KR20140129391A - 네트린-1 활성을 이용한 항암 화합물의 스크리닝 - Google Patents

네트린-1 활성을 이용한 항암 화합물의 스크리닝 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양 세포들에서 발현된 네트린-1 수용체의 세포내 도메인의 다이머화를 저해하고 또는 네트린-1 수용체와 상호작용을 하는 이들 화합물에 대한 능력에 기초한 항-암 화합물의 스크리닝에 대한 인 비트로 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 네트린-1의 발현 수준의 측정에 기초한 항-암 치료의 효율성을 결정하거나 전이성 또는 침습성 암을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종양 세포들에 의한 네트린-1의 과발현에 관련된 전이성 유방암과 같은 암의 치료를 위한 약제로서 화합물들과 키트들을 더욱 포함한다.

Description

네트린-1 활성을 이용한 항암 화합물의 스크리닝{SCREENING FOR ANTI-CANCER COMPOUNDS USING NETRIN-1 ACTIVITY}
본 발명은 종양 세포에서 발현된 네트린-1 수용체의 세포내 도메인의 다이머화의 저해 및/또는 네트린-1과 상호작용하는 이들 화합물의 능력에 기초한 항암 화합물의 인 비트로 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 네트린-1의 발현 수준 측정에 기초한 항암 치료의 효율을 결정하거나 전이성 암의 존재를 예측할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종양 세포들에 의하여 네트린-1의 과발현과 관련된 유방암과 같은 전이성 암의 치료를 위한 투약으로서 화합물 및 키트를 더욱 포함한다.
확산성 라미닌-관련 단백질인 네트린(Netrin)-1은 그것의 주요한 수용체들, DCC (결장암에서는 삭제된)(Serafini, T. et al. Cell 87, 1001-14 (1996);Keino-Masu, K. et al. Cell 87, 175-85 (1996);Forcet, C. et al. Nature 417, 443-7 (2002)) 및 UNC5H(Ackerman, S. L. et al. Nature 386, 838-42 (1997);Hong, K. et al. Cell 97, 927-41 (1999))과 상효작용에 의하여 신경계의 발생 동안에 신경 항해(navigation)의 주요한 역할(Serafini, T. et al. Cell 78, 409-24 (1994))을 하는 것으로 알려졌다. 그러나 더 최근에는 네트린-1은 세포 생존을 조절하는 완전히 다른 분자로 출현하였다. 사실, 네트린-1 수용체DCC 및 UNC5H, -즉 UNC5H1, UNC5H2, 및 UNC5H3-는 소위 의존성(dependence) 수용체 계열에 속한다(Mehlen, P. et al. Nature 395, 801-4 (1998);Llambi, F., Causeret, F., Bloch-Gallego, E. & Mehlen, P. Embo J 20, 2715-22 (2001)). 의존성 수용체는 그들의 리간드가 없는 곳에서 발현이 셋팅될 때 세포 사멸을 유도하는 능력을 공유하는 수용체들의 군을 형성한다(Mehlen, P. and Bredesen, D.E. (2004) Apoptosis, 9, 37-49). 그러한 수용체들은 RET(Bordeaux, M. C. et al. Embo J 19, 4056-63 (2000)), 베타-인테그린(Stupack, D. G., Puente, X. S., Boutsaboualoy, S., Storgard, C. M. & Cheresh, D. A. J Cell Biol, 155, 459-70 (2001)), Patched(Thibert, C. et al. Science 301, 843-6 (2003)), neogenin(Matsunaga, E. et al. Nat Cell Biol 6, 749-55 (2004)), p75NTR(Rabizadeh, S. et al. Science 261, 345-8 (1993) 및 안드로겐 수용체(Ellerby, L.M., Hackam, A.S., Propp, S.S., Ellerby, H.M., Rabizadeh, S., Cashman, N.R., Trifiro, M.A., Pinsky, L., Wellington, C.L., Salvesen, G.S., Hayden, M.R. and Bredesen, D.E. (1999) J Neurochem, 72, 185-195)을 포함하는 그러한 수용체들은 그들의 리간드로부터 비어있는 경우에는 세포 사멸을 유도하는 반면에 그들의 리간드의 존재는 이 프로-아팝토틱 활성을 저해하는 기능적인 특성을 공유한다. 따라서 그러한 수용체들은 그들의 각 리간드들에 대한 의존성 세포 상태를 생성한다(Mehlen, P. & Thibert, C. Cell Mol Life Sci 61, 1854-66 (2004);Bredesen, D. E., Mehlen, P. & Rabizadeh, S. Cell Death Differ 12, 1031-43 (2005)).
이 의존성 효과는 리간드가 발현되지 아니하는 조직에 대한 전이성 종양 세포들의 이동 또는 일정한 그리고 제한된 리간드 존재를 가지는 세포 환경에서 종양 세포의 증식:리간드 비가동성(unavailability)의 셋팅에서 발생하는 종양 세포의 제거를 위한 메카니즘으로 작용하게 제안되어 왔다. 종양 세포에 대한 선택적 잇점은 그것의 의존성 수용체들의 프로-아팝토틱 활성을 잃는 것일 것이다. 그것은 C. elegans 네트린-1 -UNC6-가 UNC40 및 UNC5와 상호작용하는 유전자 스크리닝으로부터 예측된다(Hedgecock, E.M., Culotti, J.G. and Hall, D.H. (1990) Neuron, 4, 61-85). UNC5의 네 상동체(orthologue)가 포유류에서 동정되었다: UNC5H1, H2, H3, H4 및 UNC40가 척추동물 DCC (결장암에서 삭제된)의 상동체인 것이 발견되었다(Chan, S.S., Zheng, H., Su, M.W., WiIk, R., Killeen, M.T., Hedgecock, E.M. and Culotti, J.G. (1996) Cell, 87, 187- 195). 이 라인을 따라, DCC는 그것의 발현이 다양한 주요 인간 암들에서 손실된 종양 억제 유전자로 1990년대 초반에 제안되었다(Fearon, E. R. et al. Science 247, 49-56 (1990);Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. Cell 87, 159-70 (1996). 이 가설은 또한 여러 결장암에서 UNC5H 유전자들이 다운-조절되고 따라서 UNC5H 유전자들의 손실은 종양 발생에 대한 선택적인 효과를 나타낸다는 최근 관찰과 잘 맞는다(Thiebault, K. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 4173-4178 (2003)). 흥미롭게도 마우스에서 위장관에서 UNC5H3의 불활성화와 네트린-1의 과발현 모두는 장암 진행과 관련이 있고(Mazelin, L. et al. Nature 431, 80-4 (2004);Bernet, A. et al. submitted (2007)), 따라서 인간 병리학에서 네트린-1 의존성 수용체들의 손실은 종양 진행에 주요한 인자인 것을 나타낸다. 그러나, 비록 일련의 초기 보고들은 DCC가 종양 억제자로서 작용한다는 사실을 지지하지만 DCC 코딩 서열에서 포인트 돌연변이의 희소성 및 DCC 반접합체(hemizygous) 마우스에서 종양 경향의 결핍으로 인하여 의심이 일어났다(Fazeli, A., Dickinson, S.L., Hermiston, MX., Tighe, R. V., Steen, R.G., Small, C.G., Stoeckli, E.T., Keino-Masu, K., Masu, M., Rayburn, H., Simons, J., Bronson, R.T., Gordon, J.I., Tessier-Lavigne, M. and Weinberg, R. A. (1997) Nature, 386, 796-804).
[기술적 과제]
그러나 그 모델은 그들이 유사한 선택적 효과를 나타내어야 하기 때문에
네트린-1 수용체들의 손실 및 리간드 발현-즉 오토크라인 발현의 획득 모두 인간 암에서 관찰되어야 한다는 상기 예측에 기재되었다. 이 의문은 기본적인 지식뿐 아니라 치료에도 중요하다:사실 네트린-1 의존성 수용체들 및 네트린-1 사이의 세포외 상호작용을 저해하는 것은 종양 퇴화를 촉진하는 설득력있는 전략을 나타낼 수 있다. 종양의 치료에 사용되는 신규 화합물들을 동정하고 특성화하기 위한 단순하고 일관된 수단들을 제공하는 것이 특히 바람직하다.
[기술적 해결방법]
본 발명에서 사용된 "항체"라는 용어는 면역글로불린 분자들 및 면역글로불린 분자들의 면역적으로 활성부위들, 즉 네트린-1 단백질 또는 그것의 수용체에 특이적으로 결합(면역반응)하는 항원 결합 자리를 포함한 분자들을 의미한다.
"항체"라는 용어는 단일클론 또는 다중클론 항체뿐 아니라 키메릭 또는 인간화된 항체들을 포함한다. 분리된 네트린-1 단백질 또는 네트린-1 수용체 단백질 또는 그것의 특정 절편은 다중클론 및 단일클론 항체 제조를 위한 표준 기술을 사용하여 그러한 단백질에 결합하는 항체들을 생성하는 이뮤노젠으로 사용될 수 있다. 적어도 하나의 항원 결정자를 가지는 이들 단백질들의 사용할 수 있어서 이들 특정 항체들을 생성하는데 사용된다. 단백질 이뮤노젠은 전형적으로 이뮤노젠으로 적당항 대상(예를 들어 토끼, 염소, 마우스 또는 다른 포유류)를 면역화시켜서 항체를 제조하는데 사용된다. 적당한 면역원 제조는 상기 단백질 또는 그것의 절편을 포함할 수 있고 Freund's 컴플리트 또는 비컴플리트 어쥬번트와 같은 어쥬번트 또는 유사한 면역촉진제를 더욱 포함할 수 있다. 따라서 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 네트린-1 단백질 또는 그것의 수용체의 아미노산 서열의 적어도 8에서 10 아미노산의 인접한 스팬을 포함하는 에피토프를 함유한 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하거나 선택적으로 결합할 수 있는 항체들, 폴리클론, 단일클론 키메릭 또는 인간화된 항체 중 하나를 포함한다.
네트린-1 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 cDN를 검출하고 정량화하는 바람직한 물질은 이 mRNA 또는 cDNA에 교잡할 수 있는 표지된 핵산 프로브 또는 프라이머들이다. 핵산 프로브는 mRNA 또는 cDNA에 엄격한 조건 하에서 특이적으로 교잡하기에 충분한 길이의 적어도 10, 15, 30, 50 또는 100 뉴크레오타이드들의 올리고뉴크레오타이드들일 수 있다. 그 핵산 프라이머는 mRNA 또는 cDNA 또는 그것의 상보 서열에 엄격한 조건 하에서 특이적으로 교잡하기에 충분한 길이의 적어도 10, 15, 또는 20 뉴크레오타이드들의 올리고뉴크레오타이드들일 수 있다. 네트린-1 단백질을 검출하고 정량화하기 위한 바람직한 물질은 이들 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 검출할 수 있는 표지를 가지는 항체이다. 항체들은 폴리클론 또는 더욱 바람직하게는 단일클론일 수 있다. 원래 항체 또는 그것의 절편(예를 들어 Fab 또는 F(ab')2)가 사용될 수 있다. 프로브 또는 항체와 관련하여 "표지된"이란 용어는 직접적으로 표지된 또 다른 물질과 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적인 표지뿐 아니라, 프로브 또는 항체에 검출될 수 있는 물질을 커플링(즉 물리적으로 연결)에 의한 프로브 또는 항체의 직접적인 표지를 포함한다. 간접적인 표지의 예들은 형광적으로 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있는 바이오틴으로 DNA 프로브를 말단-표지 및 형광적으로 표지된 이차 항체를 사용한 일차 항체의 검출을 포함한다. 예를 들어, 후보 mRNA의 검출을 위한 인 비트로 기술들은 노던 교잡 및 인 시투 교잡을 포함한다. 후보 단백질의 검출을 위한 인 비트로 기술들은 효소 결합면역흡수법, 웨스턴 블럿, 면역침전 및 면역형광법을 포함한다. 후보 cDNA의 검출을 위한 인 비트로 기술들은 서던 교잡을 포함한다. 본 발명이 네트린-1 단백질의 수준을 정량화하기 위한 키트를 포함할 때, 그 키트는 이들 단백질들을 정량화할 수 있는 물질 또는 표지된 화합물을 포함할 수 있다. 상기 물질들은 적당한 용기에 포장될 수 있다. 그 키트는 네트린-1 전사체 또는 네트린-1 단백질의 수준을 정량화하기 위한 키트를 사용하기 위한 지시서를 더욱 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 네트린-1 전사체들의 결정은 앵커 PCR 또는 RACE PCR와 같은 중합효소연쇄반응 또는 대안적으로 리게이션 연쇄 반응(LCR)에서 프로브/프라이머의 (예를 들어 Landegran et al., 1988, Science 241:23-1080; 및 Nakazawa et al, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:360-364 참고), 또는 대안적으로 정량 실시간 RT-PCR이 사용이 관련된다. 이 방법은 환자로부터 세포들의 샘플을 수집하고 샘플의 세포들로부터 핵산(예를 들어 mRNA)를 분리하고 선택적으로 mRNA를 해당 cDNA로 변형하고, 네트린-1 mRNA 또는 cDNA의 교잡 및 증폭이 일어나는 조건 하에서 네트린-1 또는 mRNA 또는 그것의 해당 cDNA에 특이적으로 교잡하는 하나 이상의 프라이머들로 핵산 샘플을 접촉하고 증폭 산물의 존재를 정량화하는 단계들을 포함할 수 있다. 증폭단계로 PCR 및/또는 LCR이 핵산 표지를 정량화하기 위해 사용된 기술들 중 하나를 결합하여 사용하는 것이 바람직할 수 있다는 것은 예측된다.
본 발명의 방법은 예를 들어 여기에 기재된 적어도 한 프로브 핵산 또는 프라이머 세트 또는 항체 물질을 포함하는 미리 포장된 진단키트를 이용하여 통상적으로 사용될 수 있는 예를 들어 환자를 진단하고 추적하기 위한 임상 세팅에서 수행될 수 있다.
결국 본 발명은 전이성 또는 침습성 암을 치료 또는 예방하기 위한 약을 제조하기 위한 네트린-1 단백질을 코딩하는 핵산에 특이적인 앤티센스 또는 iRNA (interfering RNA) 올리고뉴크레오타이드의 사용과 관련되고, 바람직하게 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 신경아세포종, 신경교종, 급성 골수성백혈병, 육종, 흑색종, 난소 선암(ovarian adenocarcinoma), 신장 선암(renal adenocarcinoma), 췌장 선암, 자궁 선암, 위 선암, 및 직장 선암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
Interfering RNA (iRNA)는 그것의 상보적인 서열을 포함하는 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는 이중 나선 RNA (dsRNA)의 한 현상이다. iRNA는 많은 생물체에 대한 유용한 연구 수단일 되었다. 비록 dsRNA가 유전자 발현을 억제하는 기작에 대하여 완전하게 이해되지 않았지만, 실험 데이터는 중요한 내용을 제공한다. 이 기술은 포유류 세포들에서 유전자 기능을 연구하는 수단으로 매우 강력하고 siRNA (small interfering RNA)에 기초한 약제의 개발을 유도한다. 환자에게 투여될 때, 본 발명의 화합물은 약학적으로 수용가능한 비히클을 선택적으로 포함하는 조성물의 형태로 바람직하게 투여된다. 그 조성물은 경구 또는 다른 통상의 방법으로 그리고 다른 생물학적 제제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 여러 운반 시스템, 예를 들어 리포좀에 캡슐화, 미세입자, 캡슐 등이 알려졌고 본 발명의 선택된 화합물 또는 그것의 약학적으로 수용가능한 염을 투여하는데 사용될 수 있다.
투여 방법은 피내, 근육내, 정맥내, 경막, 피하, 복강내, 비내, 혀밑, 질내, 경구, 뇌내, 직장내, 경피 흡입, 또는 국소적인 것을 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 투여 모드는 의사의 분별에 의한다. 대부분의 예에서 투여는 일차 종양에 직접 또는 혈관으로 화합물의 분비를 야기한다. 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물들 또는 본 발명의 방법에 의하여 선택된 조성물들은 본 발명의 일부를 구성한다. 이들 조성물들은 부가적으로 환자에 적당한 투여를 위한 형태를 제공하기 위하여 적당한 양의 약학적으로 수용가능한 비히클을 포함할 수 있다. "약학적으로 수용가능한"이란 용어는 동물, 포유류, 더욱 상세하게는 인간에서 사용하기 위한 국가 또는 승인된 약전에 의하여 리스트되거나 정부에 의하여 승인된 것을 의미한다. "비히클"이란 용어는 본 발명의 화합물이 투여되는 담체, 외제, 어쥬번트, 희석제를 의미한다. 그러한 약학적 비히클들은 물 및 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 및 그 유사체와 같은 정유, 동물유, 식물유 또는 합성 기원의 것들을 포함하는 기름과 같은 액체일 수 있다. 그 약학적 비히클들은 식염수, 젤라틴, 녹말 및 그 유사체일 수 있다. 또 부가, 안정, 증량, 광택 및 염료 등이 사용될 수 있다. 식염수 및 수용성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 특히 주사용액에 액체 비히클로 사용될 수 있다. 적당한 악학적 비히클들은 녹말, 포도당, 유당, 설탕, 젤라틴, 스테아레이트 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물 또는 그 유사체와 같은 첨가제를 포함한다. 필요한 경우에 테스트 화합물은 소량의 습윤 또는 에멀젼화제 또는 pH 버퍼제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물들은 용액, 서스펜젼, 에멀젼, 정제, 알약, 펠렛, 캡슐, 액체 함유 캡슐, 분말, 지속성 제제, 좌약, 에어로졸, 스프레이, 현탁액 또는 다른 사용에 적합한 형태를 가질 수 있다. 상기 조성물은 일반적으로 정맥내 투여 또는 구강 투여를 위한 인간에 채택된 약학 조성물로서 통상적인 방법에 따라 제조된다. 치료에 효과적인 활성 화합물의 양은 표준 임상 기술에 의하여 결정될 수 있고, 또 인 비트로 또는 인 비보 분석이 선택적으로 적정 투여 용량 범위를 결정하는데 도움을 주기 위하여 채택될 수 있다. 채택되는 정확한 용약은 투여 경로, 질병의 중증도에 의존하고, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 그러나 경구, 비내, 피내 또는 정맥내 투여에 적당한 투여 범위는 일반적으로 하루 체중 kg당 약 0.01 mg에서 약 75 mg, 더욱 바람직하게는 약 0.5 mg에서 5 mg이다.
놀랍게도 본 발명자들은 네트린-1 의존선 수용체들을 소실하기보다는 대부분의 전이성 유방암이 전이성 종양의 사멸을 촉발하는 치료에 사용될 수 있는 증가된 네트린-1 발현을 보인다는 것을 최초로 확인하였다. 만약 DCC 및/또는 UNC5H의 프로-아팝토틱 신호가 문서화되기 시작하면 이 사멸/소생 신호에 중요한 문제는 DCC,UNC5H 및 다른 공지된 의존성 수용체에 의하여 더 일반적인 것에 의하여 지시되고 어떻게 리간드의 존재가 프로-아팝토틱 활성을 저해하는 지를 알 수 있다(Mehlen P. and C. Furne (2005) Netrin- 1: Cell Mol Life Sci. 62:2599-616).
두 번째 본 발명자들은 네트린-1 유도된 DCC 및/또는 UNC5H 멀티머화가 DCC 및/또는 UNC5H 프로-아팝토틱 활성을 저해하는 중요한 단계일 수 있는지를 분석하였다. 놀랍게도 그들은 네트린-1에 반응하여 DCC 및/또는 UNC5H 멀티머화와 같은 네트린-1 수용체는 아팝토시스를 저해하는데 충분한 과정을 나타내었다.
첫째, 본 발명은
a)네트린-1, 또는 그것의 절편 및 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편을 포함하는 배지를 가지고, 여기서:
- 상기 네트린-1, 또는 그것의 절편 및 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편은 특이적으로 서로 상호작용하여서 결합쌍을 형성할 수 있고 또는
- 상기 네트린-1, 또는 그것의 절편 및 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편은 상기 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편, 특히 상기 네트린-1 수용체의 세포내 도메인의 다이머화 또는 다중화를 유도할 수 있으며;
b) 테스트되는 화합물과 상기 배지를 접촉하고;
c)네트린-1, 또는 그것의 절편 및 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편의 저해를 측정하고 또는
상기 화합물이 상기 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편의 다이머화 또는 다중화, 특히 상기 네트린-1 수용체의 세포내 도메인의 다이머화를 저해하는지를 결정하고; 그리고
d) -만약 c) 단계에서 측정이 상기 화합물 존재하에서 네트린-1, 또는 그것의 절편과 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편 사이의 상호작용의 현저한 저해를 나타내고, 또는
- 만약 c) 단계에서 측정이 상기 화합물 존재하에서 상기 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편의 다이머화 또는 다중화, 특히 상기 네트린-1 수용체의 세포내 도메인의 다이머화를 현저하게 저해한다면 그 화합물을 선택하는 것을 포함하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 인 비트로 방법을 제공한다.
네트린-1과 그것의 네트린-1 수용체 사이의 상호작용의 용어에 의하여 본 발명에서는 바람직하게는 증가된 네트린-1 수준에 의하여 네트린-1 의존성 수용체 유도된 에팝토시스를 회피하기 위하여 종양 세포에 대한 선택적 효과를 야기하는 상호작용을 의미한다. 따라서 이러한 상호작용의 저해는 예를 들어 네트린-1 (그것의 네트린-1 수용체의 수용성 세포외 막 도메인 또는 그것의 부분과 같은)과 특이적인 복합체를 형성할 수 있는 화합물의 존재 또는 경쟁적인 리간드(상기 네트린-1 수용체의 이 세포외 막 도메인에 대한 항체와 같은)의 존재 하에서 네트린-1의 그것의 수용체에 대한 결합의 완전한 또는 부분적인 저해에 의하여 얻을 수 있다.
바람직한 실시예에서 본 발명에 따른 방법에서 치료 또는 예방되는 암들은 네트린-1을 발현 또는 과발현하는 종양세포들인 암이다.
또 다른 바람직한 실시에에 있어서, 상기 치료 또는 예방되는 암은 유방암, 대장암, 폐암, 신경아세포종, 신경교종, 급성 골수성백혈병, 육종, 흑색종, 난소 선암(ovarian adenocarcinoma), 신장 선암(renal adenocarcinoma), 췌장 선암, 자궁 선암, 위 선암, 및 직장 선암으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다.
또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 상기 치료 또는 예방되는 암은 전이성 또는 침습성 암이다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 네트린-1 수용체는 DCC, UNC5H (특히 UNC5H1, UNC5H2 및 UNC5H3), 네오제닌 및 아데노신 A2b로 구성된 군으로부터 선택되고 더욱 바람직하게는 DCC, UNC5H1, UNC5H2 및 UNC5H3b로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 방법에 있어서, a) 단계에서 - 상기 네트린-1 수용체 절편은 네트린-1과 상호작용할 수 있는 네트린-1 수용체 또는 그것의 부분의 세포외 도메인이거나 그 도메인을 포함하고; 또는
- 상기 네트린-1 수용체 절편은 네트린-1 존재 하에서 다이머화 또는 다중화할 수 있는 네트린-1 수용체 또는 그것의 부분의 세포내 도메인이거나 그 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 방법에서 상기 네트린-1 및/또는 상기 네트린-1 수용체는 포유류, 특히 마우스, 랫트 또는 인간으로부터 유래한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법의 특정 예에서 a) 단계에서 상기 네트린-1은 닭으로부터 유래한다.
또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 상기 네트린-1 및/또는 상기 네트린-1 수용체 및/또는 테스트되는 상기 화합물은 직접 또는 간접적으로 측정될 수 있는 마커에 의하여 표지되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 바람직한 실시예에 있어서, c) 단계에서 상기 네트린-1 또는 그것의 절편과 상기 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편 상호작용의 저해의 측정은 면역분석(특히 ELISA 또는 면역방사계측 분석(IRJVIA)), 섬광근접검색법(SPA) 또는 형광 공명 에너지 전이(FRET)에 의하여 수행에 의하고;또는
상기 네트린-1 수용체, 또는 그것의 절편, 특히 세포내 도메인의 다이머화 또는 다중화 또는 그것의 저해는 면역침전 또는 FRET에 의하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 특이적으로 바람직한 실시예에 있어서, a) 단계에서 상기 배지는 그들의 표면 막에서 내재적인 네트린-1 수용체 또는 재조합 네트린-1 수용체, 특히 적어도 재조합 네트린-1 수용체의 세포외 도메인을 발현하는 세포들을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 재조합 네트린-1 수용체는 또 상기 네트린-1 수용체의 세포내 도메인을 포함한다.
또 다른 특이적인 바람직한 실시예에 있어서, a) 단계에서 상기 배지는 그들의 막 표면에서 상기 네트린-1 수용체를 내재적으로 발현하고 네트린-1을 발현하거나 과발현하는 종양세포, 바람직하게는 전이성 종양세포를 포함하고, c) 단계에서 테스트하는 화합물의 존재 하에서 네트린-1과 그것의 네트린-1 수용체 사이의 상호작용의 저해는 바람직하게는 하기 실시예에서 기재한 바와 같은 트립판 블루 염색을 사용하여 분석된 테스트하는 화합물의 존재에 의하여 유도되는 세포 사멸 또는 에팝토시스에 의하여 측정되는 것을 특징으로 한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 종양 세포들은 DCC-EC-Fc의 존재에 반응하여 세포사멸에 더욱 민감한 CAL51-36 세포주와 같은 CAL51 세포주,4Tl 세포들, CAL51 세포들, T47D 세포들, SKBR7 세포들, IMR32 세포들, GL26 세포들 및 H358 세포들로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또 a) 내재적인 또는 재조합 네트린-1 수용체 또는 적어도 그것의 세포내 도메인을 포함하는 그것의 절편을 발현하는 포유류 세포, 바람직하게는 종양 세포, 더욱 바람직하게는 그것의 네트린-1 수용체 세포내 도메인이 네트린-1의 존재하에서 다이머화 또는 다중화를 할 수 있는 세포 또는 그것의 네트린-1 수용체 세포내 도메인의 다이머화 또는 다중화를 나타내는 세포를 포함하는 배지를 가지고;
b) 테스트되는 화합물과 상기 배지를 접촉하고, 선택적으로 상기 배지는 네트린-1 또는 네트린-1 수용체의 세포외 도메인과 상호작용할 수 있는 그것의 절편을 포함하고;
c)테스트하는 화합물의 조재하에서 상기 네트린-1 수용체 세포내 도메인이 저해되는지를 결정하고;
d) 선택적으로 테스트하는 화합물의 존재가 상기 포유류 세포의 사멸을 유도하는지를 결정(예를 들어 트립판 방법에 의하여)하고; 그리고
e) 만약 c) 단계에서 상기 화합물이 상기 네트린-1 수용체의 세포내 도메인의 다이머화 또는 다중화를 현저하게 저해하고 또는
만약 d)단계에서 상기 포유류 세포의 세포 사멸을 나타낸다면 그 화합물을 선택하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 인 비트로 방법을 제공한다.
두 번째, 본 발명은 (a) 생검에서 네트린-1 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 일차 종양 세포들을 포함하는 환자의 생검으로부터 유래한 일차 종양을 가지는 환자에서 전이성 또는 침습성 암의 존재를 예측하는 인 비트로 방법을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 비-전이성 일차 종양 생검 또는 비-침습성 암 생검에서 네트린-1의 발현과 비교하여 상기 생검에서 네트린-1 발현 수준의 증가는 전이성 암 또는 침습성 암의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 환자에서 전이성 또는 침습성 암의 존재를 예측하는 방법을 제공한다.
더욱 바람직한 실시예에 있어서, 테스트하는 생검과 비-전이성 또는 비-침습성 참고 생검에서 네트린-1 발현의 비가 2 이상, 바람직하게는 2.5 이상, 3이상, 3.5이상,4 이상, 4.5 이상, 및 5 이상인 경우에 전이성 암 또는 침습성 암의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 환자에서 전이성 또는 침습성 암의 존재를 예측하는 방법을 제공한다.
세 번째, 본 발명은 (a) 상기 치료된 환자의 일차 종양 생검을 얻고; (b) 상기 생검에서 네트린-1 발현 수준을 측정하며, 여기서 항암 치료의 효율성은 상기 생검에서 측정된 네트린-1 발현 수준의 양의 감소와 상관관계가 있거나 또는 특정 항암 치료에 반응하는 상기 선택된 환자는 상기 특정 치료 후에 그들의 생검에서 측정된 네트린-1 발현 수준의 양이 감소된 환자인 것을 특징으로 하는 특정 항암치료에 반응하는 환자를 인 비트로 선택하거나 환자에 대한 항암 치료의 효율성을 인비트로 결정하는 방법을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 암은 네트린-1의 과발현을 유도하였고 또는 전이성 또는 침습성 암인 것을 특징으로 하는 특정 항암치료에 반응하는 환자를 인 비트로 선택하거나 환자에 대한 항암 치료의 효율성을 인비트로 결정하는 방법이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 측정된 네트린-1 발현 산물은 네트린-1을 코딩하는 RNA, 특히 정량적인 실시간 역 PCR 방법에 의하거나 상기 측정된 네트린-1의 발현 수준은 네트린-1 단백질 수준, 특히 상기 네트린-1 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 특정한 항체들을 사용한 방법에 의한 것을 특징으로 하는 특정 항암치료에 반응하는 환자를 인 비트로 선택하거나 환자에 대한 항암 치료의 효율성을 인비트로 결정하는 방법이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 일차 종양은 유방암, 대장암, 폐암, 신경아세포종, 신경교종, 급성 골수성백혈병, 육종, 흑색종, 난소 선암(ovarian adenocarcinoma), 신장 선암(renal adenocarcinoma), 췌장 선암, 자궁 선암, 위 선암, 및 직장 선암으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 특정 항암치료에 반응하는 환자를 인 비트로 선택하거나 환자에 대한 항암 치료의 효율성을 인비트로 결정하거나 예측하기 위한 방법이다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 네트린-1 단백질과 특이적으로 서로 상호작용하여서 결합쌍을 형성할 수 있는 네트린-1 수용체 단백질 또는 그것의 절편, 바람직하게는 재조합 단백질; 및 상기 네트린-1 수용체 단백질과 특이적으로 상호작용하여서 결합쌍을 형성할 수 있는 네트린-1 단백질 또는 그것의 절편, 바람직하게는 재조합 단백질을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 화합물을 선택하기 위한 키트를 제공한다.
상기 네트린-1 수용체는 DCC, UNC5H (특히 UNC5H1, UNC5H2 및 UNC5H3), 네오제닌 및 아데노신 A2b로 구성된 군으로부터 선택되고 더욱 바람직하게는 DCC, UNC5H1, UNC5H2 및 UNC5H3으로 구성된 군으로부터 선택되고 다욱 바람직하게는 마우스, 랫트, 또는 인간으로부터 유래한 것을 특징으로 한다.
바람직한 실시예에서, 상기 키트는 특히 바람직하게는 DCC-EC-Fc의 존재에 대하여 반응하여 세포 사멸에 더욱 민감해지는 CAL51-36 세포주와 같은 CAL51 세포주,4Tl 세포들, CAL51 세포들, T47D 세포들, SKBR7 세포들, IMR32 세포들, GL26 세포들 및 H358 세포들로 구성된 군으로부터 선택되는 전이성 종양 세포주로부터 유래한 세포들인 네트린-1 수용체를 발현하고 네트린-1을 발현하거나 과발현하는 종양 세포들을 포함한다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 네트린-1과 상기 네트린-1 수용체 사이의 상호작용을 특이적으로 저해할 수 있고 또는 상기 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편 특히 상기 네트린-1 수용체의 세포내 도메인의 다이머화 또는 다중화를 억제할 수 있는 네트린-1 수용체의 세포 외 도메인 또는 그것의 절편을 포함하는 화합물; 및
약으로 상기 네트린-1 또는 네트린-1 수용체에 대하여 특이적으로 지시되고, 특히 상기 네트린-1 수용체의 세포외 도메인과 상호작용할 수 있는 네트린-1 절편 또는 상기 네트린-1 수용체의 세포외 도메인에 지시되는 단일클론 또는 폴리클론 항체로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함한다.
UNC5H1, UNC5H2 및 UNC5H3 (Unc-5 호모로그 A, B 및 C에 균등한 Unc-5 호모로그 1, 2 및 3)와 같은 인간 네트린-1 또는 인간 네트린 수용체의 아미노산 서열은 당업자에 주지된다. 그들의 특정 도메인의 위치화를 가지는 이들 아미노산 서열들의 예는 인간 네트린-1에 대한 등록번호 AAD09221 또는 NP 004813, 인간 네트린 수용체 Unc-5 homolog 1에 대해서 NP 588610, 인간 네트린 수용체 Unc-5 homolog 2에 대해서 Q8IZJ1 그리고 인간 네트린 수용체 Unc-5 homolog 3에 대해서 O95185로 진뱅크에서 발견될 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 화합물에서 상기 네트린-1 수용체의 세포외 도메인 또는 그것의 절편은 DCC, UNC5H (특히 UNC5H1, UNC5H2 및 UNC5H3), 네오제닌 및 아데노신 A2b로 구성된 군으로부터 선택되고 더욱 바람직하게는 DCC, UNC5H1, UNC5H2 및 UNC5H3으로 구성된 군으로부터 선택되고 다욱 바람직하게는 마우스, 랫트, 또는 인간으로부터 유래한 것을 특징으로 한다.
더욱 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 상기 화합물은 DCC로부터 유래한 네트린-1 수용체의 세포외 도메인을 포함하고, 바람직하게는 상기 화합물은 DCC-EC-Fc 또는 DCC-5Fbn이다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 환자에서 전이성 암, 바람직하게는 전이성 유방암 또는 대장암, 가장 바람직하게는 전이성 유방암의 동정을 위한 마커로 네트린-1 발현의 수준의 용도에 관한 것이다. 또 다른 면에서 본 발명은 그것이 필요한 환자에서 본 발명의 방법에 의해서 선택되거나 본 발명의 화합물, 네트린-1 수용체의 다이머화 또는 다중화를 저해할 수 있는 화합물, 네트린-1과 그것의 네트린-1 수용체 사이의 상호작용을 저해할 수 있는 화합물을 투여하는 것을 포함하는 환자에서 바람직하게는 증가된 네트린-1 수준에 의한 네트린-1 의존성 수용체 유도된 에팝토시스를 회피하는 선택적인 효과를 가진 종양 세포들의 에팝토시스 또는 세포 사멸을 유도하기 위한 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간을 포함하는 포유류에서 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 방법에 의하여 선택되거나 본 발명에 따른 화합물의 용도를 포함한다. 바람직하게는 상기 암은 전이성 또는 침습성 암이다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 화합물의 용도 또는 치료 방법에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 신경아세포종, 신경교종, 급성 골수성백혈병, 육종, 흑색종, 난소 선암(ovarian adenocarcinoma), 신장 선암(renal adenocarcinoma), 췌장 선암, 자궁 선암, 위 선암, 및 직장 선암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
더욱 바람직하게는 본 발명의 화합물의 용도 또는 치료 방법에서 상기 암의 일차 종양 세포들은 네트린-1을 발현 또는 과발현한다.
도 1A 및 1B: 네트린-1은 인간 전이성 유방암에서 과발현됨
도 1A: 네트린-1의 발현 프로화일은 정량적 실시간 역전사 PCR로 조사. Q-RT PCR은 특정 인간 네트린-1 프라이머(Latil, A. et al. Int J Cancer 103, 306-15 (2003)) 및 인간 TBP(TATA Binding Protein) 유전자에 해당하는 프라이머를 가지고로부터 추출한 전체 RNA를 사용하여 수행함 . TBP는 de Cremoux, P. et al. Endocr Relat Cancer 11, 489-95 (2004)에 기재된 것과 같이 정상 및 유방암 조직 사이의 mRNA 수준에서 약한 다양성을 보이기 때문에 여기서 대조군으로 사용. 네트린-1 발현은 비 전이성 샘플에서 네트린-1 발현의 평균 및 각 샘플에서 네트린-1 발현 사이의 비로서 주어짐. 도 1B: Q-RT-PCR는 표준으로서 마우스 유전자 RPLPO 및 특이적인 마우스 네트린-1 프라이머들과 67NR 및 4Tl 마우스 세포주들로부터 유래한 전체 RNA를 사용하여 수행됨.
도 2A-2D: 67NR 마우스 세포주에서 네트린-1의 강화된 발현이 전이성 발생을 유도
도 2A 및 2B: 네트린-1 (67NR-net)으로 안정하게 트랜스팩션된 Mock 트랜스팩션된 67NR 세포들 또는 67NR 세포들은 네트린-1 발현 분석을 감수.
도 2A, 특정 닭 네트린-1 프라이머를 사용한 RT-PCR은 67NR-netl 및 67NR-mock으로부터 추출한 전체 RNA를 사용하여 수행. 도 2B, anti-myc (닭 네트린-1) 또흔 항-네트린l 항체들을 사용한 웨스턴블럿을 수행.
도 2C: 두 67NR-netl 및 67NR-net2 클론들을 어버이 67NR 및 4Tl 세포주와 비교한 현미경사진.
도 2D: 전이성 4Tl 세포들, Puromycine 저항성(67NR 1 및 67NR2)을 가지는 두 대조군 세포클론 및 두 네트린-1 발현 세포클론(67NRnetl 및 67NRnet2)을 16 마우스(세포 타입 당 4 마우스)의 족저지방에 주사하고 전이성을 폐환경에서 분석. 각 세포클론(4Tl, 67NR 1, 67NRnetl, 67NRnet2)의 주사 후 늑막 아래 및 경(intra)-실질성(parenchymatous) 작은 혹의 현미경 사진. IPL: 경 실질성 병변(intra-parenchymatous lesion), UPL: 늑막아래 병변(under-pleural lesions).
도 3A-3D: 네트린- 1/수용체 상호작용을 저해하여 마우스 전이성 세포 사멸 유도
도 3A: 네트린-1 및 그 수용체s, DCC 및 UNC5H를 나타낸 그림. 도 3B, 3C, 3D: 대조군(도 3B)으로서 비 특이적 IL3-EC-Fc 및 DCC-EC-Fc, 네트린-1/수용체에 대한 경쟁자로서 다양한 농도(도 3C), 또는 더 제한적인 DCC-5Fbn 도메인(도 3D)를 사용한 67NR 및 4Tl 세포들에서 세포 사멸의 정량적인 분석. 세포 사멸은 트립판 블루 배제 분석(도 3B, 3D) 또는 캐스페이즈 활성 분석(도 3C)에 의하여 정량화. 표준 편차를 나타냄(n=3).
도 4A 및 4B: 네트린-1/수용체 상호작용을 저해하여 인간 전이성 세포 사멸의 유도 도 4A: 트립판 블루 배제 분석에 의한 여러 농도의 DCC-EC-Fc로 처리한 CAL51 세포 사멸의 정량적 측정. 도 4B: 배양 배지에서 DCC-EC-Fc 경쟁자로 처리 또는 처리하지 않은 클론 세포주 CAL51-36 또는 CAL51 어버이 세포주에서 트립판 블루 배제에 의하여 모니터된 세포 사멸의 정량적 분석
도 5: 네트린-1은 인간 전이성 유방암에서 과발현된다. 네트린-1 발현 프로화일은 정량적 실시간 역전사 PCR로 조사 . Q-RT PCR은 51 종양 생검으로부터 추출된 총 RNA를 사용하여 수행되었다. 그들은 유방에 위치한 종양(NO, empty bar); 단지 겨드랑이 결절 관련(N+, gray bar) 및 진단에서 먼 전이성을 가진(M+, solid bar) 환자로부터 얻었다. 인간 BGD 유전자(TATA 결합 단백질)에 해당하는 프라이머 및 특이적인 인간 네트린-1 프라이머(Chan, S.S., Zheng, H., Su, M.W., WiIk, R., Killeen, M.T., Hedgecock, E.M. and Culotti, J.G. (1996) Cell, 87, 187- 195)를 레퍼런스로 여기에 사용되었다. Wilson, B. D. et al. Science (2006)에 기재된 것과 같이, 정상 및 유방암 조직 사이에 mRNA 수준에서 약한 다양성을 보이기 때문에 PBGD를 여기서 레퍼런스로 사용하였다. 다른 레퍼런스 TBP도 유사한 결과를 가지고 사용되었다(도시 안함). 네트린-1 발현은 NO 샘플들에서 네트린-1 발현의 평균 및 각 샘플에서 네트린-1 발현 사이의 비로서 주어진다. 비 계수적인 통게 유의성 테스트(Mann- Whitney)를 사용하였다, p 값을 나타냄.
도 6A: DCC-EC-Fc는 DCC/네트린-1 및 UNC5H2/네트린-l 상호작용을 나타낸다. 증가된 농도의 DCC-EC-Fc의 존재 하에서 항-네트린-1 항체를 사용하여 결합된 네트린-1의 정량화 및 DCC-EC-Fc (탑 패널) 또는 UNC5H2-EC-Fc (아래 패널) 코팅으로 ELISA 분석.
도 6A-6C: 네트린-1/수용체 상호작용을 저해하여 전이성 세포사멸을 유도
도 6B 및 6C: 대조군으로 비특이적 IL3-EC-Fc 및 DCC-EC-Fc를 사용하여 67NR 및 4Tl 세포들에서 세포사멸의 정량적 분석. 세포 사멸은 트립판 블루 배제 분석(도 6B), 또는 캐스페이즈 활성 분석(도 6C)에 의하여 정량화되었다. 표준편차를 나타냄(n=3).
도 7A-7C: DCC-5Fbn 처리에 의한 마우스에서 전이 형성의 저해
도 7A: DCC-5Fbn로 처리된 67NR 및 4Tl 세포들에서 세포사멸의 정량적 분석 . MTT 분석은 DCC-5Fbn ([mu]g/ml)의 용량을 증가하여 처리한 후에 증가된 용량으로 67NR 또는 4Tl 세포들에 대하여 수행되었다. 세포 생존의 퍼센트를 나타내었다.표준편차를 나타냄(n=3).
도 7B 및 7C: 4Tl-luc 세포들을 0일에 BALB/c 마우스에 정맥내 주사하고 PBS 또는 DCC-5Fbn를 0일에 시작하여 매 2일마다 한번은 정맥내 한번은 복간 주사하였다. 13 일 후, 전이성 발생을 발광(luminescence) 기록(도 7B, 7C) 또는 현미경 하에서 폐의 조사에 의하여 연구하였다. 도 7B: PBS 처리(오른쪽) 또는 DCC-5Fbn 처리된(왼쪽) 마우스의 냉광 기록의 대표적인 이미지.
도 7C: NightOwLB 시스템에 의해 측정된 냉광 신호의 정량화. 광자/pixel/sec의 수는 각 동물에서 정량하고 냉광 신호의 인덱스는 DCC-5Fbn 처리된 마우스에서 검출된 평균 신호에서 PBS 처리된 마우스에서 평균 광자/마우스 사이의 비율에서 주어진다. 두 독자적인 실험들은 나타냄(실험 1에서 분석된 20 마우스, 실험 2에서 8 마우스). 만들어진 PBS 처리된 마우스 또는 DCC-5Fbn 처리된 마우스로부터 얻은 폐의 대표적인 매크로스코픽 사진(도시 안함)은 PBS 처리된 마우스로부터 얻은 폐에서 나타낼 수 있다.
도 8A 및 8B: 네트린-1 발현 인간 유방암 세포주에 대한 DCC-5Fbn의 효과
도 8A: 다른 48 유방암 세포주로부터 추출된 전체 RNA를 사용한 Q-RT PCR에 의하여 네트린-1의 발현을 조사하였다. 네트린-1 발현은 각 샘플에서 네트린-1 발현 및 하우스키핑 유전자 HMBS 발현(Hydroxymethylbilane synthase) 사이의 비율로 나타냄. TBP는 여기서 대조군으로 사용되었고 유사한 결과를 줌. 그들의 고 수준의 네트린- 1 에 대하여 선택된 두 세포주는 별표로 나타냄.
도 8B: SKBR7 및 T47D 세포주에서 DCC-5Fbn에 의한 세포 사멸 유도. 세포 사멸은 도 4A에 기재된 것과 같은 MTT분석(우측 패널) 또는 도 3D에 기재된 것과 같은 캐스페이즈 활성 측정(좌측 패널)에 의하여 정량화되었다. 표준편차들을 나타냄(n=3).
도 9A 및 9B: 인간 신경아세포종
도 9A: 네트린-1은 인간 신경아세포종에서 침습성의 마커이다.
네트린-1의 발현 프로화일은 정량 실시간 역전사 PCR로 조사. Q-RT PCR은 101 단계 4 또는 4s 신경아세포종 생검으로부터 추출한 전체 RNA를 사용하여 수행되었다. 종양들은 1살 이하의 환자에서 진단된 단계 4(4<1 year) 또는 1살 이상의 환자에서 진단된 단계 4(4>1 year)이었다. 나쁜 징후 암(단계 4 >1 year)은 현저한 과발현의 네트린-1을 보였다는 것이 주목될 수 있다. Student t 테스트가 사용되고 p 값들을 나타내었다.
도 9B: 네트린-1을 내재적으로 생산하는 IMR32 세포들을 대조군으로 ILR3 ( interleukin-3 receptor ectodomain), 또는 DCC-5Fbn를 처리하거나 처리하지 않고 캐스페이즈 활성을 측정하거나(상단) 또는 MTT분석을 통한 세포 생존을 측정하여(하단) 세포 사멸을 분석하였다. IMR32 세포들의 사멸에 효과가 없는 반면에, DCC-5Fbn는 현저한 IMR32 세포 사멸을 유도하였다는 점에 주목. 표준 편차들을 나타냄(n=3).
도 1OA 및 1OB: 신경교종
도 1OA: 네트린-1은 신경교종의 큰 분획에서 과발현된다. 네트린-1의 발현 프로화일은 정량 실시간 역전사 PCR에 의하여 조사하였다. Q-RT PCR는 단계 II 및 단계 III 핍지교종(oligodendroglioma) 및 단계 IV 교아종(glioblastoma) 생검으로부터 추출한 전체 RNA를 사용하여 수행되었고 정상 인간 뇌와 비교하였다.
도 1OB: 네트린-1을 내재적으로 생성하는 GL26 세포들(도시 안함)을 과량의 재조합 네트린-1의 존재 또는 부존재 하에서 DCC-5Fbn를 처리하거나 처리하지 않고 DCC-5Fbn는 현저한 GL26 세포 사멸을 유도하고 이 효과는 네트린-1의 첨가에 의하여 완전하게 저해되는 것을 주목하고, 따라서 DCC-5Fbn 효과는 내재적인 네트린-1의 저해와 직접 연관이 된다는 것을 나타낸다. 표준 편차들을 나타냄(n=3).
도 11A-11C: 폐암
도 11A: 네트린-1은 인간 폐암의 많은 분획에서 과발현된다.
네트린-1의 발현 프로화일은 정량 실시간 역전사 PCR에 의하여 조사하였다. Q-RT PCR는 폐암으로부터 추출된 전체 RNA를 사용하여 수행되었고 정상 조직과 비교하였다.
도 11B: H358 및 H460, 두 NSCLC 세포주들를 세포 사멸분석을 위하여 더 사용하였다. 네트린-1을 내재적으로 발현하는 H358 세포들 및 검출될수있을 정도의 네트린-1을 보이지 못하는 H460 세포들을 과량의 재조합 네트린-1의 존재 또는 부존재 하에서 DCC-5Fbn를 처리 또는 비처리하여 캐스페이즈 활성을 측정하거나(상단) 또는 MTT분석을 통한 세포 생존을 측정하여(하단) 세포 사멸을 분석하였다. DCC-5Fbn는 현저한 H358 세포사멸을 유도하지만 H460 세포들에 대한 효과를 보이지 못한다는 점에 주목하라. 또 H358 세포들 에서 관찰된 사멸 효과는 네트린- 1의 첨가에 의하여 완전하게 저해된다. H460 세포들은 DCC-5Fbn에 민감하지 않다는 사실과 함께, 이들 데이터는 DCC-5SFbn에 대한 에팝토시스를 당한다는 것을 나타낸다. 표준 편차들을 나타냄(n=3).
도 11C: DCC-5Fbn는 누드 마우스에서 이종이식된(xenografted) H358 종양 성장을 저해한다. 5 주령(20-22 g 체중) 암 athymic nu/nu 마우스들을 Charles River로부터 구입하였다. 그 마우스들을 살균된 필터-토핑된 케이지에 넣어서 무균 동물 시설에서 유지하였다. H358 세포들을 20 마이크로리터의 PBS에 5.106 세포들의 피하 주사에 의하여 좌측 옆구리에 이식하였다. 종양이 형성되면, PBS 또는 20 마이크로그램의 DCC-5Fbn를 매일 종양으로 투여(i.t.)하였다(치료의 지속은 화살표로 나타냄). 종양 크기는 41일 동안 캘리퍼로 측정하였다. 종양 부피는 DCC-5Fbn로 처리한 6 마우스 및 PBS로 처리한 4 마우스에 대하여 식 v = (0.5*(길이*넓이2))±SE,*)로 계산되었다. PBS 처리한 종양은 성장한 반면에 DCC-5Fbn 처리한 종양들은 대규모 퇴화를 보였다는 점에 주목.
도 12A 및 12B: 네트린-1은 DCC 및 UNC5H2 다중화를 매개한다
도 12A: HEK293T 세포들에서 네트린-1 존재에서 DCC 다중화. 네트린-1 발현 컨스트럭트를 가지지 아니하거나 c-myc-DCC 발현 컨스트럭트 및/또는 HA-DCC로 일시적으로 트랜스팩션된 HEK293T 세포들의 파쇄액을 myc 풀-다운(IP 알파-myc)을 수행하였다. DCC-HA 존재는 항-HA 항체로 나타내었다.
도 12B: HEK293T 세포들에서 네트린-1 존재에서 UNC5H2 다이머화. 세포 트랜스팩션 및 세포 파쇄액 제조는 (A)에서와 한 것과 같이 했으나 HA-Unc5H2 및/또는 FlagM2-UNC5H2 발현 컨스트럭트로 수행하였다. 세포 파쇄액을 FlagM2 풀다운(IP 알파-Flag)를 수행하였다. HA-UNC5H2 존재는 항-HA 항체로 나타내었다. 전체: 풀-다운 전에 파쇄액에 대한 웨스턴 블럿.
도 13A 및 13B: UNC5H2 다이머화에 대한 화학적으로 유도가능한 시스템의 획인
도 13A: 인공적인 다이머화 시스템을 확인하기 위하여 사용된 두 컨스트럭트(HA 태그된 것, c-myc 태그된 다른 것)을 나타내는 Fv2e-UNC5H2 융합 컨스트럭트의 도식적인 묘사.
도 13B: 다이머화 약제(AP20187)를 가지거나 가지지 않은 Fv2E-UNC5H2 태그된 HA 또는 c-myc로 일시적으로 트랜스팩션된 HEK293T 세포들의 파쇄액을 c-myc 풀-다운(IP 알파-myc)를 수행하였다. 전체: 풀-다운 전에 파쇄액에 대한 웨스턴 블럿.HA-Fv2E- UNC5H2 존재는 항-HA 항체로 나타내었다.
도 14A-14C: 강화된 DCC 다이머화는 그것의 프로아펩토시스 활성을 막는다
도 14A: DCC-유도된 세포사멸은 트립판 블루 배제에 의하여 측정된 바와 같이 AP20187에 의하여 유도된 다이머화에 의하여 저해된다. HEK293T 세포들을AP20187 (AP) 처리 또는 처리하지 않고 mock 플라즈미드(Cont.), Fv2E (Fv), Fv2E-DCC-IC (Fv-DCC)로 트랜스팩션하였다. 모든 조건에서, 세포들은 표면 마커 pKk로 트랜스팩션하였다. 상기 마커를 발현하는 트랜스팩션된 세포들을 MACSelect 마이크로비드로 자기적으로 표지되고 MACS Separator 및 Separation Columns을 사용하여 분리하였다. 트립판 블루 배제를 이들 정제된 세포들에 대하여 분석하였다.
도 14B: UNC5H2-유도된 세포 사멸은 (A)에서와 같이 트립판 블루 배제에 의하여 측정된 바와 같이 AP20187에 의하여 유도된 다이머화에 의하여 저해된다. 세포들을 AP20187 (AP) 처리 또는 처리하지 않고 pMACSKk 및 Fv2E (Fv), Fv2E-UNC5H2-IC (Fv-UNC5H2)로 트랜스팩션하였다.
도 14C: UNC5H2-유도된 캐스페이즈 활성화는 상대적인 캐스페이즈-3 활성에 의하여 측정된 바와 같이 AP20187에 의하여 유도된 다이머화에 의하여 저해된다. HEK293T 세포들 AP20187 (AP) 처리 또는 처리하지 않고 mock 벡터pCMV (Cont.) Fv2E (Fv), Fv2E-UNC5H2-IC (Fv-UNC5H2)로 트랜스팩션하였다. 상대적인 캐스페이즈 활성의 인덱스는 pCMV로 트랜스팩션된 HEK293T 세포들에서 측정된 것과 샘플의 캐스페이즈 활성 사이의 비율로 나타낸다. 표준 편차들을 나타냄(n=3).
도 15A-15C: DCC (DCC- 5Fbn)의 재조합 수용성 5번째 피브로넥틴 도메인이 네트린-1-유도된 DCC-다중화를 저해
도 15A: ELISA 테스트에 의하여 측정된 DCC-5Fbn에 대한 친화곡선은 DCC-5Fbn이 네트린-1에 결합할 수 있다는 것을 보여준다. DCC-5Fbn (100 ng) 또는 IL3-R (600 ng)를 코팅하고 네트린-1의 용량을 증가하여 첨가하였다(0에서 800 ng). IL3 값들을 DCC-5Fbn 값에서 차감하였다. DCC-5Fbn/네트린-l의 대략적인 Kd는 5 nM에서 측정되었다.
도 15B: 경쟁분석. (A)에서와 같이 그러나 DCC의 완전한 세포외 도메인(DCC-EC, 125 ng)를 DCC-5Fbn 대신에 코팅하고 네트린-1을 DCC-5Fbn (625 ng) 또는 완전한 DCC-EC (125 ng)의 존재 하에서 첨가(50 ng) 하였다. DCC-5Fbn은 DCC/네트린-1 상호작용을 경쟁하는데 실패한 점을 주목.
도 15C: 네트린-1-유도된 DCC 다중화는 DCC-5Fbn에 의하여 저해된다. 네트린-1 (300 ng/ml) 및/또는 DCC-5Fbn (900 ng/mL)를 가지거나 가지지 않은 HA-DCC 및/또는 c-myc-DCC 발현 컨스트럭트로 일시적으로 트랜스팩션된 HEK293T 세포들의 파쇄액을 HA 풀-다운(IP 알파-HA)를 수행하였다. c-myc-DCC 존재는 항-c-myc 항체로 나타내었다. 전체: 풀-다운 전에 파쇄액에 대한 웨스턴 블럿.
도 16A 및 16B: DCC-5Fbn는 DCC-유도된 세포 사멸에 대한 네트린-1 저해 효과를 길항
도 16A: HEK293T 세포들을 mock (Cont.) 또는 전장 DCC 컨스트럭트로 일시적으로 트랜스팩션하고 네트린-1(300 ng/ml) 및/또는 DCC-5Fbn (800 ng/mL)으로 배양하거나 배양하지 않았다. 세포 사멸을 트립판 블루 염색으로 분석하였다.
도 16B: 전이성 유방암 4Tl을 DCC-5Fbn (300 ng/mL)의 존재(+ DCC-5Fbn) 또는 부존재(- DCC-5Fbn)에서 24시간 동안 배양하고 세포 사멸을 트립판 블루 염색으로 분석하였다. 표준 편차들을 나타냄(n=3).
본 발명의 상기의 기재와 함께 하기 기재 및 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것이지 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 범위 내의 다른 예들, 효과들 및 변형들은 본 발명이 속하는 당업자에 의하여 명백할 것이다.
실시예 1: 물질 및 방법들
세포주, 세포배양, 트랜스팩션 과정, 시약들 및 면역블럿:
4Tl 및 67NR 세포들은 F. Miller (Detroit, MI, USA)로부터 제공받았다. Cal5l, MCF7, MDA-MB231, 453, 361, 157, SK-BR3, CAMA-I, T47D를 표준 방법을 사용하여 배양하였다. 인간 유방 세포주들은 도 8B에서 리스트하였고, 더욱 특이적으로는 T47D 및 SKB7 세포주들을 D. Birnbaun으로부터 얻었다.67NR 세포들을 리포펙타민 시약(Invitrogen)과 푸로마이신(Sigma) 선택을 사용하여 안정하게 트랜스팩션하였다. 인간 배아 신장 293T 세포들 (HEK293T)의 일시적인 트랜스팩션은 제조업자(Invitrogen)의 지시서에 따라 리포펙타민을 사용하거나 변형된 인산칼슘 방법에 따라 Thibert, C. et al. Science 301, 843-6 (2003)에 기재된 것과 같이 수행하였다. 유방암 4Tl 세포주는 전에 기재하였다(Aslakson, C. J. & Miller, F. R. Cancer Res 52, 1399-405 (1992)). 4Tl-luc 세포들을 하이그로마이신 저항성을 가지는 CMV-루시퍼레이즈 벡터의 안정한 트랜스팩션에 의하여 얻었다. 클론들을 luminoskan Ascent Station (Labsystems)을 사용하여 냉광 강도에 의하여 선택하였다. 면역 블럿들을 항-c-myc (Sigma; 1/200) 항-FlagM2 (Sigma, 1/200) 또는 항-HA (Sigma; 1/500)을 사용하여 Mehlen, P. et al. Nature 395, 801-4 (1998)에 기재된 것과 같이 수행하였다. 인공적인 다이머화제 AP20187는 Ariad Pharmaceuticals로부터 구입하였다. DCC 의 완전한 세포외 도메인(DCC-EC), DCC- EC-Fc는 R&D 시스템으로부터 네트린-1은 Apotech corp로부터 구입하였다. 세포 사멸 분석, 캐스페이즈 활성 측정 및 면역침전을 위하여, AP20187를 최종 농도로 10 nM 사용하였고 네트린-1을 최종 농도로 300 ng/mL사용하였다.
인간 유방암 샘플들:
51 인간 유방암 샘플들을 Centre Leon Berard의 종양 은행으로부터 제공받았다. 종양의 신선한 조직은 전신치료 전에 유방암 수술 동안에 얻어서 액체 질소에서 급속냉동하였다.
위치 특이적인 돌연변이화 및 플라즈미드 컨스트럭트들:
닭 네트린-1을 코딩하는 PGNET-1 pCMV 및 pGNET-1은 Mehlen, P. et al. Nature 395, 801-4 (1998)에 기재되었다. pKk는 Llambi, F. et al. EMBO J 24, 1192-201 (2005)에 기재되었다. DCC (pCR-DCC-IC-D1290N) 및 UNC5H (pCR-UNC5H2-IC-D412N)에 대한 도미넌트 음성 돌연변이체들은 전에 기재하였다(Mehlen, P. et al. Nature 395, 801-4 (1998);Llambi, F., Causeret, F., Bloch-Gallego, E. & Mehlen, P. Embo J 20, 2715-22 (2001);Forcet, C, Ye, X., Granger, L., Corset, V., Shin, H., Bredesen, D.E. and Mehlen, P. (2001) Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 3416- 3421).
HA-DCC는 하기 프라이머들을 사용하여 QuikChange 위치 특이적인 돌연변이화 시스템(Stratagene)에 의하여 주형 pCMV-DCC(Mehlen, P. et al. Nature 395, 801-4 (1998))에서 HA 태그를 삽입시켜서 얻었다:
DCC-HA F: 5'-CACAGGCTCAGCCTTTTATCCATATGATGTACCGGATTATGCATA ACATGTATTTCTGAATG-3' (서열번호:1); DCC-HA R: 5'- CATTCAGAAA
TACATGTTATGCATAATCCGGTACATCATATGGATAAAAGGCTGAGCCTGTG-S'
(서열번호:2). c-myc-DCC는 하기 프라이머들을 사용하여 QuikChange 위치 특이적인 돌연변이화 시스템(Stratagene)에 의하여 주형 pCMV-DCC에서 c-myc 태그를 삽입시켜서 얻었다: DCC-myc F: 5'- CACAGGCTCAGCCTTTGAGCAGAAGTTGATAAGTGAGGAAGATCTGTAACATGTATTTCTGAATG-3' (서열번호:3) DCC-myc R: 5'- CATTCAGAAATACATGTTACAGATCTTCCTCACTTCTCAACTTCTGCTCAAAGGCTGAGCCTGTG-3' (서열번호:4).
Argent Regulated Homodimerization 키트로부터 유래한 HA-Fv2E 코딩하는 발현벡터(pC4M내에)는 Ariad Pharmaceuticals로부터 구입하였다. 이 플라즈미드로부터, 상기 HA-Fv2E-DCC-IC 플라즈미드를 구축하였다. DCC의 세포내 도메인의 PCR 절편(1122-1447)을 하기 프라이머로 얻었다: F 5'-TATGTCGACCGACGCTCTTCAGCCCAGCAGAGA-3' (서열번호:5) 및 R 5'- TATGAATTCTTAGTCGAGTGCGTAGTCTGGTACGTCGTACGGATAAAAGGCTGA GCCTGTGATGGCATTAAG -3' (서열번호:6). 역 프라이머는 DCC의 C-말단에서 HA태그와 융합되었다. 그 PCR 절편은 SalI 및 EcoRI 제한효소 처리에 의해서 HA-Fv2E에 서브클론되었다. 그 c-myc-Fv2E-DCC-IC는 주형으로 pC4M-Fv2E-DCC-IC-HA 및 하기 프라이머들을 가지고 QuikChange 위치 특이적인 돌연변이화 시스템(Stratagene)을 사용하여 얻었다: 프라이머 F: 5'-CTTAATGCCATCACAGGCTCAGCCTTTGAACAGAAACTCATCTCTGAAGAGGAT CTGTAAGAATTCATAAAGGGCAAT-3' (서열번호:7) 및 프라이머 R: 5'- ATTGCCCTTTATGAATTCTTACAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGTTCAAAG GCTGAGCCTGTGATGGCATTAAG-3' (서열번호:8).
HA-UNC5H2(pcDNA3.1 내에)에서 이미 기재(Llambi, F., Causeret, F., Bloch-Gallego, E. & Mehlen, P. Embo J 20, 2715-22 (2001))한 바와 같이, 주형으로 HA-UNC5H2로부터 유래한 Notl-EcoRI PCR 절편을 그리고 하기 프라이머들을 p3xFlag-CMVTM-7.1 (Sigma)에서 클로닝하여서 FlagM2-UNC5H2를 코딩하는 컨스트럭트를 생성하였다: 프라이머 F 5'- GCGCGGCCGCAGGGCCCGGAGCGGG-3' (서열번호:9) 및 프라이머 R 5'- CGGAATTCTCAGCAATCGCCATCAGTGGTC-3' (서열번호: 10). pC4M에서 HA-Fv2E-UNC5H2-IC- 및 c-myc-Fv2E-UNC5H2-IC은 하기 프라이머들을 사용하여 UNC5H2 세포내 도메인의 PCR증폭에 의하여 생성되었다: 각각 UNC5H2- HA F 5'-CGGTCGACGTGTACCGGAGAAACTGC-3' (서열번호: 11) 및 UNC5H2-HA R 5'-GCGAATTCTCATGCATAATCCGGCACATCATACGGATAGC AATCGCCATCAGTGGTC-3' (서열번호: 12), 및 UNC5H2-myc F 5'- CGGTCGACGTGTACCGGAGAAACTGC-3' (서열번호:13) 및 UNC5H2-myc R 5'- GCGAATTCTCACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGCAATCGCCATCA GTGGTC-3' (서열번호: 14). 상기 PCR 절편들은 HA-Fv2E by SalI 및 EcoRI 제한효소에 의하여 HA-Fv2E에서 클로닝되었다.
다음 HA-Fv2E-UNC5H2-IC 및 c-myc-Fv2E-UNC5H2-IC 융합 단백질들을 코딩하는 cDNA를 하기 프라이머들을 사용하여 PCR에 의하여 pcDNA3.1-TOPO에서 서브클론하였다: 각각 Fv2E F 5'-CCACCATGGGGAGTAGCA-3' (서열번호:15) 및 UNC5H2-HA R 5'-TCATGCATAATCCGGCACATCATACGGATAGCAATCGCCATCAGTGGTC-3' (서열번호:16), 및 Fv2E F 5'-CCACCATGGGGAGTAGCA-3' (서열번호:15) 및 UNC5H2-myc R 5'-TCACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGCAATC GCCATCAGTGGTC-3' (서열번호:17)이고 각 주형으로 pC4M 내의 HA-Fv2E-UNC5H2-IC 및 c-myc-Fv2E-UNC5H2-IC.
DCC의 다섯번째 피브로넥틴 타입 III 도메인의 Ps974-DCC-5Fbn 허락하는 박테리아 발현은 주형으로 pDCC-CMV-S를 사용하여 PCR에 의하여 생성된 Pstl/BamHl DNA 절편을 삽입하여 얻었다.
DCC-5Fbn 생성:
DCC-5Fbn 생성은 표준 방법을 사용하여 수행되었다. 간략하게 정리하면 BL21 세포들을 이미다졸에 대하여 DCC-5Fbn을 발현하게 하고 BL21 파쇄액을 Flag-agarose (Sigma)를 사용하여 친화 크로마토그래피를 수행하였다.
면역침전:
동시면역침전은 Geisbrecht, B. V., Dowd, K. A., Barfield, R. W., Longo, P. A. & Leahy, D. J. J Biol Chem 278, 32561-8 (2003)에 기재된 것과 같이 여러 태그된 컨스트럭트를 가지고 트랜스팩션된 HEK293T 세포들에서 수행되었다. 정리하면, HEK293T 세포들을 프로테이즈 저해제 존재 하에서 50 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 5 mM EDTA 및 0.1% NP-40에서 파쇄하고 항-HA (Sigma), 항-c-myc 항체(Sigma), 항- FlagM2 (Sigma) 및 단백질-A Sepharose (Sigma)로 더욱 배양하였다. 세척을 50 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 5 mM EDTA에서 수행하였다.
결합 분석 및 ELISA 경쟁 분석:
DCC-5Fbn (lOOng)또는 IL3-R (R&D systems, 600ng)을 maxisorp 플레이트(Nunc) 상에 코팅하고 결합 분석을 위하여 네트린-1 (Apotech)의 용량을 증가하면서 첨가하였다(0 to 800ng). DCC-EC(R&D systems, 125ng)을 ELISA 경쟁 분석을 위하여 maxisorp 플레이트 상에 코팅하였다. 네트린-1-FlagM2 (50ng) 및 경쟁자 DCC-EC (125ng) 또는 DCC-5Fbn (625ng)을 그 후에 동시에 첨가하였다. 세척 후, 결합 분석 또는 ELISA 경쟁 분석을 위하여, 여전히 고정된 잔류 네트린-1 -FlagM2을 항-FlagM2 항체(Sigma)로 나타내었다.
DCC/네트린-1 ELISA 분석:
DCC-EC-Fc (1.25ng/ml) 또는 UNC5H2-EC-Fc (0.5ng/ml)을 제조업자의 지시에 따라서 96-웰 maxisorp 플레이트(Nunc) 상에 흡착하였다. Flag-태그된 네트린-1 (0.5ng/ml)을 그 후에 증가된 농도의 DCC-EC-Fc와 함께 첨가하였다. 1시간 배양 후, 플레이트들을 세척하고 결합된 네트린-1을 항-flagM2 항체(Sigma) 및 HRP-염소-항-마우스(Jackson)를 사용하여 면역표지하여 검출하였다. 발색측정은 다중 표지Victor station (Wallac) 상에서 수행되었다.
세포 사멸 분석:
67NR, 4Tl, CAL51, T47D 및 SKBR7를 혈청-희소 배지에서 성장시키고 DCC-EC-Fc 또는 DCC-5Fbn을 24시간 동안 처리 또는 비처리하였다. 세포 사멸은 Mehlen, P. et al. Nature 395, 801-4 (1998)에 기재된 것과 같이 트립판 블루 염색 방법을 사용하여 분석하였다. 세포 사멸의 정도는 여러 세포군에서 트립판 블루-포지티브 세포들의 퍼센트로 나타내었다. 트랜스팩션된 세포들을 선택하기 위하여, 세포들을 관심있는 유전자를 코딩하는 플라즈미드 및 표면 마커 pKk로 동시트랜스팩션하였다. 마커를 발현하는 트랜스팩션된 세포들을 MACSelect Microbeads로 자기적으로 표지하고 MACS Separator 및 Separation Columns(Miltenyi Biotec)을 사용하여 분리하였다. 트립판 블루 배제를 이들 정제된 세포들에 대하여 분석하였다. 세포 생존은 제조업자의 방법에 따라 Vybrant MTT 분석 키트(Molecular Probes)를 사용하여 MTT 분석에 의하여 측정하였다.
캐스페이즈 활성 측정:
상대적인 캐스페이즈 활성은 하기와 같은 유세포분석법에 의하여 결정되었다: 2.105 처리된 세포들을 수집하여서, 1 ml PBS로 1회 세척하고, FITC-VAD-fmk (CaspACE, Promega)을 포함하는 200마이크로리터의 염색 용액에서 재부유하였다. 37℃에서 60분 배양 후, 세포들을 유세포분석을 위하여 1 ml PBS에서 세척하고 200 마이크로리터 PBS에 재부유하였다. 염색된 세포들을 488 nm과 525-550 nm (filter FLl)의 각각 여기 및 방출 세팅을 가지는 CellQuest 분석 소프트웨어 및 FACS Calibur (Becton Dickinson)를 사용하여 계수하였다. 캐스페이즈-3 활성은 BioVision으로부터 구입한 캐스페이즈-3 분석을 사용하여 측정하였다. 캐스페이즈 활성은 pCMV로 트랜스팩션된 HEK293T 세포들에서 측정된 것과 샘플의 캐스페이즈 활성 사이의 비율로 나타낸다. 세포 사멸 분석 및 캐스페이즈 활성 측정을 위하여, AP20187 또는/및 네트린-1 또는/및 DCC-5Fbn을 세포들을 수집하기 1시간 전에 그리고 20시간에 세포 배양 배지에 첨가하였다.
정량 RT-PCR:
인간 유방암에서 네트린-1 발현을 분석하기 위하여, 전체 RNA를 Nucleospin RNAII 키트(Macherey-Nagel)를 사용하여 유방암에 대한 수술을 하는 환자의 생검으로부터 추출하여서 1 마이크로그램을 iScript cDNA 합성 키트(BioRad)를 사용하여 역전사하였다. 실시간 정량적 RT-PCR은 Light Cycler FastStart DNA Master SYBERGreen I 키트(Roche)를 사용하여 LightCycler 2.0 apparatus (Roche)에서 수행하였다. 네트린-1의 프라이머 선택뿐 아니라 모든 적정 증폭에 대한 반응조건은 Mazelin, L. et al. Nature 431, 80-4 (2004)에 기재된 것과 같이 결정되었다. 정상 및 유방암 조직 사이에서 발현의 편차를 덜 보이는 편재하게 발현되는 인간 PBGD, TBP 및 마우스 RPLPO 유전자들(de Cremoux, P. et al. Endocr Relat Cancer 11, 489-95 (2004);de Kok, J. B. et al. Lab Invest 85, 154-9 (2005))을 내부 대조군으로 사용하였다. 하기 프라이머들을 사용하였다:
PBGD:
- FOR: 5'-CTGGAGTTCAGGAGTATTCGGGG-3' (서열번호: 18),
- REV: 5'-CAGATCCAAGATGTCCTGGTCCTT-3' (서열번호: 19);
TBP:
- FOR: 5'-CACGAACCACGGCACTGATT-3' (서열번호:20),
- REV: 5' TTTTCTTGCTGCCAGTCTGGAC 3' (서열번호:21);
인간 네트린- 1-NTN 1 :
- FOR: 5'-TGCAAGAAGGACTATGCCGTC-3' (서열번호:22),
- REV: S'-GCTCGTGCCCTGCTTATACAC-3' (서열번호:23);
UNC5B:
- FOR: 5'-TGCAGGAGAACCTCATGGTC-3' (서열번호:24),
-REV: 5'-GGGCTGGAGGATTACTGGTG-3' (서열번호:25);
DCC:
- FOR: 5'-AGCCAATGGGAAAATTACTGCTTAC-3'(서열번호:26),
- REV: 5'-AGGTTGAGATCCATGATTTGATGAG-3'(서열번호:27);
UNC5C:
- FOR: 5'-GCAAATTGCTGGCTAAATATCAGGAA-3'(서열번호:28),
-REV: 5-GCTCCACTGTGTTCAGGCTAAATCTT-3' (서열번호:29).
마우스들, 정맥내 및 유선 주사, 전이 발생의 측정:
동계적(Syngenic) 마우스 모델. Jackson Laboratory으로부터 구입한 8-11주령의 암놈 BALB/cByJ 마우스들을 수술에 사용하였다. 67NR 세포들의 유선 주사를 위하여, 마우스를 2,2,2-트리브로모에탄올로 마취하고, 50 마이크로리터 PBS의 106 세포들을 유선에 주사하고 종양이 1.5 cm를 초과하고 동물의 이동에 장애를 야기할 때 희생시켰다. 정맥내 주사를 위하여, in 150 마이크로 리터 PBS 속의 105 종양 4Tl-luc 세포들을 꼬리정맥에 주사하고 13- 15 일(4Tl 세포들 주사 후) 또는 20-23 일(67NR 세포들 주사 후)에 희생하거나 냉광 기록을 사용하여 분석하였다. 동물을 희생하였을 때, 폐를 제거하고 중량을 측정하고 동물의 전체 중량을 비교하고 전이성 결절을 계수하였다.
누드 마우스에 이종이식:
5주령(20-22 g 체중) 암놈 athymic nu/nu를 Charles River로부터 구입하였다. 그 마우스들을 살균된 필터-토핑된 케이지에 넣어서 무균 동물 시설에서 유지하였다. 인간 유방암 세포주(SKBR7, T47D 및 H358)들을 200 마이크로리터의 PBS에 5.106 세포들의 피하 주사에 의하여 좌측 옆구리에 이식하였다. 종양이 형성되면(T47D에 대해서는 5주, SKBR7에 대해서는 2주 그리고 H358에 대해서는 5일), PBS 또는 20 마이크로그램의 DCC-5Fbn를 14일 동안 매일 종양으로 투여(i.t.)하였다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정하였다. 종양 부피는 식 v = (0.5*(길이*넓이2))±SE,*)로 계산되었다.
종양 분석:
4 μm-두께의 폐 절편을 제조하여 헤마토시린-에오신-사프론으로 염색하였다. 종양 병변의 등급과 조직학적 분류는 맹 방법(blinded fashion)에서 수행하고 표준 방법에 따랐다. 4Tl- luc 세포들을 사용한 전이의 인 비보 이미지를 위하여, 복강내 주사된 내부톡신-없는 루시페린(Promega) (120 mg/kg 체중)의 생냉광(bioluminescent) 산화로부터 야기된 빛을 TEM SEGA로부터 기체 이소흐루란(isofiurane)을 가지는 마취 시스템을 사용하여 erthold Technologies로부터 구입한 NightOWL LB 981 NC 100 시스템을 가지고 검출하고 정량(주사 10분 후)하였다.
실시예 2: 네트린 -1은 에팝토시스를 저해하여 유방암의 전이를 지령한다
본 발명자들은 30 유방 일차 종양의 패널에서 Q-RT-PCR에 의하여 네트린-1과 그것의 의존성 수용체-즉 DCC 및 UNC5H 발현을 분석하였고, 그 중 15는 알려진 전이 연관이 없었고, 15는 전이성으로 진단되었다. 두 타입 사이에 UNC5H는 유의적인 변화를 보이지 않았으며 DCC는 거의 검출되지 않은 반면, 네트린-1은 비전이성 유방암 보다 전이성 유방암에서 더 현저하게 발현된 것으로 나타났다(도 1A).
60%의 테스트한 전이성 유방암은 네트린-1의 과발현을 보였다 (1.4에서 9.6 배 범위, p<0.015) (표 1).
n=15 전이성 비전이성
네트린-1을 과발현하는 유방암의 % 60 33
네트린-1의 과발현 범위 1.4-9.6 1.6-2.9
표 1은 비전이성 생검에서 평균 발현보다 더 높은 네트린=1 발현을 보이는 샘플의 퍼센트를 과발현의 범위와 같이 나타낸 것이다.
마우스에서 Miller와 동료들은 전이성 대 비전이성의 생검을 연구하기 위한 강력한 모델을 개발하였다: BALB/c 마우스에서 자연적으로 발생하는 단일 일차 포유류 종양으로부터, 동계적 마우스를 주사한 경우에 다른 전이능을 보이는 일련의 세포주들을 얻었다., 특히 67NR 세포들은 일차 포유류 종양을 형성하지만 전이는 없는 반면, 4Tl 세포들은 특히 폐, 골수 및 간에서 전이와 일차 종양을 형성하였다(Aslakson, C. J. & Miller, F. R. Cancer Res 52, 1399-405 (1992)). 흥미롭게 네트린-1은 67NR 세포들에서 검출되지 않은 반면에, 네트린-1은 4Tl 세포들에서는 과발현되었다(도 1B).
4Tl 세포들의 전이능을 67NR 세포들의 전이능과 비교하여, 네트린-1 발현과 관련이 있는지를 분석하기 위하여, 67NR 세포들을 네트린-1을 안정적으로 발현하게 하였다. 네트린-1을 발현하는 Mock 트랜스팩션된 67NR 세포들 또는 67NR-net 세포들 (도 2A, 2B)을 유선 또는 정맥내 주사하고 전이를 폐의 해부-병리학(anatomo-pathology)에 의하여 모니터하였다. 지방 패드에 주사한 경우에 양 세포주 모두 전이를 형성하는데 실패하였고, 67NR 에서 네트린-1의 존재는 일차 부위로부터 폐전이를 형성하는데 충분하지 않다는 것을 암시한다. 그러나 세포들을 정맥내 주사한 경우에, 폐에서 전이의 현저한 증가가 네트린-1 발현하는 67NR에서 검출되었다(도 2C).
능막하 병변 실질성내(intra-parenchymatous) 결절
클론으로 주사된 마우스 침범된 폐의 수 폐당 결절 수(범위) 침범된 폐의 수 폐당 결절 수(범위)
67NR1 3 0-5 0 0
67NR2 2 0-2 0 0
67NR-net1 3 0-5 1 0-4
67NR-net2 1 0-3 2 1-2
표 2는 능막하(폐 외부 전이) 및 실질성 내 결절(폐 내 전이)의 수를 나타냄.
따라서 , 네트린-1 발현은 아마도 인트라베이션 후 종양 세포들을 유리하게 함에 의하여 전이 형성을 도와주는 중요한 사건을 나타낸다.
네트린-1이 인트라베이션 후 67NR 세포들의 전이능에 충분하게 나타나고 네트린-1이 네트린-1 의존성 수용체-유도된 세포 사멸을 저해하기 때문에(Mehlen, P. et al. Nature 395, 801-4 (1998);Llambi, F., Causeret, F., Bloch-Gallego, E. & Mehlen, P. Embo J 20, 2715-22 (2001);azelin, L. et al. Nature 431, 80-4 (2004)), 본 발명자들은 네트린-1의 오토크라인 생성이 이들 세포에서 DCC/UNC5H-유도된 세포 사멸을 저해하여 4Tl 세포들에 선택적인 잇점을 제공하는지를 조사하였다. 네트린-1의 N-말단에 위치한 도메인 (소위 라미닌-VI 도메인)은 DCC 및 UNC5H 수용체 모두와 상호작용하여서(도 3A;Geisbrecht, B. V., Dowd, K. A., Barfield, R. W., Longo, P. A. & Leahy, D. J. J Biol Chem 278, 32561-8 (2003) ), DCC의 수용성 세포외 도메인(DCC-EC-Fc)은 DCC/네트린-1 및 UNC5H/네트린-l 상호작용 모두을 저해할 수 있다(도시 안함). 그 다음 DCC-EC-Fc는 4Tl 세포들의 배양에 첨가되고 세포사멸은 트립판 블루 배제 분석(도 3B) 또는 캐스페이즈 활성을 측정(도 3C)하여 모니터되었다. 도 3C에서 나타낸 바와 같이, 배양 배지에서 경쟁하는 단백질의 첨가는 용량 의존적으로 4Tl 세포들의 사멸을 촉발한다. 게다가 이 효과는 DCC-EC-Fc는 67NR 세포 사멸에 효과가 없고 IL3 R-EC-Fc(IL3 수용체의 세포외 도메인)는 4Tl 세포 사멸을 촉발하지 않으므로(도 3B, 3C) 특이적이다. 이 효과는 과량의 네트린-1 첨가로 4Tl 세포들에 대한 DCC-EC-Fc의 프로-에팝토시스 활성을 저해하는 DCC-EC-Fc와 함께 네트린-1 저해에 기인한다(도시 안함). 더 작은 도메인에 대한 경쟁을 제한하기 위하여, 본 발명자들은 네트린-1과 상호작용하는 것으로 알려진(Geisbrecht, B. V., Dowd, K. A., Barfield, R. W., Longo, P. A. & Leahy, D. J. J Biol Chem 278, 32561-8 (2003)) DCC의 다섯번째 피브로넥틴 타입 III를 생성하였다. 이 도메인-DCC-5Fbn-의 첨가는 4Tl 세포들에 대하여 유사한 프로-에팝토시스 활성을 가졌다(도 3D). 따라서 네트린-1이 마우스에서 종양 세포들에 대한 전이능을 주는 것으로 나타난 반면, 이들 네트린- 1 발현하는 전이성 종양 세포들은 네트린-1 /수용체 상호작용의 저해에 의하여 에팝토시스에 관여될 수 있다.
이것이 인간 유방암 세포들에서도 적용되는지를 더 분석하기 위하여, 네트린-1 발현을 인간 전이성 유방암 세포주들의 패널에서 분석하였다(표 3 참고).
인간 유방암 세포주 네트린-1 전사 발현 DCC-EC-Fc 민감성
MDA-MB 157 ++++ +/-
MCF-7 ++++ -
CAMA-1 +++ -
SKBR3 ++ ND
SAV-NUDE ++ ND
Cal51 ++ +++
MDA-MB231 + ++
MDA-MB453 + +
T47D - ND
T47D* ++ ++
* 또 다른 T47D 세포주에서 수행
표 3은 트립판 블루 배제에 의한 세포 사멸의 측정에 의한 DCC-EC-Fc에 대한 그들의 민감성 및 도 1A, 1B에서와 같이 Q-RT PCR에 의한 네트린-1 발현을 분석하였다. 네트린-1 발현의 상대적인 양 및 DCC-EC-Fc 민감성을 (+)로 나타내고, 이들 기준의 부존재는 (-)로 나타내었다. 일부 세포주에서 DCC-EC-Fc는 결정되지 않았다(ND).
예상한 것과 같이, 네트린-1은 많은 수의 전이성 세포주에서 발현되고 그들 중 일부는 DCC-EC-Fc의 존재하에서 배양될 때 에팝토시스를 진행한다. 일 예서와 같이 CAL51 세포들은 DCC-Ec-Fc에 대하여 용량 의존적으로 에팝토시스를 진행한다. 상기에서와 같이 과량의 네트린-1 첨가는 DCC-EC-Fc의 효과를 복귀하고, 그 경쟁하는 단백질들은 네트린-1 /네트린-1 수용체들 상호작용을 저해하여서 이들 인간 세포주를 사멸한다는 견해를 지지한다. 게다가 CAL51 세포들로부터 클론 선택은 CAL51-36 세포주의 확립을 가능하게 하고, 그것은 DCC-EC-Fc에 대한 세포 사멸을 더 민감하게 한다(도 4B). 결론적으로 DCC-EC-Fc 또는 DCC-5Fbn가 인간 전이성 종양 세포들의 선택적 에팝토시스를 촉발하는 훌륭한 도구를 나타낼 수 있다.
여기서 본 발명자들은 네트린-1 발현이 유방암 보급의 마커로 간주될 수 있다는 것을 보인다. 전이성을 가지는 절반 이상의 유방암은 증가된 네트린-1 발현을 보였다. 상기 기재된 마우스 모델 및 인간 유방암 세포주에서 얻은 데이터 모두는 이 증가된 네트린-1 -의존성 수용체 유도된 에팝토시스를 회피하고 결론적으로 네트린-1 유용성과 독립적으로 생존하는 종양 세포에 의하여 얻어진 선택적 잇점이다라는 면을 지지한다. 기계론적인 관점으로부터 이 네트린-1의 자기분비 발현은 UNC5H에 의하여 유도된 세포사멸을 저해한다. 사실, DCC는 연구된 전이성 및 비전이성 두 군에서 거의 검출되지 않았고 따라서 DCC는 유방 종양형성 기단 동안 초기에 다운-조절되거나 유방 조직에서 단지 약하게 발현된다는 것을 암시한다. 게다가, UNC5H 프로-에팝토시스 활성의 도미넌트 네가티브 돌연변이 형태의 동시발현에 의한 UNC5H-유도된 에팝토시스의 저해는 DCC-EC-Fc에 대한 CAL51 세포 사멸을 저해한다(도시 안함). 이것은 UNC5H2 프로-에팝토시스 활성의 일부가 전이 조절에 관여하는 단백질(Inbal, B. et al. Nature 390, 180-4 (1997)) 세린/트레오닌 DAPK의 활성화를 통하여 진행된다(Llambi, F. et al. EMBO J24, 1192-201 (2005))는 최근의 결과와 일치하는 것 같다.
이들 관찰은 종양 발생의 조절에서 리간드/의존성 수용체의 중요성에 대한 증거를 제공할 뿐 아니라 새로운 치료전략을 가능하게 한다. 사실, 이제까지 전이성 유방암의 효과적인 치료 방법이 없어서 해마다 세계적으로 400,000 여성들의 사망에 이른다(Andre, F. et al. J Clin Oncol 22, 3302-8 (2004)). 여기서 본 발명자들은 네트린-1과 그것의 의존성 수용체들 사이의 상호작용의 저해에 기초한 치료는 전이성 유방암으로 고생하는 절반의 환자에 긍정적인 효과를 가지게 한다는 것을 제안한다. 이들 치료들은 여기에 기재된 DCC-5Fbn 단백질 또는 단일클론항체 도는 화학 약물을 포함할 수 있다. 이것이 일차 유방암을 진단받은 여성에 대한 장기적인 예방적 치료를 수반하는 전이 형성을 저해하는 전략 또는 나타난 전이 퇴화를 유도하는데 사용될 수 있는 전략으로 간주될 수 있는지 더 많은 임상 시도가 이점을 대답해야한다.
여기서 인간 비전이성 유방암과 다르게 대부분의 전이성 유방암은 과발현의
네트린-1을 나타낸 것으로 기재하였다. 마우스 모델에서 본 발명자들은 비-전이성 포유류 종양 세포들에서 네트린-1의 강화된 발현은 폐에서 전이와 관련이 있다는 것을 나타내었다. 게다가 네트린-1을 크게 발현하는 것으로 나타난 마우스 또는 인간 전이성 종양 세포주들은 경쟁하는 단백질에 의하여 네트린- 1/수용체 상호작용이 저해받는 경우에 에팝토시스를 진행한다. 따라서, 네트린-1은 전이성 유방암과 같은 인간 전이성 암에 대한 마커이고 네트린-1 /수용체 상호작용의 저해는 전이성 세포사멸을 유도하는 치료적 접근을 나타낸다.
실시예 3: 네트린 -1 의존성 수용체들 경로의 회복은 전이성 유방암에서 에팝 토시스를 촉발
네트린-1 및 그것의 의존성 수용체들-즉, DCC, UNC5H2, UNC5H3 발현은 51 유방암 패널에서 Q-RT-PCR에 의하여 분석하였다. 종양이 유방에 위치(NO, 16 환자들), 결절 관련(N+, 19 환자들) 또는 진료시에 먼 전이 질환(M+, 16 환자들)인 환자들을 포함한다. DCC는 거의 검출되지 않고 UNC5H 발현은 여러 타입의 종양 사이에서 현저한 차이를 나타내지 못하는 반면(도시 안함), 네트린-1은 N+ 종양에서 더 높은 네트린-1 발현의 범위를 가지고 NO 종양보다 N+종양에서 현저하게 더 발현된다(평균: 1.8 대 0.5, p=0.007)(도 5 및 표 4).
표 4는 과발현의 범위에서와 같이 5 배 또는 15배 이상 네트린-1 발현을 보이는 샘플의 퍼센트를 나타냄.
n=51
 N0
종양이 유방에 위치(n=16)		 N+
결절 관련(n=16)		 M+
먼 전이(n=16)
네트린-1을 과발현하는 유방암의 %
 31 73.7 93.7
네트린-1을 과발현하는 유방암의 %
 5배 이상 0 31.5 62.5
15배 이상 0 0 37.5
네트린-1의 과발현의 범위
 0.02-4.6 0.03-12.8 0.6-111.7
31.5%의 N+ 종양들은 네트린-1 발현에서 적어도 5배 증가를 보인 반면 테스트된 NO 종양에서 그러한 증가는 검출되지 않음(도 5 및 표 4). 심지어 더 큰 차이는 M+ 대 NO 종양에서 네트린-1 발현을 비교할 때 관찰(평균: 7.8 대 0.5, p 〈O.0001). 이 선을 따라서 62.5%의 M+ 종양들은 적어도 5배의 네트린-1 발현의 증가를 보였다. 네트린-1 발현에서 현저한 차이가 N+ 및 M+ 종양 사이에도 존재한다(평균: 1.8 대 7.8, p=0.009). 게다가, 네트린-1 과발현이 N+ 종양보다 M+종양에서 더 높다, 37.5%의 M+ 종양들이 네트린-1 수준에서 15배 이상 나타내는 반면, 그러한 증가는 N+ 종양들에서는 검출되지 않는다(도 5 및 표 4). 따라서 네트린-1 업-조절은 인간 유방암에서 먼 전이성 질병 및 결절 관여의 마커이다.
마우스에서 Miller와 동료들은 전이성 대 비전이성의 생검을 연구하기 위한 강력한 모델을 개발하였다: BALB/c 마우스에서 자연적으로 발생하는 단일 일차 포유류 종양으로부터, 동계적 마우스를 주사한 경우에 다른 전이능을 보이는 일련의 세포주들을 얻었다., 특히 67NR 세포들은 일차 포유류 종양을 형성하지만 전이는 없는 반면, 4Tl 세포들은 특히 폐, 골수 및 간에서 전이와 일차 종양을 형성하였다(Aslakson, C. J. & Miller, F. R. Cancer Res 52, 1399-405 (1992)). 흥미롭게 네트린-1은 67NR 세포들에서 검출되지 않은 반면, 네트린-1은 4Tl 세포들에서는 과발현되었다(도 1B).
4Tl 세포들의 전이능을 67NR 세포들의 전이능과 비교하여, 네트린-1 발현과 관련이 있는지를 분석하기 위하여, 67NR 세포들을 네트린-1을 안정적으로 발현하게 하였다. 네트린-1을 발현하는 Mock 트랜스팩션된 67NR 세포들 또는 67NR-net 세포들 (도 2A, 및 2B)을 유선 또는 정맥내 주사하고 전이를 폐의 해부-병리학(anatomo-pathology)에 의하여 모니터하였다. 지방 패드에 주사한 경우에 양 세포주 모두 간 또는 폐에서 전이를 형성하는데 실패하였다( 네트린-1 발현하는 67NR 세포를 19 마우스에 주사하고 단지 두 개의 의심스런 미세-전이가 하나는 폐에서 다른 하나는 간에서 검출되었다(표 5).
표 5는 지방 패드-주사된 67NR 대 네트린-1 발현하는 세포들의 폐 및 간 전이. 푸로마이신 저항성을 가지는 한 대조군 세포 클론(67NR-mock), 한 네트린-1 발현하는 세포 클론(67NRnetl) 및 네트린-1 안정하게 트랜스팩션된 67NR의 한 폴리클론 군(67NR-netl-polyclonal)을 마우스 지방 패드에 주사하고 전이를 폐 또는 간 환경에서 분석하였다.
주사된 세포들 마우스(n) 일차 종양들 전이 견해
67NR-mock 9 9 0
67NR-netl 7 7 0 간에서 1 미세-전이의 의심
67NR-netl-polyclonal 12 12 0 폐에서 1 미세-전이의 의심
표 5:지방 패드-주사된 67NR 대 네트린-1 발현하는 세포들의 폐 및 간 전이. 푸로마이신 저항성을 가지는 한 대조군 세포 클론(67NR-mock), 한 네트린-1 발현하는 세포 클론(67NRnetl) 및 네트린-1 안정하게 트랜스팩션된 67NR의 한 폴리클론 군(67NR-netl-polyclonal)을 마우스 지방 패드에 주사하고 전이를 폐 또는 간 환경에서 분석하였다.
따라서 종양 세포들에서 네트린-1 발현은 일차 부위로부터 전이 형성을 가능하게하는데 충분하지 않다.
네트린-1이 네트린-1 의존성 수용체-유도된 세포 사멸을 저해하는 것으로 알려졌기 때문에((Mehlen, P. et al. Nature 395, 801-4 (1998);Llambi, F., Causeret, F., Bloch-Gallego, E. & Mehlen, P. Embo J 20, 2715-22 (2001);azelin, L. et al. Nature 431, 80-4 (2004)), 다음 본 발명자들은 전이성 4Tl 세포들에서 검출된 네트린-1의 오토크라인 생성은 DCC/UNC5H-유도된 세포 사멸을 저해하여서 이들 세포들에 대한 선택적 효과를 주는지를 조사하였다. 이것을 분석하기 위하여, 본 발명자들은 네트린-1을 적정할 수 있는 화합물을 찾았다. 네트린-1의 N-말단에 위치한 도메인(소위 라미닌-VI 도메인)이 DCC 및 UNC5H 수용체들 모두와 상호작용하는 것이 보고되었다(도 3A; Geisbrecht, B. V., Dowd, K. A., Barfield, R. W., Longo, P. A. & Leahy, D. J. J Biol Chem 278, 32561-8 (2003)). 본 발명자들은 ELISA 분석에 의하여 측정된 것과 같이 DCC의 수용성 세포외 도메인(DCC-EC-Fc)이 DCC/네트린-1 및 UNC5H2/네트린-l 상호작용 둘 다를 저해할 수 있다는 것을 보였다(도 6A). DCC-EC-Fc를 그 다음 4Tl 세포들의 배양에 첨가했고 트립판 블루 배제 분석(도 3 B 및 6B) 또는 유세포 분석에 의한 캐스페이즈 활성을 측정(도 3C 및 6C)하여서 세포 사멸을 모니터하였다. 도 3B, 3C, 6B 및 6C에 나타낸 바와 같이 배양 배지에서 경쟁하는 단백질의 첨가가 용량 의존적으로 4Tl 세포들의 세포사멸을 촉발한다. 이 효과는 DCC-EC-Fc는 67NR 세포 사멸에 대한 효과가 없고(도 3B, 3C, 6B 및 6C) 그리고 IL3 R-EC-Fc(IL3 수용체의 세포외 도메인)는 4Tl 세포 사멸을 촉발하는데 실패하였기 때문에(도 3D) 이 효과는 특이적이다. 따라서 4Tl 세포들은 네트린-1의 오토크라인 생성을 통하여 생존하고, 그것은 네트린-1 수용체-유도된 세포 사멸을 저해한다.
DCC의 완전한 세포외 도메인이 인 비보 및 치료에 대한 유일의 적당한 관심으로 나타나기 때문에(DCC-EC-Fc는 약 1100 아미노산 크기), 본 발명자들은 4Tl 세포들에서 에팝토시스를 촉발할 수 있는 DCC 세포외 도메인으로부터 유래한 대안 폴리펩타이드를 찾았다. 본 발명자들은 결론적으로 네트린-1과 상호작용하는 것으로 알려진 DCC의 다섯 번째 타입 III 도메인, DCC-5Fbn를 생성하였다(Geisbrecht, B. V., Dowd, K. A., Barfield, R. W., Longo, P. A. & Leahy, D. J. J Biol Chem 278, 32561-8 (2003)) (도 3A). 흥미롭게도, 이 100 아미노산 단백질 DCC/네트린-1 또는 UNC5H/네트린-l의 결합을 저해하지 못하였지만, 이들 수용체들의 다중화를 촉발하는 네트린-1의 능력에 영향을 주었다(실시예 4 참고). DCC 및 UNC5H 다중화가 DCC/UNC5H-유도된 세포 사멸에 대한 네트린-1 저해 활성에 대한 예비이기 때문에, DCC-5Fbn의 첨가가 네트린-1의 존재 하에서 배당된 DCC-발현하는 세포들에서 에팝토시스를 촉발하고(Llambi, F. et al. EMBO. J 24, 1192-201 (2005)) 양 4Tl의 사멸을 촉발하였다(도 7A).
본 발명자들은 다음으로 인 비트로에서 관찰되는 세포 사멸 효과가 인 비보에 확장될 수 있는지를 조사하였다. 그렇게 하기 위하여, 4Tl 세포들을 루시퍼레이즈 기반 벡터로 안정적으로 트랜스팩션시키고 4Tl-luc 세포들 동계적 BALB/c 마우스로 정맥내 주사하였다. 그 후 마우스를 PBS 버퍼 또는 Flag-태그된-DCC-5Fbn (1.25μg/마우스g/주사)로 0일에서 13일까지 복강내 그리고 정맥내 주사(한번은 복강, 한번은 정맥 주사, 이틀마다 한번 주사)하였다. 그 후 전이 형성은 냉광 기록을 사용하여 분석되었다. 도 7B 및 7C에 나타난 바와 같이, 정맥 주사된 경우에, 4Tl-luc 세포들은 폐를 효과적으로 군집화하였다. 반대로 DCC-5Fbn로 처리된 마우스는 폐 전이의 현저한 감소를 나타내었다(도 7B 및 7C). 이 전이 형성의 저해는 폐의 해부-병리 조사에 의하여 확인되었다(도시 안함, 표 6 참고).
처리 마우스(n) 마우스 당 전이의 평균 마우스 당 전이의 범위
PBS 10 42.4 0-75
DCC-5Fbn 10 2.6 0-6
표 6: 각 마우스에서 폐 전이 결절의 수를 두 처리된 군(+PBS, +DCC-5Fbn)에서 해부 현미경 하에서 계수하였다
유사한 결과들을 PBS 대신에 GST-FADD 그리고 Flag-태그된-DCC-5Fbn 대신에 GST- 태그된-DCC-5Fbn의 매일 복강내 주사를 수행한 경우에도 얻었다(도시 안함). 따라서 마우스에서 네트린-1 오토크라인 발현에 의하여 제공된 프로-서바이벌 활성의 DCC-5Fbn에 의한 저해는 전이 예방과 관련된다.
네트린-1 오토크라인 발현에 의하여 얻어진 생존 효과는 그것이 인간 유방암 세포주에서도 검출되기 때문에 쥐 종양 세포들에 제한되지 않는다. 사실, 네트린-1은 상당한 분획의 인간 유방암 세포주들에서 발현되는 것을 나타내고(도 8A) 자연적으로 네트린-1 발현하는 인간 유방 선암 T47D 또는 SKBR7 세포배양에 DCC-EC-Fc 또는 DCC-5Fbn의 첨가는 캐스페이즈-3 활성 분석 또는 MTT 분석에 의하여 측정된 세포 사멸 유도를 촉발한다(도 8B 및 도시 안함). 이 효과는 네트린-1 저해에 기인하고, 과량의 네트린-1의 첨가에 따라, DCC-EC-Fc/DCC-5Fbn의 프로-에팝토시스 활성을 저해하였다(도시 안함). DCC-5Fbn의 항 종양 효과를 모니터하기 위하여, T47D 세포들의 이종이식을 누드 마우스에 이식하였다. 종양이 알수 있는 크기에 도달하면, 마우스를 PBS 또는 DCC-5Fbn로 매일 처리하고 종양 크기를 18일 동안 측정하였다. 상기 동계적 모델에서 얻은 데이터와 유사하게, DCC-5Fbn는 종양 성장을 완전하게 저해한다(표 7).
처리 마우스(n) 종양 성장(〉40%) 종양 퇴화(〉30%)
PBS 4 3 0
DCC-5Fbn 5 0 3
표 7:PBS 또는 DCC-5Fbn로 처리된 이종이식된 T47D 종양의 수와 형태를 나타냄. 크기가 40%이상 성장한 종양들의 수 및 감소된 크기(30% 이상)를 가지는 종양들의 수를 나타냄
여기서 본 발명자들은 네트린-1 발현이 전파되는 유방 종양능의 마커로 간주될 수 있다는 것을 보였다. 전이는을 가지는 대부분의 유방암은 증가된 네트린-1 발현을 보였다. 그 데이터 모두는 인간/마우스 유방암 세포주 및 동계/인간 이종이식 마우스 모델로부터 얻었고 이 증가된 네트린-1 수준은 네트린-1-의존성 수용체들 유도된 에팝토시스를 회피하는 암세포에 의하여 얻어진 선택적 효과이고 결론적으로 네트린-1 유용성과 독립적으로 생존한다라는 관점을 지지한다. 기계론적인 관점으로부터 인간 병리학에서, 네트린-1의 이 오토크라인 발현은 아마도 UNC5H-유도된 세포 사멸을 저해한다. 사실, DCC는 연구된 유방의 여러 군들(NO, N+, M+)에서 거의 검출되지 아니하고, 따라서 DCC는 유방 종양형성과정 동안 초기에 다운-조절되거나 유방 조직에서 단지 약하게 발현되는 것을 암시한다. 게다가, UNC5H 프로-에팝토시스 활성의 도미넌트 네가티브 돌연변이체의 동시 발현에 의한 UNC5H-유도된 에팝토시스의 저해는 DCC- EC-Fc에 대한 인간 유방암 세포사멸을 저해한다(도시 안함).
따라서, 의존성 수용체 모델에 의하여 예측된 바와 같이, 본 발명자들은 적어도 세가지 형태에서 종양 세포가 의존성 수용체 의존성을 회피할 수 있음을 보였다. 첫째, 의존성 수용체의 발현은 DCC에 대하여 더욱 최근에는 UNC5H에 대하여 기재된 바와 같이 다운-조절될 수 있다(Fearon, E. R. et al. Science 247, 49-56 (1990);Thiebault, K. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 4173-4178 (2003);Bernet, A. et al. submitted (2007);Mehlen, P. & Fearon, E. R. J Clin Oncol 22, 3420-8 (2004)). 두 번째, 다운스트림 사멸 신호는 닫힐 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 UNC5H2 프로-에팝토시스 활성은 전이 조절에 관여하고 인간 종양에서 다운-조절되는 것으로 나타난 단백질(Inbal, B. et al. Nature 390, 180-4 (1997))인 UNC5H2 세린/쓰레오닌 DAPK에 대한 UNC5H2의 결합에 의존한다는 것을 최근에 보였다(Llambi, F. et al. EMBO. J24, 1192-201 (2005)). 유사하게, Stupack와 그 동료에 의한 최근 보고는 의존성 수용체들로 작용하는 일부 인테그린의 경우 이들 인테그린에 의하여 매개되는 세포사멸을 촉발하는 캐스페이즈-8는 신경아세포종 전이에 중요하다는 것을 보였다(Stupack, D. G. et al. Nature 439, 95-9 (2006)). 여기서 본 발명자들은 종양 세포의 선택적 효과는 의존성 리간드의 자가 생성이다라는 것을 보였다. 대장암은 네트린-1 발현의 획득보다는 수용체의 선택된 손실을 대부분 가짐- 사실 단지 7%의 대장암만이 네트린-1 발현의 증가를 보이는 반면(Mazelin, L. et al. Nature 431, 80-4 (2004)),전이능을 가지는 유방암은 바람직하게는 수용체 손실보다 선택된 네트린-1 자가 생성을 가지는지에 대한 흥미있는 의문이 남는다. 가능한 설명은 네트린-1 발현이 이동하는 세포들에 대한 생존의 획득 뿐만 아니라, 네트린-1 수용체의 비-에팝토시스/포지티브 신호의 가능한 획득을 제공한다는 것이다. 이와 관련하여 네트린-1이 원래는 안내 역할로 기재되었고(Serafini, T. et al. Cell 78, 409-24 (1994)), 비록 완전하게 증명되지는 않았지만 전이성 세포들의 친화성에서 역할을 한다는 것을 주목하는 것이 중요한다. 네트린-1의 다른 제안된 역할은 전이 발생에 중요한 양 메카니즘인 부착과 형태형성 조절을 포함한다(Yebra, M. et al. Dev Cell 5, 695-707 (2003);Liu, Y. et al. Curr Biol 14, 897-905 (2004)). 유사하게, 네트린-1은 배아 혈관신생 동안에 관여하고, 비록 모순되는 결과가 공개되었지만(Lu, X. et al. Nature 432, 179-86 (2004);Nguyen, A. & Cai, H. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 6530-5 (2006);Wilson, B. D. et al. Science (2006)), 본 발명자들은 이차 부위에서 전이 발생을 유리하게 할 수 있는 선호할 수 있는 신생혈관형성 인자로 네트린-1의 역할을 이 단계에서 버릴 수 없다. 그러나, 네트린-1 오토크라인 발현에 의한 "포지티브" 신호의 획득은 비 전이성 세포들에서 네트린-1의 강화된 발현이 전이 형성과 관련이 있다는 것이 실패하였기 때문에 그자체로 전이를 촉진하는데 아마 충분하지 않을 것이다.
이들 관찰들은 종양 발생의 조절에서 리간드/의존성 수용체들 쌍들의 중요성에 대한 증거를 제공할 뿐만 아니라 새로운 치료 전략도 가르친다. 사실, 현재로 는 전이성 유방암에 대한 효율적인 치료가 없고 그러한 치료의 부족은 매년 400,000 명의 여성들을 사망에 이르게한다(Andre, F. et al. J Clin Oncol 22, 3302-8 (2004)). 여기서 본 발명자들은 네트린-1과 그것의 의존성 수용체들 사이의 상호작용의 저해에 기초한 치료가 유방암과 같은 전이성 암을 앓고 있는 환자들 -즉 일차 종양에서 높은 네트린-1 발현을 보이는 환자들-의 많은 부분에 긍정적인 효과를 가질 것이라는 것을 나타내었다. 이러한 치료들은 여기에 기재된 DCC-5Fbn 단백질, 화학 약물, 또는 단일클론 항체을 포함할 수 있다.
실시예 4: 다른 인간 종양들에서 네트린 -1 발현 및 네트린 -1 활성의 저해
A) 네트린-1은 인간 신경아세포종에서 침습성의 마커이고(도 9 A, 그것의 설명 및 표 8 참조) 네트린-1 활성의 저해는 신경아세포종 세포사멸을 촉진한다(도 1OB 및 그것의 설명 참조).
세포주 네트린-1
CLB-BAB -
CLB-BAC -
CLB-BAR -
CLB-BARREC -
CLB-BEL +
CLB-BOULT ++
CLB-BER2 -
CLB-BERLUD -
CLB-CAR -
CLB-ESP -/+
CLB-GAR -
CLB-GHE MO -
CLB-GHE PCT -
CLB-HUT +++
CLB-MAR MO -/+
CLB-MAR LT +
CLB-PEC -
CLB-REM +++
CLB-SED +
CLB-TRA -
CLB-VOL ++++
IGRN91 -/+
IMR32 +++
SHEP -/+
SHSY 5Y -/+
SKNAS ++++
표 8: 26 신경아세포종 세포주(Centre Leon Berard (CLB-X)에서 환자 종양으로부터 직접 얻거나 전통적인 신경아세포종 세포주(IMR32, SHEP, SHSY 또는 SKNAS))들을 Q-RT-PCR에 의한 네트린-1 발현에 대하여 (a)에서 테스트하였다. 네트린-1 수준은 네트린-1이 없으면 (-), 네트린-1 레벨에 따라 낮은데서 높은데로 (+, ++, +++)로 나타내었다. 상당한 부분의 세포주들이 높은 네트린-l의 발현을 가지는 것에 주목될 수 있다.
B) 네트린-1은 많은 신경교종에서 과발현되고(도 1OA 및 그것의 설명 참조) 네트린-1 활성의 저해는 신경교종 세포 사멸을 촉진한다(도 1OB 및 그것의 설명 참조).
C) 네트린-1은 인간 폐암에서 과발현되고(도 11A, 그것의 설명 및 표 9 참조) 네트린-1 활성의 저해는 폐암 세포사멸을 촉진하고 폐암 발생을 예방한다(도 12C 및 12D 그리고 그것의 설명 참조).
세포주 네트린-1
NSCLC



 A549 +
H322 ++
H358 ++
H460 -
H1299 +
SCLC

 H69 -
H146 +
H196 -
표 9: 소-세포-폐암(SCLC) eHSMS 비-소-세포-폐암(NSCLC)으로부터 유래된 폐암 세포주들을 Q-RT- PCR에 의한 네트린-1 발현에 대하여 (a)에서와 같이 테스트하였다. 네트린-1 수준은 네트린-1이 없으면 (-), 네트린-1 레벨에 따라 낮은데서 높은데로 (+, ++, +++)로 나타내었다. 상당한 부분의 세포주들이 높은 네트린-l의 발현을 가지는 것에 주목될 수 있다.
D) 다른 종양들에서의 네트린-1 발현
네트린-1의 발현은 도 10A- 1OB, 11A-11C, 12A-12B에서와 같이 다른 인간 종양들로부터 추출된 전체 RNA를 사용하여 Q-RT PCR에 의하여 조사하였다.
종양들 n 네트린-1의 과발현
신장 선암 5 40%
급성 골수성 백혈병 55 62%
육종 10 30%
흑색종 6 50%
난소 선암 14 93%*
췌장 선암 7 57%
자궁 선암 42 19%
위 선암 27 26%
콩팥 선암 20 50%
직장 선암 18 17%
표 10은 각 병리학에서 네트린-1의 과발현을 보이는 종양들의 퍼센트 및 테스트한 종양들의 수(n)을 나타낸다.
* 100 %의 7 전이성 샘플
실시예 5:
네트린-1이 존재하지 않는다면 DCC가 그것의 모노머 형태 하에 있는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 HEK293T 세포들에서 c-myc-태그된 전장 DCC로 HA-태그된 전장 DCC를 일시적으로 동시-발현하였다. 그 후 면역침전을 항-c-myc 항체를 사용하여 수행하였고, 도 12 A에 나타난 바와 같이, HA 및 c-myc 태그된-DCC 모두 좋은 발현에도 불구하고, HA-DCC는 리간드의 부존재 하에서 c-myc-DCC 풀다운에서 단지 적제 포함되었고, 그것은 DCC가 네트린-1의 부존재 하에서 HEK293T에서 발현될 때 모노머로 주로 존재하였다는 것을 암시한다. 동일한 실험 조건에서, 네트린-1을 배양 배지에 첨가하거나(도시 안함 그리고 도 15C) 또는 네트린-1 발현 컨스트럭트를 DCC-발현 컨스트럭트와 동시-발현되었을 때(도 11A), HA-DCC는 c-myc DCC 풀다운에서 명백하게 포함되었고, 따라서 네트린-1이 DCC의 다이머화 또는 다중화를 촉발한다는 것을 나타낸다. 이 결과는 비록 본 발명자들의 배양 및 면역침전 조건에서 네트린-1의 부존재에서 DCC가 비록 약한 다중화의 검출되는 수준을 나타내지만 다중화의 네트린-1-유도된 다중화를 처음 보고한 Tessier-Lavigne 및 동료들로부터 온 데이터(Stein, E., Zou, Y., Poo, M. and Tessier-Lavigne, M. (2001) Science, 291, 1976-1982)와 일치한다. 이 구조적이고 낮은 다중화 수준은 리간드 부존재하에서 그들스스로에 대한 DCC 수용체들의 낮은 친화도 또는 높은 수준의 막횡단 수용체들의 강화된 발현에 기초하는 사용된 시스템의 덕분일 수 있다
본 발명자들은 다음 다른 UNC5H 네트린-1 수용체들이 유사한 형태를 가지는지를 조사하였다. HEK293T 세포들을 네트린-1의 존재 또는 부존재하에서 Flag-태그된 전장 UNC5H2와 함께 HA-태그된 전장 UNC5H2으로 일시적으로 트랜스팩션시켰다. 그 후 면역침전을 항-FlagM2 항체를 사용하여 수행하였다. 도 11B에서 나타난 바와 같이, 네트린-1의 존재는 Flag-UNC5H2로 HA-UNC5H2의 효과적인 면역침전을 촉발한다. 따라서 네트린-1의 부존재하에서, DCC 및 UNC5H2는 주로 모노머 형태로 존재하고, 양 DCC 및 UNC5H2 모두는 네트린-1의 존재하에서 다중화하는 증가된 능력을 보인다.
네트린-1-유도된 다중화가 DCC/UNC5H2 프로-에팝토시스 세포 사멸을 저해하기 위한 중요한 단계인지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 화학물질에 의하여 단백질 다이머화가 일어나는 키메릭 시스템을 개발하였다. 이 시스템은 캐스페이즈-8 활성화에서 캐스페이즈-8 다이머화의 역할(Yang, X., Chang, H. Y. and Baltimore, D. (1998) Mol Cell, 1, 319-325) 및 p75ntr 프로-에팝토시스 활성에서 p75ntr-다중화의 중요성(Wang, JJ., Rabizadeh, S., Tasinato, A., Sperandio, S., Ye, X., Green, M., Assa- Munt, N., Spencer, D. and Bredesen, D.E. (2000) J Neurosci Res, 60, 587-593) 모두를 나타내는데 성공적으로 사용되었다. 이 시스템은 FkBP 모티프를 교차-다이머화하는 Fk1012의 능력으로부터 유래한다. DCC와 UNC5H2 세포내 도메인은 유래된 Fv2e FkBP 모티브들과 그들의 N-말단에서 융합되고 AP20187 화합물을 사용하여 다이머화가 유도되었다(도 13A). 본 발명자들은 먼저 그 개발된 시스템이 UNC5H2 세포내 도메인의 네트린-1 유도된 다중화를 반복하는지를 분석하였다. HEK293T 세포들을 c-myc-태그된 Fv2e-UNC5H2-IC와 HA-태그된 Fv2e-UNC5H2-IC를 동시-트랜스팩션시키고 항-c-myc 항체를 사용하여 동시-면역침전을 수행하였다. 도 13B에서 나타난 바와 같이, AP20187의 첨가가 없으면, HA-Fv2e-UNC5H2-IC는 c-myc-Fv2e-UNC5H2-IC 풀-다운에서 거의 검출되지 않고, 따라서 Fv2e-UNC5H2-IC는 주로 모노머로 HEK293T 세포들에서 발현된다는 것을 지지한다. 예상한 바와 같이, AP20187의 첨가는 c-myc-Fv2e-UNC5H2-IC로 HA-Fv2e-UNC5H2-IC의 효과적인 풀-다운을 이끌었다 . 유사한 결과들을 Fv2e-DCC-IC로 얻었다(도시 안함). 따라서, 이 다이머화 시스템은 네트린-1 수용체들 DCC 및 UNC5H2의 세포내 도메인의 다이머화를 반복한다.
이 화학적으로-유도될 수 있는 DCC/UNC5H2 다이머화 시스템은 네트린-1-유도된 DCC/UNC5H2 다중화를 모방하는데 적합하게 작용하기 때문에 본 발명자들은 DCC/UNC5H2의 다이머화가 DCC/UNC5H2 프로-에팝토시스 활성을 저해하는데 충분한지를 조사하였다. HEK293T 세포들을 AP20187의 존재 또는 부존재하에서 Fv2e-DCC-IC를 발현하게 하고 세포 사멸을 전에 기재한 것과 같이 DCC-유도된 세포사멸을 측정하기 위하여 트립판 블루 염색으로 조사하였다(Mehlen, P. et al. Nature 395, 801-4 (1998);Forcet, C, Ye, X., Granger, L., Corset, V., Shin, H., Bredesen, D.E. and Mehlen, P. (2001) Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 3416- 3421). 도 14 A에 나타난 바와 같이, Fv2e-DCC-IC의 발현은 DCC-IC 융합없는 Fv2e 모티프들의 발현과 비교하여 증가된 세포 사멸과 관련되었다. 흥미롭게도,AP20187를 첨가 시에, Fv2e-DCC-IC에 의하여 유도된 세포사멸은 크게 감소하였다(도 14A). 유사하게, AP20187의 부존재하에서 HEK293T에서 발현될 때 Fv2e-UNC5H2-IC는 세포 사멸을 촉발하거나(도 14B) 캐스페이즈 활성화를 촉발하는(도 14C) 반면, 다이머화제의 첨가는 Fv2e-UNC5H2-IC-유도된 세포사멸(도 14B) 또는 캐스페이즈 활성화(도 14C)를 현저하게 감소시키는데 충분하다. 따라서, 모노머 DCC-IC 및 UNC5H2-IC는 프로-에팝토시스이지만, DCC-IC 또는 UNC5H2-IC의 멀티머 형태는 더 이상 프로-에팝토시스 활성을 나타내지 않는다. 따라서 DCC/UNC5H2-프로-에팝토시스 활성을 저해하는 네트린-1의 활성은 이 다중화 과정이 DCC 및 UNC5H2 프로-에팝토시스 활성을 억제하는데 충분하기 때문에 DCC 또는 UNC5H2을 다중화하는 네트린-1의 능력과 본질적으로 연관된다.
DCC 또는 UNC 5 H2의 모노머 형태는 수용체의 세포내 도메인의 초기 캐스페이즈 절단을 쉽게 하게하는 공간적 형태를 갖는다는 모델이 있다. 반대로 리간드의 존재는 세포내 도메인의 다중화를 이끌고 그것은 캐스페이즈 절단에 덜 영향을 받는다. 이와 관련하여, Arakawa와 그 동료들은 UNC5H2의 캐스페이즈 절단은 네트린-1 존재에 의하여 저해된다는 것을 보였다(Tanikawa, C, Matsuda, K., Fukuda, S., Nakamura, Y. and Arakawa, H. (2003) Nat Cell Biol, 5, 216-223). 그러나, 기술적 제한때문에 본 발명자들은 Fv2e 융합 단백질들을 발현하게 하는 세포들에서 DCC 또는 UNC5H2 절단을 검출하는데 실패하였다. 절단 저해의 대안적인 모델은 네트린-1-유도된 수용체 다중화는 생존 신호를 촉발하고 그것은 구조적인 캐스페이즈 절단과 관련된 DCC 또는 UNC5H2의 구조적인 프로-에팝토시스 활성을 저해한다는 것이다. 그러나 본 발명자들은 네트린-l 결합에 대한 DCC에 의하여 활성화되는 알려진 포지티브 신호 경로가 DCC 프로-에팝토시스 활성에 대한 네트린-1의 저해활성에 관여한다는 것을 보이는데 실패하였다. 예를 들어, 네트린-1은 항-에팝토시스 효과를 나타내는 것으로 알려진 카이네이즈인 ERK-1/2의 DCC-매개되는 활성화를 유도한다(Forcet, C. et al. Nature 417, 443-7 (2002)). 그러나 네트린-1 -유도된 ERK- 1/2 인산화에 영향을 주는 반면 ERK- 1/2 경로의 전통적인 저해제들은 DCC 프로-에팝토시스 활성에 대한 네트린-1 저해효과를 억제하는데 실패하였다 (Forcet and Mehlen, unpublished). 따라서, 네트린-1-유도된 DCC 다중화는 DCC 세포내 접근성에 영향을 줄 수 있다. 그러나 이것이 단순한 당량적인 것인지 또는 세포외 도메인들의 접근을 일으키는 것이 세포내 구획내에서 형태의 변화를 유도하는지를 밝히는 것이 남아 있다.
만약 네트린-1-유도된 수용체 다중화에 기초를 이루는 메카니즘이 기재되어져 있다면, 네트린-1-유도된 DCC/UNC5H2 다중화가 DCC/UNC5H2-유도된 세포 사멸을 저해하는데 충분하다는 관찰이 네트린-1이 오토크라인 형태로 발현되는 종양, 인 비보에서 DCC 또는 UNC5H 프로-에팝토시스 활성을 작동하는 흥미있는 도구를 나타낼 수 있다. 사실 본 발명자들은 마우스 장에서 네트린-1 과발현이 에팝토시스 저해 때문에 장 종양 발생과 관련이 있다는 것을 보였고(Mazelin, L. et al. Nature 431, 80-4 (2004)) 네트린-1이 대부분의 인간 전이성 유방암에서 과발현되다는 것을 관찰하였다. 게다가 네트린-1 과발현 기작은 네트린-1의 환경적 부존재의 세팅에서 생존을 위한 전이성 종양 세포들의 선택적인 잇점을 얻어진 것을 나타낸다(실시예 2 및 3 참조). 따라서 DCC/UNC5H 다이머화를 저해하는 것은 종양 세포 에팝토시스를 촉발하는 흥미로운 방법을 나타낼 수 있다.
이와 관련하여, 비록 모순되는 데이터가 보고되었지만(Kruger, R.P., Lee, J., Li, W. and Guan, K.L. (2004) J Neurosci, 24, 10826-10834) DCC의 다섯 번째 피브로넥틴 도메인은 네트린-1과 상호작용의 도메인을 나타내었다(도l5A 및 Geisbrecht, B. V., Dowd, K. A., Barfield, R. W., Longo, P. A. & Leahy, D. J. J Biol Chem 278, 32561-8 (2003)). 따라서 본 발명자들은 먼저 DCC의 재조합 수용성 다섯 번째 피브로넥틴 도메인(DCC-5Fbn)이 재조합 네트린-1에 결합할 수 있는지를 조사하였다. ELISA 분석은 관련없는 수용체 IL3-R의 세포외 도메인과 반대로 DCC-5Fbn는 네트린-1에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 나타낸다(도 15A). DCC-5Fbn/네트린-l에 대한 대략적인 Kd는 기재된 DCC/네트린-1 Kd의 10배를 따라가는 대략 5nM이었다. 다음 본 발명자들은 이 도메인이 DCC/네트린-1 상호작용을 대체하는데 충분한지를 조사하였다. 도 15B에 나타난 바와 같이, DCC의 세포외 도메인이 코팅되고 네트린-1 /DCC 상호작용이 네트린-1 면역반응성에 의하여 검출되는 ELISA 분석을 사용하여, 본 발명자들은 양성 대조군으로서 DCC의 완전한 세포외 도메인(DCC-EC)이 DCC/네트린-1 상호작용을 대체하기에 충분한 반면, DCC-5Fbn는 방해하는 것을 실패하였다는 것을 관찰하였다. 따라서, DCC-5Fbn는 네트린-1과 상호작용을 하지만 DCC/네트린-1 상호작용을 저해하는데 충분하지 않다. 다음 본 발명자들은 DCC-5Fbn이 DCC 다중화에 영향을 미치는지를 조사하였다. 본 발명자들은 네트린-1 존재 또는 부존재 하에서 c-myc-태그된 전장과 함께 HA-태그된 전장 DCC로 일시적으로 트랜스팩션된 HEK293T에서 동시-면역침전을 수행하였다. 도 1A에도 기재된 것과 같이, 네트린-1의 존재는 네트린-1-유도된 DCC 다중화를 나타내는 c-myc-DCC로 HA-DCC의 면역침전을 촉발한다(도 15C). 그러나, 네트린-1으로 배양된 세포들을 DCC-5Fbn와 동시에 처리할 때, 그 HA-DCC/c-myc-DCC 상호작용은 네트린-1 비처리 수준으로 돌아온다. 따라서 DCC-5Fbn은 둘 이상의 DCC분자들에 네트린-1-매개된 근접성에 관여하는 지역에서 네트린-1과 상호작용을 하고 네트린-1-유도된 DCC-다중화를 저해할 수 있다.
다음 본 발명자들은 DCC-5Fbn가 결론적으로 네트린-1 수용체들-유도된 세포사멸을 촉발할 수 있는지를 테스트하였다. 이 목적을 위하여, HEK293T 세포들을 DCC-5Fbn를 처리하거나 처리하지 아니하고 네트린-1 존재 또는 부존재하에서 DCC를 발현하게 하고 세포 사멸을 트립판 블루 배제 분석에 의하여 결정하였다(도 16A). 도 16A에 나타낸 바와 같이, DCC는 네트린-1의 부존재하에서 에팝토시스를 촉발하고, 네트린-1의 존재에 의하여 프로-에팝토시스 활성을 억제하는 반면, DCC-5Fbn의 존재는 네트린-1의 저해 활성을 억제하는데 충분하고, 따라서 DCC-유도된 세포 사멸을 이끈다. HEK293T 세포 시스템은 네트린-1의 정규장소 밖의 발현을 사용하기 때문에, 본 발명자들은 DCC-5Fbn 더 생물학적으로 적절한 모델에서 DCC-5Fbn를 테스트하였다. 본 발명자들은 비전이성 유방암과 비교하여 대부분의 인간 전이성 유방암은 네트린-1을 과발현한다는 것을 보였다. 본 발명자들은 또한 과발현된 네트린-1의 적정은 인 비트로에서 종양 세포 에팝토시스 및 마우스에서 전이 저해를 촉발한다는 것을 보였다(실시예 2 및 3 참조). 많은 유방 종양 세포주들은 네트린-1을 발현하는 것으로 나타났고 본 발명자들은 마우스 유방 암종 4Tl 세포들에서 네트린-1 적정은 에팝토시스를 촉발하는 것을 나타냈다(실시예 2 및 3 참조). 도 16B에 나타난 바와 같이, 4Tl 세포 배양에 DCC-5Fbn의 첨가는 증가된 세포 사멸과 관련된다.
종합하면, 본 발명자들은 의존성 수용체들 DCC 및 UNC5H의 다중화는 프로-에팝토시스 활성을 억제하는 충분한 기작이라는 것을 보였다. 흥미롭게도, 이 저해 기작은 사멸 수용체로 관찰된 것과 거울을 나타내었다. 사실 TNFr 또는 Fas는 에팝토시스를 유도하는데 삼중화가 필요하다고 알려졌다(Muppidi, J.R., Tschopp, J. and Siegel, R.M. (2004) Immunity, 21, 461-465). 따라서 이 본질적인 차이는 의존성 수용체들을 사용한 치료 전략에 대한 더해진 가치를 나타낼 수 있다. 사실, 과거 치료 분자들의 검색은 주로 활성화제들보다는 세포 과정의 저해-예를 들어 카이네이즈 저해제, IAP 저해제들-에 대하여 작용하는 것에 이르렀다. 결론적으로 수용체 다중화를 저해하는데 스크리닝된 어느 화합물을 통하여 또는 재조합 DCC-5Fbn의 사용을 통하여 네트린-1 수용체들 다중화의 저해는 네트린-1 오토크라인 발현을 얻은 종양의 치료에 대한 매력적인 전략으로 나타났다.
여기서 본 발명자들은 네트린-1이 DCC 및 UNC5H 수용체들 모두의 다중화를 촉발한다는 것을 보였다. 다이머화가 화학적으로 유도된 시스템을 사용하여, 본 발명자들은 DCC와 UNC5H2와 같은 네트린-1 수용체들의 세포내 도메인의 다중화가 그들의 프로-에팝토시스 활성을 저해하는 중요한 단계라는 것을 보였다. 따라서 본 발명자들은 모노머 네트린-1-의존성 수용체는 프로-에팝토시스이고, 반면 네트린-1에 의하여 유도된 그들의 다중화는 그들의 프로-에팝토시스 활성을 파괴한다는 모델을 제안한다. 이 특성을 사용하여, 본 발명자들은 종양 세포들의 에팝토시스를 촉발하기 위하여 (i)네트린-1과 상호작용을 하고 (ii)네트린-1-유도된 다중화를 저해하는 DCC 세포외 부위의 재조합 특정 도메인의 사용을 제안한다.
<110> Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Centre Leon Berard <120> SCREENING FOR ANTI-CANCER COMPOUNDS USING NETRIN-1 ACTIVITY <130> P08CR157/KR <150> US60/776,926 <151> 2006-02-28 <160> 29 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for introducing a HA tag in the template pCMV-DCC <400> 1 cacaggctca gccttttatc catatgatgt accggattat gcataacatg tatttctgaa 60 tg 62 <210> 2 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for introducing a HA tag in the template pCMV-DCC <400> 2 cattcagaaa tacatgttat gcataatccg gtacatcata tggataaaag gctgagcctg 60 tg 62 <210> 3 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for introducing a c-myc tag in the template pCMV-DCC <400> 3 cacaggctca gcctttgagc agaagttgat aagtgaggaa gatctgtaac atgtatttct 60 gaatg 65 <210> 4 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for introducing a c-myc tag in the template pCMV-DCC <400> 4 cattcagaaa tacatgttac agatcttcct cacttctcaa cttctgctca aaggctgagc 60 ctgtg 65 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used forfragment of the intracellular domain of DCC (1122-1447) <400> 5 tatgtcgacc gacgctcttc agcccagcag aga 33 <210> 6 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for fragment of the intracellular domain of DCC (1122-1447) <400> 6 tatgaattct tagtcgagtg cgtagtctgg tacgtcgtac ggataaaagg ctgagcctgt 60 gatggcatta ag 72 <210> 7 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for obtaining c-myc-Fv2E-DCC-IC <400> 7 cttaatgcca tcacaggctc agcctttgaa cagaaactca tctctgaaga ggatctgtaa 60 gaattcataa agggcaat 78 <210> 8 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for obtaining c-myc-Fv2E-DCC-IC <400> 8 attgcccttt atgaattctt acagatcctc ttcagagatg agtttctgtt caaaggctga 60 gcctgtgatg gcattaag 78 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for the constructs encoding FlagM2-UNC5H2 <400> 9 gcgcggccgc agggcccgga gcggg 25 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for the constructs encoding FlagM2-UNC5H2 <400> 10 cggaattctc agcaatcgcc atcagtggtc 30 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used forby PCR amplification of the UNC5H2-HA intracellular domain <400> 11 cggtcgacgt gtaccggaga aactgc 26 <210> 12 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used forting by PCR amplification of the UNC5H2-HA intracellular domain <400> 12 gcgaattctc atgcataatc cggcacatca tacggatagc aatcgccatc agtggtc 57 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used forby PCR amplification of the UNC5H2-myc intracellular domain <400> 13 cggtcgacgt gtaccggaga aactgc 26 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used forby PCR amplification of the UNC5H2-myc intracellular domain <400> 14 gcgaattctc acagatcctc ttctgagatg agtttttgtt cgcaatcgcc atcagtggtc 60 60 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv2E forward primer <400> 15 ccaccatggg gagtagca 18 <210> 16 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UNC5H2-HA primer <400> 16 tcatgcataa tccggcacat catacggata gcaatcgcca tcagtggtc 49 <210> 17 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UNC5H2-myc reverse primer <400> 17 tcacagatcc tcttctgaga tgagtttttg ttcgcaatcg ccatcagtgg tc 52 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for expressed human as internal control <400> 18 ctggagttca ggagtattcg ggg 23 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for expressed human as internal control <400> 19 cagatccaag atgtcctggt cctt 24 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for expressed human as internal control <400> 20 cacgaaccac ggcactgatt 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for expressed human as internal control <400> 21 ttttcttgct gccagtctgg ac 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for expressed human netrin-1-NTN1 as internal control <400> 22 tgcaagaagg actatgccgt c 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for expressed human human netrin-1-NTN1 as internal control <400> 23 gctcgtgccc tgcttataca c 21 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for expressed human UNC5B as internal control <400> 24 tgcaggagaa cctcatggtc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for expressed human UNC5B as internal control <400> 25 gggctggagg attactggtg 20 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for expressed human DCC as internal control <400> 26 agccaatggg aaaattactg cttac 25 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for expressed human DCC as internal control <400> 27 aggttgagat ccatgatttg atgag 25 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for expressed human UNC5C as internal control <400> 28 gcaaattgct ggctaaatat caggaa 26 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used for expressed human UNC5C as internal control <400> 29 gctccactgt gttcaggcta aatctt 26

Claims (38)

  1. a)네트린-1, 또는 그것의 절편 및 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편을 포함하는 배지를 가지고, 여기서:
    - 상기 네트린-1, 또는 그것의 절편 및 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편은 특이적으로 서로 상호작용하여서 결합쌍을 형성할 수 있고 또는
    - 상기 네트린-1, 또는 그것의 절편 및 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편은 상기 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편, 특히 상기 네트린-1 수용체의 세포내 도메인의 다이머화 또는 다중화를 유도할 수 있으며;
    b) 테스트되는 화합물과 상기 배지를 접촉하고;
    c)네트린-1, 또는 그것의 절편 및 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편의 저해를 측정하고 또는
    상기 화합물이 상기 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편의 다이머화 또는 다중화, 특히 상기 네트린-1 수용체의 세포내 도메인의 다이머화를 저해하는지를 결정하고; 그리고
    d)만약 c) 단계에서 측정이 상기 화합물 존재하에서 네트린-1, 또는 그것의 절편과 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편 사이의 상호작용의 현저한 저해를 나타내고, 또는
    만약 c) 단계에서 측정이 상기 화합물 존재하에서 상기 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편의 다이머화 또는 다중화, 특히 상기 네트린-1 수용체의 세포내 도메인의 다이머화를 현저하게 저해한다면 그 화합물을 선택하는 것을 포함하는
    암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 치료 또는 예방되는 암은 종양세포가 네트린-1을 발현하거나 과발현하는 암인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 치료 또는 예방되는 암은 유방암, 대장암, 폐암, 신경아세포종, 신경교종, 급성 골수성백혈병, 육종, 흑색종, 난소 선암(ovarian adenocarcinoma), 신장 선암(renal adenocarcinoma), 췌장 선암, 자궁 선암, 위 선암, 및 직장 선암으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제3항에 있어서, 상기 치료 또는 예방되는 암은 전이성 또는 침습성 암인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항에 있어서, a) 단계에서 상기 네트린-1 수용체는 DCC, UNC5H (특히 UNC5H1, UNC5H2 및 UNC5H3), 네오제닌 및 아데노신 A2b로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, a) 단계에서 상기 네트린-1 수용체는 DCC, UNC5H1, UNC5H2 및 UNC5H3로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제6항에 있어서, a) 단계에서
    - 상기 네트린-1 수용체 절편은 네트린-1과 상호작용할 수 있는 네트린-1 수용체 또는 그것의 부분의 세포외 도메인이거나 그 도메인을 포함하고; 또는
    - 상기 네트린-1 수용체 절편은 네트린-1 존재하에서 다이머화 또는 다중화할 수 있는 네트린-1 수용체 또는 그것의 부분의 세포내 도메인이거나 그 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제7항에 있어서, a) 단계에서
    상기 네트린-1 및/또는 상기 네트린-1 수용체는 포유류, 특히 마우스, 랫트 또는 인간으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제8항에 있어서, a) 단계에서
    상기 네트린-1은 닭으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항에 있어서, 상기 네트린-1 및/또는 상기 네트린-1 수용체 및/또는 테스트되는 상기 화합물은 직접 또는 간접적으로 측정될 수 있는 마커에 의하여 표지되는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항에 있어서, c) 단계에서 상기 네트린-1 또는 그것의 절편과 상기 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편 상호작용의 저해의 측정은 면역분석(특히 ELISA 또는 면역방사계측 분석(IRJVIA)), 섬광근접검색법(SPA) 또는 형광 공명 에너지 전이(FRET)에 의하여 수행에 의하고;또는
    상기 네트린-1 수용체, 또는 그것의 절편, 특히 세포내 도메인의 다이머화 또는 다중화 또는 그것의 저해는 면역침전 또는 FRET에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항에 있어서, a) 단계에서 상기 배지는 그들의 표면 막에서 내재적인 네트린-1 수용체 또는 재조합 네트린-1 수용체, 특히 적어도 재조합 네트린-1 수용체의 세포외 도메인을 발현하는 세포들을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, a) 단계에서 상기 배지는 재조합 네트린-1 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서, a) 단계에서 상기 배지는 그들의 막 표면에서 상기 네트린-1 수용체를 내재적으로 발현하고 네트린-1을 발현하거나 과발현하는 종양세포를 포함하고, c) 단계에서 테스트하는 화합물의 존재하에서 네트린-1과 그것의 네트린-1 수용체 사이의 상호작용의 저해는 테스트하는 화합물의 존재에 의하여 유도되는 세포 사멸 또는 에팝토시스에 의하여 측정되는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  15. 제 12항에 있어서, a) 단계에서 상기 배지는 전이성 종양세포들 특히 상기 세포들 4Tl 세포들, CAL51 세포들, T47D 세포들, SKBR7 세포들, IMR32 세포들, GL26 세포들 및 H358 세포들로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항에 있어서, a) 내재적인 또는 재조합 네트린-1 수용체 또는 적어도 그것의 세포내 도메인을 포함하는 그것의 절편을 발현하는 포유류 세포, 바람직하게는 종양 세포, 더욱 바람직하게는 그것의 네트린-1 수용체 세포내 도메인이 네트린-1의 존재하에서 다이머화 또는 다중화를 할 수 있는 세포 또는 그것의 네트린-1 수용체 세포내 도메인의 다이머화 또는 다중화를 나타내는 세포를 포함하는 배지를 가지고;
    b) 테스트되는 화합물과 상기 배지를 접촉하고, 선택적으로 상기 배지는 네트린-1 또는 네트린-1 수용체의 세포외 도메인과 상호작용할 수 있는 그것의 절편을 포함하고;
    c)테스트하는 화합물의 조재하에서 상기 네트린-1 수용체 세포내 도메인이 저해되는지를 결정하고;
    d) 선택적으로 테스트하는 화합물의 존재가 상기 포유류 세포의 사멸을 유도하는지를 결정하고; 그리고
    e) 만약 c) 단계에서 결정이 상기 화합물이 상기 네트린-1 수용체의 세포내 도메인의 다이머화 또는 다중화를 현저하게 저해하고 또는
    만약 d)단계에서 결정이 상기 포유류 세포의 세포 사멸을 나타낸다면 그 화합물을 선택하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 화합물을 선택하는 방법.
  17. (a) 생검에서 네트린-1 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 일차 종양 세포들을 포함하는 환자의 생검으로부터 유래한 일차 종양을 가지는 환자에서 전이성 또는 침습성 암의 존재를 예측하는 인 비트로 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 비-전이성 일차 종양 생검 또는 비-침습성 암 생검에서 네트린-1의 발현과 비교하여 상기 생검에서 네트린-1 발현 수준의 증가는 전이성 암 또는 침습성 암의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 환자에서 전이성 또는 침습성 암의 존재를 예측하는 인 비트로 방법.
  19. 제 17항 및 제18항에 있어서, 테스트하는 생검에서와 비-전이성 참고 생검 에서 네트린-1 발현의 비가 2 이상인 경우에 전이성 암의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 환자에서 전이성 또는 침습성 암의 존재를 예측하는 인 비트로 방법.
  20. (a) 치료된 환자의 일차 종양 생검을 얻고;
    (b) 상기 생검에서 네트린-1 발현 수준을 측정하며, 여기서 항암 치료의 효율성은 상기 생검에서 측정된 네트린-1 발현 수준의 양의 감소와 상관관계가 있거나 또는 특정 항암 치료에 반응하는 상기 선택된 환자는 상기 특정 치료 후에 그들의 생검에서 측정된 네트린-1 발현 수준의 양이 감소된 환자인 것을 특징으로 하는 특정 항암치료에 반응하는 환자를 인 비트로 선택하거나 환자에 대한 항암 치료의 효율성을 인비트로 결정하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 암은 네트린-1의 과발현을 유도하였고 또는 전이성 또는 침습성 암인 것을 특징으로 하는 특정 항암치료에 반응하는 환자를 인 비트로 선택하거나 환자에 대한 항암 치료의 효율성을 인비트로 결정하는 방법.
  22. 제 17항 내지 제21항에 있어서, 상기 측정된 네트린-1 발현 산물은 네트린-1을 코딩하는 RNA, 특히 정량적인 실시간 역 PCR 방법에 의한 것을 특징으로 하는 특정 항암치료에 반응하는 환자를 인 비트로 선택하거나 환자에 대한 항암 치료의 효율성을 인비트로 결정하는 방법.
  23. 제 17항 내지 제21항에 있어서, 상기 측정된 네트린-1의 발현 수준은 네트린-1 단백질 수준, 특히 상기 네트린-1 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 특정한 항체들을 사용한 방법에 의한 것을 특징으로 하는 특정 항암치료에 반응하는 환자를 인 비트로 선택하거나 환자에 대한 항암 치료의 효율성을 인비트로 결정하는 방법.
  24. 제 17항 내지 제23항에 있어서, 상기 일차 종양은 유방암, 대장암, 폐암, 신경아세포종, 신경교종, 급성 골수성백혈병, 육종, 흑색종, 난소 선암(ovarian adenocarcinoma), 신장 선암(renal adenocarcinoma), 췌장 선암, 자궁 선암, 위 선암, 및 직장 선암으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 특정 항암치료에 반응하는 환자를 인 비트로 선택하거나 환자에 대한 항암 치료의 효율성을 인비트로 결정하는 방법.
  25. 네트린-1 단백질과 특이적으로 서로 상호작용하여서 결합쌍을 형성할 수 있는 네트린-1 수용체 단백질 또는 그것의 절편, 바람직하게는 재조합 단백질; 및
    상기 네트린-1 수용체 단백질과 특이적으로 상호작용하여서 결합쌍을 형성할 수 있는 네트린-1 단백질 또는 그것의 절편, 바람직하게는 재조합 단백질을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 화합물을 선택하기 위한 키트.
  26. 네트린-1 수용체를 발현하고, 네트린-1을 발현하거나 과발현하는 종양 세포들, 특히 종양 세포주들로부터 유래한 세포들, 바람직하게는 4Tl 세포들, CAL51 세포들, T47D 세포들, SKBR7 세포들, IMR32 세포들, GL26 세포들 및 H358 세포들로 구성된 군으로부터 선택되고; 선택적으로,
    - 상기 네트린- 1 수용체 단백질과 특이적으로 상호작용을 하여 결합쌍을 형성할 수 있는 그 절편 또는 네트린-1 단백질, 바람직하게는 재조합 네트린-1 단백질을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 화합물을 선택하기 위한 키트.
  27. 제 1항 내지 제15항의 방법에 의하여 선택된 화합물;
    네트린-1과 상기 네트린-1 수용체 사이의 상호작용을 특이적으로 저해할 수 있고 또는 상기 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편 특히 상기 네트린-1 수용체의 세포내 도메인의 다이머화 또는 다중화를 억제할 수 있는 네트린-1 수용체의 세포외 도메인 또는 그것의 절편을 포함하는 화합물; 및
    - 약으로 상기 네트린-1 또는 네트린-1 수용체에 대하여 특이적으로 지시되고, 특히 상기 네트린-1 수용체의 세포외 도메인과 상호작용할 수 있는 네트린-1 절편 또는 상기 네트린-1 수용체의 세포외 도메인에 지시되는 단일클론 또는 폴리클론 항체로 구성된 군으로부터 선택된 화합물.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 네트린-1 수용체 또는 그것의 절편은 DCC, UNC5H (특히 UNC5H1, UNC5H2 및 UNC5H3), 네오제닌 및 아데노신 A2b로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 화합물.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 화합물은 DCC로부터 유래한 네트린-1 수용체의 세포외 도메인을 포함하고, 바람직하게는 상기 화합물은 DCC-EC-Fc 또는 DCC-5Fbn인 것을 특징으로 하는 화합물.
  30. 환자의 종양 세포에서 선택적 효과를 저해할 수 있는 화합물을 투여하는 것을 포함하는 환자에서 바람직하게는 증가된 네트린-1 수준에 의하여 네트린-1 의존성 수용체 유도된 에팝토시스를 회피하는 선택적 효과를 얻은 종양 세포의 세포 사멸 또는 에팝토시스를 유도하는 치료방법.
  31. 그것이 필요한 환자에게 제27항 내지 제29항의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 환자에서 암 치료 또는 예방 방법.
  32. 인간을 포함한 포유류의 암 치료 또는 예방용 의약품을 제조하기 위한 제27항 내지 제29항의 화합물의 용도.
  33. 제 31항 또는 제32항에 있어서, 상기 암은 전이성 또는 침습성 암인 것을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  34. 제 30항 내지 제32항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 신경아세포종, 신경교종, 급성 골수성백혈병, 육종, 흑색종, 난소 선암(ovarian adenocarcinoma), 신장 선암(renal adenocarcinoma), 췌장 선암, 자궁 선암, 위 선암, 및 직장 선암으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  35. 제 29항 내지 제34항에 있어서, 상기 암의 일차 종양 세포들은 네트린-1을 발현 또는 과발현하는 것을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  36. 환자에서 전이성 또는 침습성 암의 동정용 마커로서 네트린-1 발현의 수준의 용도.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 전이성 또는 침습성 암은 유방암, 대장암, 폐암, 신경아세포종, 신경교종, 급성 골수성백혈병, 육종, 흑색종, 난소 선암(ovarian adenocarcinoma), 신장 선암(renal adenocarcinoma), 췌장 선암, 자궁 선암, 위 선암, 및 직장 선암으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 용도.
  38. 제 36항 또는 제37항에 있어서, 상기 암은 유방암 또는 대장암인 것을 특징으로 하는 용도.
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