion se caracteriza porque en la etapa c):

30 - la medida de la inhibicion de la interaccion entre netrina-1, o un fragmento de la misma, y dicho receptor de netrina- 1, o un fragmento del mismo, se lleva a cabo mediante inmunoensayo (particularmente mediante ELISA o mediante ensayo inmunorradiometrico (IRMA)), mediante ensayo de centelleo por proximidad (SPA) o mediante transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia (FRET); y/o

- la dimerizacion o multimerizacion, o su inhibicion, de dicho receptor de netrina-1, o fragmento del mismo, 35 particularmente el dominio intracelular, se lleva a cabo mediante inmunoprecipitacion o FRET.

[0021] En otra realizacion preferida particular, el procedimiento de acuerdo con la presente invencion se caracteriza porque en la etapa a) dicho medio contiene celulas que expresan en su membrana superficial un receptor de netrina-1 endogeno o uno recombinante, particularmente un dominio extracelular recombinante de dicho

40 receptor de netrina-1.

[0022] En una realizacion preferida, dicho receptor de netrina-1 recombinante tambien comprende el dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1.

45 [0023] En otra realizacion preferida particular, el procedimiento de acuerdo con la presente invencion se

caracteriza porque en la etapa a) dicho medio contiene celulas tumorales, preferentemente celulas tumorales metastasicas, que expresan de forma endogena dicho receptor de netrina-1 en la superficie de su membrana y que expresan o sobreexpresan netrina-1, y donde en la etapa c) la inhibicion de la interaccion entre netrina-1 y su receptor de netrina-1 en presencia del compuesto a poner a prueba, se mide mediante la apoptosis o muerte de 50 celulas inducida por la presencia del compuesto a poner a prueba, preferentemente analizada usando el procedimiento de tincion con azul de tripano, tal como se indica en los ejemplos a continuacion.

[0024] En una realizacion preferida, dichas celulas tumorales se seleccionan entre el grupo que consiste en celulas 4T1, celulas CAL51, celulas T47D, celulas SKBR7, celulas IMR32, celulas GL26 y celulas H358,

55 especialmente lmeas celulares CAL51, tales como la lmea celular CAL51-36, que son mucho mas susceptibles a muerte celular en respuesta a la presencia de DCC-EC-Fc. 0025

[0025] La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento in vitro para seleccionar un compuesto para la prevencion o el tratamiento de cancer, donde dicho procedimiento comprende las siguientes etapas de:

a) tener un medio que contiene una celula de mairnfero que expresa un receptor de netrina-1 endogeno o uno recombinante, o un fragmento del mismo que comprende al menos su dominio intracelular, preferentemente una celula tumoral, mas preferentemente una celula que presenta dimerizacion o multimerizacion del dominio intracelular

5 de su receptor de netrina-1 o una celula donde el dominio intracelular de su receptor de netrina-1 es capaz de dimerizarse o multimerizarse en presencia de netrina-1;

b) poner en contacto dicho medio con el compuesto a poner a prueba, conteniendo opcionalmente el medio ademas netrina-1, o un fragmento de la misma capaz de interactuar con el dominio extracelular del receptor de netrina-1;

c) determinar si la dimerizacion o multimerizacion del dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1 se inhibe en 10 presencia de dicho compuesto a poner a prueba;

d) opcionalmente, determinar (por ejemplo mediante el procedimiento de azul de tripano) si la presencia del compuesto a poner a prueba induce la muerte celular de dicha celula de mamnfero; y

e) seleccionar dicho compuesto si la determinacion en la etapa c) demuestra una inhibicion significativa de la dimerizacion o multimerizacion del dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1 y/o si la determinacion en la

15 etapa d) demuestra la muerte celular de dicha celula de mamnfero.

[0026] En un segundo aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento in vitro para predecir la presencia de un cancer metastasico o un cancer agresivo (tal como neuroblastoma) en un paciente que tiene un tumor primario a partir de una biopsia de dicho paciente que contiene celulas de tumores primarios, comprendiendo

20 dicho procedimiento las siguientes etapas de:

(a) medicion del nivel de expresion de netrina-1 en dicha biopsia.

[0027] En una realizacion preferida, el procedimiento para predecir de acuerdo con la presente invencion se 25 caracteriza porque en la etapa a) donde un incremento del nivel de expresion de netrina-1 en dicha biopsia, en

comparacion con la expresion de netrina-1 en biopsias de tumor primario no metastasico o en biopsias de cancer no agresivo es indicativo de la presencia de un cancer metastasico o un cancer agresivo.

[0028] En una realizacion mas preferida, el procedimiento para predecir de acuerdo con la presente invencion 30 se caracteriza porque una relacion superior a 2, preferentemente a 2,5, a 3, a 3,5, a 4, a 4,5 y a 5, entre la expresion

de netrina-1 en la biopsia a poner a prueba y en la biopsia de referencia no metastasica o no agresiva es indicativa de la presencia de un cancer metastasico o agresivo.

[0029] En un tercer aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para determinar in vitro la 35 eficiencia de un tratamiento anti-cancer para un paciente o para seleccionar pacientes que responden a un

tratamiento anti-cancer espedfico, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas de:

(a) obtener una biopsia de tumor primario de dicho paciente tratado; y

(b) medicion del nivel de expresion de netrina-1 en dicha biopsia,

40

donde la eficiencia de dicho tratamiento anti-cancer se correlaciona con la disminucion de la cantidad del nivel de expresion de netrina-1 medida en dicha biopsia, o donde los pacientes que responden a un tratamiento anti-cancer espedfico seleccionados son pacientes donde la cantidad del nivel de expresion de netrina-1 medido en su biopsia se ha reducido despues de dicho tratamiento espedfico.

45

[0030] En una realizacion preferida, el procedimiento para determinar in vitro la eficiencia de un tratamiento anti-cancer para un paciente o para seleccionar pacientes que responden a un tratamiento anti-cancer espedfico, se caracteriza porque dicho cancer indujo una sobreexpresion de netrina-1 y/o es un cancer metastasico o agresivo.

50 [0031] En una realizacion preferida, el procedimiento para prediccion o para determinar in vitro la eficiencia

de un tratamiento anti-cancer para un paciente se caracteriza porque el producto de expresion de netrina-1 medido es el ARN que codifica netrina-1, particularmente medido mediante un procedimiento de PCR inversa en tiempo real cuantitativa, o porque el nivel de expresion de netrina-1 que se mide es la medida del nivel de protema netrina-1, particularmente mediante un procedimiento que usa anticuerpos espedficos capaces de reconocer espedficamente 55 dicha protema netrina-1.

[0032] En una realizacion preferida, el procedimiento para prediccion o para determinar in vitro la eficiencia

de un tratamiento anti-cancer para un paciente se caracteriza porque el tumor primario es un tumor primario de un cancer seleccionado entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de pulmon,

neuroblastoma, glioma, leucemia mieloide aguda, sarcoma, melanoma, adenocarcinoma de ovario, adenocarcinoma renal adenocarcinoma pancreatico, adenocarcinoma de utero, adenocarcinoma de estomago, adenocarcinoma de rinon y adenocarcinoma rectal.

5 [0033] En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un kit para la seleccion de un compuesto para la

prevencion o el tratamiento de cancer, donde dicho kit comprende:

- una protema receptora de netrina-1, o un fragmento de la mismo capaz de interactuar espedficamente con la protema netrina-1 para formar un par de union, preferentemente protema recombinante; y

10 - protema netrina-1, o un fragmento de la misma capaz de interactuar espedficamente con dicho receptor de protema netrina-1 para formar un par de union, preferentemente protema recombinante.

[0034] Seleccionandose dicho receptor de netrina-1 preferentemente entre el grupo de DCC, UNC5H (particularmente UNC5H1, UNC5H2 y UNC5H3), neogenina y la adenosina A2b, mas preferentemente seleccionado

15 entre el grupo de DCC, UNC5H1, UNC5H2 y UNC5H3, mas preferentemente de mairnfero tal como de raton, rata o ser humano.

[0035] En una realizacion preferida, dicho kit comprende:

20 - celulas tumorales que expresan el receptor de netrina-1 y que expresan o sobreexpresan netrina-1, particularmente celulas de lmea celular tumoral metastasica, preferentemente seleccionadas entre el grupo que consiste en celulas 4T1, celulas CAL51, celulas T47D, celulas SKBR7, celulas IMR32, GL26 celulas y celulas H358, especialmente lmeas celulares CAL51, tales como lmea celular CAL51-36, que son mucho mas susceptibles a la muerte celular en respuesta a la presencia de DCC-EC-Fc.

25

[0036] En otro aspecto, la presente invencion comprende un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en:

- un compuesto que comprende un dominio extracelular del receptor de netrina-1 o fragmento del mismo capaz de inhibir espedficamente la interaccion entre la netrina-1 y dicho receptor de netrina-1, y/o capaz de inhibir la dimerizacion o multimerizacion de dicho receptor de netrina-1, o un fragmento del mismo, particularmente de inhibir el dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1; y

- un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido espedficamente contra netrina-1 o el receptor de netrina-1, particularmente dirigido al dominio extracelular de dicho receptor de netrina-1 o al fragmento de netrina-1 capaz de interactuar con el dominio extracelular de dicho receptor de netrina-1,

como un medicamento.

[0037] La secuencia de aminoacidos de netrina-1 humana o el receptor de netrina humana tal como 40 UNC5H1, UNC5H2 y UNC5H3 (homologo de Unc-5 1, 2 y 3 equivalente al homologo de Unc-5 A, B y C) son bien

conocidas por el experto en la materia. Ejemplos de estas secuencias de aminoacidos con la localizacion de su dominio particular pueden encontrarse en el Genbank con el numero de entrada AAD09221 o NP_004813 para netrina-1 humana, Np_588610 para el receptor de netrina humana homologo de Unc-5 1, Q8IZJ1 para el receptor de netrina homologo de Unc-5 2 y 095185 para el homologo de Unc-5 3.

45

[0038] Preferentemente, en los compuestos de la presente invencion, dicho dominio extracelular del receptor de netrina-1 o fragmento del mismo se selecciona entre el grupo de DCC, UNC5H (particularmente UNC5H1, UNC5H2 y UNC5H3), neogenina y la adenosina A2b, mas preferentemente seleccionada entre el grupo de DCC, UNC5H1, UNC5H2 y UNC5H3, mas preferentemente de marnffero tal como de raton, rata o ser humano.

50

[0039] En una realizacion mas preferida, dicho compuesto de acuerdo con la presente invencion comprende un dominio extracelular del receptor de netrina-1 de DCC, preferentemente dicho compuesto es DCC-EC-Fc o DCC- 5Fbn.

55 [0040] En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso del nivel de expresion de netrina-1 como

marcador para la identificacion de cancer metastasico en un paciente, preferentemente de cancer de mama o colorrectal metastasico, siendo el mas preferido el cancer de mama metastasico.

[0041] En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento de tratamiento para inducir la

30

35

apoptosis o la muerte celular de celulas tumorales que han adquirido la ventajas selectiva de escapar de la apoptosis inducida por receptores de dependencia de netrina-1, preferentemente por un nivel de netrina-1 elevado, en un paciente que comprende administrar un compuesto capaz de inhibir la interaccion entre netrina-1 y su receptor de netrina-1, un compuesto capaz de inhibir la dimerizacion o la multimerizacion del receptor de netrina-1, un 5 compuesto de acuerdo con la presente invencion, o seleccionado mediante el procedimiento de la presente invencion, a dicho paciente que lo necesita.

[0042] En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para la prevencion o para el tratamiento de cancer en un paciente que comprende administrar un compuesto de acuerdo con la presente

10 invencion, o seleccionado mediante el procedimiento de la presente invencion, a dicho paciente que lo necesita.

[0043] La presente invencion tambien comprende el uso de un compuesto de acuerdo con la presente invencion, o seleccionado mediante el procedimiento de la presente invencion, para la fabricacion de un medicamento para la prevencion o el tratamiento de cancer en mairnferos, incluyendo el ser humano.

15 Preferentemente dicho cancer es un cancer metastasico o agresivo.

[0044] Mas preferentemente, en el procedimiento de tratamiento o en el uso de un compuesto de acuerdo con la presente invencion, dicho cancer se selecciona entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de pulmon, neuroblastoma, glioma, leucemia mieloide aguda, sarcoma, melanoma,

20 adenocarcinoma de ovario, adenocarcinoma renal adenocarcinoma pancreatico, adenocarcinoma de utero, adenocarcinoma de estomago, adenocarcinoma de rinon y adenocarcinoma rectal.

[0045] Mas preferentemente, en el procedimiento de tratamiento o en el uso de un compuesto de acuerdo con la presente invencion, las celulas tumorales primarias de dicho cancer expresan o sobreexpresan netrina-1.

25

[0046] El termino “anticuerpo” tal como se usa en el presente documento se refiere a moleculas de inmunoglobulina y partes inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen un sitio de union al antigeno que se une espedficamente (inmunorreacciona con) la protema netrina-1 o su receptor.

30

[0047] El termino “anticuerpo” comprende anticuerpos monoclonales o policlonales pero tambien anticuerpos quimericos o humanizados.

[0048] Una protema netrina-1 o receptor de protema netrina-1 aislado, o un fragmento espedfico de los 35 mismos, pueden usarse como inmunogeno para generar anticuerpos que se unen a dicha protema usando tecnicas

estandar para preparacion de anticuerpos policlonales y monoclonales. Puede ser posible usar cualquier fragmento de estas protemas que contenga al menos un determinante antigenico puede usarse para generar estos anticuerpos espedficos.

40 [0049] Un inmunogeno de protema se usa habitualmente para preparar anticuerpos inmunizando un sujeto

adecuado, (por ejemplo, conejo, cabra, raton u otro mam^era) con el inmunogeno. Una preparacion inmunogena apropiada puede contener dicha protema, o fragmento de la misma, y puede incluir ademas un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, o agente inmunoestimulador similar.

45 [0050] Por lo tanto, el anticuerpo para uso de acuerdo con la invencion incluye anticuerpos policlonales,

monoclonales quimericos o humanizados, anticuerpos capaces de unirse selectivamente, o que se unen selectivamente a un epftopo que contiene un polipeptido que comprende un tramo contiguo de al menos 8 a 10 aminoacidos de una secuencia de aminoacidos de la protema netrina-1 o su receptor.

50 [0051] Un agente preferido para detectar y cuantificar ARNm o ADNc que codifica la protema netrina-1, es

una sonda de acido nucleico marcada o cebadores capaces de hibridar con este ARNm o ADNc. La sonda de acido nucleico puede ser un oligonucleotido de al menos 10, 15, 30, 50 o 100 nucleotidos de longitud y suficiente para hibridar espedficamente en condiciones rigurosas con el ARNm o ADNc. El cebador de acido nucleico puede ser un oligonucleotido de al menos 10, 15 o 20 nucleotidos de longitud y suficiente para hibridar espedficamente en 55 condiciones rigurosas con el ARNm o ADNc, o secuencia complementaria de los mismos.

[0052] Un agente preferido para detectar y cuantificar la protema netrina-1, es un anticuerpo capaz de unirse

espedficamente a esta protema, preferentemente un anticuerpo con una marca detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o mas preferentemente, monoclonales. Puede usarse un anticuerpo intacto, o un fragmento del

mismo (por ejemplo, Fab o F(ab')2). El termino “marcado/a”, con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende abarcar marcado directo de la sonda o anticuerpo acoplando (es decir, enlazando ffsicamente) una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, asf como marcado indirecto de la sonda o anticuerpo mediante reactividad con otro reactivo que esta marcado directamente. Los ejemplos de marcado indirecto incluyen deteccion de un anticuerpo primario usando 5 un anticuerpo secundario marcado de forma fluorescente y marcado en el extremo de una sonda de ADN con biotina, de modo que pueda detectarse con estreptavidina marcada de forma fluorescente.

[0053] Por ejemplo, tecnicas in vitro para la deteccion del ARNm candidato incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las tecnicas in vitro para la deteccion de la protema candidata incluyen ensayos

10 inmunoadsorbentes ligados a enzimas (ELISA), transferencias de Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las tecnicas in vitro para la deteccion de ADNc candidato incluyen hibridaciones de Southern.

[0054] Cuando la invencion abarca kits para cuantificar el nivel de protema netrina-1, el kit puede comprender un compuesto o agente marcado capaz de cuantificar estas protemas. Dichos agentes pueden estar envasados en

15 un recipiente adecuado. El kit puede comprender ademas instrucciones para usar el kit para cuantificar el nivel de la protema netrina-1 o del transcrito de netrina-1.

[0055] En ciertas realizaciones del procedimiento de la presente invencion, la determinacion de los transcritos de netrina-1 implica el uso de una sonda/cebador en una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), tal como PCR

20 anclada o RACE PCR, o, como alternativa, en una reaccion en cadena de la ligasa (LCR) (vease, por ejemplo, Landegran et al., 1988, Science 241: 23-1080; y Nakazawa et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. eE. UU., 91: 360-364), o como alternativa RT-PCR en tiempo real cuantitativa. Este procedimiento puede incluir las etapas de recoger una muestra de celulas de un paciente, aislar acido nucleico (por ejemplo ARNm) a partir de las celulas de la muestra, opcionalmente transformar el ARNm en el ADNc correspondiente, poner en contacto la muestra de acido nucleico

25 con uno o mas cebadores que hibridan espedficamente con la netrina-1 o el ARNm o si ADNc correspondiente en condiciones tales que la hibridacion y amplificacion del ARNm o ADNc de netrina-1 se producen, y cuantificar la presencia de los productos de amplificacion. Se preve que PCR y/o LCR pueden ser deseables para usar como una etapa de amplificacion junto con cualquiera de las tecnicas usadas para cuantificar la deteccion de acido nucleico.

30 [0056] Los procedimientos descritos en el presente documento pueden realizarse, por ejemplo, utilizando kits

de diagnostico envasados previamente que comprenden al menos una sonda de acido nucleico o conjunto de cebador o reactivo de anticuerpo descrito en el presente documento, que puede usarse convenientemente, por ejemplo, en entornos clmicos para seguir o diagnosticar pacientes.

35 [0057] Finalmente, la presente invencion se refiere al uso de oligonucleotidos antisentido o de ARNi (ARN

interferente) espedficos del acido nucleico que codifica la protema netrina-1 para la fabricacion de un medicamento destinado a prevenir o a tratar cancer metastasico o agresivo, preferentemente dicho cancer se selecciona entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de pulmon, neuroblastoma, glioma, leucemia mieloide aguda, sarcoma, melanoma, adenocarcinoma de ovario, adenocarcinoma renal adenocarcinoma

40 pancreatico, adenocarcinoma de utero, adenocarcinoma de estomago, adenocarcinoma de rinon y adenocarcinoma rectal.

[0058] El ARN interferente (ARNi) es un fenomeno en el que un ARN bicatenario (ARNbc) suprime espedficamente la expresion de un gen que porta su secuencia complementaria. El ARNi se ha convertido, por lo

45 tanto, en una herramienta de investigacion util para muchos organismos. Aunque el mecanismo mediante el cual el ARNbc suprime la expresion genica no se entiende completamente, datos experimentales proporcionan percepciones importantes. Esta tecnologfa tiene un gran potencial como una herramienta para estudiar la funcion genica en celulas de mamffero y puede conducir al desarrollo de agentes farmacologicos basandose en ARNip (ARN interferente pequeno).

50

[0059] Cuando se administra a un paciente, un compuesto de la presente invencion se administra preferentemente como componente de una composicion que opcionalmente comprende un veldculo farmaceuticamente aceptable. La composicion puede administrarse por via oral, o mediante cualquier otra via conveniente, y puede administrarse junto con otro agente biologicamente activo. La administracion puede ser

55 sistemica o local. Se conocen diversos sistemas de administracion, por ejemplo, encapsulacion en liposomas, micropartmulas, microcapsulas, capsulas, etc., y pueden usarse para administrar el compuesto de la presente invencion seleccionado o sales farmaceuticamente aceptables del mismo.

[0060] Las vfas de administracion incluyen, aunque no se limitan a, intradermica, intramuscular,

intraperitoneal, intravenosa, subcutanea, intranasal, epidural, oral, sublingual, intranasal, intracerebral, intravaginal, transdermica, por via rectal, por inhalacion, o por via topica. La via de administracion se deja a discrecion del facultativo. En la mayona de los casos, la administracion dara como resultado la liberacion del compuesto al torrente sangumeo o directamente en el tumor primario.

5

[0061] Las composiciones que comprenden el compuesto de acuerdo con la invencion o seleccionadas mediante los procedimientos de acuerdo con la presente invencion, tambien forman parte de la presente invencion. Estas composiciones pueden comprender adicionalmente una cantidad adecuada de un vehnculo farmaceuticamente aceptable para proporcionar la forma para administracion apropiada al paciente. La expresion “farmaceuticamente

10 aceptable” significa aprobado/a por una agencia reguladora o enumerada por una farmacopea nacional o reconocida para uso en animales, mairnferos, y mas particularmente en seres humanos. El termino “vetnculo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o transportador con el que se administra un compuesto de la invencion. Dichos vehnculos farmaceuticos pueden ser lfquidos, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen de petroleo, animal, vegetable o sintetico, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y 15 similares. Los vehnculos farmaceuticos pueden ser solucion salina, gelatina, almidon y similares. Ademas, pueden usarse agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. Tambien pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehnculos lfquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los vehnculos farmaceuticos adecuados tambien incluyen excipientes tales como almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, estearato sodico, monoestearato de glicerol, cloruro sodico, leche desnatada 20 deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua y similares. Composiciones de compuesto de ensayo, si se desea, tambien pueden contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes de pH. Las composiciones de la invencion pueden asumir la forma de soluciones, suspensiones, emulsion, comprimidos, pfldoras, microgranulos, capsulas, capsulas que contienen lfquidos, polvos, formulaciones de liberacion sostenida, supositorios, emulsiones, aerosoles, esprais, suspensiones, o cualquier otra forma adecuada 25 para uso. Dicha composicion esta formada generalmente de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composicion farmaceutica adaptada a seres humanos para administracion oral o para administracion intravenosa. La cantidad del compuesto activo que sera eficaz en el tratamiento pueden determinarse mediante tecnicas clmicas estandar. Ademas, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar intervalos de dosificacion optimos. La dosis precisa a emplear dependera tambien de la via de administracion, y la gravedad de la 30 enfermedad, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del facultativo y las circunstancias de cada paciente. Sin embargo, los intervalos de dosificacion adecuados para administracion oral, intranasal, intradermica o intravenosa son generalmente de aproximadamente 0,01 miligramos a aproximadamente 75 miligramos por kilogramo de peso corporal por dfa, mas preferentemente de aproximadamente 0,5 miligramos a 5 miligramos por kilogramo de peso corporal por dfa.

35

[0062] Se entendera, aunque la invencion se ha descrito junto con las realizaciones anteriores, que la descripcion anterior y los siguientes ejemplos pretenden ilustrar y no limitar el alcance de la invencion. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del alcance de la invencion seran evidentes para los expertos en la materia a la que se refiere la invencion.

40

Leyendas de las figuras

[0063]

45 Figuras 1A y 1B: la netrina-1 se sobreexpresa en tumores de mama metastasicos humanos

Figura 1A: perfil de expresion de netrina-1 examinado con PCR de transcripcion inversa en tiempo real cuantitativa. La Q-RT PCR se realizo usando ARN total extrafdo de 15 biopsias de tumor primario metastasico (barra maciza) y 15 no metastatico (barra hueca) con cebadores de netrina-1 humana espedficos 26 y cebadores correspondientes al 50 gen TBP humano (protema de union a TATA). En este caso se uso TBP como control, dado que muestra una variabilidad debil a nivel del ARNm entre tejidos normal y tumoral de mama, tal como se describe en 25 La expresion de netrina-1 se da como la relacion entre la expresion de netrina-1 en cada muestra y la expresion de netrina-1 promedio en las muestras no metastasicas.

Figura 1B: la Q-RT-PCR se realizo usando ARN total extrafdo de lmeas celulares de raton 67NR y 4T1 con 55 cebadores de netrina-1 de raton espedficos y el gen de raton RPLP0 como patron.

Figuras 2A-2D: la expresion forzada de netrina-1 en la lmea celular de raton 67NR conduce al desarrollo de metastasis

Figuras 2A y 2B: celulas 67NR transfectadas de forma simulada o celulas 67NR transfectadas de forma estable con netrina-1 (67NR-net) se sometieron a analisis de la expresion de netrina-1. Figura 2A, RT-PCR usando cebadores de netrina-1 de pollo espedficos se realizo usando ARN total extrafdo de 67NR-net1 y 67NR-mock. Figura 2B, se realizo transferencia de Western usando anticuerpos anti-myc (netrina-1 de pollo) o anti-netrinal.

5 Figura 2C: microfotograffas de los dos clones 67NR-net1 y 67NR-net2 en comparacion con 67NR parental y con la lmea celular 4T1.

Figura 2D: celulas 4T1 metastasicas, dos clones celulares de control que portan resistencia a puromicina (67NR1 y 67NR2) y dos clones celulares que expresan netrina-1 (67NRnet1 y 67NRnet2) se inyectaron en la almohadilla adiposa de 16 ratones (4 ratones por tipo celular) y se analizo la metastasis en el entorno del pulmon. 10 Microfotograffas representativas de nodulos sub-pleurales e intra-parenquimatosos despues de la inyeccion de los clones celulares respectivos (4T1, 67NR1, 67NRnetl, 67NRnet2). IPL: lesion intra-parenquimatosa, UPL: lesiones sub-pleurales.

Figuras 3A-3D: induccion de muerte de celulas metastasicas en raton inhibiendo la interaccion netrina- 15 1/receptor

Figura 3A: esquema que representa netrina-1 y sus receptores, DCC y UNC5H.

Figuras 3B, 3C, 3D: analisis cuantitativo de muerte celular en celulas 67NR y 4T1 usando DCC-EC-Fc e IL3-EC-Fc inespedfico como control (figura 3B), a diferente concentracion (figura 3C) o el dominio DCC-5Fbn mas restringido 20 (figura 3D) como competidor para la interaccion netrina-1/receptor. La muerte celular se cuantifico mediante el ensayo de exclusion con azul de tripano (figuras 3B, 3D) o mediante ensayo de actividad caspasa (figura 3C). Se indican las desviaciones estandar (n=3).

Figuras 4A y 4B: induccion de muerte de celulas metastasicas humanas inhibiendo la interaccion netrina- 25 1/receptor

Figura 4A: medicion cuantitativa de muerte de celulas CAL51 tratadas con diferente concentracion de DCC-EC-Fc mediante el ensayo de exclusion con azul de tripano.

Figura 4B: Analisis cuantitativo de muerte celular monitorizada mediante exclusion con azul de tripano en la lmea 30 celular parental CAL51 o en la lmea celular clonal CAL51-36, tratada o no con el competidor DCC-EC-Fc en medios de cultivo.

Figura 5: la netrina-1 se sobreexpresa en tumores de mama metastasicos humanos

Perfil de expresion de netrina-1 examinado con PCR de transcripcion inversa en tiempo real cuantitativa. La Q-RT 35 PCR se realizo usando ARN total extrafdo de 51 biopsias tumorales. Estas se obtuvieron a partir de la paciente con tumores localizados en la mama (N0, barra vada); con solamente implicacion del ganglio linfatico (N+, barra gris) y con metastasis distante en el diagnostico (M+, barra maciza). Se usaron cebadores de netrina-1 humana espedficos 39 y cebadores correspondientes al gen PBGD humano (protema de union a TATA). Se uso PBGD como referencia en este caso, dado que muestra una variabilidad debil a nivel del ARNm entre tejidos normal y tumoral de mama, tal 40 como se describe en 38 El otro TBP de referencia tambien se uso con resultados similares (no mostrado). La expresion de netrina-1 se da como la relacion entre la expresion de netrina-1 en cada muestra y la expresion de netrina-1 promedio en las muestras N0. Se uso una prueba de importancia estadfstica no parametrica (Mann- Whitney), se indica el valor p.

45 Figuras 6A-6C: induccion de muerte de celulas metastasicas inhibiendo la interaccion netrina-1/receptor

Figura 6A: DCC-EC-Fc desplaza la interaccion DCC/netrina-1 y UNC5H2/netrina-1. Ensayo ELISA con DCC-EC-Fc (panel superior) o UNC5H2-EC-Fc (panel inferior) revestido, y cuantificacion de netrina-1 unida usando anticuerpo anti-netrina-1 en presencia de una concentracion creciente de DCC-EC-Fc.

50 Figuras 6B y 6C: Analisis cuantitativo de muerte celular en celulas 67NR y 4T1 usando DCC-EC-Fc e IL3-EC-Fc inespedfico como control. La muerte celular se cuantifico mediante el ensayo de exclusion con azul de tripano (figura 6B), o mediante el ensayo de actividad caspasa (figura 6C). Se indican las desviaciones estandar (n=3).

Figuras 7A-7C: Inhibicion de la formacion de metastasis en ratones mediante tratamiento con DCC-5Fbn

55

Figura 7A: analisis cuantitativo de muerte celular en celulas 67NR y 4T1 tratadas con DCC-5Fbn. El ensayo MTT se realizo en celulas 67NR o 4T1 despues del tratamiento con dosis crecientes de DCC-5Fbn (|ig/ml). Se presenta el porcentaje de supervivencia celular. Se indican las desviaciones estandar (n=3).

Figuras 7B y 7C: se inyectaron i.v. celulas 4T1-luc en ratones BALB/c el dfa 0 y se inyectaron PBS o DCC-5Fbn

cada dos d^as, una vez i.v., una vez i.p. comenzando el d^a 0. Despues de 13 d^as, el desarrollo de metastasis se estudio mediante registro de luminiscencia (figuras 7B, 7C) o mediante examen de los pulmones en un microscopio. Figura 7B: una imagen representativa de registro de luminiscencia de ratones tratados con PBS (derecha) o tratados con DCC-5Fbn (izquierda).

5 Figura 7C: cuantificacion de la senal luminiscente medida mediante el sistema NightOwLB. El numero de foton^xel/s se cuantifico en cada animal y se da un mdice de senal luminiscente a la relacion entre el foton/raton promedio en ratones tratados con PBS con respecto a la senal promedio detectada en ratones tratados con DCC- 5Fbn. Se presentan dos experimentos independientes (se analizaron 20 ratones en el experimento 1, 8 ratones en el experimento 2).

10

Se ha realizado una fotograffa macroscopica representativa de un pulmon de ratones tratados con PBS o de ratones tratados con DCC-5Fbn (no mostrada) puede demostrarse en el pulmon de ratones tratados con PBS.

Figuras 8A y 8B: efecto de DCC-5Fbn sobre lineas celulares e cancer de mama humanas que expresan netrina-1

15

Figura 8A: expresion de netrina-1 examinada mediante Q-RT PCR usando ARN total extrafdo de 48 lineas celulares tumorales de mama diferentes. La expresion de netrina-1 se da como la relacion entre la expresion de netrina-1 y la expresion del gen de mantenimiento HMBS (hidroximetilbilano sintasa) en cada muestra. Tambien se uso TBP como control en este caso y dio resultados similares. Las dos lineas celulares que han sido seleccionadas por su elevado 20 nivel de netrina-1 se indican mediante asteriscos.

Figura 8B: induccion de muerte celular mediante DCC-5Fbn en lineas celulares SKBR7 y T47D. La muerte celular se cuantifico mediante ensayo MTT tal como se describe en la figura 4A (panel derecho) o mediante medicion de actividad caspasa tal como se describe en la figura 3D (panel izquierdo). Se indican las desviaciones estandar (n=3).

25 Figuras 9A y 9B: neuroblastoma humano

Figura 9A: la netrina-1 es un marcador de agresividad en neuroblastoma humano. Perfil de expresion de netrina-1 examinado con PCR de transcripcion inversa en tiempo real cuantitativa. La Q-RT PCR se realizo usando ARN total extrafdo de 101 biopsias de neuroblastoma de estadio 4 o 4s. Los tumores de estadio 4 diagnosticados en pacientes 30 que teman menos de un ano de edad (4<1 ano) o de estadio 4 diagnosticados en pacientes que teman mas de un ano de edad (4>1 ano). Puede observarse que canceres de mal pronostico (estadio 4 >1 ano) muestran una sobreexpresion significativa de netrina-1. Se usaron pruebas de la t de Student y se indican los valores p.

Figura 9B: celulas IMR32 que producen de forma endogena netrina-1 se trataron o no con DCC-5Fbn o como control ILR3 (el ectodominio del receptor de interleucina 3) y se analizaron para muerte celular midiendo la actividad 35 caspasa (parte superior) o midiendo la supervivencia celular mediante un ensayo MTT (abajo). Notese que aunque IL3R no tiene ningun efecto sobre la muerte de celulas IMR32, DCC-5Fbn induce una muerte de celulas IMR32 significativa. Se indican las desviaciones estandar (n=3).

Figuras 10A y 10B: glioma

40

Figura 10A: se sobreexpresa netrina-1 en una gran fraccion de glioma. Perfil de expresion de netrina-1 examinado con PCR de transcripcion inversa en tiempo real cuantitativa. La Q-RT PCR se realizo usando ARN total extrafdo de biopsias de oligodendroglioma de estadio II y estadio III y estadio IV y se comparo con cerebro humano normal. Figura 10B: celulas GL26 que producen de forma endogena netrina-1 (no mostradas) se trataron o no con DCC- 45 5Fbn en presencia o no de una cantidad en exceso de netrina-1 recombinante y se analizaron para muerte celular midiendo la actividad caspasa (parte superior) o midiendo la supervivencia celular mediante un ensayo MTT (abajo). Notese que DCC-5Fbn induce una muerte de celulas GL26 significativa y que su efecto es completamente inhibido por la adicion de netrina-1, demostrando de este modo que el efecto de DCC-5Fbn esta relacionado directamente con la inhibicion de netrina-1 endogena. Se indican las desviaciones estandar (n=3).

50

Figuras 11A-11C: cancer de pulmon

Figura 11A: la netrina-1 se sobreexpresa en una fraccion considerable de cancer de pulmon humano. Perfil de expresion de netrina-1 examinado con PCR de transcripcion inversa en tiempo real cuantitativa. La Q-RT PCR se 55 realizo usando ARN total extrafdo de biopsias de cancer de pulmon y se comparo con tejido normal.

Figura 11B: H358 y H460, dos lineas celulares de NSCLc, se usaron adicionalmente para ensayos de muerte celular. Celulas H358 que expresan de forma endogena netrina-1 y celulas H460 que no consiguen mostrar expresion de netrina-1 detectable se trataron o no con DCC-5Fbn en presencia o no de una cantidad en exceso de netrina-1 recombinante y se analizaron para muerte celular midiendo la actividad caspasa (parte superior) o

midiendo la supervivencia celular mediante un ensayo MTT (abajo). Notese que DCC-5Fbn induce una muerte de celulas H358 significativa pero no consigue mostrar un efecto sobre celulas H460. Ademas, el efecto de muerte observado en celulas H358 es completamente inhibido por la adicion de netrina-1. Junto con el hecho de que las celulas H460 no son sensibles a DCC-5Fbn, estos datos apoyan que celulas tumorales de pulmon que expresan 5 netrina-1 experimentan apoptosis en respuesta a DCC-5Fbn. Se indican las desviaciones estandar (n=3).

Figura 11C: DCC-5Fbn inhibe el crecimiento de tumor de H358 xenoinjertado en ratones desnudos. Ratones nu/nu atfmicos hembra de cinco semanas de edad (20-22 g de peso corporal) se obtuvieron de Charles River. Los ratones se alojaron en jaulas recubiertas con filtro esterilizadas y se mantuvieron en una instalacion animal libre de patogenos. Celulas H358 se implantaron mediante inyeccion s.c. de 5x106 celulas en 200 |il de PBS en el flanco 10 izquierdo de los ratones. Cuando los tumores se establecieron, PBS o 20 |ig de DCC-5Fbn se administraron al interior del tumor (i.t.) todos los dfas (la duracion del tratamiento se indica mediante flechas). Los tamanos del tumor se midieron mediante un calibre durante 41 dfas. El volumen del tumor se calculo con la formula v = (0,5*(longitud*anchura2))± SE,*) en 6 ratones tratados con DCC-5Fbn y 4 ratones tratados con PBS. Notese que, aunque se mostro que los ratones tratados con PBS credan, los tumores tratados con DCC-5Fbn mostraban una 15 regresion masiva.

Figuras 12A y 12B: la netrina-1 media la multimerizacion de DCC y UNC5H2

Figura 12A: multimerizacion de DCC en presencia de netrina-1 en celulas HEK293T. Lisados de celulas HEK293T 20 transfectadas transitoriamente con construcciones que expresan HA-DCC y/o c-myc-DCC junto o no con construccion que expresa netrina-1 se sometieron a arrastre “pull-down" de myc (IP a-myc). La presencia de DCC- HA se revelo con un anticuerpo anti-HA.

Figura 12B: dimerizacion de UNC5H2 en presencia de netrina-1 en celulas HEK293T. La transfeccion de celulas y la preparacion de lisado celular se realizaron como en (A) pero con construcciones que expresan HA-Unc5H2 y/o 25 FlagM2-UNC5H2. Los lisados celulares se sometieron a arrastre de FlagM2 (IP a-Flag). La presencia de HA- UNC5H2 se revelo con un anticuerpo anti-HA. Total: transferencia de Western en lisado antes del arrastre.

Figuras 13A y 13B: validacion del sistema quimicamente inducible para dimerizacion de UNC5H2

30 Figura 13A: representacion esquematica de construccion de fusion Fv2e-UNC5H2 que muestra las dos construcciones (una marcada con HA, la otra marcada con c-myc) usadas para validar el sistema de dimerizacion artificial.

Figura 13B: lisados de celulas HEK293T transfectadas de forma transitoria con Fv2E-UNC5H2 marcado con HA o c- myc con o sin el farmaco de dimerizacion (AP20187) se sometieron a arrastre de c-myc (IP a-myc). Total: 35 transferencia de Western en lisado antes del arrastre. La presencia de HA-Fv2E-UNC5H2 se revelo con anticuerpo anti-HA.

Figuras 14A-14C: la dimerizacion forzada de DCC bloquea su actividad proapoptotica

40 Figura 14A: la muerte celular inducida por DCC es inhibida por la dimerizacion inducida por AP20187, segun lo medido mediante exclusion con azul de tripano. Las celulas HEK293T se transfectaron con plasmido de simulacro (Cont.), Fv2E (Fv), Fv2E-DCC-IC (Fv-DCC) con o sin AP20187 (AP). En todas las condiciones, las celulas tambien se transfectaron con el marcador superficial pKk. Las celulas transfectadas que expresan el marcador se marcaron magneticamente con microperlas MACSelect y se separaron usando un separador MACS y columnas de separacion. 45 La exclusion con azul de tripano se ensayo en estas celulas purificadas.

Figura 14B: la muerte celular inducida por UNC5H2 es inhibida mediante dimerizacion inducida por AP20187, segun lo medido mediante exclusion con azul de tripano como en (A). Las celulas se transfectaron con pMACSKk y Fv2E (Fv), Fv2E-UNC5H2-IC (Fv-UNC5H2) con o sin AP20187 (AP).

Figura 14C: la activacion de caspasa inducida por UNC5H2 se inhibe mediante dimerizacion inducida por AP20187, 50 segun lo medido mediante actividad caspasa-3 relativa. Las celulas HEK293T se transfectaron con vector de simulacro pCMV (Cont.), Fv2E (Fv), Fv2E-UNC5H2-IC (Fv-UNC5H2) con o sin AP20187 (AP). El mdice de actividad caspasa relativa se presenta como la relacion entre la actividad caspasa de la muestra y la medida en celulas HEK293T transfectadas con pCMV. Se indican las desviaciones estandar (n=3).

55 Figuras 15A-15C: el quinto dominio de fibronectina soluble recombinante de DCC (DCC-5Fbn) inhibe la multimerizacion de DCC inducida por netrina-1

Figura 15A: la curva de afinidad de netrina-1 en DCC-5Fbn medida mediante ensayo ELISA muestra que DCC-5Fbn es capaz de unirse a netrina-1. Se aplico DCC-5Fbn (100 ng) o IL3-R (600 ng) y se anadieron dosis crecientes de

netrina-1 (de 0 a 800 ng). Los valores de IL3 se restaron a los valores de DCC-5Fbn. La Kd aproximada de DCC- 5Fbn/netrina-1 se estimo a 5 nM.

Figura 15B: ensayo de competicion. Como en (A) pero el dominio extracelular completo de DCC (DCC-EC, 125 ng) se aplico en lugar de DCC-5Fbn y se anadio netrina-1 (50 ng) en presencia de DCC-5Fbn (625 ng) o el DCC-EC 5 completo (125 ng). Notese que DCC-5Fbn no consigue competir con la interaccion DCC/netrina-1.

Figura 15C: la multimerizacion de DCC inducida por netrina-1 es inhibida por DCC-5Fbn. Lisados de celulas HEK293T transfectadas de forma transitoria con construcciones que expresan HA-DCC y/o c-myc-DCC con o sin netrina-1 (300 ng/ml) y/o DCC-5Fbn (900 ng/ml) se sometieron a arrastre de HA (IP a-HA). La presencia de c-myc- DCC se revelo con anticuerpo anti-c-myc. Total: transferencia de Western en el lisado antes del arrastre.

10

Figuras 16A y 16B: DCC-5Fbn antagoniza efectos de bloqueo de netrina-1 sobre la muerte celular inducida por DCC

Figura 16A: celulas HEK293T se transfectaron de forma transitoria con un simulacro (Cont.) o una construccion 15 DCC de longitud completa y se incubaron o no con netrina-1 (300 ng/ml) y/o DCC-5Fbn (800 ng/ml). La muerte celular se evaluo mediante tincion con azul de tripano.

Figura 16B: celulas de cancer de mama metastasico 4T1 se cultivaron en presencia (+ DCC-5Fbn) o ausencia (- DCC-5Fbn) de DCC-5Fbn (300 ng/ml) durante 24 horas y la muerte celular tambien se midio mediante ensayo de exclusion con azul de tripano. Se indican las desviaciones estandar (n=3).

20

Ejemplo 1: Materiales y procedimientos

Linea celular, cultivos celulares, procedimiento de transfeccion, reactivos e inmunotransferencias:

25 [0064] Las celulas 4T1 y 67NR fueron una amable donacion de F. Miller (Detroit, MI, EE. UU.). Cal51, MCF7,

MDA-MB231, 453, 361, 157, SK-BR3, CAMA-1, T47D se cultivaron usando un procedimiento estandar. Lmeas celulares de mama humana enumeradas en la figura 8B y mas espedficamente lmeas celulares T47D y SKB7 se obtuvieron de D. Birnbaun. Celulas 67NR se transfectaron de forma estable usando la seleccion de reactivo lipofectamina (Invitrogen) y puromicina (Sigma). Las transfecciones transitorias de celulas de rinon embrionario 30 humano 293T (HEK293T) se realizaron tal como se ha descrito anteriormente 10 de acuerdo con un procedimiento con fosfato calcico modificado o usando Lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). La lrnea celular 4T1 de cancer de mama se describio anteriormente 20 Celulas 4T1-luc se obtuvieron mediante transfeccion estable de un vector CMV-luciferasa que porta resistencia a higromicina. Se seleccionaron clones mediante intensidad de luminiscencia usando la luminoskan Ascent Station (Labsystems). Se realizaron 35 inmunotransfererencia tal como se ha descrito anteriormente 6 usando anti-c-myc (Sigma; 1/200) anti-FlagM2 (Sigma, 1/200) o anti-HA (Sigma; 1/500). El agente dimerizante artificial AP20187 era de Ariad Pharmaceuticals. El dominio extracelular completo de DCC (DCC-EC), DCC-EC-Fc se obtuvieron de R&D system y Netrina-1 de Apotech corp. Para el analisis de muerte celular, medicion de la actividad caspasa e inmunoprecipitacion, se uso AP20187 a una concentracion final de 10 nM y se uso netrina-1 a una concentracion final de 300 ng/ml.

40

Muestras de tumores de mama humanos:

[0065] 51 muestras de cancer de mama humano fueron proporcionadas por el banco de tumores del Centre Leon Berard. Tejido fresco del tumor se obtuvo durante cirugfa de mama antes de cualquier terapia sistemica y se

45 ultracongelaron en nitrogeno lfquido.

Mutagenesis dirigida y construcciones de plasmidos:

[0066] PGNET-1 pCMV y pGNET-1 que codifican netrina-1 de pollo eran tal como se ha descrito 50 anteriormente 6 pKk se describio 22 Los mutantes negativos dominantes para DCC (pCR-DCC-IC-D1290N) y para

UNC5H (pCR-uNC5H2-IC-D412N) se han descrito anteriormente 6,27,7. HA-DCC se obtuvo introduciendo una marca HA en la plantilla pCMV-DCC 6 mediante el sistema de mutagenesis dirigida QuikChange (Stratagene) usando los siguientes cebadores:

55 DCC-HA F (directo): 5'-CACAGGCTCAGCCTTTTATCCATATGATGTACCGGATTATGCATA

ACATGTATTTCTGAATG-3' (SEQ ID NO: 1); DCC-HA R (inverso): 5'-CATTCAGAAA

TACATGTTATGCATAATCCGGTACATCATATGGATAAAAGGCTGAGCCTGTG-3' (SEQ ID NO: 2). c-myc-DCC tambien se obtuvo introduciendo una marca c-myc en la plantilla pCMV-DCC mediante QuikChange usando los siguientes cebadores: DCC-myc F: 5'-

CACAGGCTCAGCCTTTGAGCAGAAGTTGATAAGTGAGGAAGATCTGTAACATG TATTTCTGAATG-3' (SEQ ID NO: 3). DCC-myc R: 5'- CATTCAGAAATACATGTTAC

AGATCTTCCTCACTTCTCAACTTCTGCTCAAAGGCTGAGCCTGTG-3' (SEQ ID NO: 4).

HA-Fv2E que codifica el vector de expresion (en pC4M) del kit Argent Regulated Homodimerization kit es de Ariad 5 Pharmaceuticals. A partir de este plasmido, se construyo el plasmido HA-Fv2E-DCC-IC. Un fragmento de PCR del dominio intracelular de DCC (1122-1447) se obtuvo con los cebadores: F 5'-

TATGTCGACCGACGCTCTTCAGCCCAGCAGAGA-3' (SEQ ID NO: 5) y R 5'-

TATGAATTCTTAGTCGAGTGCGTAGTCTGGTACGTCGTACGGATAAAAGGCTGA GCCTGTGATGGCATTAAG -3' (SEQ ID NO: 6).

10

[0067] El cebador inverso se fusiono a la marca HA en el extremo C-terminal de DCC. El fragmento de PCR

se subclono en HA-Fv2E mediante digestion por restriccion con SalI y EcoRI. El c-myc-Fv2E-DCC-IC se obtuvo usando el sistema de mutagenesis dirigida QuikChange (Stratagen) con pC4M-Fv2E-DCC-IC-HA como plantilla y los siguientes cebadores: cebador F: 5'

15 CTTAATGCCATCACAGGCTCAGCCTTTGAACAGAAACTCATCTCTGAAGAGGAT

CTGTAAGAATTCATAAAGGGCAAT-3' (SEQ ID NO: 7) y cebador R: 5'-

ATTGCCCTTTATGAATTCTTACAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGTTCAAAG GCTGAGCCTGTGATGGCATTAAG-3' (SEQ ID NO: 8).

20 [0068] HA-UNC5H2 (en pcDNA3.1) ya se ha descrito 7 las construcciones que codifican FlagM2-UNC5H2 se

generaron mediante clonacion en p3xFlag-CMVTM-7.1 (Sigma) el fragmento de PCR NotI-EcoRI derivado de HA- UNC5H2 como plantilla y los siguientes cebadores: cebador F 5'-GCGCGGCCGCAGGGCCCGGAGCGGG-3' (SEQ ID NO: 9) y cebador R 5'-CGGAATTCTCAGCAATCGCCATCAGTGGTC-3' (SEQ ID NO: 10).

25 [0069] HA-Fv2E-UNC5H2-IC- y c-myc-Fv2E-UNC5H2-IC en pC4M se generaron mediante amplificacion por

PCR del dominio intracelular de UNC5H2 usando los siguientes cebadores: UNC5H2-HA F 5'- CGGTCGACGTGTACCGGAGAAACTGC-3' (SEQ ID NO: 11) y UNC5H2-HA R 5'-

GCGAATTCTCATGCATAATCCGGCACATCATACGGATAGC AATCGCCATCAGTGGTC-3' (SEQ ID NO: 12), y UNC5H2-myc F 5'-CGGTCGACGTGTACCGGAGAAACTGC-3' (SEQ ID NO: 13) y UNC5H2-myc R 5'30 GCGAATTCTCACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGCAATCGCCATCA GTGGTC-3' (SEQ ID NO: 14) respectivamente. Los fragmentos de PCR se clonaron en HA-Fv2E mediante digestion de restriccion SalI y EcoRI.

35

40

[0070] El ADNc que codifica las protemas de fusion HA-Fv2E-UNC5H2-IC y c-myc-Fv2E-UNC5H2-IC se

subclono a continuacion en pcDNA3.1-TOPO mediante PCR usando los siguientes cebadores: Fv2E F 5'- CCACCATGGGGAGTAGCA-3' (SEQ ID NO: 15) y UNC5H2-HA R 5'-

TCATGCATAATCCGGCACATCATACGGATAGCAATCGCCATCAGTGGTC-3' (SEQ ID NO: 16), y Fv2E F 5'- CCACCATGGGGAGTAGCA-3' (SEQ ID NO: 15) y UNC5H2-myc R 5'-

TCACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGCAATC GCCATCAGTGGTC-3' (SEQ ID NO: 17)

respectivamente y HA-Fv2E-UNC5H2-IC y c-myc-Fv2E-UNC5H2-IC en pC4M como plantillas respectivas.

[0071] Ps974-DCC-5Fbn que permite la expresion bacteriana del quinto dominio de fibronectina tipo III de

DCC se obtuvo insertando un fragmento de ADN de Pst1/BamH1 generado mediante PCR usando pDCC-CMV-S como plantilla.

45 Produccion de DCC-5Fbn:

[0072] La produccion de DCC-5Fbn se realizo usando un procedimiento estandar. En resumen, celulas BL21 fueron forzadas a expresar DCC-5Fbn en respuesta a imidazol y el lisado de BL21 se sometio a cromatograffa de afinidad usando Flag-agarosa (Sigma).

50

Inmunoprecipitacion:

[0073] Se llevaron a cabo coinmunoprecipitaciones en celulas HEK293T transfectadas con diversas construcciones marcadas tal como se ha descrito anteriormente 27 En resumen, celulas HEK293T se lisaron en

55 HEPES 50 mM, pH 7,6, NaCl 125 mM, EDTA 5 mM y NP-40 al 0,1% en presencia de inhibidor de proteasa, y se incubaron adicionalmente con anti-HA (Sigma), anticuerpo anti-c-myc (Sigma), anti-FlagM2 (Sigma) y protema-A Sepharose (Sigma). Los lavados se realizaron en HEPES 50 mM pH 7,6, NaCl 125 mM, EDTA 5 mM.

Ensayo de union y ensayo ELISA de competicion:

[0074] DCC-5Fbn (100 ng) o IL3-R (R&D systems, 600 ng) se aplicaron sobre una placa maxisorp (Nunc) y se anadieron dosis crecientes de netrina-1 (Apotech) (0 a 800 ng) para el ensayo de union. DCC-EC (R&D systems, 125 ng) se aplico sobre una placa maxisorp para el ensayo ELISA de competicion. Netrina-1-FlagM2 (50 ng) y el

5 competidor DCC-EC (125ng) o DCC-5Fbn (625ng) se anadieron a continuacion simultaneamente. Despues de los lavados, para ensayo tanto de union como el ensayo ELISA de competicion, el netrina-1-FlagM2 residual aun fijado se revelo con un anticuerpo anti-FlagM2 (Sigma).

Ensayos ELISA con DCC/netrina-1:

10

[0075] DCC-EC-Fc (1,25 ng/ml) o UNC5H2-EC-Fc (0,5 ng/ml) se adsorbio sobre una placa maxisorp de 96 pocillos (Nunc) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Netrina-1 marcada con Flag (0,5 ng/ml) se anadio a continuacion junto con concentraciones crecientes de DCC-EC-Fc. Despues de una incubacion de 1 hora, las placas se lavaron exhaustivamente y la netrina-1 unida se detecto mediante inmunomarcado usando un anticuerpo anti-

15 flagM2 (Sigma) y un HRP de cabra anti-raton (Jackson). La medicion colorimertrica se realizo en la estacion Victor multimarca (Wallac).

Ensayos de muerte celular:

20 [0076] Se cultivaron 67NR, 4T1, CAL51, T47D y SKBR7 en medio pobre en suero y se trataron (o no) con

DCC-EC-Fc o DCC-5Fbn durante 24 horas. La muerte celular se analizo usando procedimientos de tincion con azul de tripano tal como se ha descrito anteriormente 6 El grado de muerte celular se presenta como el porcentaje de celulas positivas para azul de tripano en las diferentes poblaciones de celulas. Para seleccionar celulas transfectadas, las celulas se co-transfectaron con el marcador superficial pKk y los genes que codifican en plasmido 25 de interes. Las celulas transfectadas que expresan el marcador se marcaron magneticamente con microperlas MACSelect y se separaron usando un separador MACS y columnas de Separacion (Miltenyi Biotec). La exclusion con azul de tripano se ensayo en estas celulas purificadas. La supervivencia de las celulas tambien se midio mediante ensayo MTT usando el kit de ensayo Vybrant MTT (Molecular Probes) de acuerdo con los procedimientos del fabricante.

30

Medicion de actividad caspasa:

[0077] La actividad caspasa relativa se determino mediante analisis citometrico de flujo de la siguiente manera: 2x105 celulas tratadas se recogieron, se lavaron una vez en 1 ml de PBS, y se resuspendieron en 200 |il de

35 solucion de tincion que contema FITC-VAD-fmk (CaspACE, Promega). Despues de incubacion durante 60 min a 37°C, las celulas se lavaron en 1 ml de PBS y se resuspendieron en 200 |il de PBS para analisis por citometna de flujo. Las celulas tenidas se contaron usando un FACS Calibur (Becton Dickinson) y software de analisis CellQuest con ajustes de excitacion y emision de 488 nm y 525-550 nm (filtro FL1), respectivamente. La actividad caspasa-3 se midio usando el ensayo Caspase-3 de BioVision. La actividad caspasa se presenta como la relacion entre la 40 actividad caspasa de la muestra y la medida en celulas HEK293T transfectadas con pCMV. Para el analisis de la muerte celular y la medicion de la actividad caspasa, se anadieron AP20187 y/o netrina-1 y/o DCC-5Fbn en medio de cultivo celular 20 horas y 1 hora antes de recoger las celulas.

RT-PCR cuantitativa:

45

[0078] Para ensayar la expresion de netrina-1 en tumores de mama humanos, el ARN total se extrajo de biopsias de pacientes sometidas a cirugfa para cancer de mama usando el kit Nucleospin RNAII kit (Macherey- Nagel) y 1 |ig se transcribio de forma inversa usando el kit iScript ADNc Synthesis kit (BioRad). Se realizo RT-PCR cuantitativa en tiempo real en un aparato LightCycler 2.0 (Roche) usando el kit Light Cycler FastStart DNA Master

50 SYBERGreen I kit (Roche). Las condiciones de reaccion para toda la amplificacion optima, asf como seleccion del cebador de netrina-1, se determinaron como ya se ha descrito anteriormente 18 Los genes PBGD, TBP humanos y RPLP0 de raton expresados ubicuamente que mostraban la menor variabilidad en la expresion entre tejidos normal y tumoral de mama 25 28 se usaron como controles internos. Se usaron los siguientes cebadores:

55 PBGD:

- DIR 5'-CTGGAGTTCAGGAGTATTCGGGG-3' (SEQ ID NO: 18),

- INV: 5'-CAGATCCAAGATGTCCTGGTCCTT-3' (SEQ ID NO: 19);

TBP:

- DIR 5'-CACGAACCACGGCACTGATT-3' (SEQ ID NO: 20),

- INV: 5' TTTTCTTGCTGCCAGTCTGGAC 3' (SEQ ID NO: 21); netrina-1 humana-NTNI:

- DIR 5'-TGCAAGAAGGACTATGCCGTC-3' (SEQ ID NO: 22),

- INV: 5'-GCTCGTGCCCTGCTTATACAC-3' (SEQ ID NO: 23);

5 UNC5B:

- DIR 5'-TGCAGGAGAACCTCATGGTC-3' (SEQ ID NO: 24),

- INV: 5'-GGGCTGGAGGATTACTGGTG-3' (SEQ ID NO: 25);

DCC:

- DIR 5'-AGCCAATGGGAAAATTACTGCTTAC-3' (SEQ ID NO: 26),

10 - INV: 5'-AGGTTGAGATCCATGATTTGATGAG-3' (SEQ ID NO: 27);

UNC5C:

- DIR 5'-GCAAATTGCTGGCTAAATATCAGGAA-3' (SEQ ID NO: 28),

- INV: 5-GCTCCACTGTGTTCAGGCTAAATCTT-3' (SEQ ID NO: 29).

15 Ratones, inyecciones intravenosas y en la glandula mamaria, medicion del desarrollo de metastasis:

[0079] Modelo en raton singenico. Ratones BALB/cByJ hembra de 8-11 semanas de edad de Jackson Laboratory se usaron para cirugfa. Para inyeccion en la glandula mamaria de celulas 67NR, los ratones se anestesiaron con 2,2,2-tribromoetanol y 106 celulas en 50 |il de PBS se inyectaron en la glandula mamaria y los

20 ratones se sacrificaron cuando el tumor superaban los 1,5 cm y causaba impedimento al movimiento del animal. Para inyeccion intravenosa, 105 celulas 4T1-luc tumorales en 150 |il de PBS se inyectaron en una vena caudal y los ratones se sacrificaron el dfa 13-15 (despues de la inyeccion de celulas 4T1) o el dfa 20-23 (despues de la inyeccion de celulas 67NR) o se analizaron usando registro de luminiscencia. Cuando se sacrificaron los animales, los pulmones se extirparon, se pesaron y se compararon con el peso total del animal, y se contaron los nodulos 25 metastasicos.

Xenoinjerto en ratones desnudos:

[0080] Ratones atfmicos nu/nu de cinco semanas de edad (20-22 g de peso corporal) se obtuvieron de 30 Charles River. Los ratones se alojaron en jaulas recubiertas con filtro esterilizadas y se mantuvieron en una

instalacion animal libre de patogenos. Lmeas celulares de cancer de mama humano (SKBR7, T47D y H358) se implantaron mediante inyeccion s.c. de 5.106 celulas en 200 |il de PBS en el flanco izquierdo de los ratones. Cuando los tumores se establecieron (5 semanas para T47D, 2 semanas para SKBR7 y 5 dfas para H358), PBS o 20 |ig de DCC-5Fbn se administraron al interior del tumor (i.t.) todos los dfas durante 14 dfas. Los tamanos del tumor se 35 midieron mediante un calibre. El volumen del tumor se calculo con la formula v = 0,5*(longitud*anchura2).

Analisis del tumor:

[0081] Se prepararon secciones de pulmon de 4 |im de grosor y se tineron con hematoxilina-eosina-azafran. 40 Se realizo clasificacion y gradacion histologica de lesiones neoplasicas a ciegas y de acuerdo con procedimientos

estandar. Para imaginologfa in vivo de metastasis usando celulas 4T1-luc, la luz resultante de la oxidacion bioluminiscente de la luciferina libre de endotoxinas inyectada por via intra-peritoneal (Promega) (120 mg/kg de peso corporal) se detecto y se cuantifico (10 minutos despues de la inyeccion) con un sistema NightOWL LB 981 NC 100 de Berthold Technologies, usando un sistema de anestesia con isoflurano gaseoso de TEM SEGA.

45

Ejemplo 2: la netrina-1 dicta la metastasis de tumor de mama inhibiendo la apoptosis

[0082] En primer lugar se analizo netrina-1 y sus receptores de dependencia -es decir, la expresion de DCC y UNC5H mediante Q-RT-PCR en un panel de 30 tumores primarios de mama, 15 de los cuales fueron sin evolucion

50 metastasica conocida, y 15 que fueron metastasicos en el diagnostico. Aunque DCC era apenas detectable y UNC5H no consegrna mostrar un cambio significativo entre los dos tipos de tumores, netrina-1 parecfa estar significativamente mas expresada en tumores de mama metastasicos que en tumores de mama no metastasicos (figura 1A).

55 [0083] El 60% de los tumores de mama metastasicos ensayados mostraba una sobreexpresion de netrina-1

(intervalo de 1,4 a 9,6 veces, p<0,015) (Tabla 1).

Tabla 1: El porcentaje de muestras que muestran una expresion de netrina-1 mayor que la expresion promedio en

biopsias no metastasicas se indica, al igual que el intervalo de sobreexpresion.

n= 15

Metastasis Sin metastasis

% de tumores de mama que sobreexpresan netrina-1

60 33

Intervalo de sobreexpresion de netrina-1

1,4-9,6 1,6-2,9

[0084] En ratones, Miller y colegas desarrollaron un potente modelo para estudiar la biologfa de tumores 5 metastasicos frente a no metastasicos: a partir de un unico tumor mamario primario que se produda de forma

natural en un raton BALB/c, se obtuvieron una serie de lmeas celulares que mostraron diferentes potenciales metastasicos cuando se inyectaban en ratones singenicos. En particular, mientras que las celulas 67NR forman tumores mamarios primarios pero no metastasis, las celulas 4T1 forman tumores primarios y metastasis, especialmente en el pulmon, la medula osea y el tugado 20 Curiosamente, aunque no se consegrna detectar la 10 netrina-1 en celulas 67NR, la netrina-1 era altamente expresada en celulas 4T1 (figura 1B).

[0085] Para ensayar si el potencial metastasico de celulas 4T1, en comparacion con el de celulas 67NR, estaba relacionado con la expresion de netrina-1, celulas 67NR fueron forzadas a expresar de forma estable netrina- 1. Celulas 67NR transfectadas de forma simulada o celulas 67NR-net que expresan netrina-1 (figuras 2A, 2B) se

15 inyectaron en la glandula mamaria o i.v. y la metastasis se monitorizo mediante examen de anatoirna-patologfa de los pulmones. Ambas lmeas celulares no consiguieron formar metastasis cuando se inyectaron en la almohadilla adiposa, lo que sugiere que la presencia de netrina-1 en 67NR no es suficiente para permitir formacion de metastasis en el pulmon a partir del sitio primario. Sin embargo, cuando las celulas se inyectaron i.v., se detecto un incremento significativo de metastasis en los pulmones en las 67NR que expresan netrina-1 (figura 2C).

20

[0086] Vease la tabla 2 que muestra el numero de nodulos sub-pleurales (metastasis fuera del pulmon) e intra-parenquimatosos (metastasis en el pulmon).

Tabla 2:

Lesiones subpleurales Lesiones intraparenquimatosas (metastasis de pulmon)

Ratones inyectados con clon:

Numero de pulmones afectados Numero de nodulo por pulmon (intervalo) Numero de pulmones afectados Numero de nodulos por pulmon (intervalo)

67NR1

3 0-5 0 0

67NR2

2 0-2 0 0

67NR-net1

3 0-5 1 0-4

67NR-net2

1 0-3 2 1-2

25

[0087] Por lo tanto, la expresion de netrina-1 parece ser un evento crucial que apoya la formacion de metastasis, probablemente favoreciendo celulas tumorales despues de la intravasacion.

[0088] Dado que la netrina-1 parece ser suficiente para el potencial metastasico de celulas 67NR despues de

30 la intravasacion y, dado que la netrina-1 demostro inhibir la muerte celular inducida por los receptores de

dependencia de netrina-1 6, 7, 18, a continuacion se investigo si la produccion autocrina de netrina-1 proporciona una ventaja selectiva a las celulas 4T1 inhibiendo la muerte celular inducida por DCC/UNC5H en estas celulas. Un dominio ubicado en el extremo N de netrina-1 (el llamado dominio de laminina-VI) interactua con los receptores tanto DCC como UNC5H (figura 3A; 21), de modo que un dominio extracelular soluble de DCC (DCC-EC-Fc) pueda inhibir 35 la interaccion tanto de DCC/netrina-1 como de UNC5H/netrina-1 (no mostrado). A continuacion se anadio DCC-EC- Fc a un cultivo de celulas 4T1 y la muerte celular se monitorizo mediante un ensayo de exclusion con azul de tripano (figura 3B) o midiendo la actividad caspasa (figura 3C). Tal como se muestra en la figura 3C, la adicion de la protema competidora en el medio de cultivo desencadena la muerte de celulas 4T1 de manera dependiente de la dosis. Ademas, este efecto es espedfico, dado que DCC-EC-Fc no teman ningun efecto sobre la muerte de celulas 67NR 40 e IL3R-EC-Fc (el dominio extracelular del receptor de IL3) no consegrna desencadenar la muerte de celulas 4T1 (figuras 3B, 3C). Este efecto se debfa a la inhibicion de netrina-1, dado que la adicion de una cantidad en exceso de netrina-1, junto con DCC-EC-Fc inhida la capacidad proapoptotica de DCC-EC-Fc sobre celulas 4T1 (no mostrado). Para restringir la competencia a un dominio mas pequeno, se produjo el quinto dominio de fibronectina de tipo III de DCC, que se sabe que interactua con netrina-1 21. La adicion de este dominio -DCC-5Fbn- tema una actividad 45 proapoptotica similar sobre celulas 4T1 (figura 3D). Por lo tanto, aunque la netrina-1 parece otorgar potencial metastasico a celulas tumorales en ratones, estas celulas tumorales metastasicas que expresan netrina-1 pueden

ser inducidas hacia apoptosis mediante inhibicion de la interaccion netrina-1/receptores.

[0089] Para analizar adicionalmente si esto sigue siendo cierto en celulas tumorales de mama humanas, la

expresion de netrina-1 se analizo en un panel de lmeas celulares de cancer de mama metastasicas humanas (vease 5 la tabla 3).

Tabla 3:

Lmea celular de carcinoma de mama humana

Expresion transcripcional de netrina-1 Sensibilidad a DCC- EC-Fc

MDA-MB 157

+ + + + +/-

MCF-7

+ + + + -

CAMA-1

+ + + -

SKBR3

+ + ND

SAV-NUDE

+ + ND

Cal51

+ + + + +

MDA-MB231

+ + +

MDA-MB453

+ +

T47D

- ND

T47D*

+ + + +

*Llevada a cabo en otra lmea celular de T47D

Tabla 3 que muestra las diferentes lmeas celulares de mama metastasicas humanas analizadas para la expresion 10 de netrina-1 mediante Q-RT PCR como en las figuras 1A, 1B, y su sensibilidad a DCC-EC-Fc mediante medicion de la muerte celular mediante exclusion con azul de tripano. La cantidad relativa de la expresion de netrina-1 y la sensibilidad a DCC-EC-Fc se indican mediante (+), mientras que la ausencia de estos criterios se indica mediante (- ). En algunas lmeas celulares, el DCC-EC-Fc no se ha determinado (ND).

15 [0090] Como se esperaba, la netrina-1 se expresa en un gran numero de lmeas celulares metastasicas y

algunas de ellas experimentan apoptosis cuando se cultivan en presencia de DCC-EC-Fc. Como ejemplo, celulas CAL51 experimentaron apoptosis de manera dependiente de la dosis en respuesta a DCC-Ec-Fc. Como anteriormente, la adicion de netrina-1 en exceso revierte el efecto de DCC-EC-Fc, apoyando la opinion de que las protemas competidoras destruyen estas lmeas celulares humanas inhibiendo la interaccion netrina-1/receptores de 20 netrina-1. Ademas, una seleccion clonal de celulas CAL51 permitfa el establecimiento de una lmea celular CAL51- 36, que es mucho mas susceptible a muerte celular en respuesta a DCC-EC-Fc (figura 4B). Dado que DCC-EC-Fc o DCC-5Fbn pueden representar, como consecuencia, buenas herramientas para desencadenar apoptosis selectiva de celulas tumorales metastasicas humanas.

25 [0091] En este caso se muestra que la expresion de netrina-1 puede considerarse un marcador de

diseminacion de un tumor de mama. Mas de la mitad de los tumores de mama con propension a metastasis mostraban expresion de netrina-1 elevada. Tanto el modelo en ratones descrito anteriormente como los datos obtenidos en lmeas celulares de cancer de mama humano apoyan la opinion de que este elevado nivel de netrina-1 es una ventaja selectiva adquirida por la celula cancerosa para escapar a la apoptosis inducida por receptores de 30 dependencia de netrina-1 y, en consecuencia, para sobrevivir independientemente de la disponibilidad de netrina-1. Desde un punto de vista mecanicista, esta expresion autocrina de netrina-1 inhibe la muerte celular inducida por UNC5H. De hecho, DCC era apenas detectable en los dos grupos -metastasico y no metastasico- de canceres de mama estudiados, sugiriendo por lo tanto que DCC esta regulado negativamente pronto durante la tumorigenesis de mama o se expresa solamente debilmente en tejido de mama. Ademas, la inhibicion de apoptosis inducida por 35 UNC5H mediante coexpresion de una forma mutante negativa dominante de la actividad proapoptotica de UNC5H inhibe la muerte de celulas CAL51 en respuesta a DCC-EC-Fc (no mostrado). Esto puede encajar con la reciente observacion de que parte de la actividad proapoptotica de UNC5H2 pasa a traves de la activacion de la serina/treonina DAPK 22 una protema implicada en la regulacion de metastasis 23

40 [0092] Estas observaciones no solamente proporcionan evidencia de la importancia del par ligando/receptor

de dependencia en la regulacion del desarrollo del tumor, sino que tambien explican una nueva estrategia terapeutica. De hecho, a dfa de hoy, no existe ningun tratamiento eficiente para pacientes con cancer de mama metastasico, una falta de tratamiento que causa la muerte de 400.000 mujeres en el mundo al ano 24 En el presente documento, se propone que un tratamiento basado en la inhibicion de la interaccion entre netrina-1 y sus receptores

de dependencia podna afectar positivamente a la mitad de las pacientes que padecen cancer de mama metastasico. Estos tratamientos podnan incluir farmacos qmmicos, anticuerpos monoclonales o la protema DCC-5Fbn presentada en el presente documento. Si esto debe considerarse una estrategia que previene la formacion de metastasis, que implicana un tratamiento preventivo a largo plazo en mujeres diagnosticadas con cancer de mama primario, o como 5 una estrategia que podna usarse para inducir regresion de metastasis aun esta por demostrar. Futuros ensayos clmicos deben responder tambien a este punto.

[0093] En el presente documento se describe que, a diferencia de los tumores de mama no metastasicos

humanos, la mayona de los canceres de mama metastasicos muestra una sobreexpresion de netrina-1. En un 10 modelo en ratones, se demostro que, en celulas tumorales mamarias no metastasicas, la expresion forzada de netrina-1 se asocia con metastasis en los pulmones. Ademas, lmeas celulares tumorales metastasicas de raton o humanas, que demostraron expresar de manera elevada netrina-1, experimentan apoptosis cuando la interaccion netrina-1/receptores es inhibida por una protema competidora. Por lo tanto, la netrina-1 es un marcador para cancer metastasico humano tal como de mama metastasico y la inhibicion de la interaccion netrina-1/receptores representa 15 un enfoque terapeutico para inducir la muerte de celulas metastasicas.

Ejemplo 3: la restauracion de ruta de receptores de dependencia de netrina-1 activa la apoptosis en tumores de mama metastasicos

20 [0094] Netrina-1 y sus receptores de dependencia -es decir, la expresion de DCC, UNC5H2, UNC5H3 se

analizaron mediante Q-RT-PCR en un panel de 51 tumores de mama. Esto incluye pacientes cuyos tumores estaban localizados en la mama (N0, 16 pacientes), presentaban implicacion nodal (N+, 19 pacientes) o presentaban enfermedad metastasica distante en el momento del diagnostico (M+, 16 pacientes). Aunque DCC era apenas detectable y la expresion de UNC5H no consegrna presentar cambios significativos entre los diferentes tipos de 25 tumores (no mostrados), la netrina-1 se expresa significativamente mas en tumores N+ que en tumores N0 (mediana: 1,8 frente a 0,5, p=0,007) con un intervalo de expresion de netrina-1 mayor en tumores N+ (figura 5 y tabla 4).

Tabla 4: El porcentaje de muestras que muestra una expresion de netrina-1 mas elevada que la expresion promedio 30 en biopsias N0, 5 veces mayor o 15 veces mayor se indica, al igual que el intervalo de sobreexpresion.

n = 51

N0 localizado en la mama (n=16) N+ Implicacion nodal (n=19) M+ metastasis distante (n=16)

% de tumores de mama que sobreexpresan netrina-1

31 73,7 93,7

% de tumores de mama que sobreexpresan netrina-1.

Mas de 5 veces 0 31,5 62.5

Mas de 15 veces

0 0 37.5

Intervalo de sobre-expresion de Netrina-1

0,02-4,6 0,03-12,8 0,6-111,7

[0095] El 31,5% de los tumores N+ muestran al menos un incremento de 5 veces en la expresion de netrina-1 mientras que ningun incremento de este tipo se detecto en ninguno de los tumores N0 puestos a prueba (figura 5 y tabla 4). Una diferencia aun mas impactante se observa cuando se compara la expresion de netrina-1 en tumores

35 M+ frente a N0 (mediana: 7,8 frente a 0,5, p<0,0001). En esta lmea el 62,5% de los tumores M+ muestran al menos un incremento de 5 veces de la expresion de netrina-1. Una diferencia significativa en la expresion de netrina-1 tambien existe entre tumores N+ y M+ (mediana: 1,8 frente a 7,8, p=0,009). Ademas, la sobreexpresion de netrina-1 es mayor en tumores M+ que en tumores N+, dado que el 37,5% de los tumores M+ presentan un incremento de mas de 15 veces del nivel de netrina-1, mientras que un incremento de este tipo no se detecta en tumores N+ (figura

40 5 y tabla 4). Por lo tanto, la regulacion positiva de netrina-1 es un marcador de implicacion nodal y enfermedad metastasica distante en cancer de mama humano.

[0096] En ratones, Miller y colegas desarrollaron un potente modelo para estudiar la biologfa de tumores metastasicos frente a no metastasicos: a partir de un unico tumor mamario primario que se originaba de forma

45 natural en un raton BALB/c, se obtuvieron una serie de lmeas celulares que mostraban diferentes potenciales metastasicos cuando se inyectaban en ratones singenicos. En particular, aunque las celulas 67NR forman tumores mamarios primarios pero no metastasis, las celulas 4T1 forman tumores primarios y metastasis, especialmente en el pulmon, el tugado y la medula osea 20 Curiosamente, aunque no se consegrna detectar la netrina-1 en celulas 67NR, la netrina-1 se expresaba de manera elevada en celulas 4T1 (figura 1B).

[0097] Para ensayar en primer lugar si el potencial metastasico de las celulas 4T1, en comparacion con el de

las celulas 67NR, estaba relacionado con la expresion de netrina-1, celulas 67NR fueron forzadas a expresar de forma estable netrina-1. Celulas 67NR transfectadas de forma simulada o celulas 67NR que expresan netrina-1 5 (figuras 2A y 2B) se inyectaron en glandulas mamarias y la metastasis se monitorizo mediante examen anatomico- patologico. Ambas lmeas celulares no consiguieron formar de forma eficiente metastasis en el hngado o en los pulmones cuando se inyectaron en almohadillas adiposas de ratones (a 19 se les inyectaron celulas 67NR que expresaban netrina-1 y solamente dos sospechosos de micro-metastasis, uno en el pulmon y uno en el hngado se detectaron) (tabla 5).

10

Tabla 5: Metastasis en pulmones e hngado de 67NR inyectadas en la almohadilla plantar frente a celulas que expresan netrina-1. Un clon de celulas de control que portan resistencia a puromicina (67NR-mock), un clon de celulas que expresan netrina-1 (67NRnet1) y una poblacion policlonal de 67Nr transfectadas de forma estable con netrina-1 (67NR-net1-policlonal) se inyectaron en la almohadilla adiposa de ratones y la metastasis se analizo en el 15 ___________________________entorno del pulmon o del higado.____________________________

Celulas inyectadas

Ratones (n) Tumores primarios Metastasis Comentario

67NR-mock

9 9 0

67NR-net1

7 7 0 Sospecha de 1 micrometastasis en el hngado

67NR-net1 policlonal

12 12 0 Sospecha de 1 micrometastasis en el pulmon

[0098] Por lo tanto, la expresion de netrina-1 en celulas tumorales no es suficiente para permitir la formacion

de metastasis a partir del sitio primario.

20 [0099] Puesto que la netrina-1 mostro inhibir la muerte celular inducida por receptores de dependencia de

netrina-1 6, 7, 18, a continuacion se investigo si la produccion autocrina de netrina-1 detectada en celulas 4T1 metastasicas otorga una ventaja selectiva a estas celulas, inhibiendo la muerte celular inducida por DCC/UNC5H. Para ensayar esto, se busco un compuesto que puede valorar netrina-1. Se notifico que un dominio ubicado en el extremo N de netrina-1 (el llamado dominio de laminina-VI) interactua con los receptores tanto DCC como UNC5H

25 (figura 3A; 21). Se muestra que un dominio extracelular soluble de DCC (DCC-EC-Fc) puede inhibir la interaccion tanto DCC/netrina-1 como UNC5H2/netrina-1, segun lo medido mediante ensayo ELISA (figura 6A). DCC-EC-Fc se anadio a continuacion a un cultivo de celulas 4T1 y la muerte celular se monitorizo, mediante un ensayo de exclusion con azul de tripano (figuras 3B y 6B) o midiendo la actividad caspasa mediante citometria de flujo (figuras 3C y 6C). Tal como se muestra en las figuras 3B, 3C, 6B y 6C la adicion de la protema competidora al medio de cultivo

30 desencadena la muerte de celulas 4T1 de manera dependiente de la dosis. Este efecto es espedfico, dado que DCC-EC-Fc no terna ningun efecto sobre la muerte de celulas 67NR (figuras 3B, 3C, 6B y 6c) e IL3R-EC-Fc (el dominio extracelular del receptor IL3) no consegrna desencadenar muerte de celulas 4T1 (figura 3D). Por lo tanto, las celulas 4T1 sobreviven a la produccion autocrina de netrina-1, que bloquea la muerte celular inducida por receptores de netrina-1.

35

[0100] Dado que el dominio extracelular completo de DCC parece solamente de modesto interes para uso in vivo y en terapia (DCC-EC-Fc es de aproximadamente 1100 aminoacidos de tamano), se busco un polipeptido alternativo a partir del dominio extracelular de DCC, que podria desencadenar apoptosis en celulas 4T1. Se produjo, en consecuencia, el quinto dominio de fibronectina de tipo III de DCC, DCC-5Fbn, que se sabe que interactua con

40 netrina-1 21 (figura 3A). Curiosamente, esta protema de 100 aminoacidos no interfiere en la union de DCC/netrina-1 o UNC5H/netrina-1, pero afecta a la capacidad de netrina-1 de desencadenar multimerizacion de estos receptores (vease el ejemplo 4). Dado que la multimerizacion de DCC y UNC5H es un prerrequisito para la actividad inhibidora de netrina-1 sobre la muerte celular inducida por DCC/UNC5H, la adicion de DCC-5Fbn desencadena apoptosis en celulas que expresan DCC cultivadas en presencia de netrina-1 22 y desencadena la muerte de ambas 4T1 (figura

45 7A).

[0101] A continuacion se investigo si el efecto de muerte celular observado in vitro puede extenderse in vivo. Para hacer esto, celulas 4T1 se transfectaron de forma estable con un vector basado en luciferasa y las celulas 4T1- luc se inyectaron por via intravenosa (i.v.) en ratones BALB/c sinergicos. A los ratones se les inyectaron a

50 continuacion por via intraperitoneal (i.p.) e i.v (1 inyeccion cada dos dfas, una vez i.v., una vez i.p.) del dfa 0 al dfa 13 con tampon PBS o DCC-5Fbn marcado con Flag (1,25 |ig/raton g/inyeccion). La formacion de metastasis se analizo

a continuacion usando registro de luminiscencia. Tal como se muestra en las figuras 7B y 7C, cuando se inyectaron i.v., las celulas 4T1-luc colonizan eficientemente los pulmones. Por el contrario, los ratones tratados con DCC-5Fbn muestran una drastica reduccion de metastasis en el pulmon (figuras 7B y 7C). Esta inhibicion de la formacion de metastasis se confirmo a continuacion mediante examen anatomico-patologico de los pulmones, (no mostrado, 5 vease la tabla 6).

Tabla 6: el numero total de nodulos metastasicos pulmonares en ratones individuales se contaron en un microscopio

de diseccion en las dos poblaciones tratadas (+PBS, +DCC-5Fbn)

Tratamiento

Ratones (n) Promedio de metastasis por raton Intervalo de metastasis por raton

PBS

10 42,4 0-75

DCC-5Fbn

10 2,6 0-6

10 [0102] Se obtuvieron resultados similares cuando se realizo inyeccion i.p. diaria de DCC-5Fbn marcado con

GST en lugar de DCC-5Fbn marcado con Flag y GST-FADD en lugar de PBS (no mostrado). Por lo tanto, en ratones, la inhibicion mediante DCC-5Fbn de la actividad pro-supervivencia otorgada por la expresion autocrina de netrina-1 esta asociada con la prevencion de la metastasis.

15 [0103] La ventaja de supervivencia adquirida a traves de la expresion autocrina de netrina-1 no esta limitada

a celulas tumorales murinas, dado que se detecta en lmeas celulares de cancer de mama humano. De hecho, se demostro que la netrina-1 se expresaba en una fraccion considerable de lmeas de cancer de mama humano (figura 8A) y la adicion de DCC-EC-Fc o DCC-5Fbn a cultivos celulares de T47D o SKBR7 de adenocarcinoma de mama humano que expresan de forma natural netrina-1, desencadena la induccion de muerte celular medida mediante 20 ensayo de actividad caspasa-3 o ensayo MTT (figura 8B y no mostrado). Este efecto se debe a la inhibicion de netrina-1, dado que la adicion de una cantidad en exceso de netrina-1, inhibfa la capacidad proapoptotica de DCC- EC-Fc/DCC-5Fbn (no mostrado). Para monitorizar el efecto anti-tumoral de DCC-5Fbn, xenoinjertos de celulas T47D se implantaron en ratones desnudos. Cuando los tumores alcanzaban un tamano palpable, los ratones fueron tratados a diario con PBS o DCC-5Fbn y el volumen del tumor se determino durante 18 dfas. De forma similar a los 25 datos obtenidos en el modelo sinergico anterior, DCC-5Fbn inhibe completamente el crecimiento del tumor (tabla 7).

Tabla 7: que muestra el numero y el comportamiento de tumores T47D xenoinjertados que han sido tratados con PBS o DCC-5Fbn. Se indican el numero de tumores que han aumentado de tamano mas del 40% y el numero de _____________________tumores que tiene un tamano reducido (mas del 30%)_____________________

Tratamiento

Numero de ratones Crecimiento del tumor (> 40 %) Regresion del tumor (> 30 %)

PBS

4 3 0

DCC-5Fbn

5 0 3

30

[0104] En el presente documento se muestra que la expresion de netrina-1 puede considerarse un marcador

de la capacidad del tumor de mama de diseminarse. La mayona de los tumores de mama con propension a metastasis mostraban expresion de netrina-1 elevada. Tanto los datos obtenidos en lmeas celulares de cancer de mama humano/de raton como los modelos en raton sinergicos/de xenoinjerto humano descritos anteriormente 35 apoyan la opinion de que este elevado nivel de netrina-1 es una ventaja selectiva adquirida por la celula cancerosa para escapar a la apoptosis inducida por receptores de dependencia de netrina-1 y, en consecuencia, para sobrevivir independientemente de la disponibilidad de netrina-1. Desde un punto de vista mecanicista, en la patologfa humana, esta expresion autocrina de netrina-1 probablemente inhibe la muerte celular inducida por UNC5H. De hecho, DCC era apenas detectable en los diferentes grupos (N0, N+, M+) de canceres de mama 40 estudiados, lo que sugiere por lo tanto que DCC esta regulado negativamente temprano durante la tumorigenesis de mama o se expresa solamente debilmente en tejido de mama. Ademas, la inhibicion de apoptosis inducida por UNC5H mediante coexpresion de una forma mutante negativa dominante de la actividad proapoptotica de UNC5H inhibe la muerte de celulas de cancer de mama humano en respuesta a DCC-EC-Fc (no mostrado).

45 [0105] Por lo tanto, tal como se predijo mediante el modelo de receptor de dependencia, se ha demostrado

ahora que una celula tumoral puede escapar a la dependencia del receptor de dependencia de al menos tres maneras. En primer lugar, la expresion del receptor de dependencia puede estar regulada negativamente, tal como se ha descrito exhaustivamente para DCC y mas recientemente para UNC5H 15, 17, 19, 29 En segundo lugar, la senalizacion de muerte cadena abajo puede detenerse. En esta lmea, se demostro recientemente que la actividad 50 proapoptotica de UNC5H2 depende de la union de UNC5H2 a la serina/treonina DAPK 22, una propiedad que se demostro que esta implicada en la regulacion de metastasis y regulada negativamente en neoplasia humana 23 Analogamente, un reciente informe de Stupack y colegas muestra que, en el caso de algunas integrinas que actuan

como receptores de dependencia, la caspasa-8, que desencadena la muerte celular mediada por estas integrinas, es crucial para metastasis de neuroblastoma 30 En el presente documento se muestra que una tercera ventaja selectiva para la celula tumoral es la auto-produccion del ligando de dependencia. Queda una cuestion intrigante en cuando a por que los tumores de mama con propension metastasica parecen haber seleccionado preferentemente 5 auto-produccion de netrina-1 en lugar de perdida del receptor, mientras que los tumores colorrectales han seleccionado en su mayona perdida de los receptores en lugar de aumento de la expresion de netrina-1 - de hecho, solamente el 7% de los canceres colorrectales muestran un incremento de la expresion de netrina-1 18 Una posible explicacion es que la expresion de netrina-1 no solamente otorga un aumento de supervivencia a las celulas que migran, sino que tambien posiblemente un aumento en la senalizacion no apoptotica/positiva de receptores de

10 netrina-1. En esta lmea, es importante observar que la netrina-1 se describio originalmente como una senal de guiado 31, que, incluso aunque completamente sin demostrar, podna desempenar un papel en el tropismo de celulas metastasicas. Otros papeles propuestos de netrina-1 incluyen regulacion de adhesion y morfogenesis 32'34, ambos mecanismos que pueden ser de importancia para el desarrollo de metastasis. Analogamente, recientemente se propuso que la netrina-1 desempena un papel durante la angiogenesis embrionaria e incluso aunque se han

15 publicado resultados conflictivos 36'38, en esta fase no se puede descartar el papel de la netrina-1 como factor angiogenico que, de algun modo, podna favorecer el desarrollo de metastasis en el sitio secundario. Sin embargo, el amento de senalizacion “positiva” mediante expresion autocrina de netrina-1 probablemente no es suficiente per se para promover la metastasis, dado que la expresion forzada de netrina-1 en celulas no metastasicas no consegrna asociarse con la formacion de metastasis.

20

[0106] Estas observaciones no solamente proporcionan evidencia de la importancia de pares de ligando/receptores de dependencia en la regulacion del desarrollo de tumores, sino que tambien explican una nueva estrategia terapeutica. De hecho, a dfa de hoy, no existe ningun tratamiento eficiente para pacientes con cancer de mama metastasico, una falta de tratamiento que causa la muerte de 400.000 mujeres en el mundo al ano 24 En el

25 presente documento, se propone que un tratamiento basado en la inhibicion de la interaccion entre netrina-1 y sus receptores de dependencia podna afectar positivamente a la mitad de las pacientes que padecen cancer de mama metastasico, tal como cancer de mama -es decir pacientes que mostranan elevada expresion de netrina-1 en tumores primarios-. Estos tratamientos podnan incluir farmacos qmmicos, anticuerpos monoclonales o la protema DCC-5Fbn presentada en el presente documento.

30

Ejemplo 4: expresion de netrina-1 e inhibicion de la actividad netrina-1 en otros tumores humanos

[0107] A) La netrina-1 es un marcador de agresividad en neuroblastoma humano (vease la figura 9A, su leyenda y la tabla 8) e inhibir la actividad de netrina-1 promueve la muerte de celulas de neuroblastoma (vease la

35 figura 10B y su leyenda).

Tabla 8: 26 lmeas celulares de neuroblastoma (obtenidas directamente a partir de tumores de pacientes en el Centre Leon Berard (CLB-X) o lmeas celulares de neuroblastoma clasicas (IMR32, SHEP, SHSY o SKNAS)) se ensayaron como en (a) para expresion de netrina-1 mediante Q-RT-PCR. El nivel de netrina-1 se indica como (-) sin netrina-1,

40 (+, ++, +++) nivel de netrina-1 bajo a elevado. Puede observarse que una fraccion significativa de lmeas celulares

tienen expresion elevada de netrina-1.

Lmea celular

netrina-1

CLB-BAB

-

CLB-BAC

-

CLB-BAR

-

CLB-BARREC

-

CLB-BEL

+

CLB-BOULT

+ +

CLB-BER2

-

CLB-BERLUD

-

CLB-CAR

-

CLB-ESP

-/+

CLB-GAR

-

CLB-GHE MO

-

CLB-GHE PCT

-

CLB-HUT

+ + +

CLB-MAR MO

-/+

CLB-MAR LT

+

CLB-PEC

-

CLB-REM

+ + +

CLB-SED

+

CLB-TRA

-

CLB-VOL

+ + + +

IGRN91

-/+

IMR32

+ + +

SHEP

-/+

SHSY 5Y

-/+

SKNAS

+ + + +

B) La netrina-1 se sobreexpresa en una gran fraccion de glioma (vease la figura 10A y su leyenda) y la inhibicion de la actividad netrina-1 promueve la muerte de celulas de glioma (vease la figura 10B y su leyenda).

C) La netrina-1 se sobreexpresa en cancer de pulmon humano (vease la figura 11A, su leyenda y la tabla 9) y la 5 inhibicion de la actividad netrina-1 promueve la muerte de celulas de cancer de pulmon e impide el desarrollo de

cancer de pulmon (vease las figuras 12C y 12D y sus leyendas).

Tabla 9: Lmeas celulares de cancer de pulmon derivadas a partir de cancer de pulmon microdtico (SCLC) o cancer de pulmon no microdtico (NSCLC) se ensayaron como en (a) para la expresion de netrina-1 mediante Q-RT-PCR. El 10 nivel de netrina-1 se indicaba como (-) sin netrina-1, (+, ++) nivel de netrina-1 de bajo a elevado. Puede observarse

que una fraccion significativa de lmeas celulares tienen elevada expresion de netrina-1.

Lmea celular

netrina-1

NSCLC

A549

H322

+ +

H358

+ +

H460

-

H1299

+

SCLC

H69

-

H146

+

H196

-

D) Expresion de netrina-1 en otros tumores humanos.

Expresion de netrina-1 examinada mediante Q-RT PCR usando ARN total extrafdo de diferentes tumores humanos como en las figuras 10A-10B, 11A-11C, 12A-12B. La tabla 10 indica (n) el numero de tumores ensayados y el porcentaje de tumores que muestran una sobreexpresion de netrina-1 en cada patologfa.

Tabla 10:

Canceres

n sobreexpresion de netrina-1

Adenocarcinoma renal

5 40%

Leucemia mieloide aguda

55 62%

Sarcoma

10 30%

Melanoma

6 50%

Adenocarcinoma de ovario

14 93 %*

Adenocarcinoma pancreatico

7 57%

Adenocarcinoma de utero

42 19%

Adenocarcinoma de estomago

27 26%

Adenocarcinoma de rinon

20 50%

Adenocarcinoma rectal

18 17%

*100% de las 7 muestras metastasicas

Ejemplo 5:

10 [0108] Para analizar si DCC estaba en su forma monomerica a menos que netrina-1 estuviera presente, se

coexpresaron de forma transitoria un DCC de longitud completa marcado con HA con DCC de longitud completa marcado con c-myc en celulas HEK293T. A continuacion se realizo inmunoprecipitacion usando un anticuerpo anti-c- myc y, tal como se muestra en la figura 12A, a pesar de una buena expresion de DCC marcado tanto con HA como con c-myc, HA-DCC estaba incluido solamente modestamente en el arrastre de c-myc-DCC en ausencia de ligando, 15 sugiriendo que DCC, estaba principalmente presente como un monomero cuando se expresaba en HEK293T en ausencia de netrina-1. En las mismas condiciones experimentales, cuando se anadio netrina-1 al medio de cultivo (no mostrado y figura 15C) o cuando una construccion de expresion de netrina-1 se coexpreso con las construcciones que expresan DCC (figura 11A), HA-DCC estaba claramente incluido en el arrastre de c-myc DCC, demostrando por lo tanto que la netrina-1 desencadena la dimerizacion o multimerizacion de DCC. Este resultado 20 concuerda con datos de Tessier-Lavigne y colegas que notificaron en primer lugar la multimerizacion inducida por netrina-1 46, incluso aunque en las condiciones de cultivo e inmunoprecipitacion, DCC presenta un modesto aunque detectable nivel de multimerizacion en ausencia de netrina-1. Este bajo nivel de multimerizacion constitutivo, podna atribuirse a la baja afinidad de receptores de DCC por sf mismos en ausencia de ligando o al sistema usado, que se basa en expresion forzada de niveles elevados de receptores transmembrana.

25

[0109] A continuacion se investigo si los otros receptores de netrina-1 UNC5H comparten un comportamiento

similar. Celulas HEK293T se transfectaron transitoriamente con un UNC5H2 de longitud completa marcado con HA junto con UNC5H2 de longitud completa marcado con Flag en presencia o ausencia de netrina-1. A continuacion se realizo inmunoprecipitacion usando un anticuerpo anti-FlagM2. Tal como se muestra en la figura 11B, la presencia 30 de netrina-1 desencadena una inmunoprecipitacion eficiente de HA-UNC5H2 con Flag-UNC5H2. Por lo tanto, aunque en ausencia de netrina-1, DCC y UNC5H2 estan principalmente en formas monomericas, tanto DCC como UNC5H2 muestran una propension incrementada a multimerizar en presencia de netrina-1.

[0110] Para determinar si la multimerizacion inducida por netrina-1 es la etapa crucial para inhibir la muerte

35 celular proapoptotica de DCC/UNC5H2, se desarrollo un sistema quimerico en el que la dimerizacion de protemas puede ser inducida por un agente qmmico. Este sistema se uso con exito para mostrar tanto el papel de la dimerizacion de caspasa-8 en la activacion de caspasa-8 49 como la importancia de multimerizacion de p75ntr en actividad proapoptotica de p75ntr 48 Este sistema se deriva de la capacidad del compuesto Fk1012 de dimerizar de forma cruzada el motivo FkBP. Los dominios intracelulares de DCC y UNC5H2 se fusionaron en su extremo N a 40 motivos Fv2e FkBP derivados y la dimerizacion se indujo usando el compuesto qmmico AP20187 (figura 13A). En primer lugar, se analizo si el sistema desarrollado recapitula la multimerizacion inducida por netrina-1 del dominio intracelular de UNC5H2. Celulas HEK293T se cotransfectaron con un Fv2e-UNC5H2-IC marcado con HA junto con Fv2e-UNC5H2-IC marcado con c-myc y se realizaron coinmunoprecipitaciones usando un anticuerpo anti-c-myc. Tal como se muestra en la figura 13B, sin adicion de AP20187, HA-Fv2e-UNC5H2-IC era apenas detectable en el 45 arrastre de c-myc-Fv2e-UNC5H2-IC, apoyando por lo tanto que Fv2e-UNC5H2-IC se expresa en celulas HEK293T principalmente como un monomero. Como se esperaba, la adicion de AP20187 causo el eficiente arrastre de HA-

Fv2e-UNC5H2-IC con c-myc-Fv2e-UNC5H2-IC. Se obtuvieron resultados similares con Fv2e-DCC-IC (no mostrados). Por lo tanto, este sistema de dimerizacion recapitula la dimerizacion del dominio intracelular de los receptores de netrina-1 DCC y UNC5H2.

5 [0111] Puesto que este sistema de dimerizacion de DCC/UNC5H2 qmmicamente inducible parece funcionar

adecuadamente para imitar multimerizacion de DCC/UNC5H2 inducida por netrina-1, a continuacion se evaluo si la dimerizacion de DCC/UNC5H2 era suficiente para inhibir la actividad proapoptotica de DCC/UNC5H2. Celulas HEK293T fueron forzadas a expresar Fv2e-DCC-IC en presencia o ausencia de AP20187 y la muerte celular se evaluo mediante tincion con azul de tripano, tal como se ha descrito anteriormente, para medir la muerte celular

10 inducida por DCC 6, 27 Tal como se muestra en la figura 14A, la expresion de Fv2e-DcC-IC estaba asociada con muerte celular incrementada en comparacion con la expresion de los motivos Fv2e sin la fusion DCC-IC. Curiosamente, cuando se anadio AP20187, la muerte celular inducida por Fv2e-DCC-IC se redujo drasticamente (figura 14A). Analogamente, aunque Fv2e-UNC5H2-IC desencadena muerte celular (figura 14B) o activacion de caspasa (figura 14C) cuando se expresaba en HEK293T en ausencia de AP20187, la adicion del farmaco

15 dimerizante es suficiente para reducir significativamente la muerte celular inducida por Fv2e-UNC5H2-IC (figura 14B)

0 la activacion de caspasa (figura 14C). Por lo tanto, aunque DCC-IC y UNC5H2-IC monomericos son proapoptoticos, las formas multimericas de DCC-IC o UNC5H2-IC ya no presentan actividad proapoptotica. Por lo tanto, la capacidad de netrina-1 para inhibir la actividad proapoptotica de DCC/UNC5H2 esta enlazada intrmsecamente a la capacidad de netrina-1 de multimerizar DCC o UNC5H2, dado que este proceso de

20 multimerizacion es suficiente para detener la actividad proapoptotica de DCC y UNC5H2.

[0112] Un modelo atractivo sena que la forma monomerica de DCC o UNC5H2 tenga una conformacion espacial que se somete facilmente a la escision por caspasa inicial del dominio intracelular del receptor. Por el contrario, la presencia del ligando causana multimerizacion del dominio intracelular, que de algun modo se vuelve

25 menos accesible a escision por caspasa. En esta lmea, Arakawa y colegas han demostrado que la escision por caspasa de UNC5H2 es inhibida por la presencia de netrina-1 47 Hasta ahora, debido a limitaciones tecnicas, no se ha podido detectar escision de DCC o UNC5H2 en celulas forzadas a expresar las protemas de fusion Fv2e. Un modelo alternativo a la inhibicion de la escision sena que la multimerizacion del receptor inducida por netrina-1 desencadena una senal de supervivencia, que de algun modo inhibe una actividad proapoptotica constitutiva de

30 DCC o UNC5H2 relacionada con escision de caspasa constitutiva. Sin embargo, no se consiguio demostrar que las rutas de senalizacion positivas conocidas activadas por DCC tras la union de netrina-1 estan implicadas en la actividad inhibidora de netrina-1 sobre la actividad proapoptotica de DCC. Por ejemplo, netrina-1 induce activacion mediada por DCC de ERK-1/2 3, quinasas que se sabe que presentan un efecto anti-apoptotico. Sin embargo, los inhibidores clasicos de la ruta de ERK-1/2, aunque afectan a la fosforilacion de ERK-1/2 inducida por netrina-1, no

35 consiguieron bloquear el efecto inhibidor de netrina-1 sobre la actividad proapoptotica de DCC (Forcet y Mehlen, no publicado). Por lo tanto, es probable que la multimerizacion de DCC inducida por netrina-1 afecte a la accesibilidad intracelular de DCC. Sin embargo, aun esta por demostrar si esto es cuestion de simple estequiometna, o si el acercamiento de los dominios extracelulares induce un cambio de conformacion dentro de los compartimentos intracelulares.

40

[0113] Si los mecanismos que subyacen en la multimerizacion del receptor inducida por netrina-1 aun estan por describir, la observacion de que la multimerizacion de DCC/UNC5H2 inducida por netrina-1 es suficiente para inhibir la muerte celular inducida por DCC/UNC5H2 puede representar una herramienta interesante para activar la actividad proapoptotica de DCC o UNC5H in vivo, en tumores en los que netrina-1 se expresa de manera autocrina.

45 De hecho, se ha demostrado que la sobreexpresion de netrina-1 en el intestino de ratones esta asociada con el desarrollo de tumores intestinales debido a la inhibicion de la apoptosis 18 y recientemente se observo que la netrina-

1 se sobreexpresa en la mayona de canceres de mama metastasicos humanos. Ademas, el mecanismo de la sobreexpresion de netrina-1 parece ser una ventaja selectiva adquirida de celulas tumorales metastaticas para supervivencia en entornos de ausencia ambiental de netrina-1 (vease los ejemplos 2 y 3). Por lo tanto, inhibir la

50 dimerizacion de DCC/UNC5H representana supuestamente una manera interesante de desencadenar apoptosis de celulas tumorales.

[0114] En esta lmea, el quinto dominio de fibronectina de DCC ha demostrado ser un dominio de interaccion con netrina-1 (figura 15A y 21), incluso aunque tambien se han notificado datos conflictivos 43 En primer lugar se

55 evaluo, por lo tanto, si un quinto dominio de fibronectina soluble recombinante de DCC (DCC-5Fbn) podna unirse a netrina-1 recombinante. El ensayo ELISA demuestra que DCC-5Fbn se une espedficamente a netrina-1, al contrario que el dominio extracelular de un receptor no relacionado, IL3-R (figura 15A). La Kd aproximada para DCC- 5Fbn/netrina-1 se estimo de forma grosera en 5 nM, ajustandose al orden de magnitud de la Kd de DCC/netrina-1 descrita. A continuacion se investigo si este dominio era suficiente para desplazar la interaccion DCC/netrina-1. Tal

como se muestra en la figura 15B, usando un ensayo ELISA en el que el dominio extracelular de DCC estaba revestido y se detecto interaccion netrina-1/DCC mediante inmunorreactividad de netrina-1, se observo que, aunque como control positivo el dominio extracelular completo de DCC (DCC-EC) era suficiente para desplazar la interaccion DCC/netrina-1, DCC-5Fbn no consegma interferir. Por lo tanto, DCC-5Fbn interactua con netrina-1 pero no es 5 suficiente para inhibir la interaccion DCC/netrina-1. A continuacion se investigo si DCC-5Fbn podna influir en la multimerizacion de DCC. A continuacion se realizo coinmunoprecipitacion en HEK293T transfectadas de forma transitoria con DCC de longitud completa marcado con HA junto con DCC de longitud completa marcado con c-myc en presencia o ausencia de netrina-1. Tal como tambien se describe en la figura 1A, la presencia de netrina-1 desencadena la inmunoprecipitacion de HA-DCC con c-myc-DCC, demostrando multimerizacion de DCC inducida

10 por netrina-1 (figura 15C). Sin embargo, cuando las celulas incubadas con netrina-1 tambien se trataron simultaneamente con DCC-5Fbn, la interaccion HA-DCC/c-myc-DCC volvfa a niveles no tratados con netrina-1. Por lo tanto, DCC-5Fbn interactua con netrina-1 en una region responsable del acercamiento mediado por netrina-1de dos o mas moleculas de DCC y es capaz de inhibir la multimerizacion de DCC inducida por netrina-1.

15 [0115] A continuacion se ensayo si DCC-5Fbn podna desencadenar, en consecuencia, muerte celular

inducida por receptores de netrina-1. Para este fin, celulas HEK293T fueron forzadas a expresar DCC en presencia o ausencia de netrina-1, con o sin DCC-5Fbn, y la muerte celular se determino mediante ensayo de exclusion con azul de tripano (figura 16A). Tal como se muestra en la figura 16A, aunque DCC desencadena apoptosis en ausencia de netrina-1, una actividad proapoptotica bloqueada por la presencia de netrina-1, la presencia de DCC-

20 5Fbn es suficiente para bloquear la actividad inhibidora de netrina-1, causando de este modo muerte celular inducida por DCC. Dado que el sistema de celulas HEK293T usa expresion ectopica de netrina-1, a continuacion se ensayo DCC-5Fbn en un modelo mas relevante biologicamente. Recientemente se demostro que, en comparacion con canceres de mama no metastasicos, la mayona de canceres de mama metastasicos humanos sobreexpresa netrina-

1. Tambien hemos demostrado que la valoracion cuantitativa de netrina-1 sobreexpresada desencadena apoptosis

25 de celulas tumorales in vitro e inhibicion de metastasis en ratones (vease los ejemplos 2 y 3). Muchas lmeas celulares de tumor de mama parecen expresar netrina-1 y se ha demostrado que la valoracion cuantitativa de netrina-1 celulas 4T1 de carcinoma de mama de ratones desencadena apoptosis (vease los ejemplos 2 y 3). Tal como se muestra en la figura 16B, la adicion de DCC-5Fbn a un cultivo de celulas 4T1 esta asociada con muerte celular incrementada.

30

[0116] En conjunto, se ha demostrado en el presente documento que la multimerizacion de los receptores de dependencia DCC y UNC5H es un mecanismo suficiente para bloquear su actividad proapoptotica. Curiosamente, el mecanismo inhibidor parece copiar el que se observa con los receptores de muerte. De hecho, se sabe que TNFr o Fas requiere trimerizacion para inducir apoptosis 45 Esta diferencia intnnseca puede representar, por lo tanto, un

35 valor anadido para estrategias terapeuticas que usan receptores de dependencia. De hecho, la busqueda de moleculas terapeuticas en el pasado condujo principalmente a impactos que actuan sobre la inhibicion de procesos celulares -por ejemplo, inhibidores de quinasas, inhibidores de IAP- en lugar de activadores. Como consecuencia, la inhibicion de multimerizacion de receptores de netrina-1 mediante el uso de DCC-5Fbn recombinante o mediante cualquier compuesto cribado para interferir en la multimerizacion del receptor parece una estrategia atractiva para el

40 tratamiento de canceres en los que se ha adquirido expresion autocrina de netrina-1.

[0117] En el presente documento, se demuestra que la netrina-1 desencadena la multimerizacion de los receptores tanto DCC como UNC5H. Usando un sistema en el que la dimerizacion es qmmicamente inducida, se demostro que la multimerizacion del dominio intracelular de receptores de netrina-1, tales como DCC y UNC5H2, es

45 la etapa cntica para inhibir su actividad proapoptotica. Se propuso, por lo tanto, un modelo en el que receptores de dependencia de netrina-1 monomericos son proapoptoticos, mientras que su multimerizacion, inducida por netrina-1, suprime su actividad proapoptotica. Usando esta propiedad, se propone el uso de un dominio espedfico recombinante de la region extracelular de DCC que (i) interactua con netrina-1 y (ii) inhibe la multimerizacion inducida por netrina-1, para desencadenar la apoptosis de celulas tumorales.

50

Referencias

[0118]

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55

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Claims (31)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para seleccionar un compuesto para la prevencion o el tratamiento de cancer, seleccionandose dicho cancer a prevenir o tratar entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer de pulmon,

   5 neuroblastoma, glioma, leucemia, sarcoma, melanoma y adenocarcinoma, donde dicho cancer a prevenir o tratar es un cancer donde celulas tumorales expresan o sobreexpresan netrina-1, donde dicho procedimiento comprende las siguientes etapas de:

   a) tener un medio que contiene netrina-1, o un fragmento de la misma, y un receptor de netrina-1, o un fragmento del 10 mismo, donde:

   - dicha netrina-1, o un fragmento de la misma, y dicho receptor de netrina-1, o un fragmento del mismo, son capaces de interactuar espedficamente entre sf para formar un par de union, y/o

   - dicha netrina-1, o un fragmento de la misma, es capaz de inducir la dimerizacion o multimerizacion del dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1;

   15

   b) poner en contacto dicho medio con el compuesto a poner a prueba;

   c)

   - medir la inhibicion de la interaccion entre netrina-1, o un fragmento de la misma, y dicho receptor de netrina-1, o un 20 fragmento del mismo, y/o

   - determinar si dicho compuesto inhibe la dimerizacion o multimerizacion de dicho receptor de netrina-1, o un fragmento del mismo, particularmente la dimerizacion del dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1; y

   d) seleccionar dicho compuesto si:

   - la medicion en la etapa c) demuestra una inhibicion significativa de la interaccion entre netrina-1, o un fragmento de 25 la misma, y el receptor de netrina-1, o un fragmento del mismo, en presencia de dicho compuesto, y/o

   - la determinacion en la etapa c) demuestra una inhibicion significativa de la dimerizacion o multimerizacion, en presencia de dicho compuesto, del dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1.
2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, donde dicho adenocarcinoma a prevenir o tratar 30 se selecciona entre el grupo que consiste en adenocarcinoma de ovario, adenocarcinoma renal, adenocarcinoma

   pancreatico, adenocarcinoma de utero, adenocarcinoma de estomago, adenocarcinoma de rinon y adenocarcinoma rectal.
3. 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, donde dicho cancer a prevenir o tratar es un 35 cancer metastasico.
4. 4. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, donde en la etapa a) dicho receptor de netrina-1 se selecciona entre el grupo de delecionado en cancer colorrectal (DCC), homologo de Unc-5 (UNC5H), neogenina y los receptores de adenosina A2b.

   40
5. 5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 4, donde en la etapa a) dicho receptor de netrina-1 se selecciona entre el grupo de DCC, UNC5H1, UNC5H2 y UNC5H3.
6. 6. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, donde en la etapa a):

   45 - dicho fragmento del receptor de netrina-1 comprende o es el dominio extracelular del receptor de netrina-1, o parte del mismo capaz de unirse a netrina-1; y/o

   - dicho fragmento del receptor de netrina-1 comprende o es el dominio intracelular del receptor de netrina-1, o parte del mismo capaz de dimerizarse o multimerizarse en presencia de netrina-1.

   50 7. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, donde en la etapa a) dicha netrina-1 y/o

   dicho receptor de netrina-1 son de mairnfero.
7. 8. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, donde en la etapa a) dicha netrina-1 es de pollo.

   55
8. 9. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, donde dicha netrina-1 y/o dicho receptor de netrina-1 y/o el compuesto a poner a prueba esta marcado mediante un marcador capaz de ser medido directa o indirectamente.
9. 10. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9, donde en la etapa c):

   - la medida de la inhibicion de la interaccion entre netrina-1, o un fragmento de la misma, y dicho receptor de netrina- 1, o un fragmento del mismo, se lleva a cabo mediante inmunoensayo (particularmente mediante ensayo

   5 inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA) o mediante ensayo inmunorradiometrico (IRMA)), mediante ensayo de centelleo por proximidad (SPA) o mediante transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia (FRET); y/o

   - la dimerizacion o multimerizacion, o su inhibicion, de dicho receptor de netrina-1, o fragmento del mismo, particularmente el dominio intracelular, se lleva a cabo mediante inmunoprecipitacion o FRET.

   10
10. 11. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, donde en la etapa a) dicho medio contiene celulas que expresan, en su membrana superficial, un receptor de netrina-1 endogeno o un receptor de netrina-1 recombinante, particularmente al menos el dominio extracelular de un receptor de netrina-1 recombinante.

    15 12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11, donde en la etapa a) dicho medio contiene

    celulas que expresan el receptor de netrina-1 recombinante.
11. 13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11, donde en la etapa a) dicho medio contiene celulas tumorales que expresan de forma endogena dicho receptor de netrina-1 en la superficie de su membrana y

    20 que expresan o sobreexpresan netrina-1, y donde en la etapa c) la inhibicion de la interaccion entre netrina-1 y su receptor de netrina-1 en presencia del compuesto a poner a prueba, se mide mediante la apoptosis o muerte de celulas inducida por la presencia del compuesto a poner a prueba.
12. 14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 13, donde en la etapa a) dicho medio contiene 25 celulas tumorales metastasicas.
13. 15. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14, para seleccionar un compuesto para la prevencion o el tratamiento de cancer, donde dicho procedimiento comprende las siguientes etapas de:

    30 a) tener un medio que contiene una celula de mairnfero que expresa un receptor de netrina-1 endogeno o uno recombinante, o un fragmento del mismo que comprende al menos su dominio intracelular;

    b) poner en contacto dicho medio con el compuesto a poner a prueba;

    c) determinar si la dimerizacion o multimerizacion del dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1 se inhibe en presencia de dicho compuesto a poner a prueba; y

    35 d) seleccionar dicho compuesto si la determinacion en la etapa c) demuestra una inhibicion significativa de la dimerizacion o multimerizacion del dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1.
14. 16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 15, donde dicha celula de la etapa (a) es una celula tumoral.

    40
15. 17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 15, donde dicha celula de la etapa (a) es una celula que presenta dimerizacion o multimerizacion del dominio intracelular de su receptor de netrina-1 o una celula donde el dominio intracelular de su receptor de netrina-1 es capaz de dimerizarse o multimerizarse en presencia de netrina- 1.

    45
16. 18. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, donde en la etapa (b) el medio contiene ademas netrina-1, o un fragmento de la misma, capaz de unirse al dominio extracelular del receptor de netrina-1.

    50 19. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, que comprende

    ademas determinar si la presencia del compuesto a poner a prueba induce la muerte celular de dicha celula de mamffero; y la etapa (d) comprende la determinacion de la muerte celular de dicha celula de mamnfero.
17. 20. Un procedimiento in vitro para predecir la presencia de un cancer metastasico o agresivo en un

    55 paciente que tiene un tumor primario a partir de una biopsia de dicho paciente que contiene celulas de tumores primarios, seleccionandose dicho cancer entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer de pulmon, neuroblastoma, glioma, leucemia, sarcoma, melanoma y adenocarcinoma, donde dicho cancer a prevenir o tratar es un cancer donde celulas tumorales expresan o sobreexpresan netrina-1, que comprende las siguientes etapas de:

    (a) medicion del nivel de un producto de expresion de netrina-1 en dicha biopsia, donde dicho producto es (i) ARN que codifica netrina-1 o (ii) protema netrina-1; y

    (b) comparar dicho nivel de producto de expresion con la expresion del nivel de un producto de expresion de netrina- 1 en una biopsia de tumor primario no metastasico o en una biopsia de cancer no agresivo;

    5 donde un incremento con una relacion superior a 2 entre los niveles de un producto de expresion de netrina-1 en la biopsia a poner a prueba y en la biopsia de referencia no metastasica o no agresiva es indicativo de la presencia de un cancer metastasico o un cancer agresivo.
18. 21. Un procedimiento para determinar in vitro la eficiencia de un tratamiento anti-cancer para un paciente 10 o para seleccionar in vitro pacientes que responden a un tratamiento anti-cancer espedfico, seleccionandose dicho

    cancer entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer de pulmon, neuroblastoma, glioma, leucemia, sarcoma, melanoma y adenocarcinoma, donde dicho cancer a prevenir o tratar es un cancer donde celulas tumorales expresan o sobreexpresan netrina-1, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas de:

    15 - medicion de un nivel de un producto de expresion de netrina-1 en una biopsia de dicho paciente, donde dicho producto es (i) ARN que codifica netrina-1 o (ii) protema netrina-1;

    donde la eficiencia de dicho tratamiento anti-cancer esta correlacionada con la disminucion en una relacion de al menos 2 de la cantidad del nivel de un producto de expresion de netrina-1 medido en dicha biopsia, o 20 donde los pacientes que responden a un tratamiento anti-cancer espedfico seleccionados son pacientes donde la cantidad del nivel de un producto de expresion de netrina-1 medida en su biopsia se ha reducido en una relacion de al menos 2 despues de dicho tratamiento espedfico.
19. 22. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 21, donde dicho cancer induda una sobreexpresion 25 de netrina-1 y/o es un cancer metastasico.
20. 23. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 20 a 22, donde dicho ARN que codifica netrina-1 se mide mediante un procedimiento de reaccion en cadena de la polimerasa inversa (PCR) en tiempo real cuantitativa.

    30
21. 24. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 20 a 22, donde dicha protema netrina-1 se mide usando anticuerpos espedficos capaces de reconocer espedficamente dicha protema netrina-1.
22. 25. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 20 a 24, donde el tumor primario es un tumor 35 primario de un cancer seleccionado entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer de pulmon,

    neuroblastoma, glioma, leucemia, sarcoma, melanoma y adenocarcinoma.
23. 26. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 25, donde dicho adenocarcinoma se selecciona entre el grupo que consiste en adenocarcinoma de ovario, adenocarcinoma renal, adenocarcinoma pancreatico,

    40 adenocarcinoma de utero, adenocarcinoma de estomago, adenocarcinoma de rinon y adenocarcinoma rectal.
24. 27. Uso para la seleccion de un compuesto para la prevencion o el tratamiento de cancer, seleccionandose dicho cancer entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer de pulmon, neuroblastoma, glioma, leucemia, sarcoma, melanoma y adenocarcinoma, de un kit que comprende celulas tumorales que expresan

    45 receptor de netrina-1 y expresan o sobreexpresan netrina-1.
25. 28. Uso de acuerdo con la reivindicacion 27, donde las celulas tumorales son celulas de una lmea celular tumoral.

    50 29. Uso de acuerdo con la reivindicacion 27 o 28, que comprende ademas una protema netrina-1, o un

    fragmento de la misma capaz de interactuar espedficamente con dicho receptor de protema netrina-1 para formar un par de union.
26. 30. Un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en:

    55

    - un compuesto que comprende un dominio extracelular del receptor de netrina-1 o un fragmento del mismo capaz de inhibir espedficamente la interaccion entre la netrina-1 y dicho receptor de netrina-1, y/o capaz de inhibir la dimerizacion o multimerizacion del dominio intracelular de dicho receptor de netrina-1; y

    - un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido espedficamente contra netrina-1 o el dominio extracelular del

    receptor de netrina-1 o a un fragmento de netrina-1 capaz de interactuar con el dominio extracelular de dicho receptor de netrina-1,

    para uso en un procedimiento in vivo para prevenir o tratar cancer de mama, cancer de pulmon, neuroblastoma, 5 glioma, leucemia, sarcoma, melanoma y adenocarcinoma.
27. 31. Un compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicacion 30, donde dicho dominio extracelular del receptor de netrina-1 o fragmento del mismo se selecciona entre el grupo de DCC; UNC5H, neogenina y la adenosina A2b.

    10
28. 32. Un compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicacion 30 o 31, donde dicho compuesto que comprende un dominio extracelular del receptor de netrina-1 es de DCC.
29. 33. Un compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicacion 32, donde dicho compuesto es DCC-EC- 15 Fc o DCC-5Fbn.
30. 34. Un compuesto para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, para uso en un procedimiento para prevenir o tratar un cancer donde las celulas tumorales expresan o sobreexpresan netrina-1.

    20 35. El compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 30 a 34, o un oligonucleotido antisentido o de ARNi

    (ARN interferente) que es espedfico y complementario del acido nucleico que codifica protema netrina-1 para uso en un procedimiento in vivo para tratar o prevenir cancer en mairnferos, incluyendo el ser humano, seleccionandose dicho cancer entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer de pulmon, neuroblastoma, glioma, leucemia, sarcoma, melanoma y adenocarcinoma, donde dicho cancer a prevenir o tratar es un cancer donde celulas 25 tumorales expresan o sobreexpresan netrina-1.
31. 36. El uso del compuesto de acuerdo con la reivindicacion 35, caracterizado porque dicho cancer es un

    cancer metastasico.

    30 37. El uso del compuesto de acuerdo con la reivindicacion 35 o 33, caracterizado porque dicho

    adenocarcinoma se selecciona entre el grupo que consiste en adenocarcinoma de ovario, adenocarcinoma renal, adenocarcinoma pancreatico, adenocarcinoma de utero, adenocarcinoma de estomago, adenocarcinoma de rinon y adenocarcinoma rectal.

    35 38. El uso del compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 35 a 37, caracterizado porque las celulas

    tumorales primarias de dicho cancer expresan o sobreexpresan netrina-1.