BRPI0707040A2

BRPI0707040A2 - método de seleção de um composto, método in vitro de previsão da presença de cáncer metastático ou cáncer agressivo, método de determinação in vitro da eficiência de um tratamento anticancerìgeno, kit de seleção, composto, método de tratamento, método de prevenção ou de tratamento, uso de um composto, método ou uso e uso do nìvel de expressão de netrina-1

Info

Publication number: BRPI0707040A2
Application number: BRPI0707040-3A
Authority: BR
Inventors: Patrick Mehlen; Agnes Bernet; Julien Fitamant
Original assignee: Centre Nat Rech Scient; Ct Leon Berard
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2011-04-12
Also published as: WO2007099133A1; IL193580A; CN101389958A; EP1989546A1; CN101389958B; SI1989546T1; EP1989546B1; AU2007220515B2; MX2008011067A; CA2638974C; BRPI0707040B8; US20090226458A1; PT1989546T; KR20080113368A; AU2007220515A1; SG172645A1; US20180291106A1; ES2601352T3; US11203641B2; US20150004159A1

Abstract

MéTODO DE SELEçãO DE UM COMPOSTO, MéTODO IN VITRO DE PREVISãO DA PRESENçA DE CáNCER METASTáTICO OU CáNCER AGRESSIVO, MéTODO DE DETERMINAçãO IN VITRO DA EFICIêNCIA DE UM TRATAMENTO ANTICANCERIGENO, KIT DE SELEçãO, COMPOSTO, MéTODO DE TRATAMENTO, MéTODO DE PREVENçãO OU DE TRATAMENTO, USO DE UM COMPOSTO, MéTODO OU USO E USO DO NìVEL DE EXPRESSãO DE NETRINA-1. O objeto da presente invenção refere-se a um método in vitro de seleção de compostos anticancerigenos com base na capacidade de interação desses compostos com receptor de netrina-1 e/ou de inibir a dimerização do domínio intracelular do receptor de netrina-1 expresso em células de tumores. A presente invenção também se refere a um método de previsão da presençade câncer agressivo ou metastático ou de determinação da eficiência de um tratamento anticancerígeno com base na medição do nível de expressão de netrina-1. A presente invenção compreende ainda kits e compostos como medicamento para o tratamento de câncer tal como câncer de mama metastático, com relação à sobreexpressão de netrina-1 pelas células de tumores.

Description

"MÉTODO DE SELEÇÃO DE UM COMPOSTO, MÉTODO IN VITRO DEPREVISÃO DA PRESENÇA DE CÂNCER METASTÁTICO OU CÂNCERAGRESSIVO, MÉTODO DE DETERMINAÇÃO IN VITRO DA EFICIÊNCIA DEUM TRATAMENTO ANTICANCERÍGENO, KIT DE SELEÇÃO, COMPOSTO,

MÉTODO DE TRATAMENTO, MÉTODO DE PREVENÇÃO OU DETRATAMENTO, USO DE UM COMPOSTO, MÉTODO OU USO E USO DONÍVEL DE EXPRESSÃO DE NETRINA-1"

O objeto da presente invenção refere-se a um método in vitro deseleção de compostos anticancerígenos com base na capacidade de interaçãodesses compostos com receptor de netrina-1 e/ou de inibir a dimerização dodomínio intracelular do receptor de netrina-1 expresso em células de tumores.

A presente invenção também se refere a um método de previsão da presençade câncer metastático ou de determinação da eficiência de um tratamentoanticancerígeno com base na medição do nível de expressão de netrina-1. Apresente invenção compreende ainda kits e compostos como medicamentopara o tratamento de câncer metastático tal como câncer de mama, comrelação à sobreexpressão de netrina-1 pelas células de tumores.

Demonstrou-se que netrina-1, uma proteína relativa a Iamininadifundível, desempenha um papel importante no controle da navegaçãoneuronal durante o desenvolvimento do sistema nervoso 31, por meio deinteração com os seus receptores principais, DCC (Excluído em Câncer Colo-Retal) 1·2·3 e UNC5H 4'5. Mais recentemente, entretanto, netrina-1 surgiu comomolécula completamente diferente que regula a sobrevivência celular. De fato,os receptores de netrina-1 DCC e UNC5H, ou seja, UNC5H1, UNC5H2 eUNC5H3, pertencem à chamada família de dependência de receptores 6' 7Receptores de dependência formam um grupo de receptores que compartilhama capacidade de indução da morte celular quando expressos em configuraçõesnas quais o seu Iigante não está disponível 44. Esses receptores, que tambémincluem RET 8, β-integrinas 9, Patched 10, neogenina 11, p75NTR 12 e o receptorandrógeno 40, compartilham a propriedade funcional de indução da mortecelular quando desengatados dos seus Iigantes1 enquanto a presença do seuligante bloqueia esta atividade pró-apoptótica. Estes receptores criam, destaforma, estados celulares de dependência sobre os seus ligantescorrespondentes 13, u.

Sugeriu-se que este efeito de dependência age como mecanismopara eliminar células de tumores que se desenvolveriam em ambientes deindisponibilidade de ligantes: proliferação de células de tumores em ambientecelular com presença de ligantes constante e limitada ou migração de célulasde tumores metastáticos em direção a tecidos em que o ligante não éexpresso. Uma vantagem seletiva de uma célula de tumor seria, portanto, aperda da atividade pró-apoptótica dos seus receptores de dependência. Previu-se a partir de telas genéticas que a netrina-1 de C. elegans -UNC6- interagiucom UNC40 e com UNC5 42. Quatro ortólogos de UNC5 foram identificados emmamíferos: concluiu-se que UNC5H1, H2, H3, H4 e UNC40 são o ortólogo doDCC (Excluído em Câncer Colo-Retal) de vertebrados 39 Ao longo desta linha,propôs-se no início dos anos 1990 que DCC é um gene supressor de tumores,cuja expressão é perdida na ampla maioria de cânceres humanos 15·16. Estahipótese também se enquadra na recente observação de que genes UNC5Hsão regulados para baixo na ampla maioria de tumores colo-retais, de forma asugerir que a perda de genes UNC5H representa uma vantagem seletiva parao desenvolvimento de tumores 17. De forma interessante, em camundongos,tanto a desativação de UNC5H3 quando a sobreexpressão de netrina-1 notrato gastrointestinal são associadas ao progresso de tumores intestinais 18,19,de forma a demonstrar intrinsecamente que a perda de receptores dedependência de netrina-1 na patologia humana é um fator causai do progressode tumores. Embora uma série inicial de relatórios sustentasse o fato de queDCC agiu como supressor de tumores (para análise, vide 29), surgiram dúvidas,principalmente devido à raridade de mutações pontuais na seqüência decodificação de DCC e devido à falta de pré-disposição de tumores emcamundongos hemizigóticos DCC 41.

O modelo descrito acima prevê, entretanto, que tanto a perda dosreceptores de netrina-1 quanto o ganho de expressão de Iigantes (ou seja,expressão autócrina) deverão ser observados em cânceres humanos, pois elesdeverão representar vantagens seletivas similares. Esta questão é importantenão apenas para conhecimento básico, mas é crucial para a terapia; de fato,inibir a interação extracelular entre receptores de dependência de netrina-1 enetrina-1 poderá representar uma estratégia importante para acionar aregressão de tumores.

É particularmente desejável fornecer meios simples econsistentes de identificação e caracterização de compostos novos quepossam ser utilizados para o tratamento de câncer.

Surpreendentemente, os inventores demonstraram em primeirolugar que, em vez de perder receptores de dependência de netrina-1, a maiorparte de tumores de mama metastáticos exibe maior expressão de netrina-1,uma característica que pode ser utilizada em terapia para acionar a morte detumor metastático.

Caso a sinalização pró-apoptótica de DCC e/ou UNC5H estejacomeçando a ser documentada, uma questão importante nesta assinatura demorte/vida ditada por DCC, UNC5H e, mais geralmente, pelos outrosreceptores de dependência conhecidos, é como a presença do Iigante inibe asua atividade pró-apoptótica 50.

Em um segundo momento, os inventores analisaram se amultimerização de DCC e/ou UNC5H induzida por netrina-1 poderia ser a etapafundamental que inibe a atividade apoptótica de DCC e/ou UNC5H.Surpreendentemente, eles demonstraram que um receptor de netrina-1, talcomo DCC e/ou UNC5H, multimeriza-se em resposta a netrina-1, um processosuficiente para inibir a apoptose.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a ummétodo in vitro de seleção de um composto para a prevenção ou o tratamentode câncer, em que o mencionado método compreende as etapas a seguir de:

a. ter um meio que contenha netrina-1, ou um de seusfragmentos, e um receptor de netrina-1, ou um de seus fragmentos, em que:

a mencionada netrina-1, ou um de seus fragmentos, e omencionado receptor de netrina-1, ou um de seus fragmentos, são capazes deinteragir especificamente juntos para formar um par de união; e/ou

a mencionada netrina-1, ou um de seus fragmentos, écapaz de induzir a dimerização ou a multimerização do mencionado receptorde netrina-1, ou um de seus fragmentos, particularmente o domínio intracelulardo mencionado receptor de netrina-1;

b. contato do mencionado meio com o composto a sertestado;

c. medição da inibição da interação entre netrina-1, ou um deseus fragmentos, e o mencionado receptor de netrina-1, ou um de seusfragmentos; e/ou

determinação de se o mencionado composto inibe adimerização ou multimerização do mencionado receptor de netrina-1, ou um deseus fragmentos, particularmente a dimerização do domínio intracelular domencionado receptor de netrina-1; e

d. seleção do mencionado composto se:a medição da etapa c demonstrar uma inibição significativada interação entre netrina-1, ou um de seus fragmentos, e receptor de netrina-1, ou um de seus fragmentos, na presença do mencionado composto; e/oua determinação na etapa c demonstrar uma inibiçãosignificativa da dimerização ou multimerização do mencionado receptor denetrina-1, ou um de seus fragmentos, na presença do mencionado composto,particularmente a dimerização do domínio intracelular do mencionado receptorde netrina-1.

Pelas expressões interação entre netrina-1 e o seu receptor denetrina-1, pretende-se designar no presente pedido a interação que resulta navantagem seletiva para células de tumores de escapar de receptores dedependência de netrina-1 que induziram apoptose, preferencialmente devidoao nível elevado de netrina-1.

Desta forma, a inibição desta interação pode ser obtida, porexemplo, por meio da inibição completa ou parcial da união de netrina-1 ao seureceptor, notadamente na presença de um Iigante competitivo (tal como umanticorpo que é dirigido a esse domínio de membrana extracelular domencionado receptor de netrina-1) ou na presença de um composto capaz deformar um complexo específico com a netrina-1 (tal como um domínio demembrana extracelular solúvel do seu receptor de netrina-1, ou uma de suaspartes).

Em uma realização preferida, o método de acordo com a presenteinvenção é caracterizado pelo fato de que o mencionado câncer a ser evitadoou tratado é um câncer em que as células de tumores expressam ousobreexpressam netrina-1.

Em outra realização preferida, o método de acordo com apresente invenção é caracterizado pelo fato de que o mencionado câncer a serevitado ou tratado é selecionado a partir do grupo que consiste de câncer demama, câncer colo-retal, câncer de pulmão, neuroblastoma, glioma, leucemiamielóide aguda, sarcoma, melanoma, adenocarcinoma do ovário,adenocarcinoma renal, adenocarcinoma pancreático, adenocarcinoma doútero, adenocarcinoma do estômago, adenocarcinoma do rim eadenocarcinoma retal.

Em outra realização preferida, o método de acordo com apresente invenção é caracterizado pelo fato de que o mencionado câncer a serevitado ou tratado é um câncer metastático ou agressivo.

No método de acordo com a presente invenção, o mencionadoreceptor de netrina-1 é preferencialmente selecionado a partir do grupo deDCC1 UNC5H (particularmente UNC5H1, UNC5H2 e UNC5H3), neogenina e aadenosina A2b, de maior preferência selecionado a partir do grupo de DCC1UNC5H1, UNC5H2 e UNC5H3.

Em outra realização preferida, o método de acordo com apresente invenção é caracterizado pelo fato de que, na etapa a:

o mencionado fragmento receptor de netrina-1 compreendeou é o domínio extracelular do receptor de netrina-1, ou uma de suas partescapaz de interagir com netrina-1/; e/ou

o mencionado fragmento receptor de netrina-1 compreendeou é o domínio intracelular do receptor de netrina-1, ou uma de suas partescapaz de dimerizar-se ou multimerizar-se na presença de netrina-1.

Em outra realização preferida, o método de acordo com apresente invenção é caracterizado pelo fato de que a mencionada netrina-1e/ou o mencionado receptor de netrina-1 são de mamífero, particularmente decamundongo, rato ou ser humano.

Em um aspecto adicional do método de acordo com a presenteinvenção, na etapa a, a mencionada netrina-1 é de galinha.

Em outra realização preferida, o método de acordo com apresente invenção é caracterizado pelo fato de que a mencionada netrina-1e/ou o mencionado receptor de netrina-1 e/ou o composto a ser testado émarcado por um marcador capaz de ser medido direta ou indiretamente.Em outra realização preferida, o método de acordo com apresente invenção é caracterizado pelo fato de que, na etapa c:

a medição da inibição da interação entre netrina-1, ou umde seus fragmentos, e o mencionado receptor de netrina-1, ou um de seusfragmentos, é conduzida por meio de imunoteste (particularmente por meio deELISA ou de Teste Imunorradiométrico (IRMA)), por meio de Teste deProximidade de Cintilação (SPA) ou Transferência de Energia de Ressonânciade Fluorescência (FRET); e/ou

a dimerização ou multimerização, ou sua inibição, domencionado receptor de netrina-1, ou um de seus fragmentos, particularmentedo domínio intracelular, é conduzida por meio de imunoprecipitação ou FRET.

Em outra realização preferida específica, o método de acordo coma presente invenção é caracterizado pelo fato de que, na etapa a, omencionado meio contém células que expressam na sua membrana desuperfície um receptor de netrina-1 endógeno ou recombinante,particularmente um domínio extracelular recombinante do mencionado receptorde netrina-1.

Em uma realização preferida, o mencionado receptor de netrina-1recombinante também compreende o domínio intracelular do mencionadoreceptor de netrina-1.

Em outra realização preferida específica, o método de acordo coma presente invenção é caracterizado pelo fato de que, na etapa a, omencionado meio contém células de tumores, preferencialmente células detumores metastáticos, que expressam de forma endógena o mencionadoreceptor de netrina-1 na sua superfície de membrana e que expressam ousobreexpressam netrina-1, e em que, na etapa c, a inibição da interação entrenetrina-1 e o seu receptor de netrina-1 na presença do composto a ser testadoé medida por meio da apoptose ou morte celular induzida pela presença docomposto a ser testado, preferencialmente analisada utilizando o método demanchas de azul de tripano conforme indicado nos exemplos abaixo.

Em uma realização preferida, as mencionadas células de tumoressão selecionadas a partir do grupo que consiste de células 4T1, células CAL51,células T47D, células SKBR7, células IMR32, células GL26 e células H358,notadamente linhagens de células CAL51, tais como linhagem de célulasCAL51-36, que são muito mais suscetíveis a morte celular em resposta àpresença de DCC-EC-Fc.

A presente invenção também se refere a um método in vitro deseleção de um composto para a prevenção ou o tratamento de câncer, em queo mencionado método compreende as etapas a seguir de:

a. ter um meio que contém uma célula de mamífero queexpressa um receptor de netrina-1 endógeno ou recombinante, ou um de seusfragmentos que compreende pelo menos o seu domínio intracelular,preferencialmente uma célula de tumor, de maior preferência uma célula queapresente dimerização ou multimerização do seu domínio intracelular dereceptor de netrina-1 ou uma célula em que o seu domínio intracelular dereceptor de netrina-1 é capaz de dimerizar-se ou multimerizar-se na presençade netrina-1;

b. contato do mencionado meio com o composto a sertestado, em que o meio opcionalmente contém ainda netrina-1, ou um de seusfragmentos capaz de interagir com o domínio extracelular do receptor denetrina-1;

c. determinar se a dimerização ou multimerização domencionado domínio intracelular de receptor de netrina-1 é inibida na presençado mencionado composto a ser testado;

d. opcionalmente, determinar (por meio do método de azul detripano, por exemplo) se a presença do composto a ser testado induz a mortecelular da mencionada célula de mamífero; e

e. seleção do mencionado composto caso a determinação naetapa c demonstre inibição significativa da dimerização ou multimerização dodomínio intracelular do mencionado receptor de netrina-1 e/ou se adeterminação na etapa d demonstrar a morte celular da mencionada célula demamífero.

Em segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um métodoin vitro de previsão da presença de câncer metastático ou câncer agressivo (talcomo neuroblastoma) em um paciente que possui um tumor primário a partir deuma biópsia do mencionado paciente que contém células de tumores primários,em que o mencionado método compreende a etapa a seguir de:

a. medição do nível de expressão de netrina-1 na mencionadabiópsia.

Em uma realização preferida, o método de previsão de acordocom a presente invenção é caracterizado pelo fato de que, na etapa a, umaumento do nível de expressão de netrina-1 na mencionada biópsia, emcomparação com a expressão de netrina-1 em biópsias de tumores primáriosnão metastáticos ou em biópsias de câncer não agressivas, é indicativa dapresença de um câncer metastático ou um câncer agressivo.

Em uma realização preferida, o método de previsão de acordocom a presente invenção é caracterizado pelo fato de que uma razão superiora 2, preferencialmente a 2,5, a 3, a 3,5, a 4, a 4,5 e a 5, entre a expressão denetrina-1 na biópsia a ser testada e na biópsia de referência não metastática ounão agressiva é indicativa da presença de um câncer metastático ou agressivo.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a ummétodo de determinação in vitro da eficiência de um tratamentoanticancerígeno para um paciente ou para selecionar pacientes que reajam aum tratamento anticancerígeno específico, em que o mencionado métodocompreende as etapas a seguir de:

a. obtenção de uma biópsia de tumor primária do mencionadopaciente tratado; e

b. medição do nível de expressão de netrina-1 na mencionadabiópsia;

em que a eficiência do mencionado tratamento anticancerígeno écorrelacionada com a redução da quantidade do nível de expressão de netrina-1 medido na mencionada biópsia; ou

em que os pacientes selecionados que reagem a um tratamentoanticancerígeno específico são pacientes em que a quantidade do nível deexpressão de netrina-1 medida na sua biópsia caiu após o mencionadotratamento específico.

Em uma realização preferida, o método de determinação in vitroda eficiência de um tratamento anticancerígeno para um paciente ou paraselecionar pacientes que reajam a um tratamento anticancerígeno específico écaracterizado pelo fato de que o mencionado câncer induziu sobreexpressãode netrina-1 e/ou é um câncer metastático ou agressivo.

Em uma realização preferida, o método de previsão ou dedeterminação in vitro da eficiência de um tratamento anticancerígeno para umpaciente é caracterizado pelo fato de que o produto de expressão de netrina-1medido é a netrina-1 que codifica RNA1 particularmente medida por meio de ummétodo de PCR reversa em tempo real quantitativa, ou pelo fato de que o nívelde expressão de netrina-1 que é medido é a medida do nível de proteína denetrina-1, particularmente por meio de método que utiliza anticorposespecíficos capazes de reconhecer especificamente a mencionada proteínanetrina-1.

Em uma realização preferida, o método de previsão ou dedeterminação in vitro da eficiência de um tratamento anticancerígeno para umpaciente é caracterizado pelo fato de que o tumor primário é um tumor primáriode um câncer selecionado a partir do grupo que consiste de câncer de mama,câncer colo-retal, câncer do pulmão, neuroblastoma, glioma, leucemia mielóideaguda, sarcoma, melanoma, adenocarcinoma do ovário, adenocarcinoma renal,adenocarcinoma pancreático, adenocarcinoma do útero, adenocarcinoma doestômago, adenocarcinoma do rim e adenocarcinoma retal.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit deseleção de um composto de prevenção ou tratamento de câncer, em que omencionado kit compreende:

uma proteína receptora de netrina-1, ou um de seusfragmentos capaz de interagir especificamente com a proteína netrina-1 paraformar um par de união, preferencialmente proteína recombinante; e

proteína netrina-1, ou um de seus fragmentos capaz deinteragir especificamente com a mencionada proteína receptora de netrina-1para formar um par de união, preferencialmente proteína recombinante.

O mencionado receptor de netrina-1 também é preferencialmenteselecionado a partir do grupo que consiste de DCC, UNC5H (particularmenteUNC5H1, UNC5H2 e UNC5H3), neogenina e a adenosina A2b, de maiorpreferência selecionado a partir do grupo que consiste de DCC, UNC5H1,UNC5H2 e UNC5H3, de maior preferência de mamífero tal como camundongo,rato ou ser humano.

Em uma realização preferida, o mencionado kit compreendecélulas de tumores que expressam receptor de netrina-1 e que expressam ousobreexpressam netrina-1, particularmente células de linhagem de células detumores metastáticos, preferencialmente selecionadas a partir do grupo queconsiste de células 4T1, células CAL51, células T47D, células SKBR7, célulasIMR32, células GL26 e células H358, notadamente linhagens de célulasCAL51, tais como linhagem de células CAL51-36, que são muito maissuscetíveis a morte celular em resposta à presença de DCC-EC-Fc.

Em um outro aspecto, a presente invenção compreende umcomposto selecionado a partir do grupo que consiste de:

um composto que compreende um domínio extracelular dereceptor de netrina-1 ou seu fragmento capaz de inibir especificamente ainteração entre a netrina-1 e o mencionado receptor de netrina-1 e/ou capaz deinibir a dimerização ou multimerização do mencionado receptor de netrina-1, ouum de seus fragmentos, particularmente para inibir o domínio intracelular domencionado receptor de netrina-1; e

. um anticorpo monoclonal ou policlonal dirigidoespecificamente contra netrina-1 ou receptor de netrina-1, particularmentedirigido ao domínio extracelular do mencionado receptor de netrina-1 ou aofragmento de netrina-1 capaz de interagir com o domínio extracelular domencionado receptor de netrina-1;

como medicamento.

A seqüência de aminácidos de netrina-1 humana ou receptor denetrina humano tal como UNC5H1, UNC5H2 e UNC5H3 (homólogo de Unc-5 1,2 e 3 equivalente ao homólogo de Unc-5 A, B e C) é bem conhecida dostécnicos no assunto. Um exemplo destas seqüências de aminoácidos com alocalização do seu domínio específico pode ser encontrado no Genbank com onúmero de acesso AAD09221 ou NP_004813 para netrina-1 humana, NP_588610para homólogo 1 de receptor de netrina humana Unc-5, Q8IZJ1 para homólogo 2de receptor de netrina Unc-5 e 095185 para homólogo 3 de Unc-5.

Preferencialmente, nos compostos de acordo com a presenteinvenção, o mencionado domínio extracelular de receptor de netrina-1 ou seufragmento é selecionado a partir do grupo de DCC, UNC5H (particularmenteUNC5H1, UNC5H2 e UNC5H3), neogenina e a adenosina A2b, selecionada demaior preferência a partir do grupo que consiste de DCC, UNC5H1, UNC5H2 eUNC5H3, de maior preferência a partir de mamífero tal como camundongo, ratoou ser humano.

Em realização de maior preferência, o mencionado composto deacordo com a presente invenção compreende um domínio extracelular dereceptor de netrina-1 de DCC e, preferencialmente, o mencionado composto éDCC-EC-Fc ou DCC-5Fbn.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso do nívelde expressão de netrina-1 como marcador para a identificação de câncermetastático em um paciente, preferencialmente de câncer colo-retal ou demama metastático, em que o de maior preferência é o câncer de mamametastático.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método detratamento para indução da apoptose ou da morte celular de células detumores que tenham adquirido a vantagem seletiva de escapar de apoptoseinduzida por receptores de dependência de netrina-1, preferencialmente pornível elevado de netrina-1, em um paciente que compreende a administraçãode um composto capaz de inibir a interação entre netrina-1 e o seu receptor denetrina-1, um composto capaz de inibir a dimerização ou a multimerização doreceptor de netrina-1, um composto de acordo com a presente invenção ouselecionado por meio do método de acordo com a presente invenção, nomencionado paciente dele necessitado.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método deprevenção ou de tratamento de câncer em pacientes que compreende aadministração de um composto de acordo com a presente invenção, ouselecionado por meio do método de acordo com a presente invenção, nomencionado paciente dele necessitado.

A presente invenção também compreende o uso de um compostode acordo com a presente invenção, ou selecionado por meio do método deacordo com a presente invenção, para a fabricação de um medicamento para aprevenção ou o tratamento de câncer em mamíferos, incluindo seres humanos.Preferencialmente, o mencionado câncer é um câncer metastático ouagressivo.

De maior preferência, no método de tratamento ou no uso de umcomposto de acordo com a presente invenção, o mencionado câncer éselecionado a partir do grupo que consiste de câncer de mama, câncer colo-retal, câncer do pulmão, neuroblastoma, glioma, leucemia mielóide aguda,sarcoma, melanoma, adenocarcinoma do ovário, adenocarcinoma renal,adenocarcinoma pancreático, adenocarcinoma do útero, adenocarcinoma doestômago, adenocarcinoma do rim e adenocarcinoma retal.

De maior preferência, no método de tratamento ou no uso de umcomposto de acordo com a presente invenção, as células de tumores primáriosdo mencionado câncer expressam ou sobreexpressam netrina-1.

O termo "anticorpo", da forma utilizada no presente, indicamoléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculasde imunoglobulina, ou seja, moléculas que contêm um local de união deantígenos que une especificamente (imunorreage com) a proteína netrina-1 ouo seu receptor.

O termo "anticorpo" compreende anticorpos monoclonais oupoliclonais, mas também anticorpos quiméricos ou humanizados.

Uma proteína netrina-1 isolada ou proteína receptora de netrina-1,ou um de seus fragmentos específicos, pode ser utilizada como imunogenepara gerar anticorpos que unem essa proteína utilizando métodos padrão paraa preparação de anticorpos monoclonais e policlonais. Pode também serpossível utilizar qualquer fragmento dessas proteínas que contenha pelomenos um determinante antigênico para gerar estes anticorpos específicos.

Um imonogene de proteína é tipicamente utilizado para prepararanticorpos por meio da imunização de um paciente apropriado (tal comocoelho, cabra, camundongo ou outro mamífero) com o imunogene. Umapreparação imunogênica apropriada pode conter a mencionada proteína, ouseu fragmento, e pode incluir adicionalmente um adjuvante, tal como adjuvantecompleto ou incompleto de Freund, ou agente imunoestimulante similar.

Desta forma, anticorpo para uso de acordo com a presenteinvenção inclui anticorpos policlonais, monoclonais, quiméricos ouhumanizados, anticorpos capazes de unir seletivamente ou que se unemseletivamente a um epítopo que contém um polipeptídeo que compreende umespaço contíguo de pelo menos oito a dez aminoácidos de uma seqüência deaminoácidos da proteína netrina-1 ou seu receptor.

Um agente preferido para detectar e quantificar mRNA ou cDNAque codifica proteína netrina-1 é uma sonda de ácido nucleico marcada ouprimers capazes de hibridizar este mRNA ou cDNA. A sonda de ácido nucleicopode ser um oligonucleotídeo com pelo menos 10, 15, 30, 50 ou 100nucleotídeos de comprimento e suficiente para hibridização específica sobcondições estringentes no mRNA ou cDNA. O primer de ácido nucleico podeser um oligonucleotídeo com pelo menos 10, 15 ou 20 nucleotídeos decomprimento e suficiente para hibridizar-se especificamente sob condiçõesestringentes no mRNA ou cDNA, ou sua seqüência complementar.

Um agente preferido para detectar e quantificar a proteína netrina-1 é um anticorpo capaz de unir-se especificamente a essa proteína,preferencialmente um anticorpo com uma marca detectável. Anticorpos podemser policlonais ou, de maior preferência, monoclonais. Pode ser utilizado umanticorpo intacto, ou um de seus fragmentos (tal como Fab ou F(ab')2). Otermo "marcado", com relação à sonda ou anticorpo, destina-se a englobarmarcação direta da sonda ou anticorpo por meio de acoplamento (ou seja,ligação física) de substância detectável à sonda ou anticorpo, bem comomarcação indireta da sonda ou anticorpo por meio de reatividade com outroreagente que é marcado diretamente. Exemplos de marcação indireta incluema detecção de um anticorpo primário utilizando um anticorpo secundáriomarcado de forma fluorescente e marcação final de uma sonda de DNA combiotina, de forma que possa ser detectado com estreptavidina marcada deforma fluorescente.

Métodos in vitro de detecção de possível mRNA incluem, porexemplo, hibridizações Northern e hibridizações in situ. Métodos in vitro dedetecção da possível proteína incluem testes imunossorventes ligados porenzimas (ELISAs), Western Blots, imunoprecipitações e imunofluorescência.

Os métodos in vitro para detecção de possível cDNA incluem hibridizaçõesSouthern.

Quando a presente invenção englobar kits para quantificar o nívelde proteína netrina-1, o kit pode compreender um agente ou compostomarcado capaz de quantificar estas proteínas. Os mencionados agentespodem ser embalados em um recipiente apropriado. O kit pode compreenderainda instruções de uso do kit para quantificar o nível da proteína netrina-1 oudo transcrito de netrina-1.

Em certas realizações do método de acordo com a presenteinvenção, a determinação dos transcritos de netrina-1 envolve o uso de umasonda/primer em uma reação em cadeia de polimerase (PCR), tal como PCRâncora ou PCR RACE ou, alternativamente, em uma reação de cadeia deligação (LCR) (vide, por exemplo, Landegran et al, 1988, Science 241: 23-1080; e Nakazawa et al, 1994, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 91: 360-364) ou,alternativamente, PCR RT em tempo real quantitativa. Este método pode incluiras etapas de coleta de uma amostra de células de um paciente, isolamento deácido nucleico (tal como mRNA) das células da amostra, transformaçãoopcional de mRNA em cDNA correspondente, contato da amostra de ácidonucleico com um ou mais primers que se hibridizam especificamente nanetrina-1, mRNA ou seu cDNA correspondente sob condições tais que ocorra ahibridização e a amplificação de cDNA ou mRNA de netrina-1 e quantificaçãoda presença dos produtos de amplificação. Antecipa-se que PCR e/ou LCRpode ser desejável para uso como uma etapa de amplificação em conjunto comqualquer dos métodos utilizados para quantificar a detecção de ácido nucleico.

Os métodos descritos no presente podem ser realizados, porexemplo, utilizando kits de diagnóstico previamente embalados quecompreendem pelo menos uma sonda de ácido nucleico ou conjunto de primerou reagente de anticorpo descrito no presente, que podem serconvenientemente utilizados, por exemplo, em ambientes clínicos paraacompanhamento ou diagnóstico de pacientes.

Por fim, a presente invenção refere-se ao uso deoligonucleotídeos sem sentido ou de iRNA (RNA interferente) específicos doácido nucleico que codifica proteína netrina-1 para a fabricação de ummedicamento destinado a evitar ou tratar câncer metastático ou agressivo, emque o mencionado câncer é preferencialmente selecionado a partir do grupoque consiste de câncer de mama, câncer colo-retal, câncer do pulmão,neuroblastoma, glioma, leucemia mielóide aguda, sarcoma, melanoma,adenocarcinoma do ovário, adenocarcinoma renal, adenocarcinomapancreático, adenocarcinoma do útero, adenocarcinoma do estômago,adenocarcinoma do rim e adenocarcinoma retal.

RNA interferente (iRNA) é um fenômeno no qual um RNA de fitadupla (dsRNA) suprime especificamente a expressão de um gene que contéma sua seqüência de complementaridade. iRNA tornou-se desde então umaferramenta de pesquisa útil para muitos organismos. Embora o mecanismo pormeio do qual dsRNA suprime a expressão genética não seja completamentecompreendido, dados experimentais fornecem indicações importantes. Estatecnologia possui grande potencial como ferramenta de estudo da funçãogenética em células de mamíferos e pode gerar o desenvolvimento de agentesfarmacológicos com base em siRNA (RNA interferente pequeno).

Quando administrado a um paciente, um composto de acordocom a presente invenção é preferencialmente administrado como componentede uma composição que compreende opcionalmente um veículofarmaceuticamente aceitável. A composição pode ser administrada oralmenteou por qualquer outra via conveniente e pode ser administrada junto com outroagente biologicamente ativo. A administração pode ser sistêmica ou local.Vários sistemas de fornecimento são conhecidos, tais como encapsulação emlipossomos, micropartículas, microcápsulas, cápsulas etc., e podem serutilizados para administrar o composto selecionado de acordo com a presenteinvenção ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Os métodos de administração incluem, mas sem limitar-se aintradérmico, intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, subcutâneo,intranasal, epidural, oral, sublingual, intranasal, intracerebral, intravaginal,transdérmico, retal, por inalação ou tópico. O modo de administração é deixadoa critério do praticante. Na maior parte dos casos, a administração resultará naliberação do composto para o fluxo sangüíneo ou diretamente para o tumorprimário.

As composições que compreendem o composto de acordo com apresente invenção ou selecionadas por meio dos métodos de acordo com apresente invenção também fazem parte da presente invenção. Estascomposições podem compreender adicionalmente uma quantidade apropriadade um veículo farmaceuticamente aceitável, para fornecer a forma paraadministração apropriada ao paciente. A expressão "farmaceuticamenteaceitável" indica aprovado por uma agência reguladora ou relacionado por umafarmacopéia nacional ou reconhecida para uso em animais, mamíferos e, maisparticularmente, em seres humanos. O termo "veículo" designa diluente,adjuvante, excipiente ou veículo com o qual é administrado um composto deacordo com a presente invenção. Esses veículos farmacêuticos podem serlíquidos, tais como água e óleos, incluindo os de petróleo, origem animal,vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral,óleo de gergelim e similares. Os veículos farmacêuticos podem ser soluçãosalina, gelatina, amido e similares. Além disso, podem ser utilizados agentesauxiliares, estabilizantes, espessantes, lubrificantes e corantes. As soluçõessalinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol podem também serempregadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis.

Veículos farmacêuticos apropriados também incluem excipientes tais comoamido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, estearato de sódio, monoestearatode glicerol, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol,água e similares. Composições de compostos de teste, se desejado, podemtambém conter pequenas quantidades de agentes umectantes ouemulsificantes, ou agentes tamponadores do pH. As composições de acordocom a presente invenção podem assumir a forma de soluções, suspensões,emulsões, pastilhas, pílulas, comprimidos, cápsulas, cápsulas que contêmlíquidos, pós, formulações para liberação sustentada, supositórios, emulsões,aerossóis, pulverizações, suspensões ou qualquer outra fôrma apropriada parauso. A mencionada composição geralmente é formulada de acordo comprocedimentos de rotina na forma de composição farmacêutica adaptada aseres humanos para administração oral ou para administração intravenosa. Aquantidade do composto ativo ou aquela que será eficaz no tratamento podeser determinada por meio de métodos clínicos padrão. Além disso, testes invitro ou in vivo podem ser opcionalmente empregados para ajudar a identificarfaixas de dosagem ideais. A dose precisa a ser empregada também dependeráda via de administração e da seriedade da doença e deve ser decidida deacordo com o julgamento do praticante e com as circunstâncias de cadapaciente. Faixas de dosagem apropriadas para administração oral, intranasal,intradérmica ou intravenosa, entretanto, são geralmente de cerca de 0,01miligramas a cerca de 75 miligramas por quilograma de peso do corpo por dia,de maior preferência cerca de 0,5 miligramas a 5 miligramas por quilograma depeso do corpo por dia.

Deve-se compreender que, embora a presente invenção tenhasido descrita em conjunto com as realizações acima, a descrição abaixo e osexemplos a seguir destinam-se a ilustrar e não a limitar o escopo da presenteinvenção. Outros aspectos, vantagens e modificações dentro do escopo dapresente invenção serão evidentes para os técnicos no assunto ao qualpertence a presente invenção.

Breve Descrição das Figuras

Figuras 1a e 1b: netrina-1 é sobreexpressa em tumores de mamametastáticos humanos

Figura 1A: perfil de expressão de netrina-1 examinado com PCRde transcrição reversa em tempo real quantitativa. PCR Q-RT foi realizadautilizando RNA total extraído de quinze biópsias de tumores primáriosmetastáticos (barra sólida) e quinze não metastáticos (barra aberta) comprimers de netrina-1 humana específicos 26 e primers correspondentes ao geneTBP humano (Proteína de União TATA). TBP foi utilizado como controle nopresente, pois ele exibe fraca variabilidade no nível de mRNA entre tecidostumorosos normais e de mama, conforme descrito em 25. A expressão denetrina-1 é fornecida como a razão entre a expressão de netrina-1 em cadaamostra e a média da expressão de netrina-1 nas amostras não metastáticas.

Figura 1B: realizou-se PCR Q-RT utilizando RNA total extraído delinhagens de células de camundongo 67NR e 4T1 com primers de netrina-1 decamundongo específicos e o gene RPLPO de camundongo como padrão.FIGURAS 2Α A 2D: EXPRESSÃO FORCADA DE NFTRINA-1 EM LINHAGEM DE CÉLULASDE CAMUNDONGO 67NR GERA O DESENVOLVMFNTO DE METÁSTASE

Figuras 2A e 2B: imitações de células 67NR transfectadas oucélulas 67NR transfectadas de forma estável com netrina-1 (67NR-net) foramsubmetidas a análise de expressão de netrina-1. A Figura 2A, PCR RT que utilizaprimers de netrina-1 de galinha específicos, foi realizada utilizando RNA totalextraído de 67NR-net1 e 67NR-imitação. Na Figura 2B, realizou-se Western Blotutilizando anticorpos anti-myc (netrina-1 de galinha) e anti-netrina-1.

Figura 2C: microfotografias dos dois clones 67NR-net1 e 67NR-net2 em comparação com 67NR parental e linhagem celular 4T1.

Figura 2D: células 4T1 metastáticas, dois clones de célulascontrole que possuem resistência a puromicina (67NR1 e 67NR2) e dois clonesde células que expressam netrina-1 (67NRnet1 e 67NRnet2) foram injetadosem almofada de gordura de dezesseis camundongos (quatro camundongos portipo de célula) e a metástase foi analisada no ambiente de pulmão.Microfotografias representativas de nódulos subplêuricos eintraparenquimatosos após a injeção dos clones de células correspondentes(4T1, 67NR1, 67NRnet1, 67NRnet2). IPL: lesão intraparenquimatosa, UPL:lesões subplêuricas.

FIGURAS 3A A 3D: INDUÇÃO DA ΜΩΕΤΕ DE CÉLULAS METASTÁTICAS DECAMUNDONGOS POR MEIO DA ·Μ·«ί*θ DA INTERAÇÃO DE RECEPTOR DE NETRINA-1

Figura 3A: esquema que representa netrina-1 e seus receptores,DCCe UNC5H.

Figuras 3B, 3C e 3D: análise quantitativa da morte celular emcélulas 67NR e 4T1 utilizando DCC-EC-Fc e IL3-EC-Fc não específico comocontrole (Figura 3B) em concentrações diferentes (Figura 3C) ou o domínioDCC-SFbn mais restrito (Figura 3D) como competidor para interação entrenetrina-1 e receptor. A morte celular foi quantificada por meio do teste deexclusão de azul tripano (Figuras 3B e 3D) ou por meio de teste de atividade decaspase (Figura 3C). Os desvios padrão são indicados (n = 3).

Figuras 4A ε 4B: indução da morte de células metastáticas humanas pormeio de inibicão da interação entre netrina-1 e receptor

Figura 4A: medição quantitativa da morte de células CAL51tratadas com concentração diferente de DCC-EC-Fc por meio do teste deexclusão de azul de tripano.

Figura 4B: análise quantitativa da morte celular monitorada pormeio de exclusão de azul de tripano na linhagem de células parentais CAL51ou na linhagem de células clonais CAL51-36, tratadas ou não com ocompetidor DCC-EC-Fc em meios de cultivo.

Figura 5: netrina-1 é sobreexpressa em tumores de mama metastáticoshumanos

Perfil de expressão de netrina-1 examinada com PCR detranscrição reversa em tempo real quantitativa. PCR Q-RT foi realizadautilizando RNA total extraído de 51 biópsias de tumor. Elas foram obtidas deum paciente com tumores localizados na mama (NO, barra vazia); comenvolvimento apenas de nó axilar (N+f barra cinza) e com metástasesdistantes em diagnóstico (M+, barra sólida). Foram utilizados primers denetrina-1 humanos específicos 39 e primers correspondentes ao genePBGD humano (Proteína de União TATA). PBGD foi utilizado comoreferência no presente, pois exibe variabilidade fraca em nível de mRNAentre tecidos de tumores de mama e normais, conforme descrito em^38 . Ooutro TBP de referência também foi utilizado com resultados similares (nãoexibidos). A expressão de netrina-1 é fornecida como a razão entre aexpressão de netrina-1 em cada amostra e a média da expressão denetrina-1 nas amostras NO. Foi utilizado teste de significação estatísticanão paramétrico (Mann-Whitney) e o valor ρ é indicado.Figuras 6A a 6C: indução da morte de células metastáticas por meio deinibicão da interação entre netrina-1 e receptor

Figura 6A: DCC-EC-Fc desloca a interação DCC/netrina-1 eUNC5H2/netrina-1. Teste ELISA com DCC-EC-Fc (painel superior) ouUNC5H2-EC-Fc (painel inferior) revestidos e a quantificação de netrina-1 unidautilizando anticorpo anti-netrina-1 na presença de concentração crescente deDCC-EC-Fc.

Figuras 6B e 6C: análise quantitativa da morte celular em células67NR e 4T1 utilizando DCC-EC-Fc e IL3-EC-Fc não específica como controle.

A morte celular foi quantificada pelo teste de exclusão de azul de tripano(Figura 6B) ou por meio de teste de atividade de caspase (Figura 6C). Sãoindicados os desvios padrão (n = 3).

Figuras 7A a 7C: inibicão da formação de metástase em camundongos pormeio de tratamento com DCC-5FBN

Figura 7A: análise quantitativa da morte celular em células 67NRe 4T1 tratadas com DCC-5Fbn. Teste MTT foi realizado sobre células 67NR ou4T1 após o tratamento com doses crescentes de DCC-5Fbn (ug/ml). Eapresentado o percentual de sobrevivência celular. São indicados desviospadrão (n = 3).

Figuras 7B e 7C: células 4T1-luc foram injetadas por viaintravenosa em camundongos BALB/c no dia 0 e PBS ou DCC-5Fbn foraminjetados a cada dois dias, uma vez por via intravenosa, uma vez por viaintraperitoneal a partir do dia 0. Após treze dias, o desenvolvimento demetástase foi estudado por meio de registro de luminescência (Figuras 7B e7C) ou de exame de pulmões em um instrumento.

Figura 7B: imagem representativa de registro de luminescência decamundongos tratados com PBS (direita) ou tratados com DCC-5Fbn(esquerda).Figura 7C: quantificação do sinal Iuminescente medido por meiodo sistema NightOwLB. O número de fótons/pixel/seg foi quantificado em cadaanimal e um índice de sinal Iuminescente é fornecido na razão entre ofóton/camundongo médio em camundongos tratados com PBS e o sinal médiodetectado em camundongos tratados com DCC-5Fbn. São apresentados doisexperimentos independentes (vinte camundongos foram analisados noexperimento 1 e oito camundongos no experimento 2).

Foi tirada uma fotografia macroscópia representativa de umpulmão de camundongo tratado com PBS ou de camundongo tratado comDCC-SFbn (não exibida) e pode ser demonstrada no pulmão de camundongostratados com PBS.

FIGURAS 8A E 8B: EFEITO DE HHC-SFBN SOBRF NFTRINA-1 QUE EXPRESSALINHAGENS DE CÉLULAS DE CÂNCER DE MAMA HUMANO

Figura 8A: expressão de netrina-1 examinada por meio de PCRQ-RT utilizando RNA total extraído de 48 linhagens de células de tumores demama diferentes. A expressão de netrina-1 é fornecida como a razão entre aexpressão de netrina-1 e a expressão de HBMS do gene doméstico(hidroximetilbilano sintase) em cada amostra. TBP também foi utilizado comocontrole no presente e gerou resultados similares. As duas linhagens celularesque foram selecionadas pelo seu alto nível de netrina-1 são indicadas porestrelas.

Figura 8B: indução da morte celular por DCC-õFbn em linhagensde células SKBR7 e T47D. A morte celular foi quantificada por meio de testeMTT conforme descrito na Figura 4A (painel direito) ou por medição daatividade de caspase, conforme descrito na Figura 3D (painel esquerdo). Sãoindicados os desvios padrão (n = 3).

Figuras 9A ε 9B: neurobi astoma humano

Figura 9A: netrina-1 é um marcador da agressividade emneuroblastoma humano. O perfil de expressão de netrina-1 foi examinado comPCR de transcrição reversa em tempo real quantitativa. PCR Q-RT foi realizadautilizando RNA total extraído de 101 na etapa 4 ou biópsias de neuroblastoma4s. Os tumores foram de estágio 4 diagnosticado em pacientes que tinhammenos de um ano de idade (4 <1 ano) ou estágio 4 diagnosticado em pacientesque tinham mais de um ano de idade (4 >1 ano). Pode-se observar quecânceres com mau prognóstico (estágio 4 >1 ano) exibem sobreexpressãosignificativa de netrina-1. Testes de estudantes t foram utilizados e os valores ρsão indicados.

Figura 9B: células IMR32 que produzem de forma endógenanetrina-1 foram tratadas ou não com DCC-5Fbn ou como ILR3 controle (oectodomínio receptor de interleucina-3) e foram analisadas para determinar amorte celular por meio de medição da atividade de caspase (acima) ou damedição da sobrevivência celular por meio de teste MTT (abaixo). Observe-seque, embora IL3R não possua efeito sobre a morte de células IMR32, DCC-5Fbn induz morte de células IMR32 significativa. Os desvios padrão sãoindicados (n = 3).

Figuras 1QA ε 10B: glioma

Figura 10A: netrina-1 é sobreexpressa em uma grande fração deglioma. O perfil de expressão de nextrina-1 foi examinado com PCR detranscrição reversa em tempo real quantitativa. Q-RT PCR foi realizadautilizando RNA total extraído de biópsias de oligodendroglioma do estágio Il eestágio Ill e glioblastoma do estágio IV e foi comparado com cérebro humanonormal.

Figura 10B: células GL26 que produzem netrina-1 de formaendógena (não exibido) foram tratadas ou não com DCC-õFbn na presença ounão de quantidade excessiva de netrina-1 recombinante e foram analisadaspara determinar a morte celular seja por meio da medição da atividade decaspase (acima) ou por meio de medição da sobrevivência celular por meio deteste MTT (abaixo). Observe-se que DCC-5Fbn induz morte de células GL26significativa e que este efeito é totalmente inibido pela adição de netrina-1, deforma a demonstrar que o efeito de DCC-5Fbn é diretamente relacionado coma inibição de netrina-1 endógena. Os desvios padrão são indicados (n = 3).

Figuras 11A a 11C: câncer do pulmão

Figura 11 A: netrina-1 é sobreexpressa em uma fraçãodimensionável de câncer do pulmão humano. O perfil de expressão de netrina-1 foi examinado com PCR de transcrição reversa em tempo real quantitativa.Q-RT PCR foi realizado utilizando RNA total extraído de biópsias de câncer dopulmão e foi comparado com tecido normal.

Figura 11B: H358 e H460, duas linhagens de células NSCLC,foram adicionalmente utilizadas para testes de morte celular. Células H358 queexpressam netrina-1 de forma endógena e células H460 que deixam de exibirexpressão de netrina-1 detectável foram tratadas ou não com DCC-5Fbn napresença ou não de quantidade excessiva de netrina-1 recombinante e foramanalisadas para determinar a morte celular por meio de medição da atividadede caspase (acima) ou de medição da sobrevivência celular por meio de testeMTT (abaixo). Observe-se que DCC-5Fbn induz morte de células H358significativa, mas deixa de exibir efeito sobre células H460. Além disso, o efeitode morte observado em células H358 é totalmente inibido pela adição denetrina-1. Junto com o fato de que as células H460 não são sensíveis a DCC-5Fbn, estes dados sustentam que células de tumor de pulmão que expressamnetrina-1 sofrem apoptose em resposta a DCC-5Fbn. Os desvios padrão sãoindicados (n = 3).

Figura 11C: DCC-5Fbn inibe o crescimento de tumor H358xenoenxertado em camundongos brutos. Fêmeas de camundongos nu/nuatímicos com cinco semanas de idade (20 a 22 g de peso do corpo) foramobtidas de Charles River. Os camundongos foram abrigados em gaiolascobertas com filtro esterilizadas e mantidos em uma instalação de animais livrede patógenos. Células H358 foram implantadas por meio de injeçãosubcutânea de 5 χ 106 células em 200 μΙ de PBS no flanco esquerdo doscamundongos. Quando os tumores foram estabelecidos, PBS ou 20 μg deDCC-5Fbn foram administrados ao tumor (it) todos os dias (a duração dotratamento é indicada por setas). Os tamanhos de tumores foram medidos porum calibrador durante 41 dias. O volume do tumor foi calculado com a fórmulaν = (0,5 * (comprimento*largura2)) ± desvio padrão, *) em seis camundongostratados com DCC-5Fbn e quatro camundongos tratados com PBS. Observe-seque, embora se tenha demonstrado que tumores tratados com PBS crescem,tumores tratados com DCC-5Fbn exibiram regressão massiva.

Figuras 12A ε 12B: netrina-1 media a multimerizacão de UNC5H2 e DCC

Figura 12A: multimerização de DCC na presença de netrina-1 emcélulas HEK293T. Lisatos de células HEK293T transfectadas transitoriamentecom construções que expressam HA-DCC e/ou c-myc-DCC junto comconstrução que expressa netrina-1 ou não foram submetidos a retirada de myc(IP α-myc). A presença de DCC-HA foi revelada com um anticorpo anti-HA.

Figura 12B: dimerização de UNC5H2 na presença de netrina-1em células HEK293T. A transfecção das células e a preparação de Iisatocelular foram realizadas como em (A), mas com construções que expressamHA-Unc5H2 e/ou Marca M2-UNC5H2. Lisatos celulares foram submetidos aretirada de Marca M2 (IP α-Marca). A presença de HA-UNC5H2 foi reveladacom um anticorpo anti-HA. Total: Western Blot sobre o Iisato antes da retirada.

Figuras 13A ε 13B: validação do sistema quimicamente indutível paradimerização de UNC5H2

Figura 13A: representação esquemática de construções de fusãode Fv2e-UNC5H2 que exibem as duas construções (um HA marcado, o outroc-myc marcado) utilizadas para validar o sistema de dimerização artificial.

Figura 13B: Iisatos de células HEK293T transfectadastransitoriamente com HA marcado por Fv2E-UNC5H2 ou c-myc com ou sem adroga de dimerização (AP20187) foram submetidos a retirada de c-myc (IP <*-myc). Total: Western Blot sobre Iisato antes da retirada. A presença de HA-

Fv2E-UNC5H2 foi revelada com anticorpo anti-HA.FifiiIRAS 14A A eras DE D.ME^^Ãn nF DCC FORCADA BLOQUEIA A SUAATIVIDADE PRÓ-APOPTÓTICA

Figura 14A: a morte celular induzida por DCC é inibida por meiode dimerização induzida por AP20187, conforme medido por meio de exclusãode azul de tripano. Células HEK293T foram transfectadas com imitação deplasmídeo (Cont)1 Fv2E (Fv)1 Fv2E-DCC-IC (Fv-DCC) com ou sem AP20187(AP). Em todas as condições, as células também foram transfectadas com omarcador de superfície pKk. Células transfectadas que expressam o marcadorforam marcadas magneticamente com Microesferas MACSeIect e separadasutilizando um Separador MACS e Colunas de Separação. A exclusão de azulde tripano foi testada sobre estas células purificadas.

Figura 14B: a morte celular induzida por UNC5H2 é inibida por meiode dimerização induzida por AP20187, conforme medido por meio de exclusão deazul de tripano como em (A). As células foram transfectadas com pMACSKk e Fv2E(Fv)1 Fv2E-UNC5H2-IC (Fv-UNC5H2) com ou sem AP20187 (AP).

Figura 14C: a ativação de caspase induzida por UNC5H2 é inibidapor meio de dimerização induzida por AP20187, conforme medido pelaatividade relativa de caspase-3. Células HEK293T foram transfectadas comimitação de vetor pCMV (ConL)1 Fv2E (Fv)1 Fv2E-UNC5H2-«C (Fv-UNC5H2)com ou sem AP20187 (AP). O índice de atividade relativa de caspase éapresentado como a razão entre a atividade de caspase da amostra e aquelamedida em células HEK293T transfectadas com pCMV. Os desvios padrão sãoindicados (η = 3).

FIGURAS 15A a 15C: O QUINTO DOMINIO DE FIBRONECTINA SOLÚVEL RECOMBINANTEDE DCC ( DCC-5FBN) INIBE A MULTIMERIZACAO DE DDC INDUZIDA POR NETRINA-1

Figura 15A: curva de afinidade de netrina-1 sobre DCC-5Fbnmedida por meio de teste ELISA demonstra que DCC-SFbn é capaz de unirnetrina-1. DCC-SFbn (100 ng) ou IL3-R (600 ng) foi revestido e foramadicionadas doses crescentes de netrina-1 (0 a 800 ng). Os valores IL3 foramsubtraídos dos valores DCC-SFbn. Kd aproximado de DCC-5Fbn/netrina-1 foiestimado em 5 nM.

Figura 15B: teste de competição. Como em (A), mas o domínioextracelular completo de DCC (DCC-EC, 125 ng) foi revestido no lugar deDCC-SFbn e adicionou-se netrina-1 (50 ng) na presença de DCC-SFbn (625ng) ou o DCC-EC completo (125 ng). Observe-se que DCC-õFbn deixa decompetir com a interação de DCC/netrina-1.

Figura 15C: multimerização de DCC induzida por netrina-1 éinibida por DCC-5Fbn. Lisatos de células HEK293T transfectadastransitoriamente com construções que expressam HA-DCC e/ou c-myc-DCCcom ou sem netrina-1 (300 ng/ml) e/ou DCC-5Fbn (900 ng/ml) foramsubmetidos a retirada de HA (IP α-ΗΑ). A presença de c-myc-DCC foi reveladacom anticorpo anti-c-myc. Total: Western Blot sobre Iisato antes da retirada.

FIGURAS 16A E 16B: DCC-5FBN ANTAGONIZA OS EFFITOS DE BLOQUEIO DENETRINA-1 SOBRE A MORTE CELULAR INDUZIDA POR DCC

Figura 16A: células HEK293T foram transfectadastransitoriamente com imitação (Cont.) ou uma construção DCC de comprimentototal e incubadas ou não com netrina-1 (300 ng/ml) e/ou DCC-SFbn (800ng/ml). A morte celular foi determinada por meio de manchas de azul tripano.

Figura 16B: células de câncer de mama metastático 4T1 foramcultivadas na presença (+ DCC-SFbn) ou ausência (- DCC-5Fbn) de DCC-SFbn(300 ng/ml) por 24 horas e a morte celular também foi medida por meio deteste de exclusão de azul tripano. Os desvios padrão são indicados (n = 3).

Exemplo 1

MARERIAS E METODOS

LINHAGEM CELLULAR, CULTIVOS CELULARES, PROCEDIMENTO DE TRANSFECÇÃO,REAGENTES E IMUNOMANCHAS

Células 4T1 e 67NR foram recebidas por gentileza de F. Miller(Detroit Ml, Estados Unidos). Cal51. MCF7, MDA-MB231, 453, 361, 157, SK-BR3, CAMA-1, T47D foram cultivados utilizando procedimento padrão.Linhagens de células de mama humanas relacionadas na Figura 8B e, maisespecificamente, linhagens de células T47D e SKB7 foram obtidas por meio deD. Birnbaun. Células 67NR foram transfectadas de forma estável utilizando oreagente Iipofectamina (Invitrogen) e seleção de puromicina (Sigma).Transfecções transitórias de células de Rim Embriônico Humano 293T(HEK293T) foram realizadas conforme descrito anteriormente 10 de acordo comum procedimento de fosfato de cálcio modificado ou utilizando Lipofectaminade acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). A linhagem de célulasde câncer de mama 4T1 foi descrita anteriormente 2°. Células 4T1-luc foramobtidas por meio de transfecção estável de vetor CMV-.uciferase que possuiresistência a higromicina. Cones foram selecionados por meio de intensidadede luminescência utilizando a Estação Luminoskan Ascent (Labsystems).Imunomanchas foram realizadas conforme descrito anteriormente 6 utilizandoanti-c-myc (Sigma; 1/200) anti-Marca M2 (Sigma, 1/200) ou anti-HA (Sigma,1/500). O agente de dimerização artificial AP20187 foi da AriadPharmaceuticals. O domínio extracelular completo de DCC (DCC-EC), DCC-EC-Fc, foi obtido por meio da R&D Systems e Netrina-1 da Apotech Corp. Paraanálise da morte celular, medição da atividade de easpase eimunoprecipitação, AP20187 foi utilizado em concentração final de 10 nM enetrina-1 foi utilizada em concentração final de 300 ng/ml.

Amostras de tumores df mama humanos

Foram fornecidas 51 amostras de câncer de mama humano pelobanco de tumores do Centre Léon Bérard. Tecido novo do tumor foi obtidodurante cirurgia da mama antes de qualquer terapia sistêmica e congeladorapidamente em nitrogênio líquido.

mutagênese dirigida a local ε construções de plasmídeos:

pGNET-1 pCMV e pGNET-1 que codifica netrina-1 de galinha foiconforme descrito anteriormente 6. pKk foi descrito 22. Os mutantes negativosdominantes para DCC (PCR-DCC-IC-D1290N) e para UNC5H (pCR-UNC5H2-IC-D412N) foram descritos anteriormente 6'27·7. HA-DCC foi obtido por meio daintrodução de uma marca HA no modelo pCMV-DCC 6 pelo sistema demutagênese dirigida a local QuikChange (Stratagene) utilizando os primers aseguir: DCC-HA F.

CACAGGCTCAGCCTTTTATCCATATGATGTACCGGATTATGCATAACATGTA

TTTCTGAATG-3' (SEQ ID N° 1); DCC-HA R: 5'-

CATTCAGAAATACATGTTATGCATAATCCGGTACATCATATGGATAAAAGGC

TGAGCCTGTG-3' (SEQ ID N0 2).

c-myc-DCC também foi obtido por meio da introdução de uma

marca c-myc no modelo pCMV-DCC por meio de QuikChange utilizando os

primers a seguir: DCC-myc F: 5'-

CACAGGCTCAGCCTTTGAGCAGAAGTTGATAAGTGAGGAAGATCTGTAAC

ATGTATTTCTGAATG-3' (SEQ ID N0 3). DCC-myc R: 5-

CATTCAGAAATACATGTTACAGATCTTCCTCACTTCTCAACTTCTGCTCAAA

GGCTGAGCCTGTG-3' (SEQ ID N0 4).

Vetor de expressão que codifica HA-Fv2E (em pC4M) do kit de

Homodimerização Regulada Argent é da Ariad Pharmaceuticals. A partir deste

plasmídeo, foi construído o plasmídeo HA-Fv2E-DCC-IC. Um fragmento dePCR do domínio intracelular de DCC (1122-1447) foi obtido com os primers: F5'-TATGTCGACCGACGCTCTTCAGCCCAGCAGAGA-3' (SEQ ID N0 5) e R 5'-TATGAATTCTTAGTCGAGTGCGTAGTCTGGTACGTCGTACGGATAAAAGGCTGAGCCTGTGATGGCATTAAG-3' (SEQ ID N0 6).

O primer reverso fundiu-se à marca HA para a extremidade C-terminal de DCC. O fragmento de PCR foi subclonado em HA-Fv2E por meiode digestão de restrição de Sall e EcoRI. O c-myc-Fv2E-DCC-IC foi obtidoutilizando o sistema de mutagênese dirigido por local QuikChange (Stratagen)com pC4M-Fv2E-DCC-IC-HA como modelo e os primers a seguir: primer F: 5'-CTTAATGCCATCACAGGCTCAGCCTTTGAACAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGTAAGAATTCATAAAGGGCAAT-3' (SEQ ID N0 7) e o primer R: 5'-ATTGCCCTTTATGAATTCTTACAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGTTCAAAGGCTGAGCCTGTGATGGCATTAAG-3' (SEQ ID N0 8).

HA-UNC5H2 (em pcDNA3.1) já foi descrito 7. As construções quecodificam Marca M2-UNC5H2 foram geradas por meio de clonagem emp3xMarca-CMVTM-7.1 (Sigma) do fragmento de NotI-EcoRI PCR derivado deHA-UNC5H2 como modelo e os primers a seguir: primer F 5'-GCGCGGCCGCAGGGCCCGGAGCGGG-3' (SEQ ID N° 9) e primer R 5'-CGGAATTCTCAGCAATCGCCATCAGTGGTC-3' (SEQ ID N° 10).

HA-FV2E-UNC5H2-IC e c-myc-Fv2E-UNC5H2-IC em pC4M foramgerados por meio de amplificação por PCR do domínio intracelular de UNC5H2utilizando os primers a seguir: UNC5H2-HA F 5'-CGGTCGACGTGTACCGGAGAAACTGC-3' (SEQ ID NM1) e UNC5H2-HA R

5'-

GCGAATTCTCATGCATAATCCGGCACATCATACGGATAGCAATCGCCATCAGT

GGTC-3' (SEQ ID N° 12) e UNC5H2-myc F 5'-CGGTCGACGTGTACCGGAGAAACTGC-3' (SEQ ID N° 13) e UNC5H2-myc R 5'-

GCGAATTCTCACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGCAATCGCCATCAGTGGTC-3' (SEQ ID N0 14), respectivamente. Os fragmentos de PCR foramclonados em HA-Fv2E por meio de digestão de restrição de Sall e EcoRI.

O cDNA que codifica as proteínas de fusão HA-Fv2E-UNC5H2-ICe c-myc-Fv2E-UNC5H2-IC foi subclonado em seguida em pcDNA3.1-T0P0 pormeio de PCR utilizando os primers a seguir: Fv2E F 5'-CCACCATGGGGAGTAGCA-3' (SEQ ID N° 15) e UNC5H2-HA R 5'-

TCATGCATAATCCGGCACATCATACGGATAGCAATCGCCATCAGTGGTC-3'

(SEQ ID N0 16) e Fv2E F 5'-CCACCATGGGGAGTAGCA-3' (SEQ ID N° 15) eUNC5H2-myc n

TCACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGCAATCGCCATCAGTGGT

C-3' (SEQ ID N0 17), respectivamente, e HA-Fv2E-UNC5H2-IC e c-myc-Fv2E-

UNC5H2-IC em pC4M como modelos correspondentes.

Ps974-DCC-5Fbn que permite a expressão bacteriana do quintodomínio de f.bronectina tipo Ill de DCC foi obtido por meio da inserção de umfragmento de DNA de Pstl/BamHI gerado por meio de PCR utilizando pDCC-CMV-S como modelo.

Produção DE DCC-5FBN

A produção de DCC-SFbn foi realizada utilizando umprocedimento padrão. Resumidamente, células BL21 foram forçadas aexpressar DCC-5Fbn em resposta a imidazol e o Iisato de BL21 foi submetido acromatografia de afinidade utilizando Marca-agarose (Sigma).

IMIINOPRECIPITAÇÃO

Foram conduzidas coimunoprecipitações sobre células HEK293Ttransfectadas com várias construções marcadas conforme descritoanteriormente 27. Resumidamente, células HEK293T foram Iisadas em 50 mMde HEPES1 pH 7,6, 125 mM de NaCI, 5 mM de EDTA e 0,1% NP-40 napresença de inibidor de protease e incubadas adicionalmente com anti-HA(Sigma), anticorpo anti-c-myc (Sigma), anti-Marca M2 (Sigma) e proteína ASepharose (Sigma). Lavagens foram realizadas em 50 mM de HEPES, pH 7,6,125 mM de NaCI, 5 mM de EDTA.

Teste de união ε teste de competição ELISA

DCC-5Fbn (100 ng) ou IL3-R (R&D Systems, 600 ng) foramrevestidos sobre placa Maxisorp (Nunc) e foram adicionadas doses crescentesde netrina-1 (Apotech) (0 a 800 ng) para teste de união.

DCC-EC (R&D Systems, 125 ng) foi revestido sobre placa

Maxisorp para teste de competição ELISA. Netrina-1-Marca M2 (50 ng) ecompetitor DCC-EC (125 ng) ou DCC-5Fbn (625 ng) foram adicionados emseguida simultaneamente. Após as lavagens, para o teste de união ou teste decompetição ELISA, netrina-1-Marca M2 residual ainda fixo foi revelado com umanticorpo anti-Marca M2.

Tfstes ELISA PCC/netrina-1

DCC-EC-Fc (1,25 ng/ml) ou UNC5H2-EC-Fc (0,5 ng/ml) foiadsorvido sobre placas maxisorp de 96 cavidades (Nunc) de acordo cominstruções do fabricante. Netrina-1 marcada com Marca (0,5 ng/ml) foi adicionadaem seguida junto com concentrações crescentes de DCC-EC-Fc. Após incubaçãopor uma hora, as placas foram extensamente lavadas e netrina-1 unida foidetectada por meio de imunomarcação utilizando um anticorpo anti-marca M2(Sigma) e anti-camundongo de cabra HRP (Jackson). Medição colorimétrica foirealizada sobre a estação Victor multimarcas (Wallac).

Testes de morte celular

67NR, 4T1, CAL51, T47D e SKBR7 foram cultivados em meiopobre em soro e foram tratados (ou não) com DCC-EC-Fc ou DCC-5Fbn por 24horas. A morte celular foi analisada utilizando procedimentos de mancha deazul tripano conforme descrito anteriormente 6. A extensão da morte celular éapresentada como o percentual de células positivas para azul de tripano nasdiferentes populações celulares. Para selecionar células transfectadas, ascélulas foram cotransfectadas com o marcador de superfície pKk e o plasmídeoque codifica genes de interesse. As células transfectadas que expressam omarcador foram marcadas magneticamente com Microesferas MACSeIect eseparadas utilizando Separador de MACS e Colunas de Separação (MiltenyiBiotec). A exclusão de azul de tripano foi testada sobre essas célulaspurificadas. A sobrevivência celular também foi medida por meio de teste MTTutilizando kit de teste MTT Vybrant (Molecular Probes) de acordo com osprocedimentos do fabricante.

Medição da atividade de caspase

A atividade de caspase relativa foi determinada por meio deanálise citométrica de fluxo conforme segue: 2 χ 105 células tratadas foramcolhidas, lavadas uma vez em 1 ml de PBS e novamente suspensas em 200 μΙde solução de manchas contendo FITC-VAD-fmk (CaspACE, Promega). Apósincubação por sessenta minutos a 37 0C1 as células foram lavadas em 1 ml dePBS e novamente suspensas em 200 μΙ de PBS para análise por citometria defluxo. Células manchadas foram contadas utilizando software de análiseCeIIQuest e FACS Calibur (Becton Dickinson) com excitação e configuraçõesde emissão de 488 nm e 525-550 nm (filtro FL1), respectivamente. A atividadede caspase-3 foi medida utilizando o teste Caspase-3 da BioVision. A atividadede caspase é apresentada como a razão entre a atividade de caspase daamostra e aquela medida em células HEK293T transfectadas com pCMV. Paraanálise da morte celular e medição da atividade de caspase, AP20187 e/ounetrina-1 e/ou DCC-5Fbn foram adicionados em meio de cultivo celular vintehoras e uma hora antes de recolher as células.

RT-PCR quantitativa

Para testar a expressão de netrina-1 em tumores de mamahumanos, RNA total foi extraído de biópsias de pacientes que passam porcirurgia de câncer de mama utilizando kit Nucleospin RNAII (Macherey-NageI)e 1 μ9 sofreu transcrição reversa utilizando o kit de Síntese de cDNA iScript(BioRad). RT-PCR quantitativo em tempo real foi realizado sobre um aparelhoLightCycler 2.0 (Roche) utilizando o kit Light Cyeler FastStart DNA MasterSYBERGreen I (Roche). As condições de reação para toda a amplificaçãoideal, bem como seleção de primers de netrina-1, foram determinadasconforme já descrito 18. Os genes PBGD1 TBP humanos e RPLPO decamundongo onipresentemente expressos que exibem a menor variabi.idadede expressão entre tecidos de tumores de mama e normais 25' 28 foramutilizados como controles internos. Foram utilizados os primers a seguir:PBGD:

FOR: 5'-CTGGAGTTCAGGAGTATTCGGGG-3' (SEQ ID N0

18);N0 19);

21);

22);

23);

REV: 5--CAGATCCAAGATGTCCTGGTCCTT-3· (SEQ ID

TBP:

FOR: 5'-CACGAACCACGGCACTGATT-3' (SEQ ID N° 20);REV: 5'-TTTTCTTGCTGCCAGTCTGGAC-3' (SEQ ID N0

Netrina-1 humana - NTN1:

FOR: 5'-TGCAAGAAGGACTATGCCGTC-3' (SEQ ID N0

REV: 5'-GCTCGTGCCCTGCTTATACAC-3' (SEQ ID N0

UNC5B:

FOR: 5'-TGCAGGAGAACCTCATGGTC-3' (SEQ ID N0 24);REV: 5'-GGGCTGGAGGATTACTGGTG-3' (SEQ ID N0 25);

DCC:

FOR: 5'-AGCCAATGGGAAAATTACTGCTTAC-3' (SEQ IDN0 26);

REV: 5'-AGGTTGAGATCCATGATTTGATGAG-3' (SEQ ID

N0 27);

UNC5C:

FOR: 5'-GCAAATTGCTGGCTAAATATCAGGAA-3' (SEQ

ID N0 28);

REV: 5'-GCTCCACTGTGTTCAGGCTAAATCTT-3· (SEQ

ID N0 29).

CAMUNDONGOS, INJECOES INTRAVENOSAS E NAS GLANDULAS MAMARIAS, MEDICAODO DESENVOLVIMENTO DE METASTASE

Modelo de camundongos singênicos: fêmeas de camundongosBALB/cByJ com oito a onze semanas de idade do Jackson Laboratoni foramutilizadas para cirurgia. Para injeção em glândulas mamárias de células 67NR,camundongos foram anestesiados com 2,2,2-tribromoetanol. 10= células em 50μl de PBS foram injetadas na glândula mamaria e camundongos foramsacrificados quando o tumor excedeu 1,5 cm e causou impedimento domovimento do animal. Para injeção intravenosa, 10= células 4T1-luc de tumoresem 150 μl de PBS foram injetadas em uma veia da cauda e os camundongosforam sacrificados no dia 13-15 (apôs a injeção de células 4T1) ou no dia 20-23(após a injeção de células 67NR), ou analisados utilizando registro deuminescência. Quando os animais foram sacrificados, os pulmões foramremovidos, pesados, comparados com o peso total do animal e os nàdulosmetastáticos foram contados.

XENOENXERTO FM CAMUNDONGOS BRUTOS

Fêmeas de camundongos nu/nu atimicos com cinco semanas deidade (peso do corpo de 20 a 22 g) foram obtidas por meio da Charles River.Os camundongos foram abrigados em gaiolas com filtro no topo esterilizadas emantidas em instalação de animais livre de patógenos. Linhagens de células decâncer de mama humano (SKBR7, T47D e H358) foram implantadas por meiode injeção subcutânea de 5 χ 106 células em 200 μΙ de PBS no flanco esquerdodos camundongos. Quando tumores foram estabelecidos (cinco semanas paraT47D, duas semanas para SKBR7 e cinco dias para H358), PBS ou 20 μ9 deDCC-SFbn foram administrados ao tumor (it) todos os dias durante quatorzedias. Os tamanhos de tumores foram medidos por um calibrador. O volume detumor foi calculado com a fórmula ν = 0,5 * (comprimento * largura2).

Amai ise de tumor

Seções de pulmão com 4 μπι de espessura foram preparadas emanchadas com hematoxilina-eosina-safron. A classificação histológica egraduação de lesões neoplásticas foi realizada de forma cega e de acordo comprocedimentos padrão. Para formação de imagens in vivo de metástaseutilizando células 4T1-luc, a luz resultante da oxidação bioluminescente daIuciferina livre de endotoxina injetada por via intraperitoneal (Promega) (120mg/kg de peso do corpo) foi detectada e quantificada (dez minutos após ainjeção) com sistema NightOWL LB 981 NC 100 da Berthold Technologies,utilizando sistema de anestesia com isoflurano gasoso da TEM SEGA.

Exemplo 2

NETRINA-1 DITA METASTASE DE TUMORE de Mama Inibindo a Apoptose

Analisamos em primeiro lugar netrina-1 e os seus receptores dedependência, ou seja, expressão de DCC e UNC5H por Q-RT-PCR em umquadro de trinta tumores primários de mama, quinze dos quais nãoapresentaram evolução metastática conhecida e quinze deles forammetastáticos no diagnóstico. Embora DCC fosse pouco detectável e UNC5Htenha deixado de exibir alterações significativas entre os dois tipos de tumores,netrina-1 aparentemente é significativamente mais expressa em tumores demama metastáticos que em tumores de mama não metastáticos (Figura 1 A).

60% dos tumores de mama metastáticos testados exibiramsobreexpressâo de netrina-1 (faixa de 1,4 a 9,6 vezes, ρ < 0,015) (Tabela 1).

Tabela 1

PFRCENNTUAL DE AMnsTPAS QUE EX.BF™ FyprfmàO DE NFTRINA-1 SUPERIOR Àfyprfrsão Média ™ R1HP^AS NÃO MftastAticas ε Faixa hf Sobreexpressâo

<table>table see original document page 40</column></row><table>

Em camundongos, Miller e seus colegas desenvolveram ummodelo poderoso para estudar a biologia de tumores metastáticos contra nãometastáticos: de um único tumor mamário primário que ocorreu naturalmenteem um camundongo BALB/c, foi obtida uma série de linhagens celulares queexibiram diferentes potenciais metastáticos quando injetadas em camundongossingênicos. Particularmente, embora células 67NR formem tumores mamáriosprimários mas sem metástase, células 4Τ1 de tumores primários e metástase,especialmente no pulmão, na medula óssea e no fígado 20. De formainteressante, embora netrina-1 não tenha sido detectada em células 67NR,netrina-1 foi altamente expressa em células 4Τ1 (Figura 1B).

Para determinar se o potencial metastático de células 4Τ1, emcomparação com o de células 67NR, era relacionado à expressão de netrina-1,células 67NR foram forçadas a expressar de forma estável netrina-1. Imitaçõesde células 67NR transfectadas ou células 67NR-net que expressam netrina-1(Figuras 2A e 2B) foram injetadas em glândulas de mamíferos ou por viaintravenosa e a metástase foi monitorada quando injetada em almofadas degordura, o que sugere que a presença de netrina-1 em 67NR não é suficientepara permitir a formação de metástase de pulmão a partir do local primário.

Quando as células recebem injeção intravenosa, entretanto, foi detectadoaumento significativo de metástase nos pulmões no 67NR que expressanetrina-1 (Figura 2C).

Vide a Tabela 2 que exibe a quantidade de nódulos subplêuricos(metástase fora do pulmão) e nódulos intraparenquimatosos (metástase nopulmão).

Tabela 2

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Desta forma, a expressão de netrina-1 aparentemente é umevento fundamental que sustenta a formação de metástase, provavelmentefavorecendo células de tumores após a encravação.

Como netrina-1 aparentemente é suficiente para o potencialmetastático de células 67NR após a encravação e como se demonstrou quenetrina-1 inibe a morte celular induzida por receptores com dependência denetrina-1 6·7·18, investigamos em seguida se a produção autócrina de netrina-1fornece vantagem seletiva para células 4Τ1 por meio da inibição da mortecelular induzida por DCC/UNC5H nessas células. Um domínio loca.izado noterminal N de netrina-1 (o chamado domínio laminina-VI) interage comreceptores de DCC e UNC5H (Figura 3A; 21), de forma que um domínioextracelular solúvel de DCC (DCC-EC-Fc) pode inibir a interação deDCC/netrina-1 e UNC5H/netrina-1 (não exibido). DCC-EC-Fc foi adicionado emseguida a um cultivo de células 4Τ1 e a morte celular foi monitorada por meiode teste de exclusão de azul de tripano (Figura 3B) ou da medição da atividadede caspase (Figura 3C). Conforme exibido na Figura 3C, a adição da proteínaconcorrente no meio de cultivo aciona a morte de células 4T1 de formadependente de dosagem. Além disso, este efeito é específico, pois DCC-EC-Fcnão apresentou efeito sobre a morte de células 67NR e IL3R-EC-Fc (o domínioextracelular de receptor IL3) deixou de acionar a morte de células 4T1 (Figuras3B e 3C). Este efeito se deve à inibição de netrina-1, pois a adição dequantidade excessiva de netrina-1, junto com DCC-EC-Fc, inibiu a atividadepró-apoptótica de DCC-EC-Fc sobre células 4T1 (não exibido). Para restringir aconcorrência a um domínio menor, produzimos o quinto domínio de fibronectinatipo Ill de DCC1 que é conhecido por interagir com netrina-1 21. A adição destedomínio -DCC-5Fbn- apresentou atividade pró-apoptótica similar sobre células4T1 (Figura 3D). Desta forma, embora netrina-1 aparentemente confirapotencial metastático a células de tumores em camundongos, estas células detumores metastáticos que expressam netrina-1 podem ser encaixadas paraapoptose por meio de inibição da interação entre receptores e netrina-1.

Para analisar adicionalmente se isso permanece verdade emcélulas de tumor de mama humano, a expressão de netrina-1 foi analisada emum quadro de linhagens de células de câncer de mama metastático humano(vide a Tabela 3).

<table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table>

Conduzido em outra linhagem de células T47D.

A Tabela 3 exibe as diferentes linhagens de células de mamametastáticas humanas analisadas para a expressão de netrina-1 por Q-RTPCR como nas Figuras 1A e 1B e a sua sensibilidade a DCC-EC-Fc pormeio de medição da morte celular por meio de exclusão de azul tripano. Aquantidade relativa de expressão de netrina-1 e sensibilidade a DCC-EC-Fc são indicadas por (+), enquanto a ausência destes critérios é indicadapor (-). Em algumas linhagens celulares, o DCC-EC-Fc não foi determinado(ND).

Conforme o esperado, netrina-1 é expressa em grandequantidade de linhagens de células metastáticas e algumas delas sofremapoptose quando cultivadas na presença de DCC-EC-Fc. Células CAL51sofreram apoptose de forma dependente de dosagem, por exemplo, emresposta a DCC-Ec-Fc. Conforme o acima, a adição de netrina-1 em excessoreverte o efeito de DCC-EC-Fc, sustentando a opinião de que as proteínasconcorrentes matam estas linhagens de células humanas inibindo a interaçãoentre netrina-1 e receptores de netrina-1. Além disso, seleção clonal de célulasCAL51 permitiu o estabelecimento de uma linhagem de células CAL51-36, queé muito mais suscetível a morte celular em resposta a DCC-EC-Fc (Figura 4B).DCC-EC-Fc ou DCC-5Fbn podem conseqüentemente representar boasferramentas para acionar apoptose seletiva de células de tumores metastáticoshumanos.

Demonstramos aqui que a expressão de netrina-1 pode serconsiderada marcador da disseminação de tumores de mama. Mais da metadedos tumores de mama com propensão à metástase obteve elevada expressãode netrina-1. Tanto o modelo de camundongo descrito acima quanto os dadosobtidos sobre linhagens de célula de câncer de mama humano sustentam avisão de que este nível elevado de netrina-1 é uma vantagem seletiva obtidapela célula cancerosa para escapar de apoptose induzida por receptores comdependência de netrina-1 e, conseqüentemente, sobreviverindependentemente da disponibilidade de netrina-1. Do ponto de vistamecânico, esta expressão autócrina de netrina-1 inibe a morte celular induzidapor UNC5H. De fato, DCC era pouco detectável nos dois grupos (metastático enão metastático) de cânceres de mama estudados, de forma a sugerir queDCC é regulado para baixo cedo durante tumorigênese de mama ou é apenasfracamente expresso em tecido de mama. Além disso, a inibição de apoptoseinduzida por UNC5H por meio de coexpressão de forma mutante negativadominante da atividade pró-apoptótica de UNC5H inibe a morte de célulasCAL51 em resposta a DCC-EC-Fc (não exibido). Isso pode corresponder àobservação recente de que parte da atividade pró-apoptótica de UNC5H2passa através da ativação da serina/treonina DAPK 22, proteína envolvida naregulagem de metástase 23.

Estas observações não apenas fornecem evidência daimportância do par de receptores ligantes/de dependência na regulagem dodesenvolvimento de tumores, mas também esclarecem uma nova estratégiaterapêutica. De fato, atualmente, não há tratamento eficiente de pacientes comcâncer de mama metastático, falta de tratamento que leva à morte 400.000mulheres por ano em todo o mundo 24. Propomos no presente que umtratamento com base na inibição da interação entre netrina-1 e seus receptoresde dependência poderá afetar positivamente a metade dos pacientes quesofrem de câncer de mama metastático. Estes tratamentos poderão incluirdrogas químicas, anticorpos monoclonais ou a proteína DCC-5Fbnapresentada no presente. Permanece a ser demonstrado se isso deve serconsiderado estratégia para evitar a formação de metástase, o que gerariatratamento preventivo a longo prazo de mulheres diagnosticadas com câncerde mama primário, ou como estratégia que poderá ser utilizada para induzir aregressão de metástase. Testes clínicos futuros deverão também responderesta questão.

Descrevemos no presente que, ao contrário de tumores de mamanão metastáticos humanos, a maior parte dos cânceres de mama metastáticosexibe sobreexpressão de netrina-1. Em um modelo de camundongos,demonstramos que, em células de tumores mamários não metastáticos, aexpressão forçada de netrina-1 é associada à metástase nos pulmões. Alémdisso, camundongos ou linhagens de células de tumores metastáticoshumanos que se demonstrou expressarem altamente netrina-1 sofremapoptose quando a interação entre netrina-1 e receptores é inibida por umaproteina concorrente. Desta forma, netrina-1 é um marcador para câncermetastático humano tal como mama metastática e inibição da interação entrenetrina-1 e receptores representa uma abordagem terapêutico para induzir amorte de células metastáticas.

Exemplo 3

RESTAURACAO DO PROCESSO DE RECEPTORES DE DEPENDENCIA DE NETRINA-1ACIONA APOPTOSEEM TUMORES MAMA METASTATICOS

Netrina-1 e seus receptores de dependência, ou seja, expressãode DCC, UNC5H2 e UNC5H3, foram analisados por meio de Q-RT-PCR emum quadro de 51 tumores de mama. Ele inclui pacientes cujos tumores foramlocalizados para a mama (NO. 16 pacientes), apresentaram envolvimento denódulos (N+, 19 pacientes) ou possuíam doença metastática distante nomomento do diagnóstico <M+. 16 pacientes). Embora DCC fosse poucodetectável e a expressão de UNC5H deixasse de exibir alterações significativasentre os diferentes tipos de tumores (nâo exibidos), netrina-1 ésignificativamente mais expressa em tumores N+ que em tumores NO (média:1,8 contra 0,5, ρ = 0,007) com faixa de expressão de netrina-1 mais alta emtumores N+ (Figura 5 e Tabela 4).

Tabela 4

<formula>formula see original document page 46</formula>

31,5% dos tumores N+ exibem aumento de pelo menos cincovezes na expressão de netrina-1 enquanto nenhum aumento foi detectado emqualquer tumor NO testado (Figura 5 e Tabela 4). Diferença ainda mais notávelé observada ao comparar a expressão de netrina-1 em M+ com tumores NO(média· 7,8 contra 0,5, ρ < 0,0001). Ao longo desta linha, 62,5% de tumores M+exibem aumento de pelo menos cinco vezes da expressão de netrina-1.Diferença significativa da expressão de netrina-1 também existe entre tumoresN+ e M+ (média: 1,8 contra 7,8, ρ = 0,009). Além disso, a sobreexpressão denetrina-1 é mais alta em tumores M+ que em tumores N+, pois 37,5% detumores M+ exibem aumento de mais de quinze vezes no nível de netrina-1,enquanto esse aumento não é detectado em tumores N+ (Figura 5 e Tabela 4).Desta forma, a regulagem para cima de netrina-1 é um marcador doenvolvimento nodal e da doença metastática distante em câncer de mamahumano.

Em camundongos, Miller e seus colegas desenvolveram modelopoderoso para estudar a biologia de tumores metastáticos contra nãometastáticos: a partir de um único tumor mamário primário que ocorreunaturalmente em um camundongo BALB/c, foi obtida uma série de linhagenscelulares que exibiram diferentes potenciais metastáticos quando injetadas emcamundongos singênicos. Particularmente, enquanto células 67NR formamtumores mamários primários, mas sem metástase, células 4T1 formam tumoresprimários e metástase, especialmente no pulmão, no fígado e na medula ósseaDe forma interessante, enquanto netrina-1 deixava de ser detectada emcélulas 67NR, netrina-1 era altamente expressa em células 4T1 (Figura 1B).

Para determinar em primeiro lugar se o potencial metastático decélulas 4T1, em comparação com o de células 67NR, era relacionado àexpressão de netrina-1, células 67NR foram forçadas a expressar netrina-1 deforma estável. Imitações de células 67NR transfectadas ou células 67NR queexpressam netrina-1 (Figuras 2A e 2B) foram injetadas em glândulas mamáriase a metástase foi monitorada por meio de exame anatômico-patológico. Asduas linhagens celulares deixaram de formar eficientemente metástase nofígado ou em pulmões quando injetadas em almofadas de gordura decamundongos (19 camundongos receberam injeção de células 67NR queexpressam netrina-1 e apenas duas suspeitas de micrometástases, uma nopulmão e outra no fígado, foram detectadas) (Tabela 5).

Tabela 5

METASTASE DO PULMAO E DO FIGADO 67NR INJETADO EM ALMOFADA DEGORDURA CONTRA CELULAS QUE EXPRESSAM NETRINA-1

Um clone de célula controle que possui resistência a puromicina(imitação de 67NR), um clone de célula que expressa netrina-1 (67NRnet1) e umapopulação policlonal de 67NR transfectada de forma estável de netrina-1 (67NR-netl-policlonal) foram injetados em almofada de gordura de camundongos e ametástase foi analisada no ambiente do pulmão ou do fígado.

<formula>formula see original document page 48</formula>

Desta forma, a expressão de netrina-1 em células tumorosasnão é suficiente para permitir a formação de metástase a partir do localprimário.

Como se demonstrou que netrina-1 inibe a morte celular induzidapor receptores com dependência de netrina-1 6·7·18, investigamos a seguir se aprodução autócrina de netrina-1 detectada em células 4T1 metastáticas conferevantagem seletiva para estas células, por meio da inibição da morte celularinduzida por DCC/UNC5H. Para testar isso, observamos um composto quepode titular netrina-1. Relatou-se que um domínio localizado no terminal N denetrina-1 (o chamado domínio de iaminina-VI) interage com os receptores deDCC e UNC5H (Figura 3A; 21). Demonstramos que um domínio extracelularsolúvel de DCC (DCC-EC-Fc) pode inibir a interação de DCC/netrina-1 eUNC5H2/netrina-1, conforme medido por meio de teste ELISA (Figura 6A).DCC-EC-Fc foi adicionado em seguida a um cultivo de células 4T1 e a mortecelular foi monitorada, seja por meio de teste de exclusão de azul de tripano(Figuras 3B e 6B) ou medindo-se a atividade de caspase por meio de citometriade fluxo (Figuras 3C e 6C). Conforme exibido nas Figuras 3B, 3C, 6B e 6C, aadição da proteína concorrente no meio de cultivo aciona a morte de células4T1 de forma dependente da dose. Este efeito é específico, pois DCC-EC-Fcnão apresentou efeito sobre a morte de células 67NR (Figuras 3B, 3C, 6B e6C) e ILSR-EC-Fc (o domínio extracelular do receptor IL3) deixou de acionar amorte de células 4T1 (Figura 3D). Desta forma, as células 4T1 sobrevivem pormeio da produção autócrina de netrina-1, que bloqueia a morte celular induzidapor receptores de netrina-1.

Como o domínio extracelular completo de DCC aparece cominteresse apenas modesto para uso in vivo e em terapia (DCC-EC-Fc possuitamanho de cerca de 1100 aminoácidos), procuramos um polipeptídeoalternativo a partir do domínio extracelular de DCC, que pudesse acionar aapoptose em células 4T1. Conseqüentemente, produzimos o quinto domíniotipo Ill de fibronectina de DCC, DCC-SFbn, que é conhecido por interagir comnetrina-1 21 (Figura 3A). De forma interessante, essa proteína com cemaminoácidos não interfere com a união de DCC/netrina-1 ou UNC5H/netrina-1,mas afeta a capacidade de netrina-1 de acionar a multimerização dessesreceptores (vide Exemplo 4). Como a multimerização de DCC e UNC5H érequisito prévio para a atividade inibidora de netrina-1 sobre a morte celularinduzida por DCC/UNC5H, a adição de DCC-SFbn aciona a apoptose emcélulas que expressam DCC cultivadas na presença de netrina-1 22 e aciona amorte dos dois 4T1 (Figura 7A).investigamos a seguir se o efeito de morte celular observado invltro pode ser estendido in vivo. Para fazê-lo, células 4T1 foram transfectadasde forma estável com vetor com base em luciferase e células 4T1-luc foraminjetadas por via intravenosa (iv) em camundongos BALB/c singênicos. Oscamundongos receberam em seguida injeção intraperiloneal (ip) e intravenosa(uma injeção a cada dois dias, uma intravenosa e uma intraperitoneal) do dia 0ao dia 13 com tampão PBS ou DCC-SFbn marcado com Flag (1,25 ug/g decamundongo/injeção). A formação de metas,ase foi analisada em segu,dautilizando registro de luminescência. Conforme exibido nas Figuras 7B e 7C,quando injetado por via intravenosa, células 4T1-luc colonizam pulmõeseficientemente. Por outro lado, camundongos tratados com DCC-5Fbn exibemredução dramática da metástase de pulmão (Figuras 7B e 7C). Esta inibição daformação de metástase foi confirmada em seguida por meio de exameanatômico-patológico de pulmões (não exibido, vide Tabela 6).

Tabela 6

INDIVIDUAIS CONTADOS SOB INSTRUMENTO DE DISSECACAO NAS DUAS POPULACOESTATRADAS (+PBS, +DCC-5FBN)

<table>table see original document page 50</column></row><table>

Foram obtidos resultados similares ao realizarmos diariamenteinjeção intraperitoneal de DCC-SFbn marcado com GST no lugar de DCC-SFbnmarcado com Flag e GST-FADD em vez de PBS (não exibido). Desta forma,em camundongos, a inibição por DCC-SFbn da atividade prô-sobrevivénciaconferida pela expressão autécrina de netrina-1 é associada à prevenção demetástase.A vantagem de sobrevivência obtida por meio da expressãoautócrina de netrina-1 não é restrita a células de tumores murinas, como édetectado em linhagens de células de câncer de mama humano. Na verdade,demonstrou-se que netrina-1 é expressa em fração dimensionàvel de linhagensde câncer de mama humano (Figura 8A) e a adição de DCC-EC-Fc ou DCC-SFbn a cultivos de células T47D ou SKBR7 de adenocarcinoma de mamahumana que expressam netrina-1 naturalmente aciona a indução da mortecelular medida por meio de teste de atividade de oaspase-3 ou teste MTT(Figura 8B e hão exibido). Este efeito deve-se à inibição de netrina-1, comoadição de quantidade em excesso de netrina-1, que inibiu a atividade pro-apoptótica de DCC-EC-Fc/DCC-5Fbn (nâo exibida). Para monitorar o efe,toantitumoroso de DCC-SFbn, xenoenxertos de células T47D foram implantadosem camundongos brutos. Quando os tumores atingiram tamanho palpável, oscamundongos foram tratados diariamente com PBS ou DCC-SFbn e o volumede tumor foi determinado por dezoito dias. De forma similar aos dados obt,dosno modelo singênico acima, DCC-SFbn inibe completamente o crescimento detumores (Tabela 7).

Tabela 7

NUMERO E COMPORTAMENTO DE TUMORES T47D XENOENXERTADOS QUE FORAMTRADADOS COM PBS OU DCC-5FBN

São indicados o nümero de tumores que cresceu de tamanho emmais de 40% e o número de tumores que apresentaram tamanho reduzido(mais de 30%).

<formula>formula see original document page 51</formula>

Demonstramos no presente que a expressão de netrina-1 podeser considerada um marcador da capacidade de disseminação de tumores demama. A maior parte dos tumores de mama com propensão à metástasedemonstrou elevada expressão de netrina-1. Os dados obtidos em linhagensde células de câncer de mama de camundongos/humano e os modelos decamundongos de xenoenxerto humano/singênico descritos acima sustentam aobservação de que este nível elevado de netrina-1 é uma vantagem seletivaobtida pela célula de câncer para escapar da apoptose induzida por receptorescom dependência de netrina-1 e, conseqüentemente, sobreviverindependentemente da disponibilidade de netrina-1. Do ponto de vistamecânico, na patologia humana, esta expressão autócrina de netrina-1provavelmente inibe a morte celular induzida por UNC5H. De fato, DCC erapouco detectável nos diferentes grupos (NO, N+, M+) de cânceres de mamaestudados, de forma a sugerir que DCC é regulado para baixo cedo durantetumorigênese de mama ou somente é expresso fracamente em tecido demama. Além disso, a inibição de apoptose induzida por UNC5H por meio decoexpressão de uma forma mutante negativa dominante da atividade pró-apoptótica de UNC5H inibe a morte de células de câncer de mama humano emresposta a DCC-EC-Fc (não exibido).

Desta forma, conforme previsto pelo modelo de receptor dedependência, demonstramos agora que uma célula de tumor pode escapar dadependência de receptor de dependência em pelo menos três maneiras.Primeiro, a expressão do receptor de dependência pode ser regulada parabaixo, conforme descrito extensamente para DCC e, mais recentemente, paraUNC5H 15'17'19' 29· Segundo, a sinalização de morte abaixo no fluxo pode serdesligada. Ao longo desta linha, demonstramos recentemente que a atividadepró-apoptótica de UNC5H2 depende da união de UNC5H2 à serina/treoninaDAPK 22, uma proteína que se demonstrou estar envolvida na regulagem demetástase e regulada para baixo em malignidade humana 23. De forma similar,um relatório recente de Stupack e colegas demonstra que, no caso de algumasintegrinas que agem como receptores de dependência, caspase-8, que acionaa morte celular mediada por estas integrinas, é fundamental para a metástasede neuroblastoma 30 Demonstramos no presente que terceira vantagemseletiva para a célula de tumor é a autoprodução do Iigante de dependência.Permanece uma questão intrigante sobre como tumores de mama compropensão metastática parecem ter autoprodução de netrina-1preferencialmente selecionada em vez de perda do receptor, enquanto tumorescolo-retais possuem principalmente perda selecionada dos receptores em vezde ganho da expressão de netrina-1; de fato, apenas 7% de cânceres colo-retais exibem aumento da expressão de netrina-1 Uma possível explicaçãoé que a expressão de netrina-1 não apenas confere um ganho desobrevivência para as células migratórias, mas também possivelmente umganho na sinalização positiva/não apoptótica de receptores de netrina-1. Aolongo desta linha, é importante observar que netrina-1 foi originalmente descritacomo guia de orientaçãoque, muito embora absolutamente não comprovada,poderia desempenhar papel no tropismo de células metastáticas. Outros papéispropostos de netrina-1 incluem regulagem da morfogênese e adesão ^34. doismecanismos que podem ser importantes para o desenvolvimento demetástase. De forma similar, propôs-se recentemente que netnna-1desempenha papel durante a angiogênese embriônica e, muito embora tenhamsido publicados resultados conflitantes não podemos atualmente descartaro papel de netrina-1 como fator angiogênico que, de alguma forma, poderáfavorecer o desenvolvimento de metástase no local secundário. Entretanto, oganho de sinalização "positiva" por meio de expressão autócrina de netrina-1provavelmente não é intrinsecamente suficiente para promover a metástase,como expressão forçada de netrina-1 em células não metastáticas quedeixaram de ser associadas à formação de metástase.Estas observações não apenas fornecem evidência para aimportância de pares de Iigante e receptores de dependência na regulagem dodesenvolvimento de tumores, mas também ilustram uma nova estrateg,aterapêutica. De fato, atualmente, não há tratamento eficiente para pac,entescom câncer de mama metastático, falta de tratamento que leva à morte400 000 mulheres por ano em todo o mundo Propomos no presente quetratamento com base na inibiçâo da interação entre netrina-1 e os seusreceptores de dependência poderá afetar positivamente uma parcela grandedos pacientes que sofrem de câncer metastático, tal como câncer de mama (ouseja pacientes que exibiriam alta expressão de netrina-1 em tumoresprimários). Estes tratamentos poderão incluir drogas químicas, ant,corposmonoclonais ou a proteína DCC-SFbn apresentada no presente.

Exemplo 4

EXPRESSAO DE NETRINA-1 E INIBICAO DA ATIVIDADE DE NETRINA-1 EM OUTRASTUMORES HUMANOS

a. Netrina-1 é um marcador da agressividade emneuroblastoma humano (vide a Figura 9A, sua legenda e a Tabela 8) e ainibiçâo da atividade de netrina-1 promove a morte de células deneuroblastoma (vide a Figura 10B e a sua legenda).

Tabela 8

26 linhagens de células de neuroblastoma (seja obtidasdiretamente a partir de tumores de pacientes no Centre Uéon Bérard (CLB-X) ou linhagens de células de neuroblastoma clássicas (IMR32, SHEP,SHSY ou SKNAS)) foram testadas como em (a) para determinar aexpressão de netrina-1 por meio de Q-RT-PCR. O nível de netrina-1 éindicado como (-) sem netrina-1, <+, ++, +++ > nlvl de netrina-1 baixo aa,to. Pode-se observar que uma fração significativa de linhagens celularespossui alta expressão de netrina-1.<table>table see original document page 55</column></row><table>

Netrina-1 é sobreexpressa em uma fração grande deglioma (vide Figura 10A e sua legenda) e a inibição da atividade de netrina-1promove a morte de células de glioma (vide a Figura 10B e sua legenda).

c. Netrina-1 é sobreexpressa em câncer pulmonar humano(vide a Figura 11A1 sua legenda e a Tabela 9) e a inibição da atividade denetrina-1 promove a morte de células de câncer do pulmão e evita odesenvolvimento de câncer do pulmão (vide as Figuras 12C e 12D e suaslegendas).

Tabela 9

Linhagens de células de câncer do pulmão derivadas de câncerdo pulmão de células pequenas (SCLC) ou câncer do pulmão não de célulaspequenas (NSCLC) foram testadas como em (a) para determinar a expressãode netrina-1 por meio de Q-RT-PCR. O nível de netrina-1 é indicado como (-)sem netrina, (+, ++) baixo a alto nível de netrina-1. Pode-se observar que umafração significativa de Iinahgens celulares possui alta expressão de netrina-1.

<table>table see original document page 56</column></row><table>

d. Expressão de netrina-1 em outros tumores humanos.

A expressão de netrina-1 examinada por meio de Q-RT PCRutilizando RNA total extraído de diferentes tumores humanos como nas Figuras10Α a 10B, 11A a 11C, 12A e 12B. A Tabela 10 indica (η) o número de tumorestestados e o percentual de tumores que exibem sobreexpressão de netrina-1em cada patologia.

TabelA IO

<table>table see original document page 57</column></row><table>

* 100% das sete amostras metastáticas.

Exemplo 5

Para analisar se DCC estava sob sua forma monomérica a menosque netrina-1 estivesse presente, coexpressamos transitoriamente um DCC decomprimento total marcado com HA junto com DCC de comprimento totalmarcado com c-myc em células HEK293T. Imunoprecipitação foi realizada emseguida utilizando um anticorpo anti-c-myc e, conforme exibido na Figura 12A,apesar de boa expressão de HA e DCC marcado com c-myc, HA-DCC foiapenas modestamente incluído na retirada de c-myc-DCC na ausência deligante, o que sugere que DCC estava principalmente presente na forma demonômero quando expresso em HEK293T na ausência de netrina-1. Nasmesmas condições experimentais, quando netrina-1 foi adicionada ao meio decultivo (não exibido e Figura 15C) ou quando uma construção de expressão denetrina-1 foi coexpressa com as construções que expressam DCC (Figura11 Α), HA-DCC foi claramente incluído na retirada de c-myc DCC1 de forma ademonstrar que netrina-1 aciona a dimerização ou multimehzação de DCC.Este resultado encontra-se de acordo com dados de Tessier-Lavigne e colegasque relataram pela primeira vez multimehzação induzida por netrina-1 46, muitoembora na nossa cultura e condições de imunoprecipitação, DCC exibe umnível modesto mas detectável de multimehzação na ausência de netrina-1.

Este baixo nível de multimehzação constitutivo poderá ser atribuído à baixaafinidade de receptores DCC por si próprios na ausência de Iigante ou para osistema utilizado, que é baseado na expressão forçada de altos níveis dereceptores transmembrana.

Investigamos em seguida se os outros receptores de netrina-1

UNC5H compartilham comportamento similar. Células HEK293T foramtransfectadas transitoriamente com um UNC5H2 de comprimento total marcadocom HA junto com UNC5H2 de comprimento total marcado com Flag napresença ou ausência de netrina-1. Imunoprecipitação foi realizada em seguidautilizando um anticorpo anti-Flag M2. Conforme exibido na Figura 11B1 apresença de netrina-1 aciona imunoprecipitação eficiente de HA-UNC5H2 comFlag-UNC5H2. Desta forma, embora na ausência de netrina-1, DCC e UNC5H2encontrem-se principalmente em formas monoméricas, DCC e UNC5H2exibem maior propensão à multimehzação na presença de netrina-1.

Para determinar se a multimehzação induzida por netrina-1 é aetapa crucial de inibição da morte de células pró-apoptóticas DCC/UNC5H2,desenvolvemos um sistema quimérico no qual a dimerização de proteína podeser induzida por um agente químico. Este sistema foi utilizado com sucessopara exibir o papel de dimerização de caspase-8 em ativação de caspase-8 ea importância de multimehzação de P75ntr em atividade pró-apoptótica dep75ntr 48. Este sistema é derivado da capacidade do composto Fk1012 dedimerização cruzada do motivo de FkBP. Domínios intracelulares de DCC eUNC5H2 foram fundidos no seu terminal N para motivos Fv2e FkBP derivadose a dimerização foi induzida utilizando o composto químico AP20187 (Figura13A). Analisamos em primeiro lugar se o sistema desenvolvido recapitulamultimerização induzida por netrina-1 do domínio intracelular UNC5H2. CélulasHEK293T foram cotransfectadas com Fv2e-UNC5H2-IC marcada com HAjuntocom Fv2e-UNC5H2-IC marcada com c-myc e coimunoprecipitações foramrealizadas utilizando um anticorpo anti-c-myc. Conforme exibido na Figura 13B,sem adição de AP20187, HA-Fv2e-UNC5H2-IC foi pouco detectável na retiradade c-myc-Fv2e-UNC5H2-iC, de forma a sustentar que Fv2e-UNC5H2-IC éexpresso em células HEK293T principalmente como monômero. Conformeesperado, a adição de AP20187 gerou a retirada eficiente de HA-Fv2e-UNC5H2-IC com c-myc-Fv2e-UNC5H2-IC. Resultados similares foram obtidoscom Fv2e-DCC-IC (não exibido). Desta forma, este sistema de dimerizaçãorecapitula a dimerização do domínio intracelular dos receptores de netrina-1DCC e UNC5H2.

Como este sistema de dimerização de DCC/UNC5H2quimicamente indutível aparentemente trabalha adequadamente para imitar amultimerização de DCC/UNC5H2 induzida por netrina-1, determinamos emseguida se a dimerização de DCC/UNC5H2 era suficiente para inibir aatividade pró-apoptótica de DCC/UNC5H2. Células HEK293T foram forçadas aexpressar Fv2e-DCC-«C na presença ou ausência de AP20187 e a mortecelular foi determinada por manchas de azul de tripano, conforme descritoanteriormente, para medir a morte celular induzida por DCC 6· 27. Conformeexibido na Figura 14A, a expressão de Fv2e-DCC-IC foi associada a maiormorte celular em comparação com a expressão dos motivos Fv2e sem a fusãode DCC-IC. De forma interessante, ao adicionar-se AP20187, a morte celularinduzida por Fv2e-DCC-IC foi dramaticamente reduzida (Figura 14A). De formasimilar, embora Fv2e-UNC5H2-IC acione a morte celular (Figura 14B) ouativação de caspase (Figura 14C) quando expresso em HEK293T na ausênciade AP20187, a adição da droga de dimerização é suficiente para reduzirsignificativamente a morte celular induzida por Fv2e-UNC5H2-IC (Figura 14B)ou ativação de caspase (Figura 14C). Desta forma, embora DCC-IC eUNC5H2-IC monoméricos sejam pró-apoptóticos, as formas multiméricas deDCC-IC ou UNC5H2-IC não exibem mais atividade pró-apoptótica. Acapacidade de netrina-1 de inibir a atividade pró-apoptótica de DCC/UNC5H2,portanto, está intrinsecamente ligada à capacidade de netrina-1 de multimerizarDCC ou UNC5H2, pois este processo de multimerização é suficiente paradesligar a atividade pró-apoptótica de DCC e UNC5H2.

Um modelo tentador seria aquele em que a forma monomérica deDCC ou UNC5H2 possui conformação espacial que é facilmente submetida àdivisão de caspase inicial do domínio intracelular do receptor. Por outro lado, apresença do Iigante geraria multimerização do domínio intracelular, que àsvezes torna-se menos acessível à divisão de caspase. Ao longo desta linha,Arakawa e colegas demonstraram que a divisão de caspase de UNC5H2 éinibida pela presença de netrina-1 47. Ainda assim, devido a limitações técnicas,deixamos de detectar a divisão de DCC ou UNC5H2 em células forçadas aexpressar as proteínas de fusão Fv2e. Um modelo alternativo de inibição dadivisão seria aquele em que a multimerização de receptor induzida por netrina-1 aciona um sinal de sobrevivência, que de alguma forma inibe atividade pró-apoptótica constitutiva de DCC ou UNC5H2 relativa à divisão de caspaseconstitutiva. Deixamos de exibir, entretanto, que os processos de sinalizaçãopositiva conhecidos ativados por meio de DCC mediante união de netrina-1estão envolvidos na atividade inibidora de netrina-1 sobre a atividade pró-apoptótica de DCC. Netrina-1 induz, por exemplo, a ativação mediada por DCCde ERK-1/2 3, quinases conhecidas por exibirem efeito anti-apoptótico.

Inibidores clássicos do processo de ERK-1/2, entretanto, embora afetem afosforilação de ERK-1/2 induzida por netrina-1, deixaram de bloquear o efeitoinibidor de netrina-1 sobre a atividade pró-apoptótica de DCC (Forcet e Mehlen1não publicado). Desta forma, é provável que a multimerização de DCC induzidapor netrina-1 afete a acessibilidade intracelular de DCC. Segue por serdemonstrado, entretanto, se esta é uma questão de estequiometria simples, ouse trazer mais perto os domínios extracelulares induz alteração deconformação dentro dos compartimentos intracelulares.

Caso os mecanismos subjacentes à multimerização do receptorinduzida por netrina-1 ainda estejam por ser descritos, a observação de que amultimerização de DCC/UNC5H2 induzida por netrina-1 é suficiente para inibira morte celular induzida por DCC/UNC5H2 pode representar uma ferramentainteressante para ligar a atividade pró-apoptótica de DCC ou UNC5H in vivo,em tumores nos quais netrina-1 é expressa de forma autócrina. Na verdade,demonstramos que a sobreexpressão de netrina-1 em intestino decamundongos está associada ao desenvolvimento de tumor intestinal devido àinibição da apoptose 18 e observamos recentemente que netrina-1 ésobreexpressa na maior parte dos cânceres de mama metastáticos humanos.

Além disso, o mecanismo de sobreexpressão de netrina-1 aparentemente é umavantagem seletiva de células de tumores metastáticos para sobrevivência emconfigurações de ausência de netrina-1 no ambiente (vide Exemplos 2 e 3). Destaforma, a inibição da dimerização de DCC/UNC5H supostamente representaria umaforma interessante de acionar a apoptose de células tumorosas.

Ao longo desta linha, demonstrou-se que o quinto domínio defibronectina de DCC é um domínio de interação com netrina-1 (Figura 15A e21), muito embora tenham também sido relatados dados conflitantes 43.Determinamos em primeiro lugar, portanto, se quinto domínio de fibronectinasolúvel recombinante de DCC (DCC-5Fbn) poderia unir-se a netrina-1recombinante. Teste ELISA demonstra que DCC-5Fbn une-se especificamentea netrina-1, e não ao domínio extracelular de um receptor não relacionado, IL3-R (Figura 15A). O Kd aproximado para DCC-5Fbn/netrina-1 foi estimado emaproximadamente 5 nM, mantendo a ordem de magnitude do Kd deDCC/netrina-1 descrito. Investigamos em seguida se este domínio foi suficientepara deslocar a interação de DCC/netrina-1. Conforme exibido na Figura 15B,utilizando um teste ELISA no qual o domínio extracelular de DCC foi revestidoe a interação entre netrina-1 e DCC foi detectada por meio deimunorreatividade de netrina-1, observamos que, embora como controlepositivo o domínio extracelular completo de DCC (DCC-EC) fosse suficientepara deslocar a interação entre DCC e netrina-1, DCC-SFbn deixou deinterferir. Desta forma, DCC-õFbn interage com netrina-1, mas não é suficientepara inibir a interação entre DCC e netrina-1. Investigamos em seguida seDCC-õFbn poderia influenciar a multimerização de DCC. Realizamoscoimunoprecipitação em HEK293T transfectado de forma transitória com DCCde comprimento total marcado com HA junto com DCC de comprimento totalmarcado com c-myc na presença ou ausência de netrina-1. Também conformedescrito na Figura 1A, a presença de netrina-1 aciona a imunoprecipitação deHA-DCC com c-myc-DCC, o que demonstra multimerização de DCC induzidapor netrina-1 (Figura 15C). Quando as células incubadas com netrina-1também foram tratadas simultaneamente com DCC-õFbn, entretanto, ainteração entre DCC e c-myc retorna aos níveis não tratados de netrina-1.

Desta forma, DCC-õFbn interage com netrina-1 em uma região responsávelpela aproximação mediada por netrina-1 de duas ou mais moléculas de DCC eé capaz de inibir a multimerização de DCC induzida por netrina-1.

Testamos em seguida se DCC-õFbn poderia, conseqüentemente,acionar a morte celular induzida por receptores de netrina-1. Com estepropósito, células HEK293T foram forçadas a expressar DCC na presença ouausência de netrina-1, com ou sem DCC-õFbn, e a morte celular foideterminada por meio de teste de exclusão de azul de tripano (Figura 16A).Conforme exibido na Figura 16A, embora DCC acione a apoptose na ausênciade netrina-1, atividade pró-apoptótica bloqueada pela presença de netrina-1. apresença de DCC-SFbn é suficiente para bloquear a atividade inibidora denetrina-1, de forma a gerar a morte celular induzida por DCC. Como o sistemade células HEK293T utiliza expressão ectópica de netrina-1, testamos emseguida DCC-SFbn em um modelo biologicamente mais relevante.Demonstramos recentemente que, em comparação com cânceres de mamanão metastáticos, a maior parte dos cânceres de mama metastáticos humanossobreexpressa netrina-1. Também demonstramos que a titulação de netrina-1sobreexpressa aciona a apoptose de células de tumores in vitro e a inibição demetástase em camundongos (vide Exemplos 2 e 3). Muitas linhagens decélulas de tumores de mama aparentemente expressam netrina-1 edemonstramos que a titulação de netrina-1 em células 4T1 de carcinoma demama de camundongos aciona a apoptose (vide Exemplos 2 e 3). Conformeexibido na Figura 16B, a adição de DCC-SFbn a um cultivo de células 4T1 éassociada a maior morte celular.

Em resumo, demonstramos no presente que a multimerização dosreceptores de dependência DCC e UNC5H é um mecanismo suficiente parabloquear a sua atividade pró-apoptética. De forma interessante, estemecanismo inibidor aparentemente espelha o que é observado com receptoresde morte. De fato, sabe-se que TNFr ou Fas necessita de trimerizaçâo parainduzir a apoptose Esta diferença intrínseca pode representar, portanto,valor agregado para estratégias terapêuticas utilizando receptores dedependência. De fato, a busca de moléculas terapêuticas no passado gerouprincipalmente acertos que agem sobre a inibição de processos celulares (taiscomo inibidores de quinases, inibidores de IAP) e não ativadores.Conseqüentemente, a inibição da multimerização de receptores de netrina-1utilizando DCC-5Fbn recombinante ou por meio de qualquer compostoselecionado para interferir com a multimerização de receptores aparece comoestratégia tentadora para o tratamento de cânceres nos quais foi adquirida aexpressão de autócrina de netrina-1.

Demonstramos no presente que netrina-1 aciona amultimerização de receptores de DCC e UNC5H. Utilizando um sistema no quala dimerização é induzida quimicamente, demonstramos que a multimerizaçãodo domínio intracelular de receptores de netrina-1, tais como DCC e UNC5H2,é a etapa fundamental para inibir a sua atividade pró-apoptótica. Propomos,portanto, um modelo no qual receptores com dependência de netrina-1monoméricos são pró-apoptóticos, enquanto a sua multimerização, induzidapor netrina-1, abole a sua atividade pró-apoptótica. Utilizando esta propriedade,propomos o uso de um domínio específico recombinante da região extracelularde DCC que (i) interage com netrina-1 e (ii) inibe a multimerização induzida pornetrina-1, a fim de acionar a apoptose de células tumorosas.

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<110> Centre National de Ia Recherche Scientifique (CNRS)Centre Léon Bérard

<120> SELEÇÃO DE COMPOSTOS ANTICANCERÍGENOS UTILIZANDO ATIVIDADE DE NETRINA-1<130> 353327D24201

<140> PCT/EP2007/051920<141> 28-02-2007

<150> US 60/776,926<151> 28-02-2006

<160> 29

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1<211> 62<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<220>

<223> Primer usado para introduzir um marcador HA ao modelopCMV-DCC

cacaggctca gecttttatc eatatgatgt aecggattat gcataacatg tatttctgaa 60tg

<210> 1<211> 62<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer usado para introduzir um marcador HA ao modelopCMV-DCC

cattcagaaa taeatgttat gcataatccg gtaeateata tggataaaag gctgagectg 60tg

<210> 3<211> 65<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer usado para introduzir um marcador c-myc ao modelopCMV-DCC

<400> 3cacaggctca gcctttgagc agaagttgatgaatg

<210> 4<211> 65<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer usado para introduzir um marcador c-myc ao modelopCMV-DCC

<400> 4cattcagaaa tacatgttac agatcttcct cacttctcaa cttctgctca aaggctgagcctgtg

<210> 5<211> 33<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Primer usado para obter um fragment PCR do domíniointracelular do DCC (1122-1447)

<400> 5tatgtcgacc gacgctcttc agcccagcag aga

<210> 6<211> 72<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer usado para obter um fragment PCR do domíniointracelular do DCC (1122-1447)

<400> 6tatgaattct tagtcgagtg cgtagtctgg tacgtcgtac ggataaaagg ctgagcctgtgatggcatta ag

<210> 7<211> 78<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer usado para obter c-myc-Fv2E-DCC-IC

<400> 7 cttaatgcca tcacaggctc agcctttgaa cagaaactca tctctgaaga ggatctgtaagaattcataa agggcaat

<210> 8<211> 78<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer usado para obter c-myc-Fv2E-DCC-IC

<400> 8 attgcccttt atgaattctt acagatcctc ttcagagatg agtttctgtt caaaggctgagcctgtgatg gcattaag

<210> 9<211> 25<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer usado para as construções que codificam FlagM2-UNC5H2

<400> 9gcgcggccgc agggcccgga gcggg

<210> 10<211> 30<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer para as construções que codificam FlagM2-UNC5H2

<400> 10cggaattctc agcaatcgcc atcagtggtc

<210> 11<211> 26<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer usado para geração pela amplificação PCR doDomínio intracelular UNC5H2-HA

<400> 11cggtcgacgt gtaccggaga aactgc

<210> 12<211> 57<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<400> 12gcgaattctc atgcataatc cggcacatca tacggatagc aatcgccatc agtggtc

<210> 13<211> 26<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer usado para geração pela amplificaçao PCR doDomínio intracelular UNC5H2-myc

<400> 13cggtcgacgt gtaccggaga aactgc

<210> 14<211> 60<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer usado para geração pela amplificação PCR doDomínio intracelular UNC5H2-myc

<400> 14gcgaattctc acagatcctc ttctgagatg agtttttgtt cgcaatcgcc atcagtggtc

<210> 15<211> 18<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer direto Fv2E

<400> 15ccaccatggg gagtagca

<210> 16<211> 49<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer reverse UNC5H2-HA<400> 16tcatgcataa tccggcacat catacggata gcaatcgcca tcagtggtc

<210> 17<211> 52<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer reverse UNC5H2-myc

<400> 17tcacagatcc tcttctgaga tgagtttttg ttcgcaatcg ccatcagtgg tc

<210> 18<211> 23<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Primer usado para PBGD humano expresso como controle interno

<400> 18ctggagttca ggagtattcg ggg

<210> 19<211> 24<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Primer usado para PBGD humano expresso como controle interno

<400> 19cagatccaag atgtcctggt cctt

<210> 20<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Primer usado para TBP humano expresso como controle interno<400> 20cacgaaccac ggcactgatt

<210> 21<211> 22<212> DNA

<213 Seqüência Artificial<220>

<223> Primer usado para TBP humano expresso como controle interno<400> 21ttttcttgct gccagtctgg ac

<210> 22<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Primer usado para nitrin-l-NTNl humano expresso como controleinterno

<400> 22tgcaagaagg actatgccgt c

<210> 23<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Primer usado para nitrin-l-NTNl humano expresso como controleinterno

<400> 23gctcgtgccc tgcttataca c

<210> 24<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Primer usado para UNC5B humano expresso como controle interno<400> 24tgcaggagaa cctcatggtc

<210> 25<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer usado para UNC5B humano expresso como controle interno

<400> 25gggctggagg attactggtg

<210> 26<211> 25<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer usado para DCC humano expresso como controle interno

<400> 26agccaatggg aaaattactg cttac

<210> 27<211> 25<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer usado para DCC humano expresso como controle interno

<400> 27aggttgagat ccatgatttg atgag

<210> 28<211> 26<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> Primer usado para UNC5C humano expresso como controle interno<400> 28gcaaattgct ggctaaatat caggaa

<210> 29<211> 26<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Primer usado para UNC5C humano expresso como controle interno

<400> 29gctccactgt gttcaggcta aatctt

Claims

1. MÉTODO DE SELEÇÃO DE UM COMPOSTO, para aprevenção ou tratamento de câncer, em que o mencionado métodocompreende as etapas de:a. ter um meio que contenha netrina-1, ou um de seusfragmentos, e um receptor de netrina-1, ou um de seus fragmentos, em que:a mencionada netrina-1, ou um de seus fragmentos, e omencionado receptor de netrina-1, ou um de seus fragmentos, são capazes deinteragir especificamente juntos para formar um par de união; e/oua mencionada netrina-1, ou um de seus fragmentos, écapaz de induzir a dimerização ou a multimerização do mencionado receptorde netrina-1, ou um de seus fragmentos, particularmente o domínio intracelulardo mencionado receptor de netrina-1;b. contato do mencionado meio com o composto a sertestado;c. medição da inibição da interação entre netrina-1, ou um deseus fragmentos, e o mencionado receptor de netrina-1, ou um de seusfragmentos; e/oudeterminação de se o mencionado composto inibe adimerização ou multimerização do mencionado receptor de netrina-1, ou um deseus fragmentos, particularmente a dimerização do domínio intracelular domencionado receptor de netrina-1; ed. seleção do mencionado composto se:a medição da etapa c demonstrar uma inibição significativada interação entre netrina-1, ou um de seus fragmentos, e receptor de netrina-1, ou um de seus fragmentos, na presença do mencionado composto; e/oua determinação na etapa c demonstrar uma inibiçãosignificativa da dimerização ou multimerização do mencionado receptor denetrina-1, ou um de seus fragmentos, na presença do mencionado composto,particularmente a dimerização do domínio intracelular do mencionado receptorde netrina-1.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que omencionado câncer a ser evitado ou tratado é um câncer em que as célulastumorosas expressam ou sobreexpressam netrina-1.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou-2, em que o mencionado câncer a ser evitado ou tratado é selecionado a partirdo grupo que consiste de câncer de mama, câncer colo-retal, câncer dopulmão, neuroblastoma, glioma, leucemia mielóide aguda, sarcoma,melanoma, adenocarcinoma do ovário, adenocarcinoma renal, adenocarcinomapancreático, adenocarcinoma do útero, adenocarcinoma do estômago,adenocarcinoma do rim e adenocarcinoma retal.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a-3, em que o mencionado câncer a ser evitado ou tratado é um câncermetastático ou um câncer agressivo.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a-4, em que, na etapa a, o mencionado receptor de netrina-1 é selecionado apartir do grupo que consiste de DCC, UNC5H (particularmente UNC5H1,UNC5H2 e UNC5H3), neogenina e adenosina A2b.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, em que, naetapa a, o mencionado receptor de netrina-1 é selecionado a partir do grupoque consiste de DCC, UNC5H1, UNC5H2 e UNC5H3.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a-6, em que, na etapa a:o mencionado fragmento receptor de netrina-1 compreendeou é o domínio extracelular do receptor de netrina-1, ou uma de suas partescapaz de interagir com netrina-1; e/ouo mencionado fragmento receptor de netrina-1 compreendeou é o domínio intracelular do receptor de netrina-1, ou uma de suas partescapaz de dimerizar-se ou multimerizar-se na presença de netrina-1.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a-7, em que, na etapa a, a mencionada netrina-1 e/ou o mencionado receptor denetrina-1 são de mamífero, particularmente de camundongo, rato ou serhumano.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a-8, em que, na etapa a, a mencionada netrina-1 é de galinha.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a-9, em que a mencionada netrina-1 e/ou o mencionado receptor de netrina-1e/ou o composto a ser testado é marcado por um marcador capaz de sermedido direta ou indiretamente.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a-10, em que, na etapa c:a medição da inibição da interação entre netrina-1, ou umde seus fragmentos, e o mencionado receptor de netrina-1, ou um de seusfragmentos, é conduzida por meio de imunoteste (particularmente por meio deELISA ou de Teste Imunorradiométrico (IRMA)), por meio de Teste deProximidade de Cintilação (SPA) ou Transferência de Energia de Ressonânciade Fluorescência (FRET); e/oua dimerização ou multimerização, ou sua inibição, domencionado receptor de netrina-1, ou um de seus fragmentos, particularmentedo domínio intracelular, é conduzida por meio de imunoprecipitação ou FRET.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a-11, em que, na etapa a, o mencionado meio contém células que expressam nasua membrana de superfície, um receptor de netrina-1 endógeno ourecombinante, particularmente pelo menos o domínio extracelular recombinantede um receptor de netrina-1 recombinante.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, em que, naetapa a, o mencionado meio contém células que expressam receptor demetrina-1 recombinante.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, em que, naetapa a, o mencionado meio contém células de tumores que expressam deforma endógena o mencionado receptor de netrina-1 na sua superfície demembrana e que expressam ou sobreexpressam netrina-1, e em que, na etapac, a inibição da interação entre netrina-1 e o seu receptor de netrina-1 napresença do composto a ser testado é medida por meio da apoptose ou mortecelular induzida pela presença do composto a ser testado.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, em que, naetapa a, o mencionado meio contém células tumorosas metastáticas,particularmente células selecionadas a partir do grupo que consiste de células-4T1, células CAL51, células T47D, células SKBR7, células IMR32, célulasGL26 e células H358.

16. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a-15 para seleção de um composto para a prevenção ou o tratamento de câncer,em que o mencionado método compreende as etapas a seguir de:a. ter um meio que contém uma célula de mamífero queexpressa um receptor de netrina-1 endógeno ou recombinante, ou um de seusfragmentos que compreende pelo menos o seu domínio intracelular,preferencialmente uma célula de tumor, de maior preferência uma célula queapresente dimerização ou multimerização do seu domínio intracelular dereceptor de netrina-1 ou uma célula em que o seu domínio intracelular dereceptor de netrina-1 é capaz de dimerizar-se ou multimerizar-se na presençade netrina-1;b. contato do mencionado meio com o composto a sertestado, em que o meio opcionalmente contém ainda netrina-1, ou um de seusfragmentos capaz de interagir com o domínio extracelular do receptor denetrina-1;c. determinar se a dimerização ou multimerização domencionado domínio intracelular de receptor de netrina-1 é inibida na presençado mencionado composto a ser testado;d. opcionalmente, determinar se a presença do composto aser testado induz a morte celular da mencionada célula de mamífero; ee. seleção do mencionado composto caso a determinação naetapa c demonstre inibição significativa da dimerização ou multimerização dodomínio intracelular do mencionado receptor de netrina-1 e/ou se adeterminação na etapa d demonstrar a morte celular da mencionada célula demamífero.

17. MÉTODO IN VITRO DE PREVISÃO DA PRESENÇA DECÂNCER METASTÁTICO OU CÂNCER AGRESSIVO, em um paciente quepossui um tumor primário a partir de uma biópsia do mencionado paciente quecontém células de tumores primários, em que o mencionado métodocompreende a etapa a seguir de:a. medição do nível de expressão de netrina-1 na mencionadabiópsia.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que um aumento do nível de expressão de netrina-1 namencionada biópsia, em comparação com a expressão de netrina-1 embiópsias de tumor primário não metastático ou em biópsias de câncer nãoagressivo é indicativo da presença de um câncer metastático ou cânceragressivo.

19. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 17ou 18, em que razão superior a 2 entre a expressão de netrina-1 na biópsia aser testada e na biópsia de referência não metastática é indicativa da presençade um câncer metastático.

20. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO IN VITRO DA EFICIÊNCIADE UM TRATAMENTO ANTICANCERÍGENO, para um paciente ou paraselecionar in vitro pacientes que reajam a um tratamento anticancerígenoespecífico, em que o mencionado método compreende as etapas a seguir de:a. obtenção de uma biópsia de tumor primária do mencionadopaciente tratado; eb. medição do nível de expressão de netrina-1 na mencionadabiópsia;em que a eficiência do mencionado tratamento anticancerígeno écorrelacionada com a redução da quantidade do nível de expressão de netrina--1 medido na mencionada biópsia; ouem que os pacientes selecionados que reagem a um tratamentoanticancerígeno específico são pacientes em que a quantidade do nível deexpressão de netrina-1 medida na sua biópsia caiu após o mencionadotratamento específico.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que omencionado câncer induziu sobreexpressão de netrina-1 e/ou é um câncermetastático ou agressivo.

22. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 17 a-21, em que o produto de expressão de netrina-1 medido é o RNA que codificanetrina-1, particularmente medido por meio de método de PCR reversa emtempo real quantitativa.

23. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 17 a-21, em que o nível de expressão de netrina-1 que é medido é a medição donível de proteína de netrina-1, particularmente por meio de método que utilizaanticorpos específicos capazes de reconhecer especificamente a mencionadaproteína netrina-1.

24. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 17 a-23, em que o tumor primário é um tumor primário de um câncer selecionado apartir do grupo que consiste de câncer de mama, câncer colo-retal, câncer dopulmão, neuroblastoma, glioma, leucemia mielóide aguda, sarcoma,melanoma, adenocarcinoma do ovário, adenocarcinoma renal, adenocarcinomapancreático, adenocarcinoma do útero, adenocarcinoma do estômago,adenocarcinoma do rim e adenocarcinoma retal.

25. KIT DE SELEÇÃO, de um composto de prevenção outratamento de câncer, em que o mencionado kit compreende:uma proteína receptora de netrina-1, ou um de seusfragmentos capazes de interagir especificamente com a proteína netrina-1 paraformar um par de união, preferencialmente proteína recombinante; eproteína netrina-1, ou um de seus fragmentos capaz deinteragir especificamente com a mencionada proteína receptora de netrina-1para formar um par de união, preferencialmente proteína recombinante.

26. KIT DE SELEÇÃO, de um composto para a prevenção outratamento de câncer, em que o mencionado kit compreende:células de tumores que expressam receptor de netrina-1 eque expressam ou sobreexpressam netrina-1, particularmente células delinhagem de células de tumores, preferencialmente selecionadas a partir dogrupo que consiste de células 4T1, células CAL51, células T47D, célulasSKBR7, células IMR32, células GL26 e células H358; e, opcionalmente,proteína netrina-1 ou um de seus fragmentos capaz deinteragir especificamente com a mencionada proteína receptora de netrina-1para formar um par de união, preferencialmente uma proteína de netrina-1recombinante.

27. COMPOSTO, selecionado a partir do grupo que consiste de:um composto selecionado por meio do método de acordocom qualquer das reivindicações 1 a 15;um composto que compreende um domínio extracelular dereceptor de netrina-1 ou seu fragmento capaz de inibir especificamente ainteração entre a netrina-1 e o mencionado receptor de netrina-1 e/ou capaz deinibir a dimerização ou multimerização do mencionado receptor de netrina-1, ouum de seus fragmentos, particularmente o domínio intracelular do mencionadoreceptor de netrina-1; eum anticorpo monoclonal ou policlonal dirigidoespecificamente contra netrina-1 ou receptor de netrina-1, particularmentedirigido ao domínio extracelular do mencionado receptor de netrina-1 ou aofragmento de netrina-1 capaz de interagir com o domínio extracelular domencionado receptor de netrina-1;como medicamento.

28. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 27, em que omencionado domínio extracelular de receptor de netrina-1 ou um de seusfragmentos é selecionado a partir do grupo que consiste de DCC, UNC5H(particularmente UNC5H1, UNC5H2 e UNC5H3), neogenina e adenosina A2b.

29. COMPOSTO, de acordo com qualquer das reivindicações-27 ou 28, em que o mencionado composto compreende um domínioextracelular de receptor de netrina-1 de DCC, preferencialmente o mencionadocomposto é DCC-EC-Fc ou DCC-5Fbn.

30. MÉTODO DE TRATAMENTO, para indução da apoptoseou da morte celular de células de tumores que tenham adquirido a vantagemseletiva de escapar de apoptose induzida por receptores de dependência denetrina-1, preferencialmente por nível elevado de netrina-1, em um pacienteque compreende a administração de um composto capaz de inibir estavantagem seletiva em uma célula de tumor do mencionado paciente delenecessitado.

31. MÉTODO DE PREVENÇÃO OU DE TRATAMENTO, decâncer em pacientes que compreende a administração de um composto deacordo com qualquer das reivindicações 27 a 29 ao mencionado paciente delenecessitado.

32. USO DE UM COMPOSTO, de acordo com qualquer dasreivindicações 27 a 29 para a fabricação de um medicamento para a prevençãoou o tratamento de câncer em mamíferos, incluindo seres humanos.

33. MÉTODO OU USO, de acordo com qualquer dasreivindicações 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o mencionado câncer éum câncer metastático ou agressivo.

34. MÉTODO OU USO, de acordo com qualquer dasreivindicações 30 a 32, caracterizado pelo fato de que o mencionado câncer éselecionado a partir do grupo que consiste de câncer de mama, câncer colo-retal, câncer do pulmão, neuroblastoma, glioma, leucemia mielóide aguda,sarcoma, melanoma, adenocarcinoma do ovário, adenocarcinoma renal,adenocarcinoma pancreático, adenocarcinoma do útero, adenocarcinoma doestômago, adenocarcinoma do rim e adenocarcinoma retal.

35. MÉTODO OU USO, de acordo com qualquer dasreivindicações 29 a 34, caracterizado pelo fato de que as células de tumoresprimários do mencionado câncer expressam ou sobreexpressam netrina-1.

36. USO DO NÍVEL DE EXPRESSÃO DE NETRINA-1, comomarcador para a identificação de um câncer metastático ou agressivo empacientes.

37. USO, de acordo com a reivindicação 36, em que omencionado câncer metastático ou agressivo é selecionado a partir do grupoque consiste de câncer de mama, câncer colo-retal, câncer do pulmão,neuroblastoma, glioma, leucemia mielóide aguda, sarcoma, melanoma,adenocarcinoma do ovário, adenocarcinoma renal, adenocarcinomapancreático, adenocarcinoma do útero, adenocarcinoma do estômago,adenocarcinoma do rim e adenocarcinoma retal.

38. USO, de acordo com qualquer das reivindicações 36 ou 37,em que o mencionado câncer é selecionado a partir de câncer de mama oucâncer colo-retal.